KR20220022086A - 기기에서의 시약 교환 - Google Patents

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토니 옌
에릭 스타바
라자고팔 판차파케산
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일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

방법은, 기기의 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 혼입 시약을 유동시키는 단계를 포함한다. 유동 셀은 내부에 포지셔닝된 제1 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 혼입 시약은 염기 서열에 제1 염기를 추가한다. 염기 서열은 제1 폴리뉴클레오티드에 상보적인 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 제1 염기가 제2 폴리뉴클레오티드에 추가된 후에, 제1 염기로부터 나오는 식별 신호의 이미지가 캡처된다. 염기 서열의 후속 염기가 제2 폴리뉴클레오타이드에 추가되는 것을 가능하게 하기 위하여 제1 염기로부터 제1 종결자를 제거하기 위해, 절단 시약이 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 유동된다. 완충 시약이 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 유동된다.

Description

기기에서의 시약 교환
[0001] 본 특허 출원은, Reagent Exchange In An Instrument란 명칭으로 2019년 6월 19일자로 출원된 미국 특허 가출원 번호 제62/863,444호에 대한 우선권을 주장한다. 전술된 출원의 전체 내용이 이로써 인용에 의해 본원에 포함된다.
[0002] 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드들의 순서를 결정하기 위한 방법들의 수행에 활용되는 기기들은 유동 셀과 유체 연통하는 시약 관리 시스템(RMS; reagent management system)을 포함할 수 있다. RMS는, 복수의 시약들을 저장하고 선택하며 유동 셀의 유동 채널을 통해 순차적으로 유동시킬 수 있다.
[0003] 그러한 방법들은, 유동 셀의 유동 채널에 포지셔닝된 복제된(cloned) 제1 폴리뉴클레오티드들의 클러스터들에 대해 다양한 제어된 화학 반응들을 수행하기 위하여 유동 셀의 유동 채널을 통해 라우팅되는 선택된 시약들의 서열의 다수의 사이클들을 포함할 수 있다. 화학 반응들은 태깅된 뉴클레오타이드들이, 제1 폴리뉴클레오타이드들의 염기 서열로, 한 번에 한 염기 쌍씩 염기 쌍들을 형성하는 것을 가능하게 한다. 일단 페어링되면(paired), 태그들은 염기 쌍을 식별하는 식별 신호를 방출하도록 여기된다(excited). 각각의 태깅된 폴리뉴클레오타이드는, 유동 셀에서 제1 폴리뉴클레오타이드와 이중 가닥인 성장하는 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥에 추가된다.
[0004] 이에 따라서, 제1 폴리뉴클레오타이드들의 클러스터에서의 염기 서열을 결정하기 위해, 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥들은 한 번에 한 염기씩 구축될 수 있다. 구축될 수 있는 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥들의 알려진 뉴클레오타이드들의 수가 많을수록(즉, 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥 길이가 길어질수록), 제1 폴리뉴클레오타이드들의 클러스터에서의 뉴클레오타이드들의 순서에 관한 더 많은 데이터가 제공될 수 있고, 전체 분석이 더 빨라진다.
[0005] 그러나, 시약 유동들 사이의 시약 교환이 충분하지 않으면, 시약들 사이의 교차 오염이 발생할 수 있다. 이에 따라서, 시약 유동들 사이의 개선된 시약 교환을 갖는, 폴리뉴클레오타이드들의 뉴클레오타이드들의 순서를 결정하기 위한 기기들 및 방법들이 필요하다.
[0006] 본 개시내용은, 본 개시내용의 하나 이상의 양상들에 따라, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드들의 순서를 결정하는 방법을 수행하도록 동작가능한 기기(instrument)를 제공함으로써 장점들을 제공한다. 방법은 세척 단계(wash phase)를 포함하고, 여기서, 기기의 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 완충 시약(buffer reagent)을 유동시킬 때, 완충 시약의 총 스윕 볼륨(total sweep volume)은 완충 시약의 총 유체 소모량(total fluidic consumption)보다 더 크다. 추가로, 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 비(ratio)는 6, 10 또는 그 초과만큼 높을 수 있다. 방법은, 다른 방법들에 비하여 시약 교환을 향상시키고, 여기서, 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 비는 1이다. 따라서, 프리-페이징(pre-phasing)이 감소되며, 성장될 수 있는 폴리뉴클레오타이드들의 길이가 그러한 다른 방법들에 비해 증가된다.
[0007] 본 개시내용의 하나 이상의 양상들에 따른 방법은, 기기의 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 혼입 시약을 유동시키는 단계를 포함한다. 유동 셀은 내부에 포지셔닝된 제1 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 혼입 시약은 염기 서열에 제1 염기를 추가한다. 염기 서열은 제1 폴리뉴클레오티드에 상보적인 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 제1 염기가 제2 폴리뉴클레오티드에 추가된 후에, 제1 염기로부터 나오는 식별 신호의 이미지가 캡처된다. 염기 서열의 후속 염기가 제2 폴리뉴클레오타이드에 추가되는 것을 가능하게 하기 위하여 제1 염기로부터 제1 종결자를 제거하기 위해, 절단 시약이 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 유동된다. 시약 관리 시스템 및 유동 셀로부터 절단 시약을 세척하기 위해, 완충 시약이 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 유동된다.
[0008] 방법의 일부 예들에서, 복수의 사이클들은 4 개 이상의 사이클들을 포함한다.
[0009] 방법의 일부 예들에서, 복수의 사이클들은 12 개 이상의 사이클들을 포함한다.
[0010] 방법의 일부 예들에서, 시약 관리 시스템 및 유동 셀은 기기의 카트리지에 포지셔닝되고, 카트리지는 기기에 제거가능하게 삽입가능하다.
[0011] 방법의 일부 예들에서, 혼입 시약, 절단 시약 및 완충 시약은 시약 관리 시스템의 시약 웰(reagent well)들에 저장되고, 시약 웰들은 각각의 시약의 유한 총 볼륨(finite total volume)을 저장하도록 구성된다.
[0012] 방법의 일부 예들에서, 완충 시약을 유동시키는 단계는,
복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향으로 완충 시약의 제1 순방향 유동 볼륨을 유동시키는 단계; 및 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 역방향 유동 방향으로 완충 시약의 제2 역방향 유동 볼륨을 유동시키는 단계를 포함하고, 제1 순방향 유동 볼륨은 제2 역방향 유동 볼륨보다 더 크다.
[0013] 방법의 일부 예들에서, 순방향 유동 볼륨은 역방향 유동 볼륨보다 약 3% 이상만큼 더 크다.
[0014] 방법의 일부 예들에서, 완충 시약을 유동시키는 단계는,
복수의 사이클들 중 마지막 사이클 후에 약 10 초 이상 동안 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통한 완충 시약의 유동이 실질적으로 없는 인큐베이션 기간; 및 인큐베이션 기간 후에 순방향 유동 방향으로 완충 시약의 제3 순방향 유동 볼륨을 유동시키는 단계를 포함한다.
[0015] 방법의 일부 예들에서, 완충 시약을 유동시키는 단계 동안의 완충 시약의 총 스윕 볼륨은 식 ((제1 FFV + 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정되고, 여기서,
제1 FFV는 제1 순방향 유동 볼륨이고,
제2 RFV는 제2 역방향 유동 볼륨이고,
N은 복수의 사이클들의 총 사이클 수이며, 그리고
제3 FFV는 제3 순방향 유동 볼륨이다.
[0016] 방법의 일부 예들에서, 완충 시약을 유동시키는 단계 동안의 완충 시약의 총 유체 소모량은 식 ((제1 FFV - 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정된다.
[0017] 방법의 일부 예들에서, 완충 시약의 총 유체 소모량에 대한 완충 시약의 총 스윕 볼륨의 비는 약 6 이상이다.
[0018] 방법의 일부 예들에서, 순방향 유동 방향으로 유동시키는 단계와 역방향 유동 방향으로 유동시키는 단계는, 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향에 대해 약 1 초 이하의 지연(delay) 시간만큼 분리된다.
[0019] 방법의 일부 예들에서, 순방향 유동 방향으로 유동시키는 단계와 역방향 유동 방향으로 유동시키는 단계는, 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향에 대해 약 200 밀리초 이하의 지연 시간만큼 분리된다.
[0020] 방법의 일부 예들에서, 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향은 약 200 밀리초 이하의 지연 시간만큼 분리된다.
[0021] 방법의 예들 중 임의의 예는 본원에서 설명된 장점들을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 구현될 수 있다.
[0022] 본 개시내용의 하나 이상의 양상들에 따른 기기는, 기기에 포지셔닝되도록 동작가능한 시약 관리 시스템을 포함한다. 시약 관리 시스템은 복수의 시약 웰들을 포함한다. 시약 웰들은 적어도, 내부에 각각 포지셔닝된 혼입 시약, 절단 시약 및 완충 시약을 포함하도록 구성된 제1 시약 웰, 제2 시약 웰 및 제3 시약 웰을 갖는다. 시약 관리 시스템은 복수의 시약 웰들 중 하나의 시약 웰로부터의 시약의 유동을 선택하도록 동작가능하다. 유동 셀이 기기에 포지셔닝되도록 동작가능하다. 유동 셀은 시약 관리 시스템과 유체 연통(fluid communication)하는 유동 채널을 포함한다. 유동 채널은 유동 채널에 포지셔닝된 제1 폴리뉴클레오타이드 위로의 시약의 유동을 라우팅하도록 동작가능하다.
기기는,
염기 서열에 제1 염기를 추가하기 위해, 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 혼입 시약을 유동시키도록 ―염기 서열은 제1 폴리뉴클레오티드에 상보적인 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함함―;
제1 염기가 제2 폴리뉴클레오티드에 추가된 후에, 제1 염기로부터 나오는 식별 신호의 이미지를 캡처하도록;
염기 서열의 후속 염기가 제2 폴리뉴클레오타이드에 추가되는 것을 가능하게 하기 위하여 제1 염기로부터 제1 종결자를 제거하기 위해, 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 절단 시약을 유동시키도록; 그리고
시약 관리 시스템 및 유동 셀로부터 절단 시약을 세척하기 위해, 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 완충 시약을 유동시키도록 동작가능하다.
[0023] 일부 예들에서, 기기는, 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 포함하도록 동작가능한 카트리지를 포함하고, 혼입 시약, 절단 시약 및 완충 시약은 시약 관리 시스템의 시약 웰들에 저장되고, 시약 웰들은 각각의 시약의 유한 총 볼륨을 저장하도록 구성된다.
[0024] 일부 예들에서, 기기는, 4 개 이상의 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 완충 시약을 유동시키도록 동작가능하다.
[0025] 일부 예들에서, 기기는,
복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향으로 완충 시약의 제1 볼륨이 유동되고;
복수의 사이클들의 각각의 사이클의 역방향 유동 방향으로 완충 시약의 제2 볼륨이 유동되고 ―제1 볼륨은 제2 볼륨보다 더 큼―;
복수의 사이클들 중 마지막 사이클 후에 약 10 초 이상 동안 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통한 완충 시약의 유동이 실질적으로 없는 인큐베이션 기간이 부과되며(imposed); 그리고
인큐베이션 기간 후에 순방향 유동 방향으로 완충 시약의 제3 순방향 유동 볼륨이 유동되게, 완충 시약을 유동시키도록 동작가능하다.
[0026] 일부 예들에서, 기기는,
완충 시약의 총 스윕 볼륨이 식 ((제1 FFV + 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정되고 ―
제1 FFV는 제1 순방향 유동 볼륨이고,
제2 RFV는 제2 역방향 유동 볼륨이고,
N은 복수의 사이클들의 총 사이클 수이며, 그리고
제3 FFV는 제3 순방향 유동 볼륨임―;
완충 시약의 총 유체 소모량이 식 ((제1 FFV - 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정되게, 완충 시약을 유동시키도록 동작가능하며, 그리고
완충 시약의 총 유체 소모량에 대한 완충 시약의 총 스윕 볼륨의 비는 약 6 이상이다.
[0027] 일부 예들에서, 기기는, 순방향 유동 방향으로 유동시키는 것과 역방향 유동 방향으로 유동시키는 것이 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향에 대해 약 200 밀리초 이하의 지연 시간만큼 분리되게, 완충 시약을 유동시키도록 동작가능하다.
[0028] 기기들의 예들 중 임의의 예는 본원에서 설명된 장점들을 달성하기 위해 임의의 적절한 조합으로 구현될 수 있다.
[0029] 방법들 및 기기들을 포함하여, 전술된 양상들의 모든 조합들, 및 아래에서 더 상세히 논의되는 추가적인 개념들(그러한 개념들이 상호 불일치하지 않는 경우)은 본원에서 개시된 신규한 발명의 요지의 일부인 것으로서 고려된다는 것이 인식되어야 한다.
[0030] 본 개시내용의 이들 및 다른 목적들, 특징들 및 장점들은 첨부된 도면들과 함께 취해진 본 개시내용의 다양한 양상들에 대한 다음의 상세한 설명으로부터 자명해질 것이다.
[0031] 본 개시내용은 첨부된 도면들과 함께 해석되는 다음의 상세한 설명으로부터 더 완전히 이해될 것이며, 도면들에서:
[0032] 도 1은 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 뉴클레오타이드의 화학 구조의 단순화된 예를 도시하고;
[0033] 도 2는 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 제1 폴리뉴클레오타이드 및 성장하는 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드의 단순화된 예를 도시하고;
[0034] 도 3은 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드들의 순서를 결정하는 방법의 흐름도의 예를 도시하고;
[0035] 도 4는 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드들의 순서를 결정하는 다른 방법의 흐름도의 예를 도시하고;
[0036] 도 5는 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 세척 단계의 작업 예 동안 획득된, 완충 시약의 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 다양한 비들을 보여주는 표를 도시하고;
[0037] 도 6은 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 도 5의 작업 예에서 획득된 데이터로부터 플롯된, 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨들 대 프리-페이징 기울기(pre-phasing slope)의 비들의 그래프들을 도시하고;
[0038] 도 7은 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 기기의 개략도의 예를 도시하며; 그리고
[0039] 도 8은 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 도 7의 기기의 개략적인 블록 다이어그램의 예를 도시한다.
[0040] 본원에서 개시되는 방법들, 시스템들 및 디바이스들의 구조, 기능, 제조 및 사용의 원리들에 대한 전체적인 이해를 제공하기 위해, 특정 예들이 이제 설명될 것이다. 하나 이상의 예들이 첨부된 도면들에 예시된다. 당업자들은, 본원에서 구체적으로 설명되고 첨부된 도면들에 예시된 방법들, 시스템들 및 디바이스들이 비-제한적인 예들이고 본 개시내용의 범위가 청구항들에 의해서만 정의된다는 것을 이해할 것이다. 일 예와 관련하여 예시되거나 또는 설명되는 특징들은 다른 예들의 특징들과 조합될 수 있다. 그러한 수정들 및 변형들은 본 개시내용의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.
[0041] 청구항들을 포함하여, 본 개시내용 전체에 걸쳐 사용될 수 있는, "실질적으로", "대략", "약", "비교적"이란 용어들 또는 다른 그러한 유사한 용어들은, 기준 또는 파라미터로부터 이를테면 프로세싱 시의 변형들에 기인한 작은 변동(fluctuation)들을 설명 및 고려(account for)하기 위해 사용된다. 그러한 작은 변동들은 기준 또는 파라미터로부터의 0 변동도 또한 포함한다. 예컨대, 그러한 작은 변동들은 ± 10% 이하, 이를테면, ± 5% 이하, 이를테면, ± 2% 이하, 이를테면, ± 1% 이하, 이를테면, ± 0.5% 이하, 이를테면, ± 0.2% 이하, 이를테면, ± 0.1% 이하, 이를테면, ± 0.05% 이하를 지칭할 수 있다.
[0042] 도 1을 참조하면, 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 뉴클레오타이드(100)의 화학 구조의 단순화된 예가 도시된다. 뉴클레오타이드(100)는 다음의 3 가지 소단위체 분자들: 질소 염기(102)(핵염기 또는 염기로서 또한 알려짐), 오탄당(five-carbon sugar)(104)(이를테면, 리보스 또는 데옥시리보스) 및 적어도 하나의 인산염 그룹(106)으로 구성된다. 함께 연결되는 다수의 뉴클레오타이드들은 폴리뉴클레오타이드들로서 알려져 있다. 도 2에서 가장 잘 보여지는 제1 폴리뉴클레오타이드(108) 및 제2 폴리뉴클레오타이드(110)는 그러한 폴리뉴클레오타이드들의 예들이다.
[0043] 뉴클레오타이드(100)의 질소 염기(102)는 다음의 5 가지 유형들: 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 티민(T) 및 유라실(U) 중 하나일 수 있다. 각각의 유형의 염기(102)는 단 하나의 다른 염기 유형과 페어링(즉, 화학적으로 부착)되어, 도 2에 도시된 상보적 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(112)와 같은 폴리뉴클레오타이드들의 2 개의 상보적 이중 가닥들에서 상보적 염기 쌍을 형성할 것이다.
[0044] 본원에서 사용되는 상보적이란 것은, 제1 뉴클레오타이드의 제1 염기와 이러한 제1 뉴클레오타이드의 제1 염기에 화학적으로 부착될 수 있는 제2 뉴클레오타이드의 특정 제2 염기의 페어링(pairing)을 지칭한다. 제2 염기(및 제2 염기와 연관된 뉴클레오타이드)는 본원에서 제1 염기(및 제1 염기와 연관된 뉴클레오타이드)에 상보적인 것으로 간주된다. 예컨대, 아데닌-티민(A-T) 및 구아닌-사이토신(G-C)은 데옥시리보핵산(DNA)의 상보적 이중 폴리뉴클레오타이드 가닥들을 연결할 수 있는 상보적 염기 쌍들이다. 또한, 아데닌-유라실(A-U) 및 구아닌-사이토신(G-C)은 리보핵산(RNA)의 상보적 이중 폴리뉴클레오타이드 가닥들을 연결할 수 있는 상보적 염기 쌍들이다.
[0045] 도 2를 참조하면, 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 제1 폴리뉴클레오타이드(108) 및 성장하는 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드(110)의 단순화된 예가 도시된다. 제1 폴리뉴클레오타이드(108)와 제2 폴리뉴클레오타이드(110)는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(112)를 형성하도록 함께 연결된다.
[0046] 제1 폴리뉴클레오타이드(108)는 (도 7에서 가장 잘 보여지는) 유동 셀(202)의 유동 채널(224)의 바닥(floor)(116)에 화학적으로 고정된다(114). 제1 폴리뉴클레오타이드(108)는 뉴클레오타이드들(118-1 내지 118-N)을 포함하고, 여기서, N은 제1 폴리뉴클레오타이드(108)의 뉴클레오타이드들(118)의 총 수를 표현하고, 또한 제1 폴리뉴클레오타이드(108)의 길이를 표시한다. 각각의 뉴클레오타이드(118)와 연관된 특정 유형의 질소 염기는, 각각, 염기 유형들인 아데닌, 구아닌, 사이토신 및 티민을 표현하는 원형 문자들(A, G, C 또는 T)에 의해 식별된다. 제1 폴리뉴클레오타이드(108)는 유동 채널(224)의 바닥(116)에 고정된 복제된 동일한 제1 폴리뉴클레오타이드들(108)의 많은 클러스터 중 하나일 수 있다.
[0047] 제2 폴리뉴클레오타이드(110)는 적어도 뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-6)을 포함한다. 다시, 각각의 뉴클레오타이드(120)와 연관된 특정 유형의 질소 염기는 원형 문자들(A, G, C 또는 T)에 의해 식별된다. 각각의 뉴클레오타이드(120)는 화학 태그(이를테면, 형광 태그)를 포함하고, 이러한 화학 태그는 (예컨대, 여기 광에 의해) 여기될 때 식별 신호(이를테면, 형광 광)를 방출할 것이며, 이러한 식별 신호는 뉴클레오타이드(120)의 특정 염기를 식별할 것이다.
[0048] 뉴클레오타이드들(120)의 염기들은 뉴클레오타이드들(118)의 상보적 염기에만 부착되어, 일련의 상보적 염기 쌍들(122-1 내지 122-6)을 형성할 수 있다. 염기 쌍들(122) 및 이러한 염기 쌍들(122)과 연관된 뉴클레오타이드(118, 120)는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드(112)를 형성한다.
[0049] 제1 폴리뉴클레오타이드(108)의 뉴클레오타이드들(118-1 내지 118-N)의 순서를 결정하기 위한 방법들의 수행에 활용되는 기기(200)와 같은 기기는 (도 7에서 가장 잘 보여지는) 유동 셀(202)과 유체 연통하는 시약 관리 시스템(204)을 포함할 수 있다. 시약 관리 시스템은, 복수의 시약들을 저장하고 선택하며 유동 셀(202)의 유동 채널(224)을 통해 순차적으로 유동시킬 수 있다. 시약 관리 시스템 및/또는 유동 셀은, 기기의 제거가능하게 삽입가능한 카트리지(230)(도 7에서 가장 잘 보여짐)에 위치될 수 있거나 또는 위치되지 않을 수 있다.
[0050] 본원에서 더 상세히 설명될 바와 같이, 그러한 방법들은, 제1 폴리뉴클레오타이드(108)에 대해 다양한 제어된 화학 반응들을 수행하기 위하여 유동 셀(202)의 유동 채널(224)을 통해 라우팅되는 (도 7에서 가장 잘 보여지는) 선택된 시약들(208-218)의 서열의 다수의 사이클들을 포함할 수 있다. 제1 폴리뉴클레오타이드(108) 위로 유동하는 혼입 시약으로서 알려진 적어도 하나의 시약은 뉴클레오타이드들(120)을 포함한다. 혼입 시약 내의 각각의 뉴클레오타이드(120)는 화학 태그(이를테면, 형광 태그)를 포함하고, 이러한 화학 태그는 (예컨대, 여기 광에 의해) 여기될 때 식별 신호(이를테면, 형광 광)를 방출할 것이며, 이러한 식별 신호는 뉴클레오타이드(120)의 특정 염기를 식별할 것이다. 추가적으로, 혼입 시약 내의 각각의 뉴클레오타이드(120)의 염기는, 다른 염기들이 자신에 부착되는 것을 방지하는 분리가능한 종결자를 포함한다. 화학 반응들은 뉴클레오타이드들(120)이, 제1 폴리뉴클레오타이드(108)의 염기 서열(118)로, 한 번에 한 염기 쌍(122)씩 염기 쌍들(122)을 형성하는 것을 가능하게 한다.
[0051] 그러나, 시약 유동들 사이의 시약 교환이 충분하지 않으면, 시약들 사이의 교차 오염이 발생할 수 있다. 즉, 제1 시약이 제거되지 않고, 방법의 연속적인 제2 시약 유동으로 교환되면, 제1 시약은 제2 시약을 오염시킬 수 있다. 이는 프리-페이징으로서 알려진 현상으로 이어질 수 있고, 여기서, 다수의 태깅된 염기들은 각각의 사이클에 따라, 성장하는 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥에 부주의로 추가된다. 프리-페이징은 뉴클레오타이드들의 서열을 결정하는 방법의 정확도를 저하시킨다. 프리-페이징은 또한 누적되고, 여기서, 이러한 프리-페이징은 방법의 각각의 사이클에 따라 반복될 수 있으며, 각각의 사이클에 따라 정확도를 추가로 감소시킬 수 있다. 프리-페이징은 또한, 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드에 구축될 수 있는 염기들의 수를 감소(즉, 길이를 감소)시킬 것이고, 여기서, 그러한 염기들의 순서는 정확도의 허용가능한 정도 내에서 결정될 수 있다. 시약 교환은 특히, 불균일한 채널들을 갖는 유동 셀의 구역들, 또는 코너들과 같은 열악한 유체 유동 조건들을 갖는 구역들에서 난제일 수 있다.
[0052] 프리-페이징의 증가 외에도, 부적절한 시약 교환이 또한, 뉴클레오타이드들의 서열을 결정하기 위한 다양한 방법들의 정확도를 저하시킬 수 있는 다른 현상에 기여할 수 있다. 예컨대, 부적절한 시약 교환은 페이징(phasing)의 증가로 이어질 수 있고, 이 페이징에서는, 어떤 태깅된 염기들도 성장하는 상보적 제2 뉴클레오타이드에 추가되지 않는다. 또한, 부적절한 시약 교환은 필터를 통과하는 클러스터들의 백분율(이는 각각의 클러스터로부터의 신호 순도의 표시임)의 감소로 이어질 수 있다.
[0053] 추가로, RMS가 기기의 카트리지에 위치될 때, 시약 웰들의 시약 저장 용량이 카트리지의 공간적 제약들에 의해 제한될 수 있어서, 효율적인 시약 교환은 더 중요하다.
[0054] 도 2에 예시된 예에서, 방법은, 태깅된 뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-5)이 뉴클레오타이드들(118-1 내지 118-5)과 순차적으로 결합하여 상보적 염기 쌍들(122-1 내지 122-5)을 형성하는 것을 가능하게 했다. 뉴클레오타이드(120-6)는 서열에서 다음 차례에 있고, 뉴클레오타이드(118-6)와 결합(또는 페어링)되어 상보성 염기 쌍(122-6)을 형성할 것이다.
[0055] 일단 페어링되면, 뉴클레오타이드(120-6)의 화학 태그가 여기되어 식별 신호를 방출할 것이고, 이러한 식별 신호는 염기 쌍(122-6)을 식별할 것이다. 일단 식별되면, 후속 염기가 부착될 수 있도록, 뉴클레오타이드(120-6)의 염기에 부착된 종결자는 제거된다. 태깅된 뉴클레오타이드(120-6)는 제1 폴리뉴클레오타이드(108)와 이중 가닥인 성장하는 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥(110)에 추가된다.
[0056] 이에 따라서, 제1 폴리뉴클레오타이드들(108)의 클러스터에서의 염기(118) 서열을 결정하기 위해, 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥(110)은 한 번에 한 염기(120)씩 구축될 수 있다. 구축될 수 있는 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥(110)의 뉴클레오타이드들(120)의 수가 많을수록(즉, 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥 길이가 길어질수록), 제1 폴리뉴클레오타이드(108)의 클러스터에서의 뉴클레오타이드들의 순서에 관한 더 많은 데이터가 제공될 수 있고, 전체 분석이 더 빨라진다.
[0057] 도 3을 참조하면, 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드들의 순서를 결정하는 방법(130)의 단순화된 흐름도의 예가 도시된다. 방법(130)은, 혼입 단계(132), 이미징 단계(134), 절단 단계(136) 및 세척 단계(138)인 4 개의 기본 단계들을 포함한다.
[0058] 혼입 단계(132) 동안, 혼입 시약이 (도 7에서 가장 잘 보여지는) 기기(200)의 시약 관리 시스템(204) 및 유동 셀(202)을 통해 유동된다. 유동 셀(202)은 내부에 포지셔닝된 (도 2에서 가장 잘 보여지는) 제1 폴리뉴클레오타이드(108)를 갖는다. 혼입 시약은 (뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-5)과 연관된) 염기 서열에 (뉴클레오타이드(120-6)와 연관된) 제1 염기를 추가한다. 염기 서열(및 이 염기 서열과 연관된 뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-6))은 제1 뉴클레오타이드(108)에 상보적인 제2 폴리뉴클레오타이드(110)를 포함한다.
[0059] 더 구체적으로, 혼입 시약은 유동 셀(202)의 유동 채널(224)에 미리 고정되는 복제된 제1 폴리뉴클레오타이드들(108)의 클러스터들 위로 유동한다. 혼입 시약은 알려진 뉴클레오타이드들(120)을 포함하고, 여기서, 그러한 뉴클레오타이드들(120)의 염기들이 제1 폴리뉴클레오타이드들(108)의 염기들과 순차적으로 페어링되어, 제1 폴리뉴클레오타이드(108)에 상보적인 성장하는 제2 폴리뉴클레오타이드들(110)을 형성한다. 제1 폴리뉴클레오타이드(108)와 제2 폴리뉴클레오타이드(110)는, DNA 단편(fragment)들과 같은 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드들(112)을 형성한다. 제1 폴리뉴클레오타이드(108) 및 제2 폴리뉴클레오타이드(110)의 염기들의 유형들은 아데닌(A), 구아닌(G), 사이토신(C), 티민(T) 또는 유라실(U) 중 임의의 하나일 수 있다.
[0060] 혼입 시약 내의 뉴클레오타이드들(120)은 또한, 여기 신호(이 예에서, 여기 광)를 이용한 염기 유형의 식별을 가능하게 하는 태그(이 예에서, 형광 태그)를 포함한다. 뉴클레오타이드들(120)은 또한, 기술분야에서 알려진 절단가능한 종결자(또는 차단기(blocking group))를 포함하며, 이러한 절단가능한 종결자(또는 차단기)는 한 번에 제2 폴리뉴클레오타이드들(110)의 하나보다 많은 염기가 제1 폴리뉴클레오타이드들(108)의 염기들과 페어링되는 것을 방지한다.
[0061] 이미징 단계(14) 동안, 뉴클레오타이드(120-6)의 제1 염기가 제2 폴리뉴클레오타이드(110)에 추가된 후에, 뉴클레오타이드(120-6)의 제1 염기로부터 나오는 식별 신호의 이미지가 캡처된다.
[0062] 더 구체적으로, 제2 폴리뉴클레오타이드(110)와 연관된 뉴클레오타이드들(120)의 형광 태그들이 여기 광으로 여기되어, 특성 형광 광을 방출한다. 그런 다음, 성장하는 제2 폴리뉴클레오타이드(110)를 형성하는 뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-6)의 서열에서 새로 추가된 뉴클레오타이드(120-6)의 염기 유형을 식별하기 위해, 형광 광의 이미지가 찍힌다. 제2 폴리뉴클레오타이드(110)가 제1 폴리뉴클레오타이드(108)에 상보적이기 때문에, 제1 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드들(118)의 순서가 결정될 수 있다. 제2 폴리뉴클레오타이드(110)가 더 길게 성장될 수 있을수록, 제1 폴리뉴클레오타이드(108)의 뉴클레오타이드들(118)의 순서가 더 많이 결정될 수 있다.
[0063] 절단 단계(136) 동안, 절단 시약이 뉴클레오타이드(120-6)로부터 종결자를 제거하기 위해 시약 관리 시스템(204) 및 유동 셀(202)을 통해 유동된다. 이는, 뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-6)의 서열의 후속 뉴클레오타이드(미도시)가 제2 폴리뉴클레오타이드(110)에 추가되는 것을 가능하게 한다.
[0064] 세척 단계(138) 동안, 시약 관리 시스템(204) 및 유동 셀(202)로부터 절단 시약을 세척하기 위해, 완충 시약(또는 세척 시약)이 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 유동된다. 완충 시약은 유동 셀 및 시약 관리 시스템으로부터 의도되지 않은 화학물질들을 제거하기 위해 활용되는 화학물질들의 혼합물일 수 있다. 의도되지 않은 화학물질들은, 예컨대, 이전 단계로부터 남아 있는 활성 시약들(이를테면, 과잉 절단 시약들) 또는 이전 단계로부터의 부산물들로서 초래된 다양한 오염물들일 수 있다. 완충 시약은 예컨대 리포산이 추가된 완충 생리식염수(buffered saline solution)일 수 있다.
[0065] 본원에서 사용되는 순방향 유동은, 시약 관리 시스템(204)의 시약 웰들(232)로부터 유동 셀(202)로의 시약 유동의 방향을 지칭한다(도 7에서 가장 잘 보여짐). 본원에서 사용되는 역방향 유동은 유동 셀(202)로부터 시약 웰들(232)로의 시약 유동의 방향을 지칭한다.
[0066] 도 3의 예에서, 복수의 사이클들은, 완충 시약의 순방향 유동 방향(140) 및 연속적인 역방향 유동 방향(142)의 12 개의 반복 사이클들인 것으로서 예시된다. 그러나, 완충 시약은 임의의 횟수로, 순방향 유동 방향(140)으로, 그리고 그런 다음, 연속적인 역방향 유동 방향(142)으로 순환될 수 있다. 예컨대, 복수의 사이클들은 2 개, 4 개, 6 개, 12 개 또는 그 초과의 사이클들일 수 있다.
[0067] 세척 단계(138) 동안의 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향(140) 및 역방향 유동 방향(142)은, 동일한 유한 볼륨의 완충 시약을 활용하는 이전 방법들보다, 절단 단계(136) 동안 시스템 안으로 유입되는 절단 시약의 더 철저한 제거(즉, 시약 교환)를 가능하게 한다. 그 이유는, 이전 방법들은 세척 단계 동안 순방향으로만 시약을 유동시켰기 때문이다. 따라서, 이전 방법들에서, 동일한 완충 시약이 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 한 번만 통과할 것이고, 세척 단계 동안 절단 시약을 충분히 제거하지 않을 수 있다. 그러한 조건들 하에서, 후속 혼입 단계 동안, 후속 혼입 시약은 남아 있는 절단 시약으로 오염되어질 수 있다. 그런 다음, 남아 있는 절단 시약은 후속 혼입 단계 동안 뉴클레오타이드들로부터 종결자들을 조기에 제거할 수 있다. 이는, 바람직하지 않은 양(amount)의 프리-페이징을 가능하게 할 수 있고, 여기서, 하나보다 많은 염기가 한 번에, 성장하는 제2 폴리뉴클레오타이드에 부착된다.
[0068] 프리-페이징이 각각의 새로운 사이클에 따라 누적되도록 허용되면, 폴리뉴클레오타이드들에서의 염기들의 순서에서 상당한 불확실성이 발생할 수 있다. 불확실성은 각각의 사이클에 걸쳐 증가할 수 있으며, 이는 폴리뉴클레오타이드 가닥이 성장함에 따라 획득될 수 있는 데이터의 정확도를 감소시킬 수 있다. 이에 따라서, 성장될 수 있는 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥의 염기들의 순서가 합리적인 정도의 정확도로 결정될 수 있도록 하는, 이러한 제2 폴리뉴클레오타이드 가닥의 전체 길이가 프리-페이징에 의해 제한될 수 있다.
[0069] 이에 비해, 본 개시내용의 복수의 사이클들의 순방향 유동 방향(140) 및 역방향 유동 방향(142)은, 동일한 완충 시약이 더 철저한 세척을 위해 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 여러 번 통과하는 것을 가능하게 한다. 일 예에서, 본원에서 설명되는 바와 같이 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향을 사용하는 것은, 특히, 예컨대 공간 및/또는 비용 제약들에 기인하여 완충 시약의 볼륨을 증가시키는 것이 바람직하지 않은 경우, 유한 볼륨의 완충 시약의 더 효율적인 사용을 제공할 수 있다. 그 결과, 주어진 수준의 시약 교환을 달성하기 위해 더 적은 완충 시약이 필요할 수 있다.
[0070] 본원에서 사용되는 연속적인 순방향 유동 방향(140) 및 역방향 유동 방향(142)은, 개입(intervening) 단계들 없이, 서로 인접하게 발생하는 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향을 지칭한다. 개입 단계들이 없다는 것은, 시약의 순방향 유동과 시약의 역방향 유동 사이에는 유동이 없는 실질적인 인큐베이션 기간(또는 지연 시간)이 없다는 것을 지칭한다.
[0071] 이에 따라서, 순방향 유동 방향(140)으로 유동시키는 것과 역방향 유동 방향(142)으로 유동시키는 것은, 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향에 대해, 약 1 초 이하, 약 200 밀리초 이하, 또는 약 100 밀리초 이하의 지연 시간만큼 분리되어야 한다. 추가적으로, 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향은 약 1 초 이하, 약 200 밀리초 이하, 또는 약 100 밀리초 이하의 지연 시간에 의해 분리되어야 한다.
[0072] 일 예에서, (도 7에서 가장 잘 보여지는) 시약 관리 시스템(204)에 있는 시약 웰들(232)의 오염을 방지하기 위하여, 순방향 유동 방향(140)으로 유동하는 완충 시약의 볼륨은 역방향 유동 방향으로 유동하는 완충 시약의 볼륨보다 더 커야 한다. 다시 말해서, 세척 단계 동안 시약 웰들의 오염을 방지하기 위하여:
복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향으로 완충 시약의 제1 순방향 유동 볼륨(제1 FFV)이 유동되며; 그리고
복수의 사이클들의 각각의 사이클의 역방향 유동 방향으로 완충 시약의 제2 역방향 유동 볼륨(제2 RFV)이 유동되고, 제1 순방향 유동 볼륨은 제2 역방향 유동 볼륨보다 더 크다. 더 구체적으로, 제1 순방향 유동 볼륨(제1 FFV)은 제2 역방향 유동 볼륨(제2 RFV)보다 약 3% 이상만큼 더 클 수 있다.
[0073] 복수의 순방향 유동 방향(140) 및 역방향 유동 방향(142)이 발생한 후에, 세척 단계(138)는 인큐베이션 기간(144)으로 진행한다. 인큐베이션 기간(144)은 시약 관리 시스템(204) 및 유동 셀(202)을 통한 완충 시약의 유동이 실질적으로 없는 기간이다. 인큐베이션 기간(144)은 복수의 사이클들(140, 142)의 마지막 사이클이 발생한 후에 약 10 초 이상의 지속기간을 가질 수 있다.
[0074] 인큐베이션 기간(144) 후에, 세척 단계(138)는 제3 순방향 유동(146)으로 진행한다. 즉, 인큐베이션 기간(144) 후에 순방향 유동 방향으로 완충 시약의 제3 순방향 유동 볼륨(제3 FFV)이 유동된다. 인큐베이션 기간(144) 및 제3 순방향 유동(146)은 시약 관리 시스템 또는 유동 셀의 에지들에서 발생할 수 있는 균열들로부터 절단 시약을 확산시키는 데 도움이 될 수 있다.
[0075] 그런 다음, 세척 단계(138)의 완료 후에, 방법은, 뉴클레오타이드들의 서열에서 다음 차례의 뉴클레오타이드(120)를 제2 폴리뉴클레오타이드(110)에 추가하는 프로세스를 시작하기 위해, 혼입 단계(132)로 다시 순환한다(148).
[0076] 일부 기존 방법들에서는, 완충 시약이 세척 단계 동안 순방향으로만 유동되기 때문에, 세척 단계 동안 소모되는 완충 시약의 총량(총 유체 소모량)은 본질적으로, 세척 단계 동안 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 스윕된 완충 시약 볼륨의 총량(총 스윕 볼륨)과 동일하다. 이에 비해, 본 개시내용의 방법에서, 총 스윕 볼륨은 세척 단계 동안 총 유체 소모량보다 몇 배 더 클 수 있다.
[0077] 더 구체적으로, 완충 시약을 유동시키는 단계(세척 단계) 동안의 완충 시약의 총 스윕 볼륨은 식 ((제1 FFV + 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정되고, 여기서,
제1 FFV는 제1 순방향 유동 볼륨이고,
제2 RFV는 제2 역방향 유동 볼륨이고,
N은 복수의 사이클들의 총 사이클 수이며, 그리고
제3 FFV는 제3 순방향 유동 볼륨이다.
추가적으로, 완충 시약을 유동시키는 단계(세척 단계) 동안의 완충 시약의 총 유체 소모량은 식 ((제1 FFV - 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정된다.
전술된 유형의 식에 사용된 "실질적으로 결정된"이란 용어는 제1 FFV, 제2 RFV 및 제3 FFV와 같은 파라미터들을 결정할 때 발생할 수 있는 측정 허용오차(tolerance)들을 설명 및 고려하기 위해 사용된다.
[0078] 동일한 볼륨의 완충 시약이 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 여러 번 통과할 수 있기 때문에, 완충 시약의 총 유체 소모량에 대한 완충 시약의 총 스윕 볼륨의 비는 실질적으로 1보다 더 클 수 있다. 더 구체적으로, 완충 시약의 총 유체 소모량에 대한 완충 시약의 총 스윕 볼륨의 비는 약 6, 약 10, 약 12 또는 그 초과일 수 있다.
[0079] 카트리지 기반 기기 시스템에서, 시약 관리 시스템 및/또는 유동 셀은 카트리지에 포지셔닝될 수 있다. 카트리지는 기기에 제거가능하게 삽입가능할 수 있는데, 이는 카트리지가 기기로부터 삽입되고 제거될 수 있다는 것을 의미한다.
[0080] 따라서, 카트리지 기반 기기 시스템에서, 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 큰 비(2, 6, 10, 12 또는 그 초과)가 특히 유리할 수 있다. 그 이유는, 혼입 시약, 절단 시약 및 완충 시약이 시약 관리 시스템의 시약 웰들에 저장될 수 있고, 시약 관리 시스템이 카트리지의 일부일 수 있기 때문이다. 이에 따라서, 시약 관리 시스템의 시약 웰들은, 카트리지에 맞춰지기(fit) 위하여 각각의 시약의 유한 총 볼륨을 저장하도록 구성될 수 있다. 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 큰 비는, 동일한 유한 볼륨의 시약이 소모되기 전에 시약 관리 시스템 및 유동 셀에 걸쳐 여러 번 스위핑되어서(swept), 시약 교환을 향상시키는 것을 가능하게 한다.
[0081] 도 4를 참조하면, 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드들의 순서를 결정하는 다른 방법(150)의 흐름도의 예가 도시된다. 방법(150)은, 혼입 단계(152), 이미징 단계(154), 절단 단계(156) 및 세척 단계(158)를 포함한다.
[0082] 혼입 단계(152) 동안, 혼입 시약(160)이 (도 7에서 가장 잘 보여지는) 기기(200)의 시약 관리 시스템(204) 및 유동 셀(202)을 통해 유동된다. 혼입 시약은 형광 표지된(fluorescently-labeled) 뉴클레오타이드들을 DNA 가닥들에 혼입시키는 화학물질들의 혼합물일 수 있다.
[0083] 유동 셀(202)은 내부에 포지셔닝된 (도 2에서 가장 잘 보여지는) 제1 폴리뉴클레오타이드(108)를 갖는다. 혼입 시약은 (뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-5)과 연관된) 염기 서열에 (뉴클레오타이드(120-6)와 연관된) 제1 염기를 추가한다. 염기 서열(및 이 염기 서열과 연관된 뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-6))은 제1 뉴클레오타이드(108)에 상보적인 제2 폴리뉴클레오타이드(110)를 형성한다.
[0084] 혼입 시약 내의 뉴클레오타이드들(120)은 또한, 여기 신호(이 예에서, 여기 광)를 이용한 염기 유형의 식별을 가능하게 하는 태그(이 예에서, 형광 태그)를 포함한다. 뉴클레오타이드들(120)은 또한, 기술분야에서 알려진 절단가능한 종결자(또는 차단기)를 포함하며, 이러한 절단가능한 종결자(또는 차단기)는 한 번에 제2 폴리뉴클레오타이드들(110)의 하나보다 많은 염기가 제1 폴리뉴클레오타이드들(108)의 염기들과 페어링되는 것을 방지한다.
[0085] 다음 차례로, 혼입 단계(152) 동안, 세척 시약(162)이 임의의 과잉 혼입 시약(160)을 제거하기 위해 사용된다. 세척 시약은 유동 셀로부터 활성 시약들을 제거하기 위해 활용되는 화학물질들의 혼합물일 수 있다.
[0086] 방법은 이미지 단계(154)로 진행하며, 여기서, 이미지가 찍히기 전에 포토 손상으로부터 유동 셀 표면을 보호하기 위해 스캔 시약(164)이 사용된다. 스캔 시약(164)은 검출 프로세스 동안 뉴클레오타이드 가닥들을 안정화시키는 화학물질들의 혼합물일 수 있다.
[0087] 다음 차례로, 이미징 단계(154) 동안, 뉴클레오타이드(120-6)의 제1 염기가 제2 폴리뉴클레오타이드(110)에 추가된 후에, 뉴클레오타이드(120-6)의 제1 염기로부터 나오는 식별 신호의 이미지가 캡처된다(166).
[0088] 더 구체적으로, 제2 폴리뉴클레오타이드(110)와 연관된 뉴클레오타이드들(120)의 형광 태그들이 여기 광으로 여기되어, 특성 형광 광을 방출한다. 그런 다음, 성장하는 제2 폴리뉴클레오타이드(110)를 형성하는 뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-6)의 서열에서 새로 추가된 뉴클레오타이드(120-6)의 염기 유형에 관한 식별 정보를 제공하기 위해, 형광 광의 이미지가 찍힌다.
[0089] 다음 차례로, 이미징 단계(154) 동안, 새로 추가된 뉴클레오타이드(120-6)에 제2 태그를 부착하기 위해 추가 태깅 시약(168)이 사용된다. 태깅 시약(168)은 형광 태그를 뉴클레오타이드에 전달하기 위해 활용되는 화학물질들의 혼합물일 수 있다.
[0090] 다음 차례로, 이미징 단계(154) 동안, 세척 시약(170)이 과잉 태깅 시약(168)을 제거하기 위해 사용된다. 세척 시약(170)은 유동 셀로부터 활성 시약들을 제거하기 위해 활용되는 화학물질들의 혼합물일 수 있다.
[0091] 다음 차례로, 이미징 단계(154) 동안, 제2 이미지가 찍히기 전에 포토 손상으로부터 유동 셀 표면을 보호하기 위해 제2 스캔 시약(172)이 적용된다. 제2 스캔 시약은 검출 프로세스 동안 뉴클레오타이드 가닥들을 안정화시키는 화학물질들의 혼합물일 수 있다.
[0092] 다음 차례로, 이미징 단계(154) 동안, 뉴클레오타이드(120-6)의 제1 염기로부터 나오는 제2 식별 신호의 제2 이미지가 캡처된다(174). 더 구체적으로, 제2 폴리뉴클레오타이드(110)와 연관된 뉴클레오타이드들(120)의 제2 형광 태그들이 여기 광으로 여기되어, 제2 특성 형광 광을 방출한다. 그런 다음, 새로 추가된 뉴클레오타이드(120-6)의 염기 유형에 관한 추가 식별 정보를 제공하기 위해 제2 형광 광의 이미지가 찍힌다.
[0093] 방법은 절단 단계(156)로 진행하며, 여기서, 세척 시약(176)이 임의의 과잉 제2 스캔 시약(172)을 제거하기 위해 사용된다. 세척 시약은 유동 셀로부터 활성 시약들을 제거하기 위해 활용되는 화학물질들의 혼합물일 수 있다.
[0094] 다음 차례로, 절단 단계(156) 동안, 절단 시약(178)이 뉴클레오타이드(120-6)로부터 종결자를 제거하기 위해 시약 관리 시스템(204) 및 유동 셀(202)을 통해 유동된다. 이는, 뉴클레오타이드들(120-1 내지 120-6)의 서열의 후속 뉴클레오타이드(미도시)가 제2 폴리뉴클레오타이드(110)에 추가되는 것을 가능하게 한다.
[0095] 방법은 세척 단계(158)로 진행하며, 여기서, 시약 관리 시스템(204) 및 유동 셀(202)로부터 절단 시약(178)을 세척하기 위해, 제1 완충 시약이 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 유동된다. 제1 완충 시약은 예컨대 리포산이 추가된 완충 생리식염수일 수 있다.
[0096] 더 구체적으로, 복수의 사이클들의 각각의 사이클을 시작하기 위해, 순방향 유동 방향(180)으로 제1 완충 시약의 22
Figure pct00001
(microliter)의 제1 순방향 유동 볼륨(제1 FFV)이 유동된다. 그런 다음, 복수의 사이클들의 각각의 사이클을 끝내기 위해, 역방향 유동 방향(182)으로 제1 완충 시약의 19
Figure pct00002
(microliter)의 제2 역방향 유동 볼륨(제2 RFV)이 유동된다. 도 4의 이 구체적인 예에서, 총 12 개의 사이클들의 순방향 유동 및 역방향 유동이 있다.
[0097] 다음 차례로, 세척 단계(158) 동안, 시약 관리 시스템(204) 및 유동 셀(202)을 통한 제1 완충 시약의 유동이 실질적으로 없는 인큐베이션 기간(184)이 시스템에 부과된다. 이 특정 예에서 인큐베이션 기간(184)은 약 30 초의 지속기간을 갖지만, 다른 인큐베이션 기간들이 사용될 수 있다.
[0098] 인큐베이션 기간(184) 후에, 세척 단계(158)는 제3 순방향 유동(186)으로 진행한다. 즉, 인큐베이션 기간(184) 후에 순방향 유동 방향으로 제1 완충 시약의 12
Figure pct00003
(microliter)의 제3 순방향 유동 볼륨(제3 FFV)이 유동된다.
[0099] 제1 완충 시약은 시스템으로부터 절단 시약(178)을 실질적으로 제거하기 위해 세척 단계(158)에서 활용된다. 그러나, 절단 시약(178)을 제거하는데 효과적인 제1 완충 시약의 특정 화학물질들이 또한, 다음 차례의 사이클의 혼입 시약을 간섭할 수 있다. 그러한 화학물질의 하나의 그러한 예는 리포산일 수 있다.
[00100] 이에 따라서, 세척 단계(158) 동안, 제2 완충 시약(188)의 순방향 유동이 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 유동되어 제1 완충 시약을 제거한다. 제2 완충 시약은 리포산이 없는 생리식염수일 수 있다. 제2 완충 시약은 절단제(cleave agent)의 제거에 중요하지 않지만, 다음 차례의 사이클에서 혼입 시약(160)을 간섭하지 않을 것이다.
[00101] 그런 다음, 세척 단계(158)의 완료 후에, 방법은, 뉴클레오타이드들의 서열에서 다음 차례의 뉴클레오타이드(120)를 제2 폴리뉴클레오타이드(110)에 추가하는 프로세스를 시작하기 위해, 혼입 단계(152)로 다시 순환한다(190).
[00102] 본원에서 앞서 진술된 바와 같이, 세척 단계 동안의 제1 완충 시약의 총 스윕 볼륨은 식 ((제1 FFV + 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정되고, 여기서,
제1 FFV는 제1 순방향 유동 볼륨이고, 22
Figure pct00004
과 동일하며,
제2 RFV는 제2 역방향 유동 볼륨이고, 19
Figure pct00005
과 동일하며,
N은 복수의 사이클들의 총 사이클 수이고, 12와 동일하며, 그리고
제3 FFV는 제3 순방향 유동 볼륨이고, 12
Figure pct00006
과 동일하다.
이에 따라서, 도 4의 예에서, 총 스윕 볼륨은 (22+19)*12+12=504
Figure pct00007
과 동일하다.
[00103] 추가적으로, 세척 단계 동안의 제1 완충 시약의 총 유체 소모량은 식 (제1 FFV - 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정된다.
이에 따라서, 도 4의 예에서, 총 유체 소모량은 (22-19)*12+12=48
Figure pct00008
과 동일하다.
[00104] 부가적으로, 도 4의 예에서, 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 비는 504/48=10.5와 동일하다. 비교로, 이전 시스템들의 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 비는 본질적으로 1이다. 그 이유는, 이전 시스템들이 절단 시약의 제거에 효과적인 완충 시약의 순방향 유동만을 활용하기 때문이다.
[00105] 도 5 및 도 6은 비-제한적인 작업 예로부터 획득된 결과들을 도시한다.
[00106] 도 5를 참조하면, 방법(150)의 예시적인 세척 단계(158) 동안 획득된 제1 완충 시약의 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 다양한 비들의 작업 예를 보여주는 표(190)가 도시된다. 행들(190-1 내지 190-7)에서, 총 유체 소모량은 48
Figure pct00009
로 일정하게 유지되었다. 또한, 총 유체 소모량이 48
Figure pct00010
로 일정하게 유지된 반면, 행들(190-2 내지 190-7)에서, 제1 순방향 유동 볼륨(제1 FFV), 제2 역방향 유동 볼륨(제2 RFV), 사이클 수(N) 및 제3 순방향 유동 볼륨(제3 FFV)은 총 스윕 볼륨을 100
Figure pct00011
로부터 1200
Figure pct00012
로 증가시키도록 변화되었다. 알 수 있는 바와 같이, 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 비는 (행(190-2)의) 2.08로부터 (행(190-7)의) 25로 변화되었다.
[00107] 최상단 행(190-1)은 이전 방법의 비교 예를 표현하고, 여기서, 완충 시약의 역방향 유동 및 순방향 유동의 순환(cycling)은 없다. 오히려, 행(190-1)은 세척 단계 동안 순방향 유동만 갖고, 이에 따라 총 스윕 볼륨은 총 유체 소모량과 동일했다.
[00108] 도 6을 참조하면, 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 도 5의 작업 예에서 획득된 데이터로부터 플롯된, 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨들 대 프리-페이징 기울기의 비들의 그래프들(192, 194)이 도시된다. 그래프(194)는 주위 온도(예컨대, 섭씨 25도 내지 35도 범위 내의 주위 온도)에서 플롯되었다. 그래프(192)는 주위 온도 더하기 섭씨 8도(예컨대, 섭씨 33도 내지 43도 범위 내의 온도)에서 플롯되었다.
[00109] 그래프들(192 및 194)에 표시된 프리-페이징 기울기는, 사이클당 1 개 염기 쌍만큼 선행하는 유동 셀의 폴리뉴클레오타이드들 클러스터들에 있는 분자들의 백분율(%)로서 표현된다. 프리-페이징 기울기는 사이클당 프리-페이징의 레이트의 척도(measure)이다.
[00110] 프리-페이징 값들이 낮을수록, 본원의 방법들의 프로세싱 동안 주어진 폴리뉴클레오타이드 길이에서 데이터 품질이 더 우수하다. 부가적으로, 프리-페이징 값들이 낮을수록, 성장될 수 있는 폴리뉴클레오타이드들이 길어진다.
[00111] 그래프들(192 및 194)로부터 결정될 수 있는 바와 같이, 최저 프리-페이징 기울기 백분율이 달성될 수 있는, 총 유체 소모량에 대한 총 스윕 볼륨의 비에 대한 최적 범위는 약 6 이상이다. 도 5의 작업 예의 플롯된 데이터의 그래프들(192, 194)로부터 결정될 수 있는 대안적인 최적 범위는 또한, 약 6 내지 약 12일 것이다.
[00112] 최적 범위들은 낮은 프리-페이징 기울기들과 연관된다. 도 6의 작업 예의 대부분의 경우들에서, 최적 범위들은 2.0% 미만인 프리-페이즈 기울기 백분율(pre-phase slope percentage)들과 연관된다. 그러한 낮은 프리-페이즈 기울기 백분율들은, 허용가능한 정확도 내에서, 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드(110)가 유한 양의 시약으로 앞서 획득된 것보다 더 긴 길이들의 염기들을 구축하는 것을 가능하게 하는, 도 5 및 도 6의 작업 예로부터 획득된 놀라운 결과들을 제공했다. 도 5 및 도 6의 작업 예에서, 카트리지 기반 기기 시스템들은, 높은 시간 백분율(예컨대, 시간의 90% 초과)로 200 개 이상 염기들의 길이들까지 상보적 제2 폴리뉴클레오타이드들(110)을 정확하게 구축할 수 있었다. 그러므로, 제1 폴리뉴클레오타이드(108)와 제2 폴리뉴클레오타이드(110)의 염기 쌍들은 또한, 해당하는 동일한 높은 시간 백분율로 200 개 이상의 염기 쌍들의 길이들까지 정확하게 구축될 수 있었다.
[00113] 도 7을 참조하면, 본원에서 개시되는 양상들에 따른, 기기(200)의 개략도의 예가 도시된다. 이 특정 예에서, 기기는 내부에 맞물려진 카트리지(230)를 포함한다. 카트리지(230)는 시약 관리 시스템(RMS; reagent management system)(204)과 유체 연통하는 유동 셀(202)을 포함한다. 이 특정 예에서, RMS(204)는 중간 연결(206)을 통해 유동 셀(202)과 유체 연통한다. 카트리지(230)는 기기(200)에 제거가능하게 삽입가능할 수 있는데, 이는 카트리지가 기기로부터 삽입되고 제거될 수 있다는 것을 의미한다.
[00114] 심지어 이러한 도 7의 예가 카트리지(230)에 포함되는 RMS(204) 및 유동 셀(202)을 갖는 카트리지-기반 기기(200)를 예시하더라도, 다른 기기들(200)은 그러한 카트리지-기반 시스템을 포함하지 않을 수 있다. 오히려, 일부 기기들(200)에서, RMS(204)의 구성요소들은 기기(200) 내에 일체로 견고하게 장착될 수 있고, 유동 셀(202)만이 기기(200)로부터 분리가능할 수 있다. 계속해서 추가로, 유동 셀(202)은 카트리지(230)로부터 분리가능할 수 있거나 또는 분리가능하지 않을 수 있다.
[00115] RMS는 복수의 시약 웰들(232)을 포함한다. 각각의 시약 웰(232)은 내부에 포지셔닝된 복수의 시약들(208-218) 중의 시약을 포함하도록 동작가능하다. RMS(204)는 복수의 시약들(208-218) 중 하나로부터의 시약 유동(234)을 선택하도록 동작가능하다.
[00116] RMS는 또한, 시약 유동(234)을 순방향으로 그리고 역방향으로 지향시키도록 동작가능하다. 본원에서 사용되는 순방향 유동은, 시약 웰들(232)로부터 유동 셀(202)로의 시약 유동(234)의 방향을 지칭한다. 본원에서 사용되는 역방향 유동은 유동 셀(202)로부터 시약 웰들(232)로의 시약 유동(234)의 방향을 지칭한다.
[00117] 시약들(208-218)은 유동 셀에서 수행되어야 하는 화학 반응들의 유형 및 서열에 따라 시약들의 여러 유형들 또는 조합들 중 임의의 것일 수 있다. 예컨대, 시약들(208-218)은 다음의 유형들일 수 있다:
시약(208 및 209)은 혼입 시약의 상이한 제제(formulation)들일 수 있다.
시약(210 및 211)은 스캔 시약의 상이한 제제들일 수 있다.
시약(212)은 절단 시약일 수 있다.
시약(214 및 216)은 완충 시약의 상이한 제제들일 수 있다.
시약(218)은 공기일 수 있다.
[00118] 연결(206)은 RMS 출구 포트(256)를 통해 RMS(204)와 유체 연통하는 제1 채널(236)을 포함한다. 제1 채널(236)은 유동 셀(202)의 입구 포트(220)를 통해 유동 셀(202)의 유동 채널(224) 안으로 시약 유동(234)을 라우팅하도록 동작가능하다. 연결(206)은 또한, 유동 셀(202)의 출구 포트(222)를 통해 유동 채널(224)과 유체 연통하는 제2 채널(238)을 포함한다. 제2 채널(238)은, 시약 유동(234)이 유동 채널(224)을 통과한 후에, 유동 셀(202)로부터 RMS 입구 포트(258)를 통해 다시 RMS(204)로 시약 유동(234)을 라우팅하도록 동작가능하다.
[00119] 기기(200)의 유동 셀(202)은, 입구 포트(220)를 통해 제1 채널(236)과 유체 연통하고 출구 포트(222)를 통해 제2 채널(238)과 유체 연통하는 유동 채널(224)을 포함한다. 유동 채널(224)은, 유동 채널(224)에 포지셔닝된, 도 2의 폴리뉴클레오타이드들(108)과 같은 폴리뉴클레오타이드들과 복수의 시약들(208-218)로부터의 다양한 시약 유동들(234) 사이의 다양한 화학 반응들을 수행하도록 동작가능하다.
[00120] 도 7의 예가 단일 입구 포트(220) 및 단일 출구 포트(222)를 갖는 유동 셀(202)을 예시하지만, 다른 구성들의 유동 셀들이 또한 활용될 수 있다. 예컨대, 유동 셀(202)은 연결(206)의 다수의 채널들로부터 시약 유동들을 수용하기 위한 다수의 입구 포트들(220)을 포함할 수 있다. 또한, 예로서, 유동 셀은 연결(206)의 다수의 채널들로 시약 유동을 라우팅하기 위한 다수의 출구 포트들(222)을 포함할 수 있다.
[00121] 도 7의 예가 중간 연결(206)을 통해 RMS(204)와 유체 연통하는 유동 셀(202)을 예시하지만, 유동 셀(202)은 대안적으로, 유동 셀(202)과 RMS(204) 사이의 연결(206) 없이, RMS(204)에 직접적으로 연결될 수 있다. 즉, RMS 출구 포트(256)는 유동 셀 입구 포트(220)에 직접적으로 연결될 수 있고, RMS 입구 포트(258)는 유동 셀 출구 포트(222)에 직접적으로 연결될 수 있다.
[00122] 이 예에서, RMS(204)는 시약들(208-218)을 선택하기 위한 회전 밸브(242)를 포함한다. 회전 밸브(242)는 내부 회전 밸브 본체(244)를 갖는다. 밸브 본체(244)는 중심 포트(246) 및 회전가능 포트(248)를 포함하고, 중심 포트(246)와 회전가능 포트(248)는 회전 채널(250)에 의해 연결된다. 밸브 본체(244)는 회전가능 포트(248)를 이동시키기 위해 중심 포트(246)를 중심으로 피벗(pivot)한다.
[00123] 시약들(208-218)을 포함하는 복수의 시약 웰들(232)은 회전 밸브(242)의 주변부 주위에 배치되거나 또는 그렇지 않으면 회전 밸브(242)로부터 멀리 배치될 수 있다. 각각의 시약 웰(232)은 대응하는 웰 채널(252)과 유체 연통한다. 각각의 웰 채널(252)은, 임의의 주어진 시약 웰(232)로부터 시약 유동(234)을 수용하기 위하여 회전 밸브(242)의 회전가능 포트(248)와 정렬될 수 있는 웰 채널 포트(254)를 포함한다.
[00124] 회전가능 포트(248)가 웰 채널 포트들(254) 중 하나와 정렬될 때, 시약 유동(234)이 선택된 웰(232)로부터 웰 채널(252)을 통해, 회전 밸브(242)를 통해, 공통 라인(255)을 통해 RMS 출구 포트(256) 밖으로 유동할 수 있게 하는, 시약 유동(234)을 위한 설정된다. 그런 다음, 시약 유동(234)은 제1 채널(236)을 통해 유동 셀(202)의 입구 포트(220)로, 그리고 유동 채널(224)을 통해 계속되고, 이 유동 채널(224)에서, 복수의 시약들(208-218) 중 선택된 시약이 폴리뉴클레오타이드들(108)과 반응할 수 있다.
[00125] 반응의 부산물들 및/또는 반응되지 않은 시약들은 유동 셀(202)의 출구 포트(222)로부터 제2 채널(238)을 통해 유동할 수 있다. 그런 다음, 시약 유동(234)은 RMS 입구 포트(258)를 통해 RMS(204)에 다시 들어갈 수 있다.
[00126] RMS(204)의 RMS 입구 포트(258)는 제1 핀치 밸브(260)와 유체 연통한다. 제1 핀치 밸브(260)는 제2 핀치 밸브(262)와 유체 연통한다. 제1 핀치 밸브(260) 및 제2 핀치 밸브(262)는, 핀치 밸브들(260, 262)을 통해 시약 유동(234)을 핀치 오프(pinch off)하거나 또는 릴리즈하도록 기계적으로 또는 공압적으로 작동될 수 있는 탄력 있는 중심 부분을 포함한다. 추가적으로, 이 예에서 핀치 밸브들(260, 262)이 예시되지만, 다른 유형들의 밸브들이 동일한 기능을 수행하기 위해 활용될 수 있다. 예컨대, 밸브들(260, 262)은 회전 밸브들일 수 있다.
[00127] 온보드 펌프(onboard pump)(264)(이를테면, 실린지 펌프, 또는 유사한 펌프)가 또한, RMS(204) 상에 배치된다. 심지어 온보드 펌프(264)가 다른 유형들의 펌프들일 수 있지만, 온보드 펌프(264)는 본원에서 실린지 펌프(264)로 지칭될 것이다. 실린지 펌프(264)는 제1 핀치 밸브(260)와 제2 핀치 밸브(262) 사이의 티 형성물(tee formation)에 연결된다. 핀치 밸브들(260, 262) 둘 모두는, 유동 셀(202) 및/또는 폐기물 탱크(270)로부터 실린지 펌프(264)를 맞물림하거나 또는 맞물림해제하도록 기기(200)에 의해 개폐된다.
[00128] 실린지 펌프(264)는 실린더(268)에 배치된 왕복 플런저(reciprocating plunger)(266)를 포함하고, 실린더(268)는 실린더 보어(270)를 갖는다. 플런저(266)는 플런저-실린더 보어 밀봉부를 형성하도록 실린더 보어(270) 내에 수용된다. 플런저(266)는, 실린더 보어(270) 내에서 왕복하고 시약 웰들(232)로부터 폐기물 탱크(272)로의 순방향 유동 방향으로 시약들(208-218)을 펌핑하도록 기기(200)에 의해 구동된다.
[00129] 시약 웰들(232)로부터 유동 셀(202)로 그리고 펌프(264)로의 순방향으로 시약 유동(234)을 펌핑하도록 기기(200)가 동작가능한 것에 추가하여, 기기(200)는 시약 유동(234)을 역방향으로 펌핑하도록 동작가능할 수 있다. 즉, 시약들(208-218)은, 펌프(264)로부터 유동 셀(202)로 그리고 시약 웰들(232)로의 역방향 유동 방향으로 펌핑될 수 있다. 이에 따라서, 기기는, 예컨대, 도 3의 방법(130) 및 도 4의 방법(150)에 따라, 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 RMS(204) 및 유동 셀(202)을 통해 완충 시약들(214, 216)을 유동시키도록 동작가능하다.
[00130] 기기(200)는 또한, 검출 모듈(226)을 포함하고, 검출 모듈(226)은 광의 광자들 또는 다른 형태들의 검출가능한 특성들을, 시약들(208-218)에 의해 유발된 화학 반응이 폴리뉴클레오타이드들(108)이 그러한 검출가능한 특성들에 영향을 미치도록 유도할 때 검출하도록 동작가능하다.
[00131] 도 7에 예시된 구현이 공통 라인(255)을 통해 유동 셀(202)로 다양한 시약들(208-218)을 라우팅하는 회전 밸브(242)를 활용하는 기기(200)의 구현이지만, 다른 기기들(200)은 회전 밸브(242)를 활용하지 않을 수 있다. 예컨대, 각각의 시약 웰(232)로부터의 웰 채널들(252)은 복수의 별개의 RMS 출구 포트들(256) 중 하나로 직접적으로 연장될 수 있다.
[00132] 이 경우, 웰 채널들(252) 각각은 각각의 시약 웰(232)로부터의 시약 유동(234)을 제어하기 위한 밸브(미도시)를 포함할 수 있다. 추가적으로, 제1 채널(236)은, 대응하는 RMS 출구 포트(256)로부터 대응하는 시약 유동(234)을 각각 수용하기 위한 복수의 제1 채널들일 수 있다. 게다가, 유동 셀(202)의 입구 포트(220)는 복수의 제1 채널들(236) 각각으로부터 다양한 시약 유동들(234)을 수용하기 위한 복수의 입구 포트들(220)일 수 있다.
[00133] 도 8을 참조하면, 도 7의 기기(200)의 개략적인 블록 다이어그램의 예가 도시된다. 기기(200)는 카트리지(230)를 수용하기 위한 도킹 스테이션(274)을 포함한다. 기기(200) 내의 다양한 전기 및 기계 조립체들이, 유동 셀(202)에서 수행되는 다양한 화학 반응들의 미세유체 분석 동작 동안 카트리지(230)를 동작시키기 위해 카트리지와 상호작용한다.
[00134] 기기(200)는, 무엇보다도, 미세유체 분석 동작들을 수행하기 위하여 메모리(278)에 저장된 프로그램 명령들을 실행하려는 하나 이상의 프로세서들(276)을 포함할 수 있다. 프로세서들은 회전 밸브 구동 조립체(280), 실린지 펌프 구동 조립체(282), 핀치 밸브 구동 조립체(284), 검출 모듈(226) 및 온도 조절 조립체(306)와 전자 통신한다.
[00135] 사용자 인터페이스(286)는 사용자들이 기기(200)의 동작을 제어 및 모니터링하도록 제공된다. 통신 인터페이스(288)는 기기(200)와 원격 컴퓨터들, 네트워크들 등 사이에서 데이터 및 다른 정보를 전달할 수 있다.
[00136] 회전 밸브 구동 조립체(280)는 회전 밸브 인터페이스 브라켓(292)에 기계적으로 커플링되는 구동 샤프트(290)를 포함한다. 회전 밸브 인터페이스 브라켓(292)은 카트리지(230)의 회전 밸브(242)에 선택적으로 기계적으로 커플링된다. 회전 밸브 구동 조립체(280)는 회전 모터(294), 그리고 일부 구현들에서 병진 모터(296)를 포함한다. 병진 모터(296)는, 회전 밸브(242)와의 맞물림 상태와 맞물림해제 상태 사이에서 병진 방향으로 구동 샤프트(290)를 이동시킬 수 있다. 회전 모터(294)는 회전 밸브(242)의 회전 밸브 본체(244)의 회전(rotation)을 관리한다.
[00137] 회전 밸브 구동 조립체(280)는 또한, 구동 샤프트(290)의 포지션을 모니터링하는 포지션 인코더(298)를 포함한다. 인코더(298)는 프로세서(276)에 포지션 데이터를 제공한다.
[00138] 실린지 펌프 구동 조립체(282)는 연장가능 샤프트(302)에 커플링된 실린지 펌프 모터(300)를 포함한다. 샤프트(302)는, 실린지 펌프(264) 상의 실린더(268)의 실린더 보어(270) 내에서 플런저(366)를 왕복시키기 위해 연장 포지션과 후퇴 포지션 사이에서 실린지 펌프 모터(300)에 의해 구동된다.
[00139] 핀치 밸브 구동 조립체(284)는 2 개의 공압 구동식 핀치 밸브 구동 모터들(304)의 세트를 포함한다. 2 개의 핀치 밸브 구동 모터들(304)은 제1 핀치 밸브(260) 및 제2 핀치 밸브(262) 중 대응하는 핀치 밸브에 기계적으로 커플링된다. 핀치 밸브 구동 모터들(304)은 공기압을 활용하여 제1 핀치 밸브(260) 및/또는 제2 핀치 밸브(262)의 탄력 있는 중심 부분을 핀치 오프하거나 또는 릴리즈하여 제1 핀치 밸브(260) 및/또는 제2 핀치 밸브(262)를 공압적으로 개폐할 수 있다. 대안적으로, 핀치 밸브 구동 모터들(304)은 전기적으로 구동될 수 있다.
[00140] 검출 모듈(226)은, 유동 셀(202)에 있는 폴리뉴클레오타이드들(108)과 관련된, 방출 광 광자들 또는 다른 형태들의 검출가능한 특성들의 검출을 가능하게 하는 데 적절하고 그리고/또는 필요한 카메라들 및/또는 검출 센서들 전부를 포함할 수 있다. 그런 다음, 기기(200) 내의 디바이스 회로(미도시)는 그러한 검출된 방출들로부터 도출된 데이터 신호들을 프로세싱 및 송신할 수 있다. 그런 다음, 데이터 신호들은 폴리뉴클레오타이드들(108)의 특성들을 나타내기 위해 분석될 수 있다.
[00141] 온도 조절 조립체(306)(또는 다른 환경 제어 디바이스)가 또한, 기기(200)에 포함될 수 있다. 온도 조절 조립체(306)는 다양한 화학 반응들 동안 유동 셀(202)의 온도 제어를 제공하기 위해 활용될 수 있다. 더 구체적으로, 온도 조절 조립체(306)는 유동 셀(202)의 가열 및 냉각 둘 모두를 제공하여서, 유동 셀(202)의 열 순환(thermocycling)을 가능하게 할 수 있다. 환경 제어 디바이스는 단지 온도 이외의 파라미터들(예컨대, 압력)을 제어하거나 또는 조절할 수 있다.
[00142] 전술된 개념들의 모든 조합들, 및 본원에서 더 상세히 논의된 추가적인 개념들(그러한 개념들이 상호 불일치하지 않는 경우)은 본원에서 개시된 신규한 발명의 요지의 일부인 것으로서 고려된다는 것이 인식되어야 한다. 특히, 본 개시내용의 말단에 나타나는 청구된 발명의 요지의 모든 조합들은 본원에서 개시된 신규한 발명의 요지의 일부인 것으로서 고려된다.
[00143] 전술된 개시내용이 특정 예들을 참조하여 설명되었지만, 설명된 신규한 개념들의 사상 및 범위 내에서 많은 변화들이 이루어질 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 이에 따라서, 본 개시내용은 설명된 예들에 제한되지 아니라, 다음의 청구항들의 언어에 의해 정의된 전체 범위를 갖는 것으로 의도된다.

Claims (26)

  1. 기기(instrument)의 시약 관리 시스템 및 유동 셀을 통해 혼입 시약(incorporation reagent)을 유동시키는 단계 ―상기 유동 셀은 내부에 포지셔닝된 제1 폴리뉴클레오타이드를 갖고, 상기 혼입 시약은 염기 서열(sequence of bases)에 제1 염기를 추가하며, 상기 염기 서열은 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 상보적인 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함함―;
    상기 제1 염기가 상기 제2 폴리뉴클레오티드에 추가된 후에, 상기 제1 염기로부터 나오는 식별 신호의 이미지를 캡처하는 단계;
    상기 염기 서열의 후속 염기가 상기 제2 폴리뉴클레오타이드에 추가되는 것을 가능하게 하기 위하여 상기 제1 염기로부터 제1 종결자(terminator)를 제거하기 위해, 상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 통해 절단 시약(cleavage reagent)을 유동시키는 단계; 및
    복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 통해 완충 시약(buffer reagent)을 유동시키는 단계
    를 포함하는,
    방법.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 복수의 사이클들은 4 개 이상의 사이클들을 포함하는,
    방법.
  3. 제1 항에 있어서,
    상기 복수의 사이클들은 12 개 이상의 사이클들을 포함하는,
    방법.
  4. 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀은 상기 기기의 카트리지에 포지셔닝되고, 상기 카트리지는 상기 기기에 제거가능하게 삽입가능한,
    방법.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혼입 시약, 상기 절단 시약 및 상기 완충 시약은 상기 시약 관리 시스템의 시약 웰(reagent well)들에 저장되고, 상기 시약 웰들은 각각의 시약의 유한 총 볼륨(finite total volume)을 저장하도록 동작가능한,
    방법.
  6. 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충 시약을 유동시키는 단계는,
    상기 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향으로 상기 완충 시약의 제1 순방향 유동 볼륨을 유동시키는 단계; 및
    상기 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 역방향 유동 방향으로 상기 완충 시약의 제2 역방향 유동 볼륨을 유동시키는 단계를 포함하고, 상기 제1 순방향 유동 볼륨은 상기 제2 역방향 유동 볼륨보다 더 큰,
    방법.
  7. 제6 항에 있어서,
    상기 순방향 유동 볼륨은 상기 역방향 유동 볼륨보다 약 3% 이상만큼 더 큰,
    방법.
  8. 제1 항 내지 제7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 완충 시약을 유동시키는 단계는,
    상기 복수의 사이클들 중 마지막 사이클 후에 약 10 초 이상 동안 상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 통한 상기 완충 시약의 유동이 실질적으로 없는 인큐베이션 기간; 및
    상기 인큐베이션 기간 후에 상기 순방향 유동 방향으로 상기 완충 시약의 제3 순방향 유동 볼륨을 유동시키는 단계
    를 포함하는,
    방법.
  9. 제8 항에 있어서,
    상기 완충 시약을 유동시키는 단계 동안의 상기 완충 시약의 총 스윕 볼륨(total sweep volume)은 식 ((제1 FFV + 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정되고,
    상기 제1 FFV는 상기 제1 순방향 유동 볼륨이고,
    상기 제2 RFV는 상기 제2 역방향 유동 볼륨이고,
    상기 N은 상기 복수의 사이클들의 총 사이클 수이며, 그리고
    상기 제3 FFV는 상기 제3 순방향 유동 볼륨인,
    방법.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 완충 시약을 유동시키는 단계 동안의 상기 완충 시약의 총 유체 소모량(total fluidic consumption)은 식 ((제1 FFV - 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정되는,
    방법.
  11. 제10 항에 있어서,
    상기 완충 시약의 상기 총 유체 소모량에 대한 상기 완충 시약의 상기 총 스윕 볼륨의 비(ratio)는 약 6 이상인,
    방법.
  12. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 순방향 유동 방향으로 유동시키는 단계와 상기 역방향 유동 방향으로 유동시키는 단계는, 상기 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향에 대해 약 1 초 이하의 지연(delay) 시간만큼 분리되는,
    방법.
  13. 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 순방향 유동 방향으로 유동시키는 단계와 상기 역방향 유동 방향으로 유동시키는 단계는, 상기 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향에 대해 약 200 밀리초 이하의 지연 시간만큼 분리되는,
    방법.
  14. 제1 항 내지 제13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향은 약 200 밀리초 이하의 지연 시간만큼 분리되는,
    방법.
  15. 기기로서,
    상기 기기에 포지셔닝된 시약 관리 시스템 ―상기 시약 관리 시스템은 복수의 시약 웰들을 포함하고, 상기 시약 웰들은 적어도, 내부에 각각 포지셔닝된 혼입 시약, 절단 시약 및 완충 시약을 포함하도록 동작가능한 제1 시약 웰, 제2 시약 웰 및 제3 시약 웰을 가지며, 상기 시약 관리 시스템은 상기 복수의 시약 웰들 중 하나의 시약 웰로부터의 시약의 유동을 선택하기 위한 것임―; 및
    상기 기기에 포지셔닝된 유동 셀을 포함하고, 상기 유동 셀은 상기 시약 관리 시스템과 유체 연통(fluid communication)하는 유동 채널을 포함하고, 상기 유동 채널은 상기 유동 채널에 포지셔닝된 제1 폴리뉴클레오타이드 위로의 시약의 유동을 라우팅하기 위한 것이고,
    상기 기기는,
    염기 서열에 제1 염기를 추가하기 위해, 상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 통해 상기 혼입 시약을 유동시키도록 ―상기 염기 서열은 상기 제1 폴리뉴클레오티드에 상보적인 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함함―;
    상기 제1 염기가 상기 제2 폴리뉴클레오티드에 추가된 후에, 상기 제1 염기로부터 나오는 식별 신호의 이미지를 캡처하도록;
    상기 염기 서열의 후속 염기가 상기 제2 폴리뉴클레오타이드에 추가되는 것을 가능하게 하기 위하여 상기 제1 염기로부터 제1 종결자를 제거하기 위해, 상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 통해 상기 절단 시약을 유동시키도록; 그리고
    복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 통해 상기 완충 시약을 유동시키도록 동작가능한,
    기기.
  16. 제15 항에 있어서,
    상기 기기는, 4 개 이상의 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 통해 상기 완충 시약을 유동시키도록 동작가능한,
    기기.
  17. 제15 항에 있어서,
    상기 기기는, 12 개 이상의 복수의 사이클들의 연속적인 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향으로 상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 통해 상기 완충 시약을 유동시키도록 동작가능한,
    기기.
  18. 제15 항 내지 제17 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기기는, 순방향 유동 방향으로 유동시키는 것과 역방향 유동 방향으로 유동시키는 것이 상기 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향 및 역방향 유동 방향에 대해 약 200 밀리초 이하의 지연 시간만큼 분리되게, 상기 완충 시약을 유동시키도록 동작가능한,
    기기.
  19. 제15 항 내지 제18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약 관리 시스템은 상기 기기에 제거가능하게 삽입가능한,
    기기.
  20. 제15 항 내지 제19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 유동 셀은 상기 기기에 제거가능하게 삽입가능한,
    기기.
  21. 제15 항 내지 제20 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 포함하기 위한 카트리지를 포함하고,
    상기 혼입 시약, 상기 절단 시약 및 상기 완충 시약은 상기 시약 관리 시스템의 시약 웰들에 저장되고, 상기 시약 웰들은 각각의 시약의 유한 총 볼륨을 저장하는,
    기기.
  22. 제21 항에 있어서,
    상기 카트리지는 상기 기기에 제거가능하게 삽입가능한,
    기기.
  23. 제15 항 내지 제22 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기기는,
    상기 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 순방향 유동 방향으로 상기 완충 시약의 제1 볼륨이 유동되고;
    상기 복수의 사이클들의 각각의 사이클의 역방향 유동 방향으로 상기 완충 시약의 제2 볼륨이 유동되게, 상기 완충 시약을 유동시키도록 동작가능하고, 상기 제1 볼륨은 상기 제2 볼륨보다 더 큰,
    기기.
  24. 제23 항에 있어서,
    순방향 유동 볼륨은 역방향 유동 볼륨보다 약 3% 이상만큼 더 큰,
    기기.
  25. 제23 항 또는 제24 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기기는,
    상기 복수의 사이클들 중 마지막 사이클 후에 약 10 초 이상 동안 상기 시약 관리 시스템 및 상기 유동 셀을 통한 상기 완충 시약의 유동이 실질적으로 없는 인큐베이션 기간이 부과되며(imposed); 그리고
    상기 인큐베이션 기간 후에 상기 순방향 유동 방향으로 상기 완충 시약의 제3 순방향 유동 볼륨이 유동되게, 상기 완충 시약을 유동시키도록 동작가능한,
    기기.
  26. 제25 항에 있어서,
    상기 기기는,
    상기 완충 시약의 총 스윕 볼륨이 식 ((제1 FFV + 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정되고 ―
    상기 제1 FFV는 상기 제1 순방향 유동 볼륨이고,
    상기 제2 RFV는 상기 제2 역방향 유동 볼륨이고,
    상기 N은 상기 복수의 사이클들의 총 사이클 수이며, 그리고
    상기 제3 FFV는 상기 제3 순방향 유동 볼륨임―;
    상기 완충 시약의 총 유체 소모량이 식 ((제1 FFV - 제2 RFV) * N) + 제3 FFV에 의해 실질적으로 결정되게, 상기 완충 시약을 유동시키도록 동작가능하며, 그리고
    상기 완충 시약의 상기 총 유체 소모량에 대한 상기 완충 시약의 상기 총 스윕 볼륨의 비는 약 6 이상인,
    기기.
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