JP2022537853A - 機器における試薬交換 - Google Patents

Abstract

方法には、機器の試薬管理システム及びフロー・セルを介して取り込み試薬を流すことが含まれる。フロー・セルは、該フロー・セルに位置付けられた第１ポリヌクレオチドを有する。取り込み試薬は、塩基配列に第１塩基を付加する。塩基配列には、第１ポリヌクレオチドに相補的な第２ポリヌクレオチドが含まれる。第１塩基が第２ポリヌクレオチドに付加された後、第１塩基から発される識別信号の画像が捕捉される。塩基配列における後続の塩基を第２ポリヌクレオチドへ付加可能とするため、試薬管理システム及びフロー・セルを通して切断試薬が流され、第１塩基から第１ターミネーターを除去する。バッファー試薬は、連続する順流方向及び逆流方向の複数のサイクルで、試薬管理システム及びフロー・セルを通して流される。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、Ｒｅａｇｅｎｔ Ｅｘｃｈａｎｇｅ Ｉｎ Ａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔと題する、２０１９年６月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／８６３，４４４号の優先権を主張する。前記出願の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を決定するための方法の実行に利用される機器には、フロー・セルと流体連通する試薬管理システム（ＲＭＳ）が含まれ得る。ＲＭＳは、フロー・セルのフロー・チャネルを介して、複数の試薬を貯蔵、選択、及び順次流すことができる。

このような方法には、フロー・セルのフロー・チャネルに位置付けられた、クローニングされた第１ポリヌクレオチドのクラスターに様々な制御された化学反応を実行するため、フロー・セルのフロー・チャネルを通るように経路決定される（又は送る、route）選択された試薬の配列の複数サイクルが含まれ得る。化学反応により、タグ付与されたヌクレオチドは、第１ポリヌクレオチドの塩基配列を有する塩基対を一度に１塩基対ずつ形成することが可能となる。対になると、タグが励起され、塩基対を識別する識別信号を発する。タグ付与された各ポリヌクレオチドは、フロー・セルにおいて、第１ポリヌクレオチドを有する二重鎖である、成長中の相補的な第２ポリヌクレオチド鎖に付加される。

したがって、相補第２ポリヌクレオチド鎖は、第１ポリヌクレオチドのクラスターにおける塩基配列を決定するため、一度に１塩基ずつ構築され得る。構築され得る相補的な第２ポリヌクレオチド鎖における既知のヌクレオチドの数が多いほど（すなわち、第２ポリヌクレオチド鎖の長さが長くなるほど）、第１ポリヌクレオチドのクラスターにおけるヌクレオチドの順序に関してより多くのデータを供することができ、全体の分析がより速くなる。

しかしながら、試薬の流れの間の試薬交換が不十分である場合、次いで試薬間の交差汚染が起こり得る。したがって、試薬の流れ間の試薬交換を改善した、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を決定するための機器及び方法が必要である。

本開示は、本開示の１つ又はそれより多くの態様に従い、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を決定する方法を実施するように作動可能な機器を供することによって、利点を提供する。この方法には洗浄フェーズが含まれ、機器の試薬管理システム及びフロー・セルを介してバッファー試薬（又は緩衝試薬、buffer reagent）を流す際に、バッファー試薬の全掃引体積（又は全スイープ体積、total sweep volume）は、バッファー試薬の全流体消費量より大きい。さらに、全流体消費量に対する全掃引体積の比は、６、１０、又はそれより大きくてよい。この方法は、他の方法より試薬交換を強化し、全流体消費量に対する全掃引体積は１である。このように、そのような他の方法と比較して、プレフェージング（pre-phasing）が減じられ、成長し得るポリヌクレオチドの長さは増加する。

本開示の１つ又はそれより多くの態様に従う方法には、機器の試薬管理システム及びフロー・セルを介して、取り込み試薬（incorporation regent）を流すことが含まれる。フロー・セルは、該フロー・セルに位置付けられる第１ポリヌクレオチドを有する。取り込み試薬は、塩基配列に第１塩基（又は最初の塩基、first base）を付加する。塩基配列には、第１ポリヌクレオチドに相補的な第２ポリヌクレオチドが含まれる。第１塩基が第２ポリヌクレオチドに付加された後、第１塩基から生じる識別信号の画像が捕捉される。塩基配列における後続の塩基を第２ポリヌクレオチドに付加可能とするため、切断試薬は試薬管理システム及びフロー・セルを介して流され、第１塩基から第１ターミネーターを除去する。バッファー試薬は、連続する順方向及び逆方向の流れ方向の複数のサイクルで、試薬管理システム及びフロー・セルを介して流され、試薬管理システム及びフロー・セルから切断試薬を洗い流す。

方法のいくつかの例示において、複数のサイクルは、４以上のサイクルを含む。

方法のいくつかの例示において、複数のサイクルは、１２以上のサイクルを含む。

方法のいくつかの例示において、試薬管理システム及びフロー・セルは、機器のカートリッジ内に位置付けられ、カートリッジは取り外し可能に機器内に挿入可能である。

方法のいくつかの例示において、取り込み試薬、切断試薬及びバッファー試薬は、試薬管理システムの試薬ウェル（regent well）に貯蔵され、試薬ウェルは各試薬の有限の全量を貯蔵するように構成される。

方法のいくつかの例示において、バッファー試薬を流すことは、複数のサイクルの各サイクルの順流方向（又は順フロー方向、forward flow direction）にバッファー試薬の第１順流体積（又は順フロー体積、forward flow volume）を流すこと；及び、複数のサイクルの各サイクルの逆流方向（又は逆フロー方向、reverse flow direction）にバッファー試薬の第２逆流体積（又は逆フロー体積、reverse flow volume）を流すことを含み、第１順流体積は第２逆流体積より大きい。

方法のいくつかの例示において、順流体積は、逆流体積より約３％以上大きい。

方法のいくつかの例示において、バッファー試薬を流すことは、複数のサイクルの最後のサイクルの後、約１０秒以上、試薬管理システム及びフロー・セルを通るバッファー試薬の流れが実質的にない、インキュベーション期間（incubation period）；並びに、インキュベーション期間後に順流方向にバッファー試薬の第３順流体積を流すことを含む。

方法のいくつかの例示において、バッファー試薬を流す間、バッファー試薬の全掃引体積は、実質的に式（（１^ｓｔＦＦＶ＋２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって決定される。ここで、
１^ｓｔＦＦＶは第１順流体積であり、
２^ｎｄＲＦＶは第２逆流体積であり、
Ｎは複数のサイクルにおける全サイクル数であり、及び
３^ｒｄＦＦＶは第３順流体積
である。

方法のいくつかの例示において、バッファー試薬を流す間、バッファー試薬の全流体消費量は、実質的に式（（１^ｓｔＦＦＶ－２^ｎｄＲＦＶ）×Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって決定される。

方法のいくつかの例示において、バッファー試薬の全流体消費量に対するバッファー試薬の全掃引体積の比は、約６に等しい、又は約６より大きい。

方法のいくつかの例示において、順流方向の流れ及び逆流方向の流れは、順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルに関して、約１秒以下の遅延時間によって分離される。

方法のいくつかの例示において、順流方向の流れ及び逆流方向の流れは、順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルに関して、約２００ミリ秒以下の遅延時間によって分離される。

方法のいくつかの例示において、順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルは、約２００ミリ秒以下の遅延時間によって分離される。

方法の例示のいずれも、本明細書で説明される利点を達成するためのいずれの適当な組合せでも実行され得る。

本開示の１つ又はそれより多くの態様に従う機器には、機器内に位置付けられる、作動可能な試薬管理システムが含まれる。試薬管理システムには、複数の試薬ウェルが含まれる。試薬ウェルは、第１試薬ウェル、第２試薬ウェル及び第３試薬ウェルを少なくとも有し、そのそれぞれに位置付けられる取り込み試薬、切断試薬及びバッファー試薬を含むように構成される。試薬管理システムは、複数の試薬ウェルの１つから試薬の流れを選択するように作動可能である。フロー・セルは、機器内に位置付けられるように作動可能である。フロー・セルには、試薬管理システムと流体連通するフロー・チャネルが含まれる。フロー・チャネルは、フロー・チャネルに位置付けられた第１ポリヌクレオチド上において試薬の流れを経路決定するように作動可能である。機器は、以下のように作動可能である：
試薬管理システム及びフロー・セルを介して取り込み試薬を流し、塩基配列に第１塩基を付加する。塩基配列は、第１ポリヌクレオチドに相補的な第２ポリヌクレオチドを含んで成る；
第１塩基が第２ポリヌクレオチドに付加された後、第１塩基から生じる識別信号のイメージを取り込む；
試薬管理システム及びフロー・セルを介して切断試薬を流し、塩基配列における後続の塩基を第２ポリヌクレオチドに付加可能とするために第１塩基から第１ターミネーターを除去する；並びに
連続する順流方向及び逆流方向の複数のサイクルで、試薬管理システム及びフロー・セルを介してバッファー試薬を流し、試薬管理システム及びフロー・セルから切断試薬を洗い流す。

いくつかの例示において、機器は、試薬管理システム及びフロー・セルを含むように作動可能なカートリッジを有して成る。ここで、取り込み試薬、切断試薬及びバッファー試薬は、試薬管理システムの試薬ウェルに保存され、試薬ウェルは、核試薬の有限の全量を保存するように構成される。

いくつかの例示において、機器は、連続する順流方向及び逆流方向の、４以上の複数のサイクルで試薬管理システム及びフロー・セルを介してバッファー試薬を流すように作動可能である。

いくつかの例示において、機器は以下のようにバッファー試薬を流すように作動可能である：
バッファー試薬の第１体積は、複数のサイクルの各サイクルの順流方向に流される；
バッファー試薬の第２体積は、複数のサイクルの各サイクルの逆流方向に流され、第１体積は第２体積より大きい；
複数のサイクルの最後のサイクルの後、試薬管理システム及びフロー・セルを介するバッファー試薬の流れが実質的にないインキュベーション期間が、約１０秒以上課せられる；並びに
インキュベーション期間後、バッファー試薬の第３順流体積が順流方向に流される。

いくつかの例示において、機器は以下のようにバッファー試薬を流すように作動可能である：
バッファー試薬の全掃引体積は、実質的に式（（１^ｓｔＦＦＶ＋２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって決定され、ここで：
１^ｓｔＦＦＶは第１順流体積であり、
２^ｎｄＲＦＶは第２逆流体積であり、
Ｎは複数のサイクルにおける全サイクル数であり、及び
３^ｒｄＦＦＶは第３順流体積
である。
バッファー試薬の全流体消費量は、実質的に式（（１^ｓｔＦＦＶ－２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって決定される；並びに
バッファー試薬の全流体消費量に対するバッファー試薬の全掃引体積の比は、約６に等しい、又は約６より大きい。

いくつかの例示において、機器は、順流方向の流れ及び逆流方向の流れが、順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルに関して、約２００ミリ秒以下の遅延時間によって分離されるようにバッファー試薬を流すように作動可能である。

機器のいずれの例示も、本明細書で説明される利点を達成するため、いずれの適当な組合せでも実施され得る。

方法及び機器を含む前述の態様、及び以下により詳細に説明されるさらなる概念の全ての組合せは（このような概念が相互に矛盾しないという条件で）、本明細書で開示される発明の主題の一部として考えられるということが認識されるべきである。

本開示のこれら及び他の目的、特徴及び利点は、添付の図面と併せて取り入れられる、本開示の様々な態様の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。

本開示は、添付の図面と併せて取り入れられる以下の詳細な説明から、より完全に理解されるであろう。

図１は、本明細書で開示される態様に従う、ヌクレオチドの化学構造の簡略化された例を示す。 図２は、本明細書で説明される態様に従う、第１ポリヌクレオチド及び成長する相補的な第２ポリヌクレオチドの簡略化された例を示す。 図３は、本明細書で開示された態様に従う、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を決定する方法のフロー図の例を示す。 図４は、本明細書で開示された態様に従う、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を決定する別の方法のフロー図の例を示す。 図５は、本明細書で開示された態様に従う、洗浄フェーズの作用例の間に得られる、バッファー試薬の全流体消費量に対する全掃引体積の様々な比を示す表を示す。 図６は、本明細書で開示された態様に従う、図５の実施例において得られたデータからプロットされた、全流体消費量に対する全掃引体積の比対プレフェージング勾配のグラフを示す。 図７は、本明細書で開示された態様に従う機器の概略図の例を示す。 図８は、本明細書で開示された態様に従う、図７の機器の概略ブロック図の例を示す。

ここで、本明細書で開示される方法、システム、及びデバイスの構造、機能、製造、及び使用の原理の全体的な理解を供するため、特定の例を説明する。１つ又はそれより多くの例は、添付の図面に示されている。当業者は、本明細書で具体的に説明され、添付の図面に示される方法、システム、及びデバイスが非限定的な例であり、本開示の範囲が特許請求の範囲によってのみ規定されることを理解するであろう。ある例に関連して図示又は説明される特徴は、他の例の特徴と組み合わされてよい。そのような修正及び変更は、本開示の範囲内に含まれることが意図されている。

「実質的に」、「ほぼ（approximately）」、「約」、「比較的」、又は特許請求の範囲を含む本開示全体で使用され得る他の同様の用語は、参照又はパラメータからプロセスにおける変更によってなど、小さな変動を記述又は説明するために用いられる。このような小さな変動には、同様に参照又はパラメータからのゼロ変動も含まれる。例えば、これらは±１０％未満又は±１０％に等しい、±５％未満又は±５％に等しいなど、±２％未満又は±２％に等しいなど、±１％未満又は±１％に等しいなど、±０．５％未満又は±０．５％に等しいなど、±０．２％未満又は±０．２％に等しいなど、±０．１％未満又は±０．１％に等しいなど、±０．０５％未満又は±０．０５％に等しいなどを指し得る。

図１を参照すると、本明細書で開示される態様に従うヌクレオチド１００の化学構造の簡略化された例が示されている。ヌクレオチド１００は、以下の３つのサブユニット分子から構成される：窒素塩基１０２（また、核酸塩基又は塩基としても知られる）、５炭素糖１０４（リボース又はデオキシリボースなど）及び少なくとも１つのリン酸基１０６。共に結合された複数のヌクレオチドは、ポリヌクレオチドとして知られる。図２で最もよく見られる第１ポリヌクレオチド１０８及び第２ポリヌクレオチド１１０は、このようなポリヌクレオチドの例である。

ヌクレオチド１００の窒素塩基１０２は、以下の５つの種類の１つであってよい：アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びウラシル（Ｕ）。塩基１０２の各種類は、他の１つの塩基の種類のみと対となり（すなわち、化学的に結合し）、図２に示された相補的二本鎖ポリヌクレオチド１１２などの２つのポリヌクレオチドの相補的二本鎖において相補的塩基対を形成する。

本明細書で用いられる場合、相補的とは、第１ヌクレオチドの第１塩基と、それと化学的に結合し得る第２ヌクレオチドの特定の第２塩基との対を成すことを指す。第２塩基（及びその関連するヌクレオチド）は、本明細書では第１塩基（及びその関連するヌクレオチド）に相補的であると考えられる。例えば、アデニン－チミン（Ａ－Ｔ）及びグアニン－シトシン（Ｇ－Ｃ）は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の相補的二重ポリヌクレオチド鎖を接続し得る相補的塩基対である。また、アデニン－ウラシル（Ａ－Ｕ）及びグアニン－シトシン（Ｇ－Ｃ）は、リボ核酸（ＲＮＡ）の相補的二重ポリヌクレオチド鎖を接続し得る相補的塩基対である。

図２を参照すると、本明細書で説明される態様に従う、第１ポリヌクレオチド１０８及び成長する相補的第２ポリヌクレオチド１１０の簡略化された例が示されている。第１ポリヌクレオチド１０８及び第２ポリヌクレオチド１１０は、共に接続され、二重鎖ポリヌクレオチド１１２を形成する。

第１ポリヌクレオチド１０８は、フロー・セル２０２のフロー・チャネル２２４のフロア（又は床、floor）１１６に化学的に固定される（又は係留される、anchor）１１４（図７で最もよく見られる）。第１ポリヌクレオチド１０８には、ヌクレオチド１１８－１から１１８－Ｎが含まれ、ここで、Ｎは第１ポリヌクレオチド１０８におけるヌクレオチド１１８の総数を表し、また、第１ポリヌクレオチド１０８の長さも示す。各ヌクレオチド１１８に関連する特定の種類の窒素塩基は、それぞれアデニン、グアニン、シトシン及びチミンの塩基の種類を表す、丸で囲まれた文字Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴによって識別される。第１ポリヌクレオチド１０８は、フロー・チャネル２２４のフロア１１６に固定された、クローニングされた（又はクローン化された、clone）同一の第１ポリヌクレオチド１０８の多くのクラスターの１つであり得る。

第２ポリヌクレオチド１１０には、少なくともヌクレオチド１２０－１から１２０－６が含まれる。さらに、各ヌクレオチド１２０に関連する特定の種類の窒素塩基は、丸で囲まれた文字Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴによって識別される。各ヌクレオチド１２０には、化学タグ（蛍光タグなど）が含まれ、励起した場合（例えば、励起光によって）、ヌクレオチド１２０の特定の塩基を識別する識別信号（蛍光など）を放出することになる。

ヌクレオチド１２０の塩基は、一連の相補的塩基対１２２－１から１２２－６を形成するため、ヌクレオチド１１８の相補的塩基にのみ結合し得る。塩基対１２２及びそれらに関連するヌクレオチド１１８、１２０は、二重鎖ポリヌクレオチド１１２を形成する。

第１ポリヌクレオチド１０８におけるヌクレオチド１１８－１から１１８－Ｎの順序を決定するために方法の実行において利用される機器２００などの機器には、フロー・セル２０２（図７で最もよく見られる）と流体連通する試薬管理システム２０４が含まれてよい。試薬管理システムは、フロー・セル２０２のフロー・チャネル２２４を介して複数の試薬を保存し、選択し、順次流すことが可能である。試薬管理システム及び／又はフロー・セルは、取り外し可能に挿入可能な機器のカートリッジ２３０（図７で最もよく見られる）に配置されてよく、配置されなくてもよい。

本明細書でより詳細に説明されるように、第１ポリヌクレオチド１０８で様々な制御された化学反応を実行するため、このような方法には、フロー・セル２０２のフロー・チャネル２２４を通るように経路決定される、選択された試薬２０８～２１８（図７で最もよく見られる）の配列の複数のサイクルが含まれる。第１ポリヌクレオチド１０８を流れる、取り込み試薬として知られる少なくとも１つの試薬には、ヌクレオチド１２０が含まれる。取り込み試薬における各ヌクレオチド１２０には、励起された場合（例えば、励起光によって）、ヌクレオチド１２０の特定の塩基を識別する識別信号（蛍光など）を放出する化学タグ（蛍光タグなど）が含まれる。さらに、取り込み試薬における各ヌクレオチド１２０の塩基には、他の塩基がそれと結合することを防ぐ分離可能なターミネーターが含まれる。化学反応により、ヌクレオチド１２０が第１ポリヌクレオチド１０８の塩基配列１１８を有し、一度に１つの塩基対１２２で複数の塩基対１２２を形成することが可能である。

しかしながら、試薬の流れ間の試薬交換が十分でない場合、次いで試薬間の相互汚染が起こり得る。すなわち、第１試薬が除去されず、方法の連続する第２試薬の流れと交換されない場合、次いで第１試薬は第２試薬を汚染し得る。これは、プレフェージングとして知られる現象を引き起こし得るものであり、複数のタグ付与された塩基は、各サイクルで成長する相補的第２ポリヌクレオチド鎖に意図せず付加される。プレフェージングは、ヌクレオチドの配列を決定する方法の精度を低下させる。また、プレフェージングは累積的（cumulative）であり、メソッドの各サイクルで繰り返し、各サイクルで精度をさらに低下させ得る。また、プレフェージングは、相補的第２ポリヌクレオチドで構築され得る塩基の数を減じ（すなわち、長さを減じ）、これらの塩基の順序は、許容可能な程度の精度内で決定され得る。試薬交換は、不均一なチャネルを有するフロー・セルの範囲又はコーナー（又は角若しくは隅、corner）などの流体の流れ状態が悪い領域では、特に困難であり得る。

また、プレフェージングの増加に加え、不適切な試薬交換は、ヌクレオチドの配列を決定するための様々な方法の精度を低下させ得る他の現象に寄与し得る。例えば、不適切な試薬交換は位相化の増加につながり得るものであり、タグ付与された塩基は、成長する相補的第２ヌクレオチドに付加されない。また、不適切な試薬交換は、フィルターを通過するクラスターの割合の減少につながる可能性があり、これは、各クラスターからの信号の純度の指標である。

さらに、ＲＭＳが機器のカートリッジ内に配置される場合、試薬ウェルの試薬保存容量は、カートリッジの空間的制約によって制限される可能性があるため、効率的な試薬交換がより重要となる。

図２に示される例において、方法により、タグ付与されたヌクレオチド１２０－１から１２０－５をヌクレオチド１１８－１から１１８－５と順次結合させ、相補的塩基対１２２－１から１２２－５を形成することが可能となる。ヌクレオチド１２０－６は配列の次のものであり、ヌクレオチド１１８－６と結合され（又は対になり）、相補的塩基対を形成しようとする。

対になると、ヌクレオチド１２０－６の化学タグが励起され、塩基対１２２－６を識別する識別信号を放出する。識別されると、ヌクレオチド１２０－６の塩基に結合されるターミネーターが除去され、それによって後続の塩基が結合され得る。タグ付与されたヌクレオチド１２０－６は、第１ヌクレオチド鎖１０８を有する二本鎖である、成長する相補的第２ポリヌクレオチド鎖１１０に付加する。

したがって、相補的第２ヌクレオチド鎖１１０は、第１ポリヌクレオチド１０８のクラスターにおける後続の塩基１１８を決定するため、一度に１つの塩基を構築し得る。構築され得る相補的第２ポリヌクレオチド鎖１１０におけるヌクレオチド１２０の数が多いほど（すなわち、第２ポリヌクレオチド鎖の長さが長くなるほど）、第１ポリヌクレオチド１０８のクラスターにおけるヌクレオチドの順序に関してより多くのデータを供することができ、全体的な分析がより速くなる。

図３を参照すると、本明細書で説明される態様に従うポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を決定する方法１３０の簡略化されたフロー図の例が示されている。方法１３０には、４つの基本的なフェーズが含まれ、それらは、取り込みフェーズ１３２、画像フェーズ１３４、切断フェーズ１３６、及び洗浄フェーズ１３８である。

取り込み段階１３２の間、取り込み試薬は、機器２００の試薬管理システム２０４及びフロー・セル２０２を通るように流される（図７で最もよく見られる）。フロー・セル２０２は、その中に位置付けられた第１ポリヌクレオチド１０８（図２で最もよく見られる）を有する。取り込み試薬は、塩基配列（ヌクレオチド１２０－１から１２０－５に関連付けられる）に第１塩基（ヌクレオチド１２０－６に関連付けられる）を付加する。塩基配列（及びそれらの関連するヌクレオチド１２０－１から１２０－６）には、第１ポリヌクレオチド１０８に相補的な第２ポリヌクレオチド１１０が含まれる。

より具体的には、取り込み試薬は、フロー・セル２０２のフロー・チャネル２２４に前もって固定された、クローニングされた第１ポリヌクレオチド１０８のクラスター上を流れる。取り込み試薬には既知のヌクレオチド１２０が含まれ、ここで、これらのヌクレオチド１２０の塩基は、第１ポリヌクレオチド１０８の塩基と順次対をなし、第１ポリヌクレオチド１０８に相補的な成長する第２ポリヌクレオチド１１０を形成する。第１ポリヌクレオチド１０８及び第２ポリヌクレオチド１１０は、ＤＮＡフラグメントなどの二本鎖ポリヌクレオチドを形成する。第１ポリヌクレオチド１０８及び第２ポリヌクレオチド１１０の塩基の種類は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ）のいずれか１つであり得る。

また、取り込み試薬におけるヌクレオチド１２０には、励起信号で（この例では、励起光で）塩基の種類の識別を可能とするタグ（この例では、蛍光タグ）が含まれる。また、ヌクレオチド１２０には当技術分野において既知である切断可能なターミネーター（又はブロッキング基（blocking group））も含まれ、これは、第２ポリヌクレオチドの１つより多くの塩基が第１ポリヌクレオチド１０８の塩基と一度に対をなすことを防ぐ。

画像フェーズ１４の間、ヌクレオチド１２０－６の第１塩基が第２ポリヌクレオチド１１０に付加された後、ヌクレオチド１２０－６の第１塩基から生じる識別信号の画像が捕捉される。

より具体的には、第２ポリヌクレオチド１１０に関連するヌクレオチド１２０の蛍光タグは、励起光で励起され、特徴的な蛍光を放出する。次いで、蛍光の画像を撮り、成長する第２ポリヌクレオチド１１０を形成するヌクレオチド１２０－１から１２０－６の配列に新たに付加されたヌクレオチド１２０－６の塩基の種類を識別する。第２ポリヌクレオチド１１０は、第１ポリヌクレオチド１０８に相補的であるため、第１ポリヌクレオチド１０８におけるヌクレオチド１１８の順序を決定できる。第２ポリヌクレオチド１１０をより長く成長させることができるほど、第１ポリヌクレオチド１０８におけるヌクレオチド１１８の順序をより多く決定できる。

切断フェーズ１３６の間、切断試薬は、試薬管理システム２０４及びフロー・セル２０２を通るように流され、ヌクレオチド１２０－６からターミネーターを除去する。これにより、ヌクレオチド１２０－１から１２０－６の配列における後続のヌクレオチド（図示せず）を第２ポリヌクレオチド１１０に付加することが可能となる。

洗浄フェーズ１３８の間、バッファー試薬（又は洗浄試薬）は、連続する順流方向及び逆流方向の複数のサイクルで試薬管理システム２０４及びフロー・セル２０２を通るように流され、試薬管理システム及びフロー・セルから切断試薬を洗い落とす。バッファー試薬は、フロー・セル及び試薬管理システムから意図しない化学種を除去するために利用される化学種の混合物であり得る。意図しない化学種は、例えば、前のステップから残っている活性試薬（過剰な切断試薬など）又は前のステップから副産物として得られた様々な不純物であり得る。バッファー試薬は、例えば、リポ酸が添加された緩衝化生理食塩水であり得る。

本明細書で用いられるように、順方向の流れは、試薬管理システム２０４の試薬ウェル２３２からフロー・セル２０２の試薬の流れの方向を指す（図７で最もよく見られる）。本明細書で用いられるように、逆方向の流れは、フロー・セル２０２から試薬ウェル２３２の試薬の流れの方向を指す。

図３の例では、複数のサイクルが、バッファー試薬の順流方向１４０及び連続する逆流方向１４２の１２回の繰返しサイクルであるように示されている。しかしながら、バッファー試薬は、順流方向１４０で、次いで連続する逆流方向１４２で任意の回数でサイクルされ得る。例えば、複数のサイクルは、２、４、６、１２又はそれより多くのサイクルであってよい。

洗浄フェーズ１３８中の連続する順流方向１４０及び逆流方向１４２の複数のサイクルにより、同じ有限体積のバッファー試薬を利用する以前の方法よりも、切断フェーズ１３６中にシステムに導入された切断試薬のより完全な除去（すなわち、試薬交換）が可能となる。これは、以前の方法では、洗浄フェーズ中に順方向にのみ試薬が流れていたためである。そのため、以前の方法では、同じバッファー試薬が試薬管理システム及びフロー・セルを一度通過するのみであり、切断試薬が洗浄フェーズ中に十分に除去されない可能性がある。これらの条件下では、後続の取り込みフェーズ中に、後続の取り込み試薬が残存する切断試薬で汚染され得る。次いで、残存する切断試薬は、後続の取り込みフェーズ中にヌクレオチドからターミネーターを早まって除去し得る。これにより、望まない量のプレフェージングが可能になる可能性があり、１つより多くの塩基が、成長する第２ポリヌクレオチドに一度に結合する。

プレフェージングにより新しいサイクルごとに蓄積することが可能となる場合、次いでポリヌクレオチドにおける塩基の順序の有意な不確実性が生じ得る。不確実性は、各サイクルにわたって増加し得るものであり、ポリヌクレオチド鎖が成長するにつれて得られるデータの精度が低下し得る。したがって、塩基の順序を妥当な程度の精度で決定できるように、成長させることができる第２ポリヌクレオチド鎖の全長は、プレフェージングによって制限され得る。

比較すると、本開示の順流方向１４０及び逆流方向１４２の複数のサイクルは、より完全な洗浄のため、同じバッファー試薬が試薬管理システム及びフロー・セルを数回通過することを可能とする。一例において、本明細書で説明されるような連続する順流方向及び逆流方向の複数のサイクルを使用することにより、特に、例えば空間及び／又はコストの制約のためにバッファー試薬の体積を増加させることが望ましくない場合、有限体積のバッファー試薬のより効率的な使用を供し得る。その結果、所定のレベルの試薬交換を達成するために必要なバッファー試薬はより少なくなり得る。

本明細書で用いられる連続的な順流方向１４０及び逆流方向１４２は、介在するステップがなく、互いに隣接して起こる順流方向及び逆流方向を指す。介在するステップがないということは、試薬の順流と逆流との間に流れがない実質的なインキュベーション期間（又は遅延時間）がないことを指す。

したがって、順流方向１４０の流れ及び逆流方向１４２の流れは、順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルに関して、約１秒以下、約２００ミリ秒以下、又は約１００ミリ秒以下の遅延時間によって分離されるべきである。さらに、順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルは、約１秒以下、約２００ミリ秒以下、又は約１００ミリ秒以下の遅延時間によって分離されるべきである。

一例では、試薬管理システム２０４（図７に最もよく見られる）における試薬ウェル２３２の汚染を防ぐため、順方向１４０に流れるバッファー試薬の体積は、逆方向に流れるバッファー試薬の体積より大きくなるべきである。換言すれば、洗浄フェーズ中の試薬ウェルの汚染を防ぐために：
バッファー試薬の第１順流体積（１^ｓｔＦＥＶ）は、複数のサイクルの各サイクルの順流方向に流される；及び
バッファー試薬の第２逆流体積（２^ｎｄＲＦＶ）は、複数のサイクルの各サイクルの逆流方向に流され、ここで、第１順流体積は、第２逆流体積より大きい。より具体的には、第１順流体積（１^ｓｔＦＥＶ）は、第２逆流体積（２^ｎｄＲＦＶ）より約３％以上大きくてよい。

複数の順流方向１４０及び逆流方向１４２が発生した後、洗浄フェーズ１３８は、インキュベーション期間１４４に進む。インキュベーション期間１４４は、試薬管理システム２０４及びフロー・セル２０２を介するバッファー試薬の流れが実質的にない期間である。インキュベーション期間１４４は、複数のサイクル１４０、１４２の最後のサイクルが起こった後に、約１０秒以上の持続期間（duration）を有し得る。

インキュベーション期間１４４の後、洗浄フェーズ１３８は第３順流１４６に進む。すなわち、バッファー試薬の第３順流体積（３^ｒｄＦＦＶ）は、インキュベーション期間１４４の後に順流方向に流される。インキュベーション期間１４４及び第３順流１４６は、試薬管理システム又はフロー・セルのエッジに発生し得るクラックから、切断試薬を拡散させることを助力し得る。

洗浄フェーズ１３８の完了後、次いで方法は取り込みフェーズ１３２に戻し１４８、ヌクレオチド配列中の次のヌクレオチド１２０を第２ポリヌクレオチド１１０に付加するプロセスを開始する。

いくつかの既存の方法では、洗浄フェーズ中にバッファー試薬が順方向のみに流されるため、洗浄フェーズ中に消費されるバッファー試薬の全量（全流体消費量）は、洗浄フェーズ中に試薬管理システム及びフロー・セルを介して掃引されたバッファー試薬体積の全量（全掃引体積）に本質的に等しい。対照的に、本開示の方法において、全掃引体積は、洗浄フェーズ中の全流体消費量より何倍も大きくなり得る。

より具体的には、バッファー試薬を流している（洗浄フェーズ）間、バッファー試薬の全掃引体積は、式（（１^ｓｔＦＦＶ＋２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって実質的に決定され、ここで：
１^ｓｔＦＦＶは、第１順流体積であり、
２^ｎｄＲＦＶは、第２逆流体積であり、
Ｎは、複数のサイクルにおけるサイクルの全数であり、及び
３^ｒｄＦＦＶは、第３順流体積である。
さらに、バッファー試薬を流している（洗浄フェーズ）間、バッファー試薬の全流体消費量は、実質的に以下の式によって決定される：
（（１^ｓｔＦＦＶ－２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶ
前述のタイプの式で用いられる「実質的に決定される」なる用語は、１^ｓｔＦＦＶ、２^ｎｄＲＦＶ、及び３^ｒｄＦＦＶなどのパラメータを決定する際に発生し得る測定誤差を記載及び説明するために用いられる。

同体積のバッファー試薬は、試薬管理システム及びフロー・セルを数回通過し得るため、バッファー試薬の全流体消費量に対するバッファー試薬の全掃引体積の比は、実質的に１より大きくなり得る。より具体的には、バッファー試薬の全流体消費量に対するバッファー試薬の全掃引体積の比は、約６、約１０、約１２又はそれより多くに等しい、若しくはそれより大きくてよい。

カートリッジ・ベースの機器システム（a cartridge based instrument system）において、試薬管理システム及び／又はフロー・セルは、カートリッジ内に位置付けられ得る。カートリッジは、機器に取り外し可能に挿入可能であってよく、すなわち、カートリッジを機器に挿入及び機器から取り外すことができる。

したがって、カートリッジ・ベースの機器システムにおいて、全流体消費量に対する全掃引体積の大きな比（２、６、１０、１２またはそれより大きい）が特に有利であり得る。これは、取り込み試薬、切断試薬及びバッファー試薬が試薬管理システムの試薬ウェル内に保存されてよく、試薬管理システムはカートリッジの一部であり得るためである。したがって、試薬管理システムの試薬ウェルは、カートリッジに適合するため、各試薬の有限な全体積を保存するように構成され得る。全流体消費量に対する全掃引体積の大きな比により、同じ有限体積の試薬は、消費される前に試薬管理システム及びフロー・セルを数回掃引されることが可能となり、したがって、試薬交換が強化される。

図４を参照すると、本明細書で開示された態様に従う、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を決定する別の方法１５０のフロー図の例が示されている。方法１５０には、取り込みフェーズ１５２、画像フェーズ１５４、切断フェーズ１５６及び洗浄フェーズ１５８が含まれる。

取り込みフェーズ１５２の間、取り込み試薬１６０は、機器２００の試薬管理システム２０４及びフロー・セル２０２を介して流される（図７で最もよく見られる）。取り込み試薬は、ＤＮＡ鎖に蛍光標識されたヌクレオチドを組み込む化学物質の混合物であってよい。

フロー・セル２０２は、そこに位置付けられた第１ポリヌクレオチド１０８（図２で最もよく見られる）を有する。取り込み試薬は、塩基配列（ヌクレオチド１２０－１から１２０－５に関連付けられる）に第１塩基（ヌクレオチド１２０－６に関連付けられる）を付加する。塩基配列（及びそれらに関連するヌクレオチド１２０－１から１２０－６）は、第１ポリヌクレオチド１０８に相補的な第２ポリヌクレオチド１１０を形成する。

また、取り込み試薬におけるヌクレオチド１２０には、励起信号（この例では、励起光）を用いて塩基の種類の識別を可能にするタグ（この例では、蛍光タグ）も含まれる。また、ヌクレオチド１２０には当技術分野で知られている切断ターミネーター（又はブロッキング基）も含まれ、これは、第２ポリヌクレオチド１１０の１つより多くの塩基が第１ポリヌクレオチド１０８の塩基と一度に対になることを防ぐ。

次に、取り込みフェーズ１５２の間、洗浄試薬１６２は、いずれの過剰な取り込み試薬１６０も除去するために用いられる。洗浄試薬は、フロー・セルから活性試薬を除去するために利用される化学物質の混合物であり得る。

この方法は画像フェーズ１５４に進み、スキャン試薬１６４は、画像が撮影される前にフロー・セルの表面を光損傷から防ぐために用いられる。スキャン試薬１６４は、検出プロセス中にヌクレオチド鎖を安定化させる化学物質の混合物であり得る。

次に、画像フェーズ１５４の間、ヌクレオチド１２０－６の第１塩基が第２ポリヌクレオチド１１０に付加された後、ヌクレオチド１２０－６の第１塩基から生じる識別信号の画像が捕捉される１６６。

より具体的には、第２ポリヌクレオチド１１０に関連するヌクレオチド１２０の蛍光タグは励起光で励起され、特徴的な蛍光を放出する。次いで、蛍光の画像が撮影され、成長する第２ポリヌクレオチド１１０を形成するヌクレオチド１２０－１から１２０－６の配列において、新たに付加されたヌクレオチド１２０－６の塩基の種類に関する識別情報が供される。

次に、画像フェーズ１５４の間、追加のタグ付与試薬１６８は、新たに付加されたヌクレオチド１２０－６に第２タグを付加するために用いられる。タグ付与試薬１６８は、ヌクレオチドに蛍光タグを送達するために利用される化学物質の混合物であり得る。

次に、画像フェーズ１５４の間、洗浄試薬１７０は、過剰のタグ付与試薬１６８を除去するために用いられる。洗浄試薬１７０は、フロー・セルから活性試薬を除去するために利用される化学物質の混合物であり得る。

次に、画像フェーズ１５４の間、第２スキャン試薬１７２は、第２画像が撮影される前に、フロー・セルの表面を光損傷から保護するために適用される。第２スキャン試薬は、検出プロセス中にヌクレオチド鎖を安定化する化学物質の混合物であり得る。

次に、画像フェーズ１５４の間、ヌクレオチド１２０－６の第１塩基から生じる第２識別信号の第２画像が捕捉される１７４。より具体的には、第２ポリヌクレオチド１１０に関連するヌクレオチド１２０の蛍光第２タグが励起光で励起され、特徴的な第２蛍光を放出する。次いで、第２蛍光の画像が撮影され、新たに付加されたヌクレオチド１２０－６の塩基の種類に関するさらなる識別情報を供する。

方法は切断フェーズ１５６に進み、洗浄試薬１７６は、いずれの過剰な第２スキャン試薬１７２をも除去するために用いられる。洗浄試薬は、フロー・セルから活性試薬を除去するために利用される化学物質の混合物であり得る。

次に、切断フェーズ１５６の間、切断試薬１７８は、試薬管理システム２０４及びフロー・セル２０２を介して流され、ヌクレオチド１２０－６からターミネーターを除去する。これにより、ヌクレオチド１２０－１から１２０－６の配列における後続のヌクレオチド（図示せず）を第２ポリヌクレオチド１１０に付加することが可能になる。

方法は洗浄フェーズ１５８に進み、第１バッファー試薬は、連続する順流方向及び逆流方向の複数のサイクルで、試薬管理システム２０４及びフロー・セル２０２を介して流され、試薬管理システム及びフロー・セルから切断試薬１７８を洗浄する。第１バッファー試薬は、例えば、リポ酸が添加された緩衝化生理食塩水であり得る。

より具体的には、２２マイクロリットル（μＬ）の第１バッファー試薬の第１順流体積（１^ｓｔＦＦＶ）は順流方向１８０に流され、複数のサイクルの各サイクルを開始する。次いで、１９マイクロリットル（μＬ）の第１バッファー試薬の第２逆流体積（２^ｎｄＲＦＶ）は逆流方向１８２に流され、複数のサイクルの各サイクルを終了する。図４のこの具体例では、順流及び逆流の合計１２サイクルがある。

次に、洗浄フェーズ１５８の間、試薬管理システム２０４及びフロー・セル２０２を介する第１バッファー試薬の流れが実質的にないインキュベーション期間１８４がシステムに課される。この特定の例におけるインキュベーション期間１８４は、約３０秒の持続時間を有するものの、他のインキュベーション期間を用いてよい。

インキュベーション期間１８４の後、洗浄フェーズ１５８は第３順流１８６に進む。すなわち、１２マイクロリットル（μＬ）の第１バッファー試薬の第３順流体積（３^ｒｄＦＦＶ）は、インキュベーション期間１８４の後に順流方向に流される。

第１バッファー試薬は、洗浄フェーズ１５８において、システムから切断試薬１７８を実質的に除去するために利用される。しかしながら、切断試薬１７８の除去において有効である第１バッファー試薬における特定の化学物質も、次のサイクルの取り込み試薬を妨害し得る。このような化学物質のこのような一例は、リポ酸であり得る。

したがって、洗浄フェーズ１５８の間、第２バッファー試薬１８８の順流は、試薬管理システム及びフロー・セルを介して流され、第１バッファー試薬を除去する。第２バッファー試薬は、リポ酸のない生理食塩水であり得る。第２バッファー試薬は、切断試薬の除去において重要ではないものの、次のサイクルでの取り込み試薬１６０を妨害しない。

洗浄フェーズ１５８の完了後、次いで方法は取り込みフェーズ１５２に戻り１９０、第２ポリヌクレオチド１１０にヌクレオチドの配列における次のヌクレオチド１２０を付加するプロセスを開始する。

本明細書で前述したように、洗浄フェーズの間、第１バッファー試薬の全掃引体積は、式（（１^ｓｔＦＦＶ＋２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって実質的に決定され、ここで：
１^ｓｔＦＦＶは、第１順流体積であって、２２μＬに等しく、
２^ｎｄＲＦＶは、第２逆流体積であって、１９μＬに等しく、
Ｎは、複数のサイクルにおけるサイクルの全数であって、１２に等しく、及び
３^ｒｄＦＦＶは、第３順流体積であって、１２μＬに等しい。
したがって、図４の例において、全掃引体積は以下に等しい。
（２２＋１９）＊１２＋１２＝５０４μＬ

さらに、洗浄フェーズの間、第１バッファー試薬の全流体消費量は、以下の式によって実質的に決定される：
（１^ｓｔＦＦＶ＋２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ＋３^ｒｄＦＦＶ
さらに、図４の例において、全流体消費量は以下に等しい：
（２２－１９）＊１２＋１２＝４８μＬ

さらに、図４の例において、全流体消費量に対する全掃引体積の比は５０４／４８＝１０．５に等しい。比較として、以前のシステムの全流体消費量に対する全掃引体積の比は本質的に１である。これは、以前のシステムは、切断試薬の除去に効果的なバッファー試薬の順流のみを利用するためである。

図５及び図６は、非限定的な実施例から得られた結果を示す。

図５を参照すると、方法１５０の例示的な洗浄フェーズ１５８の間に得られた第１バッファー試薬の全流体消費量に対する全掃引体積の様々な比の実施例を示す表１９０が示されている。行１９０－１から１９０－７において、全流体消費量は４８μＬで一定に保持された。また、行１９０－２から１９０－７において、第１順流体積（１^ｓｔＦＦＶ）、第２逆流体積（２^ｎｄＲＦＶ）、サイクル数（Ｎ）及び第３順流体積（３^ｒｄＦＦＶ）は、全掃引体積が１００μＬから１２００μＬに増加するように変更され、一方で全流体消費量は４８μＬで一定に保持された。わかるように、全流体消費量に対する全掃引体積の比は、２．０８（行１９０－２）から２５（１９０－７）にまで変化した。

上の行１９０－１は以前の方法の比較例を表し、バッファー試薬の逆流及び順流のサイクルはなかった。むしろ、行１９０－１は洗浄フェーズ中に順流のみを有し、したがって、その全掃引体積はその全流体消費量に等しかった。

図６を参照すると、本明細書で開示された態様に従う、図５の作業実施例で得られたデータからプロットした全流体消費量に対する全掃引体積の比対プレフェージング勾配のグラフ１９２、１９４が示されている。グラフ１９４は、周囲温度（例えば２５～３５℃の範囲内の周囲温度）でプロットした。グラフ１９２は、周囲温度に８℃を加えた温度（例えば、３３～４３℃の範囲内の温度）でプロットした。

グラフ１９２及び１９４に示されるように、プレフェージング勾配は、サイクル当たり１塩基対進んでいるフロー・セルにおけるポリヌクレオチドのクラスター中の分子のパーセンテージ（％）として表される。プレフェージング勾配は、サイクル毎のプレフェージングの速度の尺度である。

プレフェージング値が低いほど、本明細書の方法の処理中の所与のポリヌクレオチド長さにおけるデータの品質はより良くなる。さらに、プレフェージング値が低いほど、成長され得るポリヌクレオチドは長くなる。

グラフ１９２及び１９４から決定され得るように、最も低いプレフェージング勾配が達成され得る全流体消費量に対する全掃引体積の比の最適範囲は、約６に等しい、又はそれより大きい。また、図５の実施例のプロットされたデータのグラフ１９２、１９４から決定され得る代替的な最適範囲は、約６～約１２となる。

最適範囲は、低いプレフェージング勾配に関連する。図６の実施例におけるほとんどの場合では、最適範囲は２．０％未満であるプレフェージング勾配割合に関連する。そのような低いプレフェージング勾配の割合により、相補的な第２ポリヌクレオチド１１０が、許容可能な精度内で、試薬の有限の量で以前得られたものより長い塩基の長さを構築することが可能とする、図５及び図６の実施例から得られた驚くべき結果が供された。図５及び図６の実施例において、カートリッジ・ベースの機器システムは、２００塩基の長さ、又はより高い割合の時間（例えば、９０％以上の時間）にまで、第２相補的ポリヌクレオチド１１０を正確に構築することが可能であった。したがって、第１ポリヌクレオチド１０８及び第２ポリヌクレオチド１１０の塩基対も、同じ高い割合の時間で２００塩基対以上の長さにまで正確に構築可能であった。

図７を参照すると、本明細書で説明される態様に従う機器２００の概略図の例が示されている。この特定の例において、機器にはそれに係合したカートリッジ２３０が含まれる。カートリッジ２３０には、試薬管理システム（ＲＭＳ）２０４と流体連通するフロー・セル２０２が含まれる。この特定の例において、ＲＭＳ２０４は中間接続２０６を介してフロー・セル２０２と流体連通する。カートリッジ２３０は機器２００に取り外し可能に挿入可能であってよい。これは、カートリッジが機器に挿入及び機器から除去され得ることを意味する。

この図７の例は、カートリッジ２３０に含まれるＲＭＳ２０４及びフロー・セル２０２を有するカートリッジ・ベースの機器２００を示しているものの、他の機器２００は、このようなカートリッジ・ベースのシステムを含まなくてよい。むしろ、いくつかの機器２００では、ＲＭＳ２０４の構成要素は、機器２００内に一体的に及び強固に取り付けられてよく、フロー・セル２０２のみが機器２００から取り外し可能であってよい。さらに、フロー・セル２０２は、カートリッジ２３０から取り外し可能であってよく、又は取り外し可能でなくてよい。

ＲＭＳには、複数の試薬ウェル２３２が含まれる。各試薬ウェル２３２は、そこに位置付けられる複数の試薬２０８～２１８の試薬を含むように作動可能である。ＲＭＳ２０４は、複数の試薬２０８～２１８の１つから試薬の流れ２３４を選択するように作動可能である。

また、ＲＭＳは試薬の流れ２３４を順方向及び逆方向に方向付けるように作動可能である。本明細書で用いられるように、順流は、試薬ウェル２３２からフロー・セル２０２への試薬の流れ２３４の方向を指す。本明細書で用いられるように、逆流は、フロー・セル２０２から試薬ウェル２３２への試薬の流れ２３４の方向を指す。

試薬２０８～２１８は、フロー・セルで実施される化学反応の種類及び順序に応じて、試薬の任意のいくつかの種類又は組み合わせであってよい。例えば、試薬２０８～２１８は以下の種類のものであってよい：
試薬２０８及び２０９は、取り込み試薬の異なる配合（又は製剤、formulation）であってよい。
試薬２１０及び２１１は、スキャン試薬の異なる配合であってよい。
試薬２１２は、切断試薬であってよい。
試薬２１４及び２１６は、バッファー試薬の異なる配合であってよい。
試薬２１８は、空気であってよい。

接続２０６には、ＲＭＳ出口ポート２５６を介してＲＭＳ２０４と流体連通する第１チャネル２３６が含まれる。第１チャネル２３６は、フロー・セル２０２の入口ポート２２０を介して、フロー・セル２０２のフロー・チャネル２２４に試薬の流れ２３４を経路決定するように作動可能である。また、接続２０６には、フロー・セル２０２の出口ポート２２２を介してフロー・チャネル２２４と流体連通する第２チャネル２３８が含まれる。第２チャネル２３８は、試薬の流れ２３４がフロー・チャネル２２４を通過した後、フロー・セル２０２から、ＲＭＳ入口ポート２５８を介してＲＭＳ２０４に戻る試薬の流れ２３４を経路決定するように作動可能である。

機器２００のフロー・セル２０２には、入口ポート２２０を介して第１チャネル２３６と流体連通し、出口ポート２２２を介して第２チャネル２３８と流体連通するフロー・チャネル２２４が含まれる。フロー・チャネル２２４は、複数の試薬２０８～２１８からの様々な試薬の流れ２３４と、フロー・セル２２４に位置付けられた、図２のポリヌクレオチド１０８などのポリヌクレオチドとの間の様々な化学反応を実行するように作動可能である。

図７の例は、単一の入口ポート２２０及び単一の出口ポート２２２を有するフロー・セル２０２を図示するものの、フロー・セルの他の構成も利用されてよい。例えば、フロー・セル２０２には、接続２０６の複数のチャネルから試薬の流れを受けるための複数の入口ポート２２０が含まれてよい。また、例として、フロー・セルには、接続２０６の複数のチャネルに試薬流を送るための複数の出口ポート２２２が含まれてよい。

図７の例は、中間接続２０６を介してＲＭＳ２０４と流体連通するフロー・セル２０２を示しているものの、フロー・セル２０２は、代わりに、それらの間の接続２０６を有さずにＲＭＳ２０４に直接接続されてよい。すなわち、ＲＭＳ出口ポート２５６は、フロー・セル入口ポート２２０に直接接続されてよく、ＲＭＳ入口ポート２５８は、フロー・セル出口ポート２２２に直接接続されてよい。

この例において、ＲＭＳ２０４には、試薬２０８～２１８を選択するための回転バルブ２４２が含まれる。回転バルブ２４２は、内部回転バルブ・ボディ２４４を有する。バルブ・ボディ２４４には、回転チャネル２５０によって接続される中心ポート２４６及び回転可能ポート２４８が含まれる。バルブ・ボディ２４４は、中心ポート２４６の周りを旋回し、回転可能ポート２４８を動かす。

試薬２０８～２１８を含む複数の試薬ウェル２３２は、回転バルブ２４２の周縁の周りに配置されてよく、又は回転バルブ２４２から離れて配置されてよい。各試薬ウェル２３２は、対応するウェル・チャネル２５２と流体連通する。各ウェル・チャネル２５２には、いずれの所与の試薬ウェル２３２から試薬の流れ２３４を受けるため、回転バルブ２４２の回転可能ポート２４８と整列し得る（align with）ウェル・チャネル・ポート２５４が含まれる。

回転可能ポート２４８がウェル・チャネル・ポート２５４の１つと整列する際、試薬の流れ２３４の流路を確立することにより、試薬の流れ２３４が選択されたウェル２３２からウェル・チャネル２５２を通り、回転バルブ２４２を通り、共通ライン２５５を通ってＲＭＳ出口ポート２５６から流出することが可能となる。次いで、試薬の流れ２３４は、第１チャネル２３６を通り、フロー・セル２０２の入口ポート２２０に入り、フロー・チャネル２２４を通って継続し、複数の試薬２０８～２１８の選択された試薬は、ポリヌクレオチド１０８と反応し得る。

未反応の試薬及び／又は反応の副生成物は、フロー・セル２０２の出口ポート２２２から第２チャネル２３８を通って流出してよい。次いで、試薬の流れ２３４は、ＲＭＳ入口ポート２５８を通ってＲＭＳ２０４に再び入ってよい。

ＲＭＳ２０４のＲＭＳ入口ポート２５８は、第１ピンチ・バルブ（pinch valve）と流体連通する。第１ピンチ・バルブ２６０は、第２ピンチ・バルブ２６２と流体連通する。第１ピンチ・バルブ２６０及び第２ピンチ・バルブ２６２には、ピンチ・バルブ２６０、２０２を通る試薬の流れ２３４をピンチ・オフする（pinch off）又は放出するように、機械的にまたは空気圧で作動し得る弾性中央部分が含まれる。さらに、ピンチ・バルブ２６０、２６２がこの例に図示されているものの、同じ機能を実施するために他の種類のバルブが利用されてよい。例えば、バルブ２６０、２６２は回転バルブであってよい。

また、搭載ポンプ２６４（シリンジ・ポンプ、又は同様のものなど）もＲＭＳ２０４に配置される。搭載ポンプ２６４は他の種類のポンプであってよいものの、本明細書ではシリンジ・ポンプ２６４と称される。シリンジ・ポンプ２６４は、第１ピンチ・バルブ２６０と第２ピンチ・バルブ２６２との間にＴ字の形態（tee formation）で接続される。ピンチ・バルブ２６０、２６２の両方は機器２００によって開閉され、シリンジ・ポンプ２６４をフロー・セル２０２及び／又は廃棄タンク２７０に係合又は脱係合する。

シリンジ・ポンプ２６４には、シリンダ・ボア（又はシリンダ穴、cylinder bore）２７０を有するシリンダ２６８に配置された往復プランジャ２６６が含まれる。プランジャ２６６は、プランジャ－シリンダ・ボアの封止を形成するため、シリンダ・ボア内に受けられる。プランジャ２６６は機器２００によって駆動され、シリンダ・ボア２７０内で往復運動し、試薬ウェル２３２から廃棄タンク２７２への順流方向に試薬２０８～２１８をポンプ輸送する。

機器２００が、試薬ウェル２３２からフロー・セル２０２へ、及びポンプ２６４への順流方向に試薬の流れ２３４をポンプ輸送するように作動可能であることに加え、器具２００は、試薬の流れ２３４を逆方向にポンプ輸送するように作動可能であってよい。すなわち、試薬２０８～２１８は、ポンプ２６４からフロー・セル２０２へ、及び試薬ウェル２３２への逆流方向にポンプ輸送されてよい。したがって、機器は、例えば、図３の方法１３０及び図４の１５０に従って、連続する順流方向及び逆流方向の複数のサイクルで、ＲＭＳ２０４及びフロー・セル２０２を通ってバッファー試薬２１４、２１６を流すように作動可能である。

また、試薬２０８～２１８によって引き起こされる化学反応により、ポリヌクレオチド１０８が検出可能な特性に影響するように誘導される場合、機器２００には、光の光子、又は検出可能な特性の他の形態を検出するように作動可能な検出モジュール２２６が含まれる。

図７に示される実装形態は、様々な試薬２０８～２１８を、共通ライン２５５を介してフロー・セル２０２に経路決定する回転バルブ２４２を利用する機器２００の実装形態であるものの、他の機器２００は、回転バルブ２４２を利用しなくてよい。例えば、各試薬ウェル２３２からのウェル・チャネル２５２は、複数の別個のＲＭＳ出口ポート２５６の１つにまで直接的に延在してよい。

その場合、各試薬ウェル２３２からの試薬の流れ２３４を制御するために、ウェル・チャネル２５２にはバルブ（図示せず）が各々含まれてよい。さらに、第１チャネル２３６は、対応するＲＭＳ出口ポート２５６から対応する試薬の流れ２３４を各々受けるための複数の第１チャネルであってよい。さらに、フロー・セル２０２の入口ポート２２０は、複数の第１チャネル２３６の各々から様々な試薬の流れ２３４を受けるための複数の入口ポート２２０であってよい。

図８を参照すると、図７の機器２００の概略ブロック図の例が示されている。機器２００には、カートリッジ２３０を受けるためのドッキング・ステーション（docking station）２７４が含まれる。フロー・セル２０２で実施される様々な化学反応のマイクロ流体分析操作中にカートリッジを操作するため、機器２００内の様々な電気的及び機械的アッセンブリは、カートリッジ２３０と相互作用する。

機器２００には、なかでも、マイクロ流体分析操作を実施するため、メモリ２７８に保存されたプログラム命令を実行することになる１つ又はそれより多くのプロセッサ２７６が含まれる。プロセッサは、回転バルブ駆動アッセンブリ２８０、シリンジ・ポンプ駆動アッセンブリ２８２、ピンチ・バルブ駆動アッセンブリ２８４、検出モジュール２２６及び温度調整アッセンブリ３０６と電子通信する。

ユーザー・インターフェース２８６は、ユーザーが機器２００の作動を制御及びモニタリング（又は監視、monitor）するために供される。通信インターフェース２８８は、機器２００と遠隔コンピュータ、ネットワークなどとの間で、データ及び他の情報を伝達し得る。

回転バルブ駆動アッセンブリ２８０には、回転バルブ・インターフェース・ブラケット２９２に機械的に結合される駆動シャフト２９０が含まれる。回転バルブ・インターフェース・ブラケット２９２は、カートリッジ２３０の回転バルブ２４２と選択的に、機械的に結合される。回転バルブ駆動アッセンブリ２８０には回転モーター２９４、及び、いくつかの実装形態では並進モーター２９６が含まれる。並進モーター２９６は、回転バルブ２４２との係合状態と非係合状態との間の並進方向に駆動シャフト２９０を移動させ得る。回転モーター２９４は、回転バルブ２４２の回転バルブ・ボディ２４４の回転を管理する。

また、回転バルブ駆動アッセンブリ２８０には、駆動シャフト２９０の位置をモニタリングする位置エンコーダ２９８も含まれる。エンコーダ２９８により、プロセッサ２７６に位置データが供される。

シリンジ・ポンプ駆動アッセンブリ２８２には、延長可能シャフト３０２に結合されるシリンジ・ポンプ・モーター３００が含まれる。シャフト３０２は、シリンジ・ポンプ・モーター３００によって延長位置と収縮位置との間で駆動され、シリンジ・ポンプ２６４のシリンダ２６８のシリンダ・ボア２７０内でプランジャ３６６を往復運動させる。

ピンチ・バルブ駆動アッセンブリ２８４には、２つの空気圧駆動ピンチ・バルブ駆動モーター３０４のセットが含まれる。２つのピンチ・バルブ駆動モーター３０４は、第１ピンチ・バルブ２６０及び第２ピンチ・バルブ２６２の対応する一方に機械的に結合される。ピンチ・バルブ駆動モーター３０４は、第１ピンチ・バルブ２６０及び／又は第２ピンチ・バルブ２６２の弾性中央部分をピンチ・オフ又は解放するために空気圧を利用して、第１ピンチ・バルブ２６０及び／又は第２ピンチ・バルブ２６２を空気圧で開閉してよい。代替的に、ピンチ・バルブ駆動モーター３０４は電気的に駆動されてよい。

検出モジュール２２６には、フロー・セル２０２におけるポリヌクレオチド１０８に関連する発光光子、又は検出可能な特性の他の形態の検出を可能とするために適切な及び／又は必要なカメラ及び／又は検出センサーの全てが含まれてよい。次いで、機器２００内のデバイス回路（図示せず）は、これらの検出された放出に由来するデータ信号を処理及び送信してよい。次いで、データ信号はポリヌクレオチド１０８の特性を明らかにするために分析されてよい。

また、温度調整アッセンブリ３０６（又は他の環境制御デバイス）も機器２００内に含まれてよい。温度調整アッセンブリ３０６は、様々な化学反応中にフロー・セル２０２の温度制御を供するために利用されてよい。より具体的には、温度調整アッセンブリ３０６によってフロー・セル２０２の加熱及び冷却の両方が供され、それによってフロー・セル２０２の熱サイクルが可能となる。環境制御デバイスは、温度以外のパラメータ（例えば、圧力）を制御又は調整し得る。

本明細書でより詳細に説明される前述の概念及び後述の概念の全ての組合せは（このような概念が相互に矛盾しないという条件で）、本明細書で開示される本発明の主題の一部であると考えられるということが理解されるべきである。特に、本開示の最後にある主張された主題の全ての組合せは、本明細書で開示される本発明の主題の一部であると考えられる。

前述の開示は、特定の例示を参照することによって説明されているものの、多くの変更が説明された本発明の概念の精神及び範囲内でなされ得るということが理解されるべきである。したがって、本開示は、説明された例示に制限されるのではなく、後述の特許請求の範囲の文言によって定義される全範囲を有するということが意図されている。

Claims (26)

1. 機器の試薬管理システム及びフロー・セルを通るように取り込み試薬を流すことであって、フロー・セルは該フロー・セル内に位置付けられる第１ポリヌクレオチドを有し、取り込み試薬は塩基配列に第１塩基を付加し、塩基配列は第１ポリヌクレオチドに相補的な第２ポリヌクレオチドを含んで成る、こと；
   第１塩基が第２ポリヌクレオチドに付加された後、第１塩基から生じる識別信号の画像を捕捉すること；
   試薬管理システム及びフロー・セルを通るように切断試薬を流し、塩基配列における後続の塩基を第２ポリヌクレオチドへ付加可能とするため、第１塩基から第１ターミネーターを除去すること；並びに
   連続する順流方向及び逆流方向の複数のサイクルで、試薬管理システム及びフロー・セルを通るようにバッファー試薬を流すこと
   を含む、方法。
2. 複数のサイクルが、４以上のサイクルを含む、請求項１に記載の方法。
3. 複数のサイクルが、１２以上のサイクルを含む、請求項１に記載の方法。
4. 試薬管理システム及びフロー・セルが機器のカートリッジ内に位置付けられ、カートリッジは取り外し可能に機器に挿入可能である、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
5. 取り込み試薬、切断試薬及びバッファー試薬が試薬管理システムの試薬ウェル内に保存され、試薬ウェルは各試薬の有限の全体積を保存するように作動可能である、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
6. バッファー試薬を流すことが、
   複数のサイクルの各サイクルの順流方向にバッファー試薬の第１順流体積を流すこと；及び
   複数のサイクルの各サイクルの逆流方向にバッファー試薬の第２逆流体積を流すこと
   を含み、第１順流体積は第２逆流体積より大きい、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
7. 順流体積が、逆流体積より約３％以上大きい、請求項６に記載の方法。
8. バッファー試薬を流すことが、
   複数のサイクルの最後のサイクルの後、約１０秒以上、試薬管理システム及びフロー・セルを通るバッファー試薬の流れが実質的にないインキュベーション期間；並びに
   インキュベーション期間後、順流方向にバッファー試薬の第３順流体積を流すこと
   を含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
9. バッファー試薬を流す間、バッファー試薬の全掃引体積が、式（（１^ｓｔＦＦＶ＋２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって実質的に決定され、ここで、
   １^ｓｔＦＦＶは第１順流体積であり、
   ２^ｎｄＲＦＶは第２逆流体積であり、
   Ｎは複数のサイクルにおける全サイクル数であり、及び
   ３^ｒｄＦＦＶは第３順流体積
   である、請求項８に記載の方法。
10. バッファー試薬を流す間、バッファー試薬の全流体消費量は、式（（１^ｓｔＦＦＶ－２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって実質的に決定される、請求項９に記載の方法。
11. バッファー試薬の全流体消費量に対するバッファー試薬の全掃引体積の比が約６に等しい、又は約６より大きい、請求項１０に記載の方法。
12. 順流方向における流れ及び逆流方向における流れは、順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルに関して約１秒以下の遅延時間によって分離される、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
13. 順流方向における流れ及び逆流方向における流れは、順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルに関して約２００ミリ秒以下の遅延時間によって分離される、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
14. 順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルは約２００ミリ秒以下の遅延時間によって分離される、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
15. 機器であって、
    機器内に位置付けられた、試薬管理システム；及び
    機器内に位置付けられた、フロー・セル
    を有して成り、
    試薬管理システムは複数の試薬ウェルを有して成り、試薬ウェルは、少なくとも第１試薬ウェル、第２試薬ウェル、及び第３試薬ウェルを有し、第１試薬ウェル、第２試薬ウェル、及び第３試薬ウェルは、それぞれに位置付けられる取り込み試薬、切断試薬及びバッファー試薬を収容するように作動可能であり、試薬管理システムは複数の試薬ウェルの１つから試薬の流れを選択するためのものであり、
    フロー・セルは試薬管理システムと流体連通するフロー・チャネルを有して成り、フロー・チャネルは該フロー・チャネルに位置付けられる第１ポリヌクレオチド上における試薬の流れを経路決定するためのものであり、
    機器は、
    試薬管理システム及びフロー・セルを通るように取り込み試薬を流して、第１ポリヌクレオチドに相補的な第２ポリヌクレオチドを含んで成る塩基配列に第１塩基を付加し；
    第１塩基が第２ポリヌクレオチドに付加された後、第１塩基から生じる識別信号の画像を捕捉し；
    塩基配列における後続の塩基を第２ポリヌクレオチドに付加できるように第１塩基から第１ターミネーターを除去するために、試薬管理システム及びフロー・セルを通るように切断試薬を流し；並びに
    連続する順流方向及び逆流方向の複数のサイクルで、試薬管理システム及びフロー・セルを通るようにバッファー試薬を流すように、
    作動可能である、機器。
16. 機器が、連続する順流方向及び逆流方向の複数の４以上のサイクルで試薬管理システム及びフロー・セルを通してバッファー試薬を流すように作動可能である、請求項１５に記載の機器。
17. 機器が、連続する順流方向及び逆流方向の複数の１２以上のサイクルで試薬管理システム及びフロー・セルを通してバッファー試薬を流すように作動可能である、請求項１５に記載の機器。
18. 機器は、順流方向及び逆流方向の複数のサイクルの各サイクルに関して順流方向の流れ及び逆流方向の流れが約２００ミリ秒以下の遅延時間によって分離されるようにバッファー試薬を流すように作動可能である、請求項１５～１７のいずれかに記載の機器。
19. 試薬管理システムが取り外し可能に機器に挿入可能である、請求項１５～１８のいずれかに記載の機器。
20. フロー・セルが取り外し可能に機器に挿入可能である、請求項１５～１９のいずれかに記載の機器。
21. 機器が、
    試薬管理システム及びフロー・セルを収容するためのカートリッジ
    を有して成り、
    取り込み試薬、切断試薬及びバッファー試薬は試薬管理システムの試薬ウェル内に保存され、試薬ウェルは各試薬の有限の全体積を保存する、請求項１５～２０に記載の機器。
22. カートリッジは取り外し可能に機器に挿入可能である、請求項２１に記載の機器。
23. 機器は、
    バッファー試薬の第１体積が複数のサイクルの各サイクルの順流方向に流され；
    バッファー試薬の第２体積が複数のサイクルの各サイクルの逆流方向に流されるように
    バッファー試薬を流すように作動可能であって、
    第１体積は第２体積より大きい、請求項１５～２２のいずれかに記載の機器。
24. 順流体積が逆流体積より約３％以上大きい、請求項２３に記載の機器。
25. 機器は、
    複数のサイクルの最後のサイクル後、試薬管理システム及びフロー・セルを通るバッファー試薬の流れが実質的にないインキュベーション期間が約１０秒以上課され；並びに
    インキュベーション期間後、バッファー試薬の第３順流体積が順流方向に流されるように
    バッファー試薬を流すように作動可能である、請求項２３又は２４に記載の機器。
26. 機器は、
    バッファー試薬の全掃引体積が、式（（１^ｓｔＦＦＶ＋２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって実質的に決定され、ここで、
    １^ｓｔＦＦＶは第１順流体積であり、
    ２^ｎｄＲＦＶは第２逆流体積であり、
    Ｎは複数のサイクルにおける全サイクル数であり、及び
    ３^ｒｄＦＦＶは第３順流体積であり；
    バッファー試薬の全流体消費量が、式（（１^ｓｔＦＦＶ－２^ｎｄＲＦＶ）＊Ｎ）＋３^ｒｄＦＦＶによって実質的に決定され；並びに
    バッファー試薬の全流体消費量に対するバッファー試薬の全掃引体積の比が約６に等しい、又は約６より大きいように、
    バッファー試薬を流すように作動可能である、請求項２５に記載の機器。

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