KR20220013517A

KR20220013517A - 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20220013517A
Application number: KR1020200092148A
Authority: KR
Inventors: 백준석; 기호삼; 강승혜; 임예지; 김영수
Original assignee: 주식회사 라비오
Priority date: 2020-07-24
Filing date: 2020-07-24
Publication date: 2022-02-04
Also published as: KR102416743B1

Abstract

본 발명은 발아식물을 발효하여 얻은 추출물을 포함하는 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 발아식물이 가지는 유효성분의 함량을 증가시키는 동시에 세포에 유해한 독성 성분을 최소화하여 유익한 효과를 증대시킬 수 있다. 또한, 항산화 또는 항염 효과가 향상된 천연물질로서 다양한 분야에 용이하게 적용할 수 있다.

Description

발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물 및 그 제조방법{COMPOSITION COMPRISING FERMENTED GERMINATING PLANT EXTRACT AND PREPARATION METHOD THEREOF}

본 발명은 발아식물을 발효하여 얻은 추출물을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

식물의 씨앗 내에는 생명의 유지에 필요한 영양소가 충분하다. 또한, 식물을 비롯한 생명체는 보통 싹이 트거나 성장하는 어린 시기에 성장력이 가장 왕성하다. 이 때 성장에 필요한 물질들이 생합성되며, 발아 시기에는 비타민, 미네랄 등의 유효성분 함량이 일반 성체의 최소 3배 이상이다.

식물의 싹이 발아할 때 생합성되는 새로운 물질들은 인체에 유익한 효과를 주는 성분들을 많이 함유하지만, 그 중 독성 성분이 포함되는 경우가 있다. 발아 시 생성되는 독성 성분은 인체에 유해한 영향을 줄 수 있으며, 예를 들면 감자, 가지, 토마토 등의 식물에 있어서 독성 성분이 생성될 수 있으므로 주의가 필요하다.

종래에는 새싹 또는 발아식물들이 포함하는 유효성분들의 효과가 알려지며 이를 적용한 제품들이 제조되고 있다.

그러나, 발아식물의 함량을 증가시키는 경우 이들이 가지는 독성 성분으로 인하여 세포가 유해한 영향을 받을 수 있으며, 예를 들면 배탈, 설사, 알러지 등이 유발될 수 있다.

그러므로, 발아식물이 가지는 유효성분의 효능을 극대화하면서 독성에 대한 안전성을 향상시키기 위한 연구가 필요하다.

본 발명의 목적은 발아식물을 발효하여 얻은 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

발아식물에 미생물을 접종하여 발효물을 제조하는 단계; 및

상기 발효물을 용매 추출하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법을 제공한다.

일구현예에 따르면, 상기 발아식물은 카뮤트(Kamut) 새싹, 새싹귀리, 밀크시슬 새싹, 알팔파(alfalfa) 새싹 및 브로콜리 새싹으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 미생물은 Saccharomyces sp., Lactobacillus sp. 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효물을 제조하는 단계는 상기 발아식물에 상기 미생물을 1일 1 내지 5회 접종하여 4 내지 10일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효물을 제조하는 단계는 상기 발아식물에 Saccharomyces sp.를 1일 1 내지 5회 접종하여 2 내지 5일 동안 발효하는 단계; 및

Lactobacillus sp.를 1일 1 내지 5회 접종하여 2 내지 5일 동안 발효하는 단계를 순차적으로 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효물을 제조하는 단계는 상기 발아식물에 Saccharomyces sp. 및 Lactobacillus sp.를 2:1 내지 10:1 중량비로 접종하는 단계를 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 용매는 물, 에탄올 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 추출물을 수득하는 단계는 상기 발아식물에 5 내지 20중량 배수의 용매를 첨가하고, 10초 내지 12시간 동안 교반하는 단계를 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 본 발명에 따른 제조방법은 상기 추출물을 농축하여 분말을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기한 바와 같은 방법으로 제조된, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.

일구현예에 따르면, 상기 조성물은 항염 또는 항산화용으로 적용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 항염 또는 항산화용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 항염 또는 항산화용 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 조성물을 포함하는 항염 또는 항산화용 약학 조성물을 제공한다.

기타 본 발명에 따른 구현예들의 구체적인 사항은 이하의 상세한 설명에 포함되어 있다.

본 발명에 따르면, 발아식물의 유효성분 함량을 증가시키는 동시에 독성을 최소화하여 세포에 유익한 효과를 증대시킬 수 있다.

또한, 항산화 또는 항염 효과가 향상된 천연물질로서 다양한 분야에 용이하게 적용할 수 있다.

도 1은 세포독성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 유효성분의 함량 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 활성산소 소거능을 나타내는 그래프이다.
도 4 및 5는 염증 유발 물질의 발현 정도를 나타내는 그래프이다.

본 발명은 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예를 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

본 명세서 내에서 특별한 언급이 없는 한, "내지"라는 표현은 해당 수치를 포함하는 표현으로 사용된다. 구체적으로 예를 들면, "1 내지 2"라는 표현은 1 및 2를 포함할 뿐만 아니라 1과 2 사이의 수치를 모두 포함하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명의 구현예에 따른 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물 및 그 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.

근래에는 발아식물의 유익한 효능이 알려지면서 이를 다양한 제품에 적용하려는 시도가 계속되고 있다. 식물은 발아를 위하여 필요한 많은 유효성분을 생합성한다. 하지만, 이 때, 곰팡이, 박테리아 등과 같은 외부 환경으로부터의 방어를 위하여 독성 성분 또한 생합성할 수 있다.

그러므로, 본 발명에서는 발아식물이 가지는 유효성분을 극대화하고, 독성 성분을 최소화하기 위한 조성물 및 그 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 발아식물에 미생물을 접종하여 발효물을 제조하는 단계; 및

일구현예에 따르면, 상기 발아식물은 종자(씨앗)를 1일 내지 10일 동안 생장시킨 식물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 카뮤트(Kamut) 새싹, 새싹귀리, 밀크시슬 새싹, 알팔파(alfalfa) 새싹 및 브로콜리 새싹으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

카뮤트(Kamut)는 이집트에서 재배하기 시작한 고대 원시 곡물 중 하나이다. 또한, 호라산 밀(Khorasan Wheat)의 한 종류로서 일반 밀보다 2배 정도 큰 크기이며 단백질 함량이 높다. 식이섬유, 미네랄, 마그네슘, 아연, 철분, 비타민 B군 및 셀레늄 등의 유효성분을 포함한다. 다만, 과하게 섭취하는 경우 구토, 설사, 탈모 등의 부작용이 발생할 수 있다.

새싹귀리는 귀리를 발아시켜 수확한 새싹으로, 베타글루칸, 아미노산, 폴리페놀, 엽록소, 칼슘, 비타민 B 등의 유효성분을 포함한다. 다만, 과다 섭취 시 복통, 설사, 복부팽만, 신장질환의 부작용이 발생할 수 있다.

밀크시슬(milk thistle)은 잎, 줄기, 뿌리, 씨앗의 모든 부분을 식용할 수 있고, 특히 열매 및 씨앗에는 플라보노리그난을 함유되어 있고, 전체 주요 구성 성분으로는 실리마린을 포함한다. 실리마린은 간세포의 세포막을 보호하여 간 기능을 개선한다고 알려져 있다. 다만, 과다 섭취 시 구역질, 가스, 설사 등이 발생할 수 있다.

알팔파 새싹은 콩과 다년생초본으로써 비타민 A,B,C,D,K,U 등 포함되어 있고, 사포닌과 베타카로틴, 아르기닌, 파이토에스트로겐 등 유효성분을 함유하고 있다. 다만, 과다 섭취 시 위장장애, 설사 등을 유발할 수 있다.

브로콜리 새싹은 브로콜리 씨앗을 4~6일 정도 생장시킨 것이다. 다 자란 브로콜리에 비하여 설포라판(sulforaphane)이 풍부하고, 비타민 C, 비타민 A, 비타민 B, 칼륨, 인, 칼슘 등의 유효성분을 포함한다. 다만, 과다 복용 시 위장장애, 설사, 복통의 부작용이 발생할 수 있다.

본 발명은 발아식물이 가지는 독성 성분으로 인한 부작용을 최소화하기 위하여 미생물을 이용한다. 미생물은 예를 들면, Saccharomyces sp., Lactobacillus sp. 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 1종 이상의 미생물은 발아식물에 동시에 또는 각각 순차적으로 접종할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효물을 제조하는 단계는 발아식물에 미생물을 1일 1 내지 5회, 예를 들면 1일 1 내지 3회 접종하여, 4 내지 10일, 예를 들면 5 내지 7일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.

구체적으로 예를 들면, 발아식물에 1종 이상의 미생물을 동시에 1일 1 내지 5회 접종하고, 4 내지 10일 동안 발효하여 발효물을 제조할 수 있다. 또한, 예를 들면 발아식물에 Saccharomyces sp.를 1일 1 내지 5회, 예를 들면 1 내지 3회 접종하여 2 내지 5일, 예를 들면 3 내지 4일 동안 발효한 후, Lactobacillus sp.를 1일 1 내지 5회, 예를 들면 1 내지 3회 접종하여 2 내지 5일, 예를 들면 3 내지 4일 동안 발효하여 발효물을 제조할 수 있다. 이 때, Saccharomyces sp. 처리량은 1 X 10⁷~ 1 X 10¹²CFU/ml, 예를 들면 1 X 10¹⁰~ 1X10¹²CFU/ml 농도로 1일 10% 내지 80%일 수 있고, Lactobacillus sp. 처리량은 1 X 10⁷~ 1 X 10¹²CFU/ml. 예를 들면 1 X 10¹⁰~ 1 X 10¹²CFU/ml 농도로 1일 5% 내지 10%일 수 있다.

또한, 예를 들면 발아식물에 Lactobacillus sp.를 1일 1 내지 5회, 예를 들면 1 내지 3회 접종하여 접종하여 2 내지 5일, 예를 들면 3 내지 4일 동안 발효한 후, Saccharomyces sp.를 1일 1 내지 5회, 예를 들면 1 내지 3회 접종하여 2 내지 5일, 예를 들면 3 내지 4일 동안 발효하여 발효물을 제조할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효물을 제조하는 단계는 상기 발아식물에 Saccharomyces sp. 및 Lactobacillus sp.를 접종하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 접종한 Lactobacillus sp. 총 중량에 대한 Saccharomyces sp. 총 중량은 2 이상일 수 있다. 또한, 예를 들면, Saccharomyces sp. 및 Lactobacillus sp.의 중량비는 2:1 내지 10:1, 예를 들면 3:1 내지 5:1일 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 발효물을 열수 추출, 에탄올(주정)추출 또는 이들 조합의 방법으로 추출하여 추출물을 수득할 수 있다. 예를 들면, 상기 발효물로부터 에탄올 추출하여 추출물을 제조할 수 있다.

용매로 사용되는 물은 증류수를 사용할 수 있으나, 화장료, 식품 또는 의약품에 사용할 수 있는 정도의 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 또한, 에탄올 추출 용매로는 예를 들면, 70%(v/v) 농도의 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.

일구현예에 따르면, 상기 추출물을 수득하는 단계는 상기 발아식물에 5 내지 20중량 배수, 예를 들면 5 내지 15 또는 5 내지 10 중량 배수의 용매를 첨가하고, 10초 내지 12시간, 예를 들면 1시간 내지 4시간 동안 교반하는 단계를 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 본 발명은 상기 추출물을 정제하는 단계를 더 포함할 수 있다. 정제방법으로는 원심분리, 필터 등 당업계에서 일반적으로 사용하는 방법이라면 특별히 제한되지는 않는다.

또한, 액상 상태의 추출물을 농축하여 분말을 제조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 농축은 가열, 감압, 통풍, 냉동, 분무, 삼투압, 역삼투압 방법 등을 적용할 수 있으나, 상기한 방법에 특별히 한정되지는 않으며, 예를 들면, 회전증발농축기를 사용할 수 있다.

가열농축은 농축 대상을 가열하여 용매만을 기체로 증발시키는 방법이다. 감압농축은 감압 하에서 진행하여 농축 속도를 향상시킬 수 있다. 통풍농축은 실온 또는 고온에서 기체와 액체의 계면에 기체를 가하여 농축하는 방법이다. 냉동농축은 열에 약한 용질에 적용하기 용이한 것으로, 농축 대상을 냉각하여 고체상이 된 용매를 석출하는 방법이다. 분무농축은 농축 대상을 압출하여 표면적을 증대시키는 것으로, 가열 또는 감압을 함께 적용하여 급속한 농축을 진행할 수 있다. 삼투압 또는 역삼투압 농축은 반투막을 이용하여 농축 대상이 가지는 삼투압 이상의 압력을 가하여 통과시켜 분리하는 방법이다.

일구현예에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 발아식물 원재료에 비하여 항산화 물질의 함량을 월등히 향상시킬 수 있다. 항산화 물질로는 대표적으로 폴리페놀(polyphenol)과 같은 성분을 포함할 수 있다. 폴리페놀은 활성 산소를 저해하여 항산화 효과를 가지며, 노화를 방지한다. 또한, 활성 산소에 노출되어 손상되는 DNA 보호, 세포 구성 단백질 및 효소를 보호하는 기능이 뛰어나 다양한 질병에 대한 위험도를 낮춘다고 알려져 있다. 더불어 항암 작용과 함께 심장 질환을 막아주는 역할을 한다.

일구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 항염 또는 항산화 용도로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 통상적인 화장료 조성물, 피부 외용제 약학 조성물 등 피부학적으로 적용이 가능한 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 피부학적으로 적용이 가능하다는 것은 적용 대상에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 할 수 있는 조성물로서, 피부에 적용할 수 있는 외용제를 포함할 수 있으며, 상기 조성물로부터 기인하는 부작용이 유효 성분의 효능을 저하시키기 않고, 적용 대상에 심각한 자극을 유발하지 않으면서 유효성분들의 활성 및 물성을 손상시키지 않는다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유액, 유탁액, 페이스트, 겔, 팩, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 스프레이 및 모발 화장료 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 헤어샴푸, 풋샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 및 바디클린저의 제형 등으로 제조될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기한 바와 같은 조성물을 포함하는 기능성 식품 조성물을 제공할 수 있다. 예를 들면, 상기 기능성 식품은 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 또한, 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 상기 기능성 식품은 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 희석제, 부형제 등을 첨가하여 제제화할 수 있다. 상기 담체, 부형제, 희석제 및 첨가제의 구체적인 예로는 이에 한정하는 것은 아니나, 락토즈, 덱스트로즈, 슈크로즈, 솔비톨, 만니톨, 에리스리톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 미세결정성 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 메틸셀룰로즈, 물, 설탕시럽, 메틸셀룰로즈, 메틸 하이드록시 벤조에이트, 프로필하이드록시 벤조에이트, 활석, 스테아트산 마그네슘 및 미네랄 오일로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.

일구현예에 따르면, 본 발명에 따른 약학 조성물은 약제적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 윤활제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료, 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제 등을 혼합하여 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 제형은 용액, 현탁액, 연고, 정제, 캡슐 등으로 제형화 할 수 있으나, 상기한 바에 한정하지는 않는다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예

카뮤트(Kamut^®) 종자를 4 내지 6일 동안 생장시켜 싹을 틔운 후, 건조된 카뮤트 새싹을 분말로 제조하였다. 카뮤트 새싹 분말은 상업적으로 입수 가능한 것으로 대체할 수 있다.

Saccharomyces cerevisiae(사카로미세스 세레비시아, KCTC7296, 생물자원센터)를 YM배지에 1 내지 3일 배양하여 용액을 제조하였다.

또한, Lactobacillus sakei(락토바실러스 사케이, KCTC3802, 생물자원센터)를 MRS배지에 1 내지 3일 배양하여 용액을 제조하였다.

카뮤트 새싹 분말에 먼저 Saccharomyces sp. 용액을 3일 동안, 1일 1 내지 3회 분무 접종하여 발효하였다. 그 후, Lactobacillus sp. 용액을 3일 동안, 1일 1 내지 3회 분무 접종하여 발효하여 발효물을 제조하였다. 이 때, 접종한 Saccharomyces sp. 용액은 1 X 10¹⁰~ 1 X 10¹²CFU/ml 농도로 1일 10% 내지 80% 양이고, Lactobacillus sp.용액은 1 X 10¹⁰~ 1 X 10¹²CFU/ml 농도로 1일 5% 내지 10% 양이다.

각각의 균주 분무량은 표 1과 같다.

Day	Saccharomyces sp.(ml)	Lactobacillus sp.(ml)
0	40	0
1	10	0
2	5	0
3	0	4
4	0	4
5	0	4

상기 발효물에 70%(v/v) 농도로 에탄올을 10배의 중량배수로 첨가하여 2시간 동안 교반 추출하였다. 그 후, 원심분리 및 필터하여 순수한 액상 형태의 추출물을 수득하였다. 수득한 추출물을 회전증발농축기로 분말화하여 발효 카뮤트 새싹 분말을 제조하였다.

비교예: 발효 전 카뮤트 새싹 분말 제조

발효 전 카뮤트 새싹 분말을 제조하기 위하여 카뮤트 새싹 건조물에 그의 10배 중량의 해당하는 양의 70% (w/v) 농도의 에탄올을 첨가하여 2시간 동안 교반 추출한다. 그 후, 원심분리 및 필터하여 순수한 액상 형태의 추출물을 수득한다. 수득한 추출물을 회전증발농축기로 분말화하여 발효 전 카뮤트 새싹 분말을 제조하였다.

실험예 1: 세포독성 확인

본 발명에 따른 조성물의 세포독성을 확인하기 위하여 Raw264.7 세포를 사용하였다. Raw264.7 세포에 비교예에 따른 발효하지 않은 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 전) 및 실시예에 따른 발효 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 후)을 농도 별로 처리하여 WST-1 assay로 세포의 생존율을 확인하였다. WST는 살아있는 세포의 양을 측정하는 제품으로써 cell viability를 측정하는데 사용된다. 96 well plate에 각각의 셀을 2 X 10⁴ cell/well로 시딩(seeding)하고, 5% CO₂, 37℃로 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후, 세럼 프리 배지로 교체하여 starvation 시키고 24시간 배양하였다. 발효하지 않은 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 전)과 발효 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 후)를 각각의 농도로 처리하여 5% CO₂, 37℃로 배양기에서 24시간 배양한 후, WST-1 solution을 처리하고 2시간 배양하였다. 배양 후, 흡광도 측정 기기(Multiskan GO, Thermo Fisher Scientific)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과를 바탕으로 아래의 세포생존율을 산출식을 통해 세포의 생존율을 시료를 처리하지 않은 군과 비교하여 %로 나타내었다.

세포 생존율(%) = [시료첨가군의 흡광도 (450 nm) / 시료 무첨가군의 흡광도 (450 nm)] × 100

도 1에 도시된 세포 독성 결과와 같이, 발효 전 Kamut는 약 0.6mg/ml 농도 이하에서 독성이 없음을 확인하였고, 발효 후 Kamut는 1.25mg/ml 농도 이하에서 독성이 없음을 확인하였다. 즉, 발효 후 Kamut(실시예)는 발효 전 Kamut에 비하여 2배 이상 높은 농도로 사용할 수 있음을 알 수 있다.

실험예 2: 유효성분 함량 분석

발효 전, 후 카뮤트 새싹 분말의 유효성분 함량 변화를 확인하였다. 구체적으로 0.1% w/v Gallic acid 표준 용액을 제조하여 10 내지 100 ppm 농도로 희석 후 2 N Folin & Ciocalteu's phenol reagent를 넣어 상온에서 5분간 반응시킨다. 이 후 7% w/v Na₂CO₃ 용액과 증류수를 첨가하여 상온에서 90분간 반응시킨다. 반응 종료 후 750nm 파장에서 흡광도를 측정하여 검정곡선을 구하고, 카뮤트 새싹 분말의 발효 전, 후 분말 시료도 상기와 같은 방법으로 반응시킨 후 750nm 파장에서 흡광도를 측정하여 Gallic acid 검정곡선에 대입하여 폴리페놀(polyphenol) 함량을 분석하였다. 이 때 대조군으로 증류수를 이용하였다.

구분	발효 전 폴리페놀 함량(%)	발효 후 폴리페놀 함량(%)
발효 0일차	2.52	-
발효 3일차	2.52	2.57
발효 6일차	2.52	2.63

도 2 및 표 2에 도시된 바와 같이, 발효 전의 카뮤트 새싹 분말은 폴리페놀의 함량이 2.52%로 배양 시간에 따른 변화가 없다. 반면, 발효한 카뮤트 새싹 분말(실시예)는 배양 시간에 따라 폴리페놀의 함량이 증가하는 것을 확인하였다.

실험예 3: 항산화 효과 확인

발효 전, 후 카뮤트 새싹 분말의 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 라디칼 소거능 분석을 실시하였다. 1mM DPPH 용액을 메탄올에 녹여 즉시 사용하였다. 시료 용액과 DPPH 용액을 1:1로 혼합하여, 상온 암소에서 30 분간 방치하였다. 이때 양성 대조군(positive control)으로 아스코르브산(ascorbic acid) 1 mg/ml을 사용하였다. 30분 방치 후, 흡광도 측정 기기 (Multikan Go, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(control) 대비 라디컬 비율 (%)를 산출하였다.

도 3에 도시된 바와 같이, 발효하지 않은 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 전)은 5mg/ml 농도에서 약 58%의 자유라디칼 소거능을 나타내었다. 그에 비하여, 발효한 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 후)은 5mg/ml 동일 농도에서 약 72%로 더 높은 자유라디칼 소거능을 나타내었다.

실험예 4: 항염 효과 확인

실험예 4-1: COX-2 mRNA

발효 전, 후 카뮤트 새싹 분말의 항염 효과를 확인하기 위하여 COX-2 mRNA 발현 정도를 분석하였다. HaCaT cell line을 10% FBS(fetal bovine serum)와 1X 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 함유된 DMEM 배지에 배양하고 세포를 카운팅한 뒤 6-well 플레이트에 5 x 10⁵ cell/well이 되도록 희석하여 시딩하고 5% CO₂, 37℃로 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 세럼 프리 배지로 교체 후 starvation 시키고, 카뮤트 발효 전 후 시료를 농도별로 희석하여 처리하였다. 양성 대조군(positive control)으로는 덱사메타손(dexamethasone, Dex)을 사용하였다. 10㎍/ml으로 처리 후 시료와 함께 5% CO₂, 37℃로 배양기에서 1시간 배양하고 LPS가 1㎍/ml이 되도록 처리 후 5% CO₂, 37℃로 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS로 워싱 하였다. 그 후 각 시료의 세포에서 RNA Extraction Kit (TaKaRa Mini BEST Universal kit)를 이용해서 RNA를 분리한 뒤 Qubit Fluorometer로 RNA를 정량한 후, 각각 1㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(Step One Plus, Applied Biosystems). 합성된 cDNA에 타겟 단백질인 COX-2 프라이머와 시아닌 염료인 사이버그린(Power SYBR Green PCR Master Mix, Applied Biosystems)을 첨가한 혼합물을 이용하여 Real-Time PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시함으로써 최종적으로 COX-2 유전자의 발현 정도를 확인하였다. 유전자의 발현량은 GAPDH 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하고, 도출된 결과를 도 4에 나타내었다. 유전자의 발현을 확인하기 위해 사용한 프라이머를 표 1에 나타내었다.

Gene Name	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')
COX-2	5'-GGTCTGGTGCCTGGTCTGATGATG-3'	5'-GTCCTTTCAAGGAGAATGGTGC-3'
GAPDH	5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT-3'	5'-CCATGGTGTCTGAGCGATG-3'

도 4에 도시된 바와 같이, LPS 단독 처리군에 대하여, 발효하지 않은 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 전)은 600ug/ml 농도에서 약 65%로 COX-2 유전자 발현을 억제하였다. 그에 비하여, 발효한 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 후)은 동일한 농도에서 약 80%로 COX-2 유전자 발현을 억제하였다.

실험예 4-2: IL-6 mRNA

발효 전, 후 카뮤트 새싹 분말의 항염 효과를 확인하기 위하여 IL-6 mRNA 발현 정도를 분석하였다. 실험예 4-1에 기재한 것과 동일한 세포를 사용하여 동일 조건으로 실험을 진행하였다. 최종적으로 실시간 중합효소 연쇄반응을 진행하는 과정에서 COX-2 프라이머 대신 IL-6 프라이머를 사용하였다. 유전자의 발현량은 GAPDH 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고 도출된 결과는 도 5에 나타내었다. 유전자 발현을 확인하기 위하여 사용한 프라이머를 표 2에 나타내었다.

Gene Name	Forward (5'-3')	Reverse (5'-3')
IL-6	5'-ATGAACTCCTTCTCCACAAGCGC-3'	5'-GAAGAGCCCTCAGGCTGGACTG-3'
GAPDH	5'-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTT-3'	5'-CCATGGTGTCTGAGCGATG-3'

도 5에 도시된 바와 같이, 리포폴리사카라이드(LPS) 단독 처리군에 대하여, 발효하지 않은 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 전)은 60ug/ml 농도에서 약 4%로 IL-6 유전자 발현을 억제하였다. 그에 비하여, 발효한 카뮤트 새싹 분말(Kamut 발효 후)은 동일한 농도에서 약 35%로 IL-6 유전자 발현을 억제하였다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물은 세포에 대한 독성을 감소하고, 항염 및 항산화 효과가 있음을 확인하였다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

발아식물에 미생물을 접종하여 발효물을 제조하는 단계; 및
상기 발효물을 용매 추출하여 추출물을 수득하는 단계를 포함하는, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 발아식물이 카뮤트 새싹, 새싹 귀리, 밀크시슬 새싹, 알팔파 새싹 및 브로콜리 새싹으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 미생물이 Saccharomyces sp., Lactobacillus sp. 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 발효물을 제조하는 단계가 상기 발아식물에 상기 미생물을 1일 1 내지 5회 접종하여 4 내지 10일 동안 발효하는 단계를 포함하는 것인, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 발효물을 제조하는 단계가 상기 발아식물에 Saccharomyces sp.를 1일 1 내지 5회 접종하여 2 내지 5일 동안 발효하는 단계; 및
Lactobacillus sp.를 1일 1 내지 5회 접종하여 2 내지 5일 동안 발효하는 단계를 순차적으로 포함하는 것인, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 발효물을 제조하는 단계가 상기 발아식물에 Saccharomyces sp. 및 Lactobacillus sp.를 2:1 내지 10:1 중량비로 접종하는 단계를 포함하는 것인, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 용매가 물, 에탄올 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 추출물을 수득하는 단계가 상기 발아식물에 5 내지 20중량 배수의 용매를 첨가하고, 10초 내지 12시간 동안 교반하는 단계를 포함하는 것인, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 추출물을 농축하여 분말을 제조하는 단계를 더 포함하는 것인, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제조방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물.
제10항에 있어서,
상기 조성물이 항염 또는 항산화용인 것인, 발아식물 발효 추출물을 포함하는 조성물.
제10항에 따른 조성물을 포함하는, 항염 또는 항산화용 화장료 조성물.
제10항에 따른 조성물을 포함하는, 항염 또는 항산화용 건강 기능성 식품 조성물.
제10항에 따른 조성물을 포함하는, 항염 또는 항산화용 약학 조성물.