KR20220003571A - 핵산 구조물 및 이의 제조 방법 - Google Patents

핵산 구조물 및 이의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20220003571A
KR20220003571A KR1020217038099A KR20217038099A KR20220003571A KR 20220003571 A KR20220003571 A KR 20220003571A KR 1020217038099 A KR1020217038099 A KR 1020217038099A KR 20217038099 A KR20217038099 A KR 20217038099A KR 20220003571 A KR20220003571 A KR 20220003571A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
nucleic acid
motif
sequence
stranded
conformational
Prior art date
Application number
KR1020217038099A
Other languages
English (en)
Inventor
토마스 안토니 제임스 에이디
폴 제임스 로스웰
마이클 레기비치
Original Assignee
라이트바이오 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 라이트바이오 리미티드 filed Critical 라이트바이오 리미티드
Publication of KR20220003571A publication Critical patent/KR20220003571A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs
    • C12N2310/151—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs more than 3 strands, e.g. tetrads, H-DNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/52—Physical structure branched
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/50—Physical structure
    • C12N2310/53—Physical structure partially self-complementary or closed
    • C12N2310/531—Stem-loop; Hairpin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/301—Hairpin oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
    • C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
    • C12Q2531/125—Rolling circle

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 다수의 응용분야에서 사용될 수 있는 신규한 인공적으로 합성된 단일 가닥 핵산 분자, 및 이의 제조를 위한 주형 및 방법에 관한 것이다. 예컨대 나노입자 빌딩 블록으로부터 고도로 정렬된 물질을 구축하는 것과 같이, 비제한적으로 서열(예컨대 유전자 편집, 유전자 녹-인 또는 녹-다운을 위한 유전자 서열, 또는 주형) 전달을 위한 벡터 또는 생물공학과학을 포함하여, 단일 가닥 핵산 분자에 대한 다수의 용도가 존재한다.

Description

핵산 구조물 및 이의 제조 방법
본 발명은 다수의 응용분야에서 사용될 수 있는 신규한 인공적으로 합성된 단일 가닥 핵산 분자, 및 이의 제조를 위한 주형 및 방법에 관한 것이다. 단일 가닥 핵산 분자는 예컨대 나노입자 빌딩 블록으로부터 고도로 정렬된 물질을 구축하는 것과 같이, 비제한적으로 서열(예컨대 유전자 편집, 유전자 녹-인 또는 녹-다운을 위한 유전자 서열, 또는 주형) 전달을 위한 벡터 또는 생물공학과학을 포함하여, 단일 가닥 핵산 분자에 대한 다수의 용도가 존재한다. 단일 가닥 핵산은 다양한 기하학적 구조를 가질 수 있으며, 예컨대 압타머 및 핵산 효소와 같은 기능을 제공할 수 있다. 단일 가닥 핵산이 벡터로서 사용되는 경우 이는 핵산 서열/단편을 표적 세포로 직접적으로 전달하거나 추가 성분에 의해 캡슐화하는데 사용될 수 있다.
단백질 생산을 위한 코딩을 넘어, 세포 내에서 핵산을 가정하는 기능에 대한 인식이 증가하고 있다. 이중 가닥 구조는 본질적으로 광범위하게 연구되어왔지만, 상보적 뉴클레오티드 사이의 염기쌍으로 인해 세포에서 단단한 조립체를 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 핵산의 가장 유연한 영역은 종종 염기쌍이 아니며 세포 내에서 중요한 과정에 관여하는 단일 가닥 디옥시리보스 핵산(ssDNA) 및 리보핵산(ssRNA) 영역을 포함한다. 예컨대, 이중 가닥 DNA(dsDNA)는 DNA 폴리머라제와 같은 효소에 의해 풀리고, ssDNA 섹션이 노출된다. 이어서 이러한 섹션은 메신저 RNA(mRNA)와 같은 ssRNA로의 전사, 또는 ssDNA를 인식하는 다른 단백질과의 상호작용에 사용할 수 있다.
단일 가닥 핵산 분자는 특히 핵산을 세포로 전달하는 기술 분야의 당업자에게 관심의 대상이며, 그 이유는 핵산이 형질감염된 세포 내에서 즉시 이용 가능하고, 관련 유전 정보(예컨대 전사 및 번역 또는 게놈으로의 삽입을 위한 것)를 노출하기 위해 적절한 효소에 의한 "풀기(unwinding)"가 필요하지 않기 때문이다. 이는 유전자 전달, 유전자 편집 및 바이오센싱과 같은 여러 응용분야에 최적의 전달 벡터로 간주된다. 또 다른 잠재적 응용분야는 DNA 백신의 제공이다. 대안적으로, 단일 가닥 DNA는 이의 입체형태(conformation)와 관련된 기능, 즉, 압타머로서의 기능을 가질 수 있다. 그러나, 예컨대 길이가 수천 개의 뉴클레오티드 범위인 보다 긴 단일 가닥 핵산은 현재 비효율적으로 또는 부정확하게 생산되어 하기 추가 논의되는 바와 같이 이의 유용성을 제한한다. 긴 올리고뉴클레오티드를 생산하는 가장 통상적인 방법은 박테리아에서 배양하기 위한 플라스미드에 서열을 클로닝한 후, dsDNA 서열을 제한 분해 및 정제한 다음 가닥을 제거(stripping)하여 ssDNA를 생산하는 것이다. 박테리아 전파 문제에도 불구하고, 다수의 비효율성과 정제 문제가 존재한다. 전체 플라스미드 백본 서열이 증폭된 다음 이는 박테리아 게놈과 함께 분리 및 폐기되어야 한다. 단일 가닥 핵산 분자를 드러내기 위해 2차 가닥을 제거하면 효율이 50% 더 감소한다.
단일 가닥 핵산의 치료 잠재력의 이점을 이용하기 위해, 상업적 규모의 물질을 다량으로 제조할 수 있는, 효율적으로 확장가능한 제조 방법이 요구된다. 현재 기술은 비용 효율적이고, 정확하고, 신속하며 안전한 방식으로 물질을 생산하기 위한 규모로 확장하는 능력이 제한되어 있다. 또한 길이가 200 뉴클레오티드 이상인 단일 가닥 분자를 정확하게 생산하는 것이 바람직하다.
ssDNA 및 dsDNA 공여체 서열 둘 모두는 효율적인 유전자-편집 주형으로서 작용할 수 있지만, 공여체 구조물의 선택은 종종 도입될 서열의 길이에 의해 결정된다. ssDNA 공여체는 주로 작은 편집을 필요로 하는 응용분야에서 사용되어 왔으며, 이는 대부분 상기 논의된 바와 같이 더 긴 ssDNA를 생성하는 것이 문제가 되는 것으로 밝혀졌기 때문이다. ssDNA 주형은 유전자 편집에서 사용될 때 복구 특이성 측면에서 고유한 이점이 있는 것으로 밝혀졌으며(문헌[Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR-based knock-in Han Li, Kyle A. Beckman, Veronica Pessino, Bo Huang, Jonathan S. Weissman, Manuel D. Leonetti bioRxiv 178905]), 따라서 이들의 사용이 바람직하다.
본질적으로, 선형 단일 가닥 핵산은 세포 내에서 빠르게 분해되는데, 그 이유는 유리 3' 및 5' 말단이 말단을 "씹고(chew back)" 핵산을 파괴하는 단일 가닥 뉴클레아제와 같은 효소에 사용할 수 있기 때문이다. 따라서, 이러한 목적을 위해 유리 3' 및 5' 말단이 즉각적인 분해로부터 보호되는, 안정화된 단일 가닥 핵산 구조물을 제공할 필요가 있다.
유전 물질을 세포로 전달하는데 사용되는 다수의 바이러스 벡터는 RNA 또는 DNA와 같은 단일 가닥 게놈을 가지므로, 유전자 전달에 단일 가닥 핵산을 사용한 선례가 존재한다.
예컨대, 아데노-관련 바이러스(AAV)는 흥미로운 유전자 치료 비히클이며, 파보바이러스 패밀리에 속하며 복제를 위해 본질적으로 다른 바이러스(예컨대 아데노바이러스)와의 동시-감염에 의존한다. AAV는 본질적으로 약 4.7 킬로베이스(kb)의 단일-가닥 DNA 게놈을 둘러싼 단백질 쉘이다. 다수의 고유한 AAV 균주가 존재한다. 이의 단일-가닥 게놈은 특히 Rep(복제) 및 Cap(캡시드) 유전자를 함유한다. 이러한 코딩 서열은 통상적으로 길이가 145 뉴클레오티드인 역 말단 반복(ITR: inverted terminal repeat)에 의해 두 말단에 플랭킹되어 있다.
바이러스 DNA가 결여되어 있는 재조합 AAV(rAAV)는 본질적으로 DNA 카고를 세포의 핵 내로 전달하기 위해 설계된 단백질-기반 나노입자에서 보호되는 ITR-플랭킹된 트랜스진(transgene)이다. 이러한 rAAV 벡터의 설계에서 주요 고려사항은 트랜스진의 포장 크기 및 두 ITR 사이의 관련 서열이다. 5 kb(바이러스 ITR 포함)는 ITR-플랭킹된 트랜스진이 포장되도록 하기 위한 현재 한계인 것으로 보인다. 대안적으로, ITR 플랭킹된 트랜스진(또 다른 관심 서열)은 포장 없이 세포에 직접적으로 도입될 수 있으며, 이는 "인공 게놈"이 실제로 더 길 수 있음을 의미한다.
바이러스 게놈에서 유래된 유전자 전달 벡터와 같은, 당업계에서 전형적으로 사용되는 핵산 분자는 유전자 전달 벡터의 수용자에서 면역 반응을 유도할 수 있기 때문에 문제가 될 수 있는데, 이는 면역계가 순환하는 "외래" DNA를 인식할 수 있기 때문이다. DNA가 박테리아 세포에서 생산되는 경우, 이는 진핵세포 유기체 내에서 외래인 것으로 식별될 수 있고, 유사하게 거부될 수 있는 DNA 메틸화의 원핵세포 패턴을 가질 것이다. 예컨대, 플라스미드(pDNA)는 자연 발생의 환형 dsDNA 분자로서, 한 세대에서 다음으로 안정적으로 유전되는 여분의 염색체 DNA 단편이다. 플라스미드 및 이의 유도체는 유전자 전달 벡터로서 사용되어 왔으며 다양한 성공이 있다.
핵산 벡터의 생산 방법이 또한 문제가 될 수 있다. 박테리아 세포 내에서 핵산 구조물을 제조하면 지질다당류(LPS), 내독소 및 다른 원핵세포-특이적 분자가 있는 최종 생성물로 오염될 위험이 있다. 이는 진핵세포 유기체에서 면역 반응을 높이는 능력을 갖는데, 그 이유는 이것이 미생물 병원체의 효과적인 지표이기 때문이다. 실제로, 임의의 세포-기반 시스템 내에서 핵산 벡터를 제조하는 것은 숙주 세포 유래의 게놈 물질을 포함하여, 최종 생성물 내에 세포 배양물의 오염물질이 존재할 위험이 있다. 세포 내에서 핵산을 생성하는 것은 합성 방법보다 핵산을 생산하기 위해 더 많은 물질이 공급되어야 하므로 비효율적이다. 비용 문제 외에도, 세포 배양물의 사용은 많은 경우 증폭 과정의 재현성에 어려움이 있을 수 있다. 세포의 복잡한 생화학 환경에서, 원하는 핵산 생성물의 품질과 수율을 제어하기가 어렵다. 또한 핵산이 증폭되는 세포에 독성이 있을 수 있는 서열을 다루는 것이 어렵다. 재조합 사건은 또한 관심 핵산의 충실한 문제를 야기할 수 있다.
DNA는 세포를 사용하지 않고 합성적으로 생산될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 사슬을 연장함으로써 화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 빌딩 블록의 제조는 비용이 든다. 각 뉴클레오티드의 단계적 추가는 불완전한 과정이며(각 사슬이 연장될 가능성을 "커플링 효율"이라 지칭됨), 더 긴 서열의 경우 대부분의 개시된 사슬은 전장의 올바른 생성물이 되지 않을 것이다. 이는 대규모로 긴 서열의 생산을 방해한다 ― 이러한 과정의 길이, 정확성, 및 규모 사이에는 항상 희생이 있어야 한다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 주요 용도는 여전히 수백 개의 뉴클레오티드 범위(예컨대, 프라이머 및 프로브)에 있으며 최대 정확한 길이는 길이가 약 300 뉴클레오티드인 것으로 여겨진다. 전형적으로, 합성 올리고뉴클레오티드는 길이가 약 15 내지 25 염기인 단일-가닥 핵산 분자이다.
합성 공정에 대한 바람직한 대안은 주형에 의존하는 핵산의 효소적 생산이다. 핵산 합성을 위한 무세포(cell-free), 시험관 내 효소 공정은 임의의 숙주 세포를 사용할 필요가 없으므로, 특히 생산이 우수 제조 관리기준(GMP: Good Manufacturing Practices) 표준을 필요로 하는 경우 유리하다. 결과적으로, 효소적으로 생산된 핵산은 세포-유래 오염물질의 위험 없이 훨씬 더 효율적으로 제조될 수 있다.
따라서 수용자가 더 안전하고 견딜 수 있으며, 이상적으로는 세포 내에서 즉각적인 분해에도 저항성이 있는 효소적으로 생산되고 개선된 구조물이 필요하다.
단일 가닥 디옥시리보스 핵산(DNA) 벡터를 효소적으로 제조하는 것은 폴리머라제 및 프라이머가 이중 가닥 주형과 함께 사용되는 경우, 본질적으로 두 개의 상보적 가닥이 생성되기 때문에 문제가 될 수 있다. 이러한 가닥이 분리되고 원치 않는 가닥이 폐기될 수 있지만, 이는 여전히 처리 과정의 낭비로 볼 수 있다. 생산 규모를 확장할 때, 최종 생성물에서 출발 물질의 50% 이상의 손실은 지속 가능하지 않다.
본 발명은 특히 단일 가닥 핵산 구조물을 효율적으로 및 효과적으로 제조하기 위한 신규한, 무세포 및 시험관 내 방법, 및 이의 생산을 가능케 하는 주형에 관한 것이다. 주형은 단일 가닥 핵산 구조물의 생산을 포함하여 다양한 용도를 위한 임의의 바람직한 길이의 단일 가닥 핵산 연쇄체의 생산을 가능케 한다. 이러한 구조물은 핵산 말단의 격리로 인해 단순한 선형 단일 가닥 핵산보다 더 안정하다.
이용 가능한 기술은 격리된 말단을 가진 단일 가닥 핵산 또는 본원에 기술된 이러한 공정에서 사용하기 위한 주형을 제조하는 공정을 개시하지 않는다.
다양한 문서는 "캡핑된" 말단을 가진 폐쇄형 선형 이중 가닥 DNA의 생산을 기술한다. Touchlight IP의 국제공개 WO2018/033730호는 인접한 처리 및 입체형태 모티프가 존재하지 않기 때문에 본 발명의 주형으로서 사용하기에 적합하지 않은 이중 가닥 폐쇄형 선형 DNA 분자에 관한 것이다. Generation Bio의 국제공개 WO2019/051255호 및 국제공개 WO2019/143885호는 5' 역 말단 반복(ITR) 서열 및 3' ITR 서열을 포함하는, 공유-폐쇄 말단(선형, 연속 및 비-캡시드화된 구조)을 가진 상보적 DNA의 연속 가닥으로부터 형성된 선형 이중나선 DNA 분자를 기술한다. 다시 말하지만, 이는 본 발명에 따른 주형 분자로서 사용하기에 적합하지 않다.
일부 RNA 구조가 특히 CRIPSR- Cas 9 유전자 편집 분야에 이미 알려져 있다. Gorter de Vries, et al.(문헌[Microb Cell Fact 16, 222 (2017)]. https://doi.org/10.1186/s12934-017-0835-1)은 자가-처리될 수 있는 2개의 리보자임-플랭킹된 gRNA를 개시한다. 유사한 구조가 Ng et al(문헌[Molecular Biology and Physiology, March/April 2017 Volume 2 Issue 2 e00385-16])에 상세히 기술되어 있다. 내부 트랜스-작용 리보자임을 플랭킹하는 2개의 시스-작용 리보자임으로 이루어진 삼중 리보자임(TRz) 구조물이 문헌[Benedict et al, Carcinogenesis. 1998 Jul;19(7):1223-30]에 개시되어 있다. 이러한 구조물은 관심 서열의 양 말단에 인접 입체형태 및 처리 모티프가 결여되어 있으므로, 선형 단일 가닥 생성물에서 말단 잔기의 격리를 가능케 한다.
본 발명의 단일 가닥 핵산 분자는 격리된 말단을 갖는다. 본 발명의 단일 가닥 핵산 분자는 핵산의 선형 단일 가닥이므로 각 말단에 말단 뉴클레오티드를 갖는다. 말단 핵산 잔기는 유리(free)가 아니다, 즉, 임의의 추가 입체형태를 가정하지 않은 순수 선형 단일 가닥 핵산 분자와 같이 노출되지 않는다. 따라서 핵산의 말단은 구조체 내에서 고정되거나 자리잡고 있으며 단일 가닥 뉴클레아제 등과 같은 효소에 즉시 접근할 수 없다. 단일 가닥 핵산의 말단은 말단을 보호하는 역할을 하는 입체형태 내에 말단 뉴클레오티드를 포함함으로써 격리될 수 있다. 따라서 선형 ssDNA의 각 말단에 있는 말단 뉴클레오티드는 핵산 분자의 분해를 시작하기 위해 이에 작용할 수 있는 임의의 제제로부터 떨어져 있거나 떨어져서 유지된다. 일반적으로, 효소는 말단 뉴클레오티드를 찾고 이러한 잔기에서 단일 가닥 핵산을 씹기 시작한다.
단일 가닥 핵산 분자는 주형 핵산으로부터 제조될 수 있다. 이러한 주형 핵산의 설계는 고유하다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다:
격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 분자의 무세포, 시험관 내 제조를 위한 핵산 주형으로서, 다음의 요소를 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 주형:
i) 다음에 인접한, 제1 처리 모티프
ii) 제1 입체형태 모티프,
iii) 관심 서열,
iv) 다음에 인접한, 제2 입체형태 모티프
v) 제2 처리 모티프,
상기 처리 모티프는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함하며, 상기 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
따라서, 본 발명의 주형은 본원에 기술된 단일 가닥 핵산을 코딩한다. 단일 가닥 핵산은 선형이다. 선형 단일 가닥 뉴클레오티드는 격리된 말단을 갖는다.
대안적으로 설명하면, 정방향(처리 모티프 다음 입체형태 모티프) 또는 역방향(입체형태 모티프 다음 처리 모티프)으로 서로 인접한 처리 모티프와 입체형태 모티프의 조합이 사용될 수 있다. 이들은 포맷팅 요소(formatting element)이다.
따라서, 주형은 기술된 순서로 다음의 요소를 코딩하는 다음의 서열을 포함할 수 있다:
i) 정방향 포맷팅 요소;
ii) 관심 서열;
iii) 역방향 포맷팅 요소.
본 발명의 주형은 단일 가닥 핵산 생성물을 제조하기 위한, 임의의 적합한 폴리머라제 효소를 사용하여 증폭될 수 있다.
단일 가닥 핵산 생성물은 선형이며 격리된 말단을 갖는다.
주형은 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있다. 주형의 하나의 가닥은 격리된 말단을 가진 원하는 선형 단일 가닥 핵산 생성물과 상보적이고, 따라서 동일한 생산을 지시한다. 주형은 폴리머라제 효소와 접촉할 때 생성물의 구조를 지시하므로, 주형은 복제되거나 증폭된다. 용어 증폭됨 또는 복제됨은 당업계에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 주형은 회전 환 증폭(RCA: rolling circle amplification)이 가능한 폴리머라제와 접촉될 수 있다. 본 발명의 주형은 회전 환 증폭(RCA)을 촉매할 수 있는 폴리머라제를 사용하여 증폭될 수 있다. RCA는 긴 단일 가닥 DNA 또는 RNA가 환형 DNA 주형과 특이적 DNA 또는 RNA 폴리머라제를 사용하여 합성되는 등온 효소적 과정이다. RCA 생성물은 환형 주형과 상보적인 수백 또는 수천 개의 직렬 반복을 포함하는 연쇄체이다. 따라서, 주형과 폴리머라제의 접촉은 주형의 "증폭"을 일으켜, 핵산의 상보적 단일 가닥을 생성할 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 임의의 주형은 회전 환 증폭 또는 복제가 가능한 폴리머라제를 사용하여 증폭될 수 있다. 이로 인해 긴 단일-가닥 연쇄체 핵산 분자가 생성된다. 포맷팅 요소(정방향 또는 역방향으로, 입체형태 모티프에 인접한 처리 모티프를 포함함)의 존재로 인해, 연쇄체는 필요한 엔도뉴클레아제의 첨가에 의해 간단하게 처리될 수 있다. 엔도뉴클레아제에 의한 처리 모티프 내의 절단은 입체형태 모티프가 양쪽에 플랭킹된, 관심 서열을 방출한다. 방출되면, 이러한 입체형태 모티프는 말단 뉴클레오티드를 고정하는 수소-결합 섹션을 형성함으로써 단일 가닥 핵산의 말단을 격리시키는 작용을 한다. 따라서, 단일 가닥 핵산 분자의 입체형태 모티프는 말단 뉴클레오티드를 격리하는 수소 결합을 사용하여 형태를 가정한다. 말단 뉴클레오티드는 분자내 염기쌍 또는 수소 결합이 있거나 없는 가정된 형태 내에 포함되거나 포괄됨으로써 고정될 수 있다. 대안적으로, 말단 뉴클레오티드는 입체형태 모티프가 이러한 분자 내 상호작용의 안정성을 증가시키도록 분자내 염기쌍 또는 수소 결합에 의해 고정될 수 있다.
따라서, 선형 단일 가닥 핵산 생성물의 말단 잔기는 처리 모티프 상의 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 형성되고, 말단 잔기는 엔도뉴클레아제가 더 긴 중간체 생성물을 절단하면 분자 말단의 잔기이다. 따라서, 포맷팅 요소는 입체형태 모티프에 인접한 처리 모티프를 포함하는 것으로 기술될 수 있으며, 상기 절단 부위는 입체형태 모티프에 의해 격리된 말단 잔기를 생성한다. 처리 모티프 및 입체형태 모티프는 인접(adjacent), 접한(adjoining) 또는 근접(contiguous)으로 기술될 수 있다. 대안적으로 설명하면, 처리 모티프와 입체형태 모티프 사이에 외부 또는 개재 핵산 서열이 없다. 엔도뉴클레아제의 작용은 후속적으로 격리되는 말단 잔기를 생성한다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다:
다음을 포함하는, 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 분자의 제조 방법:
(a) 회전 환 증폭이 가능한 폴리머라제를 사용하여 환형 주형을 증폭하는 단계로서, 상기 주형은 다음의 요소를 코딩하는 서열을 포함함:
i) 다음에 인접한, 제1 처리 모티프
ii) 제1 입체형태 모티프,
iii) 관심 서열,
iv) 다음에 인접한, 제2 입체형태 모티프
v) 제2 처리 모티프,
상기 처리 모티프는 엔도뉴클레아제의 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함하고, 상기 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다,
핵산 연쇄체를 생성하는 증폭, 및
(b) 하나 이상의 상기 처리 모티프에서 절단 부위를 인식하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 핵산 연쇄체를 처리하는 단계.
생산된 단일 가닥 핵산은 격리된 말단을 갖는 선형이다.
대안적으로, 본 발명은 다음을 포함한다:
다음을 포함하는, 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 분자의 제조 방법:
(a) 회전 환 증폭이 가능한 폴리머라제를 사용하여 환형 주형을 증폭하는 단계로서, 상기 주형은 다음의 요소를 코딩하는 서열을 포함함:
i) 정방향 포맷팅 요소,
iii) 관심 서열,
iv) 역방향 포맷팅 요소,
상기 정방향 포맷팅 요소는 입체형태 모티프에 인접한 처리 모티프를 포함하고, 역방향 포맷팅 요소는 처리 모티프에 인접한 입체형태 모티프를 포함하고; 처리 모티프는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함하고, 상기 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다,
핵산 연쇄체를 생성하는 증폭, 및
(b) 하나 이상의 상기 처리 모티프에서 절단 부위를 인식하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 핵산 연쇄체를 처리하는 단계.
본 발명의 단일 가닥 핵산 분자는 격리된 말단을 갖는 선형이다.
처리 단계는 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 구조물을 야기한다. 처리된 포맷에서 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합에 의해 안정화되는 원하는 형태를 형성하거나 가정할 수 있기 때문에 말단이 격리된다. 단일 가닥 핵산 분자의 말단은 입체형태 모티프에 의해 가정된 형태에 의해 격리된다. 말단 뉴클레오티드는 입체형태 내에 포함되어 엑소뉴클레아제에 의해 접근하는 것을 입체적으로 어렵게 하거나, 입체형태 모티프 내의 분자내 결합에 포함됨으로써 고정될 수 있으며, 이 전체는 말단 뉴클레오티드를 엑소뉴클레아제에 대해 보다 안정하게 만든다. 분자는 2개의 말단과 2개의 입체형태 모티프를 가지고 있기 때문에, 각각은 관련 말단 또는 말단 뉴클레오티드를 포함하는 입체형태를 가정하도록 작동한다. 분자는 핵산이 선형이기 때문에 2개의 말단 잔기를 갖는 2개의 말단을 갖는다.
연쇄체는 본 발명의 단일 가닥 핵산 분자의 제조 동안 중간 생성물이지만, 예컨대 바이오-센싱 등에서 이점이 될 수 있는 적용에서 상기 서열의 국소 농축 또는 효능을 증가시키는 역할을 할 수 있는 관심 서열의 다량체 연결된 사슬로서의 구성으로 인해 그 자체로 일부 유용성을 가질 수 있다. 친화도 결합은 하나의 가능한 결합이다.
따라서, 본 발명은 다음을 제공한다:
서열 단위의 2개 이상의 반복을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 연쇄체로서, 상기 서열 단위는 다음의 요소를 포함함:
i) 다음에 인접한, 제1 처리 모티프
ii) 제1 입체형태 모티프,
iii) 관심 서열,
iv) 다음에 인접한, 제2 입체형태 모티프
v) 제2 처리 모티프,
상기 처리 모티프는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함하며, 상기 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 다음을 제공한다:
서열 단위의 2개 이상의 반복을 가진 단일 가닥 핵산 연쇄체로서, 상기 서열 단위는 다음의 요소를 포함한다:
i) 다음에 인접한, 제1 처리 모티프
ii) 제1 입체형태 모티프,
iii) 관심 서열,
iv) 다음에 인접한, 제2 입체형태 모티프
v) 제2 처리 모티프,
상기 처리 모티프는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함하며, 상기 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
본 발명의 단일 가닥 핵산 분자는 격리된 말단을 갖는 선형이다.
대안적으로, 처리 모티프 및 입체형태 모티프가 처리 요소로서 취해지는 경우, 본 발명은 다음을 제공한다:
서열 단위의 2개 이상의 반복을 갖는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 연쇄체로서, 상기 서열 단위는 다음의 요소를 포함함:
i) 정방향 포맷팅 요소,
iii) 관심 서열,
iv) 역방향 포맷팅 요소,
상기 정방향 포맷팅 요소는 입체형태 모티프에 인접한 처리 모티프를 포함하고, 역방향 포맷팅 요소는 처리 모티프에 인접한 입체형태 모티프를 포함하며; 처리 모티프는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함하고, 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함한다.
본 발명의 단일 가닥 핵산 분자는 격리된 말단을 갖는 선형이다.
입체형태 모티프의 말단 뉴클레오티드, 또는 실제로 단일 가닥 핵산 구조물의 말단 뉴클레오티드는 일반적으로 처리 모티프에 인접하고 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 연쇄체 핵산으로부터 "방출되는" 뉴클레오티드이다. 단일 가닥 핵산 구조물의 말단을 형성하고, 분해를 지연시키기 위해 적절히 격리되는 것이 이러한 말단 뉴클레오티드이다.
정방향 포맷팅 요소는 입체형태 모티프에 인접한 처리 모티프를 포함하고, 역방향 포맷팅 요소는 처리 모티프에 인접한 입체형태 모티프를 포함한다. 이러한 배열은 관심 서열이 처리된 후 입체형태 모티프에 의해 양쪽 말단에 플랭킹되는 것을 보장한다. 따라서 관심 서열은 구조물에서 2개의 입체형태에 의해 플랭킹되며, 각각은 핵산의 말단을 격리한다.
도 1은 본 발명의 주형(100)의 예시도이다. 제1 및 제2 처리 모티프(101 및 102), 제1 및 제2 입체형태 모티프(103 및 104), 관심 서열(105), 절단 부위(106 및 107)를 함유하는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 주형(108)의 닉킹 부위(nicking site)를 코딩하는 서열이 도시되어 있다;
도 2는 상이한 예시적인 주형(100)의 표현이며, 상기 주형은 포맷팅 요소(113)를 코딩하는 서열로 각 말단에 종결되는, 백본 서열(110) 및 단일 가닥 핵산 구조물(111)의 생산을 위한 서열과 함께, 도시된 닉킹 서열(108)이 있는, 이중 가닥 환형 핵산 구조물로서 도시된다. 포맷팅 요소(113)의 주형의 가닥의 폴리머라제 증폭에 의해 생성된 단일 가닥 핵산의 확대도가 도시되어 있다. 이는 닉킹 부위(178), 제1 처리 모티프(151), 제1 입체형태 모티프(153), 및 절단 부위(161)를 함유하는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 도시한다. 제1 처리 모티프와 제1 입체형태 모티프는 인접해 있으며, 절단 부위에 의해서만 분리되고, 이들은 함께 포맷팅 요소(157)를 형성한다;
도 3은 주형의 회전 환 증폭을 사용하여 초기 핵산 가닥(150)을 생성하는, 본 발명의 주형(100)의 하나의 증폭 방법을 묘사한다. 초기 가닥에는, 관심 서열과 함께 핵산 구조물(156)의 기초를 형성하는 제1 처리 모티프(151), 제2 처리 모티프(152), 제1 입체형태 모티프(153), 제2 입체형태 모티프(154), 및 백본 서열(155)이 도시되어 있다. 절단 부위(도시되지 않음)를 포함하는 포맷팅 요소(157)가 도시되어 있다. 초기 가닥은 절단 부위를 인식하는 필수 효소(도시되지 않음)를 사용하여 처리되어, 격리된 말단(160)을 가진 단일 가닥 핵산 구조물을 생성하며, 주형 백본(158) 및 처리 모티프(159)로부터 부산물이 생성된다;
도 4는 도 3의 초기 가닥 섹션에 대한 2개의 묘사를 제공하고, 이는 부산물과 함께, 격리된 말단(160)을 갖는 단일 가닥 핵산 구조물의 생성을 초래한다. 사용된 입체형태 모티프의 유형에 따라, 구조물의 3' 및 5' 말단의 입체형태 또는 구조가 달라질 수 있다;
도 5는 주형(200)의 대안적인 표현을 도시한다. 제1 및 제2 처리 모티프(201 및 202), 제1 및 제2 입체형태 모티프(203 및 204), 관심 서열(205), 절단 부위(206 및 207)를 함유하는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 주형(208)의 닉킹 부위를 코딩하는 서열이 도시되어 있다. 또한 주형(250)으로부터 생산된 핵산의 초기 가닥이 도시되어 있다. 초기 가닥에 제1 처리 모티프(251), 제2 처리 모티프(252), 제1 입체형태 모티프(253), 및 제2 입체형태 모티프(254)가 도시되어 있으며, 이들은 관심 서열(255)과 함께 핵산 구조물을 형성한다. 절단 부위(256 및 257)는 포맷팅 요소(281 및 282) 내에 형성된다. 초기 가닥은 절단 부위를 인식하는 필수 효소를 사용하여 처리되며, 그 결과 부산물(도시되지 않음)과 함께, 격리된 말단(260)을 갖는 단일 가닥 핵산 구조물이 생성된다;
도 6은 실시예 2의 결과의 분석 결과를 도시하는 겔 사진(0.8% TAE 아가로스 겔, 1x GelRed 염색)이다. 겔 상의 레인은 다음과 같다:
M 래더; 1 kb
1 ssDNA (i) 엑소 없음
2 ssDNA (i) 100 U/mL 엑소VII
3 루프(GAA) (ii) 엑소 없음
4 루프(GAA) (ii) 100 U/mL 엑소VII
5 G-사중나선 (iii) 엑소 없음
6 G-사중나선 (iii) 100 U/mL 엑소VII
7 G-사중나선 (iv) 엑소 없음
8 G-사중나선 (iv) 100 U/mL 엑소VII
9 유사매듭 (v) 엑소 없음
10 유사매듭 (v) 100 U/mL 엑소VII
핵산 구조물은 실시예 2에 따라 표지된다;
도 7은 실시예 3의 결과의 분석 결과를 도시하는 겔 사진(0.8% TAE 아가로스 겔, 1x GelRed 염색)이다. 겔 상의 레인은 다음과 같다:
M 래더; NEB 1 kb
1 ssDNA (i) 추출물이 첨가되지 않음
2 루프 (GAA) (ii) 추출물이 첨가되지 않음
3 G-사중나선 (iii) 추출물이 첨가되지 않음
4 G-사중나선 (iv) 추출물이 첨가되지 않음
5 유사매듭 (v) 추출물이 첨가되지 않음
6 ssDNA (i) 5% 추출물, 24h
7 루프(GAA) (ii) 5% 추출물, 24h
8 G-사중나선(iii) 5% 추출물, 24h
9 G-사중나선(iv) 5% 추출물, 24h
10 유사매듭(v) 5% 추출물, 24h
11 ssDNA (i) 5% 추출물, 72h
12 루프(GAA) (ii) 5% 추출물, 72h
13 G-사중나선 (iii) 5% 추출물, 72h
14 G-사중나선 (iv) 5% 추출물, 72h
15 유사매듭 (v) 5% 추출물, 72h
16 5% 세포 추출물; DNA 첨가되지 않음
핵산 구조물은 실시예 2에 따라 표지된다;
도 8a는 AAV2 ITR의 입체형태를 나타낸다. AAV2 ITR은 보다 큰 줄기 회문 구조(A-A') 내에 삽입된 2개 팔 회문 구조(B-B' 및 C-C')로 구성된다. ITR은 2개 구성(플립 및 플롭)을 획득할 수 있다. 플립(도시됨) 및 플롭 구성은 각각 3' 말단에 가장 가까운 B-B' alc C-C' 회문 구조를 가지고 있다. D 서열은 게놈의 각 끝에 오직 한 번만 존재하므로 단일-가닥으로 남아있다. 박스 친 모티프는 Rep-결합 요소(RBE: Rep-binding element)에 해당한다. 도 8b 및 8c는 절단 전(ii) 및 후(iii) 둘 모두에 주형의 단일 가닥 생성물이 뒤따르는, 본 발명의 선형 단일 가닥 핵산에 대한 주형(i)을 나타낸다. 도 8b는 야생형 AAV ITR에서와 같은 단일 가닥 D 영역을 포함한다. 도 8c는 D' 영역과 쌍을 이루어 입체형태 모티프 내의 D 영역을 포함하므로, 이는 이중 가닥 부분 내에 있다;
도 9는 실시예 1에서 사용된 주형인, 플라스미드 맵을 나타낸다. 관심 서열, 입체형태 모티프, 처리 모티프, 백본 및 처리 효소(MlyI)에 대한 부위가 도시되어 있다. 닉킹 엔도뉴클레아제(BsrDI, 예컨대 Nb.BsrDI의 변이체에 의해 닉킹될 수 있음)가 또한 도시되어 있다; 그리고
도 10은 2개의 레인이 도시된 겔 사진(0.8% TAE 아가로스 겔, 1x SafeView 염색)이며, 첫 번째 레인은 마커 레인이고, 두 번째 레인은 실시예 1에 따라 도 9의 주형을 사용하여 제조된 핵산 구조물을 나타낸다.
본 발명은 시험관 내에서 대규모 양의 단일 가닥 핵산 분자를 제조하는 효율적인, 무세포, 효소적, 비용-효율적인, 정확하고 깨끗한 방법의 필요성을 충족시킨다. 세포-기반 사용을 위한 단일 가닥 핵산 분자의 수명을 증가시키기 위해, 본 발명자들은 단일 가닥 핵산 분자의 말단을 격리함으로써 즉각적인 분해로부터 이들을 보호하는 우수한 방법을 고안하였다.
격리된 말단
모든 선형 핵산 분자의 주요 특징은 뉴클레오티드 잔기로 구성된 중합체이며 2개의 독특한 말단을 갖는다는 것이다. 말단의 성질은 핵산의 백본의 성질에 의해 결정된다. 천연(비-합성) 핵산 분자의 경우 이러한 두 말단은 5'(5-프라임) 및 3'(3-프라임) 말단이다. 천연 핵산(즉, DNA 또는 RNA)에서, 5' 말단은 5' 포스페이트기로 종결되는 분자의 말단이다. 관례에 따라, 핵산 서열은 5' 말단이 왼쪽으로 그리고 3' 말단이 오른쪽으로 쓰여지며, 본원에 인용된 순서는 이러한 관례에 따른다. 3' 말단은 3' 포스페이트기로 종결되는 분자의 말단이다. 일반적으로 천연 핵산에서, 하나의 뉴클레오티드의 포스페이트기와 또 다른 뉴클레오티드의 당 사이에 포스포디에스터 연결이 형성되어 백본이 형성된다. 뉴클레오티드기의 탄소 번호매기기에 대한 화학적 규칙을 사용하여, 포스페이트기는 당의 5' 탄소에 결합되어 있기 때문에 뉴클레오티드의 5' 말단이다. 하나의 뉴클레오티드의 5' 말단과 또 다른 뉴클레오티드의 3' 히드록실기 사이에 포스포디에스터 연결이 형성되어, 하나의 개방 5' 말단과 하나의 개방 3' 말단이 있는 중합체를 형성한다. 따라서 5' 말단은 5' 포스페이트기가 있는 말단 잔기로 간주될 수 있다. 따라서 3' 말단은 3' 히드록실기가 있는 말단 잔기로 간주될 수 있다. DNA 및 RNA의 경우, 이러한 말단 잔기는 뉴클레오티드 잔기이다.
본 발명에서, 선형 단일 가닥 뉴클레오티드의 말단은 본 발명의 방법의 중간 생성물 상에서 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 형성된다. 따라서, 입체형태 모티프의 말단 잔기는 단일 가닥 핵산 생성물의 말단 잔기가 된다. 절단 전에, 이러한 잔기는 입체형태 모티프를 처리 모티프에 효율적으로 연결한다.
새로운 가닥을 조립하는 폴리머라제는 일반적으로 뉴클레오시드 트리포스페이트 결합을 끊음으로써 생성된 에너지에 의존하여 포스포디에스터 결합을 통해 새로운 뉴클레오시드 모노포스페이트를 3'-히드록실(-OH) 기에 부착하기 때문에, 핵산은 생체 내에서 5'에서 3' 방향으로만 합성될 수 있다. 유전자 및 다양한 단백질 결합 부위를 포함하여, 핵산 가닥을 따라 존재하는 대상체의 상대적인 위치는 일반적으로 상류(5'-말단쪽으로) 또는 하류(3'-말단쪽으로)인 것으로 알려져 있다. 자연에서, DNA의 역평행 특성으로 인해, 이는 주형 가닥의 3' 말단이 유전자의 상류에 있고 5' 말단이 하류에 있음을 의미한다.
완전히 합성된 비-천연(합성) 핵산의 경우 말단은 백본 구조에 따라 표지될 수 있다. 예컨대, 펩티드 핵산(PNA)이 조사되는 경우, 당 포스페이트 백본은 N-(2 아미노에틸) 글리신 단위로 대체된다. 4개의 천연 염기 각각은 이어서 메틸렌 카보닐 링커를 통해 백본에 연결된다. PNA는 5' 및 3' 말단이 아니라 N-말단 끝 및 C-말단 끝을 갖는다.
본 발명에서, 선형 핵산 분자의 말단은 이들 말단의 명명법에 상관없이 격리된다. 따라서, 이러한 말단의 말단 잔기 또는 말단 뉴클레오티드는 유리되거나 노출되지 않는다. 천연 핵산, 예컨대 DNA 및 RNA의 경우, 이러한 말단 잔기는 말단 뉴클레오티드이고, 3' 및 5' 말단이다. 합성 핵산의 경우, 이러한 말단은 이들의 적절한 명명법을 가질 수 있다.
격리된 각 말단은 안정화되어, 단일 가닥 뉴클레아제와 같은 효소와의 즉각적인 반응에 더 이상 사용할 수 없다. 핵산이 세포 환경에서 사용되는 경우, 말단은 단일 가닥 핵산의 즉각적인 분해를 야기할 수 있는 세포 성분으로부터 멀리 떨어지거나, 차폐되거나 격리된다. 따라서, 단일 가닥 핵산 분자의 말단은 격리가 없는 경우 정상적으로 작동하지 않는다. 말단의 격리는 격리된 말단이 없는 유사 분자와 비교하여 향상된 안정성의 분자를 제공한다. 이는 격리된 말단이 없는 유사 분자가 분해되는 반면, 본 발명의 분자는 온전하게 남아있는, 실시예 1에서 본 발명자들에 의해 입증되었다.
입체형태 모티프의 존재에 의해 말단이 격리되는 것이 바람직하다. 입체형태 모티프는 특정 서열을 갖는다. 입체형태 모티프의 서열은 특정 입체형태를 형성하거나 가정하기 위해 분자내 수소 결합을 형성할 수 있도록 설계된다. 입체형태가 단일 가닥 핵산 구조를 가정할 때, 말단 뉴클레오티드는 모티프에 의해 격리되며, 이는 이들이 고정되었음을 의미한다.
분자내 수소 결합은 입체형태 모티프 서열 그 자체 내에 있을 수 있거나, 입체형태 모티프의 일부 또는 부분과 관심 서열과 같은, 전체 단일 가닥 핵산 분자의 적어도 하나의 다른 서열 사이에 있을 수 있다. 분자내 수소 결합은 말단을 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다.
수소 결합은 분자간 또는 분자 내에서, 분자간 또는 분자내 비-공유 결합 유형이다. 이러한 결합은 동일한 분자 또는 상이한 분자의 전기음성 원자(수소 수용체)와 또 다른 전기음성 원자(수소 공여체 ― 오직 질소, 산소, 및 플루오린 원자만 작동함)와 공유적으로 부착되는 수소 원자로부터 형성된다. 이들은 쌍극자-쌍극자 상호작용의 가장 강력한 종류이다. 수소 결합은 DNA 이중 나선의 특정 염기쌍 형성을 담당하며 DNA 이중 나선 구조의 안정성에 대한 인자이다.
전형적으로, 왓슨-크릭 염기쌍에서, 수소 결합은 뉴클레오티드의 질소 염기(핵염기) 사이에 형성된다. DNA에서 아데닌-티민(A-T), RNA에서 아데닌-우라실(A-U) 및 이들 두 모두에서 시토신-구아닌(C-G)인 표준 염기쌍에서, 수소 결합이 형성된다. A-T/U 및 C-G 쌍은 상보적 염기에서 아민과 카보닐기 사이에 이중 또는 삼중 수소 결합을 형성하는 기능을 한다.
워블 염기쌍은 표준 왓슨-크릭 염기쌍 규칙을 따르지 않는, 핵산 분자, 특히 RNA의 2개 뉴클레오티드 사이의 쌍이다. 4가지 주요 워블 염기쌍은 구아닌-우라실(G-U), 하이포잔틴-우라실(I-U), 하이포잔틴-아데닌(I-A), 및 하이포잔틴-시토신(I-C)이다. 워블 염기쌍의 열역학적 안정성은 왓슨-크릭 염기쌍의 열역학적 안정성과 비슷하다. 워블 염기쌍은 RNA 구조의 기본이다.
대안적인 또는 비-정규 염기쌍은 핵산 구조에서도 가능하며, 다시 수소 결합에 의해 함께 유지된다. 이들은 일반적으로 RNA에서 더 일반적이지만, DNA 및 다른 핵산에서도 또한 가능하다. 비-정규 염기쌍의 하나의 예는 후그스틴 및 역 후그스틴 염기쌍이다. 이러한 상호작용에서, 퓨린 염기인, 아데닌 및 구아닌은 정상 방향을 뒤집고 이들의 파트너와 새로운 수소 결합 세트를 형성한다. 후그스틴 수소 결합은 본원에서 보다 상세히 논의되는 i-모티프 및 G-사중나선과 같은 사중나선에 존재하는 것으로 나타났다.
다양한 염기쌍 메커니즘의 조합도 또한 고려될 수 있다. 예컨대, 표준 B-형 DNA에서 A-T 및 G-C 염기쌍에서의 수소 결합이 형성되는 경우, 핵염기에서 여러 수소 결합 공여체 및 수용체기가 사용되지 않은 채로 남아있다. 각 퓨린 염기는 주요 홈에 노출된 가장자리에 2개의 이러한 기를 갖는다. 삼중 DNA는 이중가닥과 제3 올리고뉴클레오티드 가닥 사이에서 분자내적으로 형성될 수 있다. 제3 가닥 염기는 B-형 이중가닥에서 퓨린과 후그스틴형 수소 결합을 형성할 수 있다.
염기쌍은 또한 천연 염기와 비천연 염기 사이에 형성될 수 있으며, 또한 비-천연 염기 쌍 사이에서도 형성될 수 있다.
따라서, 염기쌍은 입체형태 모티프가 관련 입체형태를 가정할 수 있게 하는 분자내 수소 결합의 예이다. 입체형태 모티프가 말단 뉴클레오티드를 격리하기 위해 염기쌍에 의존하는 경우, 단일 가닥 핵산 구조물의 다른 곳(즉, 관심 서열 내)의 서열과 염기쌍을 이루는 상기 모티프 내에 서열이 존재할 수 있다. 대안적으로, 입체형태 모티프 내의 서열은 수소 결합이 모티프 자체 내에서 형성되도록 입체형태 모티프 내의 적어도 하나의 다른 서열과 염기쌍을 이루도록 설계될 수 있다. 표준 왓슨-크릭 쌍에 따라 "비-상보적"인 뉴클레오티드 사이에 형성되는 것들을 포함하여, 임의의 융형의 염기쌍이 고려된다.
분자내 수소 결합은 또한 후그스틴 수소 결합에 의해 안정화되는, G-사중나선의 G-테트라드에서 구아닌 잔기의 평면 배열과 같이, 고전적인 염기쌍으로 정의되지 않는 상호작용일 수 있다. 이러한 구조는 아래에서 추가로 논의된다.
또한, 핵산 분자의 안정화는 또한 염기-적층(stacking) 상호작용에도 의존할 수 있다. Pi- pi 적층(π―π 적층으로도 지칭됨)은 방향족 고리가 pi 결합을 포함하기 때문에 방향족 고리 사이의 매력적인 비공유 상호작용을 나타낸다. 이러한 상호작용은 수소 결합에 의해 결합된 핵산 분자 내의 핵염기 적층에서 중요하다. 따라서 단일 가닥 핵산 구조물은 염기-적층 상호작용에 의해 추가로 안정화될 가능성이 있다. 핵산을 안정화시키는 다른 상호작용도 또한 가능하며, 이는 pi-양이온 상호작용, 반 데르 발스 상호작용 및 소수성 상호작용을 포함한다.
일 양태에서, 입체형태 모티프는 염기쌍 섹션이 형성될 수 있도록 하는 서열을 포함하도록 설계된다. 염기쌍 섹션은 염기쌍 섹션에서 적절한 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서 염기쌍 섹션은 뉴클레오티드의 서열로 형성될 수 있다. 입체형태를 유지해야하기 때문에, 염기쌍 섹션은 길이가 적어도 5개 염기쌍일 가능성이 있다. 염기쌍 섹션은 적어도 2 뉴클레오티드, 또는 2 내지 5 뉴클레오티드, 또는 5 뉴클레오티드를 포함할 수 있거나, 5초과 뉴클레오티드, 즉, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 예에서 염기쌍 섹션은 말단 뉴클레오티드를 안전하게 격리시키기 위해 더 많은 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 따라서 염기쌍 섹션은 길이가 1 내지 50 또는 1 내지 100 뉴클레오티드일 수 있거나, 실제로 1 내지 250 뉴클레오티드 이상일 수 있다.
말단 뉴클레오티드 잔기는 입체형태 모티프를 포함하는 단일 가닥 핵산 구조물의 또 다른 부분에 분자내로 수소-결합될 수 있다. 일 양태에서, 말단 뉴클레오티드는 구조물에서 또 다른 뉴클레오티드와 염기쌍을 형성한다.
그러나, 말단 잔기는 수소 결합 또는 보다 특히 염기쌍이 없을 수 있다. 이 경우에, 입체형태 모티프는 단일 가닥 뉴클레아제가 구조물에서 인접한 뉴클레오티드로부터 이를 절단하는 것(및 이어서 인접한 뉴클레오티드 등을 절단하는 것)이 자유롭지 않도록, 말단 뉴클레오티드를 포괄하거나(embracing), 두르거나(encircling) 둘러쌈(surrounding)으로써 말단 뉴클레오티드를 고정하거나 격리시킨다. 즉, 더 큰 대상물이 이에 도달할 수 없기 때문에 말단은 분해로부터 입체적으로 보호된다. 예컨대, 말단 뉴클레오티드는 사중나선 모티프 내에 고정될 수 있다.
이는 단순히 격리되는 단일 가닥 핵산 분자의 각 말단에 있는 말단 잔기일 수 있다. 대안적으로, 인접한 하나 이상의 잔기가 또한 격리될 수 있다. 적어도 5 이상, 10 이상, 15 이상, 20 이상, 25 이상, 50 이상 잔기가 또한 말단 잔기와 함께 격리될 수 있다.
추가 양태에서, 각 말단은 적어도 분자 말단의 말단 잔기를 포함하여 이중나선(duplex)의 형성에 의해 격리될 수 있다. 이중나선은 뉴클레오티드 서열 간의 염기쌍에 의해 형성된다. 이러한 서열은 인접하거나(헤어핀) 격리되어 있을 수 있다(스템 루프 등).
잔기는 뉴클레오티드와 같은 핵산 중합체를 구성하는 단일 단위를 지칭한다.
추가 양태에서, 단일 가닥 핵산 구조물의 말단 또는 말단 뉴클레오티드를 격리시키는 작용을 하는 염기쌍 또는 이중나선 섹션이 입체형태 모티프 내에 형성되는 것이 바람직하다. 따라서, 입체형태 모티프는 염기쌍 또는 이중나선 섹션을 형성할 수 있는 자가-상보적 서열을 포함한다. 이들은 인접하거나 비-상보적 서열에 의해 격리되어있을 수 있다.
다른 양태에서, 단일 가닥 핵산 구조물의 말단 또는 말단 뉴클레오티드를 격리시키는 역할을 하는 염기쌍 또는 이중나선 섹션은 입체형태 모티프의 외부를 형성한다. 따라서, 이는 관심 서열의 일부, 또는 실제로 핵산 구조물 내(즉, "관심 서열"에서 2개 코딩 영역 사이)에 도입될 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 따라서 달성된 입체형태는 말단 잔기를 포함하는 어닐링된 상보적 서열 또는 이중나선의 섹션을 포함하는 단일 가닥 핵산의 루프인, 매듭(lariat)일 수 있다.
본원에서 추가로 논의되는 일부 흥미로운 양태에서, 말단은 사중나선과 같은 입체형태 내에 격리될 수 있다. 이들은 사중(4가닥) 구조이며, 염색체의 텔로미어 말단 구조와 관련되어 있을 수 있다. 기본 패턴은 4개 잔기의 평면 배열인 테트라드이며, 후그스틴 수소 결합 및 중심 양이온에 대한 배위에 의해 안정화된다. 사중나선은 여러 개의 테트라드의 적층에 의해 형성된다. 서열이 초기에 이러한 배열로 폴딩되는 방식에 따라 다수의 상이한 위상이 형성될 수 있다. 사중나선 구조는 양이온, 특히 테트라드의 각 쌍 사이의 중앙 채널에 있는 포타슘의 존재에 의해 더욱 안정화될 수 있다. 사중나선은 DNA, RNA, LNA, 및 PNA에서 가능한 것으로 나타났으며, 분자 내일 수 있다.
예시적인 사중나선은 G-풍부 서열로부터 형성된 G-사중나선 및 시토신-풍부 서열로부터 형성된 i-모티프(삽입된 모티프)를 포함한다.
따라서, 일 양태에서, 말단 뉴클레오티드는 사중나선, 선택적으로 G-사중나선 또는 i-모티프 내에 격리된다.
입체형태 모티프
원하는 생성물 중 하나는 단일 가닥 핵산 분자 또는 구조물이며, 이는 임의의 적합한 핵산으로 구성되지만, 바람직하게는 단일 가닥의 말단을 격리시키는 입체형태 모티프에 의해 양쪽 측면에 플랭킹된 관심 서열을 함유하는 DNA 또는 RNA로 구성된다. 따라서 단일 가닥 핵산은 제1(일반적으로 5' 말단에) 및 제2(일반적으로 3' 말단에) 입체형태 모티프를 갖는다. 각각의 입체형태 모티프는 고유할 수 있지만, 이들은 모두 단일 가닥 말단을 격리시킬 수 있는 속성을 공유한다.
단일 가닥 핵산 분자 또는 구조물은 격리된 말단과 관련하여 논의된 바와 같은, 임의의 적합한 입체형태 모티프를 포함할 수 있다.
입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 이러한 수소 결합은 임의의 종류의 염기쌍일 수 있거나, 테트라플렉스/사중나선과 같은 구조물에서 볼 수 있는 후그스틴 유형 수소 결합일 수 있다.
특히, 입체형태 모티프는 입체형태 모티프 자체 내에서 단일 가닥 핵산 내의 다른 곳에서 서열의 또 다른 섹션에 염기쌍을 형성할 수 있는 서열의 하나 이상의 섹션을 포함하는 서열일 수 있다.
따라서 입체형태 모티프는 단순히 "상보적"인 서열의 2개 섹션과 역평행 또는 실제로 평행 이중나선을 형성하는 염기쌍을 포함할 수 있다. 이러한 이중나선은 단일 가닥 핵산의 말단 잔기(즉, 3' 또는 5' 말단)를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 이러한 경우, 입체형태 모티프는 헤어핀(2개 섹션이 인접함) 또는 스템 루프(2개 섹션이 단일 가닥 핵산을 남기는 스페이서 서열에 의해 분리되는 경우)를 형성할 수 있다. 이러한 구조는 입체형태 모티프에서 역 반복 서열을 포함함으로써 달성될 수 있음을 이해할 것이다. 회문 구조 서열은 이중가닥 핵산 서열의 섹션으로서 한 섹션에서 5'에서 3' 정방향으로 읽는 것이 이중나선을 형성하는 상보적인 섹션에서 5'에서 3' 정방향으로 읽는 서열과 일치한다.
따라서 입체형태 모티프는 헤어핀, 스템 루프, 또는 유사매듭 중 하나 이상의 형성에 필요한 서열을 포함할 수 있다. 이러한 모든 입체형태는 공통적으로 이중나선을 형성할 수 있는 서열의 2개 섹션을 가지고 있다. 대안적인 구조는 이중나선을 형성할 수 있는 서열의 섹션을 또한 포함하는 매듭 또는 올가미(lassos)를 포함한다.
입체형태 모티프는 직접적인 염기쌍에 의해 말단을 격리시키기 위해, 이중나선을 형성하도록 설계된 추가 서열을 갖는 G 사중나선과 같은 상이한 입체형태의 하이브리드일 수 있다. 필요한 것은 입체형태 모티프가 말단 뉴클레오티드를 고정시킬 수 있다는 것뿐이다.
단일 가닥 DNA 또는 RNA 게놈을 가진 유기체, 또는 유전 물질이 생애 주기의 일부 동안 단일 가닥으로 존재할 수 있는 유기체는 특정 구조를 사용하거나, 단백질의 위치화(positioning)를 포함하여 다른 수단에 의해 핵산의 유리 말단을 보호하도록 진화하였다. 실제로, 포유류 게놈은 단일 가닥 오버행이 있을 수 있는 염색체의 말단을 보호하기 위해 텔로미어의 사용을 진화시켰다.
예컨대, AAV는 ITR을 사용하여 단일 가닥 DNA 게놈의 말단을 보호한다. 아데노-관련 바이러스(AAV)는 파보비리대(Parvoviridae) 패밀리의 비병원성 구성원이다. 야생형 AAV 게놈은 일반적으로 양쪽 말단에 145 뉴클레오티드로 이루어진 역 말단 반복(ITR)을 포함한다. 각 ITR의 말단 125 뉴클레오티드는 자가-어닐링되어 회문 구조 이중-가닥 T-형 헤어핀 구조를 형성할 수 있으며, 여기서 작은 회문 구조 B-B' 및 C-C' 영역은 교차 팔을 형성하고 큰 회문 구조 A-A' 영역은 스템을 형성한다. 각 구조 뒤에는 고유한 약 20-뉴클레오티드 D(또는 D') 영역이 이어진다. 재조합 AAV(rAAV) 생산은 ITR 내의 절단에 영향을 받지 않아, 길이가 137 뉴클레오티드 이하가 될 수 있다. 자연에서, ITR은 복제 원점 역할을 하며 더 큰 스템 회문 구조(A-A')에 삽입된 2개 팔 회문 구조(도 8a ― B-B' 및 C-C')로 이루어져 있다. ITR은 2개 구성(플립 및 플롭)을 획득할 수 있다. 플립(도 8a ― AAV2에 도시됨) 및 플롭 구성은 각각 3' 말단에 가장 가까운 B-B' 및 C-C' 회문 구조를 갖는다. 박스 친 모티프는 AAV Rep 단백질이 결합하는 Rep-결합 요소(RBE)에 해당한다. RBE는 공통(consensus) 서열 5'-GNGC-3' 내에 테트라뉴클레오티드 반복으로 이루어질 수 있다.
이전에(문헌[Ping et al, Mol Biotechnol DOI 10.1007/s12033-014-9832-3]) 단일 가닥 DNA에서 D 영역의 존재(도 8b에 도시된 바와 같음)는 재조합 AAV 벡터에 의해 운반된 트랜스진의 발현에 해로울 수 있다는 것이 밝혀졌다. D 영역은 이 영역에 우선적으로 결합하여 두 번째 가닥 합성을 방지하는 인간 단백질에 대한 결합 부위를 제공하는 것으로 여겨진다(문헌[Qing et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 94, pp. 10879―10884, September 1997], 문헌[Medical Sciences and Kwon et al, Human Gene Therapy, DOI: 10.1089/hum.2020.018]). 따라서, 세포 내 트랜스진을 발현하려는 의도라면 본 발명의 단일 가닥 DNA에 D 영역을 포함하는 것이 바람직하지 않을 수 있으며, 이는 도 8c에 도시된 바와 같이 D' 영역과 쌍을 이루도록 서열을 제거하거나 입체형태 모티프 내에서 제공하여 수행할 수 있다. 따라서, D 영역뿐만 아니라 쌍을 이루는 D' 영역도 존재한다. 이러한 쌍 이루기(pairing)는 ITR-스타일 구조의 추가 안정화를 제공할 수 있다. 또한, 이중 가닥 D 영역의 존재는 전사 인자(예컨대 RFX)가 결합하도록 할 수 있으며, 또한 잠재적으로 핵 수송을 향상시킬 수 있다(문헌[Julien et al, Sci Rep. 2018 Jan 9;8(1):210. doi: 10.1038/s41598-017-18604-3]). D 영역의 존재의 추가적인 이점은 숙주 체액성 면역 반응을 약화시키는 이러한 영역의 존재 가능성일 수 있다. Kwon 등은 D 서열이 MHC-II 유전자의 발현을 억제할 수 있음을 보여주었다. 따라서, D 영역이 존재하지만, 이중 가닥 형태인 경우, 숙주 면역 반응을 약화시키고 D 영역이 단일 가닥 형태일 때 나타나는 두 번째 가닥 합성의 억제를 회피하는 반면, 잠재적으로 핵 수송 메커니즘을 제공하는 이점이 있다. 따라서 핵산 구조물 내에, 특히 입체형태 모티프에 이중 가닥 D 영역의 존재가 바람직하다.
따라서 본 발명은 격리된 말단을 갖는 선형 단일 가닥 핵산 분자로 확장되며, 여기서 적어도 하나의 말단은 이중 가닥 D 영역을 포함하여 ITR 구조를 포함한다. 상기 D 영역은 D' 영역과 이중나선일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 D' 영역은 이중나선이 두 서열 사이에 형성될 수 있도록 D 영역에 충분히 상보적이다. D 영역은 천연 D 영역 서열일 수 있거나(도 8a - AGGAACCCCTAGTGATGGAG, 서열번호 2, 서열번호 3 내지 6으로 제시된 다양한 혈청형 변이체) 또는 이에 대해 충분한 상동성, 예컨대 적어도 80, 85, 90, 95 또는 99% 상동성을 갖는 서열일 수 있다. 본 발명의 선형 단일 가닥 DNA는 본원에 기술된 1 또는 2개의 ITR 말단을 포함할 수 있다. 이러한 말단은 동일하거나 상이할 수 있다. 이러한 구조의 이점은 숙주 면역계가 일시적으로 억제될 수 있는 동안 임의의 트랜스진이 발현된다는 것이다.
따라서 단일 가닥 핵산 구조물의 입체형태 모티프는 임의의 AAV 혈청형으로부터 취해진 ITR 서열일 수 있다. 이는 임의의 AAV 혈청형으로부터의 ITR에 기초한 유도체화된 서열일 수 있으며, 예컨대 하나 이상의 요소가 수정, 변경 또는 대체될 수 있다. RBE는 제거될 수 있거나, 단일 가닥 핵산 구조물이 사용될 용도에 따라 회문 구조 중 하나의 길이가 수정될 수 있다. 입체형태 모티프는 천연 AAV ITR 서열과 완전히 상이한 서열일 수 있지만 여전히 유사한 구조를 유지할 수 있다. 당업자는 적절한 자가-상보적 서열을 사용하여 2개 팔의 회문 구조를 형성하는 서열을 설계하는 방법을 이해할 것이다.
다른 바이러스 게놈도 이들의 선형 게놈 말단에 있는 격리된 말단에 의존한다. HIV는 적어도 5' 격리된 말단을 가지고 있다.
대안적으로, G-사중나선 및 삽입된 모티프(i-모티프)와 같은 폴딩 구조의 사용이 고려될 수 있다. i-모티프 및 G-사중나선은 DNA에 의해 형성된 4개 가닥 사중나선 구조이고; i-모티프는 시토신-풍부 DNA 영역에 의해 형성되고, G-사중나선은 구아닌-풍부 DNA에 의해 형성된다. i-모티프는 생리학적 이하의 pH 값에서 특히 안정하기 때문에 나노기술 및 나노의학에서 잠재적인 적용을 가지며, 바이오센서, 나노머신 및 분자 스위치로서 사용되어왔다.
G-사중나선의 서열은 다양하며 다음의 추정 화학식 (G3+N1―nG3+N1―nG3+N1―nG3+)으로 정의될 수 있으며, 여기서 N은 구아닌을 포함하여 임의의 뉴클레오티드이다. 구아닌 사이의 잔기 수는 루프의 길이를 정의한다. 7 뉴클레오티드 초과의 루프가 나타났다.
따라서 입체형태 모티프는 수소 결합에 의해 유지되는 입체형태를 가정하며, 이는 염기-적층과 같은 상호작용에 의해 더욱 안정화될 수 있다. 이러한 입체형태는 실제로 소분자 또는 이온의 존재에 의해 더욱 안정화될 수 있으며, 그 예가 하기 제시되어 있다.
사중나선(대안적으로 테트라플렉스로 지칭됨)은 예컨대 중심 이온 주위에 착물을 형성할 수 있다. 소분자 및 단백질 둘 모두 다수의 리간드가 사중나선에 결합할 수 있다. 이러한 리간드는 자연 발생 또는 합성일 수 있다. 특성이 분석된 모든 G-사중나선 결합 단백질은 FMR1 G-사중나선 결합 단백질의 이전에 기술된 RG-풍부 도메인(RRGDG RRRGG GGRGQ GGRGR GGGFKG ― 서열번호 8)과 유사한 NIQI(Novel Interesting Quadruplex Interaction Motif; 신규 흥미로운 사중나선 삽입 모티프)로 지칭되는 20개 아미노산 길이의 모티프/도메인(RGRGR GRGGG SGGSG GRGRG ― 서열번호 7)을 공유하는 것으로 밝혀졌다. 양이온성 포르피린은 G-사중나선과 삽입적으로 결합하는 것으로 나타났다. 사중체가 적층된 사중나선과 이를 함께 유지하는 핵산 루프를 매칭시키는 것이 중요할 수 있다. π-π 상호작용은 리간드 결합에 대한 중요한 결정자일 수 있다. 리간드는 평형으로 폴딩된 사중나선에 대해 더 높은 친화도를 가져야 한다. 이들을 안정화시키기 위해 다른 입체형태 모티프에 결합하는 리간드도 또한 고려된다.
입체형태 모티프는 단일 가닥 핵산 분자의 말단을 격리시키고, 일반적으로 특정 구조를 형성한다. 입체형태 모티프는 이 구조가 이의 고유한 기능을 갖도록 설계되어 추가로 말단을 격리시킬 수 있다. 예컨대, 입체형태 모티프, 또는 리보자임, 디옥시리보자임, 및 리보스위치에 의해 압타머가 형성될 수 있도록 설계될 수 있다. 압타머는 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 및 이들의 상보적 형태로 인해 특이적 표적에 결합한다. 시험관 내 선택 또는 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment; 지수 농축에 의한 리간드의 체계적 진화)의 반복 라운드를 통해 압타머 서열을 조작하여 다양한 분자 표적 예컨대 소분자, 단백질, 핵산, 및 심지어는 더 큰 대상물 예컨대 세포, 조직 및 유기체에 결합시키는 것이 가능하다. 대안적으로, 입체형태 모티프는 세포 또는 핵 막을 가로지르는 것을 촉진하는 서열을 포함하도록 설계될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 입체형태 모티프는 나노기술 등에 사용될 수 있는 핵산 구조물을 사용하여 올리고머 복합체를 형성할 수 있도록 설계될 수 있다.
핵산 입체형태는 조건의 변화에 영향을 받을 수 있다. 입체형태 모티프에 대한 서열은 핵산 구조물이 사용되는 조건(즉, pH, 온도, 염 농도, 압력, 단백질 농도, 당 농도, 삼투압 등) 하에 입체형태가 채택되도록 선택되어야 한다.
핵산 구조물은 예컨대 생리학적 조건 또는 전자공학에서 기술의 사용을 선호하는 조건과 같은 많은 다양한 조건에서 사용될 수 있다.
생리학적 조건은 해당 유기체 또는 세포 시스템에 대해 자연적으로 발생할 수 있는 외부 또는 내부 환경의 조건이며, 입체형태 모티프가 관련 입체형태를 가정하는 적합한 조건일 수 있다.
핵산 구조가 비-세포 목적으로 사용되는 경우, 즉, 나노기술에서 필요에 따라 관련 완충 용액 또는 실제로 순수한 물에서 입체형태가 달성될 수 있어야 한다.
따라서, 입체형태 모티프는 연쇄체 전구체 분자에서 단일 가닥 포맷일 수 있으며, 이들은 어떠한 입체형태로도 가정되지 않거나, 실제로 가능한 조건일 수 있다. 연쇄체 전구체에서 말단 잔기는 처리 모티프와 인접하는 것으로 이해될 것이다. 격리된 말단을 갖는 선형 단일 가닥 핵산 분자의 생산을 가능케 하는 것이 모티프의 인접 특성이다.
관심 서열
단일 가닥 핵산 구조물은 또한 관심 서열을 포함한다. 관심 서열은 하나 이상의 서열을 포함할 수 있고, 실제로 다수의 서열을 포함할 수 있으며, 예컨대 몇몇 유전자 서열이 "관심 서열" 내에 포함될 수 있으며, 이들 각각은 필요한 경우 프로모터 및 인핸서 요소와 결합될 수 있다.
관심 서열은 또한 입체형태 모티프의 서열에 대해 상보성을 갖는 서열을 포함하는 스페이서 서열을 포함하여 염기 쌍을 이루는 섹션이 형성되어 말단 또는 말단 뉴클레오티드를 격리시킬 수 있다.
이러한 관심 서열은 임의의 적합한 서열일 수 있거나, 임의의 수의 서열을 포함할 수 있다. 서열은 그 자체로 압타머, 핵산 효소, 리보자임, 디옥시리보자임, 리보스위치, 작은 간섭 RNA 등을 형성하는 것과 같은 기능을 가질 수 있다. 관심 서열은 압타머, 단백질, 펩티드, 또는 RNA, 예컨대 작은 간섭 RNA일 수 있는 생성물을 코딩할 수 있다. 관심 서열은 하나 이상의 프로모터 또는 인핸서 요소 및 mRNA 또는 관심 단백질을 코딩하는 유전자 또는 다른 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 관심 단백질을 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 진핵세포 프로모터, 및 선택적으로 인핸서 및/또는 진핵세포 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.
대안적으로, 관심 서열은 캐리어 서열이 되도록 설계될 수 있다. 따라서, 관심 서열은 어닐링될 수 있는 또 다른 별도의 서열에 충분히 상보적일 수 있으며, 이에 따라 단일 가닥 섹션과 이중나선을 형성함으로써 전체 단일 가닥 핵산 캐리어가 다른 분자에 대한 전달 매커니즘으로서 효과적으로 사용될 수 있도록 한다. 별도의 올리고뉴클레오티드가 완전히 합성될 수 있다. 이러한 맥락에서, 단일 가닥 생성물은 "캐리어" 분자로서의 역할을 한다.
관심 서열은 숙주 세포에서 발현을 위한 DNA 생산, 특히 DNA 백신 생산에 사용될 수 있다. DNA 백신은 전형적으로 감염성 유기체의 DNA의 변형된 형태를 코딩한다. DNA 백신은 대상체에 투여되어 감염성 유기체의 선택된 단백질을 발현하여, 전형적으로 보호하는 해당 단백질에 대한 면역 반응을 시작한다. DNA 백신은 또한 암 면역요법 접근법에서 종양 항원을 암호화할 수 있다.
관심 서열은 다른 유형의 치료 DNA 분자, 예컨대 유전자 치료에 사용되는 것들을 생성할 수 있다. 예컨대, 이러한 DNA 분자는 대상체가 해당 유전자의 기능장애 버전에 의해 야기되는 유전적 장애가 있는 경우 기능적 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환의 예가 당업계에 잘 알려져 있다.
관심 서열은 동물과 식물 둘 모두에서 유전자 편집 목적을 위한 공여체 핵산으로 작용할 수 있다. 예시적인 유전자 편집 방법은 CRISPR 유전자 편집 및 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN: Transcription activator-like effector nucleases) 기반 방법을 포함한다.
본 발명의 신규 구조물은 또한 재료 과학, 나노 기술, 데이터 저장 등을 포함하는 비-의학적 용도를 가질 수 있으며, 이에 따라 관심 서열이 선택될 수 있다. 핵산은 바이오-배터리, 물체의 보안 마킹, 또는 생체분자 전자 부품에 사용될 수 있다.
특히 격리된 말단을 가진 단일 가닥 핵산 구조물은 박테리아 복제 원점이 결여되어 있고, 내성 유전자(즉, 항생제에 대한)가 결여되어 있고, CpG 섬이 결여되어 있고(동일한 것이 도움이 될 수 있는 DNA 백신 제외), 시토신 및 아데닌의 메틸화가 결여되어 있고, 숙주 세포에 대해 외래인 것으로 핵산을 식별하는 서열이 결여되어 있는(구조물이 세포용인 경우) 것이 치료 용도에 바람직하다.
단일 가닥 핵산 구조물은 DNA 또는 RNA와 같은 천연 핵산 분자일 수 있다. 단일 가닥 핵산 구조물이 DNA인 것이 바람직하다. 단일 가닥 핵산 구조물은 또한 비-천연 핵산 분자일 수 있다. 비-천연 핵산 분자 또는 제노핵산(XNA)의 예는 1,5-안히드로헥시톨 핵산(HNA), 사이클로헥센 핵산(CeNA), 트레오스 핵산(TNA), 글리콜 핵산(GNA), 잠금 핵산(LNA), 펩티드 핵산(PNA) 및 FANA를 포함한다. Hachimoji DNA는 천연 핵산, DNA 및 RNA에 존재하는 4/5 외에 4개의 합성 뉴클레오티드를 사용하는 합성 핵산 유사체이다. 효소는 합성 색산 분자를 인식하기 위해 조작되거나, 돌연변이되거나, 개발되었으며, 따라서 본 발명의 방법 및 생성물은 합성 및 천연 핵산 및 이의 키메라의 유사체, 또는 하이브리드에 동등하게 적용된다.
단일 가닥 핵산 분자/구조물 제조
단일 가닥 핵산 구조물은 고유한 주형의 회전 환 증폭, 및 이어서 이러한 증폭으로 생성된 단일 가닥 핵산 연쇄체를 처리함으로써 고유한 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 구조물의 제조 방법은 관련 폴리머라제 효소를 사용한 회전 환 증폭에 의한 주형 핵산("서열 단위")의 증폭에 의존하며, 주형에 의해 코딩된 서열 단위의 다중 반복이 있는 긴, 단일 가닥 핵산이 생성된다. 이러한 연쇄체 단일 가닥 핵산은 이어서 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 생성물로 처리될 수 있다.
증폭 과정은 기질(즉, 핵산 생성을 위한 적절한 뉴클레오시드), 및 임의의 보조-인자(예컨대 염, 이온 등)의 첨가를 필요로 한다. 효소가 작동할 수 있는 완충액 및 온도의 존재를 포함하는 적합한 조건. 회전 환 증폭을 위한 적합한 조건은 등온일 수 있다.
증폭은 핵산 주형의 여러 카피의 생산, 또는 핵산 주형에 상보적인 다중 핵산 서열 카피의 생산이다. 본 발명의 방법에서, 증폭은 핵산 주형에 상보적인 다중 핵산 서열 카피의 생성을 지칭하는 것이 바람직하다.
주형이 이중 가닥인 경우, 원하는 생성물에 상보적인 가닥이 주형으로 사용되는 것을 보장하는 기술이 사용되는 것이 바람직하다. 이는 하기 추가로 논의되는 바와 같은 몇 가지 방법에 의해 달성될 수 있다.
사용되는 경우, 뉴클레오시드는 핵산 염기(핵염기)가 당 모이어티에 연결된 화합물이다. 핵산 염기는 천연일 수 있거나 변형/합성 핵염기일 수 있다. 핵산 염기는 특히 퓨린 염기(예컨대, 아데닌 또는 구아닌), 피리미딘(예컨대 시토신, 우라실, 또는 티민), 또는 디아자퓨린 염기를 포함할 수 있다. 핵산 염기는 리보스 또는 디옥시리보스 당 모이어티일 수 있다. 당 모이어티는 천연 당, 당 치환체, 치환된 당, 또는 변형된 당을 포함할 수 있다. 뉴클레오시드는 2'-히드록실, 2'-디옥시, 또는 당 모이어티의 2',3'-디디옥시 형태를 함유할 수 있다.
뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기는 뉴클레오시드 포스페이트를 지칭한다. 이는 천연, 합성, 또는 변형된 뉴클레오티드, 또는 대리 대체 모이어티(예컨대 이노신)을 포함한다. 뉴클레오시드 포스페이트는 뉴클레오시드 모노포스페이트(NMP), 뉴클레오시드 디포스페이트(NDP) 또는 뉴클레오시드 트리포스페이트(NTP)일 수 있다. 뉴클레오시드 포스페이트 중의 당 모이어티는 펜토스 당, 예컨대 리보스일 수 있다. 뉴클레오티드는 비제한적으로 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP) 또는 리보뉴클레오시드 트리포스페이트(rNTP)일 수 있다.
뉴클레오티드 유사체는 천연 발생 뉴클레오티드와 구조적으로 유사한 화합물이다. 뉴클레오티드 유사체는 변경된 포스페이트 백본, 당 모이어티, 핵염기, 또는 이들의 조합을 가질 수 있다. 이러한 유사체의 사용은 상이한 염기쌍 특성을 가질 수 있는 핵산을 생성하고 이러한 염기가 적층될 때 발생하는 상호작용이 천연 핵산에서 보이는 것과 상이할 수 있음을 이해할 것이다.
증폭 반응은 온도 순환을 필요로 하는 PCR와 같은 증폭과 달리, 바람직하게는 등온이다(일정한 온도에서). 상기 방법은 임의의 적절한 주형, 바람직하게는 환형 핵산 주형의 증폭에서 사용될 수 있다. 핵산 주형은 최소량을 포함하여 반응에 임의의 적절한 양으로 제공될 수 있다.
핵산 주형이 RCA를 사용하여 증폭되는 것이 바람직하다.
폴리머라제 효소 또는 증폭에 사용되는 효소는 교정 또는 비-교정 핵산 폴리머라제일 수 있다. 사용된 핵산 폴리머라제는 가닥 치환 핵산 폴리머라제일 수 있다. 핵산 폴리머라제는 호열성 또는 중온성 핵산 폴리머라제일 수 있다.
상기 방법은 충실도가 높은 증폭을 위한 조건에서 핵산 주형을 증폭하기 위해 고도로 진행되는, 가닥-치환 폴리머라제가 필요할 수 있다. 폴리머라제의 충실도는 주형의 정확한 복제 결과이다. 올바른 뉴클레오티드 혼입 대 부정확한 뉴클레오티드 혼입을 효과적으로 구별하는 것 외에도, 일부 폴리머라제는 3'에서 5' 엑소뉴클레아제 활성을 보유한다. 이러한 교정 활성은 부정확하게 통합된 염기를 제거한 다음 올바른 것으로 대체하는데 사용된다. 고충실도 증폭은 주형의 충실한 복제를 제공하기 위해 교정 활성과 함께 낮은 혼입율을 결합시키는 폴리머라제를 활용한다.
증폭 반응은 증폭 후에 단일 가닥의 증폭된 핵산을 생성하는 폴리머라제를 사용할 수 있다. 따라서 폴리머라제는 가닥 치환 합성이 가능하다.
Phi29 DNA 폴리머라제 또는 Phi29-유사 폴리머라제가 일부 실시형태에서 주형을 증폭하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, Phi29 DNA 폴리머라제 및 또 다른 폴리머라제의 조합이 사용될 수 있다.
증폭 반응은 방법의 한 버전에서 낮은 농도의 프라이머를 사용할 수 있다. 본 발명자들은 프라이머의 농도가 낮을수록 증폭 반응이 단일 가닥 핵산만을 생성할 수 있다는 점에서 유리하다는 것을 발견하였다. 프라이머는 핵산 합성 반응을 프라이밍하기 위해 주형 내의 서열에 혼성화하는 짧은 선형 올리고뉴클레오티드이다. 프라이머는 임의의 핵산, 예컨대 RNA, DNA, 비-천연 핵산, 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 프라이머는 천연, 합성, 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
대안적으로, 주형이 이중 가닥 환형 주형이라고 가정하면, 닉킹 효소는 이중 가닥 주형의 하나의 가닥 상에 닉을 만들기 위해 사용될 수 있다. 이는 폴리머라제에 대한 진입 지점을 남기며, 이어서 이는 핵산 합성 반응을 프라이밍하기 위해 주형 자체의 닉킹된 가닥을 활용한다.
따라서 핵산 주형은 주형을 적어도 하나의 폴리머라제 및 뉴클레오티드와 접촉시키고 핵산 증폭에 적합한 조간 하에 반응 혼합물을 인큐베이션함으로써 증폭된다. 핵산 주형의 증폭은 등온 조건 하에서 수행될 수 있다. 추가 성분은 닉킹 효소(니카제), 보조인자(예컨대 마그네슘 이온), 프라이머, 및/또는 완충제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
환형 주형의 회전 환 증폭은 주형에 의해 코딩된 인접 다중 반복을 가진 선형 단일 가닥 연쇄체를 생성한다(각각은 본원에서 서열 단위로 지칭됨). 주형의 특성으로 인해, 이는 각 서열 단위가 포맷팅 요소에 의해 플랭킹된 관심 서열을 포함하는 것을 의미한다. 이는 관심 서열이 각 말단에 포맷팅 요소를 가짐을 의미한다. 각 서열 단위는 또한 백본 서열을 포함할 수 있다.
이러한 방법은 관심 서열을 코딩하는 서열의 각 말단 중 하나에, 주형 내의 포맷팅 요소를 코딩하는 서열에 의존한다. 이러한 포맷팅 요소는 처리 모티프와 입체형태 모티프를 코딩하는 2개의 인접한 서열이다. 정방향 포맷팅 요소는 입체형태 모티프에 인접한 처리 모티프를 포함하고, 역방향 포맷팅 요소는 처리 모티프에 인접한 입체형태 모티프를 포함한다. 처리 모티프는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함한다.
연쇄체는 엔도뉴클레아제를 사용하여 핵산 구조물로 처리될 수 있다. 절단 부위는 입체형태 모티프의 말단 잔기를 방출한다.
연쇄체 핵산의 절단 부위가 필수 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 때, 이는 처리 모티프로부터 입체형태 모티프를 방출하여, 적절한 조건 하에 단일 가닥 핵산 분자의 말단을 격리시킬 수 있다.
증폭 및 처리 반응은 동시에 발생할 수 있다, 즉, 엔도뉴클레아제가 생성되자마자 연쇄체를 처리하기 위해 존재할 수 있거나, 증폭이 더 진행되거나, 실제로 완료될 때까지 엔도뉴클레아제를 추가하는데 지연이 있을 수 있다.
따라서 단일 가닥 핵산 구조물의 제조 방법은 우아하고 효율적이며, 관심 서열의 길이에 제한되지 않는다
주형
주형에서, 관심 서열을 코딩하는 서열은 포맷팅 요소를 코딩하는 서열에 의해 양쪽 측면에 플랭킹되어 있다. 하나는 정방향이고, 다른 것은 역방향이다. 코딩된 서열은 관심 서열이 입체형태 모티프에 의해 플랭킹되고, 차례로 처리 모티프, 입체형태 모티프 및 함께 포맷팅 요소를 형성하는 입체형태 모티프와 처리 모티프에 직접적으로 인접하도록 중첩된다. 이러한 중첩은 도1에 나타난 바와 같이 표현될 수 있다. 따라서 처리 모티프 및 입체형태 모티프 서열은 인접한다. 대안적으로, 관심 서열의 각 말단의 포맷팅 요소는 반대 방향 또는 미러링된 방향으로 되어 있어, 입체형태 모티프가 관심 서열에 가장 가까운 반면, 처리 모티프는 포맷팅 요소의 가장 바깥쪽 부분이다.
포맷팅 요소는 단일 가닥 핵산 분자의 생성에 고유하지만, 처리 모티프는 입체형태 모티프에서 절단되기 때문에 최종 생성물에는 완전한 형태로 존재하지 않는다. 처리 중에 엔도뉴클레아제의 작용은 처리 모티프의 절단 부위가 절단되도록 하여 이에 따라 처리 모티프가 폐기된다. 따라서, 이는 부분적으로 제거된 유용한 생성물을 생산하는 메커니즘이며 최종 생성물에 불필요한 서열의 최소량을 포함하여 관심 서열에 더 많은 공간을 제공한다. 따라서, 처리 모티프 및 인접 입체형태 모티프는 절단 부위가 절단될 때까지 효율적으로 결합되어 생성물의 말단 잔기를 방출한다. 엔도뉴클레아제에 대한 절단 부위에 의해 효율적으로 분리된, 입체형태 모티프에 인접한 처리 모티프의 조합은 엔도뉴클레아제를 사용하는, 단일 단계 공정에서 더 긴 단일 가닥 핵산 분자로부터 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산의 직접적은 생산을 가능케 한다. 처리 모티프는 제한 효소 처리를 통해 단일 가닥 핵산으로부터 제거되며, 격리된 말단을 가진 단일 가닥 핵산에 존재하지 않는다.
포맷팅 요소는 엔도뉴클레아제의 작용에 의해 효과적으로 절단되어 최종 생성물에서 부분적으로 제거된다.
처리 모티프
처리 모티프는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 절단 부위는 인식 부위로부터 멀리 떨어져 있을 수 있지만, 둘 모두 일반적으로 이중나선 구조에 있어야 한다는 것이 이해될 것이다.
하나의 포맷에서, 처리 모티프는 처리 모티프 내의 또 다른 서열에 결합할 수 있는 서열의 적어도 하나의 영역을 포함하기 때문에 염기쌍 섹션을 형성할 수 있으며, 이러한 섹션은 서열에서 자가-상보적으로 보일 수 있다. 이러한 서열은 인접할 수 있거나 스페이서 요소에 의해 분리될 수 있다. 이러한 모티프는 단일 가닥 핵산에서 서열의 상보적 스트레치를 포함함으로써 설계될 수 있다. 두 서열이 핵산의 동일한 가닥에 존재하지만, 분자의 설계는 한 서열이 분자 내로 다른 서열에 결합하도록 올바른 배향에 있도록 보장한다는 것을 이해할 것이다. 예컨대, DNA에서 염기쌍이 형성되기 위해서는 서열이 역평행해야 한다. 이러한 모티프는 예컨대 바이러스 단일 가닥 게놈에서 일반적이다.
처리 모티프의 염기쌍 섹션은 인접하므로, 이러한 섹션은 헤어핀 등을 형성할 수 있다. 핵산은 역평행 이중 가닥 헤어핀 유사 구조를 형성할 수 있다. 헤어핀 구조는 스템으로 지칭되는 이중 가닥 염기쌍 영역으로 이루어져 있다. 대안적으로 처리 모티프의 염기쌍 섹션은 염기쌍의 가능한 서열의 2개 스트레치 사이에 스페이서 서열을 포함할 수 있어, 스템-루프와 같은 구조가 형성될 수 있다. 스페이서는 임의의 적합한 길이일 수 있다. 헤어핀은 본원에 정의된 바와 같은 회문 구조인 핵산 서열로 형성될 수 있다.
핵산 분자의 염기쌍 또는 이중 가닥 섹션은 또한 상보적 서열을 가질 수 있다. 염기쌍 또는 이중나선이 본원에서 추가로 정의된다.
처리 모티프의 염기쌍 섹션에서, 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위, 및 관련 절단 부위가 포함된다. 절단 부위가 염기쌍 섹션의 기초에 형성되어 전체 처리 모티프가 필요한 필수 엔도뉴클레아제를 사용하여 단일 가닥으로부터 절단될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
염기쌍은 단일 가닥 내에서 서열의 적어도 2개 섹션 사이에서 발생한다. 이러한 염기쌍은 표준일 수 있거나(즉, DNA에서 아데닌(A)-티민(T), RNA에서 아데닌(A)-우라실(U), 및 둘 모두에서 시토신(C)-구아닌(G)인 왓슨 및 크릭 고전적 염기쌍) 비-정규일 수 있다(즉, 후그스틴 염기쌍 또는 탄소-수소 및/또는 산소/질소기 등 사이의 상호작용). 이들이 다른 곳에서 기술되어 있다.
주형은 임의의 이러한 특성을 갖는 처리 모티프를 코딩하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 처리 모티프는 상이한 서열일 수 있다.
주형은 제1 처리 모티프를 코딩하는 서열 및 제2 처리 모티프를 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 주형에 의해 코딩된, 제1 및 제2 처리 모티프는 입체형태 모티프의 외부 가장자리(및 포맷팅 요소 내)에 위치하여 관심 서열의 각 말단이 반대 방향(정방향 및 역방향)인 포맷팅 요소로 끝난다.
단일 가닥 핵산 연쇄체(처리 전)에서 처리 모티프에 대한 요건의 특성을 감안할 때, 제1 및 제2 처리 모티프의 서열은 동일하거나 상이할 수 있다. 이들이 동일하다면, 제한 부위가 염기쌍 섹션의 기초에 형성되어, 전체 처리 모티프가 필수 엔도뉴클레아제를 사용하여 단일 가닥으로부터 절단될 수 있다. 따라서, 관심 서열에 대한 처리 모티프의 배향에 관계없이(전 또는 후), 절단 부위가 염기쌍 섹션의 기초에 있기 때문에 전체 처리 모티프가 핵산으로부터 절단될 수 있고, 이는 또한 한 쌍의 섹션의 최종 염기쌍, 또는 이의 염기로 기술될 수 있다.
대안적으로, 단일 가닥 핵산 연쇄체(처리 전)에서 제1 및 제2 처리 모티프는 상이할 수 있으므로, 이에 따라 절단 부위를 함유하는 엔도뉴클레아제에 대한 각각의 인식 부위가 또한 상이하여, 본 발명의 단일 가닥 연쇄체를 처리할 때 상이한 엔도뉴클레아제의 사용을 가능케 한다.
따라서 주형은 동일하거나 상이한 제1 및 제2 처리 모티프를 코딩하는 서열을 포함한다.
엔도뉴클레아제는 폴리뉴클레오티드 사슬 내에서 포스포디에스터 결합을 절단하는 단백질성 또는 DNA와 같은 핵산으로 구성된 효소이다. 본 발명에서, 이중-가닥 핵산을 통한 절단이 격리된 말단을 가진 핵산 분자를 생성하기 위해 필요하다. 따라서, 각각이 단일 가닥을 통해 절단하는 2개의 엔도뉴클레아제의 조합이 필요할 수 있다. 대안적으로, 두 가닥 모두를 절단하는 단일 효소가 사용될 수 있다. 엔도뉴클레아제는 예컨대 닉킹 엔도뉴클레아제, 귀소 엔도뉴클레아제, 가이드 엔도뉴클레아제 예컨대 Cas9, 또는 제한 엔도뉴클레아제일 수 있다. 닉킹 엔도뉴클레아제는 오직 하나의 가닥만을 절단하도록 변형된, 변형된 제한 엔도뉴클레아제일 수 있다.
일 양태에서, 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제이다.
제헌 엔도뉴클레아제는 특정 인식 부위 내 또는 이에 인접한 절단 부위에서 이중 가닥 핵산을 절단하는 효소이다. 절단을 위해, 모든 제한 엔도뉴클레아제는 이중나선의 각 백본(즉, 각 가닥)을 통해 한 번에 2개의 절단을 생성한다. 제한 엔도뉴클레아제가 인식 부위를 인식하기 위해 이중 가닥 핵산의 존재를 필요로 하므로, 이러한 구조는 엔도뉴클레아제가 핵산을 절단할 수 있도록 하기 위해 필요하다. 따라서, 본 발명자들은 단일 가닥 분자가 인식 및 절단 부위를 포함하는 이중 가닥 구조를 형성하도록 바람직하게는 자가-상보적 서열을 사용하여, 단일 가닥 핵산 내에 염기쌍 섹션의 구조를 제안한다.
제한 엔도뉴클레아제는 뉴클레오티드의 특정 서열을 인식하여 이중나선에서 이중-가닥 절단을 생성한다. 인식 부위는 또한 염기의 수에 따라 분류될 수 있으며, 통상 4 내지 8 염기 사이이다. 모두는 아니지만 다수의 인식 부위가 회문 구조이며, 이러한 특성은 염기쌍 섹션에 보다 용이하게 배치될 수 있도록 하는 서열의 설계를 도와주기 때문에 처리 모티프를 설계할 때 매우 유용하다. 단일 다가 포맷에서, 서로 염기쌍을 형성할 때 회문 구조를 형성할 수 있는 각 섹션을 열 반복 서열이라 한다. 이러한 2개 서열은 단일 가닥 핵산에서 스페이서 서열에 의해 분리될 수 있다.
제한 엔도뉴클레아제는 블런트 절단기일 수 있거나(즉, 염기쌍 섹션을 통해 직선으로 절단) 오프셋 방식으로 절단할 수 있다(즉, 절단이 염기쌍 섹션을 통해 엇갈리게 됨). 절단 부위는 인식 부위 내에 있거나, 근처에 있을 수 있으며, 따라서 절단 부위는 인식 부위의 일부일 필요가 없다. 따라서, 절단 부위는 인식 부위와 관련되어 있지만, 반드시 인식 부위의 일부를 형성하지 않는다.
인식 및 절단 부위와 함께 천연 및 조작된 수천 개의 제한 엔도뉴클레아제가 알려져 있다. 임의의 적합한 인식 및 절단 부위가 처리 모티프에 포함되어 있을 수 있다. 클로닝 등에 일반적으로 사용되는 예시적인 제한 엔도뉴클레아제는 HhaI, HindIII, NotI, EcoRI, ClaI, BamHI, BglII, DraI, EcoRV, Pst1, SalI, SmaI, SchI 및 XmaI이다. 다수의 제품이 New England Biolabs 및 ThermoFisher Scientific와 같은 공급업체에서 상업적으로 이용 가능하다.
엔도뉴클레아제를 사용한 절단이 단일 가닥 핵산 연쇄체에서 포맷팅 요소로부터 입체형태 모티프를 방출하기 위해서는, 절단 부위가 입체형태 모티프가 단일 가닥 핵산 분자 생성물의 말단 및 격리된 말단을 형성하도록 주형에서 입체형태 모티프에 인접하는 것이 바람직하다.
주형 내에서, 코딩된 포맷팅 요소 중, 한 부분은 격리된 말단을 가진 최종 단일 가닥 핵산 분자에서 폴딩되도록 설계된 입체형태 모티프를 코딩하는 서열이다. 입체형태 모티프는 단일 가닥 핵산 분자의 말단(즉, DNA 및 RNA의 경우 5' 및 3')을 격리시킨다.
입체형태 모티프는 단일 가닥 핵산 분자 내에서 또는 캡핑 올리고뉴클레오티드와 함께 염기쌍 섹션 또는 이중나선을 형성할 수 있는 서열을 포함한다. 이러한 염기쌍 섹션 또는 이중나선은 엔도뉴클레아제로 처리하기 전에 연쇄체에서 형성될 수 있거나, 처리 모티프가 연쇄체에서 제거되면, 엔도뉴클레아제로 처리한 후에 형성될 수 있다. 도면을 참조하면, 이들은 참조의 용이성을 위해 연쇄체 핵산(도 2, 3, 4, 및 5)에서 염기쌍 섹션을 형성하는 입체형태 모티프와 함께 도시되어 있다. 이러한 구조는 처리 모티프가 엔도뉴클레아제에 의해 절단될 때까지 형성되지 않을 수 있다. 캡핑 올리고뉴클레오티드가 필요한 경우, 이러한 대상물에 대한 염기쌍이 필수 폴딩을 야기할 수 있기 때문에 이것이 첨가될 때 입체형태 모티프가 적절하게 폴딩될 것이다.
이중나선은 단일 가닥 내의 서열의 적어도 2개 섹션 사이에 염기쌍에 의해 형성될 수 있다. 이러한 염기쌍은 표준일 수 있거나(즉, DNA에서 아데닌(A)-티민(T), RNA에서 아데닌(A)-우라실(U), 및 둘 모두에서 시토신(C)-구아닌(G)인 왓슨 및 크릭 고전적 염기쌍) 비-정규일 수 있다(즉, 후그스틴 염기쌍 또는 탄소-수소 및/또는 산소/질소기 등 사이의 상호작용). 후그스틴 쌍은 G-사중나선이라 지칭되는 단일 가닥 핵산 G-풍부 세그먼트, 또는 i-모티프라고 하는 C-풍부 세그먼트의 특정 구조를 형성할 수 있다. G 사중나선은 일반적으로 짧은 스페이서로 분리된, 4개의 트리플렛 G를 필요로 한다. 이는 후그스틴 결합된 구아닌 분자의 스태킹된 결합으로 구성된 평면 사중체의 조립을 가능케 한다.
따라서, 입체형태 모티프는 자가-상보적이거나 단일 가닥 핵산 분자 내의 또 다른 서열, 즉, 관심 서열 또는 관심 서열 내의 스페이서 서열에 상보적인 서열 섹션을 포함할 수 있다.
입체형태 모티프는 단일 가닥 핵산의 스페이서 서열에 의해 각각 분리된, 하나 이상의 염기쌍 섹션 또는 이중나선을 형성하기 위한 서열을 포함할 수 있거나, 염기쌍 섹션 또는 이중나선은 다음 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있는 보다 큰 구조 부분을 형성할 수 있다: 헤어핀; 단일 가닥 영역; 벌지 루프; 내부 루프; 다중-분지형 루프 또는 접합.
입체형태 모티프가 적어도 하나의 염기쌍 섹션 또는 이중나선을 형성하면, 단일 가닥 핵산 분자의 말단 잔기가 격리된다. 단일 가닥 DNA의 양쪽 끝에 있는 말단 뉴클레오티드(또는 잔기)는 멀어진다/보호된다. 이는 말단 잔기가 단일 가닥 엑소뉴클레아제 등에 이용 가능하지 않게 한다.
단일 가닥 핵산 분자의 말단 뉴클레오티드는 입체형태 모티프의 염기쌍 섹션 또는 이중나선 내에 포함되어 격리되고, 따라서 유리 단일 가닥 말단 끝이 없거나, 입체형태 모티프의 위상 내에 폴딩되어, 말단 끝은 추가 상호작용을 위해 유리되지 않고 고정된다.
단일 가닥 핵산 생성물에서 말단 끝(말단 뉴클레오티드)은 단일 가닥 형태가 아닌 것이 바람직하다. 이러한 말단은 각 말단 잔기와 단일 가닥 핵산의 다른 부분 사이에 염기 쌍이 존재함으로써 안정화된다.
연쇄체 핵산 분자의 입체형태 모티프는 일반 처리되면 단일 가닥 핵산 구조물의 한쪽 끝을 형성한다. 말단 잔기는 입체형태 모티프에 의해 격리된다.
단일 가닥 핵산 구조물에서, 각 말단은 입체형태 모티프에 의해 격리된다.
본 발명에 따른 바람직한 입체형태 모티프는 헤어핀, 스템 루프, 접합, 유사매듭, ITR, 변형된 ITR, 합성 ITR, i-모티프 및 G-사중나선으로 폴딩될 수 있는 서열을 포함한다.
헤어핀은 핵산의 단일 가닥의 이웃하는 상보적 서열 사이의 염기쌍으로 인해 DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 구조이다. 이웃하는 상보적 서열은 몇 개의 뉴클레오티드, 예컨대 1 내지 10 또는 1 내지 5 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 이러한 예가 도 2에 도시되어 있다. 상보적 서열의 2개 섹션 사이에 비-상보적 서열의 루프가 포함된 경우, 이는 헤어핀 루프 또는 스템 루프를 형성한다. 루프는 스템 또는 이중 가닥 섹션과 같은 임의의 적합한 길이일 수 있다. 다른 유사한 구조는 매듭을 포함한다.
각 말단의 입체형태 모티프는 동일한 특정 구조(즉, 헤어핀, 스템 루프, ITR 등)로 폴딩될 수 있거나 이들은 각각 독립적으로 상이한 구조(즉, 제1 말단은 헤어핀이고 제2 말단은 ITR임)로 폴딩되도록 설계될 수 있다.
이전에 논의된 바와 같이, 입체형태 모티프는 추가 기능을 가질 수 있다. 이들은 기능적인 구조 예컨대 압타머 등을 형성할 수 있다. 대안적으로, 이들은 단일 가닥 핵산 구조물을 올리고 입체형태로 함께 결합하는 메커니즘을 제공하도록 설계될 수 있다.
주형은 또한 관심 서열을 코딩한다. 격리된 말단을 갖는 연쇄체 및 단일 가닥 핵산 구조물에서, 관심 서열은 임의의 적합한 길이의 임의의 원하는 핵산 서열일 수 있다. 관심 서열은 기능적 서열일 수 있다(즉, 추가 전사 또는 번역 없이 압타머 등으로 직접적으로 작용함). 대안적으로, 관심 서열은 기능적인 서열을 코딩할 수 있다. 기능적인 서열은 압타머, 리보자임을 포함하는 핵산 효소로 인한 촉매적 대상물, 마이크로RNA(miRNA), 짧은 간섭 RNA(siRNA), 및 piwi-상호작용 RNA(piRNA)를 포함하는 비-코딩 RNA(ncRNA)를 포함한다.
관심 서열은 동물과 식물 둘 모두에서 유전자 편집 목적을 위한 공여체 핵산으로 작용할 수 있다. 예시적인 유전자 편집 방법은 CRISPR 유전자 편집 및 전사 활성제-유사 이펙터 뉴클레아제(TALEN: Transcription activator-like effector nucleases) 기반 방법을 포함한다. 관심 서열이 공여체 핵산인 경우, 필요한 기계에 기계(machinery)에 의해 공여체 핵산의 절제를 가능케 하는 서열 또는 요소를 포함하는 것이 필요할 수 있다.
관심 서열은 트랜스진, 예컨대 세포에서 발현하기 위한 유전자 또는 유전 물질일 수 있다. 트랜스진은 발현 카세트 내에 프로모터 서열에 작동 가능하게 연결된다.
관심 서열은 치료 생성물을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 치료 생성물은 DNA 압타머, 단백질, 펩티드, 또는 RNA 분자, 예컨대 작은 간섭 RNA일 수 있다. 치료 유용성을 제공하기 위해, 이러한 관심 서열은 하나 이상의 프로모터 및 인핸서 요소와 유전자 또는 관심 mRNA 또는 단백질을 코딩하는 다른 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 발현 카세트는 관심 단백질을 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 진핵세포 프로모터, 및 선택적으로 인핸서 및/또는 진핵세포 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.
관심 서열은 숙주 세포에서 발현을 위한 DNA 생산, 특히 DNA 백신 생산에 사용될 수 있다. DNA 백신은 전형적으로 감염성 유기체의 DNA의 변형된 형태를 코딩한다. DNA 백신은 대상체에 투여되어 감염성 유기체의 선택된 단백질을 발현하여, 전형적으로 보호하는 해당 단백질에 대한 면역 반응을 시작한다. DNA 백신은 또한 암 면역요법 접근법에서 종양 항원을 암호화할 수 있다. 임의의 DNA 백신이 관심 서열로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 공정은 다른 유형의 치료 DNA 분자, 예컨대 유전자 치료에서 사용되는 것들을 생성할 수 있다. 예컨대, 이러한 DNA 분자는 대상체가 해당 유전자의 기능장애 버전에 의해 야기되는 유전적 장애가 있는 경우 기능적 유전자를 발현하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환의 예가 당업계에 잘 알려져 있다.
관심 서열 또는 입체형태 모티프의 서열을 코딩하는 주형의 일부가 박테리아 복제 원점이 결여되어 있고, 내성 유전자(즉, 항생제에 대한)가 결여되어 있고, CpG 섬이 결여되어 있고(동일한 것이 도움이 될 수 있는 DNA 백신 제외), 시토신 및 아데닌의 메틸화 및 외래 DNA의 임의의 다른 마커가 가 결여되어 있는 것이 바람직하다. 그러나, 주형의 나머지가 처리되고 생성물로부터 제거되기 때문에 이러한 대상물은 관심 서열 및 입체형태 모티프 외부에 존재할 수 있다.
주형은 바람직하게는 환형이거나 환형화될 수 있다. 주형은 이중 가닥이거나 단일 가닥일 수 있다.
주형이 이중 가닥인 경우 제1 처리 모티프 이전에 닉킹 효소에 대한 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 대안적으로 닉킹 엔도뉴클레아제로 공지된, 이러한 효소는 이중나선의 오직 한 가닥만 가수분해하여, 절단되지 않고 "닉킹된" 핵산 분자를 생성한다. 이는 추가 프라이머 없이 회전 환 증폭을 위한 시작점을 제공하고 증폭 반응에서 핵산 연쇄체의 오직 한 가닥만 생성되도록 할 수 있다. 이러한 효소는 예컨대 New England Biolabs 및 Thermo Fisher Scientific에서 상업적으로 입수할 수 있다. 이러한 효소는 인식 및 절단 부위가 주형의 관련 가닥에서 설계되어 올바른 가닥이 주형으로 직접 사용되도록 할 수 있을 정도로 충분히 특이적이다.
주형은 DNA 또는 RNA와 같은 천연 또는 이전에 논의된 바와 같이 인공적인 임의의 적합한 핵산일 수 있다. 주형은 DNA인 것이 바람직하다.
주형의 증폭
단일 가닥 핵산 구조물을 생산하기 위해서는, 주형은 효소적으로 증폭되어야 한다.
주형은 하나 이상의 폴리머라제 효소로 증폭될 수 있다. 폴리머라제 효소는 핵산을 증폭하기 위해 충분한 원료 또는 기질(예컨대 뉴클레오티드) 및 보조-인자(예컨대 금속 이온 등)과 함께 제공되는 경우, 상보적 핵산 카피를 합성하기 위해 주형을 사용할 수 있다.
임의의 적합한 폴리머라제 효소가 이러한 증폭 단계에 사용될 수 있으며, 하나의 효소, 또는 효소의 조합을 사용하는 것이 가능하다.
효소는 주형의 성질에 따라 DNA 폴리머라제 또는 RNA 폴리머라제일 수 있으며, 합성 주형을 사용하거나 합성 단일 가닥 핵산을 제조하기 위한 인공, 변형된, 조작된 또는 돌연변이 폴리머라제일 수 있다.
증폭은 가닥 치환 방법을 통해 진행하는 것이 바람직하다. 이는 (PCR과 같이) 가열 및 냉각의 반복 주기를 필요로 하지 않는 등온 방법이지만, 폴리머라제 효소는 주형에 어닐링된 가닥을 치환할 수 있다. Phi29, Deep Vent®, BST DNA 폴리머라제 I 및 이들의 변이체를 포함하여, 가닥 치환형 폴리머라제가 공지되어 있다. 이는 여러 폴리머라제가 동시에 동일한 주형에 작용할 수 있음을 의미하며, 각각은 이전 폴리머라제에 의해 생성된 초기 가닥을 치환한다.
가장 바람직한 가닥 치환 증폭 기술은 회전 환 증폭(RCA)이다. 이러한 증폭 방법에서, 가닥 치환 폴리머라제는 환형 주형 주변을 계속 진행하면서 초기 올리고뉴클레오티드를 확장한다. 이는 핵산의 긴 연쇄체 가닥의 생성으로 이어진다.
증폭 반응은 닉킹 엔도뉴클레아제로 주형을 닉킹함으로써 이중 가닥 환형 주형 상에서 개시되도록 하는 것이 바람직하다. 이러한 효소가 상기 논의되어 있다. 이중 가닥 주형의 단일 가닥을 닉킹함으로써, 폴리머라제가 결합할 주형을 열고, 환형 주형을 여러 번 처리하여 이 가닥을 연쇄체 핵산으로 확장하기 위해 생성된 유리 3' 말단을 활용할 수 있다.
주형의 닉킹 부위와 닉킹 엔도뉴클레아제의 사용은 또한 상기 방법이 RCA로부터 단일 가닥 연쇄체를 제조하는 것을 허용하고, 효소를 사용하여 단 하나의 백본이 절단되기 때문에 반대 가닥의 증폭을 방지한다.
따라서, 원하는 생성물의 생성을 가능하게 하고, 이중 가닥 주형의 상보적 가닥의 원치 않는 증폭을 방지하기 때문에 주형에 닉킹 부위를 사용하는 것이 바람직하다.
대안적으로, 본 발명자들은 원하는 주형 가닥(및 이의 상보적 가닥이 아님)에 어닐링하도록 설계된 매우 적은 양의 특이적 프라이머를 사용하여 증폭이 강제로 진행되어 이중 가닥 주형의 오직 하나의 가닥을 많은 양으로 제조할 수 있음을 발견하였다. 이러한 양태에서, 오직 피코몰 양의 프라이머가 필요하다. 따라서, 프라이머는 1 pM 내지 100 nM의 양으로 공급될 수 있다.
주형이 단일 가닥인 경우, 프라이머를 사용하여 회전 환 증폭을 개시할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 연쇄체 핵산 분자가 아닌 주형에만 어닐링하도록 설계되어, 오직 한 종의 연쇄체만 만들어지도록 한다.
따라서 본 발명자들은 RCA가 주형을 증폭하고 상보적 가닥이 아닌 단일 가닥 핵산 구조물의 생성을 위한 정확한 종인 원하는 연쇄체만을 생성하도록 진행하는 방법을 고안하였다. 상보적 가닥을 만드는 것은 50% 폐기물 증폭 반응을 초래하고 또한 상보적 연쇄체의 존재가 본질적으로 이중 가닥 핵산의 형성을 초래할 것이기 때문에 단일 가닥 구조물의 합성을 훨씬 더 어렵게 만든다.
주형은 적어도 하나의 폴리머라제와 접촉된다. 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 상이한 폴리머라제가 사용될 수 있다. 폴리머라제는 핵산의 중합체를 합성하도록 하는 임의의 적합한 폴리머라제일 수 있다. 폴리머라제는 DNA 또는 RNA 폴리머라제일 수 있다. 임의의 상업적으로 이용 가능한 폴리머라제를 포함하여, 임의의 폴리머라제가 사용될 수 있다. 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 상이한 폴리머라제가 사용될 수 있으며, 예컨대 교정 기능을 제공하는 것과 그렇지 않은 것 중 하나 이상의 다른 것이 사용될 수 있다. 상이한 메커니즘을 갖는 폴리머라제가 사용될 수 있으며, 예컨대 가닥 치환형 폴리머라제 및 다른 방법에 의한 폴리머라제 복제 핵산이 사용될 수 있다. 가닥 치환 활성을 갖지 않는 DNA 폴리머라제의 적합한 예는 T4 DNA 폴리머라제이다.
폴리머라제는 공정 조건 하에서 장기간 배양해도 활성이 실질적으로 감소하지 않을 정도로 매우 안정적일 수 있다. 따라서, 효소는 바람직하게는 비제한적으로 온도 및 pH를 포함하여 다양한 공정 조건 하에 긴 반감기를 갖는다. 폴리머라제는 제조 공정에 적합한 하나 이상의 특성을 갖는 것이 또한 바람직하다. 폴리머라제는 바람직하게는 예컨대 교정 활성을 가짐으로써 높은 충실도를 갖는다. 또한, 폴리머라제는 뉴클레오티드 및 핵산에 대해 높은 진행성, 높은 가닥 치환 활성 및 낮은 km을 나타내는 것이 바람직하다. 폴리머라제는 주형으로서 환형 및/또는 선형 DNA를 사용할 수 있다. 폴리머라제는 주형으로서 이중 가닥 또는 단일 가닥 핵산을 사용할 수 있다. 폴리머라제는 교정 활성과 관련이 없는 엑소뉴클레아제 활성을 나타내지 않는 것이 바람직하다.
당업자는 주어진 폴리머라제가 위에서 정의된 바와 같은 특성을 나타내는지 여부를 상업적으로 이용 가능한 폴리머라제, 예컨대 Phi29(New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, US), Deep Vent®(New England Biolabs, Inc.), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus, Bst) DNA 폴리머라제 I(New England Biolabs, Inc.), DNA 폴리머라제 I의 클레노우 절편(New England Biolabs, Inc.), M-MuLV 역 트랜스크립타제(New England Biolabs, Inc.), VentR®(엑소-마이너스) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, Inc.), VentR® DNA 폴리머라제(New England Biolabs, Inc.), Deep Vent®(엑소-) DNA 폴리머라제(New England Biolabs, Inc.), Bst DNA 폴리머라제 큰 절편(New England Biolabs, Inc.), 고충실도 융합 DNA 폴리머라제(예컨대, Pyrococcus-Yke, New England Biolabs, MA), 파이로코커스 퓨리오서스(Pyrococcus furiosus) 유래 Pfu DNA 폴리머라제(Strategene, Lajolla, CA), Sequenase™ T7 DNA 폴리머라제 변이체, T7 DNA 폴리머라제, T4 DNA 폴리머라제, 파이로코커스 퓨리오서스 GB-D 유래 DNA 폴리머라제(New England Biolabs, MA), 또는 써모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) 유래 DNA 폴리머라제(New England Biolabs, MA)에 의해 나타나는 특성과 비교하여 결정할 수 있다.
대안적으로, 폴리머라제는 DNA-의존적 RNA 폴리머라제일 수 있다. 예시적인 효소는 T3 RNA 폴리머라제, T7 RNA 폴리머라제, Hi-T7™ RNA 폴리머라제, SP6 RNA 폴리머라제, E. coli Poly(A) 폴리머라제, E. coli RNA 폴리머라제, 및 E. coli RNA 폴리머라제, Holoenzyme(모두 NEB로부터 이용 가능함)를 포함한다.
높은 공정도가 언급되는 경우, 이는 전형적으로 주형과의 결합/해리당 폴리머라제 효소에 의해 첨가된 뉴클레오티드의 평균 수, 즉 단일 결합 사건에서 수득된 프라이머 확장 길이를 나타낸다.
단일 치환형 폴리머라제가 바람직하다. 바람직한 가닥 치환형 폴리머라제는 Phi 29, Deep Vent 및 Bst DNA 폴리머라제 I 또는 이들의 임의의 변이체이다. "가닥 치환"은 합성 동안 이중 가닥 DNA 영역을 만날 때 상보적 가닥을 치환하는 폴리머라제의 능력을 설명한다. 따라서 주형은 상보적 가닥을 대체하고 새로운 상보적 가닥을 합성함으로써 증폭된다. 따라서, 가닥 치환 복제 동안, 새로 복제된 가닥이 추가 상보적 가닥을 복제하기 위한 폴리머라제의 제조 방법으로 대체될 것이다. 증폭 반응은 프라이머 또는 단일 가닥 주형의 유리 말단이 주형의 상보적 서열에 어닐링될 때 개시된다(둘 모두 프라이밍 사건임). 핵산 합성이 진행되고 주형이 어닐링된 추가 프라이머 또는 다른 가닥을 만나면, 폴리머라제가 이를 대체하고 이의 가닥 신장을 계속한다. 가닥 치환 증폭 방법은 이중 가닥 주형이 새로운 가닥의 지속적인 합성에 장애가 되지 않기 때문에 변성 주기가 효율적인 증폭에 필수적이지 않다는 점에서 PCR-기반 방법과 다르다는 것을 이해해야 한다. 가닥 치환 증폭은 사용되는 경우 프라이머가 프라이머 결합 부위에 어닐링할 수 있도록 이중 가닥인 경우 초기 주형을 변성시키기 위해 한 번의 초기 가열만 필요할 수 있다. 그 다음에, 더 이상의 가열 또는 냉각이 필요하지 않기 때문에 증폭은 등온으로 설명될 수 있다. 대조적으로, PCR 방법은 이중 가닥 DNA를 녹이고 새로운 단일 가닥 주형을 제공하기 위해 증폭 과정 동안 변성 주기(즉, 온도를 섭씨 94도 이상으로 상승시키는 단계)를 필요로 한다. 가닥 치환 동안, 폴리머라제는 이미 합성된 핵산 가닥을 치환할 것이다.
본 발명의 방법에서 사용된 가닥 치환 폴리머라제는 바람직하게는 적어도 20 kb, 보다 바람직하게는, 적어도 30 kb, 적어도 50 kb, 또는 적어도 70 kb 초과의 공정도를 갖는다. 일 실시형태에서, 가닥 치환 DNA 폴리머라제는 phi29 DNA 폴리머라제와 유사하거나 더 큰 공정도를 갖는다.
주형과 폴리머라제 및 니카제 또는 프라이머와의 접촉은 주형에 대한 프라이머의 어닐링을 촉진하는 조건 하에서 일어날 수 있다. 조건은 프라이머의 혼성화를 가능케 하는 단일-가닥 DNA의 존재를 포함한다. 조건은 또한 주형에 대한 프라이머의 어닐링을 가능케 하는 온도 및 완충제를 포함한다. 적절한 어닐링/혼성화 조건은 프라이머의 특성에 따라 선택될 수 있다. 본 발명에서 사용된 바람직한 어닐링 조건의 예는 완충제 30 mM Tris-HCl pH 7.5, 20 mM KCl, 8 mM MgCl2를 포함한다. 어닐링은 원하는 반응 온도까지 점진적으로 냉각하여 열을 사용하여 변성시킨 후 수행할 수 있다.
주형 및 폴리머라제는 또한 뉴클레오티드와 접촉한다. 주형, 폴리머라제 및 뉴클레오티드의 조합은 반응 혼합물을 형성한다. 반응 혼합물은 또한 하나 이상의 프라이머 또는 대안적으로 닉킹 효소(니카제)를 포함한다. 반응 혼합물은 또한 독립적으로 하나 이상의 금속 양이온 또는 핵산 합성에 요구되는 임의의 다른 보조-효소를 포함할 수 있다.
뉴클레오티드는 핵산의 모노머, 또는 단일 단위이며, 뉴클레오티드는 질소 염기, 5탄당(리보스 또는 디옥시리보스), 및 적어도 하나의 포스페이트기로 구성된다. 임의의 적합한 뉴클레오티드가 사용될 수 있다.
뉴클레오티드는 유리산, 이들의 염 또는 킬레이트, 또는 유리산 및/또는 염 또는 킬레이트의 혼합물로서 존재할 수 있다.
뉴클레오티드는 1가 금속 이온 뉴클레오티드 염 또는 2가 금속 이온 뉴클레오티드 염으로서 존재할 수 있다.
질소 염기는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 및/또는 우라실(U)일 수 있다. 질소 염기는 또한 변형된 염기, 예컨대 5-메틸시토신(m5C), 슈도우리딘(Ψ), 디히드로우리딘(D), 이노신(I), 및/또는 7-메틸구아노신(m7G)일 수 있다.
5탄당이 디옥시리보스여서 뉴클레오티드가 디옥시뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
뉴클레오티드는 dNTP로 표시되는 디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트의 형태일 수 있다. 이는 본 발명의 바람직한 실시형태이다. 적합한 dNTP는 dATP(디옥시아데노신 트리포스페이트), dGTP(디옥시구아노신 트리포스페이트), dTTP(디옥시티미딘 트리포스페이트), dUTP(디옥시우리딘 트리포스페이트), dCTP(디옥시시티딘 트리포스페이트), dITP(디옥시이노신 트리포스페이트), dXTP(디옥시잔토신 트리포스페이트), 및 이들의 유도체 및 변형된 버전을 포함할 수 있다. dNTP가 dATP, dGTP, dTTP or dCTP, 또는 이들의 변형된 버전 또는 유도체 중 하나 이상을 포함하는 것이 바람직하다. dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP 또는 이들의 변형된 버전의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다.
뉴클레오티드는 용액 중에 있거나 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 뉴클레오티드 용액이 바람직하다.
뉴클레오티드는 임의의 새로 설계된 인공 염기, 바람직하게는 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C) 중 하나 이상을 포함하여, 하나 이상의 적합한 염기의 혼합물로 제공될 수 있다. 2, 3, 또는 바람직하게는 4개 모두의 뉴클레오티드(A, G, T 및 C)가 핵산 합성 공정에 사용된다.
연쇄체
생산된 단일 가닥 연쇄체는 또한 새로운 것이며, 관심 서열을 함유할 수 있는 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산으로 처리될 수 있다.
연쇄체는 주형에 존재하는 서열 단위의 반복 단위를 갖는 핵산 분자이다. 각각의 서열 단위는 이전에 기술된 바와 같이, 포맷팅 요소에 의해 양 측면에 플랭킹된 관심 서열을 포함한다. 서열 단위는 또한 주형에 의해 코딩된 백본 서열을 포함할 수 있으며, 이는 궁극적으로 본 발명의 핵산 구조물에 존재하지 않는다.
연쇄체 핵산 분자는 다중 서열 단위, 예컨대 연속 시리즈의 10, 50, 100, 200, 500 또는 심지어는 1000개 이상의 서열 단위를 포함할 수 있다. 연쇄체 분자는 크기가 적어도 5 kb, 적어도 50 kb, 적어도 100 kB, 또는 심지어는 길이가 최대 200 kB일 수 있다.
연쇄체 핵산 분자 처리
주형이 증폭되면, 또는 증폭 동안에도, 연쇄체 핵산은 하나 이상의 처리 부위를 절단할 필수 엔도뉴클레아제를 사용하여 단일 가닥 핵산 구조물로 처리될 수 있다.
따라서, 처리 모티프는 연쇄체 핵산의 형태인 동안 염기쌍 부분을 형성할 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 등온 증폭에 적합한 조건 하에 염기쌍이 형성되도록 처리 모티프가 설계될 수 있다. 이러한 염기쌍 부분이 연쇄체 핵산 내에서 형성되면, 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위가 필요한 절단 부위와 함께 형성된다. 이러한 우아한 시스템은 이것이 핵산의 오직 단일 가닥이라는 사실에도 불구하고 연쇄체의 처리를 가능케 한다. 이는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 첨가하여 이러한 연쇄체를 처리하는 단일 단계를 가능케 하는, 연쇄체 핵산 내의 처리 부위의 형성을 가능케 하는 주형의 설계이다.
엔도뉴클레아제는 증폭 반응이 진행 중이거나 시작될 때, 증폭 반응이 완료되면 첨가될 수 있다. 연쇄체 핵산이 신속하게 처리되도록 하기 위해 엔도뉴클레아제가 첨가되기 전에 증폭 반응이 진행되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 증폭 공정은 엔도뉴클레아제의 첨가 전에 완료되도록 할 수 있다(즉, 주형 소진, 뉴클레오티드 소진, 반응 혼합물이 너무 점성).
엔도뉴클레아제로 절단되면, 연쇄체는 입체형태 모티프의 작용 덕분에 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 구조물로 절단된다. 또한 처리 모티프와 임의의 관련 주형 백본으로 구성된 부산물도 생산된다. 부산물의 말단은 격리되지 않기 때문에, 단일 가닥 엑소뉴클레아제를 사용하여 제거될 수 있다.
본 발명은 이제 하기 비-제한적인 실시예를 참조하여 설명될 것이다.
실시예
실시예 1: 핵산 구조물의 생산:
주형: 주형 A(도 9, 서열번호 1).
주형은 닉킹 부위, 입체형태 모티프에 인접한 처리 모티프, 관심 서열, 제2 처리 모티프에 인접한 제2 입체형태 모티프, 및 관심 서열과 유사한 크기의 백본을 포함한다. 백본에는 dsDNA에서만 절단되는 추가 엔도뉴클레아제 표적 부위가 존재한다.
주형 A의 서열은 관련 서열 목록에서 서열번호 1로 제시된다.
20 μl의 닉킹 반응
ㆍ 4 μl 주형(1 μg/μl의 저장 농도)
ㆍ 13 μl 물
ㆍ 2 μl CutSmart 완충액(NEB)
ㆍ 1 μl 니카제(Nb.BsrDI, NEB)
→ 37℃에서 180분 동안 인큐베이션 후, 80℃에서 20분 동안 인큐베이션
1000 μl의 증폭 반응
ㆍ 4 μl 주형(저장 농도 0.2 μg/μl)
ㆍ 100 μl 완충액 - 10x 저장 용액:
- 300 mM Tris pH 7.9
- 300 mM KCl
- 50 mM (NH4)2SO4
- 100 mM MgCl2
ㆍ 837 μl ddH2O
ㆍ 20 μl dNTPs(저장 용액 100 mM(Bioline))
ㆍ 35 μl SSB (저장 용액 5 μg/μl(E. coli SSB, 자체 제조))
ㆍ 2 μl 무기 피로포스파타제(저장 용액 2 U/μl(Enzymatics))
ㆍ 2 μl phi29 DNA 폴리머라제(저장 용액 100 U/μl(Enzymatics))
→ 30℃에서 16시간 동안 인큐베이션
처리 반응
ㆍ 1000 μl 증폭 반응
ㆍ 20 μl MlyI(저장 용액 10 U/μl)
→ 37℃에서 180분 동안 인큐베이션
결과:
겔 사진이 도 10에 도시되어 있다.
이러한 겔은 RCA 반응의 소화된 생성물을 나타낸다. 왼손 웰: Thermo Scientific Gene Ruler 1 kb Plus DNA 래더(왼쪽의 bp 크기). 오른손 웰: MlyI 처리된 RCA(오른쪽의 nt(뉴클레오티드)의 예상되는 크기). 유사한 크기의 백본 및 생성물 밴드는 주로 단일-가닥 특성으로 인해 밝게 염색되지 않는다. 생성물의 이중-가닥을 나타내는 "고유(signature)" 하부 밴드가 보이지 않았다(MlyI 부위가 백본에 존재하고, dsDNA를 절단하여 백본 밴드를 1597 및 407 염기쌍으로 축소시킴).
실시예 2: 엑소뉴클레아제를 사용한 핵산 구조물의 말단 뉴클레오티드의 안정성 시험
본 실시예는 격리된 말단을 갖는 신규한 핵산 구조물이 말단이 정의된 구조를 형성하지 않는 핵산(표준 단일-가닥 DNA)과 비교하여 유의한 엑소뉴클레아제 저항성을 제공하는지 여부를 시험한다.
엑소뉴클레아제 안정성 시험:
본 시험을 위해 상이한 입체형태 모티프를 갖는 5가지 생성물 분자를 생성하였다:
i. 입체형태 모티프가 없는 ssDNA(따라서 고정되지 않은 말단 뉴클레오티드)
ii. 염기쌍 이중나선의 스트레치의 3' 및 5' 말단 둘 모두에서 말단 뉴크레오티드를 고정하는 트리뉴클레오티드 루프(GAA) 입체형태 모티프를 갖는 ssDNA;
iii. 관심 서열에 대한 분자내 염기쌍의 섹션을 형성하고 이중나선 핵산의 섹션 내에 말단 뉴클레오티드를 포함하는 추가 서열과 함께G-사중나선 입체형태 모티프(TTAGGG)4 (서열번호를 갖는 ssDNA;
iv. 3' 및 5' 말단 둘 모두에 염기쌍이 없으므로 각 말단 뉴클레오티드를 사중나선(TTAGGG)4 내에 수용하여 고정하는데 의존하는 G-사중나선 입체형태 모티프를 갖는 ssDNA;
v. 3' 및 5' 말단 둘 모두에 염기쌍이 없으므로 각 말단 뉴클레오티드를 유사매듭 내에 포함시킴으로써 고정하는데 의존하는 유사-매듭 입체형태 모티프를 갖는 ssDNA.
핵산 분자를 100 mM KCl에서 100 ng/μl로 희석하고, 입체형태 모티프가 적절한 입체형태를 형성할 수 있도록 열 변성(95℃, 실온으로 냉각)시켰다. 10 μl의 각 구조물을 1x 엑소뉴클레아제 VII 반응 완충액(NEB; 50 mM Tris-HCl, 50 mM 소듐 포스페이트, 8 mM EDTA, 10 mM 2-머캅토에탄올, pH 8.0)에서 50 μl 최종 부피로 후속 엑소뉴클레아제 시험에 사용하였다. 반응물을 100 U/ml의 엑소뉴클레아제 VII(NEB)의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 생성물을 GelRed 염료가 포함된 아가로스 겔에서 분해하였다(도 6).
Figure pct00001
Figure pct00002
결과:
3' 및 5' 말단을 고정하는 입체형태 모티프가 없는 ssDNA는 실험의 짧은 범위 내에서 엑소뉴클레아제 VII의 존재 하에 거의 완전히 소화되었다(도 6, 레인 1 내지 2).
3' 및 5' 말단 뉴클레오티드(위의 (ii) 내지 (v)에 설명된 바와 같음), 즉 격리된 말단을 가진 단일 가닥 핵산 구조물을 고정하기 위한 형태적 모티프를 포함하는 모든 ssDNA는 ssDNA보다 엑소뉴클레아제 소화에 더 저항성이 있었다.
(ii)(레인 3 내지 4)로 설명된 구조물은 염기쌍 이중나선 스트레치의 서열 내에 포함하여 말단을 격리시켰다. 이는 엑소뉴클레아제에 대한 저항성을 보여주었다.
G-사중나선 입체형태 모티프를 사용하여 두 가지 상이한 핵산 구조물을 제조하였다. (iv)(레인 7 내지 8)에 설명된 구조물은 이를 G-사중나선 내에 수용하여 말단을 격리시켰다. (iii)(레인 5 내지 6)에 설명된 구조물은 말단 뉴클레오티드가 염기쌍에 관여하는 이중나선 핵산의 추가 섹션을 포함한다. 본 실험에서, 여분의 이중나선 서열의 추가는 엑소뉴클레아제에 대한 저항성을 돕는 것으로 나타났다. 이는 격리된 말단의 원하는 특성에 기초하여, 핵산 구조물이 사용될 수 있는 특정 조건에 적합하도록 입체형태를 조작할 수 있음을 입증한다.
(v)(레인 9 내지 10)로 설명된 구조물은 유사매듭 내에 포함하여 말단을 격리시켰다. 이는 시험된 조건 하에서 엑소뉴클레아제에 대한 중간 정도의 저항성을 나타내는 것으로 나타났다.
이러한 데이터는 말단을 격리하는 것을 엑소뉴클레아제에 의한 분해를 지연시키고 입체형태 모티프의 서열을 변화시키는데 사용될 수 있으며, 핵산 구조물의 안정성을 증가시키도록 구조물의 구조를 조작할 수 있음을 보여준다.
실시예 3: 세포 추출물의 존재 하에 핵산 구조물의 말단 뉴클레오티드의 안정성 시험
본 실험은 격리된 말단을 갖는 신규한 핵산 구조물이 말단이 정의된 입체형태를 형성하지 않는 핵산(이러한 실시예에서 표준 단일-가닥 DNA)과 비교하여 세포 추출물의 존재 하에 유의한 저항성을 제공하는지 여부를 시험하기 위해 설계하였다.
세포 추출물 제조:
HEK293T 세포(Clontech Z2180N)를 Eagle의 최소 필수 배지(10% FBS, 글루타민, 비-필수 아미노산 및 항생제 보충)에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시켰다. 완전한 컨플루언시(full confluency)를 갖는 3개의 10 cm 플레이트를 PBS로 세척하였다. 세포를 수확하고 10 ml의 1x 세포용해 완충액(Promega E397A)을 사용하여 용해시켰다. 현탁액 1 ml당 대략 2,000,000개의 세포를 수득하였다. 실온에서 5분 인큐베이션 후, 현탁액을 원심분리(5분 동안 4000rpm)하여 제거하였다. 글리세롤을 20%로 첨가하고 세포 추출물을 분취하고 -80℃에서 동결시켰다.
세포 추출물 안정성 시험:
모든 5개의 핵산 구조물(실시예 2에서 제조된 바와 같음)을 100 mM KCl에서 100 ng/μl로 희석하고, 입체형태 모티프가 적절한 입체형태를 형성할 수 있도록 열 변성(95℃, 및 실온으로 냉각)시켰다. 희석액을 2 mM MgCl2 및 10 mM Tris pH 7.5, 및 5%의 해동된 세포 추출물로 보충하였다. 샘플을 24시간 또는 72시간 동안 인큐베이션하고, 생성물을 GelRed 염료가 포함된 아가로스 겔 상에서 분해하였다(도 7).
Figure pct00003
Figure pct00004
결과:
3' 및 5' 말단을 격리시키기 위한 입체형태 모티프가 결여된 ssDNA는 5% 세포 추출물의 존재 하에 거의 완료될 때까지 점진적으로 소화되었고(레인 1, 6 및 11), 배양 72시간 후에 적은 양이 검출될 수 있었다.
격리된 말단을 갖는 다른 모든 핵산 구조물은 추출물의 존재 하에 훨씬 더 큰 안정성을 제공하였다.
시험한 조건 하에서, 염기쌍에 의해 형성된 이중나선 핵산의 섹션 또는 스트레치 내에 포함하여 3' 및 5' 말단 끝을 격리하는 것이 분해에 대한 가장 큰 저항성을 제공하는 것으로 나타났다. 레인 2, 7, 12 및 레인 3, 8, 13의 구조물 (ii) 및 (iii)에 대한 결과는 각각 가장 큰 안정성을 보여주었다.
그러나, 나머지 구조물은 어느 정도 저항성을 나타내어 염기쌍에 직접 관여하지 않고도 말단 잔기를 고정시킬 수 있음을 보여주었다. (iv)로 표시된 G-사중나선 버전은 상대적으로 강한 안정성을 나타냈으며(레인 4, 9, 14), 입체형태 모티프가 유사매듭 구조(v)(레인 5, 10, 15)를 가정하는 분자의 분해에 대한 저항성 수준은 격리된-말단 구조물 중 가장 낮았다.
특정 밴드가 세포 추출물에서 인공물로 나타날 가능성을 제거하기 위해, DNA가 추가되지 않은 5% 추출물을 포함하는 대조군을 72시간 동안 배양하였다(레인 16).
SEQUENCE LISTING <110> Lightbio Limited <120> Nucleic acid constructs and methods for their manufacture <130> WO/2020/217057 <140> PCT/GB2020/051003 <141> 2020-04-23 <150> GB1905651.4 <151> 2019-04-23 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3754 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Template A <400> 1 gtggtcacga gggtgggcca gggcacgggc agcttgccgg tggtgcagat gaacttcagg 60 gtcagcttgc cgtaggtggc atcgccctcg ccctcgccgg acacgctgaa cttgtggccg 120 tttacgtcgc cgtccagctc gaccaggatg ggcaccaccc cggtgaacag ctcctcgccc 180 ttgctcacca tggtggcaag cttctgacgg ttcactaaac cagctctgct tatatagacc 240 tcccaccgta cacgcctacc gcccatttgc gtcaatgggg cggagttgtt acgacatttt 300 ggaaagtccc gttgattttg gtgccaaaac aaactcccat tgacgtcaat ggggtggaga 360 cttggaaatc cccgtcagtc aaaccgctat ccacgcccat tgatgtactg ccaaaaccgc 420 atcaccatgg taatagcgat gactaatacg tagatgtact gccaagtagg aaagtcccat 480 aaggtcatgt actgggcata atgccaggcg ggccatttac cgtcattgac gtcaataggg 540 ggcgtacttg gcatatgata cacttgatgt actgccaagt gggcagttta ccgtaaatac 600 tccacccatt gacgtcaatg gaaagtccct attggcgtta ctatgggaac atacgtcatt 660 attgacgtca atgggcgggg gtcgttgggc ggtcagccag gcgggccatt taccgtaagt 720 tatgtaacgc ggaactccat atatgggcta tgaactaatg accccgtaat tgattactac 780 ttaagtgtac atatcagcac acaatagtcc attatacgcg cgtataatgg gcaattgtgt 840 gctgatatgt acaggtcaga ctctgcgatc gcagagtctg acccgctgag gagatctaca 900 tgttctagag gatccgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 960 tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacaagca tcacaaaaat cgacgctcaa 1020 gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 1080 ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 1140 cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 1200 tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 1260 tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 1320 cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 1380 agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 1440 agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 1500 gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 1560 aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 1620 ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 1680 gaagttttag cactctagag gatccgtgct attattgaag catttatcag ggttattgtc 1740 tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 1800 catttccccg aaaagtgcca cctgtatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 1860 aaaataccgc atcaggaaat tgtaagcgtt aataattcta gaggatcctc agaagaactc 1920 gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac 1980 gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc 2040 tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg 2100 gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc 2160 gccgtcgggc atgctcgcct tgagcctggc gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg 2220 ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc 2280 gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatccagcg tatgcagccg 2340 ccgcatagca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag 2400 atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc 2460 gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc 2520 ttgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg 2580 cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata 2640 gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat 2700 catgcgaaat ctagaggatc ctcatcctgt ctcttgatca gagcttgatc ccctgcgcca 2760 tcagatcctt ggcggcaaga aagccatcca gtttactttg cagggcttcc caaccttacc 2820 agagggcgcc ccagctggca attccggttc gcttgctgtc cataaaaccg cccagtaatt 2880 tcattgcggt cagactctgc gatcgcagag tctgaccact agttatcagc acacaatagt 2940 ccattatacg cgcgtataat gggcaattgt gtgctgataa ctagtagatc tgctagctac 3000 cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa 3060 acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3120 ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 3180 tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg aattcttact tgtacagctc 3240 gtccatgccg agagtgatcc cggcggcggt cacgaactcc agcaggacca tgtgatcgcg 3300 cttctcgttg gggtctttgc tcagggcgga ctgggtgctc aggtagtggt tgtcgggcag 3360 cagcacgggg ccgtcgccga tgggggtgtt ctgctggtag tggtcggcga gctgcacgct 3420 gccgtcctcg atgttgtggc ggatcttgaa gttcaccttg atgccgttct tctgcttgtc 3480 ggccatgata tagacgttgt ggctgttgta gttgtactcc agcttgtgcc ccaggatgtt 3540 gccgtcctcc ttgaagtcga tgcccttcag ctcgatgcgg ttcaccaggg tgtcgccctc 3600 gaacttcacc tcggcgcggg tcttgtagtt gccgtcgtcc ttgaagaaga tggtgcgctc 3660 ctggacgtag ccttcgggca tggcggactt gaagaagtcg tgctgcttca tgtggtcggg 3720 gtagcggctg aagcactgca cgccgtaggt cagg 3754 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 2 aggaacccct agtgatggag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> adeno-associated virus 1 <400> 3 gattacccct agtgatggag 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> adeno-associated virus 3 <400> 4 ccatacctct agtgatggag 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> adeno-associated virus 4 <400> 5 gcaaacctag atgatggag 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> adeno-associated virus 5 <400> 6 cttgcttgag agtgtggag 19 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Common binding motif <400> 7 Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Arg Gly Arg Gly 20 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RG rich domain <400> 8 Arg Arg Gly Asp Gly Arg Arg Arg Gly Gly Gly Gly Arg Gly Gln Gly 1 5 10 15 Gly Arg Gly Arg Gly Gly Gly Phe Lys Gly 20 25 <210> 9 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Figure 2 formatting element <400> 9 cctcagcggg tcagactctg cgatcgcaga gtctgacctg tacatatcag cacacaatag 60 tccattatac gcgcgtataa tggactattg tgtgctgata tgtacactta agta 114 <210> 10 <211> 147 <212> DNA <213> adeno-associated virus 2 <400> 10 aaccggtgag ggagagacgc gcggagcgag cgagtgactc cggcccgctg gtttccagcg 60 ggctgcgggc ccgaaacggg cccgccggag tcactcgctc gctcggcgcg tctctccctc 120 accggttgag gtagtgatcc ccaagga 147 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Quadruplex motif - various organisms <400> 11 ttagggttag ggttagggtt aggg 24

Claims (15)

  1. 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 구조물의 무세포, 시험관 내 제조를 위한 핵산 주형으로서,
    5'에서 3'으로, 다음의 요소들:
    i) 다음에 인접한, 제1 처리 모티프
    ii) 제1 입체형태 모티프,
    iii) 관심 서열,
    iv) 다음에 인접한, 제2 입체형태 모티프
    v) 제2 처리 모티프
    를 코딩하는 서열을 포함하되
    상기 처리 모티프는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함하며, 상기 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함하는, 핵산 주형.
  2. 제1항에 있어서, 처리 모티프 내의 절단 부위가 입체형태 모티프에 인접한, 핵산 주형.
  3. 제1항 및 제2항 중 어느 한 항에 있어서, 처리 모티프 내의 엔도뉴클레아제에 대한 절단 부위가 염기쌍 섹션의 말단 염기쌍에 있는, 핵산 주형.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 모티프가 단일 가닥 핵산 구조물의 말단에서 말단 뉴클레오티드를 고정시키는 작용을 하는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 서열을 포함하는, 핵산 주형.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 가닥 핵산 구조물이,
    i) 압타머;
    ii) 핵산 효소;
    iii) 유전자 편집을 위한 가이드 서열
    중 어느 하나 이상을 포함하는, 핵산 주형
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자내 수소 결합은 입체형태 모티프의 서열에서 뉴클레오티드 염기 사이에 형성되고, 선택적으로 입체형태 모티프가 입체형태를 가정하도록 허용하는, 핵산 주형.
  7. 제6항에 있어서, 뉴클레오티드 염기 사이의 분자내 수소 결합이 왓슨-크릭 염기쌍, 후그스틴 염기쌍 또는 비-정규 염기쌍을 포함하는, 핵산 주형.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 입체형태 모티프가, 다음의 입체형태:
    i) 사중나선;
    ii) 헤어핀;
    iii) 십자형;
    iv) 스템 루프; 및/또는
    v) 유사매듭
    중 하나 또는 둘 이상의 조합을 가정할 수 있는 서열일 수 있는, 핵산 주형.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 격리된 말단이 말단 뉴클레오티드의 분자내 염기쌍을 포함하는, 핵산 주형.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 격리된 말단이 이중 가닥 D 영역을 갖는 ITR 구조에 말단 뉴클레오티드를 포함하는 것을 포함하는, 핵산 주형.
  11. 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 분자의 제조 방법으로서,
    (a) 회전 환 증폭이 가능한 폴리머라제를 사용하여 환형 주형을 증폭하는 단계로서, 상기 주형은 다음의 요소들:
    i) 다음에 인접한, 제1 처리 모티프
    ii) 제1 입체형태 모티프,
    iii) 관심 서열,
    iv) 다음에 인접한, 제2 입체형태 모티프
    v) 제2 처리 모티프,
    를 코딩하는 서열을 포함하되,
    상기 처리 모티프는 절단 부위를 포함하는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함하고, 상기 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함하고, 상기 증폭은 핵산 연쇄체를 생성하는, 상기 증폭하는 단계, 및
    (b) 하나 이상의 상기 처리 모티프에서 절단 부위를 인식하는 하나 이상의 엔도뉴클레아제를 사용하여 상기 핵산 연쇄체를 처리하는 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  12. 제11항에 있어서, 주형이 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기술된 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 핵산 분자의 제조 방법.
  13. 서열 단위의 2개 이상의 반복을 갖는 단일 가닥 핵산 연쇄체로서,
    상기 서열 단위는, 다음의 요소들:
    i) 다음에 인접한, 제1 처리 모티프
    ii) 제1 입체형태 모티프,
    iii) 관심 서열,
    iv) 다음에 인접한, 제2 입체형태 모티프
    v) 제2 처리 모티프
    를 포함하되, 상기 처리 모티프는 엔도뉴클레아제에 대한 인식 부위 및 관련 절단 부위를 포함하는 염기쌍 섹션을 형성할 수 있는 서열을 포함하고, 입체형태 모티프는 분자내 수소 결합을 형성할 수 있는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 단일 가닥 핵산 연쇄체.
  14. 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 선형 핵산 분자로서,
    적어도 하나의 격리된 말단이 G 사중나선을 형성하는, 단일 가닥 선형 핵산 분자.
  15. 격리된 말단을 갖는 단일 가닥 선형 핵산 분자로서,
    적어도 하나의 격리된 말단이 이중 가닥 D 섹션을 갖는 ITR 구조를 형성하는, 단일 가닥 선형 핵산 분자.
KR1020217038099A 2019-04-23 2020-04-23 핵산 구조물 및 이의 제조 방법 KR20220003571A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB1905651.4 2019-04-23
GBGB1905651.4A GB201905651D0 (en) 2019-04-24 2019-04-24 Nucleic acid constructs and methods for their manufacture
PCT/GB2020/051003 WO2020217057A1 (en) 2019-04-23 2020-04-23 Nucleic acid constructs and methods for their manufacture

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220003571A true KR20220003571A (ko) 2022-01-10

Family

ID=66641152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217038099A KR20220003571A (ko) 2019-04-23 2020-04-23 핵산 구조물 및 이의 제조 방법

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20220195415A1 (ko)
EP (1) EP3959336A1 (ko)
JP (1) JP2022530432A (ko)
KR (1) KR20220003571A (ko)
CN (1) CN113874504A (ko)
AU (1) AU2020262371A1 (ko)
BR (1) BR112021021333A2 (ko)
CA (1) CA3137840A1 (ko)
GB (1) GB201905651D0 (ko)
IL (1) IL287468A (ko)
MX (1) MX2021013011A (ko)
SG (1) SG11202111649PA (ko)
WO (1) WO2020217057A1 (ko)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9982279B1 (en) 2017-06-23 2018-05-29 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided nucleases
RS63202B1 (sr) 2017-06-30 2022-06-30 Inscripta Inc Automatizovani postupci, moduli, instrumenti i sistemi za obradu ćelija
US10557216B2 (en) 2018-04-24 2020-02-11 Inscripta, Inc. Automated instrumentation for production of T-cell receptor peptide libraries
US10858761B2 (en) 2018-04-24 2020-12-08 Inscripta, Inc. Nucleic acid-guided editing of exogenous polynucleotides in heterologous cells
US11001831B2 (en) 2019-03-25 2021-05-11 Inscripta, Inc. Simultaneous multiplex genome editing in yeast
CN113939593A (zh) 2019-06-06 2022-01-14 因思科瑞普特公司 用于递归的核酸指导的细胞编辑的处治
WO2021102059A1 (en) 2019-11-19 2021-05-27 Inscripta, Inc. Methods for increasing observed editing in bacteria
CA3157127A1 (en) 2019-12-18 2021-06-24 Aamir MIR Cascade/dcas3 complementation assays for in vivo detection of nucleic acid-guided nuclease edited cells
US20210332388A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Inscripta, Inc. Compositions, methods, modules and instruments for automated nucleic acid-guided nuclease editing in mammalian cells
US11299731B1 (en) 2020-09-15 2022-04-12 Inscripta, Inc. CRISPR editing to embed nucleic acid landing pads into genomes of live cells
GB202014751D0 (en) * 2020-09-18 2020-11-04 Lightbio Ltd Targeting vector
WO2022125329A1 (en) * 2020-12-07 2022-06-16 Inscripta, Inc. gRNA STABILIZATION IN NUCLEIC ACID-GUIDED NICKASE EDITING
CA3204158A1 (en) 2021-01-04 2022-07-07 Juhan Kim Mad nucleases
US11884924B2 (en) 2021-02-16 2024-01-30 Inscripta, Inc. Dual strand nucleic acid-guided nickase editing

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5624803A (en) * 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
US20050118616A1 (en) * 2002-08-16 2005-06-02 Kawashima Tadashi R. Amplification of target nucleotide sequence without polymerase chain reaction
US20050153333A1 (en) * 2003-12-02 2005-07-14 Sooknanan Roy R. Selective terminal tagging of nucleic acids
EP1871897B1 (en) * 2005-04-12 2010-09-29 Olink AB Methods for production of oligonucleotides
GB201321123D0 (en) * 2013-11-29 2014-01-15 Linea Ab Q Amplification of circular molecules
WO2015089351A1 (en) * 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Compositions and methods of use of crispr-cas systems in nucleotide repeat disorders
AU2015280120B2 (en) * 2014-06-23 2017-05-25 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nuclease-mediated DNA assembly
GB201413718D0 (en) * 2014-08-01 2014-09-17 Olink Ab Method for selecting a target nucleic acid sequence
WO2016126987A1 (en) * 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Compositions and methods for synthetic gene assembly
WO2017188898A1 (en) * 2016-04-29 2017-11-02 Nanyang Technological University G-quadruplex-containing antisense oligonucleotides
WO2018033730A1 (en) 2016-08-16 2018-02-22 Touchlight IP Limited Closed linear dna production
EP3678710A4 (en) * 2017-09-08 2021-06-09 Generation Bio Co. MODIFIED CLOSED-END DNA (CEDNA)
CN111770994A (zh) * 2017-10-02 2020-10-13 基因编辑有限公司 修饰的cpf1引导rna
SG11202005271TA (en) 2018-01-19 2020-07-29 Generation Bio Co Closed-ended dna vectors obtainable from cell-free synthesis and process for obtaining cedna vectors

Also Published As

Publication number Publication date
JP2022530432A (ja) 2022-06-29
IL287468A (en) 2021-12-01
CN113874504A (zh) 2021-12-31
MX2021013011A (es) 2022-01-24
US20220195415A1 (en) 2022-06-23
CA3137840A1 (en) 2020-10-29
WO2020217057A1 (en) 2020-10-29
AU2020262371A1 (en) 2021-11-18
GB201905651D0 (en) 2019-06-05
BR112021021333A2 (pt) 2022-01-18
SG11202111649PA (en) 2021-11-29
EP3959336A1 (en) 2022-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20220003571A (ko) 핵산 구조물 및 이의 제조 방법
EP3475295B1 (en) Novel nucleoside triphosphate transporter and uses thereof
AU2016253150B2 (en) Evaluation of Cas9 molecule/guide RNA molecule complexes
JP6165789B2 (ja) 核酸分子のインビトロでの連結および組み合わせアセンブリのための方法
CN104520429B (zh) 通过Cas9-crRNA复合物的RNA指导的DNA裂解
EP3443088A1 (en) Grna fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
WO2019051097A1 (en) RNA-GUIDED ENDONUCLEASE FUSION POLYPEPTIDES AND METHODS OF USING SAME
AU2016244033A1 (en) CRISPR/CAS-related methods and compositions for treating Duchenne Muscular Dystrophy and Becker Muscular Dystrophy
CN110709514B (zh) 使用具有串联重复序列的供体dna修复模板的位点特异性dna修饰
CN110446783A (zh) 环状dna的复制或扩增方法
JP2023542347A (ja) 自己標的化発現ベクター
EP4227412A1 (en) Engineered guide rna for increasing efficiency of crispr/cas12f1 (cas14a1) system, and use thereof
US7022501B1 (en) Ligation of double-stranded DNAs
WO2019014359A2 (en) POLYMERASE CHAIN TRANSCRIPTION (PCT): EXPONENTIAL SYNTHESIS OF RNA AND MODIFIED RNA
JP7125727B1 (ja) 核酸配列改変用組成物および核酸配列の標的部位を改変する方法
US20220333129A1 (en) A nucleic acid delivery vector comprising a circular single stranded polynucleotide
WO2023107899A2 (en) A method of capturing crispr endonuclease cleavage products
JP2023543602A (ja) 標的化された配列付加
WO2023148646A1 (en) Mirror-image selection of l-nucleic acid aptamers
WO2023203082A2 (en) Method for producing double stranded dna
Hipolito Improving DNAzyme catalysis through synthetically modified DNAzymes and probing DNA polymerase function to improve selection methodology
CA2485218A1 (en) Method for creating polynucleotide molecules
Meyer Contributions to the study of the architecture and evolution of ribozymes

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination