KR20210154697A

KR20210154697A - 벤즈이미다졸 유도체 화합물을 포함하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20210154697A
Application number: KR1020200143889A
Authority: KR
Inventors: 천재희; 김승원; 손미정; 박이슬; 김동규; 김봉태; 김은지; 한재용
Original assignee: 에이치케이이노엔 주식회사
Priority date: 2020-06-12
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2021-12-21
Also published as: KR102619183B1; CA3182245A1; WO2021251565A1; BR112022025169A2; AU2020452385A1; MX2022015770A; US20230248703A1; JP2023530418A

Abstract

본 발명은 벤즈이미다졸 유도체 화합물로서 테고프라잔을 유효성분으로 하는, 대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.

Description

벤즈이미다졸 유도체 화합물을 포함하는 약학적 조성물 {Pharmaceutical Composition comprising benzimidazole derivative compound}

본 발명은 벤즈이미다졸 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 테고프라잔, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이들의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 새로운 용도의 약학적 조성물에 관한 것이다.

대장염은 대장에 염증이 발생하는 질환으로, 원인에 따라 크게 감염성 대장염과 비감염성 대장염으로 구분될 수도 있고, 발병 기간에 따라 급성 대장염과 만성 대장염으로 구분될 수도 있다. 대장염은 염증성 장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 뿐만 아니라 과민성 대장염 증후군(irritable bowel syndrome, IBS)등을 포함한다.

염증성 장 질환은 조절 이상 변역 반응, 유전적 감수성(genetic susceptibility) 또는 환경적 요인 등에 의해 유발되는 만성 염증성 질환이다. 염증성 장 질환은 임상적으로 유사하면서 조직학적 소견과 내시경 및 면역학적 측면에서 서로 다른 궤양성 대장염 및 크론병으로 분류된다. 발병원인은 장내 항원에 대한 비정상적인 면역반응을 원인 중 하나로 추정하고 있으나 복잡한 복수의 다인자성 질환으로 아직까지 명확한 원인이 밝혀지지 않아 치료가 어렵고 효과적인 치료약이 없는 대표적 난치성 질환이다.

염증성 장 질환 환자의 대장 점막 및 혈청에서의 IL-1β, TNF-α 등의 전염증성 사이토카인이 증가되고, 이 점막의 염증반응을 지속시키고 증폭시키는데 중요한 역할을 한다고 보고하고 있으며 이들의 생성 및 활성화에 관여하는 인자에 대한 연구는 염증성 장 질환의 병태 생리 및 치료에 중요한 역할을 한다.

현재까지 염증성 장 질환에 대한 치료법으로서는 설파살라진, 코르티코스테로이드, 아자트리오핀과 같은 면역억제제, 항-TNFα 항체로 대표되는 생물학적 치료법 등을 사용하고 있다. 그러나 장기간의 치료 기간 동안 이들 약제와 관련된 부작용이 발생하고, 재발률 또한 높다는 문제가 있다. 따라서, 염증성 장 질환에 대해 부작용이 적으면서 빠른 효과를 보이는 염증성 장 질환의 치료제의 개발이 요구되고 있다.

한편, 테고프라잔은 기존 양성자 펌프 억제제(proton pump inhibitor, PPI)의 강력한 위산 분비 억제력에도 불구하고, 느린 약효 발현, 야간 산분비 억제 실패 등의 단점을 보완한 새로운 약물로 많은 관심을 받고 있다. 테고프라잔은 (S)-4-(5,7-디플루오로크로만-4-일옥시)-N,N,2-트리메틸-1H-벤조[d]이미다졸-6-카복사미드[(S)-4-(5,7-difluorochroman-4-yloxy)-N,N,2-trimethyl-1H-benzo[d]imidazole-6-carboxamide](또는 7-{[(4S)-5,7-Difluoro-3,4-dihydro-2H-chromen-4-yl]oxy}-N,N,2-trimethyl-1H-benzimidazole-5-carboxamide)이라 명명되는 화합물이고, 위 H⁺/K⁺-ATPase를 가역적으로 억제하여 위-식도 역류 질환(GERD)에 대한 치료적 잠재성이 있는 칼륨-경쟁적 산 차단제(P-CAB)이다.

본 발명자들은 테고프라잔이 대장 길이가 단축되는 것을 억제하고, 질병활성도를 유의적으로 개선하며, TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 억제하고 Muc2 mRNA을 발현시키는 것을 확인하였다. 이에 따라, 테고프라잔이 대장염의 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 벤즈이미다졸 유도체 화합물로서 테고프라잔을 유효성분으로 포함하는, 종래에 치료 또는 예방의 효과가 규명되지 않은 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 벤즈이미다졸 유도체 화합물로서 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 테고프라잔, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이들의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로서 포함하는, 대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물이다.

[화학식 1]

본 발명에서 "대장염"은 세균 감염이나 장 내용물의 병적 발효 등으로 인해 대장 또는 결장에 염증이 발생한 상태를 말하며, 감염성 대장염과 비감염성 대장염을 포함하는 개념이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물을 통해 예방 또는 치료가 가능한 구체적인 대장염으로는, 염증성 장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 또는 과민성 대장염 증후군(irritable bowel syndrome, IBS) 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물을 통해 예방 또는 치료가 가능한 대장염은 급성 대장염과 만성 대장염 모두를 포함한다. 상기 급성 대장염은 급성으로 오는 염증으로서, 염증으로 인해 점막이 손상되어 점액성 설사나 선혈 증상을 주로 보인다. 본 발명에서 급성 대장염은 일반적인 급성 감염성 대장염 뿐만 아니라 급성 위막성 대장염 및 급성 궤양성 대장염을 포함한다.

본 발명에서 "염증성 장 질환"은 장에 발생하는 원인 불명의 만성적인 염증을 뜻하며, 통상적으로 특발성 염증성 장 질환인 궤양성 대장염과 크론병을 지칭하지만 우리나라에 비교적 흔한 장형 베체트병(Intestinal Behcet's disease)도 포함할 수 있다. 또한, 염증성 장 질환은 세균성, 바이러스성, 아메바성, 결핵성 장염 등의 감염성 장염과 허혈성 장 질환, 방사선 장염 등의 모든 장에 발생하는 염증성 질환을 통칭하는 것으로 정의한다.

본 발명에서 대상체의 대장염이 치료 또는 예방되었다는 것은 질환을 이미 가졌을 수 있지만 임상학적인 징후를 아직 경험하지 않았거나 보이지 않는 개체에서, 질환을 발전시키는 임상학적 증후가 나타나는 것을 예방하거나 지연시키는 것, 질환이 나타나는 것을 정지시키거나 감소시키는 것 또는 질환을 완화시키는 것을 의미할 수 있다.

DSS(dextran sodium sulfate) 및 DNBS(2,4-Dinitrobenzenesulfonic acid hydrate)를 이용한 대장염 유발 동물 모델에서의 대장염의 예방 및 치료 효과를 관찰한 결과, 테고프라잔은 동물 모델의 체중 변화를 최소화시키고 대장 길이의 변화를 최소화시키거나 단축되는 것을 억제하고, 체중감소, 혈변정도 및 대변의 점성도를 나타낸 질병활성도(Disease activity index, DAI)를 통해서도 우수한 개선효과를 확인하였다.

염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 등이 장점막 염증 또는 궤양을 초래하여, 장 점막 기능 장애 및 손상을 일으킨다. TNF-α는 염증 반응 초기에 해당 부위로 호중구를 유도하며, 급성 염증 반응을 일으키고 악화시키는 인자이고, IL-6는 대표적인 염증성 사이토카인으로서 다양한 요인에 의해 합성되어 분비되면서 급성 혹은 만성 염증질환의 발생 및 진행 과정에서 중요한 역할을 한다. 본 발명의 테고프라잔은 대장 조직에서 염증성 사이토카인 TNF-α, IL-6, IL-17 및 IL-1β의 생성/발현을 억제함을 확인하였다.

또한, 테고프라잔은 상피세포 보호에 필수적인 뮤신 단백질의 mRNA인 Muc2 mRNA을 발현시키는 것을 확인하였다.

또한, DSS 유발 대장염 동물 모델에서, 테고프라잔은 DSS에 의해 증가된 KCNJ1 mRNA 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.

또한, 테고프라잔에 의한 대장의 투과성 완화 효과를 확인하였다.

본 발명에서 상기 대상체는 동물을 말하며, 전형적으로 본 발명의 약학적 조성물을 이용한 치료로 유익한 효과를 나타낼 수 있는 포유 동물이다. 이러한 대상체의 바람직한 예에는 인간과 같은 영장류가 포함된다. 또한 이와 같은 대상체들에는 대장염 증상을 갖거나 이와 같은 증상을 가질 위험이 있는 대상체들이 모두 포함된다.

본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 투여되는 대상체에 심각한 자극을 유발하지 않고 테고프라잔의 생물학적 활성 및 물성을 손상시키지 않는 임의의 무기산 또는 유기산 또는 염기와 형성된 염을 의미한다. 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염과 같이, 당업계에서 통상적으로 사용되는 염을 사용할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은 구체적으로는 피돌레이트염, 아세테이트염, 아디페이트염, 아스파테이트염, 벤조에이트염, 베실레이트염, 바이카본에이트염/카본에이트염, 바이설페이트염/설페이트염, 보레이트염, 캄실레이트염, 사이트레이트염, 사이클라메이트염, 에디실레이트염, 에실레이트염, 폼에이트염, 퓨마레이트염, 글루셉테이트염, 글로콘에이트염, 글루쿠론에이트염, 헥사플루오로포스페이트염, 하이벤제이트염, 하이드로클로라이드염/클로라이드염, 하이드로브로마이드염/브로마이드염, 하이드로아이오다이드염/아이오다이드염, 이세티오네이트염, 락테이트염, 말레이트염, 말리에이트염, 말로에이트염, 메실레이트염, 메틸설페이트염, 나프틸레이트염, 2-납실레이트염, 니코틴에이트염, 나이트레이트염, 오로테이트염, 팔미테이트염, 파모에이트염, 포스페이트염/하이드로젠 포스페이트염/다이하이드로젠 포스테이트, 피로글루탐에이트염, 사카레이트염, 스테아레이트염, 석신에이트염, 탄네이트염, 타르트레이트염, 토실레이트염, 트라이플루오로아세테이트염 및 지노포에이트 염으로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니면 통상적으로 상기 테고프라잔의 약리활성을 나타낼 수 있는 염이라면 제한없이 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 수화물은 테고프라잔 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 물이 비공유적 분자간 힘으로 결합되어 있는 것으로, 화학양론적 또는 비화학양론적의 양의 물을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예들에 있어서, 상기 용매화물은 테고프라잔 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과, 물이 아닌 용매가 분자간 힘으로 결합되어 있는 것으로, 용매를 화학양론적 또는 비화학양론적 양으로 포함할 수 있다.

본 발명의 대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물은 약학적으로 허용 가능함 첨가제, 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 첨가제"는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 첨가제의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 첨가제라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 첨가제의 비제한적인 예로는, 만니톨, 미결정셀룰로오스, 크로스카멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 콜로이드성이산화규소, 미결정셀룰로오스, 크로스카멜로오스나트륨, 콜로이드성이산화규소, 스테아르산 마그네슘 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있다.

본 발명의 대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물은 경구 투여용으로 제제화될 수 있으며, 구체적으로는 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캅셀, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs) 등으로 제제화될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의할 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 약제학적으로 유효한 양이여야 한다. "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 제제화 방법, 환자의 상태 및 체중, 환자의 성별, 연령, 질환의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간, 배설 속도, 반응 감응성 등과 같은 요인들에 따라 당업자에 의해 다양하게 선택될 수 있다. 유효량은 당업자에게 인식되어 있듯이 처리의 경로, 부형제의 사용 및 다른 약제와 함께 사용할 수 있는 가능성에 따라 변할 수 있다.

본 발명은 테고프라잔 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로서 포함하는 약학적 조성물의 대장염 예방 또는 치료를 위한 용도를 제공한다.

본 발명은 대장염의 예방 또는 치료를 위한 약제를 생산하기 위한, 테고프라잔 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로서 포함하는 약학적 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명은 테고프라잔 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로서 포함하는 약학적 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 대장염의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 대장염 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 유효성분인 테고프라잔은 염증 활성 지표 인자들의 활성 및 발현을 감소시키고, 대장염의 질병활성도를 개선시키는 효과를 나타내어, 대장염의 예방 및 치료용 약학적 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 DSS로 대장염이 유도된 모델에서 정상 대조군(control), 대장염 유발군(DSS+Veh), 테고프라잔 투여군(DSS+Tegoprazan) 및 대조약 투여군(DSS+Rabeprazole)의 4개군 각각의 9일간 마우스 체중 변화율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 DSS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 대장 길이를 나타낸 그래프이다.
도 3은 DSS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 DAI 점수(disease activity index score)를 나타낸 그래프이다.
도 4는 DSS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 KCNJ1 mRNA 발현 변화(fold change)를 나타낸 그래프이다.
도 5는 DSS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 대장조직에서의 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 Muc2의 mRNA 발현 변화 값(fold change)을 나타낸 그래프이다.
도 6은 DSS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 대장 조직을 PAS(periodic acid-Schiff) 염색 분석한 결과 사진들과, 배상 세포 손실(Goblet cell loss) 점수에 관한 그래프를 나타낸 도면이다.
도 7은 DSS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 대장 조직 손상 정도를 점수화한 그래프이다.
도 8은 DSS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 염증에 의한 장 투과성 특성 평가 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 DNBS로 대장염이 유도된 모델에서 정상 대조군(control), 대장염 유발군(DNBS+Vehicle), 테고프라잔 투여군(DNBS+Tegoprazan) 및 대조약 투여군(DNBS+Rabeprazole)의 4개군 각각의 5일간 마우스 체중 변화율(%)을 나타낸 그래프이다.
도 10은 DNBS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 대장 길이를 나타낸 그래프이다.
도 11은 DNBS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 DAI 점수(disease activity index score)를 나타낸 그래프이다.
도 12는 DNBS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 대장조직에서의 TNF-α, IL-6, IL-1β 및 IL-17의 mRNA 발현 변화 값(fold change)을 나타낸 그래프이다.
도 13은 DNBS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 대장 조직을 PAS(periodic acid-Schiff) 염색 분석한 결과 사진들과, 배상 세포 손실(Goblet cell loss) 점수에 관한 그래프를 나타낸 도면이다.
도 14는 DNBS로 대장염이 유도된 모델에서 4개군 마우스의 대장 조직 손상 정도를 점수화한 그래프이다.
도 15는 DNBS로 대장염이 유도된 모델의 생존율 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

DSS를 이용한 대장염 마우스 모델

C57BL/6 male 마우스로 8주령(24.0 g)을 오리엔트바이오에서 구입하여, 실험실 환경(온도 21℃±2℃, 습도 50±10%)에서 1주간 사료와 물을 충분히 공급하여 순화시킨 후 실험에 사용하였다.

정상 대조군(control, n=6), 대장염 유발군(DSS+Veh, n=8), 테고프라잔 투여군 (DSS+Tegoprazan, n=8) 및 대조약 투여군(DSS+Rabeprazole, n=8)으로 나누어 실험을 진행하였다.

대장염을 유발하기 위해서 DSS (MPbio제품, 카탈로그 No. 0216011080)를 이용하였다.

대장염 유발군(DSS+Veh)은 2.0 % DSS를 음수에 섞어 5일간 연속하여 투여하고, 5일째부터는 2.0 % DSS 투여를 중지하고, 8일째까지 3일간은 0.5 %(w/v) 메틸셀룰로오스 수용액을 1일 2회 경구투여하였다.

테고프라잔 투여군(DSS+Tegoprazan)에서는, 5일간은 테고프라잔(7-{[(4S)-5,7-Difluoro-3,4-dihydro-2H-chromen-4-yl]oxy}-N,N,2-trimethyl-1H-benzimidazole-5-carboxamide)을 0.5%(w/v) 메틸셀룰로오스 수용액에 녹여 투여량을 30mg/kg/day로 하여 1일 2회로 2% DSS 및 음수를 함께 경구투여하였다. 5일째부터는 2.0% DSS 투여를 중지하고, 8일째까지 3일간은 테고프라잔을 0.5%(w/v) 메틸셀룰로오스 수용액에 녹여 1일 2회 경구투여하였다.

대조약 투여군(DSS+Rabeprazole)은 테고프라잔 대신 라베프라졸을 이용한 것을 제외하고는 테고프라잔 투여군과 실질적으로 동일하게 DSS와 라베프라졸을 투여하였다.

테고프라잔 투여군 및 대조약 투여군에서의 1일 2회 경구 투여는 오전/오후로 나누어 수행하였다.

DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델

정상 대조군(control, n=6), 대장염 유발군(DNBS+Vehicle, n=8), 테고프라잔 투여군 (DNBS+Tegoprazan, n=8) 및 대조약 투여군(DNBS+Rabeprazole, n=8)으로 나누어 실험을 진행하였다.

대장염을 유발하기 위해서 DNBS(Sigma-Aldrich 제품, 카탈로그 No. 556971)를 이용하였고, DNBS 투여 1일 전부터 마우스를 금식 시켜 장내 분변을 제거하였다. 정상 대조군은 50% 에탄올만을 직장 투여하였다.

DNBS 투여는 DNBS 5mg를 50% 에탄올에 녹여 직장 투여하는 방법으로 실시하였다.

테고프라잔 투여군(DNBS+Tegoprazan)은, DNBS 투여된 마우스에 대해서 5일간 테고프라잔(7-{[(4S)-5,7-Difluoro-3,4-dihydro-2H-chromen-4-yl]oxy}-N,N,2-trimethyl-1H-benzimidazole-5-carboxamide)을 0.5%(w/v) 메틸셀룰로오스 수용액에 녹여 투여량을 30mg/kg/day로 하여 1일 2회 경구투여하였다.

대조약 투여군(DNBS+Rabeprazole)은 테고프라잔 대신 라베프라졸을 이용한 것을 제외하고는 테고프라잔 투여군과 실질적으로 동일하게 DNBS 투여된 마우스에 대해서 라베프라졸을 투여하였다.

대장염 유발군(DNBS+Vehicle)은 DNBS 투여된 마우스에 대해서 0.5%(w/v) 메틸셀룰로오스 수용액을 1일 2회 경구 투여하였다.

상기 테고프라잔 투여군, 대조약 투여군 및 대장염 유발군에서의 1일 2회 경구 투여는 오전/오후로 나누어 수행하였고, 4일간 투여한 후 5일째에 마우스를 희생하였다.

(1) 체중변화 측정 및 결과

(1-1) DSS를 이용한 대장염 마우스 모델

정상 대조군, 대장염 유발군, 테고프라잔 투여군 및 대조약 투여군의 마우스 각각의 체중을 측정하였다. 실험 개시일인 DSS를 투여하지 않은 상태(0 day)에서부터 9일째까지 매일 아침에 마우스의 체중을 측정하였고, 실험 개시일인 DSS를 투여하지 않은 상태(0 day)의 마우스의 체중을 100%하여 환산하였다. 그 결과를 도 1에 나타낸다.

도 1을 참조하면, 정상 대조군에서는 1일부터 8일째 되는 날까지 지속적으로 체중이 증가한 것을 확인할 수 있다. 반면, 대장염 유발군, 테고프라잔 투여군 및 대조약 투여군은 모두 5일째까지는 큰 변화를 보이지 않다가, 6일째부터 체중이 감소한 것을 확인할 수 있다.

마우스를 희생한 9일째에, 대장염 유발군은 약 21%의 체중감소를 보였고, 대조약 투여군은 오히려 대장염 유발군보다도 더 많은 약 23%의 체중감소를 보인 반면, 테고프라잔 투여군은 불과 14% 정도의 체중감소를 보인 것을 확인할 수 있다.

도 1에서, ** 및 ***는 각각 대장염 유발군과 테고프라잔 투여군과의 현저한 차이(P<0.01 및 P<0.001)를 나타내고, ###는 테고프라잔 투여군과 대조약 투여군의 현저한 차이(P<0.001)를 나타낸다.

(1-2) DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델

정상 대조군, 대장염 유발군, 테고프라잔 투여군 및 대조약 투여군의 마우스 각각의 체중을 측정하였다. 실험 개시일인 DNBS를 투여하지 않은 상태(0 day)에서부터 5일째까지 매일 아침에 마우스의 체중을 측정하였고, 실험 개시일인 DNBS를 투여하지 않은 상태(0 day)의 마우스의 체중을 100%하여 환산하였다. 실험 종료 전 폐사한 마우스의 경우, 폐사 전일 측정한 무게를 실험 종료일까지 데이터에 산입하여 환산하였다(생존기간 및 생존율은 도 15 참조). 그 결과를 도 9에 나타낸다.

도 9를 참조하면, 정상 대조군의 경우 지속적으로 체중증가를 보였고, 대장염 유발군 및 테고프라잔 투여군과 대조약 투여군은 모두 3일째까지 큰 체중감소를 보였다. 테고프라잔 투여군의 경우 4일째부터 체중이 증가하였으며, 마우스를 희생하는 5일째 체중은 약 105%로 증가하여 대장염에 의한 체중감소가 회복된 것을 확인하였다. 반면 대장염 유발군과 대조약 투여군의 체중은 각각 88% 및 89%로 DNBS 투여에 의해 체중감소가 일어난 후 회복되지 못한 것을 확인하였다.

도 9에서, ***는 대장염 유발군과 테고프라잔 투여군과의 현저한 차이(P<0.001)를 나타내고, ###는 테고프라잔 투여군과 대조약 투여군의 현저한 차이(P<0.001)를 나타낸다.

(2) 대장 길이 변화 측정 및 결과

(2-1) DSS를 이용한 대장염 마우스 모델

2% DSS 용액을 최초에 투여하고 9일째 되는 날, 마우스를 희생하였고, 결장 적출 후 적출된 대장의 길이를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다. (도 2에서, *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타낸다)

도 2를 참조하면, 정상 대조군에 비해, 대장염 유발군의 대장 길이가 유의하게 감소(약 80%)한 것을 확인할 수 있다. 이에 의해 DSS에 의해 대장염이 유발되었음을 확인할 수 있다. 또한, 대조약 투여군에서는 대장염유발군과 유사하게 대장 길이가 감소된 것으로 나타남을 확인할 수 있다.

반면, 테고프라잔 투여군은 오히려 대장 길이가 증가하거나 정상 대조군과 차이가 없음을 확인할 수 있고, 이는 테고프라잔이 대장염에 의한 대장 길이의 변화를 최소화시키거나, 단축되는 것을 억제하는 효과가 있음을 확인한 것이다.

(2-2) DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델

DNBS를 직장투여하고 5일째 되는 날, 마우스를 희생하였고, 결장 적출 후 적출된 대장의 길이를 측정하였다. 결과를 도 10에 나타낸다. (도 10에서, *는 P<0.05를 나타낸다)

도 10을 참조하면, 정상 대조군에 비해 대장염 유발군의 대장길이가 유의하게 감소(약 87 %)한 것을 확인할 수 있다. 즉, DNBS에 의해 대장염이 유발되었음을 확인할 수 있다. 반면, 테고프라잔 투여군에서는 대장 길이가 정상 대조군과 차이가 없음을 확인할 수 있고, 이는 테고프라잔이 대장염에 의한 대장 길이의 유지시키거나 변화를 최소화시키거나, 단축되는 것을 억제하는 효과가 있음을 확인한 것이다.

(3) DAI (disease activity index) 측정 및 평가

DAI로서 체중변화, 혈변 및 대변 점성도를 매일 아침에 측정하였으며, 하기 표 1에 따라 점수화하였다.

점수	체중 감소	혈변	대변 점성도
0	(없음)	정상	정상
1	1% 초과-5% 이하	붉은색 혈변	묽음
2	5% 초과-10% 이하	검붉은색 혈변	매우 묽음
3	10% 초과-20% 이하%	심각한 출혈	설사
4	20% 초과	-	-

그 결과를 도 3 및 도 11에 나타낸다. (DNBS를 이용한 대장염 유발 동물 모델에서는, 실험 종료 전 폐사한 마우스의 경우, 폐사 전일 측정한 DAI 점수를 실험 종료일까지 데이터에 산입하여 환산하였다 (생존기간 및 생존율은 도 15 참조).

도 3 및 도 11에서, ** 및 ***는 각각 대장염 유발군과 테고프라잔 투여군과의 현저한 차이(P<0.01, P<0.001)를 나타내고, #는 ###는 각각 테고프라잔 투여군과 대조약 투여군의 현저한 차이(P<0.05 및 P<0.001)를 나타낸다.

(3-1) DSS를 이용한 대장염 마우스 모델

도 3을 참조하면, 대장염 유발군은 3일째부터 붉은색으로 혈변이 보이기 시작하여 DAI 점수가 증가하였고, DSS 투여를 중단하고 측정한 다음 날인 6일째와 희생된 날인 9일째에 전날 대비 큰 차이를 보이는 것을 확인할 수 있다.

DAI 점수에서는 대장염 유발군에 비해 테고프라잔 투여군에서 유의한 호전을 보였고, 6일째와 9일째에 대장염 유발군과 대조약 투여군 각각이 테고프라잔 투여군 대비 유의한 차이를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 대조약 투여군의 경우에는 대장염 유발군과 차이가 없이 매우 유사한 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

(3-2) DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델

도 11을 참조하면, DAI 점수에서는 DNBS 투여에 의해 모든 군에서 DAI가 증가되었으나, 테고프라잔 투여군의 경우 4일째부터 DAI가 급격히 감소하여 대장염 유발군과 유의한 차이를 보인 것을 확인하였다. 반면, 대조약 투여군의 경우 대장염 유발군과 큰 차이가 없는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 테고프라잔의 대장염 완화 효과를 확인할 수 있다.

(4) 대장조직에서 JCNJ1 mRNA 발현 확인 및 결과

DSS를 이용한 대장염 마우스 모델에서, KCNJ1 mRNA의 발현 차이를 real-time PCR을 이용하여 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타낸다. (도 4에서, **는 P<0.01을 나타낸다.

도 4를 참조하면, 정상 대조군과 비교하여 대장염 유발군에서의 KCNJ1 mRNA 발현이 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있는 반면, 테고프라잔 투여군에서는 KCNJ1 mRNA 발현이 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다.

(5) 대장조직에서 염증성 사이토카인 mRNA 발현 확인 및 결과

(5-1) DSS를 이용한 대장염 마우스 모델

real-time PCR을 이용하여 DSS를 이용한 대장염 마우스 모델에서의 IL-1β, IL-6, Muc2 및 TNF-α의 mRNA의 발현 정도를 평가하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. (도 5에서, *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타내며, ***는 P<0.001을 나타낸다)

도 5를 참조하면, 대장염 유발군에 비해 테고프라잔 투여군에서 TNF-α와 IL-6의 mRNA 발현이 통계적으로 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 또한, 테고프라잔 투여군에서는 상피세포 보호에 필수적인 Muc2의 mRNA 발현 또한 통계적으로 유의하게 증가된 것을 확인할 수 있다.

(5-2) DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델

real-time PCR을 이용하여 DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델에서의 IL-17의 mRNA의 발현 정도를 평가하였다. 그 결과를 도 12에 나타낸다. (도 12에서, **는 P<0.01을 나타내며, ***는 P<0.001을 나타낸다)

도 12를 참조하면, 대장염 유발군에 비해 테고프라잔 투여군에서 전염증성 사이토카인 IL-17의 mRNA 발현이 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 또한, TNF-α와 IL-6의 mRNA의 발현 정도를 평가한 결과에서도 대장염 유발군에 비해 테고프라잔 투여군에서 mRNA 발현이 감소하는 경향을 보임을 확인하였다.

(6) PAS 염색(PAS staining) 분석 및 대장 조직 손상 확인 및 결과

DSS 및 DNBS를 이용한 동물 모델 각각에서 얻은 대장 조직에 대해서 PAS 염색 분석을 수행하였고, 배상세포 손실 점수는 하기 표 2에 따라 점수화하였고, 조직손상 정도는 하기 표 3에 따라 점수화하였다.

점수	배상세포 손실율
0	0% 초과-10 이하%
1	10 % 초과-20 이하%
2	21 초과-35 이하%
3	36 초과-50 이하%
4	51% 초과

점수	염증 정도	손상 범위	음와(crypt) 손상
0	정상	정상	정상
1	경미함	점막	기저의 1/3
2	보통	점막 및 점막하	기저의 2/3
3	심각함	경벽	오직 표면 상피만 무손상
4	-	-	전체 음와 및 상피 손상

그 결과를 도 6, 도 7, 도 13 및 도 14에 나타낸다. (도 6, 도 7, 도 13 및 도 14 각각에서, *는 P<0.05를 나타내고, **는 P<0.01을 나타내며, ***는 P<0.001을 나타낸다)

(6-1) DSS를 이용한 대장염 마우스 모델

도 6을 참조하면, 대장염 유발군에서는 전반적으로 음와(crypt)가 모두 손상되고 대장 점막에 전반적으로 염증세포가 침윤된 것을 확인할 수 있다.

반면, 테고프라잔 투여군에서는 대장염 유발군에 비해 부분적으로 손상되지 않은 음와가 관찰되었고, 배상세포(goblet cell)의 존재 또한 확인할 수 있다. 뮤신을 생산하는 배상세포가 존재한다는 결과는, Muc2 mRNA 발현 실험에서 테고프라잔 투여군의 경우 대장염 유발군보다 그 발현량이 증가한 결과와 일치한다.

도 7을 참조하면, 대장염 유발군 (8.75±1.6 point)에 비해 테고프라잔 투여군(5.38±1.8 point)의 점수는 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 반면, 대조약 투여군(8.12±1.8 point)은 조직 손상 정도에서 대장염 유발군과 유의한 차이를 보이지 않았다.

(6-2) DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델

도 13을 참조하면, 대장염 유발군에서는 전반적인 음와(crypt) 손상 및 대장 점막에의 염증세포 침윤이 확인되었다. 반면 테고프라잔 투여군에서는 대장염 유발군에 비해 부분적으로 손상되지 않은 음와가 관찰되었고, 뮤신을 생산하는 배상세포(goblet cell)의 존재 또한 확인할 수 있다.

반면, 대조약 투여군의 경우 음와 손상이 완화되지 않았으며, 배상세포의 손실이 대장염 유발군보다 더욱 크게 나타남을 확인하였다.

도 14를 참조하면, 대장염 유발군 (6.8±2.1 point)에 비해 테고프라잔 투여군(4.1±16 point)의 점수는 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 반면, 대조약 투여군 (7.0±1.4 point)은 조직 손상 정도에서 대장염 유발군(DNBS+Vehicle)과 유의한 차이를 보이지 않았다.

(7) FITC-덱스트란 투과성 실험

DSS를 이용한 대장염 마우스 모델에서, 마우스 희생 4시간 전에, FITC-덱스트란(80 mg/mL)을 경구투여한 후 심장채혈하여 헐청 내의 FITC값을 측정하였다. 정상대조군을 기준으로 하여 투과도(%)를 환산하였다. 그 결과를 도 8에 나타낸다.

도 8을 참조하면, 대장염 유발군에서 FITC 값이 증가하였고, 이는 DSS에 의해 밀착 연접(Tight junction)의 손상이 유발되었음을 의미한다. 또한, 밀착 연접의 손상은 대조약 투여군에서는 완화되지 않았음을 확인할 수 있다.

반면, 테고프라잔 투여군에서는 밀착 연접의 손상이 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있다.

(8) DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델의 생존율

DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델의 생존율을 확인하였고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15를 참조하면, 대장염 유발군과 대조약 투여군의 5일째까지의 생존율은 각각 50% 와 75%였지만, 테고프라잔 투여군은 실험 종료일까지 모든 개체가 살아남은 것을 확인하였다. 이를 통해 테고프라잔이 DNBS에 의한 대장염을 완화시키는 것을 확인하였다.

실험결과, DSS 또는 DNBS를 이용한 대장염 마우스 모델에서 테고프라잔 투여군에서정상 대조군에 비해 대장 길이, 체중 감소, DAI 점수에서 유의한 증상 개선을 확인할 수 있었다. 즉, 테고프라잔 투여군은 조직학적 소견에서도 전반적으로 심각하게 손상된 대장염 유발군과 비교했을 때 일부 손상되지 않은 음와 구조가 관찰되었고, 이를 점수화한 평가 결과에서도 통계적으로 유의한 점막 손상 보호 효과를 확인할 수 있었다. 테고프라잔은 염증으로 인한 장 투과도를 유의하게 완화시키는 효과가 나타난 것을 확인하였으나, PPI제제인 라베프라졸을 투여한 대조약 투여군에서는 대장염증 완화 효과를 확인할 수 없었다.

종합하면, 본 발명에 따른 테고프라잔을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 대장염의 예방과 치료에 우수한 효과가 있음을 확인할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 이들의 수화물 또는 용매화물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는,
대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물;
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 대장염은 염증성 장 질환(IBDs) 또는 과민성 대장염 증후군인,
대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 대장염은 염증성 장 질환이고,
상기 염증성 장 질환은 크론병, 궤양성 대장염, 장형 베체트병, 감염성 장염, 허혈성 장 질환 또는 방사선 장염인,
대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 대장염은 급성 대장염인,
대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 경구로 투여되는 것인,
대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은
TNF-α, IL-6, IL-17 및 IL-1β로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 염증성 사이토카인의 발현을 억제 또는 저해하는 것인,
대장염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.