KR20210151938A - 살리프로 입자의 제조 - Google Patents

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KR20210151938A
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로빈 뢰빙
옌스 프라우엔펠드
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살리프로 바이오테크 에이비
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Abstract

본 발명은 사포신 유사 단백질, 지질 및 임의적으로, 소수성 제제를 포함하는 사포신 지단백질 입자의 제조 방법으로서, 상기 사포신 유사 단백질 또는 상기 소수성 제제는 상기 지지체에 선택적으로 결합하여 상기 사포신 지단백질 입자가 자가 조립되게 하는, 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 (a) 소수성 제제 및 지질을 제공하는 단계, (b.1)/(b.2) 상기 소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질을 상기 2개의 분자를 지지체에 선택적으로 결합시킬 수 있는 지지체와 접촉시키는 단계, (c.1)/(c.2) 상기 지지체가 결합된 입자 성분을 나머지 입자 성분, 즉 상기 사포신 유사 단백질 또는 상기 소수성 제제와 접촉시켜 상기 지지체에서 상기 사포신 지단백질 입자가 자가 조립되게 하는 단계, 및 (d) 임의적으로, 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 지단백질 입자를 용리시키는 단계를 포함한다.

Description

살리프로 입자의 제조
본 발명은 사포신 유사 단백질, 지질 및 임의적으로, 소수성 제제를 포함하는 사포신 지단백질 입자의 제조 방법에 관한 것이다.
막은 모든 살아있는 세포를 둘러싸고 다수의 바이러스(예컨대 HIV)의 외피를 형성한다. 살아있는 세포에서 세포 막은 세포의 내용물을 보존하기 위한 반투과성 장벽 역할을 한다. 막 성분, 특히 수용체 및 수송체와 같은 막 단백질은 또한 세포가 환경과 상호작용하는 방식을 결정하고 조절한다. 신호 전달, 분자 수송, 에너지 대사, 세포-세포 접촉 형성 및 세포 항상성과 같은 생물학적 과정을 포함하는 후자의 기능은 중요하고, 막 단백질에 의존한다. 막 단백질은 모든 ORF의 대략 30%에 의해 암호화되고(문헌[Wallin and von Heijne, Protein Science 1998 Apr; 7(4):1029-38]), 따라서 세포 단백질의 대략 1/4을 나타낸다. 바이러스 외피의 막 단백질은 또한 바이러스 캡시드 및 바이러스 게놈이 숙주 세포에 들어가 감염되도록 하는 숙주 세포 막과 같은 환경과의 상호작용을 매개하는 역할을 한다.
막 단백질은 상기 언급한 중요한 기능들에 기인하여 생명 과학 연구, 특히 약물 발견에 있어서 큰 관심대상이다. 사실, 대부분의 약물, 즉 60% 이상은 막 단백질을 표적으로 한다(문헌[Overington et al., Nature Reviews Drug Discovery 5, 993-996 (December 2006)]). 연구 목적 및 임상 약물 개발을 위해서는 막 단백질이 단백질뿐만 아니라 다른 소수성 제제(예컨대 소수성 약물)도 소수성 제제 또는 기술의 기능을 손상시키지 않으면서 최첨단 기술 플랫폼의 대상이 될 수 있다. 소수성 제제가 제대로 기능하려면 소수성 환경(이상적으로는 천연 막 환경을 모방하는 구조에 내포됨)이 필요하다. 그러나, 종종 최첨단 기술 플랫폼에서 수행되는 대부분의 생화학 분석은 이러한 분석 및 플랫폼이 제대로 기능하는데 요구되는 수성 시스템을 기반으로 한다. 따라서, 본 발명의 목적은 소수성 제제의 천연 막과 지질 환경을 보존하거나 모방하는 동시에 수성 시스템에 용해되도록 하기 위해 소수성 제제를 제제화하기 위한 개선되고 보다 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
이는 또한 최첨단 설정에서 통상적으로 제대로 기능함에 수성 시스템에서의 용해성을 요하는 고처리량 스크리닝(HTS)에서 막 단백질 또는 기타 소수성 제제를 사용할 수 있게 한다. 분자 생물학, 컴퓨팅, 로봇 및 검출기 기술의 발전은 HTS를 발전시켜 제약, 생명 공학 및 생명 과학 연구의 "주력(workhorse)"이 되게 하였다. 생화학 시험의 신속한 병렬 실행을 통해 HTS는 특정 생체분자 경로를 조절하는 약물, 항체, 분자 상호작용 및 단백질의 신속한 식별을 가능하게 하였다. 수득되는 결과는 추가 약물 설계, 및 살아있는 시스템에서 특정 생화학적 과정의 역할을 이해를 위한 출발점과 중요한 단서를 제공한다.
미세유체학의 발전과 조합하여 HTS의 규모를 축소하려는 의도는 소규모 설정에서 훨씬 더 빠르고 저렴한 비용으로 분석을 수행할 수 있는 생화학적 랩온어칩(lab-on-a-chip) 접근의 계속적인 개발을 야기하였다. 그러한 HTS 또는 랩온어칩 적용례에서 막 단백질 및 기타 소수성 제제를 통상적으로 사용할 수 있다면 큰 발전을 제공할 수 있을 것이다. 이를 위해 종종 칩과 같은 표면에 시험 제제를 부동화시킴이 요구된다. 따라서, 본 발명의 추가 목적은 특히 소수성 제제의 천연 막 및 지질 환경을 보존하거나 모방하는 동시에 상기 소수성 제제를 수성 시험 시스템과 양립가능하게 함으로써 지지체에 소수성 제제를 부동화시키는 개선되고 보다 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
생화학적 상호작용 및 반응(예컨대 리간드와 상응하는 수용체의 결합, 항체와 상응하는 항원의 상호작용 또는 효소에 의한 기질 전환)을 측정하기 위한 다수의 최첨단 설정은 바이오센서 및 고체 지지체의 표면에 부착된 분석물에 의존한다. 주지된 광학 바이오센서 시스템은 SPR(표면 플라스몬 공명)을 기반으로 한다. 막 단백질은 다양한 환경 자극을 감지하는 데 중심적인 역할을 하므로 바이오센서 시스템에서 표면 부착 분석물로서 적용하기에 매력적이다. 그러나, 이러한 바이오센서 시스템은 대부분 수성 환경을 기반으로 함에 기인하여, 막 단백질 및 기타 소수성 제제가 용이하게 사용될 수 없다. 따라서, 본 발명의 추가 목적은 특히 소수성 제제의 천연 막 및 지질 환경을 보존하거나 모방하는 동시에 상기 소수성 제제를 수성 시험 시스템과 양립가능하게 함으로써 지지체에 소수성 제제를 부동화시키는 개선되고 보다 효율적인 방법을 제공하는 것이다.
요약하면, 전술한 바와 같이 막 단백질 및 기타 소수성 제제의 소수성 특성은 일반적으로 수용액에서 수행되는 생화학적 적용 및 연구에 불편하다. 막 단백질 및 기타 소수성 제제의 소수성 특성은 또한 인간 혈액을 포함하는 대부분의 생물학적 시스템이 친수성, 수성 환경을 나타냄에 기인하여 치료제 또는 진단 제제로서의 잠재적 투여에 불편하다. 따라서, 소수성 제제(예컨대 막 단백질 또는 소수성 화합물)는 생명 과학 연구 및 제약 산업에 있어서 2가지 과제를 제시한다: (i) 분석 및 시험 목적을 위해 막 단백질 및 기타 소수성 제제를 이의 기능 손상 없이 수용액에 가용성이 되게 함; 및 (ii) 치료제 및 진단제로서 이러한 소수성 제제를 목적 및/또는 자연적 기능 손상 없이 투여함.
두번째 과제, 즉 치료제 또는 진단제로서의 소수성 제제(예컨대 소수성 화합물 및/또는 단백질)의 투여 및 전달은 주로 이들의 제한된 수용해도에 의해 야기된다. 약물의 경우, 이는 약물이 응집되기 쉽도록 하여 국소적으로 고도로 농축된 약물 입자를 야기하는데, 이는 높은 독성, 원치 않는 면역 반응을 초래하고/거나 약물을 비활성화시킬 수 있다(문헌[Allen and Cullis, SCIENCE, 303(5665): 1818-1822, MAR 19,2004]).
본 발명의 목적은 HTS, 랩온어칩 및 바이오센서 적용례와 같은 최첨단 생화학적 분석 기술에서 막 단백질 또는 소수성 약물과 같은 소수성 제제를 보다 용이하게 사용할 수 있도록 하는 것뿐만 아니라, 치료 또는 진단 적용례에서 그러한 소수성 제제를 투여하기 위한 더 나은 제조 및 제형화 방법을 제공하는 것이다. 이러한 목적을 달성하기 위해 소수성 제제를 가용성 입자에 혼입하는 동시에 소수성 제제의 천연 막 및 지질 환경을 보존하거나 모방하는 효율적이고 비용 및 자원 절약적인 방법이 매우 요구된다.
막 단백질은 단백질 주위에 미셀을 형성하는 세제에서 가장 빈번히 정제된다. 그러나, 세제는 단백질 구조와 활성에 해로운 경우가 많다. 또한, 세제는 다운스트림 분석 방법을 방해할 수 있다. 따라서, 소수성 제제를 가용화하는데 있어서 고농도 세제의 사용을 피하는 것이 당업계의 목적이다. 수용액에서 불용성인 소수성 제제를 가용성이 되게 하는 과제를 해결하는 선행 기술 방법은 특히 나노디스크 시스템을 포함한다(문헌[Bayburt et al., Archives of biochemistry and biophysics, 450.2 (2006): 215-222] 및 [Denisov et al., Journal of the American Chemical Society, 126.11 (2004): 3477-3487]).
EP 1 596 828 B1에는 이중 벨트 유사 방법으로 지질 이중층을 단단히 둘러싸는 아포지단백질을 포함하는 디스크 형태의 생물활성제 전달 입자가 기재되어 있다. 상기 입자의 내부는 지질 이중층의 소수성 영역에 의해 형성된다. 이는 수성 내부를 포함하는 폐쇄 구형 이중층 껍질인 리포솜과 대조된다. EP 1 596 828 B1에 기재된 디스크형 생물활성제 전달 입자는 약 10 nm의 스토크스 직경을 갖고, 암포테라이신 B 또는 캄프토테신과 같은 소수성 약물을 위한 전달 비히클(vehicle)로서 사용하도록 제안되었다.
EP 1 345 959 B1에는 직경이 약 10 nm이고 높이가 약 5.5 nm인 유사한 유형의 나노규모 입자가 기재되어 있다. 상기 입자는 디스크 형태이고 (i) 인공 막 스캐폴드(scaffold) 단백질, (ii) 인지질 이중층 및 (iii) 하나 이상의 소수성 또는 부분 소수성 막 단백질로 구성된다.
그러나 이 나노디스크 기술에는 예컨대 입자를 조립하는 동안 세제를 제거를 요하는 것과 같은 몇 가지 단점이 있다. 더욱이, 아포지단백질 유래 MSP의 긴밀한 이중 벨트 유사 핏(tight double-belt like fit)에 의해 제공되는 크기 균질성은 선행 기술의 방법에 의해 수득가능한 고정된 최소 입자 크기를 희생하고 최대 직경을 제한하는 것으로 보인다.
최근, 지질 결합 단백질의 보존된 사포신 유사 단백질(SAPLIP) 과를 포함하는 신규한 나노입자 기술이 개발되었다(WO 2014/095576 A1, WO 2015/036549 A1 및 WO 2018/033647 A1).
SAPLIP 과는 4개의 사포신 형성 구성원을 기반으로 한다. 이들은 소형(약 80 개의 아미노산) 단백질, 즉 사포신 A 내지 D이고, 지질과 결합 및/또는 상호작용하고 스핑고지질 이화작용에서 여러 리소좀 효소에 대한 필수 보조인자로서 기능할 수 있다(참조: 문헌[Bruhn, Biochem J. (2005) 389, 249-257] 및 이에 인용된 참고 문헌). 사포신은 음전하를 띤 지질과 낮은 pH를 선호하는 것으로 기재되어 있고, 리소좀 내 pH 4.75에서 최적의 pH로 산성 pH에서 현저하게 증가된 활성을 나타낸다. 사포신 A, B, C 및 D는 하나의 대형 전구체 단백질인 프로사포신으로부터 단백질 가수분해된다. 사포신 A, B, C 및 D에 대한 완전한 아미노산 서열, 및 프로사포신의 게놈 구성 및 cDNA 서열은 보고되어 있다(문헌[O'Brien et al. (1988) Science 241, 1098-1101] 및 [Furst et al (1992) Biochim Biophys Acta 1126: 1-16]).
사포신 C는 산성 환경에서 인지질 함유 소포의 막 융합을 유도할 수 있는데(문헌[Archives of Biochemistry and Biophysics 2003 Jul 1; 415(1):43-53]), 이는 다른 사포신에서는 나타나지 않는 특징이다. 문헌[Qi et al. (2009) Clin Cancer Res 15(18): 5840-5851]은 수성 내부를 포함하고 평균 직경이 약 190 nm이고 생체내에서 종양 표적화 활성을 나타내는 사포신 C-결합 다이올레오일포스파티딜세린 나노소포(SapC-DOPS)에 대해 보고하였다. SapC-DOPS에서 사포신 C 또는 그 유래 펩티드는 그것이 부착된 리포솜에 대한 귀소 펩티드로 작용한다. 이어서, 사포신 C는 리포솜을 암세포에 표적화시켜 세포 막의 외부 리플렛(leaflet)에 포스파티딜세린을 노출시킨다. 상기 문헌의 저자는 리소좀 효소의 세포외 누출로 인한 암세포 주변의 독특한 산성 미세 환경이 종양 조직을 사포신 C에 대한 최적의 표적으로 만든다고 본다. 키(Qi) 등에 따라, SapC-DOPS 리포솜은 N2(g)하에 용매에 용해된 정제된 인지질을 건조시키고, 정제된 사포신 C를 함유하는 산성 완충액(pH 5)에 상기 건조 인지질을 분산시키고, 혼합물을 생리학적 수용액에 50배 희석하고, 후속 초음파 처리에 의한 나노소포 조립을 이용하여 제조된다.
문헌[Popovic et al., PNAS, Vol. 109, No.8 (2012) 2908-2912]에는 사포신 A 세제 디스크의 구조가 보고되어 있다. 사포신 A는 용해성 및 지질/세제 결합 상태로 존재한다. 지질이 없는 경우 사포신 A는 폐쇄형 단량체 apo 형태를 취한다. 대조적으로, 포포빅(Popovic) 등에 의해 보고된 사포신 A 세제 디스크 구조는 고도로 질서화된 이중층 유사 소수성 코어(core) 내에 조직화딘 40개의 내부 결합 세제 분자를 캡슐화하는 개방 형태의 사포신 A의 2개 쇄를 나타낸다.
사포신 A 세제 디스크의 결정화 외에도, 포포빅 등은 여러 단계를 필요로 하는 방법에 의해 pH 4.75에서 가용성 지질-사포신 A 복합체의 제조를 기재하였다. 먼저, 클로로포름에 용해된 정제된 지질을 N2(g)하에서 건조시키고, 산성 완충액(50 mM 아세트산나트륨 pH 4.8, 150 mM NaCl)에서 와류 혼합하여 상기 건조 지질을 분산시키고, 현탁액을 동결 및 해동의 10사이클로 처리하고, 와류 혼합기에서 5분 동안 배합하고 혼합물을 200 nm 필터를 통해 압출하여 대형 단일층 리포솜 소포의 균일한 분획을 제조한다. 이렇게 제조된 대형 단층 인공 리포솜 소포를 산성 완충액 중 정제된 사포신 A와 혼합하여 가용성 지질-사포신 A 입자를 제조한다. 상기 입자는 3.2 nm의 평균 유체역학(스토크스(Stokes)) 반경 근처로 좁은 크기 분포를 보였고 사포신 A 쇄당 약 5:1 지질 분자를 함유하였다. 입자의 정확한 크기는 지질 대 단백질 몰비 및 리포솜의 조성에 의해 약간만 영향을 받았다. 상기 저자는 음이온성 인지질, 콜레스테롤 또는 글리코스핑고지질이 리포솜 혼합물에 존재하는지 여부에 관계없이 유사한 3.2 nm 입자를 관찰하였다. 모든 경우에 3.2 nm의 스토크스 반경의 크기에서 단일 피크가 관찰되어 종의 상대적으로 좁은 분포를 나타냈다. 따라서, 상기 공보의 기술은 앞서 언급한 입자 크기에 대해 pH 값이 4.75로 제한되고, 고된 업스트림 리포솜 제조 단계를 포함한다.
WO 2014/095576 A1은 세제-가용화 및 정제된 지질을 사용하여 정제된 세제-가용화된 소수성 카고(cargo) 분자 또는 정제된 세제-가용화된 막 단백질을 사포신 지단백질 입자에 혼입하는 것이 가능함을 최초로 보였다. WO 2014/095576 A1에 기재된 방법은 액체 환경에서 사포신 유사 단백질을 가용화된 지질 및 정제된 형태의 소수성 제제(정제된 세제-가용화된 소수성 카고 분자 또는 세제-가용화된 막 단백질)와 접촉시킴으로써 사포신 지단백질 입자가 자가 조립(self-assembly)되게 한다. 개별 성분은 모두 자유 및 가용성 형태로 존재하고, 이의 사포신 지단백질 입자로의 자가 조립은 액체 환경에서 관련된 모든 입자 성분의 자유롭고 무작위적인 움직임을 기반으로 한다.
WO 2015/036549 A1은 WO 2014/095576 A1에 기재된 방법을 잘 정의되고 정제된 HIV-1 바이러스 유사 입자(VLP)로부터 가용화된 항원 분자(바이러스 막 단백질에 대해 나타냄)의 혼입으로 확장하였다. WO 2015/036549 A1의 실시예에 따라, 미리 정제된 VLP를 용해시키고, HIV-1 막 스파이크 단백질을 세제로 가용화시킨 후, 자유 스파이크 단백질을 액체 환경에서 자유 사포신 A 단백질과 접촉시킨다. 이러한 방법으로, 사포신 유사 단백질은 항원 분자가 그 안에 조립되도록 지질 모방 환경을 제공한다. 또한, 여기에서 개별 성분은 모두 자유 및 가용성 형태로 존재하고, 사포신 지단백질 입자로의 자가 조립은 액체 환경에서 관련된 모든 입자 성분의 자유롭고 무작위적인 움직임을 기반으로 한다.
WO 2018/033647 A1에는 세포 또는 세포 소기관 막으로부터 사포신 지단백질 입자의 라이브러리를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 가용화되고 정제된 지질 및 단백질 성분을 사용하는 대신, WO 2018/033647 A1은 미정제 세포 또는 세포 소기관 막을 사포신 지단백질 입자를 조립하기 위한 출발 물질로 직접 사용할 수 있게 한다. 이러한 방법으로, 상이한 막 지질 및/또는 막 단백질 조성을 갖는 사포신 지단백질 입자의 이종 혼합물을 포함하는 라이브러리가 수득된다. 따라서, WO 2018/033647 A1의 방법에 의해 수득된 사포신 지단백질 입자 라이브러리는 이들이 제조되는 실제 막의 마이크로도메인 및 성분의 단편적인 정보(snapshot)를 제공한다. WO 2018/033647 A1의 방법은 액체 환경에서 사포신 유사 단백질과 접촉하는 미정제 막 또는 미정제 막 소포를 제공함으로써 사포신 지단백질 입자가 자가 조립될 수 있게 한다. 또한, 여기에서 조립 과정에서 개별 성분은 모두 자유(즉 지지체가 결합되지 않은) 형태로 존재하고 사포신 지단백질 입자로의 자가 조립은 액체 환경에서 관련된 모든 입자 성분의 자유롭고 무작위적인 움직임을 기반으로 한다.
WO 2014/095576 A1, WO 2015/036549 A1 및 WO 2018/033647 A1이 이전의 나노디스크 기술에 비해 많은 장점을 갖는 사포신 단백질로부터 유도된 새로운 부류의 나노입자를 제공함으로써 상당한 개선을 제시하지만, 여전히, 사포신 지단백질 입자의 제조 방법의 추가적인 개선이 필요하다.
사포신 지단백질 입자를 상업적으로 사용하기 위해서는 적은 제조비로 대량 공급이 필요하다. 따라서, 효율성, 비용 및 자원 사용 측면에서 사포신 지단백질 입자를 조립하는 개선된 방법이 필요하다.
전술한 제약 및 생명 과학 연구에서 기술 플랫폼의 중요성이 증가함에 따라 가용성 나노입자에 혼입된 소수성 제제를 이러한 플랫폼에서 사용할 수 있음은 중요하다. 그러나, 이는 종종 바이오센서 적용례의 경우와 같이 지지체에 나노입자의 부동화를 필요로 한다.
사포신 지단백질 입자를 제조하기 위한 선행 기술 방법은 나노입자의 효율적이고 비용 및 자원 절약적 제조에 더욱 최적화될 수 있다. 특히, 선행 기술의 방법은 입자 조립 동안 액체 환경에서 출발 물질의 제한되지 않은 이동성을 요하고 전제한다. 더욱이, 선행 기술은 다른 입자 조립 반응에서의 사용을 위해 잉여 입자 성분을 용이하게 재활용할 수 있는 가능성을 제공하지 않는다.
본 발명의 목적은 이러한 결점 중 하나 이상을 해결하는 것이다.
발명의 요약
가장 일반적으로, 본 발명의 근간이 되는 과제는 사포신 지단백질 입자를 제조하기 위한 개선된 비용 및 자원 절약적인 방법의 제공에 있다.
이 문제는 청구범위의 청구항 1에 정의된 방법에 의해 해결된다. 유리한 양태는 종속항 및 본원의 하기에 추가로 기재되어 있다.
본 발명은
제조되는 사포신 지단백질 입자가
사포신 유사 단백질;
지질; 및
임의적으로, 상기 지질과는 상이한 소수성 제제
를 포함하는 사포신 지단백질 입자의 제조 방법으로서,
(I) (a) 지질, 및 임의적으로 소수성 제제를 제공하는 단계;
(b.1) 액체 환경에서 상기 사포신 유사 단백질을 지지체에 선택적으로 결합시킬 수 있는 지지체를 상기 사포신 유사 단백질과 접촉시키는 단계;
(c.1) 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 유사 단백질을 상기 지질, 및 임의적으로 상기 소수성 제제와 접촉시켜 상기 지지체에서 상기 사포신 지단백질 입자가 자가 조립되게 하는 단계; 및
(d) 임의적으로, 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 지단백질 입자를 용리시키는 단계
를 포함하거나, 다르게는
(II) (a) 상기 소수성 제제 및 상기 지질을 제공하는 단계;
(b.2) 상기 소수성 제제를 지지체에 선택적으로 결합시킬 수 있는 지지체를 상기 소수성 제제와 접촉시키는 단계;
(c.2) 상기 지지체가 결합된 상기 소수성 제제를 상기 사포신 유사 단백질과 접촉시켜 상기 지지체에서 상기 사포신 지단백질 입자가 자가 조립되게 하는 단계; 및
(d) 임의적으로, 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 지단백질 입자를 용리시키는 단계
를 포함하는 제조 방법을 제시한다.
본 발명에 따른 방법에서, 소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질은 지지체에 선택적으로 결합되고, 입자 조립은 이러한 지지체가 결합된 상태에서 지지체가 결합된 소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질을 사포신 지단백질 입자의 나머지 성분과 접촉시킴으로써 일어나는데, 이는 지지체에서 사포신 지단백질 입자가 자가 조립되게 한다. 이는 개별 성분이 모두 자유(즉 지지체에 결합되지 않은) 형태로 존재하고 이의 사포신 지단백질 입자로의 자가 조립이 액체 환경에서 관련된 모든 입자 성분의 자유롭고 무작위적인 움직임을 기반으로 하는 조립 방법에 의존하는 선행 기술의 방법과는 상이하다.
본 발명에 따른 방법은 사포신 유사 단백질 또는 소수성 제제가 지지체에 선택적으로 결합되어 지지체가 결합된 사포신 지단백질 입자가 직접 생성되거나 나중에 조립된 입자로부터 용리될 수 있다는 장점을 가진다. 이는 형성된 살리프로(salipro) 입자의 양을 미리 결합된 입자 성분의 양, 즉 결합된 사포신 유사 단백질 또는 결합된 소수성 제제의 양으로 제한한다. 결과적으로, 결합되지 않은 상태로 남아 있는 모든 물질은 재활용될 수 있다. 재활용은 각각 단계 (b.2) 및 (b.1)에서 지지체에 결합되지 않은 사포신 유사 단백질 또는 소수성 제제와 관련될 수 있다. 그러나, 재활용은 또한 단계 (c.1)/(c.2)에서 살리프로 입자가 자가 조립되게 하기 위해 지지체 결합 물질과 접촉했지만 입자에 혼입되지는 않은 잉여 입자 성분과 관련될 수 있다. 이러한 "미사용" 성분의 재활용은 비용과 자원을 절약하는 입자 조립을 가능하게 한다.
지지체에서 사포신 지단백질 입자를 직접 조립하는 것은 입자가 지지체 결합 상태로 사용되어야 하는 경우 특히 유리하다. 이는 바이오센서 적용례, 특히 표면 플라스몬 공명과 같은 광학 바이오센서 적용례와 같은 다수의 칩 기반 분석 적용례의 경우이다. 이는 더 자세히 후술된다. 과거에는, 자유 사포신 지단백질 입자가 선행 기술의 방법에 의해 먼저 제조된 후, 지지체에 부동화시키기 위해 제2의 커플링 단계가 필요하였다. 본 발명의 방법에 의해, 지지체에서 실제 입자 조립을 수행하는 것이 가능하여 추가 비용 및 방법 단계를 절약할 수 있다.
하나의 입자 성분, 즉 사포신 유사 단백질 또는 소수성 제제가 지지체에 결합될 때에도 살리프로 입자가 조립될 수 있다는 것은 놀라운 일이었다. 지지체에 대한 입자 성분 중 하나의 결합은 용액에서 다른 입자 성분과 접촉하는 자유도와 입자 성분과의 공간적 상호작용에 대한 자유도를 제한한다. 결과적으로, 효율과 관련하여 입자 조립의 손상, 궁극적으로는 수득된 입자의 전체 수율에도 영향을 미침이 예상되었다.
사포신 지단백질 입자 조립은 (예컨대 고도로 정렬된 나노막 이중층 구조로 자유 지질의 무작위 운동으로부터) 사포신 단백질 구조 및 지질 조직의 상당한 재배열을 포함하는 것으로 가정되어야 함을 염두에 두어야 한다. 사포신 단백질은 닫힌 지질이 없는 형태에서 열린 지질이 결합된 상태로 전환될 때 구조적 변화를 겪을 가능성이 있다. 입자 자가 조립은 사포신 유사 단백질이 입자에 포함될 지질과 소수성 제제를 포획하고 포용하는 단계를 포함하는 것으로 여겨진다. 이러한 자가 조립이 용액에서 일어남이 알려진 반면, 주요 입자 성분 중 하나(즉 사포신 단백질 또는 소수성 제제)가 고체 지지체에 부동화될 때 동일하게 잘 작동하고 빠르게 작동한다는 것은 전혀 예상치 못한 일이었다.
시간이 경과에도 균일한 품질 및 조성을 유지하는 지지체가 결합된 살리프로 입자를 제조하는 용이하고 신속하고 효율적인 방법을 제공하는 본 발명에 따른 방법으로 고품질의 지지체가 결합된 살리프로 입자를 수득할 수 있음을 발견한 것은 예상치 못한 일이었다. 본 발명은 원칙적으로 살리프로 입자의 조립과 커플링을 결부시킴으로써 지지체가 결합된 살리프로 입자를 수득하기 위한 보다 효율적이고 "직접적인 방법"을 제공한다. 이러한 방법으로 소수성 제제는 하나의 연속적 방법에서 자연적인 막 환경을 모방한 안정한 입자로 가용화될 수 있고 동시에 랩온어칩 또는 바이오센서 적용례(예컨대 SPR)와 같은 적용례에 직접 사용하기 위해 지지체에 부동화될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 사포신 지단백질 입자는 지지체가 결합된 형태로 직접적으로 존재한다는 점만 제외하고는 원칙적으로 선행 기술로부터 공지된 것과 동일하다. 사포신 지단백질 입자는 또한 본원에서 "살리프로 입자"로 지칭된다. 이들은 사포신 유사 단백질, 소수성 제제 및 지질을 포함하는 나노입자이다. 이들 성분 및 이의 유리한 양태는 하기 추가로 정의될 것이다. 사포신 유사 단백질은 지질 상호작용 단백질의 주지된 보존된 SAPLIP 과에 속하거나 이의 유도체 또는 이로부터 절단된 형태이다.
본 발명자들의 실제 실험은 살리프로 입자의 크기가 포함된 소수성 제제 및 지질의 성질, 예컨대 포함된 막 단백질의 크기에 따라 자가 조절된다는 것을 밝혀냈다. 살리프로 입자는 크기가 놀라울 정도로 유연하다. 또한, 본 발명에 따른 방법에서, 살리프로 입자는 포함된 소수성 제제의 성질에 맞게 크기를 조정하는 것으로 관찰되었다. 이는 다른 비-사포신 유래의 선행 기술 입자의 크기 제한보다 유리하다. 이러한 유연성은 또한 (다합체) 막 단백질과 같은 매우 큰 소수성 제제의 통합을 가능하게 한다. 특히 이들의 경우, 본 발명의 방법은 자연적인 환경(예컨대 막 지질 또는 막 단백질과 관련되고 잠재적으로 단백질의 구조 및/또는 기능을 유지하는 데 필요한 다른 세포 성분)에서 재구성될 수 있다는 장점을 가진다.
놀랍게도 살리프로 입자는 어느 정도의 열안정성을 나타내고 지지체에 결합될 때 관찰할 수 있는 주요 품질 저하 없이 동결건조 및 재수화에 순응하는 것으로 보인다. 이는 본 발명의 방법에 의해 수득된 살리프로 입자가 휴대성 및 저장 안정성이 문제가 되는 적용례에서 사용될 수 있게 한다. 본 발명의 방법으로 미리 맞춤 제작할 수 있고 저장하고 나중에 최종 사용자에게 배송할 수 있는 지지체 결합 살리프로 입자를 수득하는 것이 가능하다. 예컨대, 동일한 칩을 여러 번 재사용하는 랩온어칩 실험과 같이 더 오랜 기간 동안 적용례에 사용할 수도 있다.
본 발명의 방법으로 수득된 지지체 결합 살리프로 입자는 생리학적 pH에서 다양한 지질, 막 단백질 및 소수성 화합물을 혼입할 수 있어 가용성이지만 수성 환경에서 안정한 지지체가 결합된 나노규모 복합체를 생성할 수 있는 것으로 입증되었다. 지금까지 시험된 소수성 제제, 특히 다수의 복잡한 막 단백질의 경우 지지체에 결합된 살리프로 입자로의 혼입은 생물학적 기능에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 이들 중 다수의 경우 살리프로 입자로의 혼입은 소수성 제제의 천연 막 환경을 효율적으로 모방하므로 생물학적 기능에 긍정적인 영향을 미친다.
본 발명은 또한 생물학적 기능의 손상 또는 손실 없이 지지체에 대한 직접 부동화가 불가능한 소수성 제제가 본 발명의 방법 (I)에 따라 제조된 살리프로 입자에 혼입되어 간접적으로 부동화될 수 있다는 장점을 제공한다. 즉 여기서 살리프로 입자는 소수성 제제를 통하지 않고 사포신 유사 단백질의 결합 잔기를 통해 지지체에 결합된다. 이는 소수성 제제가 여전히 지지체에 효과적으로 결합된 상태에서 지지체와 직접 접촉하지 않고/않거나 변형되지 않은 상태로 유지되도록 한다.
전술한 바와 같이, 선택적으로 지지체로부터 용리될 수 있는 지지체 결합 살리프로 입자의 제공은 랩온어칩 또는 바이오센서(예컨대 SPR) 적용례와 같은 칩 기반 적용례에서 매우 유용한 도구이다.
소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질을 지지체에 선택적으로 결합시키고 이들을 각각의 다른 필수 입자 성분과 접촉시킴으로써, 본 발명의 방법은 수용액에서 넓은 pH 범위에 걸쳐, 특히 생리학적 pH에서 안정한 살리프로 입자를 조립하는 강력한 기술을 제공하고, 포포빅 등의 선행 기술의 교시에 따라 합성 제조된 리포솜으로부터 수득된 3.2 nm 사포신 A 유래 지단백질보다 더 큰 입자를 가능하게 것으로 제시된다.
서론에서 기재한 바와 같이, 치료 개발에서 막 단백질의 중요성은 무세포 배지, 바람직하게는 세제가 없는 환경에서 막 단백질을 조사하기 위한 혁신적인 방법의 발견을 필요로 한다.
본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 살리프로 입자는 이러한 요건을 충족시킨다. 일단 수득된 살리프로 입자는 무세포 배지 및 세제가 없는 환경에서 안정적이고 나중에 사용할 수 있도록 지지체에 직접 결합된다.
본 발명의 특히 유리한 양태에서, 사포신 지단백질 입자에 혼입될 소수성 제제 및 지질은 소수성 제제 및 사포신 지단백질 입자로 혼입될 지질을 포함하는 생물학적 막의 형태로 제공된다. 특히, 바이러스 막, 고세균 막, 진핵생물 막 또는 원핵생물 막은 본 발명의 방법에서 소수성 제제 및 지질에 대한 공급원 물질로서 직접 사용될 수 있다. 생물학적 막은 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 형태로 제공될 수 있고, 이들 모두는 온전하거나, 양친매성 제제로 처리되거나, 용해될 수 있다. 양친매성 제제는 세제, 양친매성 펩티드, 양친매성 중합체, 기타 양친매성 화합물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 양친매성 중합체의 예는 말레산 공중합체, 특히 스티렌-말레산 공중합체(SMA) 또는 다이이소부틸렌-말레산 공중합체(DIBMA)이다. 양친매성 펩티드와 양친매성 중합체는 특수 세제로 간주될 수 있다. 적합한 SMA는 예컨대 문헌[Postis, Vincent, et al. "The use of SMALPs as a novel membrane protein scaffold for structure study by negative stain electron microscopy. "Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1848.2 (2015): 496-501]에 기재되어 있다. DIBMA는 예컨대 아나트레이스(Anatrace)로부터 BMA101로서 시판된다. 바람직하게는, 양친매성 제제는 본원에 정의된 세제이다. 바람직하게는, 세포는 진핵세포, 특히 비인간 동물 또는 인간 세포이다. 놀랍게도 본 발명에 이르는 연구는 생물학적 막의 정제가 필요하지 않음을 보였다. 오히려, 본 발명의 방법을 사용할 때, 사포신 지단백질 입자는 온전한, 양친매성 제제-처리된, 또는 용해된 세포, 바이러스 또는 세포 소기관으로부터 직접 제조될 수 있다.
본 발명의 방법에서 출발 물질로서 생물학적 막을 사용함으로써, 소수성 제제는 본래의 막 환경과 함께 살리프로 입자에 혼입될 수 있다. WO 2018/033647 A1 의 방법과 비교하여, 본 발명의 방법의 대안 (II)는 대상 소수성 제제를 포함하는 입자를 다시 단리할 필요가 있는 전체 막 단백질체(proteome)/지질체(lipidome)를 나타내는 살리프로 입자의 전체 라이브러리가 아닌, 대상 소수성 제제를 포함하는 살리프로 입자만이 제조된다는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 방법은 지지체 결합 입자가 간단하고, 단순화되고, 연속적인 "1-단계 방법"으로 수득될 수 있다는 점에서 WO 2018/033647 A1에 비해 장점이 있고, 이는 특히 살리프로 입자가 지지체가 결합된 형태로 사용되는 경우 비용 효과적이고 바람직하다.
본 발명의 방법의 대안 (I)에서 출발 물질로서 생물학적 막을 사용함으로써, 상이한 막 지질 및 막 단백질 조성을 갖는 사포신 지단백질 입자의 이종 혼합물을 포함하는 살리프로 입자의 라이브러리를 수득할 수 있다. WO 2018/033647 A1의 방법과 비교하여, 본 발명의 방법의 이러한 양태는 지지체 결합 입자가 연속적인 "1-단계 방법"으로 수득될 수 있다는 점에서 WO 2018/033647 A1에 비해 장점이 있고, 이는 특히 살리프로 입자가 지지체가 결합된 형태로 사용되는 경우 비용 효과적이고 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 살리프로 입자 또는 살리프로 입자의 라이브러리는 의약용, 진단 방법, 미용 치료용 또는 백신 접종 제형으로 사용하기 위한 것일 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 입자는 진단, 약물 개발, 약물 스크리닝, 약물 발견, 항체 개발, 치료 생물학적 제제의 개발, 막 또는 막 단백질 정제, 막 단백질 발현, 막 및/또는 막 단백질 조사, 막 및/또는 막 단백질의 단리, 동정 및/또는 연구, 또는 지질체 또는 막 단백질체 데이터베이스 생성을 위한 도구로서 사용될 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 제조되는 사포신 지단백질 입자가
사포신 유사 단백질;
지질; 및
임의적으로, 상기 지질과는 상이한 소수성 제제
를 포함하는 사포신 지단백질 입자의 제조 방법으로서,
(I) (a) 지질, 및 임의적으로 소수성 제제를 제공하는 단계;
(b.1) 액체 환경에서 상기 사포신 유사 단백질을 지지체에 선택적으로 결합시킬 수 있는 지지체를 상기 사포신 유사 단백질과 접촉시키는 단계;
(c.1) 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 유사 단백질을 상기 지질, 및 임의적으로 상기 소수성 제제와 접촉시켜 상기 지지체에서 상기 사포신 지단백질 입자가 자가 조립되게 하는 단계; 및
(d) 임의적으로, 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 지단백질 입자를 용리시키는 단계
를 포함하거나, 다르게는
(II) (a) 상기 소수성 제제 및 상기 지질을 제공하는 단계;
(b.2) 상기 소수성 제제를 지지체에 선택적으로 결합시킬 수 있는 지지체를 상기 소수성 제제와 접촉시키는 단계;
(c.2) 상기 지지체가 결합된 상기 소수성 제제를 상기 사포신 유사 단백질과 접촉시켜 상기 지지체에서 상기 사포신 지단백질 입자가 자가 조립되게 하는 단계; 및
(d) 임의적으로, 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 지단백질 입자를 용리시키는 단계
를 포함하는 제조 방법을 제시한다.
본 발명에 따른 방법은 특히 지지체가 결합된 살리프로 입자가 제공될 수 있게 하는데, 여기서 각각의 살리프로 입자는 사포신 유사 단백질, 지질 및 소수성 제제를 포함한다. 지질 및 소수성 제제의 복합 세트가 단계 (a)에서 예컨대 생물학적 막의 형태로 제공되는 경우, 살리프로 입자의 라이브러리는 본 발명의 방법의 대안 (I)에서 생성된다. 상기 라이브러리는 사포신 유사 단백질, 소수성 제제(예컨대 막 단백질) 및 지질을 포함하는 살리프로 입자를 포함하지만 지질 및 사포신 유사 단백질로만 구성된 살리프로 입자도 포함할 수 있다.
사포신 지단백질 입자는 또한 본원에서 "살리프로 입자"로 지칭된다. 그들은 필수 성분으로 사포신 유사 단백질 및 지질을 포함한다. 일반적으로 살리프로 입자는 하나의 유형의 사포신 유사 단백질을 포함한다. 전형적으로, 또한 바람직한 양태에 따라, 본 발명에 따라 제조된 사포신 지단백질 입자는 사포신 유사 단백질, 지질 및 소수성 제제를 포함한다.
또한, 본 발명의 살리프로 입자는 서로 동일하거나 상이할 수 있는 다수의 소수성 제제를 포함할 수 있다. 살리프로 입자에서 동일한 소수성의 다량체의 예는 다량체 막 단백질 또는 복수의 소수성 화합물이다. 살리프로 입자에서 상이한 소수성 제제의 예는 막 단백질과 소수성 화합물을 포함하는 살리프로 입자이다.
본 발명의 살리프로 입자는 서로 동일하거나 상이할 수 있는 복수의 지질을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 사포신 유사 단백질은 사포신 유사 단백질(SAPLIP) 또는 이의 유도체 또는 이로부터 절단된 형태이다. 용어 "사포신 유사 단백질"(SAPLIP)은 당업계에 인지되고 있고 지질 상호작용 단백질의 보존된 사포신 유사 단백질(SAPLIP) 과의 모든 구성원을 포함한다. 약어 "SAPLIP"는 용어 "사포신 유사 단백질"과 동의어로 사용된다. SAPLIP 과는 고도로 보존된 분자내 이황화 결합에 의해 안정화되는 보존된 알파-나선 3차원 구조인 사포신 접힘(saposin fold)이 특징이다(문헌[Munford et al.(1995), Journal of Lipid Research, vol. 36, no. 8, 1653-1663] 및 [Bruhn(2005), Biochem J 389(15): 249-257]). 본 발명에 따른 사포신 유사 단백질(SAPLIP) 과의 구성원의 예는 문헌[Munford et al. (1995), Journal of Lipid Research, vol. 36, no. 8, 1653-1663] 및 [Bruhn(2005), Biochem J 389(15): 249-257]에 기재되어 있고, 상기 문헌 모두는 전체가 본원에 참조로 혼입된다.
리간드가 없는(즉 세제가 없는/지질이 없는) "폐쇄" 상태에서 SAPLIP는 단량체 컴팩트(compact) 4나선 다발 유형 구조인 사포신 접힘을 채택한다. 이 접힘은 폐쇄 apo 형태의 인간 사포신 A의 구조(프로틴 데이터 뱅크(Protein Data Bank, PDB) ID 코드: 2DOB, 문헌[Ahn et al. (2006) Protein Sci. 15: 1849-1857]) 또는 사포신 C의 구조(PDB ID 코드: 1M12; 문헌[de Alba et al.(2003) Biochemistry 42, 14729-14740]), NK-라이신(NK-Lysin)(PDB ID 코드: 1NKL; 문헌[Liepinsh et al.(1997) Nat. Struct. Biol. 4, 793- 795]), 아메바포어 A(Amoebapore A)(PDB ID 코드: 1OF9) 및 그래뉼라이신(granulysin)(PDB ID 코드: 1L9L; 문헌[Anderson et al.(2003) J. Mol. Biol. 325, 355-365])에 의해 예시되는데, 이는 모두 거의 동일하고 용이하게 겹침가능(super-imposable)하다.
SAPLIP는 지질 또는 세제 분자와 같은 리간드에 결합할 때 구조적 변화를 겪는다. 리간드 결합 "개방" 구조에서 SAPLIP는 결합된 지질과 접촉하는 노출된 소수성 표면이 있는 V-형 또는 부메랑-형 구조를 채택한다. 개방형 구조는 선행 기술의 사포신 A 세제 디스크 구조(PDB ID 코드: 4DDJ; 문헌[Popovic et al., PNAS, Vol. 109, No.8 (2012) 2908-2912]) 및 SDS 세제 미셀에 결합된 사포신 C의 구조(PDB ID 코드: 1SN6; 문헌[Hawkins et al. (2005) J. Mol. Biol. 346: 1381-1392])에 의해 예시된다.
살리프로 입자에서, 사포신 유사 단백질은 바람직하게는 양친매성이고, 그 구조의 한 부분은 다소 친수성이고 수성 용매를 향하고 다른 부분은 다소 소수성이고 지질을 포함하는 입자의 소수성 중심을 향한다. 사포신 유사 단백질은 바람직하게는 나선의 한 면에 우세한 더 많은 소수성 잔기(A, C, F, G, I, L, M, V, W 또는 Y) 또는 나선의 다른 면에 더 많은 극성 또는 하전된 잔기(예컨대 D, E, N, Q, S, T, H, K 또는 R)를 갖는 양친매성 α-나선을 특징으로 한다.
본원에 사용된 아미노산 잔기에 대한 약어는 하기와 같다: A, Ala, 알라닌; V, Val, 발린; L, Leu, 류신; I, Ile, 이소류신; P, Pro, 프롤린; F, Phe, 페닐알라닌; W, Trp, 트립토판; M, Met, 메티오닌; G, Gly, 글라이신; S, Ser, 세린; T, Thr, 트레오닌; C, Cys, 시스테인; Y, Tyr, 티로신; N, Asn, 아스파라긴; Q, Gln, 글루타민; D, Asp, 아스파르트산; E, Glu, 글루탐산; K, Lys, 라이신; R, Arg, 아르기닌; 및 H, His, 히스티딘.
선행 기술의 아포지단백질 유래 나노디스크와 달리, 본 발명의 사포신 유사 단백질은 이중 벨트 유사 방법으로 지질을 둘러싸지 않고, 오히려 살리프로 입자는 주어진 살리프로 입자 내 개별 사포신 유사 단백질 사이에 실질적으로 직접적인 단백질-단백질 접촉이 없는 배향으로 배열된 둘 이상의 대략 V-형 또는 부메랑-형 사포신 유사 단백질에 의해 둘러싸인 지질을 포함하는 코어에 의해 유지된다. 이 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 살리프로 입자 내 사포신 유사 단백질 및 지질의 배열이 부피가 큰 소수성 제제 또는 증가하는 양의 지질이 본 발명의 방법에서 입자에 혼입될 때 관찰되는 크기 유연성을 제공한다고 여겨진다.
전술한 양친매성 성질 및 3차원 구조뿐만 아니라 지질과 상호작용하는 능력도 SAPLIP에서 고도로 보존되는 반면, 이는 아미노산 서열 수준에 있어서 매우 다양한데, 서열이 상동성을 정의하는 25 내지 30%의 통상 임계 영역으로 일치한다(참조: 문헌[Bruhn (2005), Biochem J 389 (15): 249-257]의 도 4A 및 4B의 서열 비교, 본원에 첨부된 도면 13a 및 13b에서 재현됨).
지단백질 살리프로 입자에서 사포신 유사 단백질은 주로 구조 단백질로 작용하여 지단백질 살리프로 입자의 구조, 예컨대 디스크 유사 구조를 위한 스캐폴드를 제공한다. 이러한 이유로, 구조적 특징, 특히 SAPLIP의 특징인 사포신-접힘은 단순한 서열 결정자에 비해 본 발명의 사포신 유사 단백질을 정의함에 있어서 더욱 중요하다.
본 발명에 따른 SAPLIP의 예는 사포신 A, B, C 또는 D(예컨대 호모 사피엔스(Homo sapiens), 서열번호 1 내지 4 참조), 에쿠스 카발루스(Equus caballus, E. cabballus), 보스 타우러스(Bos Taurus), 머스 머스큘러스(Mus musculus), 오릭톨라구스 쿠니큘러스(Oryctolagus cuniculus), 래투스 노르베기쿠스(Rattus norvegicus) 또는 제노퍼스 래비스(Xenopus laevis)); 계면활성제 단백질 B(예컨대 호모 사피엔스, 카니스 파밀리아리스(Canis familiaris), 머스 머스큘러스, 오리크톨라구스 쿠니큘러스, 오비스 아리스(Ovis aries) 또는 래투스 노르베기쿠스); 그래뉼라이신(예컨대 호모 사피엔스, 서열번호 5 참조); NK-라이신(예컨대 수스 스크로파(Sus scrofa), 서열번호 6 참조); NK-라이신 오르토로그(예컨대 에쿠스 카발루스 또는 보스 타우러스); 아메바포어(예컨대 엔트아메바 히스톨라이티카(Entamoeba histolytica)); 아메바포어 오르토로그(orthologue)(예컨대 엔트아메바 디스파(Entamoeba dispar) 또는 엔트아메바 인베이던스(Entamoeba invadens)); 아메바포어 유사 단백질(예컨대 파시올라 헤파티카(Fasciola hepatica, F. hepatica)); 내글레리아포어(Naegleriapore)(예컨대 내글레리아 포울러리(Naegleria fowleri)); 클로르노린(Clornorin)(예컨대 클로노르키스 사이넨시스(Clonorchis sinensis)); 프로사포신(예컨대 호모 사피엔스, 에쿠스 카발루스, 보스 타우러스, 머스 머스큘러스, 오리크톨라구스 쿠니큘러스, 래투스 노르베기쿠스 또는 제노퍼스 래비스) 및 MSAP(예컨대 호모 사피엔스)이다.
본 발명에 따라 사용되는 특정 SAPLIP의 서열은 문헌[Bruhn(2005), Biochem J 389(15): 249-257]의 도 4A 및 4B에 제공되고, 본원에 첨부된 도 13a 및 13b에 재현되어 있고, 상기 서열은 본원에 참조로 구체적으로 혼입된다. 본 발명에 따라 사용되는 특정 SAPLIP의 서열은 하기와 같이 서열 목록에 제시된다:
서열번호 출처 단백질 종 아미노산
개수
1 공개 도메인 사포신 A 호모 사피엔스 81
2 공개 도메인 사포신 B 호모 사피엔스 79
3 공개 도메인 사포신 C 호모 사피엔스 80
4 공개 도메인 사포신 D 호모 사피엔스 78
5 공개 도메인 그래뉼라이신 호모 사피엔스 145
6 공개 도메인 NK-라이신 서스 스크로파 129
7 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 아메바포어 C 엔트아메바 히스톨라이티카 77
8 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 디스파포어(Disparpore) C 엔트아메바 디스파 75
9 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 아메바포어 B 엔트아메바 히스톨라이티카 77
10 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 디스파포 B 엔트아메바 디스파 75
11 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 아메바포어 A 엔트아메바 히스톨라이티카 77
12 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 디스퍼포어 A 엔트아메바 디스파 75
13 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A NK-라이신 1 서스 스크로파 83
14 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A NK-라이신 2 서스 스크로파 78
15 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A NK-1 유사(NK-1-like) 에쿠스 카발루스 에쿠스 카발루스 83
16 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 볼라이신(Bolysin) 보스 타우러스 84
17 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A AP 유사 파시올라 헤파티카 파시올라 헤파티카 81
18 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 그래뉼라이신 호모 사피엔스 83
19 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 내글레리아포어 B2 내글레리아 포울러리 83
20 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 클로노린 클론노르키스 사이넨시스 73
21 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A 내글레리아포어 A1 내글레리아 포울러리 83
22 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4A AP 유사 캐노르하브디티스 엘레강스 캐노르하브디티스 엘레강스(Caenorhabditis elegans, C. elegans) 88
23 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 A 호모 사피엔스 83
24 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 A 보스 타우러스 83
25 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 A 머스 머스큘러스 83
26 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 A 갈루스 갈루스(Gallus gallus) 83
27 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 A 다니오 레리오(Danio rerio) 83
28 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 A 제노퍼스 래비스 83
29 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 C 호모 사피엔스 80
30 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 C 보스 타우러스 79
31 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 C 머스 머스큘러스 79
32 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 C 갈루스 갈루스 80
33 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 C 제노퍼스 래비스 79
34 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 C 다니오 레리오 79
35 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 D 호모 사피엔스 81
36 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 D 보스 타우러스 81
37 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 D 머스 머스큘러스 81
38 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 D 갈루스 갈루스 81
39 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 D 다니오 레리오 81
40 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 D 제노퍼스 래비스 81
41 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 B 호모 사피엔스 79
42 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 B 보스 타우러스 79
43 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 B 갈루스 갈루스 83
44 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 B 머스 머스큘러스 83
45 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 B 다니오 레리오 79
46 문헌[Bruhn, 2005]의 도 4B 사포신 B 제노퍼스 래비스 79
본 발명에 따라 사용되는 SAPLIP는 또한 다중도메인 단백질의 일부로서 사포신-접힘을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 이는 예컨대 산성 스핑고마이엘리나제(호모 사피엔스, 캐노르하브디티스 엘레강스, 시오나 인테스티날리스(Ciona intestinalis), 아노펠레스(Anopheles), 드로스필라(Drosophila), 머스 머스큘러스 또는 래투스 노르베기쿠스); GDSL(Gly-Asp-Ser-Leu) 리파제, 예컨대 아실옥시 가수분해효소(호모 사피엔스 또는 래투스 노르베기쿠스); 카운틴(Countin)(딕타이오스텔리움 디스코이데움(Dictyostelium discoideum)); J3-크리스탈린(트라이페달리아 시스토포라(Tripedalia cystophora)) 및 식물 아스파라긴산 프로테아제(비리디플란태(Viridiplantae))이다. 본 발명에 따라 사용되는 추가 SAPLIP는 박테리오신 AS-48일 수 있다. 박테리오신 AS-48은 항균 활성을 나타내고 지질과 결합할 수 있고 나머지 SAPLIP 과 구성원과 동일한 접힘을 갖지만 이황화 가교가 없다.
하기에서, 본 발명은 사포신 유사 단백질로서 사포신 A 또는 이의 유도체 또는 이로부터 절단된 것에 대해 더 상세히 기술되고, 사포신 A 또는 이의 유도체 또는 이로부터 절단된 것이 바람직한 양태인 반면, 본 발명은 이에 의해 제한되지 않는다. 오히려, 명시적으로, 본 발명은 본 발명의 사포신 유사 단백질로서 사포신 유사 단백질(SAPLIP)의 전체 과를 아우른다. SAPLIP 중의 높은 수준의 구조적 및 기능적 보존으로 인해, 사포신 A를 사포신 유사 단백질로 사용하는 특정 양태의 특징 및 장점은 다른 SAPLIP 또는 사포신 유사 단백질로서 이의 유도체 또는 이로부터 절단된 형태를 사용하는 다른 양태에도 적용되는 것으로 나타났다.
바람직한 양태에 따라, SAPLIP는 사포신 A, 사포신 B, 사포신 C 또는 사포신 D이다. 하나의 양태에서, SAPLIP는 사포신 A, 사포신 B 또는 사포신 D이다. 사포신 A, 사포신 B, 사포신 C 또는 사포신 D는 바람직하게는 호모 사피엔스, 에구스 카발루스, 보스 타우러스, 머스 머스큘러스, 오릭톨라구스 쿠니큘러스, 래투스 노르베기쿠스 또는 제노퍼스 래비스로부터의 사포신 A, 사포신 B, 사포신 C 또는 사포신 D이다. 하나의 양태에서, SAPLIP는 인간 유래의 것이다(즉 호모 사피엔스 SAPLIP).
바람직한 양태에서, SAPLIP는 사포신 A, 바람직하게는 호모 사피엔스, 에구스 카발루스, 보스 타우러스, 머스 머스큘러스, 오릭톨라구스 쿠니큘러스, 래투스 노르베기쿠스 또는 제노퍼스 래비스로부터의 사포신 A, 특히 바람직하게는 인간 사포신 A이고, 이의 아미노산 서열은 서열번호 1로서 제시된다. LDAO-세제 복합체로서의 사포신 A의 발현, 정제 및 결정화는 예컨대 문헌[PNAS, Vol. 109, No.8 (2012) 2908-2912 (Popovic et al.)]에 기재되어 있는 바와 같다.
하나의 양태에 따라, 사포신 유사 단백질은 SAPLIP의 전장 서열을 포함한다. 또다른 양태에서, 사포신 유사 단백질은 SAPLIP의 유도체, 특히 각 SAPLIP의 전장 서열에 대해 적어도 20, 25, 30, 40, 50 또는 60%, 바람직하게는 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 특히, 사포신 유사 단백질은 SAPLIP의 전장 서열에 대해 적어도 80%, 85%, 90% 또는 95%의 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
SAPLIP의 유도체 또는 이로부터 절단된 형태는 청구범위 및 본원에 추가로 상세하게 특정된 본 발명의 방법에서 살리프로 입자로 자가 조립될 수 있는 한 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이는 과도한 부담 없이 본원에 기재된 양태에 따라 당업자에 의해 용이하게 시험될 수 있다.
하나의 양태에서, 사포신 유사 단백질은 청구범위의 청구항 1의 방법에서 사포신 지단백질 입자를 형성할 수 있는 사포신 A, 사포신 B, 사포신 C, 사포신 D 또는 이의 유도체 또는 이로부터 절단된 형태이다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성"은 점수화 매트릭스, 예컨대 블로섬62(Blosum62) 매트릭스(문헌[Henikoff S. and Henikoff JG., P. N. A. S. USA 1992, 89: 10915-10919]에 기재되어 있음)를 사용하여 서열의 최적 정렬에 의해 계산될 수 있다. 블로섬62 유사성 매트릭스 및 니들만(Needleman) 및 분쉬(Wunsch)의 알고리즘(문헌[J. Mol. Biol. 1970, 48: 443-453])을 사용하는 두 서열의 백분율 동일성 및 최적 정렬의 계산은 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, GCG, 미국 위스콘신주 매디슨)의 GAP 프로그램을 사용하여, 상기 프로그램의 기본 매개변수를 사용하여 수행할 수 있다. 아미노산 정렬에 대한 비교로 EMBL-온라인-툴(EMBL-online tool) "앰보스 스트레쳐(EMBOSS Stretcher)"(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_stretcher/)가 프로그램 기본 설정을 사용하여 사용된다.
또다른 양태에서, SAPLIP의 유도체는 각각의 SAPLIP의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 예컨대, SAPLIP 유도체는 1 내지 40개, 바람직하게는 1 내지 30개, 특히 1 내지 20개 또는 1 내지 15개의 아미노산이 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환된 특정 SAPLIP의 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "결실"은 각각의 출발 서열로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아미노산 잔기의 제거를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "삽입" 또는 "부가"는 각각의 출발 서열에 대한 1, 2, 3, 4 또는 5개 이상의 아미노산 잔기의 삽입 또는 부가를 지칭한다.
본원에서 사용된 용어 "치환"은 특정 위치에 위치한 아미노산 잔기를 상이한 아미노산 잔기로 교환하는 것을 의미한다.
바람직한 양태에서, SAPLIP의 유도체 또는 이로부터 절단된 형태는 하기로부터 선택된다:
(i) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 전장 서열에 대해 적어도 20%의 서열 동일성을 갖는 단백질; 특히 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 전장 서열에 대해 적어도 20%의 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 청구범위의 청구항 1의 방법에 사용될 때 지질과 함께 지질단백질 입자로 자가 조립될 수 있는 단백질; 및
(ii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 서열을 포함하는 단백질로서, 1 내지 40개의 아미노산이 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환된, 단백질.
본원에 기재된 서열 동일성은, 예컨대 사포신 유사 단백질의 유도체가 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 전장 서열에 대해 적어도 20%의 서열 동일성을 갖는 양태이고, 상기 단백질이 양친매성이고 하나 이상의 α-나선을 형성하고 청구범위의 청구항 1의 방법에 사용될 때 지질과 함께 지단백질 입자로 자가 조립될 수 있는 특징과 조합될 수 있다.
추가 양태에 따라, 사포신 유사 단백질은 서열번호 1의 하나 이상의 단편을 포함하는 사포신 A 의 유도체이다. 바람직한 단편은 사포신 A의 나선 a1, a2, a3 및 a4에 상응하되, 상기 나선 a1은 아미노산의 하기 연속 스트레치에 의해 형성되고: "SLPCDICKDVVTAAGDMLK"; 나선 a2는 아미노산의 하기 연속 스트레치에 의해 형성되고: "ATEEEILVYLEKTCDWL"; 나선 a3은 아미노산의 하기 연속 스트레치에 의해 형성되고: "PNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMS"; 나선 a4는 아미노산의 하기 연속 스트레치에 의해 형성된다: "PGEVCSAL". 특정 양태에 따라, 사포신 A의 유도체는 사포신 A의 나선 a1, a2, a3, a4 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩티드이고, 특히 상기 폴리펩티드는 사포신 A의 나선 a1, a2 및 a3의 서열을 포함한다. 나선 a1, a2, a3, a4와 같은 사포신 A의 단편은 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환을 가질 수 있다.
또다른 양태에 따라, 사포신 유사 단백질은 이전 단락에서 사포신 A와 관련하여 정의된 단편 중 하나 이상을 포함하는 사포신 유사 단백질의 유도체이되, 상기 단편은 각각의 사포신 유사 단백질의 상응하는 서열로 대체된다.
하나의 양태에 따라, SAPLIP의 유도체 또는 이로부터 절단된 형태가 본 발명에 따른 사포신 유사 단백질로서 사용될 때, 상기 유도체 또는 이로부터 절단된 형태는 양친매성이어야 하고, 하나 이상의 α-나선을 형성해야 한다. 추가로 또는 대안적으로, 상기 유도체 또는 이로부터 절단된 형태는 본 발명에 따른 방법에 사용될 때 지질과 함께 지단백질 입자로 자가 조립될 수 있어야 한다. 본원에 사용된 용어 "양친매성"은 친수성 영역 및 소수성 영역을 모두 갖는 폴리펩티드 또는 분자를 지칭한다.
바람직하게는, SAPLIP의 유도체가 사용되는 경우, SAPLIP 형성 구성원 사포신 A의 6개 시스테인에 상응하는 6개 시스테인 잔기 중 적어도 3개, 4개, 5개 또는 모두가 존재해야 한다. 이와 관련하여 문헌[Bruhn(2005), Biochem J 389(15): 249-257]의 도 4A 및 4B의 서열 비교에서 시스테인의 위치를 참조한다. 상기 브룬(Bruhn)의 문헌에서 도 4A 및 4B는 본원에 첨부된 도 13a 및 13b에 재현되어 있고 본원에 참조로 구체적으로 혼입된다.
또한, 본 발명에 따른 SAPLIP는 하나 이상의 비-천연 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 펩티드 결합이 대사 분해에 더 내성인 구조로 대체된 펩티드 모방 구조를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 (a)
본 발명의 방법의 단계 (a)에서, 살리프로 입자에 혼입될 지질, 및 임의적으로, 소수성 제제가 제공된다. 중요하게는, 추가 지질 및/또는 소수성 제제가 방법의 다른 단계에서 제공될 수도 있다.
단수형 용어는 일반적으로 "하나 이상" 또는 "하나 이상의 유형"의 의미로 본원에서 사용된다. 예컨대, 하나 이상의 소수성 제제가 본 발명의 살리프로 입자에 포함되고 상응하게 단계 (a)에서 제공된다.
소수성 제제 및/또는 지질은 다른 구성성분과 함께 조성물에 제공될 수 있다. 바람직하게는, 소수성 제제 및/또는 지질은 액체 조성물로 제공된다. 하나의 양태에서, 액체 조성물은 유기 용매를 포함한다. 또다른 양태에서, 액체 조성물은 수성 조성물이다. 또다른 양태에서, 액체 조성물은 세제를 포함하는 수성 조성물이다. 추가 양태에서, 액체 조성물은 소수성 제제 및/또는 지질이 수상에 분산되어 있는 분산액이다.
소수성 제제 및 지질은 함께 제공되거나 별도의 형태로 제공될 수 있다. 함께 제공되는 경우 생물학적 막 또는 생물학적 막 유래 조성물의 형태로 제공될 수 있다. 예컨대, 지질 및 임의적으로, 소수성 제제는 세포 막, 엔도솜, 엑소솜, 바이러스 유사 입자 또는 리포솜의 형태로 제공될 수 있다. 상이한 지질 및/또는 상이한 소수성 제제가 제공되는 경우, 이들은 함께 또는 별개의 형태로 다시 제공될 수 있다. 생물학적 막은 본 발명의 방법에 사용될 때 온전한, 양친매성 제제-처리된, 또는 용해된 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 형태로 제공될 수 있다.
소수성 제제는 입자에 포함된 지질과 상이하다. 이는 소수성 제제 자체가 지질 또는 변형된 지질인 경우 입자에 포함된 대부분의 지질(즉 입자에 존재하는 지질의 총량을 기준으로 하여 50 mol% 초과)이 소수성 제제를 형성하는 지질과는 상이해야 함을 의미한다. 하나의 양태에서, 소수성 제제는 지질이 아니고, 또다른 양태에서, 소수성 제제는 지질도 세제도 아니다.
본원에 사용된 "소수성 제제"는 실질적으로 소수성인 임의의 분자를 의미한다. "소수성"은 기술 용어이고 물과 섞이지 않거나 물에 대한 친화성/용해성이 크게 결여된 특성을 나타낸다. 소수성 제제는 소수성 유기 화합물 및/또는 소수성 생체분자일 수 있다. 이는 치료적으로 또는 생물학적으로 활성인 소수성 제제, 또는 살리프로 입자의 디스크 형태를 단순히 안정화시키는 소수성 제제일 수 있다. 소수성 제제는 제제, 즉 물에 완전히 침투하지 않거나 물에 가용성으로 남아 있고/거나 수상에 존재할 때 소수성 환경으로 응집 및/또는 분배되는 경향이 있는 제제, 즉 화합물 및/또는 생체분자이다. 살리프로 입자에 포함됨으로써, 소수성 제제는 입자 내부의 소수성 내부에서 효과적으로 가용화된다. 이로써 예컨대 촉매 활성 또는 리간드 결합과 같은 고유 기능들을 유지할 수 있다.
살리프로 입자에 포함된 소수성 제제는 일반적으로 지질 이중층의 소수성 부분과 회합되거나 통합될 수 있는 하나 이상의 소수성(예컨대 친유성) 영역을 포함한다. 이와 같이 소수성 제제는 또한 키메라 분자일 수 있는데, 여기서 지질 이중층의 소수성 부분과 회합되거나 통합될 수 있는 소수성(예컨대 친유성) 잔기, 모듈 또는 화합물은 또다른 분자에 부착되어 있다. 예컨대, 지질-커플링된 또는 지방산-커플링된 화합물, 특히 지질-커플링된 또는 지방산-커플링된 약물이 본 발명에 따른 소수성 제제로서 사용될 수 있다. 이러한 경우, 화합물 또는 약물 자체가 반드시 소수성일 필요는 없다. 일부 양태에서, 소수성 제제의 적어도 일부는 입자 내부에서 지질 분자의 소수성 잔기(예컨대 지방 아실 쇄) 사이에 삽입되거나 내부로 침투한다.
하나의 양태에서, 소수성 유기 화합물 및/또는 소수성 생체분자는 예컨대 생물학적 활성제, 약물, 약물의 활성 성분, 화장품의 활성 성분, 식물 보호 제품의 활성 성분, 식이 및/또는 영양 보충제, 진단 프로브, 조영제, 라벨 및 표시기일 수 있다.
살리프로 입자에 포함되어 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있는 소수성 약물은 수성 환경에서 용해도가 낮은 임의의 약물일 수 있다. 수성 환경에서 낮은 용해도는 특정 조건, 예컨대 특정 pH 또는 온도 범위 또는 소수성 제제의 농도가 특정 임계값을 초과하는 경우에만 명확할 수 있다.
예컨대 살리프로 입자에 포함될 수 있고 이를 필요로 하는 환자에게 투여될 수 있는 약물은 특히 암, 염증성 또는 감염성 병태, 심혈관 질환, 신경 장애 및 류머티즘의 치료를 위한 것과 같다. 소수성 제제는 항산화제, 비타민, 항증식제, 호르몬, 스테로이드 또는 효소일 수 있다. 제초제 또는 살진균제 화합물일 수 있다.
살리프로 입자에 혼입될 수 있는 소수성 약물의 일부 특정 예는 하기를 포함한다: 커큐민; 설폰아미드(예컨대 설폰아미드, 설파메톡사졸 및 설파세트아미드); 트라이메토프림(특히 설파메톡사졸과 조합된 것); 퀴놀린(예컨대 노르플록사신 및 시프로플록사신); 베타-락탐 화합물(예컨대 페니실린(예컨대 페니실린 G, 페니실린 V, 앰피실린, 아목시실린 및 피페라실린), 세팔로스포린(예컨대 세팔로스포린 C, 세팔로틴, 세폭시틴 및 세프타지딤), 기타 베타-락탐 항생제(예컨대 이미페넴) 및 아즈트레오남); 베타 락타마제 억제제(예컨대 클라불란산); 아미노글리코시드(예컨대 겐타마이신, 아미카신, 토브라마이신, 네오마이신, 카나마이신 및 네틸마이신); 테트라사이클린(예컨대 클로르테트라사이클린 및 독시사이클린); 클로람페니콜; 매크롤라이드(예컨대 에리트로마이신); 또는 항균용 및 일부 경우 항진균 감염용 기타 항생제(예컨대 클린다마이신, 폴리믹신 및 바시트라신); 폴리엔 항생제(예컨대 암포테라이신 B, 니스타틴, 하마이신); 플루시토신; 이미다졸 또는 트라이아졸(예컨대 케토코나졸, 미코나졸, 이트라코나졸 및 플루코나졸); 항진균성 질환, 예컨대 아스페르길루스증, 칸디다증 또는 히스토플라스마증을 위한 그리세오풀빈; 항바이러스 질환을 위한 지도부딘, 아사이클로비르, 간사이클로비르, 비다라빈, 이독수리딘, 트리플루리딘, 인터페론(예컨대 인터페론 알파-2a 또는 인터페론 알파-2b) 및 리바비린; 아스피린, 페닐부타존, 페나세틴, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 인도메타신, 술린닥, 피록시캄 및 디클로페낙; 염증성 질환, 예컨대 관절염을 위한 금 및 스테로이드성 소염제; ACE 억제제(예컨대 캅토프릴, 에날라프릴 및 리시노프릴); 유기 니트레이트(예컨대 아밀 니트라이트, 니트로글리세린 및 이소소르비드 다이니트레이트); 칼슘 채널 차단제(예컨대 딜티아젬, 니페디핀 및 베라파밀); 심혈관 질환을 위한 베타 아드레날린 길항제(예컨대 프로프라놀롤); 이뇨제(예컨대 티아지드, 예를 들어 벤조티아다이아진) 또는 루프(loop) 이뇨제(예컨대 푸로세미드); 교감신경작용제(예컨대 메틸도파, 클로니딘, 구나벤즈, 구아네티딘 및 레세르핀); 혈관 확장제(예컨대 하이드랄라진 및 미녹시딜); 칼슘 채널 차단제(예컨대 베라파밀); 고혈압 치료를 위한 ACE 억제제(예컨대 캡토프릴); 심장 부정맥 치료를 위한 퀴니딘, 프로카인아미드, 리도카인, 엔카이니드, 프로프라놀롤, 에스몰롤, 브레틸륨 및 딜티아젬; 저지방단백혈증 치료를 위한 로보스타틴, 리피토, 클로피브레이트, 콜레스트라이아민, 프로부콜 및 니코틴산; 안트라사이클린(예컨대 독소루비신, 다우노루비신 및 이다비신); 공유 DNA 결합 화합물, 공유 DNA 결합 화합물 및 백금 화합물(예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴); 엽산 길항제(예컨대 메토트렉세이트 및 트라이메트렉세이트); 항대사물질 및 피리미딘 길항제(예컨대 플루오로우라실, 5-플루오로우라실 및 플루오로데옥시우리딘); 항대사물질 및 퓨린 길항제(예컨대 메르캅토퓨린, 6-메르카프토퓨린 및 티오구아닌); 항대사물질 및 당 변형 유사체(예컨대 시타라빈 및 플루다라빈); 항대사물질 및 리보뉴클레오티드 환원효소 억제제(예컨대 하이드록시우레아); 공유 DNA 결합 화합물 및 질소 머스타드 화합물(예컨대 사이클로포스파미드 및 이포스파미드); 공유 DNA 결합 화합물 및 알칸 설포네이트(예컨대 부설판); 니트로소우레아(예컨대 카르무스틴); 공유 DNA 결합 화합물 및 메틸화제(예컨대 프로카바진); 공유 DNA 결합 화합물 및 아지리딘(예컨대 미토마이신); 비공유 DNA 결합 화합물; 비공유 DNA 결합 화합물(예컨대 미톡산트론 및 블레오마이신); 염색질 기능 억제제 및 토포이소머라제 억제제(예컨대 에토포사이드, 테니포사이드, 캄프토테신 및 토포테칸); 염색질 기능 억제제 및 미세소관 억제제(예컨대 빈카 알칼로이드(예를 들어 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈디신 및 파클리탁셀), 탁소테레 또는 기타 탁산); 내분비 기능에 영향을 미치는 화합물(예컨대 프레드니손, 프레드니졸론, 타목시펜, 류프롤라이드 및 에티닐 에스트라다이올) 및 항체(예컨대 헤르셉틴); 유전자(예컨대 p-53 유전자, p16 유전자, MIT 유전자 및 E-카드헤린); 사이토카인(예컨대 인터루킨, 특히 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8 및 IL-12), 종양 괴사 인자(예컨대 종양 괴사 인자-알파 및 종양 괴사 인자-베타), 집락 자극 인자(예컨대 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF) 및 과립구 대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)) 및 인터페론(예컨대 인터페론-알파, 인터페론-베타 1, 인터페론-베타 2 및 인터페론-감마); 암 치료를 위한 올-트랜스(all-trans) 레티노산 또는 다른 레티노이드; 면역억제제(예컨대 사이클로스포린, 면역 글로불린, 설파사진, 메톡살렌 및 탈리도이미드); 당뇨병을 위한 인슐린 및 글루카곤; 골다공증, 고칼슘혈증 및 파제트병(Paget's Diseas)의 치료를 위한 칼시토닌 및 나트륨 알렌드로네이트; 모르핀 및 관련 오피오이드; 메페리딘 또는 동족체; 메타돈 또는 동족체; 오피오이드 길항제(예컨대 날로르핀); 중추 활성 진해제(예컨대 덱스트로메트로판); 통증 관리를 위한 테트라하이드로칸나비놀 또는 마리놀, 리도카인 및 부피비카인; 클로르프로마진 및 프로클로르페라진; 칸나비노이드(예컨대 테트라하이드로칸나비놀) 및 부티로페논(예컨대 드로페리돌); 메스꺼움 및 구토의 치료를 위한 벤즈아미드(예컨대 메토클로프라미드); 항응고제, 항혈전용해제 또는 항혈소판제로서 헤파린, 쿠마린, 스트렙토키나제 및 조직 플라스미노겐 활성화 인자(t-PA); 염증성 장 질환의 치료를 위한 헤파린, 설파살라진, 니코틴, 스테로이드 및 종양 괴사 인자-알파; 흡연 중독 치료를 위한 니코틴; 호르몬 요법을 위한 성장 호르몬, 황체 형성 호르몬, 코르티코트로핀 및 소마토트로핀; 및 일반 아나필락시스를 위한 아드레날린.
당업자는 특정 화합물이 본원 및 WO 2014/095576 A1, 예컨대 실시예 9에 기재된 방법 및 실시예에 의해 살리프로 입자로 잘 혼입되는지를 실험적으로 용이하게 결정할 수 있다. 분광법으로 검출할 수 없는 화합물의 경우, 당업자는 특정 화합물이 살리프로 입자에 잘 통합되는지 여부를 판단하기 위해 예컨대 LC-MS 또는 박층 크로마토그래피에 의존할 수 있다.
소수성 제제를 살리프로 입자에 포함시키는 것의 장점은 입자의 안정한 구조에서 효과적으로 가용화되어 예컨대 대부분의 체액 및 조직에 존재하는 수성 환경에서 소수성 제제의 저장소 및/또는 전달 비히클 역할을 할 수 있다는 점이다. 세제 또는 유기 용매를 통한 고전적인 가용화 수단과 비교할 때, 살리프로 입자는 외부에서 친수성인 반면 소수성 제제는 입자의 소수성 내부에서 효과적으로 가용화된다는 장점을 제공하는데, 이는 소수성 제제가 촉매 활성 또는 리간드 결합과 같은 이의 고유한 기능을 유지할 수 있음을 의미한다. 또한, 대부분의 세제 및 유기 용제와는 대조적으로 살리프로 입자는 생체 적합성으로 보인다.
소수성 유기 화합물 외에도, 지단백질 살리프로 입자는 또한 소수성 잔기를 포함하는 단백질과 같은 소수성 생체분자를 안정적으로 통합할 수 있는 것으로 입증되었다. 바람직한 양태에 따라, 소수성 제제는 소수성 단백질, 특히 막 단백질이다. 막 단백질은 내재성 막횡단 단백질, 내재성 단일체(monotopic) 막 단백질, 말초 막 단백질, 지질 결합 상태의 양친매성 단백질, 지질-고정된(lipid-anchored) 단백질 및 융합된 소수성 및/또는 막횡단 도메인을 갖는 키메라 단백질로부터 선택될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "막 단백질"은 사포신 유사 단백질을 포함하지 않는다.
내재성 막 단백질은 지질 이중층에 영구적으로 결합된 막 단백질이고 일반적으로 막에서 변위되기 위해 세제 또는 무극성 용매가 필요하다. 막관통 단백질은 적어도 한 번 막을 가로질러 걸쳐 있는 내재성 막 단백질이다. 살리프로 입자에 혼입될 수 있는 막횡단 단백질의 예는 G-단백질 결합 수용체(GPCR), 유니포터, 심포터 또는 안티포터와 같은 포터, 이온 채널 또는 효소와 같은 채널이다.
내재성 단일체 막 단백질은 한쪽에서만 막에 영구적으로 부착되고 막을 가로질러 연장되지 않는다. 이 부류에는 α-나선형 막관통 앵커를 통해 막에 연결된 막 단백질이 포함된다. 이의 예는 시토크롬 P450 산화효소와 글리코포린 A를 포함한다.
말초 막 단백질은 지질 이중층 또는 내부에 혼입된 내재성 막 단백질과 일시적으로 또는 간접적으로만 연관된다. 말초 막 단백질은 일반적으로 pH가 높거나 염 농도가 높은 극성 시약으로 처리한 후, 막에서 해리된다. 말초 막 단백질의 예로는 포스포리파제 A2 또는 C, 리폭시게나제 및 시토크롬 c가 있다.
지질-고정된 단백질은 지질화, 특히 프레닐화 또는 GPI 부동화 아미노산 잔기를 통해 지질 이중층에 결합된다. 이의 예는 박테리아 지단백질, G 단백질 및 특정 키나제를 포함한다.
양친매성 단백질은 지질이 없는 수용성 상태와 지질 결합 상태의 두 가지 형태적 상태 이상으로 존재하는 단백질이다. 지질과 결합하면 양친매성 단백질은 가역적 또는 비가역적 막 결합이 되도록 하는 구조적 변화를 겪는다. 양친매성 단백질의 예는 기공 형성 독소 및 항균 펩티드이다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 소수성 제제는 상이한 방법에 의해 수득될 수 있다. 이는 합성 또는 천연 유래일 수 있다. 이는 단계 (a)에서 정제된 형태로 또는 여전히 미정제 형태, 예컨대 미정제 막 또는 미정제 반응 혼합물의 형태로 제공될 수 있다. 이는 단계 (b.2)가 소수성 제제에 대한 수반되는 정제 단계로서 사용될 수 있는 본 발명의 방법의 (II)가 사용되는 경우에 특히 그러하다. 이는 예컨대 단계 (b.2)와 (c.2) 사이에 세척 단계를 수행함으로써 달성될 수 있다. 본원에 사용된 세척 단계는 소수성 제제가 단계 (a)에서 제공되고/되거나 단계 (b.2)에서 지지체와 접촉된 결합되지 않은 조성물의 일부의 제거로 제한될 수 있다.
소수성 제제가 소수성 생체분자인 경우, 천연 공급원으로부터 정제하여 수득할 수 있다. 정제 전략은 당업자에게 알려져 있고 당업자는 달성하고자 하는 정제 목표에 따라 적합한 정제 방법을 선택할 수 있다. 소수성 생체분자의 성질은 정제 방법을 결정하고, 이는 크기 배제 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 이온 교환 크로마토그래피에서와 같이 전하 또는 소수성에 기초한 분리; 및/또는 친화성 크로마토그래피를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "정제된"은 당업계에 인정된 것으로 임의의 특정 순도를 나타내지 않는다. "정제된"은 생물학적 분자가 정제 과정을 거쳤음을 의미한다. 원하지 않는 분자의 임의의 양을 제거하는 것은 정제로 간주된다.
사포신 유사 단백질 및 하나 이상의 소수성 제제 다음으로, 본 발명의 방법에서 수득된 살리프로 입자는 또한 제3의 필수 성분으로서 지질을 포함한다. 살리프로 입자에 혼입될 지질의 적어도 일부는 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 제공된다.
본원에 사용된 용어 "지질"은 당업계에 인식되고 생물학적 유래의 천연 물질 또는 합성 지질을 지칭하되, 지질은 유기 용매에 가용성이거나 부분적으로 가용성이거나 수상에 존재할 때 소수성 환경으로 분할된다. 본원에 사용된 용어 "지질"은 본 발명의 방법에 의해 수득된 사포신 지단백질 입자에서 단일 유형의 지질 분자를 의미하지 않는다.
살리프로 입자는 일반적으로 지질 혼합물을 포함한다. 하나의 양태에서, 살리프로 입자의 지질은 이들이 수득되는 고세균, 바이러스, 원핵생물, 진핵생물 세포 또는 진핵생물 세포 소기관 막에서 천연적으로 발생하는 혼합물이다. 예컨대, 지질은 뇌 지질, 심장 추출물로부터의 지질, 간 추출물로부터의 지질, 효모 추출물로부터의 지질 또는 E.coli 추출물로부터의 지질일 수 있다. 또다른 양태에서, 지질은 합성 유래일 수 있다. 추가 양태에서, 지질은 반합성 유래일 수 있고, 이는 합성 및 천연 지질의 혼합물이 사용되고/되거나 천연 지질이 화학적으로 변형되어, 예컨대 형광 표지된 지질 또는 머리 기(head-group)-개질된 지질, 예컨대 글리코실화된 지질, 작용화된 지질, pH 민감성 지질 또는 접착성 지질이 수득됨을 의미한다. 하나의 양태에서, 살리프로 입자는 적어도 3, 5, 10 또는 20개의 상이한 지질을 포함한다.
바람직한 양태에서, 지질은 양친매성 지질을 포함하거나 이로 이루어진다. 이들은 인지질, 당지질, 스테롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
인지질은 물에 용해되는 극성 부분(인산염 "머리")과 그렇지 않은 소수성 비극성 부분("지질 꼬리")을 가진다. 이 부분들은 글리세롤 잔기에 의해 연결된다. 물에서 인지질은 머리가 물을 향하고 꼬리가 물의 반대 방향을 향하는 클러스터를 구축할 수 있다. 인지질과 당지질의 지방 쇄는 통상적으로 짝수개, 전형적으로는 16 내지 20개의 탄소 원자를 포함한다. 16개 및 18개 탄소 지방산이 가장 통상적이다. 지방산은 포화되거나 불포화될 수 있다. 이중 결합의 구성은 일반적으로 소위 시스 구성이다. 시스- 및 트랜스-이성질화는 칸-잉골드-프릴로그(문헌[CIP; Cahn, R.S. & Ingold, C.K.; Prelog, V., "Specification of Molecular Chirality". Angewandte Chemie International Edition, 5 (4), p.385-415, 1966])에 따라 분자의 작용기의 상대적 배향을 야기하는 입체 이성질화를 지칭하는 유기 화학 용어이다. 또한, 세포 막에 존재하는 전형적인 지방산은 문헌[Alberts et al., "The Cell", 4th edition, Macmillian Magazines Ltd, 2002 on pages 61 and 62]에 기재되어 있다. 막 지질의 추가 예는 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린, 예컨대 POPC(1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린), 포스파티딜에탄올아민, 및 포스파티딜세린, 예컨대 POPS(1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린)포스파티딜이노시톨, 및 스핑고미엘린이다.
당지질은 탄수화물이 글리코시드 결합에 의해 부착된 지질이다. 탄수화물은 일반적으로 진핵세포 막의 외부 표면에서 발견된다. 그들은 인지질 이중층에서 세포 외부의 수성 환경으로 확장된다. 당지질의 예는 글리세로당지질, 갈락토지질, 설포지질, 글리코스핑고지질, 글루코세레브로사이드, 설파티드, 강글리오사이드, 글로보사이드, 글리코포스포스핑고지질 및 글리코포스파티딜이노시톨이다.
스테롤은 스테로이드의 하위 그룹이다. 막의 일부인 스테롤은 일반적으로 식물, 동물 및 균류와 같은 진핵세포 막에서 발생한다. 스테롤의 예로는 콜레스테롤, 캄페스테롤, 시토스테롤, 스티그마스테롤 및 에르고스테롤이 있다.
바람직한 양태에 따라, 지질은 지질 이중층 형성 지질 및/또는 생체적합성 지질이다. 본원에 사용된 용어 "생체적합성"은 살아있는 조직에서 독성, 유해성 또는 면역학적 반응을 일으키지 않음으로써 생물학적으로 적합함을 의미한다. 본원에 사용된 "이중층 형성 지질"은 소수성 내부 및 친수성 외부를 갖는 지질 이중층을 형성할 수 있는 지질을 지칭한다. SAPLIP 또는 이의 유도체 또는 이로부터 절단된 형태와 회합되어 입자 구조로 조립될 수 있는 임의의 이중층 형성 지질이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이중층 형성 지질은 인지질, 스핑고지질, 당지질, 알킬인지질, 에터 지질, 및 플라스마로겐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 1개 유형의 이중층 형성 지질 또는 2개 이상의 유형의 혼합물이 사용될 수 있다.
지질은 또한 이중층 형성 지질이 아닌 지질을 포함할 수 있다. 이러한 지질은 비제한적으로 콜레스테롤, 카디오리핀, 포스파티딜에탄올아민(이 지질은 특정 상황에서 이중층을 형성할 수 있음), 옥시스테롤, 식물성 스테롤, 에르고스테롤, 시토스테롤, 양이온성 지질, 세레브로시드, 스핑고신, 세라마이드, 다이아실글리세롤, 모노아실글리세롤, 트라이아실글리세롤, 강글리오사이드, 에터 지질, 알킬인지질, 플라스마로겐, 프로스타글란딘 및 리소인지질을 포함한다.
지질은 상기 열거된 지질의 혼합물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전형적으로, 본 발명의 방법에 사용되는 지질은 적어도 인지질, 당지질, 콜레스테롤 및 이들의 혼합물을 포함한다. 바람직한 양태에 따라, 지질은 특히 진핵세포 또는 윈핵세포에 존재하는 막 중 임의의 하나에 전형적으로 존재하는 진핵 지질 및/또는 원핵 지질이다. 바람직한 지질은 예컨대 인지질, 글리코스핑고지질, 스테롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린(PS), 2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포콜린(POPC), 2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-글리세롤(POPG), 2-올레오일-1-팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE), 다이아실글리세롤, 콜레스테롤, 스핑고미엘린, 갈락토실세라마이드, 강글리오시드, 포스파티딜이노시톨 및 설포갈락토세라마이드 또는 이들의 조합이다.
또다른 양태에서, 지질은 인지질을 포함한다. 적합한 인지질의 예는 비제한적으로 DMPC, DMPG, POPC, 다이팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 다이팔미토일포스파티딜세린(DPPS), 카디오리핀, 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 다이스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 난황 포스파티딜콜린(egg PC), 대두 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산, 스핑고미엘린 및 양이온성 인지질을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용되는 지질은 일반적으로 세포 또는 세포 소기관 막에서 발생하는 지질의 이종 혼합물이다. 그러나, 표적화 잔기 또는 생물활성 잔기와 같은 하나 이상의 결합된 기능적 잔기를 포함하는 변형된 지질일 수 있는 합성 또는 비전형적 지질을 추가로 포함하는 것도 가능하다.
또한, 본 발명의 방법에 사용되는 지질은 천연 지질, 합성 지질, 변형된 지질, 지방, 왁스, 스테롤, 지용성 비타민, 모노글리세리드, 다이글리세리드, 트라이글리세리드, 인지질, 지방산, 글리세로지질, 글리세로인지질, 스핑고지질, 당지질, 폴리케타이드, 스테롤 지질 및 프레놀 지질 또는 이들의 조합을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.
추가 양태에서, 소수성 제제, 지질 및/또는 사포신 유사 단백질 중 하나 이상은 세제-가용화된 상태이다. 하나의 양태에서, 소수성 제제는 세제-가용화된 상태이다. 또다른 양태에서 소수성 제제 및 지질은 세제-가용화된 상태이다. 세제-가용화된 상태는 세제가 수용액에 가용성인 각 성분을 보유 및/또는 유지함을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "세제"는 당업계에 인지되고 본원에 사용된 "지질"의 정의에 포함되지 않는다. 다수의 세제는 지질과 비교하여 유사한 양친매성 일반 구조, 즉 극성 친수성 머리 기 및 비극성 소수성 꼬리를 가지지만, 세제는 단량체의 형태, 용액에서 형성되는 응집체의 유형 및 응집에 필요한 농도에 있어서 지질과는 상이하다. 지질은 일반적으로 구조가 실질적으로 원통형이고, 소수성 꼬리가 차지하는 부피는 극성 머리 기가 차지하는 부피와 유사하다. 세제 단량체는 일반적으로 더 원뿔 형태이고, 소수성 꼬리가 차지하는 부피는 극성 머리 기가 차지하는 부피보다 작다. 세제는 지질이 없는 상태에서 이중층 구조를 형성하지 않고 수용성인 구형 또는 타원형 미셀로 응집되는 경향이 있다(문헌[handbook "Detergents and their uses in membrane protein science"from Anatrace, www.anatrace.com] 참조).
사용될 수 있는 세제는 음이온성, 양이온성, 비이온성, 쌍성이온성(zwitterionic) 및 이들의 혼합물일 수 있다.
전형적인 음이온성 세제는 알킬벤젠설포네이트이다. 이러한 음이온의 알킬벤젠 부분은 친유성이고 설포네이트는 친수성이다. 음이온성 세제는 예컨대 분지형 알킬기 또는 선형 알킬기를 포함할 수 있다. 적합한 음이온성 세제의 예는 데옥시콜산(DOC)과 같은 담즙산, 분지형 나트륨 도데실벤젠설포네이트 및 선형 나트륨 도데실벤젠설포네이트와 같은 알킬벤젠설포네이트, 및 이들의 혼합물이다.
양이온성 세제는 소수성 성분이 있는 음이온성 세제와 유사하지만 음이온성 설포네이트 기 대신에 양이온성 계면활성제는 극성 말단으로 4차 암모늄을 가진다. 암모늄 중심은 양전하를 띤다.
비이온성 세제는 전하를 띠지 않는 친수성 머리 기가 특징이다. 전형적인 비이온성 세제는 예컨대 폴리옥시에틸렌 또는 글리코시드를 기반으로 한다. 전자의 통상적인 예로는 트윈(Tween), 트라이톤(Triton) 및 브리즈(Brij) 시리즈가 있다. 이러한 물질은 에톡실레이트 또는 페길레이트 및 그 대사산물인 노닐페놀로도 공지되어 있다. 글리코시드는 전하를 띠지 않는 친수성 머리 기로 당을 가진다. 예로는 옥틸 티오글루코사이드 및 말토사이드가 있다. 글리코시드 머리 기는 또한 사포닌과 같이 고분자량일 수 있다. 사포닌은 트라이테르펜 또는 스테로이드 아글리콘에 연결된 당 잔기로 구성된다. 사포닌 분자의 비당류 부분에 따라 사포닌은 트라이테르펜 글리코시드, 스테로이드 글리코시드 및 스테로이드 알칼로이드 글리코시드로 구분될 수 있다. HEGA 및 MEGA 시리즈 세제는 당 알코올을 머리 기로 가진다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 적합한 비이온성 세제의 예는 사포닌, 예컨대 에스신(Aescin), 바코파시드(Bacopaside), 바코시드(Bacoside), 샤코닌(Chaconine), 샤란틴(Charantin), 디지토닌(Digitonin), 글리시리진(Glycyrrhizin), 진세노시드(Ginsenoside), 홀로투린(Holothurin), 프로토다이오스신(Protodioscin), 솔라닌(Solanine) 및 이들의 혼합물이다. 글리콜-다이오스게닌과 같은 사포닌과 구조적으로 유사한 합성 세제도 본 발명에 따른 방법에 사용하기에 적합하다. 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 적합한 비이온성 세제의 추가 예는 알킬 글리코시드, 예컨대 단쇄, 중간쇄 또는 장쇄 알킬 말토시드, 예를 들어 n-도데실-β-말토시드(DDM), 데카노일-N-하이드록시에틸글루카미드(HEGA), n-데카노일-N-메틸-D-글루카미드(MEGA) 및 이들의 혼합물이다.
본 발명에 따른 특히 바람직한 세제는 사포닌 부류, 특히 디지토닌으로부터 선택된다. 디지토닌에 대한 실제 실험은 디지토닌이 세제의 부재 또는 다른 유형의 세제의 사용과 비교하여, 세제로 사용되는 경우 본 발명의 방법이 살리프로 입자의 제조 측면에서 더 효율적임을 보였다.
쌍성이온성 세제는 동일한 수의 불리하게 하전된 화학 기의 존재로 인해 발생하는 순전하 0을 갖는데, 즉 음전하와 양전하의 수가 같아 전체 전하가 순전하가 0이 된다. 예로는 포스-콜린, CHAPS/CHAPSO, 라우릴-다이메틸 아민-옥사이드(LDAO) 및 이들의 혼합물이 포함된다.
본 발명의 하나의 양태에서, 세제는 알킬벤젠설포네이트 또는 담즙산, 양이온성 세제 및 비이온성 또는 쌍성이온성 세제, 예컨대 라우릴-다이메틸 아민-옥사이드(LDAO), 포스-콜린, CHAPS/CHAPSO, 사포닌, 예컨대 디지토닌 및 구조적으로 관련된 합성 세제, 예컨대 글리콜-다이오스게닌, 알킬 글리코시드, 예컨대 단쇄, 중간쇄 또는 장쇄 알킬 말토시드, 특히 n-도데실-β-D-말토시드, 글루코시드, 말토스-네오펜틸 글리콜(MNG) 양친매성 물질, 양친매성 중합체(앰피폴(amphipol)), 스티렌 말레산 공중합체(SMA), 페놀과 알데하이드의 하이드록시알킬화 생성물을 기반으로 하는 거대고리 또는 환형 올리고머(칼릭사렌(Calixarene)), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에 사용되는 소수성 제제가 세제-가용화된 상태인 경우, 세제가 단쇄 내지 중간쇄 소수성 꼬리를 갖는 세제인 경우가 유리하다. 이는 막 단백질이 소수성 제제로 통합된 경우에 특히 해당된다. 본원에 사용된 "단쇄 소수성 꼬리"는 예컨대 n-노닐-β-말토시드(NM)에서와 같이 C2 내지 C9를 의미하고, 본원에 사용된 "중간쇄 소수성 꼬리"는 예컨대 n-데실-β-말토시드(DM) 또는 n-도데실-β-말토시드(DDM)에서와 같이 C10 내지 C15를 의미한다. 하나의 양태에서, 세제는 그의 소수성 꼬리에 2 내지 12개의 탄소 원자, 바람직하게는 그의 소수성 꼬리에 2 내지 10개의 탄소 원자, 가장 바람직하게는 2 내지 9개의 탄소 원자를 가진다.
실제 실험에 따라 사포신 유사 단백질은 일반적으로 정제, 저장 또는 취급 중에 세제 또는 기타 용매가 필요하지 않는다. 그러나, 임의적으로 사포신 유사 단백질도 세제-가용화된 상태이다.
소수성 제제가 세제-가용화된 상태에 있는 소수성 생체분자의 형태인 경우, 이는 또한 지질, 특히 고리형 지질과 복합체를 형성할 수 있다. 본원에서 "쉘 지질" 또는 "경계 지질"로도 지칭되는 고리형 지질은 막으로부터의 정제 동안 소수성 생체분자의 표면에 우선적으로 결합되거나 부착되는 지질의 선택된 집합을 나타낸다. 그들은 강한 지질-단백질 결합 상호작용의 존재로 인해 고도로 부동화된 지질의 층, 또는 고리 또는 쉘을 구성한다.
하나의 양태에서, 소수성 제제, 지질 및/또는 사포신 유사 단백질을 가용화하기 위해 사용되는 세제는 본 발명의 방법에서 형성된 살리프로 입자에 실질적인 양으로 전달되지 않는다. 특히, 본 발명에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 입자 내의 세제의 양은 검출할 수 없을 정도로 낮을 수 있다. 하나의 양태에서, 수득된 살리프로 입자는 입자의 중량을 기준으로 임의의 실질적인 양의 세제, 특히 0.1 중량% 미만, 바람직하게는 0.01 중량% 미만, 특히 바람직하게는 0.001 중량% 미만의 세제를 포함하지 않는다. 입자에 존재하는 세제(또는 다른 성분)의 양은 예컨대 질량 분석에 의해 측정될 수 있다.
또다른 양태에서, 소수성 제제 및 지질은 소수성 제제 및 사포신 지단백질 입자에 혼입될 지질을 포함하는 생물학적 막의 형태로 단계 (a)에서 제공된다. 생물학적 막은 바이러스 막, 고세균 막, 진핵생물 막 또는 원핵생물 막, 즉 바이러스, 고세균, 진핵생물 또는 원핵생물 세포 또는 세포 소기관으로부터 유래된 막일 수 있다. 생물학적 막은 온전한, 양친매성 제제-처리된, 또는 용해된 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 형태로 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 특히, 생물학적 막은 세제와 접촉된 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 형태로 제공될 수 있다. 막은 자연적으로 사포신 지단백질 입자에 혼입될 소수성 제제 및 지질을 포함할 수 있다. 그러나, 막은 또한 바이러스, 고세균, 진핵생물 또는 원핵생물 세포 또는 그 막에서 소수성 제제 및/또는 지질을 발현하거나 포함하도록 조작된 세포 소기관으로부터 유래될 수 있다. 예컨대, 소수성 제제가 소수성 단백질인 경우, 막은 상기 소수성 단백질을 이식유전자로서 발현하는 세포로부터 수득될 수 있다. 소수성 단백질은 특히 유전적으로 변형된(예컨대 태그된) 형태로 발현될 수 있다. 소수성 제제가 소수성 약물인 경우, 막은 소수성 약물에 노출된 세포에서 파생될 수 있다. 약물이 충분히 친유성인 경우, 막에 약물이 혼입되어 막 분획을 추출하고 약물의 존재 여부를 시험하여 용이하게 시험할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 막은 바람직하게는 바이러스, 고세균, 진핵 또는 윈핵세포 또는 세포 소기관 막으로부터 선택된다. 용어 "막"은 지질 층을 포함하는 임의의 막을 지칭한다. 바람직하게는, 막은 지질 이중층이다. 일부 경우, 본원에 사용된 용어 "막"은 "세포 막" 및/또는 "세포 소기관 막"에 대해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
막이 세포 형태로 제공되는 경우, 이들은 원핵생물, 진핵생물 및 고세균 세포로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 진핵세포, 특히 비인간 동물 또는 인간 세포이다. 상기 세포는 세포 배양에서 수득할 수 있지만, 조직 샘플, 생검 샘플 및 기타 생물학적 물질과 같은 천연 공급원에서도 수득할 수 있다.
용어 "세포 막"은 세포의 내부를 외부 환경과 분리시키는 생물학적 막을 의미한다. 세포 막에 포함되는 복잡한 구조 및 다수의 성분, 예컨대 막 지질 및 막 단백질은 문헌[Alberts et al., "The Cell", 4th edition, Macmillian Magazines Ltd, 2002 on pages 583 to 614] 및 [Campbell et al., "Biologie", 6th edition, Spektrum Verlag, 2003 on pages 163 to 177]에도 상세 기재되어 있다.
하나의 양태에서, 본 발명의 방법에 의해 수득된 살리프로 입자는 본질적으로 사포신 유사 단백질 및 바이러스, 세포 또는 세포 소기관 막으로부터 수득된 막의 성분으로 이루어진다.
소수성 제제 및 지질은 소수성 제제 및 사포신 지단백질 입자에 혼입될 지질을 포함하는 미정제 막의 형태로 단계 (a)에서 제공될 수 있다. 본원에 사용된 "미정제 막"은 특히 막 지질 및 막 단백질과 관련하여 더 이상 완전히 온전하지는 않지만 여전히 본질적으로 천연 막 조성물을 포함하는 막을 지칭한다. 미정제 막은 각각 고세균, 원핵 또는 진핵세포로부터의 미정제 세포 막, 미정제 세포 소기관 막 또는 이들의 부분일 수 있다. 미정제 막은 또한 외피 바이러스로부터의 미정제 바이러스 외피 막일 수 있다. 예컨대, 세포(고세균, 진핵생물 또는 원핵생물 유래) 또는 세포 소기관의 세포 파괴 또는 용해 후에 수득된 미정제 막 분획은 "미정제 세포 또는 세포 소기관 막"이다. 바이러스 외피가 파괴된 후 미정제 바이러스 막 파벌을 수득할 수 있다. "미정제 바이러스, 세포 또는 세포 소기관 막"은 반드시 바이러스 외피, 세포 및 세포 소기관에 존재하는 천연 막 성분을 포함한다. 특히, "미정제 바이러스, 세포 또는 세포 소기관 막"은 막 지질과 막 단백질을 모두 포함한다. 세포의 파괴 또는 용해는 기계적 방법에 의해 일어날 수 있지만 또한 세포를 양친매성 제제, 특히 세제와 접촉시킴으로써 일어날 수 있다.
미정제 세포 막, 미정제 세포 소기관 막 또는 미정제 바이러스 막은 더 이상 완전히 온전한 세포 막, 세포 소기관 막 또는 바이러스 외피가 아니다. 그들은 두 개의 주어진 막 파열 부위 사이의 소수성 상호작용으로 인해 미정제 막 소포를 자발적으로 형성한다.
소수성 제제 및 지질은 온전한, 양친매성 제제-처리된, 또는 용해된 세포, 바이러스 또는 세포 소기관에 여전히 포함된 막의 형태로 단계 (a)에서 제공될 수 있다. 따라서, 세포, 바이러스 또는 세포 소기관은 단계 (a)에서 직접 사용될 수 있다. 그들은 온전하거나, 양친매성 물질로 전처리되거나, 용해될 수 있다. 특히, 소수성 제제 및 지질은 양친매성 제제, 특히 세제와 접촉된 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 형태로 단계 (a)에서 제공될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기에 특히 적합한 막은 양친매성 제제, 특히 세제로 단순히 처리함으로써 임의의 천연 세포, 바이러스 또는 세포 소기관으로부터 직접 수득될 수 있다. 바람직하게는, 양친매성 제제와 접촉된 세포는 진핵세포, 특히 비인간 동물 또는 인간 세포이다. 양친매성 제제-처리된 진핵세포는 예컨대 신생물 세포 또는 암/종양 세포일 수 있다. 본 발명의 방법에서 양친매성 제제와 접촉하게 된 세포는 또한 예컨대 조직 또는 고형 종양으로서 조직화될 수 있다.
양친매성 제제를 사용한 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 처리는 일반적으로 액체 환경에서 수행된다. 특히, 양친매성 물질이 세제일 때, 양친매성 물질에 의한 처리는 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 막 구조가 보다 유동화되고 느슨해지는 효과가 있는 것으로 보인다. 이러한 과학적 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 양친매성 물질, 특히 세제는 아마도 개방 형태를 유도함으로써 사포신 단백질을 활성화시키는 것으로 보인다. 바람직한 양태에서, 양친매성 제제에 의한 처리 외에, 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 추가 처리가 수행되지 않고, 특히 예컨대 화학적 및/또는 기계적 방법에 의한 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 파괴를 달성하기 위한 추가 처리가 수행되지 않는다. 세포, 바이러스 또는 세포 소기관의 파괴를 달성하기 위한 적절한 화학적 및/또는 기계적 처리는 당업자에게 공지되어 있다.
바람직한 양태에서, 액체 환경에서 세제를 사용한 처리는 세포, 바이러스 또는 세포 소기관을 세제의 CMC의 0.01 내지 2,000,000배 농도, 바람직하게는 세제의 CMC의 0.1 내지 20,000배 농도, 가장 바람직하게는 세제의 CMC의 1 내지 2,000배의 농도의 세제와 접촉시키는 것을 포함한다. 다수의 양태에서, 액체 환경의 세제 농도가 세제의 CMC보다 높을 때 최상의 결과가 달성된다. CMC 미만의 세제 농도는 이미 긍정적인 효과가 있는 것으로 보이고, 세제 없이 사포신을 활성화하여 실제로 막을 가용화할 수 있다. 임계 미셀 농도(CMC)는 미셀이 형성되고 시스템에 추가되는 모든 추가 세제 분자가 미셀에 혼입되는 세제의 농도로 정의된다. 전형적으로, 세포, 바이러스 또는 세포 소기관은 특히 세제인 경우 양친매성 제제와 함께 0.5분 내지 180분, 바람직하게는 30분 내지 90분 동안 인큐베이션된다. 또한, 세제와의 인큐베이션은 통상적으로 1 내지 37℃, 바람직하게는 2 내지 6℃의 온도에서 수행된다.
본 발명의 방법의 단계 (b.1)/(b.2)
본 발명의 방법의 단계 (b.1)/(b.2)에서, 사포신 유사 단백질(단계 (b.1)) 또는 소수성 제제(단계 (b.2))는 선택적으로 소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질과 결합할 있는 지지체와 접촉된다. 본 발명의 방법의 단계 (b.2)에서, 소수성 제제는 소수성 제제를 지지체에 선택적으로 결합시킬 수 있는 지지체와 접촉된다. 대안적으로, 본 발명의 방법의 단계 (b.1)에서 사포신 유사 단백질은 사포신 유사 단백질에 선택적으로 결합할 수 있는 지지체와 접촉된다.
단계 (b.2)의 소수성 제제 또는 단계 (b.1)의 사포신 유사 단백질은 바람직하게는 액체 환경에서 지지체와 만나게, 즉 접촉되게 된다. 바람직하게는, 액체 환경은 수성 액체 환경이다. 특정 양태에서, 수성 액체 환경은 2.0 내지 10.0, 5.0 내지 10.0 또는 5.0 내지 8.5, 특히 6.0 내지 8.0, 가장 바람직하게는 7.0 내지 8.0의 pH의 완충된 용액이다.
본원에 사용된 용어 "지지체"는 관심 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있는 임의의 지지체 물질을 지칭한다. 본 발명의 방법(대안 I)의 단계 (b.1)에서 사용되는 지지체의 경우, 표적 분자는 사포신 유사 단백질이다. 본 발명의 방법(대안 II)의 단계 (b.2)에서 사용된 지지체의 경우, 표적 분자는 소수성 제제이다. 표적 분자에 결합하는 지지체의 분자 구조는 본원에서 "포획 잔기"로 지칭된다. 지지체에 의해 결합되는 표적 분자의 분자 구조는 본원에서 "결합 잔기"로 지칭된다. 따라서, 지지체는 관심 표적 분자, 즉 사포신 유사 단백질(단계 (b.1)) 또는 소수성 제제(단계 (b.2))에 존재하는 상응하는 결합 잔기에 결합하는 포획 잔기를 포함하거나 포함하도록 작용화되었다.
본원에 사용된 지지체는 특히 이러한 포획 잔기를 포함하는 "담체", "담체 물질" 또는 "고정상"일 수 있다. 바람직한 양태에서, 이는 고체 지지체이다.
지지체는 비드, 베드, 막, 또는 평면, 곡선, 뒤틀린, 꼬인 및/또는 각진 표면을 갖는 고체 지지체의 형태일 수 있다.
하나의 양태에서, 지지체는 비드 형태이다. 특히 우수한 결과는 선행 기술에서 크로마토그래피 지지체, 예컨대 생체친화성 크로마토그래피에서 사용되는 비드로 달성된다. 이러한 비드는 가교될 수 있는 아가로스, 셀룰로스, 리그노셀룰로스 및 덱스트란과 같은 다당류, 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 기타 중합체로 만들어진 물질을 기반으로 하는 것이 가장 일반적이다. 본 발명에서의 사용의 경우, 비드 물질은 관심 표적 분자, 즉 사포신 유사 단백질(단계 (b.1)) 또는 소수성 제제(단계 (b.2))를 포함하거나, 이를 포함하도록 작용화된다. 친화성 비드와 같은 본 발명의 방법에 사용되는 비드는 1 내지 900 ㎛ 또는 10 내지 500 ㎛ 범위의 평균 직경을 가질 수 있다. 하나의 양태에서, 직경은 500 ㎛ 미만, 250 ㎛ 미만 또는 100 ㎛ 미만이다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 사용되는 비드는 접근가능한 기공 구조를 가진다. 지지체는 또한 고체의 수화로 인해 겔을 형성할 수 있다. 이러한 다공성 물질 또는 겔은 물질의 부피당 이용가능한 결합 부위의 양이 많기 때문에 선호된다. 다수의 결합 부위는 더 큰 결합, 반응성 및/또는 분리 능력을 제공한다. 다른 양태에서, 비드는 자성이어서 지지체를 다른 표면에 편리하게 결합할 수 있다. 마그네틱 비드는 일반적으로 표준 친화성 비드보다 작다. 따라서, 본 발명에 따른 비드는 또한 600 nm 내지 10 ㎛, 400 nm 내지 7 ㎛ 또는 200 nm 내지 5 ㎛ 범위의 평균 직경을 가질 수 있다. 다른 양태에서, 자기 비드의 직경은 7 ㎛ 미만, 4 ㎛ 미만 또는 1 ㎛ 미만이다.
하나의 양태에서, 지지체는 베드 형태이다. 베드는 비드 또는 섬유로 형성될 수 있다. 그러나, 베드는 또한 베드가 기공에 의해 교차되는 단일 조각의 물질을 포함하도록 연속 구조일 수 있다. 연속 베드의 예는 공유 가교된 비드 또는 섬유이다. 베드는 단백질 및 지질 크로마토그래피 분야의 당업자에게 주지된 크로마토그래피 베드일 수 있다. 베드는 가교될 수 있는 아가로스, 셀룰로스, 리그노셀룰로스 및 덱스트란과 같은 다당류, 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 기타 중합체로 만들어진 물질을 기반으로 할 수 있다. 본 발명의 방법에서의 사용의 경우, 베드 물질은 관심 표적 분자, 즉 사포신 유사 단백질(단계 (b.1)) 또는 소수성 제제(단계 (b.2))에 존재하는 상응하는 결합 잔기에 결합하는 포획 잔기를 포함하거나, 포함하도록 작용화된다.
하나의 양태에서, 지지체는 막 형태이다. 막은 지질 및/또는 막 단백질과 같은 전형적인 생물학적 막 성분으로 구성되지 않는 비생물학적 막이다. 바람직하게는, 단백질 및 지질 막 크로마토그래피 분야의 당업자에게 주지된 크로마토그래피 막이 사용된다. 막은 가교될 수 있는 아가로스, 셀룰로스, 리그노셀룰로스 및 덱스트란과 같은 다당류, 또는 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 기타 중합체로 만들어진 물질을 기반으로 할 수 있다. 본 발명에서의 사용의 경우, 막은 관심 표적 분자, 즉 사포신 유사 단백질(단계 (b.1)) 또는 소수성 제제(단계 (b.2))에 존재하는 상응하는 결합 잔기에 결합하는 포획 잔기를 포함하거나, 포함하도록 작용화된다.
하나의 양태에서, 지지체는 평면 표면을 갖는 고체 지지체이다. 본원에 사용된 "평면"은 표면이 거시적으로 실질적으로 평면이라는 의미에서 "실질적인 평면"을 의미한다. 이는 미세구조가 비평면 구조를 포함할 수 있고 또한 매크로구조가 완전하게 평면이 아닌 영역을 포함할 수 있음을 의미한다. 하나의 양태에서, 구부러지거나 기울어진 구조는 또한 넓은 표면적을 포함하는 경우 본 발명의 의미에서 실질적으로 평면인 것으로 간주된다. 용어 "평면 표면을 갖는 고체 지지체"는 칩 또는 표면 평면과 같은 실질적으로 평평한 고체 지지체를 상기 설명된 비드 양태와 구별을 위해 사용된다. 본원에 사용된 용어 "고체"는 겔을 포함하는 것을 의미하지 않는다. 하나의 양태에서, 고체는 실질적으로 단단하고 유연하지 않음을 의미한다. 다른 양태에서, 평면 표면을 갖는 고체 지지체는 비다공성 표면을 포함한다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 평면 표면을 갖는 고체 지지체의 예는 칩 또는 바이오센서 표면이다. 하나의 양태에서, 고체 지지체의 평면 표면은 금속으로 제조된다. 특히, 금속은 금, 은, 구리, 알루미늄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 양태에서, 표면은 유리 및/또는 합성 수지, 즉 중합체 물질로 제조된다. 본 발명에서의 사용의 경우, 고체 지지체의 평면 표면은 관심 표적 분자, 즉 사포신 유사 단백질(단계 (b.1)) 또는 소수성 제제(단계 (b.2))에 존재하는 상응하는 결합 잔기에 결합하는 포획 잔기를 포함하거나, 포함하도록 작용화된다. 하나의 양태에서, 평면 표면을 갖는 고체 지지체의 치수는 1 내지 50 mm2, 특히 5 내지 25 mm2이다.
지지체는 표적 분자의 결합 잔기를 통해 관심 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있게 하는 포획 잔기를 포함한다. 본 발명의 방법(대안 I)의 단계 (b.1)에서 사용되는 지지체의 경우, 표적 분자는 사포신 유사 단백질이다. 본 발명의 방법(대안 II)의 단계 (b.2)에서 사용된 지지체의 경우, 표적 분자는 소수성 제제이다.
용어 "포획 잔기" 또는 "결합 잔기"는 "하나 이상의 포획 잔기" 및 "하나 이상의 결합 잔기"의 의미로 본원에서 사용된다. 본 발명의 방법에 사용되는 지지체는 전형적으로 동일하거나 상이할 수 있는 다중 표적 잔기를 포함할 것이다. 전형적으로, 지지체는 동일한 유형의 복수의 포획 잔기를 포함할 것이다. 표적 분자는 하나 이상의 결합 잔기를 포함할 수 있다. 예컨대, 결합이 친화성 상호작용을 기반으로 하는 경우, 표적 분자는 친화성 태그의 하나 이상의 카피(copy)를 포함할 수 있다. 결합이 소수성 상호작용을 기반으로 하는 경우, 표적 분자는 하나 이상의 소수성 결합 부위 등을 포함할 수 있다.
표적 분자는 지지체의 포획 잔기에 의해 선택적으로 결합되는 결합 잔기를 포함한다. 용어 "결합 잔기"는 표적 분자의 임의의 분자 구조, 즉 지지체의 상응하는 포획 잔기에 대한 선택적 결합을 허용하는 본 발명의 방법에 따른 소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질을 지칭한다. 표적 분자의 결합 잔기와 지지체의 포획 잔기는 상보적 상호작용 쌍을 형성한다. 용어 "포획 잔기" 및 "결합 잔기"는 본원에서 "인식 잔기"로 지칭될 것이다.
따라서, 본 발명의 방법의 대안 (I)에서, 지지체는 포획 잔기를 포함하고, 사포신 유사 단백질은 결합 잔기를 포함하되, 포획 잔기는 사포신 유사 단백질의 결합 잔기에 선택적으로 결합할 수 있다. 본 발명의 방법의 대안 (II)에서, 지지체는 포획 잔기를 포함하고, 소수성 제제는 결합 잔기를 포함하되, 포획 잔기는 소수성 제제의 결합 잔기에 선택적으로 결합할 수 있다. 지지체에 대한 결합과 관련하여, "소수성 제제" 및 "사포신 유사 단백질"은 본원에서 집합적으로 "표적 분자"로 지칭될 것이다.
본원에서 사용된 용어 "결합"은 지지체 상에 표적 분자를 "부동화", "포획", "부동화", "결합" 또는 "보유"하는 것을 의미할 수 있다. 용어 "선택적으로"는 지지체가 우선적으로, 주로 및/또는 거의 독점적으로 표적 분자, 즉 소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질에 결합함을 나타낸다. 선택적 결합은 지지체의 포획 잔기와 표적 분자의 결합 잔기 사이의 정전기적 상호작용, 소수성 상호작용, 친화성 결합 및/또는 공유 결합 형성에 의해 달성될 수 있다. 통상적으로 결합은 가역성일 것이다. 그러나, 하나의 양태에서, 지지체에 대한 결합은 실질적으로 비가역성이다. 또다른 양태에서, 지지체에 대한 결합은 공유 결합에 의한 것이다.
일반적으로, 적절한 결합 잔기/결합 잔기 쌍에 대한 참조가 본원에서 이루어질 때마다, 역쌍이 또한 기술되는 것을 의미한다. 다시 말해서, 다수의 경우에 지지체 상의 포획 잔기와 표적 분자의 결합 잔기는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
결합은 결합 잔기와 포획 잔기를 연결하는 링커(linker) 또는 스페이서(spacer)를 포함할 수 있다. 링커 또는 스페이서는 결합 및 포획 잔기 둘 다와 반응하거나 이에 결합하는 2작용성 이상의 분자일 수 있거나 결합 또는 포획 잔기에 포함될 수 있다.
지지체의 포획 잔기는 다양한 방식에 의해 표적 분자의 선택적 결합을 가능하게 할 수 있고, 이는 하기 더 자세히 설명될 것이다. 이의 예는 하기와 같다: (i) 화학 결합에 의해 지지체의 포획 잔기에 결합 잔기를 화학적으로 커플링하여 표적 분자를 포획함, (ii) 지지체의 포획 잔기와 표적 분자의 천연 또는 조작된 결합 잔기 사이의 친화성 기반 상호작용을 통해 표적 분자를 포획함, (iii) 지지체의 포획 잔기가, 표적 분자의 잔기에 의해 선택적으로 결합되는 가교제(예컨대 펩티드 에피토프, 기질 유사체 또는 리간드)에 결합하도록 조작함에 의한 표적 분자를 간접적 결합함, (iv) 지지체의 포획 잔기와 표적 분자의 천연 또는 조작된 결합 잔기 사이의 소수성 상호작용을 통해 표적 분자를 포획함, 및/또는 (v) 표적 분자를 포획 지지체의 포획 잔기와 표적 분자의 천연 또는 조작된 결합 잔기 간의 전하-기반 상호작용을 통해 표적 분자를 포획함.
하나의 양태에서, 단계 (b.1)/(b.2)에서 지지체에 대한 표적 분자의 선택적 결합은 화학적 결합에 의해 표적 분자의 결합 잔기를 지지체의 포획 잔기에 화학적으로 커플링함으로써 달성된다. 이는 티올기, 아미노기, 하이드록실기, 알데히드기 또는 카복실기와 같은 표적 분자의 작용기를 이용하여 달성할 수 있다. 표적 분자의 이러한 결합 잔기와 반응하기 위한 지지체의 적절한 포획 잔기는 당업자에게 공지되어 있다. 당업자는 달성될 커플링의 유형에 따라 적합한 포획 잔기/결합 잔기 쌍을 선택할 수 있다. 표적 분자의 티올 기는 예컨대 지지체의 포획 잔기로 사용되는 말레이미드, 이황화물 또는 요오드아세트아미드와 반응하거나 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 표적 분자에 1차 아민은 예컨대 지지체에서 포획 잔기로서 사용되는 숙신이미드 에스터(예컨대 N-하이드록시, 설포숙신이미드 또는 기타 숙신이미딜 에스터), 이미도에스터 또는 이소티오시아네이트(예컨대 페닐이소티오시아네이트)와 반응할 수 있고 이의 반대 경우도 마찬가지이다. 예컨대, 표적 분자의 카복실기는 지지체에서 포획 잔기로 사용되는 카보다이이미드(예컨대 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드)와 반응할 수 있고 이의 반대 경우도 마찬가지이다.
선택된 화학에 따라, 화학적 결합의 형성을 통한 지지체에 대한 표적 분자의 커플링은 실질적으로 비가역적일 수 있고, 이는 형성된 살리프로 입자를 지지체에 특히 긴밀하게 결합해야 하는 특정 적용례에 유리할 수 있다. 한편, 친화성 기반 인식 잔기, 소수성 상호작용 또는 정전기적 상호작용을 통한 포획은 통상적으로 가역적이고 단계 (d)에서 용이한 용리 및 지지체를 재생 및 재사용할 가능성을 갖는 장점이 있다.
또다른 양태에서, 단계 (b.1)/(b.2)에서 지지체에 대한 표적 분자의 선택적 결합은 지지체의 포획 잔기와 표적 분자의 천연 또는 조작된 결합 잔기 사이의 친화성 기반 상호작용에 의해 달성된다. 이러한 방법으로, 천연 또는 조작된 결합 잔기를 갖는 표적 분자는 친화성 기반 상호작용을 사용하여 지지체의 포획 잔기에 의해 선택적으로 결합된다.
천연 포획 잔기/결합 잔기 친화성 기반 쌍의 예는 표적 분자의 특정 당 잔기에 결합하는 렉틴(예컨대 글리코실화된 막 단백질인 경우) 또는 표적 분자의 천연 에피토프를 인식하는 항체이다(또는 이의 반대 경우도 마찬가지임). 글리코실화, 황산화, 팔미토일화, 미리스토일화, 유비퀴틴화 또는 SUMO일화(SUMOylation)와 같은 번역후 변형도 본 발명에 따른 결합 잔기로서 작용할 수 있다. 포획과 결합 잔기 사이의 다양한 기타 천연 친화성 기반 상호작용은 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명의 방법에 유용한 조작된 친화성 기반 포획 잔기/결합 잔기 쌍의 특히 중요한 예는 친화성 태그의 주지된 영역에서 비롯된다. 따라서, 하나의 양태에서, 포획 잔기 또는 결합 잔기는 친화성 태그이고 대응하는 다른 인식 잔기는 친화성 태그에 대해 높은 친화성을 갖는 잔기이다. 예컨대, 단백질 A-세파로스 수지는 소수성 제제-항체 융합(항체의 Fc 부분은 표적 분자의 결합 잔기임)과 함께 지지체(단백질 A는 지지체의 친화성 태그임)로 사용될 수 있다. 소수성 제제-항체 복합체를 사용하는 경우 항체는 전술한 바와 같이 링커 역할을 한다. 바람직하게는, 표적 분자의 결합 잔기는 친화성 태그이다. 예컨대, Ni2+-NTA 수지는 His-태그된 표적 분자와 함께 지지체(이때, Ni2+-NTA는 결합 잔기임)로 사용될 수 있다(따라서 His-태그는 표적 분자에서 친화성 태그 및 결합 잔기임).
친화성 태그는 예컨대 표준적인 클로닝 또는 유전자 조작을 통해 용이하게 도입되고, 주지된 통상 상업적으로 이용가능한 결합 잔기-보유 지지체에 결합한다는 장점이 있다. 단계 (b.1)에서 사용되는 사포신 유사 단백질 또는 단계 (b.2)에서 사용되는 소수성 제제(후자가 소수성 단백질인 경우)는 친화성 태그된 형태일 수 있다. 이는 클로닝 또는 유전자 조작에 의해 표적 분자에 펩티드 또는 폴리펩티드 형태의 친화성 태그를 도입함으로써 용이하게 수득될 수 있다. 따라서, 이러한 양태에서, 소수성 제제(후자가 소수성 단백질인 경우) 및/또는 사포신 유사 단백질은 각각 단계 (b.2) 및 단계 (b.1)에서 친화성 태그된 융합 단백질로서 사용된다. 용어 "융합 단백질"은 당업계에 인식되어 있고 재조합 DNA 기술에 의해 다른 펩티드 또는 폴리펩티드에 융합된 단백질을 의미한다. 용어 "융합 단백질"은 본원에서 "키메라 단백질"과 상호교환적으로 사용된다.
친화성 태그와 상응 포획 잔기 간의 상호작용은 원래 단백질 정제 및 부동화를 보조하기 위해 개발되었다. 단백질 표적 분자는 알려진 포획 잔기에 결합하는 친화성 태그로 알려진 특정 펩티드 서열을 사용하여 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 본원에 사용된 친화성 태그는 일반적으로 3가지 범주로 분류된다: a) 소분자에 결합하는 펩티드 서열; b) 소분자에 결합하는 단백질; 및 c) 항체에 결합하는 펩티드 또는 단백질. 친화성 태그는 또한 적합한 결합 짝을 갖는 소분자 화합물(예컨대 리간드)일 수 있다. 친화성 태그는 본 발명의 방법에서 사용되는 표적 분자에 공유적으로 부착될 수 있다. 예컨대, Ni2+(Ni2+-NTA)와 복합체를 형성할 때 니트릴로 트라이-아세트산은 히스티딘 태그로 알려진 히스티딘의 스트레치로 변형된 단백질을 결합하는 통상적인 포획 잔기이고, 이는 표적 분자의 결합 잔기로서 사용할 수 있는 친화성 태그를 정의한다.
"친화성 태그"는 당해 기술 분야에서 통상적인 의미를 가진다. 친화성 태그는 표적 생물학적 또는 화학적 분자에 용이하게 부착될 수 있는 생물학적 또는 화학적 물질이다. 친화성 태그는 임의의 적합한 방법에 의해 표적 생물학적 또는 화학적 분자에 부착될 수 있다. 예컨대, 일부 양태에서, 친화성 태그는 유전적 방법을 사용하여 표적 분자에 부착될 수 있다. 예컨대, 친화성 태그를 인코딩하는 핵산 서열은 친화성 태그가 생물학적 분자와 함께 발현될 수 있도록 하는 핵산 내 임의의 위치, 예컨대 내부, 인접 또는 근처에 위치할 수 있다. 다른 양태에서, 친화성 태그는 또한 분자가 생성된(예컨대 발현 또는 합성된) 표적 생물학적 또는 화학적 분자에 부착될 수 있다. 한 예로서, 비오틴과 같은 친화성 태그는 스트렙타비딘에 대한 표적의 결합을 촉진하기 위해 표적 단백질 또는 펩티드에 예컨대 화학적으로 공유 커플링될 수 있다.
친화성 태그는 예컨대 히스티딘 태그, GST(글루타티온/GST 결합에서), 스트렙타비딘(비오틴/스트렙타비딘 결합에서) 또는 말토스(MBP 또는 말토스 결합 단백질에 결합)와 같은 금속 결합 태그를 포함한다. 다른 친화성 태그에는 Myc/Max 쌍의 Myc 또는 Max, 또는 폴리히스티딘과 같은 폴리아미노산이 포함된다. 본원의 다양한 위치에서, 특이적 친화성 태그는 결합 상호작용과 관련하여 기재된다. 일반적으로 알려진 생물학적 또는 화학적 결합 짝인 친화성 태그가 상호작용하는(예컨대 선택적으로 결합하는) 지지체의 분자 구조는 본원에서 사용되는 "포획 잔기"이다.
본 발명의 방법의 단계 (b.1)/(b.2)에 유용한 친화성 태그 또는 항원(결합 잔기로 사용됨)/포획 잔기 쌍은 예컨대 폴리히스티딘/NTA/Ni2+, 글루타티온 S 트랜스퍼라제/글루타티온, 말토스 결합 단백질/말토스, 스트렙타비딘/비오틴, 비오틴/스트렙타비딘, 항원(또는 항원의 단편)/항체(또는 항체의 단편) 등을 포함한다.
본 발명의 방법의 단계 (b.1)/(b.2)에 유용한 추가 친화성 태그 또는 항원(결합 잔기로서 사용됨)/포획 잔기 쌍은 예컨대 항체/펩티드 상호작용, 항체/항원 상호작용, 항체의 단편/항원 상호작용, 핵산/핵산 상호작용, 단백질/핵산 상호작용, 펩티드/펩티드 상호작용, 단백질/단백질 상호작용, 소분자/단백질 상호작용, 글루타티온/GST 상호작용, 말토스/말토스 결합 단백질 상호작용, 탄수화물/단백질 상호작용, 탄수화물 유도체/단백질 상호작용, 펩티드 태그/금속 이온-금속 킬레이트 상호작용, 펩티드/NTA-Ni 상호작용, 에피토프 태그(예컨대 V5-태그, Myc-태그, FLAG-태그 또는 HA-태그)/항체 상호작용, 단백질 A/항체 상호작용, 단백질 G/항체 상호작용, 단백질 L/항체 상호작용, 형광 단백질(예컨대 GFP)/항체 상호작용, Fc 수용체/항체 상호작용, 비오틴/아비딘 상호작용, 비오틴/스트렙타비딘 상호작용, 아연 핑거(zinc finger)/핵산 상호작용, 소분자/펩티드 상호작용, 소분자/표적 상호작용, 및 금속 이온/킬레이트제/폴리아미노산 상호작용이다.
상기 언급된 친화성 태그 중 임의의 것은 본 발명의 방법의 단계 (b.1)/(b.2)에서 지지체에 선택적으로 결합된 소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질에 존재할 수 있다. 그 반대의 경우도 마찬가지일 수 있는데, 즉 친화성 태그는 지지체 및 표적 분자의 각각의 포획 잔기, 또는 임의적으로, 중간 링커에 존재할 수 있다. 상기 언급된 친화성 기반 상호작용 쌍 중 임의의 것이 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.
다른 양태에서, 표적 분자의 친화성 태그는 형광성 태그이다. 이러한 형광 태그는 본 발명의 방법에서 생성되는 동안 특정 소수성 제제 또는 특정 유형(종)의 살리프로 입자를 검출하고 추적하는 데 유용하다. GFP 및 그 변이체는 일반적으로 사용되는 형광 태그의 예이다.
본 발명자의 연구는 미정제 막에 존재하는 특이적으로 태그된 막 단백질을 본 발명의 방법에서 소수성 제제로 사용하는 것도 가능하다는 것을 밝혀냈다. 이는 미정제 막이 유래된 기본 세포 또는 바이러스에서 관심 있는 막 단백질을 태그함으로써 가능하다. 태그된 소수성 단백질을 포함하는 미정제 막은 소수성 단백질 및 지질을 제공하기 위해 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 사용될 수 있다. 태그는 바람직하게는 유전적 수준에서 수행되는데, 예컨대 유전 조작에 의하거나, 바이러스, 세포 또는 세포 소기관에 태그된 도입유전자를 운반하는 벡터를 삽입함에 의해 수행된다.
또다른 양태에서, 단계 (b.1)/(b.2)에서 지지체에 대한 표적 분자의 선택적 결합은 지지체의 포획 잔기에 대한 그의 결합 잔기를 통한 표적 분자의 간접 결합에 의해 달성된다. 표적 분자의 이러한 간접적인 결합은 지지체의 포획 잔기를 표적 분자의 결합 잔기에 의해 선택적으로 결합되는 가교제(예컨대 펩티드 에피토프, 기질 유사체 또는 리간드)에 결합하도록 조작함으로써 달성될 수 있다. 이러한 방법으로, 포획된 가교제 사이의 2차 상호작용을 사용하여 사포신 유사 단백질 또는 소수성 제제를 지지체에 선택적으로 결합시킬 수 있다. 가교제의 예로는 보조인자, 기질 유사체 또는 효소 억제제, 리간드 또는 펩티드 에피토프가 있다. 이들 가교제는 지지체의 포획 잔기에 커플링될 수 있고, 여기서 이들은 표적 분자에 선택적으로 결합할 수 있다. 예컨대, 보조인자, 기질 유사체 또는 효소의 억제제가 가교제로 사용되는 경우, 각각의 효소는 표적 분자이고 효소의 각 결합 포켓(pocket)은 결합 잔기를 구성한다.
추가 양태에서, 단계 (b.1)/(b.2)에서 지지체에 대한 표적 분자의 선택적 결합은 지지체의 포획 잔기와 표적 분자의 천연 또는 조작된 결합 잔기 사이의 소수성 상호작용을 통해 표적 분자를 포획함, 및/또는 지지체의 포획 잔기와 표적 분자의 천연 또는 조작된 결합 잔기 사이의 전하 기반 상호작용을 통해 표적 분자를 포획함에 의해 달성된다. 당업자는 그러한 상호작용을 매개하기에 적합한 포획 잔기를 알고 있다. 소수성 상호작용이 지지체에 표적 분자를 선택적으로 결합시키는데 사용되는 경우, 지지체는 포획 잔기로서 예컨대 소수성 기, 예를 들어 방향족 기, C8-C24 알킬, C8-C24 알켄일 또는 C8-C24 지방산을 포함한다. 정전기적 상호작용이 표적 분자를 지지체에 선택적으로 결합하는 데 사용되는 경우, 적합한 음이온 및 양이온 교환 잔기를 지지체 상의 포획 잔기로 사용할 수 있다. 특히, 시판되는 음이온 또는 양이온 교환 수지를 지지체로 사용할 수 있다. 음이온 교환기에 일반적으로 사용되는 작용기는 예컨대 4차 암모늄, 다이에틸아미노프로필 또는 다이에틸아미노에틸을 포함한다. 양이온 교환기에 일반적으로 사용되는 작용기는 예컨대 설폰산, 메틸설포네이트 또는 카복시메틸을 포함한다.
본 발명의 방법의 단계 (c.1)/(c.2)
본 발명의 방법의 단계 (c.1)/(c.2)에서, 지지체가 결합된 표적 분자(소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질)를 사포신 지단백질 입자의 나머지 성분과 접촉시킴으로써 사포신 지단백질 입자의 자가 조립이 일어난다.
본 발명의 방법의 대안 (I)의 경우, 단계 (c.1)은 지지체가 결합된 사포신 유사 단백질이 사포신 지단백질 입자의 자가 조립을 허용하도록 소수성 제제와 접촉될 것을 요한다. 이 이론에 얽매이기를 원하지는 않지만, 인접한 포획된 사포신 유사 단백질이 개별 살리프로 입자를 형성하는 데 기여할 가능성이 있다. 또한, 지지체는 매우 역동적이고 조밀한 3차원 구조의 형태로 존재할 수 있어 이웃하는 포획된 사포신 유사 단백질의 상호작용이 촉진될 수 있다. 바람직한 양태에서, 추가 사포신 유사 단백질은 사포신 지단백질 입자로의 자가 조립을 추가로 보조하기 위해 단계 (c.1) 전, 동안 또는 후에 첨가된다.
본 발명의 방법의 대안 (II)의 경우, 단계 (c.2)는 지지체가 결합된 소수성 제제가 사포신 지단백질 입자의 자가 조립을 허용하도록 사포신 유사 단백질과 접촉될 것을 요한다.
바람직하게는, 단계 (c.1) 및/또는 (c.2)에서 입자의 자가 조립은 2.0 내지 10.0, 특히 6.0 내지 10.0, 바람직하게는 6.0 내지 9.0, 특히 바람직하게는 7.0 내지 9.0, 가장 바람직하게는 7.0 내지 8.0의 pH에서 수행된다. 바람직하게는, 단계 (c.1)/(c.2)에서의 접촉은 액체 환경에서 수행된다. 바람직하게는, 액체 환경은 수성 액체 환경이다. 특정 양태에서, 수성 액체 환경은 2.0 내지 10.0, 5.0 내지 10.0 또는 5.0 내지 8.5; 특히 6.0 내지 8.0, 가장 바람직하게는 7.0 내지 8.0의 pH의 완충된 용액이다.
단계 (c.1)/(c.2)에서 지지체 결합 입자 성분과 접촉한 후, 결합되지 않은 상태로 남아 있는 모든 물질은 액체 환경에서 재활용되어 저장되고 다른 적용례에 재사용될 수 있다.
단순히 지질 및 소수성 제제과 함께 인큐베이션함으로써 소수성 제제를 살리프로 입자로 자가 조립할 수 있는 것은 사포신 유사 단백질의 현저하고 놀라운 특성이다. 본 발명의 기초가 되는 연구는 놀랍게도 이러한 자가 조립이 주요 구성성분 중 하나, 즉 사포신 유사 단백질(방법의 대안 (I)) 또는 소수성 제제 자체(방법의 대안 (II))가 지지체에서 결합되고 부동화될 때 매우 효율적으로 작동함을 것을 밝혀냈다. 이어서, 나머지 성분을 함유하는 액체 환경과 지지체 사이의 계면에서 더 까다로운 조건에서 자가 조립이 일어난다.
본 발명자들의 연구는 본 발명의 방법에 의해 수득된 입자가 액체 환경에 포함된 모든 입자 성분의 자유롭고 무작위적인 움직임에 기초하여 순수한 액체 환경에서 형성된 선행 기술의 살리프로 입자와 같은 디스크 형태임을 보였다. 바람직한 양태에서, 조립된 살리프로 입자는 디스크 형태이다. 또다른 바람직한 양태에서, 살리프로 입자는 수성 또는 친수성 코어를 포함하지 않는다. 또다른 양태에서, 살리프로 입자는 디스크 형태이고 수성 또는 친수성 코어를 포함하지 않는다.
바람직한 양태에서, 살리프로 입자는 일반적으로 디스크 형태로 간주된다. 특히, 이들은 2 nm 내지 500 nm, 특히 2 nm 내지 200 nm 또는 3 nm 내지 150 nm, 바람직하게는 3 nm 내지 100 nm의 스토크스 반경(Stokes radius, 유체역학적 반경) RS를 가질 수 있다. 숙련자는 스토크스 반경을 결정하는 방법을 알고 있다. 이는 바람직하게는 지지체로부터 입자를 용리하고, 알려진 스토크스 반경의 표준과 비교하여 분석용 겔 여과(크기 배제 크로마토그래피)에 적용함으로써 수행된다. 특히, 입자는 예컨대 슈퍼덱스(Superdex) 200 HR10 30 겔 여과 컬럼에서 겔 여과 단계를 거치고 실온에서 pH 7.5 및 0.5 mL/분의 적절한 완충액으로 용리될 수 있다. 흡광도는 단백질에 대해 280 nm에서 모니터링된다. 컬럼은 알려진 스토크스 반경의 단백질 표준 혼합물(예컨대 티로글로불린(thyroglobulin) 669 kDa(RS = 8.5 nm), 페리틴(ferritin) 440 kDa(RS = 6.1 nm), 카탈라제 232 kDa(RS = 4.6 nm), 락테이트 데하이드로게나제 140 kDa(RS = 4.1 nm), 소 혈청 알부민 66 kDa(RS = 3.55 nm) 및 말 심장 사이토크롬 c 12.4 kDa(RS = 1.8 nm))을 사용하여 보정된다. 표준 단백질은 관심 입자의 값 이상 및 이하의 Rs 값에 걸쳐 있어야 한다. 표준 단백질에 대한 용리 위치 대 Rs를 플롯팅하여 보정 곡선을 생성한다. 이는 일반적으로 대략적인 선형 플롯을 제공하지만, 그렇지 않으면 점 사이에 선을 그리고 이 표준 곡선의 용리 위치에서 관심 단백질의 Rs를 읽는 것이 충분하다.
일부 양태에서, 예컨대 막 단백질과 같은 부피가 큰 소수성 제제, 또는 보다 다량의 지질이 입자에 존재할 때, 스토크스 반경은 3.2 nm 초과, 특히 3.5 nm 이상, 5.0 nm 이상 또는 10.0 nm 이상일 것이다.
살리프로 입자를 지지체 결합 또는 "자유" 상태에서 투과 전자 현미경을 통해 검사할 수도 있다. 입자가 충분히 크면 음성 염색 전자 현미경 및 단일 입자 분석을 통해 분석할 수 있다.
구조 분석은 다수의 경우 살리프로 입자에서 막 지질이 입자 내부에서 분리된 크기의 디스크형 이중층과 유사한 구조로 조립됨을 나타낸다. 사포신 유사 단백질 성분은 일반적으로 디스크형 이중층의 경계를 정의하고 입자에 구조와 안정성을 제공한다. 대부분의 양태에서, 입자의 내부는 소수성 영역(예컨대 지질 지방 아실 쇄로 구성됨)을 포함한다. 리포솜과 달리 살리프로 입자는 일반적으로 친수성 또는 수성 코어를 포함하지 않는다. 입자는 바람직하게는 디스크 주변부 주위의 이중층의 소수성 표면과 관련된 2개 이상의 사포신 유사 단백질에 의해 제공되는 양친매성 α-나선에 의해 둘러싸인 편평하고, 디스크형이고, 대략 원형의 지질 이중층을 갖는 디스크 형태다.
일부 양태에서, 그리고 살리프로 입자에 혼입된 소수성 제제의 크기에 따라, (빈) 살리프로 입자의 주요 디스크 형태는 정사각형, 삼각형 또는 실린더에 의해 근사화될 수 있다. 예컨대, 실린더에 의해 근사화된 살리프로 입자는 적어도 1.0:1.1, 특히 1.0:1.5, 1.0:2.0, 1.0:4.00, 1.0:8.00 또는 1.0:9.00의 최대 높이 대 최대 직경의 비(주축 길이)를 가질 수 있다. 디스크형 입자의 최대 높이는 용리된 자유 입자의 투과 전자 현미경에 의하거나, 입자가 충분히 큰 경우, 음성 염색 전자 현미경 및 단일 입자 분석을 통해 측정할 때 일반적으로 3.5 nm 이상, 특히 5 nm 이상이다. 바람직하게는, 살리프로 입자는 상부, 하부 및 원주방향 측면을 갖고, 상부 및 하부 표면의 최대 직경(주축 길이)은 둘레 측면의 높이보다 크다. 살리프로 입자의 일부 양태에서, 사포신 유사 단백질은 입자의 원주방향 측면을 둘러싸도록 적어도 부분적으로 위치된다.
일부 양태에서, 디스크 형태 살리프로 입자의 평균 최대 직경(장축 길이)은 투과 전자 현미경에 의하거나, 입자가 충분히 큰 경우, 음성-염색 전자 현미경 및 단일 입자 분석을 통해 측정할 때 2 nm 내지 200 nm, 특히 3 nm 내지 150 nm, 바람직하게는 3 nm 내지 100 nm이다. 또다른 양태에서, 디스크형 입자의 평균 최대 직경(주축 길이)은 3 nm 내지 80 nm, 특히 3 nm 내지 60 nm이다. 실제 실험은 3 nm 내지 20 nm의 평균 최대 직경(주축 길이)을 갖는 입자가 본 발명의 방법으로 특히 용이하게 수득될 수 있음을 보였다.
또다른 양태에서, 입자는 예컨대 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex: 상표명) 200 16/60 GL 컬럼에서 용리된 자유 입자의 겔 여과 용리 프로파일에 의해 평가할 때 실질적으로 단분산된 디스크 구조 집단에 의해 정의된다.
일반적으로, 살리프로 입자에서 사포신 유사 단백질과 지질 이중층 사이의 주된 상호작용은 생물 활성제 전달 입자 주변의 이중층 가장자리에서 사포신 유사 단백질 분자의 양친매성 α-나선의 소수성 면에 있는 잔기와 지질, 예컨대 지질 지방 아실 쇄의 소수성 표면 사이의 소수성 상호작용을 통해 이루어진다. 사포신 유사 단백질의 양친매성 α-나선은 입자 주변에서 지질 이중층의 소수성 표면과 접촉하는 소수성 표면과 입자 외부를 향하고 입자가 수성 배지에 현탁된 수성 환경과 접촉하는 친수성 표면을 모두 포함한다.
다른 양태에서, 사포신 지단백질 입자는 수용액에서 안정하고 장기간 보관을 위해 동결건조된 후 수용액에서 재구성될 수 있다. 본원에 사용된 "안정성" 또는 "안정한"은 입자의 제조, 운송 및 저장 동안 검출할 수 없는 낮은 수준의 입자 단편화, 낮은 수준에서 검출할 수 없는 수준의 응집 또는 품질 저하를 의미한다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 방법에 따른 입자 및 입자 라이브러리는 2.0 내지 10.0, 특히 6.0 내지 10.0, 바람직하게는 6.0 내지 9.0, 특히 바람직하게는 7.0 내지 9.0, 가장 바람직하게는 7.0 내지 8.0의 pH에서 수용액에서 안정하다. 또다른 양태에서, 본 발명의 방법에 따른 라이브러리 및 입자는 예컨대 육안 검사(투명하고 침전물이 없는 용액) 또는 분석 겔 여과(50% 미만, 특히 입자의 1 내지 40% 단편화)에 의해 측정할 때 -210℃ 내지 80℃, 특히 -210℃ 내지 40℃, -210℃ 내지 30℃ 또는 -210℃ 내지 4℃의 온도에서 1일 이상, 2일 이상, 7일 이상, 2주 이상, 1개월 이상, 6개월 이상 또는 12개월 이상 동안 수용액에서 안정하다. 실제 실험은 예컨대 육안 검사(투명하고 침전물이 없는 용액) 또는 분석 겔 여과(50% 미만, 특히 1 내지 40% 입자의 단편화)에 의해 측정할 때 살리프로 입자가 pH 5.0 내지 8.0의 수용액에서 4℃ 내지 40℃의 온도에서도 1일 이상, 2일 이상, 7일 이상, 2주 이상, 1개월 이상 또는 3개월 이상 안정함을 보였다. 또한, 살리프로 입자는 예컨대 육안 검사(투명하고 투명하고 침전물이 없는 용액) 또는 분석용 겔 여과(50% 미만, 특히 입자의 1 및 40% 단편화)에 의해 측정할 때 5.0 내지 8.0의 pH 및 40℃ 내지 75℃의 온도의 수용에서 10분 이상 동안 안정한 것으로 입증되었다. 일부 양태에서, 입자는 장기간 보관을 위해 동결건조된 후 수용액에서 재구성될 수 있다. 일부 양태에서, 살리프로 입자는 pH 7.5의 적절한 완충액(입자의 50% 미만, 특히 40% 미만 또는 1 내지 40% 단편화)에 의해 측정할 때 -210℃ 내지 80℃, 특히 -210℃ 내지 40℃, -210℃ 내지 30℃, -210℃ 내지 4℃의 동결건조된 형태에서 1일 이상, 2일 이상, 7일 이상, 2주 이상, 1개월 이상, 6개월 이상 또는 12개월 이상 동안 안정하다. 본원에 사용된 "단편화"는 겔 여과 용리 프로파일에서 살리프로 입자에 상응하는 피크의 크기(즉 피크 높이)가 새로 제조된 살리프로 입자의 피크 크기와 비교하여, 자유 비-지질-결합 SAPLIP 및/또는 자유 지질 및/또는 응집체의 피크 크기를 희생하여 감소됨을 의미한다. 따라서, 예컨대 40%의 단편화는 저장 전의 피크 크기(100%)와 비교하여 피크 크기(즉 겔 여과 용리 프로파일에서 피크의 높이)가 40% 감소됨을 의미한다.
실제 실험은 살리프로 입자가 세제가 실질적으로 없는 수용액에서도 특히 안정함을 보였다. 바람직하게는, 수용액은 사용된 세제의 임계 미셀 농도(CMC)보다 낮은 세제 농도를 포함한다. CMC는 미셀이 형성되고 시스템에 첨가된 모든 추가 세제 분자가 미셀에 혼입되는 세제의 농도로 정의된다.
살리프로 입자에 혼입될 지질의 적어도 일부는 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 제공된다. 추가 지질은 특히 본 발명의 방법의 단계 (b.1)/(b.2) 및/또는 (c.1)/(c.2) 동안 방법의 임의의 추가 단계에서 제공될 수 있다. 하나의 양태에서, 지질은 고세균, 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스 지질, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법의 대안 (I)에 특정한 양태에서, 지지체가 결합된 사포신 유사 단백질은 단계 (c.1)에서 단계 (a)에서 제공된 고세균, 원핵생물, 진핵생물 또는 바이러스 막과 접촉된다. 막은 소수성 제제와 살리프로 입자에 포함될 지질의 적어도 일부를 포함한다. 이는 라이브러리가 상이한 막 지질 및 임의적으로, 막 단백질 조성을 갖는 사포신 지단백질 입자의 이종 혼합물을 포함하는 살리프로 입자의 라이브러리가 형성되게 한다.
지지체에 결합된 사포신 유사 단백질은 접촉하는 막 구성성분을 구별하지 못하는 것으로 보인다. 따라서, 지지체가 결합된 사포신 유사 단백질이 본 발명의 방법의 단계 (c.1)에서 복합적인 생물학적 막과 접촉하는 경우, 이는 복잡성을 반영하고 사용된 생물학적 막의 막 지질 및 단백질 조성의 스냅샷을 나타내는 살리프로 입자의 지지체가 결합된 라이브러리를 야기한다. 이러한 방법으로 생물학적 막의 지질체/단백질체의 지지체 결합 라이브러리를 제조하면 원래 막 구조의 개별 단위가 살리프로 입자에 보존되는 것처럼 보이는 장점이 있다. 이러한 지원 결합된 라이브러리는 고처리량 스크리닝 및 바이오센서 적용례와 같은 특수 적용례에 유리하다.
본 발명에 따른 용어 "라이브러리"는 용어는 상이한 살리프로 입자의 세트(복합 복수)를 의미한다. 특히, 그 차이는 입자의 크기 및 조성, 특히 그 안에 함유된 막 성분, 즉 막 지질, 및 임의적으로, 막 단백질의 조성에 있을 수 있다. 전형적으로, 라이브러리는 "지질 전용 입자"와 다양한 종류의 막 단백질 함유 살리프로 입자의 혼합물이다. 이는 본원에서 사용된 용어 "상이한 막 지질 및 임의적으로, 막 단백질 조성물"을 의미한다. 라이브러리의 입자는 또한 다른 막 지질의 함량과 구성이 다를 수 있다. 바람직하게는, 라이브러리의 일부 입자는 막 단백질을 함유하는지 여부 및 어떤 막 단백질을 함유하는 지에 있어서 상이하다.
단계 (c.1)에서 지지체가 결합된 사포신 유사 단백질을 단계 (a)에서 제공된 고세균, 원핵, 진핵 또는 바이러스 막과 접촉시킴으로써 상이한 막 지질 및 임의적으로, 막 단백질 조성을 갖는 사포신 유사 입자의 라이브러리가 수득된다.
본 발명의 방법에 의해 수득될 수 있는 살리프로 입자의 라이브러리는 막 단백질이 없는, 즉 본질적으로 미정제 막으로부터의 사포신 유사 단백질 및 막 지질로만 구성된 살리프로 입자("빈" 살리프로 입자)를 포함할 수 있다. 그러나, 라이브러리는 하나 이상의 막 단백질을 포함하는 살리프로 입자("충전된" 살리프로 입자)도 포함한다.
진핵생물은 세포가 핵과 임의적으로 막으로 둘러싸인 추가 세포 소기관을 포함하는 모든 세포 또는 유기체이다. 하나의 양태에서, 본 발명에 따른 방법에 사용되는 막은 진핵생물로부터의 막, 예컨대 세포 막 및/또는 세포 소기관에서 유래하는 막이다. 세포 소기관의 예로는 골지체, 미토콘드리아, 과산화소체, 소포체, 엽록체 및 핵 등이 있다.
진핵생물의 예로는 식물, 동물, 및 효모 및 곰팡이와 같은 균류가 있다. 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있는 바람직한 진핵세포는 포유동물 세포, 특히 동물 및 인간 세포, 곤충 세포, 조류 세포, 진균 세포, 예컨대 효모 세포, 식물 세포 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 용어 "포유동물 세포"는 특히 배양 배지에 보관되는 동물 및 인간 세포도 포함한다.
원핵생물은 핵이 없는 단세포 생물이다. 윈핵세포는 진핵세포보다 단순하고 작고 막 세포 소기관이 없다. 원핵생물의 예는 박테리아이다. 예시적인 박테리아 문은 산박테리아, 방선균, 산수균류, 아르마티모나데테스, 박테리오이데테스, 칼디세리카, 클라미디아, 클로로비, 클로로플렉시, 크리시오제네테스, 시아노박테리아, 데페리박테리아, 데이노코커스-테르무스, 딕티오글로미, 엘루시마이크로비아, 파이브로박테레스, 퍼미큐테스, 후소박테리아, 젬마티모나데테스, 렌티스패래, 니트로스피라, 플랑크토박테리아, 프로테오박테리아, 스피로캐태, 시너지스테테스, 테네리쿠테스, 써모데설포박테리아, 써모토개 및 베루코마이크로비아이다. 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 바람직한 윈핵세포는 박테리아, 특히 병원성 박테리아, 및 이들의 혼합물이다.
고세균은 원핵생물 및 진핵생물과 단지 먼 관련이 있다. 자세한 개요는 예컨대 문헌[De Rosa et al., "Structure, Biosynthesis, and Physicochemical Properties of Archaebacterial Lipids", MICROBIOLOGICAL REVIEWS, p. 70-80 Vol. 50, No. 1, 1986] 또는 [Albers et al., "The archaeal cell envelope", Nature Reviews Microbiology, 9, p. 414-426, 2011]에 제시되어 있다. 데 로사(De Rosa) 등은 고세균막은 원핵생물 및 진핵생물의 것과 크게 상이한 분자로 구성되어 있다고 보고하였다.
원핵생물과 진핵생물은 주로 글리세롤-에스터 지질을 포함하는 막을 포함하는 반면, 고세균은 글리세롤-에터 지질을 포함하는 막을 포함한다. 에터 결합은 에스터 결합보다 화학적으로 더 내성이 있다. 이러한 안정성은 고세균이 극한의 온도와 매우 산성 또는 알칼리성 환경에서 생존하는 데 도움이 될 수 있다. 원핵생물과 진핵생물은 에터 지질을 포함할 수 있지만, 고세균과 달리 이러한 지질은 막의 성분이 없거나 미미하다.
또한, 고세균 지질은 이소프레노이드 측쇄를 기반으로 한다. 이소프레노이드 측쇄는 20개, 25개 또는 40개 이하의 탄소 원자를 포함하는 장쇄이고 선택적으로 다중 측쇄가 있다. 그들은 또한 사이클로프로판 또는 사이클로헥산 고리를 포함할 수 있다. 이는 전술한 것처럼 다른 유기체의 막에서 발견되는 지방산과 대조된다. 이소프레노이드는 다수의 유기체의 생화학에서 중요한 역할을 하지만 고세균만이 인지질을 만드는 데 사용한다. 일부 고세균에서는 지질 이중층이 단층으로 대체될 수 있다.
고세균의 예는 메탄 생성 고세균, 할로박테리아 및 열호산성 고세균이다. 본 발명에 따른 방법에서 사용될 수 있는 바람직한 고세균은 극한성 고세균 및 상이한 극한성 고세균의 혼합물이다.
상응되는 경우 바이러스 구조 및 바이러스 막의 성분은 진핵생물, 원핵생물 및 고세균막과 상이하다. 이는 예컨대 문헌[Lorizate et al., "Comparative lipidomics analysis of HIV-1 particles and their producer cell membrane in different cell lines", Cellular Microbiology, 15(2), p. 292-304, 2013] 및 [Brugger et al., "The HIV lipidome: A raft with an unusual composition", PNAS, Vol. 103, No. 8,p. 2641-2646, 2006]에 상세 보고되어 있다.
로리제이트(Lorizate) 등은 다양한 연구에서 HIV-1 막이 제조자 세포 원형질 막과 상이하다고 보고했는데, 기존 하위 도메인으로부터의 바이러스 버딩(budding) 또는 특수화된 버딩 막의 바이러스-매개된 유도를 주장한다. 두 개의 상이한 세포주에서 정제된 원형질 막과 HIV-1의 지질 분석은 조사된 세포 유형과는 무관하게, 숙주 세포 원형질 막과 비교하여 바이러스 막의 상당히 상이한 지질 조성을 밝혀냈다. 바이러스 입자는 제조자 세포의 숙주 세포 원형질 막과 비교할 때 포스파티딜세린, 스핑고미엘린, 헥소실세라마이드 및 포화 포스파티딜콜린 종에서 유의하게 풍부하였다. 이는 불포화 포스파티딜콜린 종, 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜이노시톨의 감소된 수준을 보였다. HIV-1의 지질 조성과 공여자 원형질 막의 세포 유형-특이적 차이는 MT-4 세포에서 유래한 HIV-1에서만 강하게 농축된 플라자마로겐-포스파티딜에탄올아민에 대해 관찰되었다. MT-4 세포-유래 HIV-1에는 다이하이드로스핑고미엘린도 포함되어 있다. 종합하면 로리제이트 등에 의해 보고된 이 데이터는 HIV-1이 형태 형성을 위해 특정 지질 환경을 선택하고 숙주의 세포 막과 동일하거나 유사하지 않는다는 것을 입증한다. 일반적으로, 본 발명의 방법에 의해 수득된 입자 및 라이브러리는 바이러스 단백질 및/또는 바이러스 막을 함유하지 않는다.
외피 바이러스에는 오르톰옥시바이러스, 플라비바이러스 및 레트로바이러스가 포함된다. 외피 바이러스의 예로는 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C, 영향 바이러스 D, 바트켄 바이러스, 버번 바이러스, 도리 바이러스, C형 간염 바이러스, 뎅기열 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 엔테베박쥐 바이러스, 황열병 바이러스, 지카 바이러스, HTLV 1 및 HIV 등이 있다.
본 발명의 방법의 단계 (d)
본 발명의 방법의 단계 (d)에서 지지체가 결합된 살리프로 입자는 지지체로부터 용리될 수 있다. 특정 적용례(예컨대 바이오센서 또는 랩온어칩)의 경우 지지체 결합 살리프로 입자가 관심 생성물이기 때문에 이 단계는 선택 사항이다. 따라서, 이러한 경우 지지체에서 입자를 용리할 필요가 없다.
화학적 결합(i)의 형성을 통한 지지체에 대한 소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질의 공유 결합은 다수의 경우에 실질적으로 비가역적이다. 용리의 경우, 예컨대 역 커플링 반응 또는 다른 절단 반응을 수행하여 화학 결합을 용해해야 한다. 예컨대, 절단 결합이 있는 링커가 사용될 수 있다. 이는 예컨대 프로테아제(예컨대 TEV 프로테아제)와 함께 인큐베이션과 함께 용리를 허용하는 프로테아제 절단 부위를 포함하는 링커일 수 있다. 대조적으로, 친화성 상호작용(ii), 가교제를 통한 간접 상호작용(iii), 소수성 상호작용(iv) 또는 정전기적 상호작용(v)을 통한 살리프로 입자의 결합은 통상적으로 가역적이고 입자의 비교적 용이한 용리 및 종종 지지체의 재생 및 이의 재사용을 허용한다.
지지체로부터 조립된 살리프로 입자의 용리는 지지체와 표적 분자 사이, 특히 전술한 바와 같이 포획 잔기와 결합 잔기 사이의 상호작용 유형에 의존하는 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다. 적합한 용리 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 당업자는 표적 분자가 지지체에 선택적으로 결합되는 상호작용의 종류에 따라 적절한 용리 전략을 선택할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "용리"는 지지체가 결합된 살리프로 입자의 제거 또는 위치변경을 지칭한다.
예컨대, 성분 중 하나와 지지체 사이의 친화성 상호작용(ii)에 의해 결합된 살리프로 입자는 친화성 상호작용을 방해 및/또는 대체하는 특정 분자를 액체 환경에 제공함으로써 용리된다. 예컨대, 표적 분자가 His-태그로 태그되고 지지체가 Ni2+-NTA 포획 잔기를 운반하는 경우, 지지체가 결합된 살리프로 입자를 이미다졸과 접촉시켜 용리를 수행한다. 동일한 방법으로, 표적 분자가 GST-태그로 태그되고 지지체가 포획 잔기로서 글루타티온을 포함하는 경우, 지지체가 결합된 살리프로 입자를 글루타티온과 접촉시켜 용리를 수행할 수 있다. 표적 분자와 지지체 사이의 간접적인 상호작용(iii)을 매개하는 가교제에 의해 결합된 살리프로 입자의 용리는 가교제 또는 링커를 절단하거나 가교제와 포획 및/또는 또는 결합 잔기 사이의 상호작용을 중단시킴으로써 수행될 수 있다. 포획부와 결합부 사이의 수용체/리간드 유사 상호작용의 경우 표적 분자의 당 잔기에 결합하는 지지체에 렉틴이 부착된 경우 당과 같은 경쟁적 결합 물질을 사용하여 용리를 수행할 수 있다. 소수성 상호작용(iv)에 의해 지지체에 결합된 살리프로 입자의 용리는 액체 환경에서 염 농도를 감소시켜 용매화를 촉진하고 결합된 물질의 용리를 촉진함으로써 달성할 수 있다. 살리프로 입자가 지지체(v)에 정전기적 상호작용에 의해 결합된 경우 지지체가 결합된 살리프로 입자를 둘러싼 액체 환경에서 pH 또는 염 농도를 변경하여 용리를 수행할 수 있다.
특정 양태에 따라, 상기 기재된 단계, 특히 단계 (a), (b.1)/(b.2), (c.1)/(c.2) 및 (d)는 1℃ 내지 85℃, 특히 1℃ 내지 40℃, 특히 바람직하게는 1℃ 내지 30℃의 온도에서 수행된다. 1℃ 내지 25℃, 특히 1℃ 내지 20℃, 가장 특히 3℃ 내지 15℃의 온도가 대부분의 적용례에 충분하다. 그러나, 본원에 교시된 방법에 의해, 당업자는 사용된 막, 화합물, 지질 및 단백질의 온도 안정성과 관련하여 최적의 인큐베이션 온도를 결정할 수 있다.
또한, 본원에 사용된 용어 "본질적으로"는 본 발명에 따른 방법에 사용되는 추가 성분, 예컨대 상기 방법에 사용되는 소수성 제제 및/또는 지질 또는 제제의 제공에 사용되는 미정제 막의 추가 성분, 예컨대 세제의 미량도 살리프로 입자에 존재할 수 있음을 의미한다. 그러나, 살리프로 입자가 하나 이상의 사포신 유사 단백질과 세포 또는 세포 소기관 막으로부터 수득된 막의 성분으로 본질적으로 이루어짐은 특히 더 이상의 지질 및/또는 단백질이 첨가되지 않음을 의미한다.
본 발명의 방법에 따라 수득할 수 있는 살리프로 입자 또는 살리프로 입자의 라이브러리는 의약 분야, 특히 질환의 예방, 치료 또는 중증도 경감, 진단 방법, 미용 치료 또는 예방 접종 제형으로 사용될 수 있다.
예컨대 살리프로 입자는 이를 필요로 하는 개체에게 하나 이상의 막 단백질 및/또는 지질을 전달하기 위한 약학 조성물에 포함될 수 있고, 상기 조성물은 상기 기재된 바와 같은 살리프로 입자를 포함한다.
살리프로 입자 외에, 약학 조성물은 임의적으로 (추가) 약학적으로 허용되는 비히클, 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다.
살리프로 입자가 약학 조성물에 사용될 때, 입자 및 약학 조성물의 개별 성분은 약학적으로 허용가능해야 한다. 본원에 사용된 용어 "약학적으로 허용되는"은 양호한 의학적 판단의 범위 내에서, 과도한 독성, 자극 및 알레르기 반응 등 없이 인간 및 하등 동물의 조직에 접촉하여 하용하기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 성분, 화합물 또는 제제를 지칭한다.
살리프로 입자를 함유하는 약학 조성물은 치료되는 질병 또는 상태의 중증도에 따라 경구, 직장, 비경구, 흉골내, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고 또는 점적제), 구강, 에어로졸, 경구 또는 비강 스프레이 등을 통해 인간 및 기타 동물에게 투여될 수 있다. 특히, 약학 조성물은 장내, 비경구 및/또는 국소 투여용으로 제형화될 수 있다. 이는 캡슐, 주입 또는 주사, 솔질 또는 음용가능한 조성물 또는 에어로졸로 투여될 수 있다. 또한, 살리프로 입자가 고체 형태, 분산액 또는 용액 형태로 존재하는 약학 조성물이 본원에 기재되어 있다.
살리프로 입자는 진단 및/또는 미용 용도에도 유용하다. 예컨대, 전술한 바와 같은 검출가능한 항원 또는 태그를 포함하는 살리프로 입자는 진단제로서 사용될 수 있고 진단 목적으로 적용될 수 있다. 후자의 경우, 용리 단계 (d)가 생략되는 경우, 본 발명에 의해 수득가능한 지지체 결합 형태의 살리프로 입자를 사용하는 것도 매우 유용할 수 있다. 본 발명에 따른 진단 및 생명 과학 연구 도구의 예는 태그가 포함된 막 단백질, 태그된 사포신 유사 단백질, 태그된 지질, 포함된 형광단 또는 조영제(예컨대 MR 영상화용)를 갖는 입자를 포함한다. 태그는 예컨대 형광 태그일 수 있다.
또다른 양상에서, 살리프로 입자는 백신 접종 제제, 이의 담체 또는 약물 전달 비히클로서 유용하다. 백신 접종에서 특히 강력할 수 있는 다수의 병원성 항원은 환자의 진핵 또는 원핵 병원체 또는 질병 세포(예컨대 암 세포)의 표면 및/또는 외부 세포 막에 노출되어 있다. 이들 항원은 예컨대 병원성 지질, 기타 소수성 생체분자 또는 막 단백질로부터 유래될 수 있다. 살리프로 입자를 사용하면 이러한 항원을 입자에 효과적으로 통합할 수 있고, 이는 백신 접종 제형에서 항원 제시 전달 비히클로 사용될 수 있다. 이러한 맥락에 따라, 살리프로 입자는 또한 적합한 숙주 동물, 바람직하게는 예컨대 토끼, 염소, 라마, 마우스 및 영장류와 같은 포유동물에서 지질 또는 막 단백질에 대한 항체를 생성하기 위한 항원 제시 전달 비히클의 역할을 하는 데 유용하다.
또한 약물 개발, 약물 스크리닝 및 약물 발견을 위한 도구로서 살리프로 입자의 사용이 본원에 기재되어 있다.
예컨대 세포 표면 수용체 또는 이온 채널과 같은 특정 막 단백질 약물 표적은 살리프로 입자에 혼입되어 천연 상태로 가용화될 수 있다. 이어서, 이러한 입자는 고유 지질 이중층 환경에서 약물 표적 막 단백질의 활성을 연구하기 위한 분석에 사용되거나 신약을 식별하기 위한 약물 스크리닝에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라, 살리프로 입자는 지지체에 하나의 입자 성분과 선택적으로 결합되면서 조립된다. 이렇게 수득된 지지체 결합 살리프로 입자는 SPR(표면 플라즈몬 공명), GCI(격자 결합 간섭계) 또는 기타 바이오센서 적용례뿐만 아니라 랩온어칩과 같은 칩 기반 적용례에 직접 사용할 수 있다.
라벨이 없는 광학 SPR 바이오센서는 분자 상호작용의 결합 친화도 및 동역학을 측정하기 위한 훌륭한 표준이다. SPR 바이오센서 플랫폼은 주로 지이 헬스케어(GE Healthcare)의 바이아코어(Biacore) T100, 바이오 라드(Bio Rad)의 프로테온(ProteOn) XPR36, 포르테바이오(ForteBio)의 옥텟(Octet) RED384, 및 워삿치 마이크로플루이딕스(Wasatch Microfluidics)의 IBIS MX96으로 4개가 있다.
SPR 바이오센서 대신, GCI 기반 도파관 간섭계를 사용하여 분자 상호작용을 특성규명하고/거나 상호작용하는 분자의 운동 속도, 친화도 상수 및 농도를 결정할 수 있다.
SPR 및 GCI 기반 광학 측정은 상호작용하는 분자의 복잡한 형성에 의한 질량 변화에 기인하는 센서 표면 근처의 소멸장 내에서 굴절률 변화를 감지하지만, 다른 바이오센서 시스템은 상이한 감지 전략을 적용한다. 열량계 바이오센서는 반응에 의해 흡수 또는 방출되는 열을 기록한다. 전위차 바이오센서는 전위로 이어지는 전하 분포를 감지한다. 또한, 전류계 바이오센서는 산화환원 반응에서 생성된 전자의 움직임을 나타낼 수 있다. 또한, 바이오센서는 반응 과정에서 빛의 출력을 감지하거나 반응물과 생성물(광학 바이오센서) 간의 흡광도 차이를 감지할 수도 있다. 또한, 압전 바이오센서는 바이오센서 표면에 결합된 반응물 또는 생성물의 질량에 기인하는 효과를 이용한다. 이러한 모든 바이오센서 적용례는 연구 대상 분자 중 하나가 지지체에 결합되어 있다는 점에서 공통점이 있다. 본 발명의 방법은 관심의 소수성 제제를 지지체가 결합된 살리프로 입자에 직접 혼입하기 위한 쉽고 직접적인 "1-단계" 방법을 제공한다. 이는 추가적인 결합 단계의 필요성을 없애고, 따라서 공정 효율성 및 비용 면에서 유리하다.
본 발명의 방법은 또한 막 단백질 정제, 막 단백질 발현, 막 및/또는 막 단백질 연구, 특히 지질체학 및 단백질체학, 바람직하게는 막 및/또는 막 단백질의 분리, 동정 및/또는 연구, 또는 지질체 또는 단백질체 라이브러리 또는 데이터베이스 생성을 위한 도구로서 사용될 수 있다.
살리프로 입자는 일반적으로 불용성 막 단백질 및 막 도메인 또는 성분이 본래의 막 이중층 미세환경에서 수용액에 용해되도록 하는 데 유용하다. 본 발명의 방법으로 수득된 살리프로 입자는 막 단백질 연구에서 매우 다양한 신규 적용례에 사용될 수 있다. 예컨대, 살리프로 입자는 핵자기공명(NMR), X선 결정학, 전자현미경(EM), 질량분석법, 등온 적정 열량측정법(ITC), 시차광 산란, 소각 X선 산란(SAXS), 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 형광 활성화 세포 분류(FACS), 생화학적 분석, 고처리량 스크리닝(HTS) 등과 같은 방법으로 살리프로 입자에 혼입된 막 단백질을 연구할 수 있다.
본 발명의 방법의 특정 양태로 수득할 수 있는 입자 라이브러리는 시스템 생물학, 특히 지질체학 및 막 단백질체학 분야의 연구에 특히 유용하다. 본 발명의 라이브러리는 바이러스, 세포 또는 세포 소기관의 지질체 및/또는 단백질체를 포획하고 가용화하는데 적합할 수 있다. 지질학 및 단백질체학의 일반적인 분석 기술은 질량 분석법(MS), 핵 자기 공명(NMR) 분광법, 형광 분광법 및 계산 방법과 같은 기술이다. 이러한 방법이나 기술을 살리프로 입자에 적용하면 암, 자가면역 질환, 비만, 죽상동맥경화증, 뇌졸중, 고혈압 및 당뇨병과 같은 다수의 대사성 질환에서 천연 지질 및 막 단백질의 역할을 더욱 자세히 설명할 수 있다. 라이브러리가 지지체 결합 상태에 있는 경우, 특히 실질적으로 평면인 표면이 있는 고체 지지체에 결합된 경우 공간적 2차원 분리 및 살리프로 입자의 부동화가 이루어지고, 이는 이러한 복잡한 혼합물의 분석을 도움이 된다.
질병의 표적이 될 수 있는 특정 세포 또는 세포 소기관에서 수득된 전체 살리프로 입자 라이브러리는 표적 세포 또는 세포 소기관의 막에 존재하는 막 단백질 또는 지질과 같은 새로운 분자 약물 표적을 식별하기 위한 약물 스크리닝 목적으로 사용할 수 있다.
본 발명은 이하에서 본 발명의 특정 양태를 도시하는 도면을 참조하여 설명될 것이다. 그러나, 본 발명은 청구범위에 정의되어 있고 여기에 일반적으로 설명되어 있다. 아래의 도면에 예시를 위해 도시된 양태로 제한되지 않아야 한다.
도 1은 선행 기술의 지단백질 입자를 도시한 것이다. 도 1은 지질(3) 및 아포지단백질 스캐폴드 단백질(11)을 포함하는 선행 기술(상기 논의된 EP 1 596 828 B1)의 나노디스크 입자(10)를 함유하는 아포지단백질 A-1의 형태 및 분자 조직의 개략도이다.
도 2a 내지 2c는 특정 양태에 의해 수득된 측면도(좌측) 및 상면도(우측)의 살리프로 입자의 개략도이다. 도 2a, 2b 및 2c에는 사포신 유사 단백질(2), 지질(3), 막 단백질(4a)/올리고머 막 단백질(4b) 및 임의적으로, 소수성 화합물(4c)을 포함하는 살리프로 입자가 도시되어 있고, 여기서 막 단백질(4a, 4b)은 결합 잔기(5)를 포함한다.
도 3a 내지 3c는 특정 양태에 의해 수득된 측면도(좌측) 및 상면도(우측)의 살리프로 입자의 개략도이다. 도 3a, 3b 및 3c에는 사포신 유사 단백질(2), 지질(3) 및 임의적으로, 막 단백질(4a)/올리고머 막 단백질(4b)을 포함하는 살리프로 입자가 도시되어 있고, 여기서 사포신 유사 단백질(2)은 결합 잔기(5)를 포함한다.
도 4a 내지 4b는 특정 양태에 의해 수득된 측면도(좌측) 및 상면도(우측)의 살리프로 입자의 개략도이다. 도 4a 및 4b에는 사포신 유사 단백질(2), 지질(3), 소수성 화합물(4c) 및 임의적으로, 막 단백질(4a)을 포함하는 살리프로 입자가 도시되어 있고, 여기서 소수성 화합물(4c)은 결합 잔기(5)를 포함한다.
도 5a 내지 5b는 특정 양태에 의해 수득된 측면도(좌측) 및 상면도(우측)의 살리프로 입자의 개략도이다. 도 5a 및 5b에는 사포신 유사 단백질(2), 지질(3), 소수성 화합물(4c) 및 임의적으로, 막 단백질(4a)을 포함하는 살리프로 입자가 도시되어 있고, 여기서 사포신 유사 단백질(2)은 결합 잔기(5)를 포함한다.
도 6a 내지 6f는 특정 양태에 대한 소수성 제제를 제공하기 위한 모드의 개략도이다. 도 6a 및 6d에는 지질(3) 및 임의적으로, 막 단백질(4a, 4b)을 포함하는 미정제 막 소포(7, 7')가 도시되어 있고, 여기서 도 6a에서 막 단백질(4a)은 결합 잔기(5)를 포함한다. 도 6b 및 도 6e에는 지질(3) 및 세제 분자(6)와 결합된 막 단백질(4a)이 도시되어 있고, 여기서 도 6b에서 막 단백질(4a)은 결합 잔기(5)를 포함한다. 도 6c 및 도 6f에는 지질(3) 및 세제 분자(6)와 관련된 소수성 화합물(4c) 이 도시되어 있고, 도 6c에서 소수성 화합물(4c)은 결합 잔기(5)를 포함한다.
도 7a 내지 7b는 특정 양태에 대한 사포신 유사 단백질을 제공하기 위한 모드의 개략도이다. 도 7a 및 7b에는 사포신 유사 단백질(2)이 도시되어 있고, 도 7a에서 사포신 유사 단백질(2)은 결합 잔기(5)를 포함한다.
도 8a 내지 8d는 각각 단계 (b.2) 및 (b.1)에서 지지체가 결합된 소수성 제제 또는 사포신 유사 단백질의 특정 양태의 개략도이다. 도 8a에는 결합 잔기(5)를 통해 지지체(12)의 포획 잔기(13)에 결합된 사포신 유사 단백질(2)이 도시되어 있다. 도 8b에는 결합 잔기(5)를 통해 지지체(12)의 포획 잔기(13)에 결합된 지질(3) 및 세제 분자(6)와 결합된 소수성 화합물(4c)이 도시되어 있다. 도 8c에는 결합 잔기(5)를 통해 지지체(12)의 포획 잔기(13)에 결합된 지질(3) 및 세제 분자(6)와 결합된 막 단백질(4a)이 도시되어 있다. 도 8d에는 지질(3) 및 막 단백질(4a, 4b)을 포함하는 미정제 막 소포(7)가 제시되어 있고, 이는 막 단백질(4a)의 결합 잔기(5)를 통해 지지체(12)의 포획 잔기(13)에 결합된다.
도 9a 내지 9c는 소수성 제제가 단계 (b.2)에서 지지체에 결합되고 단계 (c.2)에서 사포신 유사 단백질과 접촉되는 특정 양태의 단계 (b.2) 및 (c.2)의 개략도이다. 도 9a에서 지질(3) 및 세제 분자(6)와 결합된 지지체(12)가 결합된 막 단백질(4a)은 단계 (c.2)에서 살리프로 입자의 자가 조립을 허용하기 위해 사포신 유사 단백질(2)과 접촉된다(도 2a와 비교). 도 9b에서 지질(3) 및 세제 분자(6)와 결합된 지지체(12)가 결합된 소수성 화합물(4c)은 사포신 유사 단백질(2)과 접촉되어 단계 (c.2)에서 살리프로 입자가 자가 조립될 수 있게 한다(도 4a 비교). 도 9c에서, 지질(3) 및 막 단백질(4a, 4b)을 포함하는 지지체(12)가 결합된 미정제 막 소포(7)를 사포신 유사 단백질(2)과 접촉하여 단계 (c.2)에서 살리프로 입자가 자가 조립될 수 있게 한다(도 2a와 비교).
도 10a 내지 10d는 사포신 유사 단백질이 단계 (b.1)에서 지지체에 결합되고 단계 (c.1)에서 소수성 제제와 접촉되는 특정 양태의 단계 (b.1) 및 (c.1)의 개략도이다. 도 10a에서 지지체 결합(12) 사포신 유사 단백질(2)은 지질(3) 및 세제 분자(6)와 결합된 막 단백질(4a)과 접촉하여 단계 (c.1)에서 살리프로 입자가 자가 조립될 수 있게 한다(도 3b와 비교). 도 10b에서 지지체 결합(12) 사포신 유사 단백질(2)은 지질(3) 및 막 단백질(4a, 4b)을 포함하는 미정제 막 소포(7, 7')와 접촉되어 단계 (c.1)에서 살리프로 입자가 자가 조립되고 입자 라이브러리가 형성될 수 있게 한다(도 3a, 3b, 3c 비교). 도 10c에서 지지체 결합(12) 사포신 유사 단백질(2)은 지질(3) 및 세제 분자(6)와 결합된 소수성 화합물(4c)과 접촉하여 단계 (c.1)에서 살리프로 입자가 자가 조립될 수 있게 한다(도 5a 비교). 도 10d에서 지지체 결합(12) 사포신 유사 단백질(2)은 소수성 화합물(4c) 및 막 단백질(4a)과 접촉되어 둘 다 지질(3) 및 세제 분자(6)와 결합하여 단계 (c.1)에서 살리프로 입자가 자가 조립될 수 있게 한다(도 5b 비교).
도 11은 실험 1c의 결과를 도시한 것이다. 도 11은 태그된 SLC 수송체(막 단백질)를 친화성 지지체에 결합시키고 지지체 결합 SLC 수송체를 상이한 농도의 사포신 A와 접촉시킬 때 살리프로 입자 조립체의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 12a 및 12b는 실험 1d의 결과를 도시한 것이다. 도 12a는 실험 1c의 샘플 5로부터 수득된 살리프로 입자의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다. 크기 배제 크로마토그래피 동안 수득된 분획을 SDS-PAGE로 분석하여 분획 13, 14 및 15가 주로 조립된 살리프로 입자를 포함함을 나타낸다. 도 12b는 도 12a에 도시된 바와 같이 분획 14의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 13은 실험 3c의 결과를 도시한 것이다. 도 13은 사포신 A를 친화성 지지체에 결합시키고 지지체가 결합된 사포신 A를 추가의 태그 없는 사포신 A, 뇌 지질 및 임의적으로, 박테리아 이온 채널 막 단백질 T2 형태의 소수성 제제와 접촉시킬 때 살리프로 입자 조립체의 크기 배제 크로마토그래피 분석을 나타낸다.
도 14a 내지 14b는 문헌[Bruhn(2005), Biochem J 389(15): 249-257]의 도 4A 및 4B를 재현한 것이다. 서열은 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 서열번호 7 내지 46으로 제시된다.
도 1은 지질(3) 및 지질 결합 폴리펩티드(11)로서 아포지단백질 A-1을 포함하는 나노디스크 입자(10)를 함유하는 선행 기술의 아포지단백질 A-1(상기 논의된 EP 1 596 828 B1 참조)을 도시한 것이다. 선행 기술의 아포지단백질 유래 나노디스크와 달리, 본 발명의 지질 결합 폴리펩티드, 즉 사포신 유사 단백질은 이중 벨트 유사 방법으로 지질을 둘러싸지 않고(도 2, 3 및 4 참조), 오히려 본 발명의 입자는 실질적으로 본 발명의 방법에 의해 수득된 주어진 살리프로 입자 내의 개별 사포신 유사 단백질 사이의 단백질들 간의 직접적인 단백질 접촉 없이 머리-대-꼬리 배향으로 배열된 2개 이상의 대략 V-형 또는 부메랑-형 지질 결합 폴리펩티드에 의해 둘러싸인 막 지질을 포함하는 코어에 의해 함께 유지된다(도 2, 3 및 4 참조).
도 2a 내지 2c는 특정 양태에 따라 수득된 살리프로 입자의 개략도를 도시한 것이다. 도 2a, 2b 및 2c의 입자는 사포신 유사 단백질(2), 복수의 상이한 지질(3), 막 단백질(4a)/올리고머 막 단백질(4b) 및 임의적으로, 소수성 화합물(4c)을 포함한다. 도 2a 내지 도 2c의 막 단백질(4a, 4b)은 결합 잔기를 포함한다. 막 단백질의 결합 잔기는 천연 또는 조작된 결합 잔기일 수 있다. 막 단백질의 결합 잔기는 N-말단, C-말단 또는 막 단백질의 아미노산 서열 내에 존재할 수 있다. 막 단백질이 조작된 결합 잔기를 포함하는 경우, 단백질 합성 중 또는 후에 막 단백질에 부착될 수 있다. 도시되지 않은 또다른 양태에서, 막 단백질(4a, 4b)은 동일하거나 상이한 유형의 다중 결합 잔기를 가질 수 있다. 도 2a 내지 도 2c에 도시된 살리프로 입자의 지질(3)은 상이하고, 이는 살리프로 입자의 지질 조성이 균일하지 않거나 균질하지 않음을 의미한다. 단계 (a)에서 막 단백질(4a, 4b)이 제공되는 방식에 따라 지질의 조성이 달라진다. 도시되지 않은 추가 양태에서, 살리프로 입자는 또한 바이러스, 고세균, 진핵생물 및/또는 원핵생물 막에 전형적으로 존재하는 추가 성분을 포함할 수 있다. 지질(3) 및 막 단백질(4a, 4b)은 동일한 바이러스, 고세균, 진핵 또는 윈핵세포 막 공급원 또는 다른 공급원에서 유래할 수 있다.
도 2a 내지 2c의 입자는 축척에 따라 그려지지 않았다. 입자에 혼입된 막 단백질(4a, 4b)의 크기에 따라 입자는 다른 입자와 비교하여 크기가 실질적으로 다를 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 살리프로 입자는 크기가 유연하다. 예컨대, 올리고머 막 단백질을 포함하는 도 2b의 입자는 단량체 막 단백질을 포함하는 도 2a의 입자와 비교하여 더 크고 더 다수의 사포신 서브유닛(2)을 포함한다. 살리프로 입자의 크기에 따라 입자는 입자당 2개 이상의 사포신 유사 분자를 포함하되, 이들은 머리에서 꼬리까지 배열된다. 도 2a 및 2c에 도시된 입자는 2개의 사포신 유사 분자를 포함하는 반면, 도 2b에 도시된 입자는 3개의 사포신 유사 분자를 포함한다.
도 2a, 2b 및 2c는 사포신 유사 단백질(2), 바이러스, 고세균, 진핵생물 및/또는 원핵생물 막 공급원으로부터의 지질(3), 막 단백질(4a, 4b) 및 임의적으로, 소수성 화합물을 포함하는 살리프로 입자를 측면도 및 평면도의 단순화된 형태로 도시한다. 막 단백질(4a)은 단량체 형태의 내재성 막횡단 단백질일 수 있다. 그러나, 막 단백질은 또한 도 2b에 도시된 바와 같이 올리고머 형태의 내재성 막횡단 단백질, 말초 막 단백질, 지질 결합 상태의 양친매성 단백질, 지질-고정된 단백질 또는 융합된 소수성 및/또는 막횡단 도메인을 갖는 키메라 단백질일 수도 있되, 이들 모두는 단량체 또는 올리고머 상태일 수 있다.
도 2c에 도시된 입자는 천연 또는 합성 유래의 소수성 화합물(4c)을 추가로 포함한다는 점에서 2a 및 2b와 상이하다. 하나의 살리프로 입자 내 소수성 화합물의 수는 다양할 수 있다. 소수성 화합물은 지질(3) 및/또는 모든 종류의 막 단백질과 긴밀한 상호작용을 형성할 수 있다. 막 단백질은 예컨대 도 2c에 도시된 바와 같이 단량체성 막횡단 단백질(4a)일 수 있다.
도 3a 내지 도 3c(다시 단순화된 개략 형태(좌측면도 및 우측면도)이고, 축척에 따라 도시되지 않음)는 특정 양태에 따라 수득된 살리프로 입자를 도시한 것이다. 도 3a, 3b 및 3c에 도시된 입자는 사포신 유사 단백질(2), 지질(3) 및 임의적으로, 단량체 또는 올리고머 형태의 막관통 단백질(4a, 4b)을 포함하되, 사포신 유사 단백질(2)은 결합 잔기(5)를 가진다. 도시되지 않은 다른 양태에서, 사포신 유사 단백질(2)은 동일하거나 상이한 유형의 다중 결합 잔기를 가질 수 있다. 도 2의 입자에 대해 설명된 바와 같이, 도 3에 도시된 입자는 단순히 2개 이상의 사포신 유사 단백질(2)을 혼입하여 소수성 단백질을 형성함으로써, 임의의 종류의 소수성 단백질을 혼입하도록 지질(3) 조성 및 그의 크기에 따라 달라질 수 있다.
도 4a 및 4b는 본 발명의 특정 양태의 측면도(좌측) 및 상면도(우측)에서 살리프로 입자의 축척되지 않은 개략도를 도시한 것이다. 도 4a 및 4b에 도시된 입자는 사포신 유사 단백질(2), 지질(3), 소수성 화합물(4c) 및 임의적으로, 막 단백질(4a)을 포함한다. 소수성 화합물은 자연적 또는 조작된 유래일 수 있는 결합 잔기를 나타낸다. 천연 결합 잔기는 소수성 화합물(4c)의 내부 부분을 형성할 수 있지만, 조작된 결합 잔기는 일반적으로 소수성 화합물의 합성 후 또는 천연 소수성 화합물의 정제 후에 적합한 말단 반응기에 부착된다. 도시되지 않은 추가 양태에서, 살리프로 입자는 동일한 천연 또는 조작된 결합 잔기를 갖는 상이한 종류의 소수성 화합물을 포함할 수 있다. 도 4a 및 4b의 입자는 입자에 혼입된 지질(3), 소수성 화합물(4c), 막 단백질(4a) 및 사포신 유사 단백질(2)의 수 및 종류가 다를 수 있다.
도 5a 및 5b(비축척 및 계략적 형태(좌측면도 및 우측면도))는 특정 양태의 살리프로 입자를 도시한 것이다. 도 5a 및 5b에 도시된 입자는 소수성 화합물(4c)이 아닌 사포신 유사 단백질(2)이 결합 잔기를 보유한다는 점에서 도 4a 및 4b에 도시된 입자와 상이하다. 도 5a 및 5b에 도시된 입자의 상이한 조성(도시되지 않음)과 관련하여, 도 4a 및 4b에 대해 설명된 것과 동일한 고려사항이 적용된다.
도 6a 내지 6f는 본 발명의 방법의 단계 (a)에서 소수성 생체분자(즉 단량체(4a) 또는 올리고머(4b) 형태의 막횡단 단백질) 또는 소수성 화합물 형태의 소수성 제제를 제공하는 특정 양태를 도시한 것이다. 도 6a에서 막 단백질(4a, 4b)은 미정제 막 소포(7, 7')로 제공된다. 막 소포(7, 7')는 바이러스, 고세균, 진핵생물 또는 원핵생물 유래일 수 있다. 이들은 복수의 지질(3) 및 소포(7)의 경우 복수의 막 단백질을 포함하되, 2개의 막 단백질(4a, 4b)에 의해 단순화된 형태로 예시되고, 여기서 막 단백질(4a)은 결합 잔기(5)를 가진다. 소포(7')는 "빈" 지질 전용 입자이다. 소포(7, 7')로 예시된 미정제 막 소포는 예컨대 고세균, 원핵생물 또는 진핵생물 유래의 세포 또는 세포 소기관을 용해함으로써 직접 수득할 수 있다. 미정제 막 소포는 바이러스 외피를 파열시켜 수득할 수도 있다. 소포(예컨대 7 및 7')는 통상적으로 용해 또는 막 파열 시 자발적으로 형성된다. 미정제 막 소포는 세제 분자(본원에 도시되지 않음)를 포함하거나 이에 회합될 수 있다. 도 6b에서, 결합 잔기(5)를 갖는 막 단백질(4a)이 도시되어 있는데, 이는 천연 막 또는 미정제 막 소포 내에 존재하지 않지만 인공 세제-가용화된 상태이다(도 6b에 도시된 지질(3) 및 세제 분자(6)를 갖는 막 단백질(4a)의 회합 참고). 도 6c에서 세제-가용화된 상태의 결합 잔기(5)를 갖는 소수성 화합물이 도시되어 있는데, 이는 소수성 화합물이 지질(3) 및 세제 분자(6)를 함유하는 미셀 내에 내포되어 있음을 의미한다. 선택적으로, 도 6b에 도시된 막 단백질(4a) 또는 도 6c에 도시된 소수성 화합물은 세제 분자에 의해서만 가용화된다. 도 6d 내지 6f에 도시된 소수성 제제를 전달하는 방식은 막횡단 단백질(4a, 4b) 또는 소수성 화합물(4c)로 예시되는 소수성 생체분자가 조립 잔기를 포함하지 않는다는 점에서 도 6a 내지 6c와 상이하다.
도 7a 및 7b는 본 발명의 방법에서 사포신 유사 단백질을 제공하기 위한 특정 양태를 도시한 것이다. 도 7a는 사포신 유사 단백질이 천연 또는 조작된 유래의 결합 잔기를 가진다는 점에서 도 7b와 상이하다. 천연 결합 잔기가 사포신 유사 단백질의 천연 아미노산 서열의 일부를 형성하는 반면, 조작된 유래의 결합 잔기는 사포신 유사 단백질의 합성 동안 또는 후에 부착될 수 있다. 조작된 결합 잔기는 본 발명의 방법에서 포획 잔기인 상응하는 결합 짝에 높은 친화도로 결합하도록 최적화된다. 추가 양태에서, 사포신 유사 단백질은 세제 분자(본원에 도시되지 않음)와 회합될 수 있다.
도 8a 내지 8d는 지지체 결합 사포신 유사 단백질(도 8a) 및 소수성 제제(도 8b 내지 8d)의 비축척 예시를 나타낸다. 지지체(12)의 포획 잔기(13)에 대한 사포신 유사 단백질(도 8a 참조) 또는 소수성 제제(도 8b 내지 8d 참조)의 결합 잔기의 선택적 결합은 지지체에서 단일 포획 잔기에 대해 예시된 것이다. 실제로, 지지체는 일반적으로 동일하거나 심지어 상이한 유형의 복수의 포획 잔기를 갖추고 있다. 결합 잔기/포획 잔기 인식 쌍의 상호작용은 화학적 결합 형성, 친화도 기반 상호작용(가교제에 의한 매개 포함), 소수성 상호작용 및/또는 정전기적 상호작용을 기반으로 할 수 있다. 지지체가 결합된 사포신 유사 단백질(2)은 세제-가용화된 상태(본원에 도시되지 않음)에 있을 수 있다. 또한, 미정제 막 소포(7)는 세제 분자(본원에 도시되지 않음)를 포함하거나 이에 회합될 수 있다. 도 8d의 막 단백질(4a, 4b)은 미정제 막 소포(7)의 형태로 천연 지질 환경에 내포되는 반면, 소수성 화합물(4c) 및 막 단백질(4a)은 인공 세제-가용화된 상태, 이에 의해 상기 소수성 제제 주위의 미셀이 지질 및 세제에 의해 형성될 수 있다. 추가 양태에서, 사포신 유사 단백질(2) 및/또는 소수성 제제를 가용화하기 위해 사용되는 세제는 동일하거나 상이한 화학적 성질을 가질 수 있다.
도 9a 내지 9c는 방법 단계 (b.2) 및 (c.2)의 특정 양태를 간략하고 개략적인 형태로 도시한 것이다. 세제-가용화된 막 단백질(4a)(도 9a), 세제-가용화된 소수성 화합물(4c)(도 9b) 및 미정제 막에 내포된 막 단백질(4c) 형태의 지지체 결합 소수성 제제 소포(7)(도 9c)는 임의적으로 세제-가용화된 상태인 단계(c.2)에서 사포신 유사 단백질(2)과 접촉된다. 일반적으로 입자의 자가 조립은 지지체가 결합된 소수성 제제가 사포신 유사 단백질(2)과 접촉할 때 지지체에서 직접 발생한다. 임의적으로 바이러스, 고세균, 진핵생물 및/또는 원핵생물 유래의 추가 가용화된 지질이 입자 조립 반응에 첨가되고, 이는 도 9a 내지 9c에 도시되지 않았다. 도 9a의 가용화된 막 단백질(4a) 및 가용화된 소수성 화합물(4c)은 단계 (b.2)에서 지지체에 선택적 결합을 위해 정제된 형태로 제공된다. 도 9a 및 9b의 조립 입자는 실질적으로 가용화된 막 단백질(4a) 또는 소수성 화합물(4c)과 결합된 지질(3)로 구성된다. 임의적으로, 추가 지질이 지지체의 액체 환경에 추가된다. 도 9c에서 미정제 막 소포(7)는 지지체(12)에 결합되어 있다. 도 9c에 도시된 바와 같이, 결합 잔기(5)에 의해 지지체(12)의 포획 잔기(13)에 결합된 막 단백질(4a)만이 사포신 유사 단백질(2)과 접촉할 때 고체 지지체에 결합된 채로 남아 지지체에서 살리프로 입자가 자가 조립될 수 있게 한다. 단계 (b.2)에서 지지체에 결합된 미정제 막 소포의 초기 부분을 형성하고 지지체의 포획 잔기에 대한 상보적 결합 잔기를 제시하지 않는 기타 막 단백질(미정제 막 소포(7) 내의 다량체 막 단백질(4b)로 예시됨)은 지지체가 결합된 살리프로 입자에 혼입되지 않는다. 따라서, 도 9c에 도시된 양태는 단계 (b.2)에서 다수의 지지체가 결합된 미정제 막 소포로부터 단일 유형의 막 단백질(4c)을 포함하는 살리프로 입자의 제조를 허용한다. 조립된 입자에는 세제가 실질적으로 없다. 도 9a 내지 9c의 지지체 결합 입자는 용리될 수 있다. 용리 전략은 지지체(12)의 포획 잔기(13)와 소수성 제제의 결합 잔기(5) 사이의 상호작용 유형에 따라 상이하다.
도 10a 내지 10d는 방법 단계 (b.1) 및 (c.1)의 특정 양태를 간략하고 개략적인 형태로 도시한 것이다. 지지체 결합 사포신 유사 단백질은 세제-가용화된 막 단백질(단량체 막횡단 단백질(4a)로 예시됨, 도 10a 참조), 미정제 막 소포(소포(7, 7')로 예시됨), 도 10b 참조), 세제-가용화 소수성 화합물(4c)(도 10c 참조) 또는 세제-가용화 소수성 화합물(4c) 및 막 단백질(4a) 둘다(도 10d 참조)와 접촉되어 단계 (c.1)에서 지지체에서 각각의 살리프로 입자가 자가 조립될 수 있게 한다. 인접한 포획된 사포신 유사 단백질 또는 추가로 첨가된 자유 사포신 유사 단백질은 개별 살리프로 입자(도시되지 않음)를 형성하는 데 기여한다. 예컨대, 추가 사포신 유사 단백질은 사포신 지단백질 입자(도시되지 않음)가 자가 조립되게 하기 위해 단계 (c.1) 동안 또는 후에 첨가된다. 도 10a의 조립된 입자는 실질적으로 가용화된 막 단백질(4a)과 결합된 지질(3)로 구성된다. 가용화된 단백질은 일반적으로 단백질 정제 과정에 의해 수득되고 이러한 상황에서 세제 분자와 지질(3)을 포함하는 미셀에 빈번히 포함된다. 가용화된 막 단백질과 관련된 지질은 종종 막 단백질(4a)이 정제된 막의 "쉘 지질"이다. 막 단백질은 "천연" 막에서 정제할 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없다. 예컨대, 진핵생물 막 단백질은 박테리아 또는 바이러스와 같은 원핵생물 세포의 이식유전자로부터 과발현될 수 있고, 이로부터 막 단백질이 정제된다. 따라서, 세제-가용화된 진핵세포 막 단백질과 결합된 상태로 남아 있는 지질(3)은 이 정제된 단백질의 "천연" 지질 환경의 일부를 형성하지 않을 수 있다. 껍질 지질은 막 단백질(4a)의 소수성 표면에 단단히 달라붙는다. 임의적으로만 추가 지질이 살리프로 입자로의 혼입을 위해 액체 환경에 추가된다.
미정제 막 소포(도 10b에서 소포(7, 7')로 예시됨)를 단계 (c.1)에서 지지체 결합 사포신 유사 단백질과 접촉(도 10b 참조)하면 살리프로 입자의 지지체 결합 라이브러리 생성이 가능하다. 즉 지지체 결합 살리프로 입자는 사포신 유사 단백질(2), 지질(3) 및/또는 막 단백질(4a, 4b)을 포함하는 크기 및 조성이 상이하다. 소수성 제제를 포함하지 않는 "빈" 입자도 생성될 수 있다. 라이브러리의 입자에서 각각의 막 단백질(4a, 4b)은 그것이 획득된 막 환경에 포함되어 있다. 즉 막 단백질은 "천연" 지질 환경에 포함된 상태로 남아 있다. 따라서, 조립된 살리프로 입자에서 막 단백질(4a, 4b)과 결합된 지질(3)은 바람직하게는 미정제 막 소포(7)에 존재하는 막 단백질의 천연 지질 환경으로부터 이동된다. 바이러스 막, 고세균 막, 진핵생물 막 또는 원핵생물 막이 근원막 역할을 할 수 있다. 도 10c의 조립된 입자는 입자당 3개의 소수성 화합물을 포함한다. 물론, 단일 입자에 포함된 소수성 화합물의 수는 단계 (c.1)의 자가 조립 반응에 사용되는 지질에 대한 소수성 화합물의 몰비를 조정하여 조정할 수 있다. 도 10c의 소수성 화합물은 가용화된 상태로 자가 조립 반응에 첨가된다. 소수성 화합물의 가용화는 일반적으로 소수성 막 단백질의 가용화와 유사하게 세제 분자에 의해 달성된다. 도 10c에 도시된 바와 같이 지질은 소수성 화합물의 가용화된 상태의 일부를 형성할 수 있다. 선택적으로 추가 지질이 추가될 수 있다. 도 11d에 도시된 바와 같이 가용화된 소수성 화합물(4c) 및 막 단백질(4a) 형태의 소수성 제제는 단계 (c.1)에서 함께 적용될 수 있다. 가용화된 소수성 화합물 대 막 단백질의 임의의 원하는 분자 비는 수득된 입자의 조성에 영향을 미치는 것으로 선택될 수 있다. 도 10a 내지 10d에 도시된 조립된 입자는 일반적으로 세제가 실질적으로 없다. 도 10a 내지 10d의 지지체 결합 입자는 용리될 수 있다. 용리 전략은 포획 잔기(13)/결합 잔기(5) 쌍 간의 상호작용 유형에 따라 상이하다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용을 제한하도록 의도되지 않는 특정 실시예 및 도면을 참조하여, 구체적으로 본 발명을 더욱 상세하게 추가로 설명하는 역할을 한다.
I. 약어
하기 약어가 사용된다.
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II. 사포신 A의 정제
하기 실험에 사용된 정제된 사포신 A는 하기와 같이 제조하였다. 사포신 A 단백질 발현은 인간 사포신 A에 대한 코딩 영역(서열번호 1)을 pNIC-Bsa4 플라스미드에 삽입하고 E. coli 로제타 가미(Rosetta gami)-2(DE3)(노바겐(Novagen)) 균주에서 형질전환 및 발현시킨 벡터를 사용하여 수행하였다. 세포를 테트라사이클린, 클로르암페니콜 및 카나마이신이 보충된 TB 배지에서 37℃에서 성장시키고 0.7 mM IPTG로 유도하였다. 유도 3시간 후, 세포를 15분 동안 12,000 x g에서 원심분리하여 수집하였다. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 용해 완충액 LB1(20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 20 mM 이미다졸)을 사용하여 재현탁하고 초음파 처리하여 파쇄하였다. 용해물을 26,000 x g에서 30분 동안 원심분리하고, 상층액을 85℃로 10분 동안 가열한 후, 26,000 x g에서 30분 동안 추가 원심분리 단계를 수행하였다. 예비 IMAC 정제는 Ni 세파로스(Sepharose: 상표명) 6 패스트 플로우(Fast Flow) 배지를 사용하여 60분 동안 엔드-오버-엔드 회전에 의한 상청액의 배치 흡착에 의해 수행되었다. 사포신 A를 IMAC 수지에 결합시킨 후, 크로마토그래피 매질을 10-mm-(i.d.) 개방 중력 유동 칼럼에 패킹하고 15층 부피의 용해 완충액 LB1로 세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거하였다. 수지를 15층 부피의 세척 완충액(20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 40 mM 이미다졸)으로 세척하였다. 사포신 A는 용리 완충액 EB1(20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 400 mM 이미다졸)의 5층 부피의 첨가에 의해 용리되었다. 용리액은 재조합 TEV 프로테아제가 보충된 겔 여과 완충액 GF pH 7.5(20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl)에 대해 밤새 투석되었다. 절단할 수 없는 His-태그를 함유하는 TEV 프로테아제를 2 mL IMAC 수지에 통과시켜 용리액으로부터 제거하였다. 절단된 표적 단백질을 원심 필터 장치를 사용하여 5 mL의 부피로 농축하고 AKTA익스플로러(AKTAexplorer: 상표명) 10 크로마토그래피 시스템을 사용하여 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex: 상표명) 200 16/60 GL 컬럼(둘 다 지이 헬스케어)에 로딩하였다. 피크 분획을 풀링하고 1.2 mg/mL 단백질로 농축시켰다. 단백질 샘플을 액체 질소에서 급속 동결하고 -80℃에서 보관하였다.
III. 지지체에서 살리프로 입자 생성
실시예 1
이 실시예에서, 대형 막횡단 수송체(SLC)는 본 발명에 따른 방법의 대안 (II)에서 소수성 제제로서 사용된다. 지질 및 소수성 제제는 SLC-과발현 HEK293F 세포로부터 수득된 미정제 막 분획의 형태로 제공된다. SLC 수송체는 결합 잔기로 Strep II-태그를 포함한다. 항-Strep II 친화성 정제 비드를 본 발명에 따른 지지체로 사용하였다. 이들은 SLC 수송체 단백질에 포함된 Strep II 결합 잔기를 결합할 수 있는 항-Strep II 포획 잔기를 포함한다. 지지체 결합 SLC 수송체 함유 가용화된 막에 사포신 A의 첨가는 SLC 수송체 단백질에 포함된 Strep II 태그를 통해 지지체에 여전히 부착된 SLC 수송체 함유 사포신 지질 입자가 형성되게 하였다. 이에 따라, 사포신 지질 입자의 조립은 전적으로 지지체에서 그리고 세포 막에서 유래하고 지지체가 결합된 SLC 수송 단백질과 여전히 복합체를 이루는 내인성 지질과 함께 일어났다.
1.a. 막 단백질의 과발현
인간 SLC 수송체의 코딩 서열을 N-말단 Strep-태그 II에 이어 daGFP 및 프리시전(PreScission) 프로테아제 절단 부위를 코딩하는 발현 벡터에 도입하였다. 형질감염 전에 HEK293F 세포(ATCC 세포주, 마이코 플라즈마 시험 음성)를 4 mM L-글루타민(시그마) 및 5㎍ mL-1 페놀 레드(시그마-알드리치(Sigma Aldrich))가 보충된 엑셀(Excell)293 배지(시그마)에서 2.5 x 106 세포/mL 밀도로 성장시켰다. 세포를 2.5 x 106 세포/mL 밀도의 폴리에틸렌이민(PEI)(폴리사이언시스(Polysciences))을 사용하여 프리스타일(Freestyle)293 배지(인비트로겐(Invitrogen))에서 발현 벡터로 일시적으로 형질감염시키고, 형질감염 6시간 후 동일한 부피의 엑셀293으로 희석하고, 배양 희석 12시간 후 2.2 mM 발프로산(시그마)으로 처리하였다. 이어서, 형질감염된 세포는 융합 단백질 Strep II-daGFP-SLC를 과발현하였다. 모든 세포를 형질감염 후 약 48시간에 수집하였다.
1.b. 미정제 세포 막의 제조
융합 단백질 Strep II-daGFP-SLC의 대규모 발현은 5 L 배양으로 본질적으로 상기 1.a에 기재된 바와 같이 수행되었다. 세포를 1 mM L-Asp, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM TCEP 및 1:200(v/v) 포유동물 프로테아제 억제제 칵테일(시그마)의 희석으로 보충된 50 mM HEPES/Tris-염기, pH 7.4, 50 mM NaCl을 함유하는 용해 완충액(LB2)에서 채집하고, 세포 균질화기(에멀시플렉스(EmulsiFlex)-C5, 아베스틴(Avestin))에서 대략 103,000 kPa에서 3회 실행을 통해 파괴하였다. 생성된 균질물을 원심분리(0.5시간 동안 4,500 g)에 의해 정화하고 초원심분리(1.5시간 동안 186,000 g)에 의해 미정제 막을 수집하였다. 막을 LB2 완충액으로 1회 세척하고 최종적으로 50 mM HEPES/Tris-염기, pH 7.4, 200 mM NaCl, 1 mM L-Asp, 1 mM EDTA, 1 mM TCEP 및 10% 글리세롤을 함유하는 완충액에서 다운서(douncer)로 균질화하고 액체 N2에서 급속 냉동하고 0.5 g 막 mL-1에서 -80℃에서 보관하였다.
1.c. 친화성 지원 및 용리에 대한 결합
하기 완충액을 사용하였다:
- 가용화 완충액(SB): 50 mM HEPES pH 7.5, 2% DDM, 0.4% CHS, 200 mM NaCl, 1 mM L-Asp, 1 mM EDTA, 1 mM TCEP 및 5% 글리세롤.
- 작업 완충액(WB): 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl, 1 mM L-Asp, 1 mM TCEP 및 5% 글리세롤.
- 용리 완충액 EB2: 2.5 mM 데스티오비오틴(dBiotin)이 보충된 WB.
- HNG 완충액: 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl 및 5% 글리세롤.
과발현된 SLC 수송체를 포함하는 800 μL 미정제 막(0.5 g 막 mL-1)을 4.2 mL SB로 가용화하고 회전 휠을 사용하여 4℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 막 파편을 30000 g에서 30 분 동안 원심분리한 후, 평형화된 항-Strep II 친화성 정제 비드(스트렙탁틴 세파로스 비드(StrepTactin Sepharose bead), 지이 헬스케어) 900 μL를 첨가하여 제거하고 총 부피를 WB를 사용하여 5 mL로 보정하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 Strep II 태그된 SLC 운반체가 친화성 비드에 결합되도록 하였다. 이어서, 샘플을 5개의 개별 컬럼으로 나누어 중력 흐름에 의해 결합되지 않은 물질을 제거할 수 있었다. 친화성 비드는 이 단계에서 세척하지 않았고 천연 세포 막 지질, 세제 미셀 및 WB 성분을 부분적으로 함유하는 환경(비드의 "사적(dead volume)")에서 친화성 결합 SCL 수송체를 함유하였다.
상이한 양(0 내지 4 mL)의 3.6 mg/mL 사포신을 상응 컬럼에 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 5개의 새로운 튜브로 옮기고 총 샘플 부피를 하기와 같이 WB를 사용하여 5 mL로 수정하였다.
- 샘플 1: 0 mL 사포신 A + 4 mL WB
- 샘플 2: 0.5 mL 사포신 A + 3.5 mL WB
- 샘플 3: 1 mL 사포신 A + 3 mL WB
- 샘플 4: 2 mL 사포신 A + 2 mL WB
- 샘플 5: 4 mL 사포신 A
이어서, 샘플 1 내지 5를 컬럼으로 다시 옮기기 전에 회전 휠을 사용하여 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 중력 흐름을 사용하여 컬럼에서 결합되지 않은 물질을 제거한 후, WB에서 6 CV 세척하고 4 mL 용리 완충액 EB2를 사용한 용리 단계를 수행하였다. 50 μL의 각 용리된 샘플을 SEC 완충제로서 무세제 WB에서 작동하는 슈퍼로스(Superose) 6 증가 5/150 GL 컬럼과 함께 SEC(280 nm에서 단백질 검출)를 사용하여 분석하였다.
그 결과를 도 11에 나타내었다. 결과는 지질과 복합체를 이루는 막 단백질이 친화성 지지체에 결합되어 있어도 사포신 지단백질 입자를 수득할 수 있음을 보여준다. 증가하는 양의 사포신 A(3.6 mg/mL 농도의 사포신 A 0.5 mL, 1 mL, 2 mL 및 4 mL)는 또한 살리프로 입자의 형성을 증가시킨다. 이러한 조건에서 음성 대조군으로서 사포신 A가 액체 환경에서 제외되었을 때 살리프로 입자를 수득할 수 없었다(도 11, 샘플 1).
도 11에 도시된 결과는 또한 무세제 완충액으로 용리하기 전에 지지체 결합 살리프로 입자가 컬럼의 완전한 세척 단계 동안 안정함을 뒷받침한다.
1.d. 수득된 살리프로 입자 분석
친화성 비드를 4 mL 사포신 A와 인큐베이션한 후, 수득된 용리액(이전 섹션 c, 샘플 5 참조)을 100kDa 분자 크기 컷오프가 있는 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-2 원심 필터를 사용하여 농축하였다. 40 μL의 농축된 샘플을 1 mM L-Asp가 보충된 무세제 HNG 완충액에서 슈퍼로스 6 증가 5/150 GL 컬럼을 사용하여 SEC에 의해 추가로 분석하였다.
SDS-PAGE에 의한 SEC 분획의 분석은 주로 분획 13, 14 및 15가 SLC 수송체 및 사포신을 함유하는 정제된 살리프로 입자를 함유함을 나타낸다(도 12a).
재구성된 살리프로 입자의 균질성을 추가로 검증하기 위해 분획 14의 20 μL를 1 mM L-Asp가 보충된 무세제 HNG 완충액에서 슈퍼로스 6 증가 5/150 GL 컬럼을 사용하여 SEC에 의해 추가로 분석하였다. 상응하는 SEC 프로파일(도 12b)은 친화성 비드 상에서 재구성될 때 살리프로 입자의 안정성 및 균질성을 추가로 입증한다.
여기에 제시된 데이터는 입자 성분 중 하나가 친화성 지지체에 결합되어 있는 동안 소수성 제제를 사포신 입자로 재구성하는 것이 가능함을 분명히 제시한 것이다. 상기 데이터는 또한 미정제 막이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있음을 보여준다.
IV. 전체 세포에서 살리프로 입자 생성
실시예 2
이 실시예에서, 막 단백질은 본 발명에 따른 방법의 대안 (II)에서 소수성 제제로서 사용된다. 지질 및 소수성 제제는 막 단백질을 과발현하는 온전한 세포, 즉 인간 배아 신장(HEK) 세포의 형태로 제공된다. 상기 HEK 세포는 기계적 세포 용해 단계를 수행하지 않고 세제와만 접촉된다. 진핵세포 막 단백질은 결합 잔기로 FLAG 태그를 포함한다. 항-FLAG 친화성 정제 비드는 본 발명에 따른 지지체로서 사용된다. 그들은 진핵세포 막 단백질에 포함된 FLAG 결합 잔기를 결합할 수 있는 항-FLAG 포획 잔기를 포함한다. 세제 처리된 막에 포함된 지지체 결합 진핵세포 막 단백질에 사포신 A를 첨가하면 진핵세포 막 단백질을 함유하는 사포신 지질 입자가 형성될 수 있다. 따라서, 이 실시예에서, 사포신 지질 입자의 조립은 포함되는 관심 진핵세포 막 단백질을 발현하는 세제 처리된 전체 세포의 형태로 제공되는 내인성 지질과 지지체에서 전적으로 일어난다.
2.a. 막 단백질의 과발현
진핵세포 막 단백질의 코딩 서열은 N-말단 FLAG-태그를 코딩하는 발현 벡터에 도입된다. 형질감염 전에 HEK 293F 세포를 293 프리스타일 배양 배지에서 성장시키고 제조사(써모 피셔(ThermoFisher))에서 제공한 프로토콜을 사용하여 PEI-Max 시약을 사용하여 형질감염시킨다. 이어서, 형질감염된 세포는 막 단백질을 과발현한다. 모든 세포는 형질감염 후 약 48시간에 수집된다.
2.b. 가용화된 막의 제조
FLAG 태그된 진핵세포 막 단백질을 과발현하는 세포는 세포 펠릿으로 수확된다. 이어서, 세포 펠릿을 HNG 완충액 II에 용해시키고, 2x의 최종 농도에서 25x 단백질 억제제 칵테일을 추가로 포함한다. 이어서, 물(w/v) 중 10% GDN을 포함하는 용액을 재현탁된 세포에 1% GDN(w/v)의 최종 농도로 첨가한다. 이어서, 샘플을 차가운 캐비닛의 회전 휠에서 5분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 샘플을 5분 동안 4℃에서 5,000 g로 원심분리한다. 세제 처리된 막을 포함하는 가용화된 물질을 포함하는 상층액을 회수하고 콜드 캐비닛의 회전 휠에서 추가로 50분 동안 인큐베이션한다. 이 인큐베이션 단계 후, 상층액을 30,000 g 및 4℃에서 30분 동안 원심분리하여 막 파편을 제거한 후, 친화성 지지체에 결합하기 위해 다음 단계 2.c에서 사용한다.
2.c. 친화성 지지체에 대한 결합 및 용리
하기 완충액이 사용된다.
- HNG 완충액 II: 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl 및 10% 글리세롤
- EB3: 50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM NaCl, 10% 글리세롤, 250 μg/mL FLAG-펩티드
중력 흐름을 통해 결합되지 않은 물질을 제거할 수 있는 4개의 컬럼은 각 컬럼에 100 μL의 평형화된 M2 항-FLAG 친화성 정제 비드(시그마-알드리치)를 로딩하여 제조한다. 이후 단계 2.b에서 수득된 가용화된 막 500 μL를 각 컬럼에 첨가한다. 이어서, 유동 통과한 것은 FLAG 태그가 붙은 진핵세포 막 단백질이 친화성 비드에 효율적으로 결합할 수 있도록 컬럼을 통해 3회 다시 통과된다. FLAG 태그된 진핵세포 막 단백질이 로딩된 친화성 비드는 이 단계에서 세척하지 않는다. 천연 세포 막 지질 및 세제 미셀 및 HNG 완충액 II 성분을 부분적으로 함유하는 환경(비드의 "사적")에서 친화도 결합된 진핵세포 막 단백질을 함유한다.
상이한 양(0 내지 6 mL)의 1 mg/mL 사포신 A를 상응 컬럼에 첨가한다.
- 샘플 1: 1 mL HNG 완충액 II
- 샘플 2: 1 mL 사포신 A
- 샘플 3: 3 mL 사포신 A
- 샘플 4: 6 mL 사포신 A
이어서, 혼합물을 4개의 새 튜브로 옮기고 회전 휠을 사용하여 4℃에서 25분 동안 인큐베이션한 후, 컬럼으로 다시 옮깁니다. 중력 흐름을 사용하여 컬럼에서 결합되지 않은 물질을 제거한 후, HNG 완충액 II에서 10 CV 세척하고 500 μL 용리 완충액 EB3으로 용리 단계를 수행한다.
2.d. 살리프로 입자 분석
다양한 양의 사포신 A(이전 섹션 2.c, 샘플 1 내지 4 참조)와 친화성 비드의 인큐베이션 후 수득된 용리액을 13,000 g 및 4℃에서 아미콘 울트라-2 원심 필터(10 kDa NMWL)를 사용하여 농축한다. 농축된 샘플은 형성된 살리프로 입자를 검출하기 위해 무세제 HNG 완충액 II에서 슈퍼로스 6 증가 5/150 GL 컬럼을 사용하여 SEC에 의해 추가로 분석한다.
앞서 언급한 실험적 작업 흐름으로 사포신 지단백질 입자는 기계적 세포 용해를 거치지 않고 관심 있는 진핵세포 막 단백질이 친화성 지지체에 결합된 상태에서 출발 물질로서 온전한 세포로부터 수득될 수 있을 것으로 예상된다. 이러한 조건에서 음성 대조군으로서 사포신 A가 액체 환경에서 제외될 때 살리프로 입자가 얻어지지 않아야 한다.
V. 지지체 상의 살리프로 입자 생성
실시예 3
이 실시예에서, 살리프로 입자의 재구성은 본 발명의 방법의 대안 (I)에 따라 수행하였는데, 즉 사포신은 친화성 지지체에 부동화되었다. 이를 위해 사포신을 비오틴일화하여 아비딘 친화성 비드 매트릭스에 결합시켰다. 지지체가 결합된 사포신을 추가의 태그 없는 사포신, 지질 및 임의적으로, 소수성 제제와 접촉시켜 본 발명에 따른 살리프로 입자가 형성되게 하였다. 따라서, 사포신 지질 입자의 조립이 지지체에서 일어났다.
3.a. 비오틴일화된 사포신 A의 제조
사포신 A를 EZ-링크(EZ-Link: 등록상표) NHS-비오틴 시약(써모 피셔, 참조번호 21343)을 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 비오틴일화시켰다. 이어서, 퀀트*태그 비오틴 키트(Quant*Tag Biotin Kit)(벡터 래버러토리(Vector laboratory), BDK-2000)를 사용하여 사포신 A당 비오틴 수를 정량화한 결과 사포신 A 분자 당 1.1개의 비오틴이 존재하는 것으로 나타났다.
3.b. 친화성 지지체에 대한 결합 및 용리
단량체 아비딘 매트릭스(써모 피셔 20228)를 제조하고 제조사의 프로토콜에 따라 세척하였다. 비오틴일화된 사포신 A는 제조된 아비딘 친화성 매트릭스에 결합되었다. 각 샘플에 대해, 100 μL의 비오틴일화된 사포신 A를 25 μL의 아비딘 친화성 매트릭스(컬럼(바이오라드, 폴리프렙(Polyprep) 크로마토그래피 컬럼, art.nr 7311550)에 함유됨)에, 상기 매트릭스에 비오틴일화된 사포신 A를 3회 통과시킴으로써, 결합시켰다. 이어서, 친화성 매트릭스를 HNG 완충액 II로 광범위하게 세척하여 결합되지 않은 사포신 A를 제거하였다.
사포신 A가 로딩된 아비딘 친화성 매트릭스를 사용하여 두 가지 다른 입자 조립 조건을 평가하였다. 샘플 1에서 뇌 지질 및 태그되지 않은 사포신 A를 사전 부동화된 사포신 A가 있는 친화성 수지에 첨가하였다. 샘플 2에서 뇌 지질, 막 단백질(박테리아 이온 채널 막 단백질 T2) 및 태그되지 않은 사포신 A를 사전 부동화된 사포신 A가 있는 친화성 수지에 첨가하였다.
뇌 지질 용액은 5 mg/mL 뇌 지질(시그마-알드리치)을 0.5% DDM에 용해하여 제조하고 37℃에서 5분 동안 사전 인큐베이션하였다.
박테리아 이온 채널 막 단백질 T2는 문헌[F Guettou et al., Nature structural & Molecular Biology, 21; 728-731, 2014]에 기재되어 있다.
샘플 1 및 2에 대한 입자 조립 조건은 하기와 같았다:
- 샘플 1: 16 μL 뇌 지질 용액을 사전 부동화된 사포신 A가 있는 친화성 수지에 첨가하고 5분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 100 μL 태그가 없는 사포신 A(1.2 mg/mL)를 첨가하였다.
- 샘플 2: 16 μL 뇌 지질 용액을 8 μL T2(10 mg/mL)와 혼합하고 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 혼합물을 사전 부동화된 사포신 A가 있는 친화성 수지에 첨가하였다. 이어서, 샘플을 실온에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 100 μL 태그가 없는 사포신 A(1.2 mg/mL)를 첨가하였다.
이어서, 상기 2개의 샘플을 25분 동안 회전 휠에서 실온에서 동시에 인큐베이션하였다. 이어서, 하기 완충액을 사용하여 샘플 컬럼을 처리하였다.
- HNG 완충액 II: 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl 및 10% 글리세롤
- EB4: 2 mM 비오틴이 보충된 HNG 완충액(써모 피셔 29129)
친화성 비드를 무세제 HNG 완충액 II(10 CV를 사용하여 3회)로 광범위하게 세척하고 부동화된 샘플을 용리 완충액 EB4를 사용하여 용리시켰다.
3.c. 수득된 살리프로 입자의 분석
용리된 샘플을 HNG 완충액 II에서 작동하는 슈퍼덱스(상표명) 200 5/150 GL 분석 겔 여과 컬럼을 사용하여 분석 SEC에 적용하였다.
결과는 도 13에 제시되어 있다. 샘플 1 및 2의 경우 살리프로 입자가 용리 프로필에서 검출되었다(도 13의 샘플 1의 경우 6.4분의 SEC 피크 및 샘플 2의 경우 4.5분의 SEC 피크 참조). 따라서, 부동화된 사포신 A는 친화성 지지체에서 살리프로 입자 조립을 가능하게 하였다.
전체적으로, 본원에 제시된 데이터는 입자 성분 중 하나가 친화성 지지체에 결합되어 있는 동안 다른 출발 물질을 사용하여 살리프로 입자를 재구성하는 것이 가능하다는 것을 분명히 보였다.
SEQUENCE LISTING <110> Salipro Biotech AB <120> Production of Salipro particles <130> 181522EP <140> PCT/EP2020/060594 <141> 2020-04-15 <150> EP 19169321.7 <151> 2019-04-15 <160> 46 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Leu Pro Cys Asp Ile Cys Lys Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Asp 1 5 10 15 Met Leu Lys Asp Asn Ala Thr Glu Glu Glu Ile Leu Val Tyr Leu Glu 20 25 30 Lys Thr Cys Asp Trp Leu Pro Lys Pro Asn Met Ser Ala Ser Cys Lys 35 40 45 Glu Ile Val Asp Ser Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Ile Ile Lys Gly 50 55 60 Glu Met Ser Arg Pro Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Glu 65 70 75 80 Ser <210> 2 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile Gln Thr 1 5 10 15 Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu His Val 20 25 30 Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile Cys Lys 35 40 45 Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met Met His 50 55 60 Met Gln Pro Lys 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musculus <400> 25 Ser Leu Pro Cys Asp Ile Cys Lys Thr Val Val Thr Glu Ala Gly Asn 1 5 10 15 Leu Leu Lys Asp Asn Ala Thr Gln Glu Glu Ile Leu His Tyr Leu Glu 20 25 30 Lys Thr Cys Glu Trp Ile His Asp Ser Ser Leu Ser Ala Ser Cys Lys 35 40 45 Glu Val Val Asp Ser Tyr Leu Pro Val Ile Leu Asp Met Ile Lys Gly 50 55 60 Glu Met Ser Asn Pro Gly Glu Val Cys Ser Ala Leu Asn Leu Cys Gln 65 70 75 80 Ser Leu Gln <210> 26 <211> 83 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 26 Ser Ile Pro Cys Asp Leu Cys Lys Glu Leu Val Thr Val Val Gly Lys 1 5 10 15 Val Leu Lys Asp Asn Gly Thr Glu Asp Glu Ile Arg Ser Tyr Leu Glu 20 25 30 Lys Thr Cys Glu Phe Leu Pro Asp Gln Gly Leu Ala Ser Glu Cys Lys 35 40 45 Glu Ile Val Asp Ser Tyr Leu Pro Val Ile Met Asp Met Ile Lys Glu 50 55 60 Glu Phe Asp Lys Pro Glu Val Val Cys Ser Ala Leu Ser Leu Cys Gln 65 70 75 80 Ser Leu Gln <210> 27 <211> 83 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 27 Thr Val Pro Cys Asp Leu Cys Lys Glu Val Leu Val Val Val Glu Gln 1 5 10 15 Leu Leu Lys Asp Asn Val Thr Glu 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PRT <213> Gallus gallus <400> 32 Phe Ser Val Cys Glu Ile Cys Glu Thr Met Val Lys Glu Val Thr Gly 1 5 10 15 Leu Leu Glu Ser Asn Lys Thr Glu Glu Glu Ile Val His Glu Met Glu 20 25 30 Val Val Cys Tyr Leu Leu Pro Ala Ser Val Lys Asp Gln Cys Lys Asp 35 40 45 Phe Ile Glu Val Tyr Gly Gln Ala Leu Ile Asp Met Leu Leu Glu Ala 50 55 60 Thr Asn Pro Glu Ala Val Cys Val Met Leu Lys Cys Cys Ala Ala Asn 65 70 75 80 <210> 33 <211> 79 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 33 Asn Val Leu Cys Glu Val Cys Glu Leu Met Val Ser Gln Leu Glu Lys 1 5 10 15 Leu Leu Asp Asn Asn Arg Thr Arg Glu Asn Ile Lys His Gly Leu Glu 20 25 30 Lys Val Cys Lys Leu Leu Pro Ser Gln Tyr Thr Gln Lys Cys Glu Asp 35 40 45 Met Ile Glu Glu Tyr Ser Asp Ala Leu Ile Glu Leu Leu Glu Gln Glu 50 55 60 Ala Asn Pro Gln Ala Ile Cys Thr Ala Leu Gly Tyr Cys Ser Gly 65 70 75 <210> 34 <211> 79 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 34 Ser Pro Gln Cys Ala Ile Cys Glu Tyr Val Met Lys Glu Ile Glu Asn 1 5 10 15 Met Ile Gln Asp Gln Thr Ser Glu Ala Glu Ile Val Gln Ala Val Glu 20 25 30 Lys Val Cys Asn Ile Leu Pro Ser Thr Leu Thr Ala Gln Cys Lys Asp 35 40 45 Leu Ile Glu Thr Tyr Gly Gln Ala Ile Ile Asp Leu Leu Val Gln Glu 50 55 60 Ala Asp Pro Lys Thr Val Cys Ser Phe Leu Ala Leu Cys Ser Gly 65 70 75 <210> 35 <211> 81 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val Gly Tyr Leu Asp Arg 1 5 10 15 Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Gln Glu Ile Leu Ala Ala Leu Glu 20 25 30 Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln Lys Gln Cys Asp Gln 35 40 45 Phe Val Ala Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu Ile Leu Val Glu Val 50 55 60 Met Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Ala 65 70 75 80 His <210> 36 <211> 81 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 36 Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val Gly Tyr Leu Asp Arg 1 5 10 15 Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Glu Gln Ile Leu Ala Ala Leu Glu 20 25 30 Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Gln Tyr Arg Lys Gln Cys Asp Gln 35 40 45 Phe Val Thr Glu Tyr Glu Pro Val Leu Ile Glu Ile Leu Val Glu Val 50 55 60 Met Asp Pro Ser Phe Val Cys Leu Lys Ile Gly Ala Cys Pro Ala Ala 65 70 75 80 His <210> 37 <211> 81 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 37 Gly Gly Phe Cys Glu Val Cys Lys Lys Leu Val Leu Tyr Leu Glu His 1 5 10 15 Asn Leu Glu Lys Asn Ser Thr Lys Glu Glu Ile Leu Ala Ala Leu Glu 20 25 30 Lys Gly Cys Ser Phe Leu Pro Asp Pro Tyr Gln Lys Gln Cys Asp Asp 35 40 45 Phe Val Ala Glu Tyr Glu Pro Leu Leu Leu Glu Ile Leu Val Glu Val 50 55 60 Met Asp Pro Gly Phe Val Cys Ser Lys Ile Gly Val Cys Pro Ser Ala 65 70 75 80 Tyr <210> 38 <211> 81 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 38 Gly Gly Phe Cys Asp Ile Cys Lys Met Ile Val Ala Tyr Ala Asp Lys 1 5 10 15 Glu Leu Glu Lys Asn Ala Thr Thr Thr Glu Ile Glu Ala Leu Leu Glu 20 25 30 Lys Val Cys His Phe Leu Pro Glu Ser Val Ser Asp Gln Cys Val Gln 35 40 45 Phe Val Glu Gln Tyr Glu Pro Val Val Val Gln Leu Leu Ala Glu Met 50 55 60 Met Asp Pro Thr Phe Val Cys Thr Lys Leu Gly Val Cys Gly Ala Ala 65 70 75 80 Lys <210> 39 <211> 81 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 39 Gly Gly Phe Cys Asp Val Cys Lys Met Ala Val Arg Tyr Val Asp Gly 1 5 10 15 Ile Leu Glu Gln Asn Ala Thr Gln Ser Glu Ile Glu Glu Ala Val Leu 20 25 30 Lys Val Cys Ser Phe Leu Pro Asp Ala Val Lys Asp Glu Cys Asn Gln 35 40 45 Leu Ile Glu Gln Tyr Glu Pro Leu Leu Val Gln Leu Leu Leu Gln Thr 50 55 60 Leu Asp Pro Asp Phe Val Cys Met Lys Leu Gly Ala Cys Pro Glu Ala 65 70 75 80 Val <210> 40 <211> 81 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 40 Gly Asp Tyr Cys Ala Val Cys Lys Met Leu Met Arg Tyr Val Asp Glu 1 5 10 15 Leu Leu Glu Lys Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ile Lys Ala Phe Leu Gly 20 25 30 Arg Ile Cys Asn Phe Leu Pro Asp Ser Met Gln Asn Glu Cys Ser Ala 35 40 45 Leu Val Asn Glu Tyr Glu Pro Leu Phe Ile Gln Leu Leu Leu Glu Ala 50 55 60 Leu Asp Pro Ser Phe Ile Cys Ile Lys Val Asn Leu Cys Gln Asn Lys 65 70 75 80 Lys <210> 41 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Met Val Thr Asp Ile Gln Thr 1 5 10 15 Ala Val Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Gln Ala Leu Val Glu His Val 20 25 30 Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ala Asp Ile Cys Lys 35 40 45 Asn Tyr Ile Ser Gln Tyr Ser Glu Ile Ala Ile Gln Met Met Met His 50 55 60 Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Ala Leu Val Gly Phe Cys Asp Glu 65 70 75 <210> 42 <211> 79 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 42 Gly Asn Val Cys Gln Asp Cys Ile Gln Leu Val Thr Asp Val Gln Glu 1 5 10 15 Ala Leu Arg Thr Asn Ser Thr Phe Val Glu Ala Leu Val Asp His Ala 20 25 30 Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ser Asp Met Cys Lys 35 40 45 Asn Tyr Ile Asn Gln Tyr Ser Glu Val Ala Ile Gln Met Val Met His 50 55 60 Met Gln Pro Lys Glu Ile Cys Val Leu Ala Gly Phe Cys Asp Glu 65 70 75 <210> 43 <211> 83 <212> PRT <213> Gallus gallus <400> 43 Glu Asp Val Cys Gln Asp Cys Ile Arg Leu Val Thr Asp Val Gln Glu 1 5 10 15 Ala Val Arg Thr Asn Ala Thr Phe Val Lys Ser Leu Val Ala His Ala 20 25 30 Lys Glu Glu Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Met Ser Asp Met Cys Lys 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Glu Tyr Ser Asp Leu Ala Ile Gln Met Met Met His 50 55 60 Met Lys Asp Gln Gln Pro Lys Asp Ile Cys Ala Met Val Gly Phe Cys 65 70 75 80 Pro Ser Val <210> 44 <211> 83 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 44 Glu Asp Val Cys Gln Asp Cys Met Lys Leu Val Ser Asp Val Gln Thr 1 5 10 15 Ala Val Lys Thr Asn Ser Ser Phe Ile Gln Gly Phe Val Asp His Val 20 25 30 Lys Glu Asp Cys Asp Arg Leu Gly Pro Gly Val Ser Asp Ile Cys Lys 35 40 45 Asn Tyr Val Asp Gln Tyr Ser Glu Val Cys Val Gln Met Leu Met His 50 55 60 Met Gln Asp Gln Gln Pro Lys Glu Ile Cys Val Leu Ala Gly Phe Cys 65 70 75 80 Asn Glu Val <210> 45 <211> 79 <212> PRT <213> Danio rerio <400> 45 Gly Asp Val Cys Gln Asp Cys Val Thr Phe Ile Ser Asp Thr Gln Asp 1 5 10 15 Glu Ala Arg Val Asn Ser Ser Phe Ile Asn Thr Leu Ile Ala Gln Val 20 25 30 Glu Asn Gln Cys Glu Leu Leu Gly Pro Gly Met Ser Asp Met Cys Lys 35 40 45 Glu Tyr Ile Ser Gln Tyr Gly Pro Leu Val Phe Gln Gln Leu Met Ser 50 55 60 Met Gln Pro Lys Asp Ile Cys Ala Arg Ala Gly Phe Cys Pro Thr 65 70 75 <210> 46 <211> 79 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 46 Gly Asp Ile Cys Asn Asp Cys Thr Lys Leu Val Ser Asp Val Gln Asp 1 5 10 15 Ala Leu Arg Ser Asn Ser Ser Phe Ser Lys Lys Leu Val Asp His Phe 20 25 30 Leu Gln Glu Cys Asn Leu Leu Asp Pro Ala Ile Ala Glu Met Cys Lys 35 40 45 Ser Tyr Ile Asn Gln Tyr Ser Asp Ile Ala Ile Gln Val Leu Leu Gln 50 55 60 Met Gln Pro Lys Gln Leu Cys Gly Met Ala Gly Phe Cys Asp Gln 65 70 75

Claims (14)

  1. 사포신 지단백질 입자의 제조 방법으로서,
    제조되는 사포신 지단백질 입자가
    사포신 유사 단백질;
    지질; 및
    임의적으로, 상기 지질과는 상이한 소수성 제제
    를 포함하고;
    제조 방법이
    (I) (a) 상기 지질, 및 임의적으로 상기 소수성 제제를 제공하는 단계;
    (b.1) 액체 환경에서 상기 사포신 유사 단백질을 지지체에 선택적으로 결합시킬 수 있는 지지체를 상기 사포신 유사 단백질과 접촉시키는 단계;
    (c.1) 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 유사 단백질을 상기 지질, 및 임의적으로 상기 소수성 제제와 접촉시켜 상기 지지체에서 상기 사포신 지단백질 입자가 자가 조립(self-assembly)되게 하는 단계;
    (d) 임의적으로, 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 지단백질 입자를 용리시키는 단계
    를 포함하거나, 다르게는
    (II) (a) 상기 소수성 제제 및 상기 지질을 제공하는 단계;
    (b.2) 상기 소수성 제제를 지지체에 선택적으로 결합시킬 수 있는 지지체를 상기 소수성 제제와 접촉시키는 단계;
    (c.2) 상기 지지체가 결합된 상기 소수성 제제를 상기 사포신 유사 단백질과 접촉시켜 상기 지지체에서 상기 사포신 지단백질 입자가 자가 조립되게 하는 단계;
    (d) 임의적으로, 상기 지지체가 결합된 상기 사포신 지단백질 입자를 용리시키는 단계
    를 포함하는, 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    (I)에서,
    지지체가 포획 잔기(capture moiety)를 포함하고;
    사포신 유사 단백질이 결합 잔기를 포함하고;
    상기 포획 잔기가 상기 사포신 유사 단백질의 상기 결합 잔기를 선택적으로 결합시킬 수 있는, 제조 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    (II)에서,
    지지체가 포획 잔기를 포함하고;
    소수성 제제가 결합 잔기를 포함하고;
    상기 포획 잔기가 상기 소수성 제제의 상기 결합 잔기를 선택적으로 결합시킬 수 있는, 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    지지체가
    (i) 비드;
    (ii) 베드;
    (iii) 막; 및/또는
    (iv) 고체 지지체, 특히 평면 표면을 갖는 고체 지지체
    의 형태인, 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    지질이 바이러스 지질, 고세균 지질, 진핵생물 지질, 원핵생물 지질 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (a)에서, 소수성 제제 및 지질이 사포신 지단백질 입자에 혼입될 상기 소수성 제제 및 상기 지질을 포함하는 바이러스 막, 고세균 막, 진핵생물 막 또는 원핵생물 막의 형태로 제공되는, 제조 방법.
  7. 제1항 또는 제6항에 있어서,
    (I)의 단계 (c.1)에서, 지지체가 결합된 사포신 유사 단백질을 단계 (a)에서 제공된 바이러스 막, 고세균 막, 진핵생물 막 또는 원핵생물 막과 접촉시켜 상이한 막 지질 및 임의적으로 막 단백질 조성물을 갖는 사포신 지단백질 입자의 이종 혼합물을 포함하는, 사포신 유사 입자의 라이브러리를 형성하는 제조 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    사포신 유사 단백질이 제1항에 따른 제조 방법에서 사포신 지단백질 입자를 형성할 수 있는 사포신 A, 사포신 B, 사포신 C, 사포신 D 또는 이의 유도체 또는 절단된 형태인, 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    유도체 또는 절단된 형태가 하기로부터 선택되는, 제조 방법:
    (i) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 전장 서열과 20% 이상의 서열 동일성을 갖는 단백질로서, 특히, 양친매성이고, 하나 이상의 α-나선을 형성하고, 제1항에 따른 제조 방법에 사용될 때 지질과 함께 지단백질 입자로 자가 조립될 수 있는 단백질; 및
    (ii) 서열번호 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 서열을 포함하는 단백질로서, 1 내지 40개의 아미노산이 결실, 추가, 삽입 및/또는 치환된, 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    소수성 제제가 소수성 유기 화합물 및 소수성 생체분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    소수성 유기 화합물 및/또는 소수성 생체분자가 생물학적 활성제, 약물, 약물의 활성 성분, 화장품의 활성 성분, 식물 보호 제품의 활성 성분, 식이 및/또는 영양 보충제, 진단 프로브, 조영제, 라벨 및 표시기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    소수성 생체분자가 소수성 잔기를 포함하는 단백질, 특히 막 단백질, 내재성 막횡단 단백질, 내재성 단일체(monotopic) 막 단백질, 말초 막 단백질, 지질 결합 상태의 양친매성 단백질, 지질-고정된(lipid-anchored) 단백질, 및 융합된 소수성 및/또는 막횡단 도메인을 갖는 키메라 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질인, 제조 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    소수성 제제, 지질 및/또는 사포신 유사 단백질이 세제에 가용화된 상태이고;
    임의적으로, 상기 세제가 알킬벤젠설포네이트 또는 담즙산, 양이온성, 비이온성 또는 쌍성이온성(zwitterionic) 세제, 예컨대 라우릴-디메틸 아민-옥사이드(LDAO), 포스-콜린, CHAPS/CHAPSO, 사포닌, 예컨대 디지토닌 및 구조적으로 관련된 합성 세제, 예컨대 글리콜-디오스게닌, 알킬 글리코시드, 예컨대 단쇄, 중간쇄 또는 장쇄 알킬 말토시드, 특히 n-도데실 β-D-말토시드, 글루코시드, 말토스-네오펜틸 글리콜(MNG) 양친매성 물질, 양친매성 중합체(앰피폴(amphipol)), 스티렌 말레산 공중합체(SMA), 페놀과 알데하이드의 하이드록시알킬화 생성물에 기초한 거대고리 또는 환형 올리고머(칼릭사렌(Calixarene)), 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 제조 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 단계 (c.2) 및/또는 (c.1)에서 수득된 입자가 디스크-형상이고, 특히 디스크-형상이고 친수성 또는 수성 코어를 포함하지 않고;
    (ii) 단계 (c.2) 및/또는 (c.1)의 입자가 2 nm 내지 200 nm, 특히 3 nm 내지 150 nm, 바람직하게는 3 nm 내지 100 nm의 평균 최대 직경을 갖고;
    (iii) 단계 (c.2) 및/또는 (c.1)에서 입자의 자가 조립이 2.0 내지 10.0, 특히 6.0 내지 10.0, 바람직하게는 6.0 내지 9.0, 특히 바람직하게는 7.0 내지 9.0, 가장 바람직하게는 7.0 내지 8.0의 pH에서 수행되는, 제조 방법.
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