KR20210150168A

KR20210150168A - 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210150168A
Application number: KR1020200067196A
Authority: KR
Inventors: 심원보; 김솔아; 이정은
Original assignee: 경상국립대학교산학협력단
Priority date: 2020-06-03
Filing date: 2020-06-03
Publication date: 2021-12-10
Also published as: KR102349848B1

Abstract

본 발명은 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것으로, 기탁번호가 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 땅콩 유래 열 안정성 수용성 단백질인 Ara h 1(Arachis hypogaea 1) 및 Ara h 3에 특이적으로 결합하는 단일클론항체에 관한 것이다.

Description

땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도{Monoclonal antibody specific to Ara h 1 and Ara h 3 from peanut and uses thereof}

본 발명은 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

식품 알레르기(food allergy)는 식이단백질(dietary protein)에 대한 면역글로불린 E(immunoglobulin E, IgE)-매개성 혹은 비면역글로불린-매개성 과민반응에 의하여 소화기뿐만 아니라 피부, 호흡기, 심혈관계 등의 장기에 다양한 증상을 나타내는 비교적 흔한 알레르기 질환으로, 정상인에게는 무해한 식품이지만, 특정인이 섭취하였을 경우 그 식품의 특정 단백질에 대한 인체의 과도한 면역반응이 일어나는 것을 말한다. 식품 알레르기의 발생 빈도는 3세 이하의 소아의 경우는 약 8%, 성인의 경우는 약 2% 내외로 보고되고 있다. 한 사람이 일생동안 섭취하는 식품의 양은 약 2~3톤에 달하고 매우 다양한 종류의 식품에 노출되지만, 인간의 위장관 면역계는 대부분의 식이단백질에 대한 면역관용(immunological tolerance)이 일어나도록 진화되어 왔으며, 극히 제한된 종류의 식품에 한하여, 식이단백질에 대한 감작(sensitization)이 일어나고 궁극적으로 알레르기 증상이 유발된다.

식품 알레르겐은 면역글로불린 E의 생산을 유도하여 즉각적인 과민반응을 일으키는 식품의 성분으로 정의되며, 입으로 섭취되는 식품 외에도 흡입성과 접촉성 식품 알레르겐도 포함된다. 식품의 주요 알레르겐 대부분은 수용성 당단백으로 분자량은 약 10,000-60,000Da이고, 흡입성 알레르겐과는 달리 위장관을 통과하는 동안 소화효소, 세균, 독소 등에 의해 변형될 가능성이 많으며, 장 점막에 머무르는 시간이 길어서 아나필락시스(anaphylaxis) 반응뿐만 아니라 지연형 반응(delayed type reaction)을 일으키는 경우도 많다. 면역글로불린 E에 의한 알레르기 반응을 일으키는 흔한 음식물로는 계란, 우유, 콩, 땅콩, 견과류, 메밀, 밀, 생선, 어패류 등이 있다. 이외에 음식물 보존제, 향신료, 색소 등에 의해서도 이상반응이 일어날 수 있으나, 이러한 경우는 면역학적 기전에 의한 경우가 아니므로 별도로 취급되어야 한다. 소아의 경우는 우유, 계란, 땅콩, 대두, 밀 등이 가장 흔한 식품 알레르겐으로 약 90% 이상의 환자에서 감작되어 있으며, 연령이 증가할수록 생선, 갑각류, 견과류(호두, 잣, 밤) 등이 문제가 된다. 식품 알레르기에 대한 예방 및 치료방법은 특별히 없으며, 이를 예방하는 가장 확실하고 유일한 방법은 식품 알레르기를 일으키는 원인 식품을 식단에서 제거하여 섭취하지 않는 것이다.

따라서, 식품 알레르기를 유발하는 원인 식품을 분석하는 것이 매우 중요하고, 이를 통해 식품의 원재료뿐만 아니라 제조·가공된 가공식품에 알레르기 유발 성분을 정확하게 표시하여 미리 확인하는 것이 중요하다.

이에 본 발명에서는 땅콩의 대표적인 알레르겐인 Ara h1과 Ara h3을 동시에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 제조하였고, 상기 하이브리도마 세포로부터 생산되는 단일클론항체를 사용하여 열처리된 식품 원·부재료의 혼합물 및 가공식품 내에 땅콩 혼입여부를 신속하게 분석할 수 있음을 확인하였다.

한편, 일본등록특허 제3853692호에는 '땅콩 성분 검사용 항체, 검사 방법 및 검사용 키트'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1223256호에는 '땅콩의 알레르기성 저감 방법 및 알레르기성이 저감된 땅콩'이 개시되어 있으나, 본 발명의 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 땅콩의 열 알정성 수용성 단백질을 항원으로 사용하여, 땅콩의 열 안정성 수용성 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마주를 제조하였다. 제조된 하이브리도마 세포주 중 Ara h 1과 Ara h 3을 동시에 검출할 수 있는 단일클론항체를 생산하는 세포주를 선별할 수 있었고, 상기 하이브리도마 세포주로부터 생산되는 단일클론항체를 이용하여 면역분석을 수행한 결과, Ara h 1 또는 Ara h 3을 단독으로 검출할 수 있는 단일클론항체에 비해, 본 발명의 단일클론항체가 보다 더 낮은 농도의 시료까지 땅콩 혼입 유무를 신속·정확하게 판별될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.

또한, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 식품 내 땅콩 혼입 여부 판별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 검체 시료와 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 식품 내 땅콩 혼입 여부의 판별방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 포함하는 식품 내 땅콩 혼입 여부 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 단일클론항체는 땅콩 내 열 안정성 수용성 단백질 중 Ara h 1과 Ara h 3을 동시에 특이적으로 검출할 수 있으며, 열처리에 의해 제조·가공된 의도적 미표기 식품에 혼입되어 있는 땅콩 혼입 여부를 효과적으로 분석할 수 있다. 따라서, 본 발명의 단일클론항체는 식품 내 땅콩의 혼입 유무에 관한 정보를 소비자에게 제공하여 식품 알레르기 유발을 방지할 수 있고, 식품 제조 및 가공 과정 개선에 활용될 수 있어, 식품 안정성 확보에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 비열처리(Non-Heat) 및 열처리(Heat) 된 땅콩에서 추출한 열 안정성 단백질의 SDS-PAGE 결과이다. 레인 1: 크기 마커, 레인 2: 비열처리 방법으로 추출한 생땅콩 시료, 레인 3: 열처리에 의해 추출한 생땅콩 시료, 레인 4: 비열처리 방법으로 추출한 삶은 땅콩 시료, 레인 5: 열처리에 의해 추출한 삶은 땅콩 시료, 레인 6: 비열처리 방법으로 추출한 구운 땅콩 시료, 레인 7: 열처리에 의해 추출한 구운 땅콩 시료, 레인 8: 비열처리 방법으로 추출한 땅콩잼 시료, 레인 9: 열처리에 의해 추출한 땅콩잼 시료.
도 2는 땅콩 추출물 시료에 대한 RP Mab GNU-10, RP Mab GNU-23 및 RP Mab GNU-30 항체의 반응 특이성을 분석한 웨스턴 블롯 결과이다. M: 크기 마커, 땅콩: 비열처리 방법으로 추출한 구운 땅콩 시료.
도 3은 다양한 농도의 생땅콩 및 볶은 땅콩 추출물이 코팅된 플레이트를 이용하여 RP Mab GNU-10, RP Mab GNU-23 및 RP Mab GNU-30의 민감도(sensitivity)를 분석한 간접 ELISA 결과이다.
도 4는 다양한 농도의 삶은 땅콩 및 땅콩버터 추출물이 코팅된 플레이트를 이용하여 RP Mab GNU-10, RP Mab GNU-23 및 RP Mab GNU-30의 민감도(sensitivity)를 분석한 간접 ELISA 결과이다.
도 5는 단일클론항체 RP Mab GNU-10의 검출 한계를 확인한 간접 ELISA 결과이다.
도 6은 단일클론항체 RP Mab GNU-10의 특이도(specificity)를 분석한 간접 ELISA 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.

땅콩(Arachis hypogaea)은 심한 전신증상 및 치명적인 아나필락시스를 유발할 수 있는 식품 알레르겐 중 하나로, 다른 식품과 달리 자연 소실이 잘 되지 않아 평생 지속되는 경향을 보인다. 땅콩의 단백 항원은 Ara h 1에서 Ara h 8까지 8개가 알려져 있으며, 가장 지배적인 주항원은 Ara h 1, Ara h 2 및 Ara h 3으로 알려져 있다. 이 알레르겐은 각각 비실린(vicilin), 콘글루틴(conglutin), 글리시닌(glycinin)으로 종자 저장 단백질(seed storage protein)이며, 땅콩 알레르기 환자의 90%에서 Ara h 1과 Ara h 2의 특이 IgE가 검출되었고, Ara h 3는 환자의 약 45%에서 양성을 보이는 것으로 알려졌다. Yapo-Crezoit 등(IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences (2017) 12(1):31-36)의 연구 결과를 보면, 생땅콩 추출물에서 Ara h 1은 약 60~75 kDa, Ara h 2는 17, 20 kDa, 그리고 Ara h 3은 25, 36, 40, 44 kD에 해당하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서, 용어 "단일클론항체(monoclonal antibody)"란 당해 분야에 공지된 용어로서 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 단일클론항체는 단세포군 항체, 모노클로날 항체 또는 단클론 항체라고 불리기도 한다. 통상적으로, 상이한 에피토프(항원결정기)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 또한 하이브리도마 배양에 의해 생산되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토 그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 단일클론항체는 한국생명공학연구원 생물자원센터에 2020년 5월 12일자로 기탁된 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주 RP MAb GNU 10으로부터 생산된 것이다.

본 발명의 항체는 (1) 땅콩에 0.1 M 탄산염 버퍼를 중량비 1:10으로 섞는 단계; (2) 상기 탄산염 버퍼와 섞어진 땅콩을 끓는 물에서 15분간 반응시켜 땅콩에서 열 안정성 수용성 단백질을 추출하는 단계; (3) 상기 추출한 열 안정성 수용성 단백질을 인산염 버퍼에 투석한 후 마우스에 주입하는 단계; (4) 상기 주입된 열 안정성 수용성 단백질에 대하여 마우스에서 항체를 형성시키는 단계; 및 (5) 항체가 형성된 마우스의 비장세포를 이용하여 단일클론항체 생산용 하이브리도마 세포를 개발하는 단계;를 포함하는 땅콩의 열 안정성 수용성 단백질 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적인 단일클론항체의 제조방법을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 땅콩의 열 안정성 수용성 단백질 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 단일클론항체를 포함하는 식품 내 땅콩 혼입 여부 판별용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3에 동시에 특이적으로 결합하는, 기탁번호가 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단일클론항체를 포함하며, 상기 항체를 이용하여 식품 내 땅콩 혼입 여부를 판별할 수 있는 것이다.

상기 식품이란 땅콩을 함유하거나, 함유할 것으로 예상되는 모든 식품을 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니나 생땅콩, 구운 땅콩, 삶은 땅콩, 튀긴 땅콩 또는 버터땅콩 등의 가공제품일 수 있다. 상기 버터땅콩은 미국에서 일반적으로 시판되고 있는 잼처럼 가공된 제품을 말한다.

본 발명은 또한, 상기 땅콩의 열 안정성 수용성 단백질 Ara h 1 및 Ara h 3에 특이적인 단일클론항체를 검체 시료와 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 식품 내 땅콩 혼입 여부의 판별방법을 제공한다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란, 시료 중의 땅콩 열 안정성 수용성 단백질인 Ara h 1 및 Ara h 3과 이를 인지하는 본 발명에 따른 단일클론항체의 결합물을 의미하며, 이러한 항원-항체 복합체는 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 발명의 판별방법에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러가지 표지체를 사용할 수 있다. 단일클론항체의 표지체의 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 반드시 이들로만 한정되는 것은 아니다. 검출 표지체로서 사용되는 바람직한 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제 또는 β-락타마제가 있으며, 바람직한 형광물로는 양자점, 플루오레세인, Eu³⁺, Eu³⁺킬레이트 또는 크립테이트가 있으며, 바람직한 리간드로는 바이오틴 유도체가 있고, 바람직한 발광물로는 아크리디늄 에스테르 또는 이소루미놀 유도체가 있으며, 바람직한 미소입자로는 콜로이드 금 또는 착색된 라텍스가 있고, 바람직한 방사성 동위원소로는 ⁷Co,³H, ¹²⁵I 또는 ¹²⁵I-볼톤(Bolton) 헌터(Hunter) 시약이 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.

항원-항체 복합체를 검출하는 방법은 바람직하게는 효소면역흡착법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)을 이용하여 검출할 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다. 효소면역흡착법은 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 항체는 검출 표지체를 가질 수 있으며, 검출 표지체를 가지지 않을 경우는 이들 항체를 포획할 수 있고, 검출 표지체를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 단일클론항체를 포함하는 식품 내 땅콩 혼입 여부 판별용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트에서, 상기 단일클론항체는 땅콩 유래 Ara h 1 및 Ara h 3을 동시에 특이적으로 결합하는, 기탁번호가 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되는 단일클론항체일 수 있다.

본 발명의 키트 시스템은 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피법 및 방사 분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다.

상기 본 발명의 키트에는 통상적으로 키트에 사용되는 것이라면 이에 한정되지 않지만, 예를 들어 ELISA를 이용한 것이라면 고체상 지지체; 본 발명의 단일클론 항체; 및 항원과의 반응을 위한 효소표지항체액 및 효소반응을 나타내는 발색액을 함유하는 효소-연관 면역분석용(ELISA) 반응액을 포함할 수 있다.

본 발명에서 '민감도(sensitivity)'는 판별검사에서 실제로 양성 시료(땅콩이 혼입된 시료) 중에서 검사결과가 양성으로 나올 확률로, 판별검사가 양성 시료를 얼마나 잘 골라내는지를 나타내는 지표이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 면역원 제조

땅콩에서 추출한 열 안정성 수용성 단백질(thermal stable-soluble protein, TSSP)을 면역원으로 사용하였다. 상세하게는, 잘게 분쇄한 생땅콩에 0.1 M 탄산염 버퍼를 생땅콩 중량 대비 10배 혼합하여 유리 비이커에 넣고 끓는 물에서 15분간 중탕하여 추출하였고, 상온에서 식힌 후 4℃에서 15분간 3,220 xg로 원심분리하여 얻은 상층액을 Whatman No. 1 여과지로 여과하였으며, 매일 인산완충식염수(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4) 용액을 바꾸어 가며 3일간 투석하여 단백질을 추출하였다. 상기 투석한 단백질 조추출물을 면역원으로 사용하였다. 조추출물의 단백질 농도는 Quick start^TM Bradford protein assay dye(Bio-Rad Laboratories Inc., 미국)를 이용하여 측정하였다.

2. 땅콩 단백질에 대한 단일클론항체 생산

준비한 단백질 조추출물(100 ㎍/100 ㎕ PBS)은 동량(100 ㎕)의 완전 프로인트 보강제(Freund's complete adjuvant)로 유화하여 7주령된 BALB/c 암컷 마우스에 유화된 면역원(200 ㎕/마우스)을 복강 내 주사하였다. 이후 2주 간격으로 불완전 프로인트 보강제(Freund's incomplete adjuvant)로 단백질 조추출물을 유화하여 2차, 3차 주사하였고, 세포 융합 4일 전에 단백질 조추출물(200 ㎍/200 ㎕ PBS)을 4차 주사하였다. 4차 주사 후, 미정액(caudal vein)에서 혈청(serum)을 수집하고 항체가를 ELISA로 확인하였다.

높은 항체가를 나타내는 면역된 마우스의 비장세포(spleen cell)와 암세포 일종인 SP2/0 골수종 세포(myeloma cell)를 융합하였다. 세포 융합의 일반적 과정은 Kohler and Milsten 방법에서 약간 변형하여 수행하였다. 비장세포(2×10⁸)와 SP2/0 골수종 세포(2×10⁷)를 1 ㎖의 50% 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol, PEG) 1500 용액을 이용하여 융합한 후, 히포잔틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 HAT 배지를 이용하여, 융합된 하이브리도마 세포만을 선택적으로 배양하고 증식시켰다. 상기 하이브리도마의 배양상등액을 땅콩 항원이 코팅된 플레이트를 이용한 간접 ELISA(indirect enzyme linked immunosorbent assay, ID-ELISA)법으로 흡광도를 측정하여 땅콩 내 열 안정성 수용성 단백질에 특이적인 단일클론항체(monoclonal antibody, MAb)의 생성 여부를 분석하였고, ELISA-양성 하이브리도마 세포는 무한대희석법(unlimited dilution method)으로 분리하여 땅콩 단백질에 특이적인 MAb을 생산하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다.

상기 하이브리도마 세포주로부터 단일클론항체를 생산하기 위해, 7~10일 동안 0.5 ㎖의 프리스틴(pristine)을 BALB/c 마우스의 복강 내에 전처리한 후, 하이브리도마 세포(1×10⁷)를 마우스 복강 내에 주입하여 복수를 생산하였다. 생산된 복수를 채취하여 황산암모늄(ammonium sulfate) 침전법으로 정제한 후, 인산완충식염수로 3일 동안 투석하고 동결건조시켜 -20℃에 보관하면서 실험에 사용하였다.

3. 웨스턴 블롯 시료의 준비

시판되고 있는 땅콩(peanut), 월넛(walnut), 아몬드(almond), 캐슈넛(cashew nut), 팥(red bean), 대두(soybean), 탈지유(skim milk) 및 땅콩 버터(peanut butter)를 이용하여 본 발명의 단일클론항체의 특이성을 분석하였다. 땅콩 및 다른 종류의 견과류의 조단백질(crude protein)은 각 재료(열처리된 땅콩(raw peanut, roasated peanut, boiled peanut), 월넛, 아몬드, 캐슈넛, 팥 및 대두)의 잘게 분쇄한 분말에 0.1 M 탄산염 버퍼를 각 분말 시료의 10배로 혼합하여 유리 비이커에 넣고 끓는 물에서 15분간 중탕하여 추출하였고, 상온에서 식힌 후 4℃에서 15분간 3,220 xg로 원심분리하여 얻은 상층액을 Whatman No. 1 여과지로 여과하고, 상기 여과액을 실험 전까지 냉동 보관하였다. 땅콩버터는 시중에 판매되는 제품을 구입하여 사용하였으며, 추출 방법은 상기와 동일하게 수행하였다.

4. 단일클론항체의 특성 분석

4-1. 간접 ELISA 분석

마이크로플레이트 웰(Nunc International, 덴마크)에 0.1 M 탄산염 버퍼 내 단백질을 포함하는 각각의 시료 100 ㎕를 넣어준 후 37℃에서 1시간 동안 코팅하였다. 플레이트를 PBST(PBS with 0.05% Tween 20)로 3번 세척하였다. 200 ㎕의 블로킹 버퍼(1% skim milk in PBS)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹한 후 PBST로 4번 세척하였고, 황산암모늄 침전법으로 정제한 단일클론항체를 1:10,000의 비율로 희석하여 각 웰에 100 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 웰 내의 반응액을 제거한 후, PBST로 5번 세척한 후, 1:10,000으로 희석시킨 HRP(horseradish peroxidase)-conjugated 염소 항-마우스 IgG(Thermo Fisher Scientific Inc., 미국)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. PBST로 6회 세척한 다음 기질 용액(ABTS 용액)(Sigma, 미국)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.

4-2. 웨스턴 블롯

SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)는 Laemmli 방법을 변형하여 수행하였다. 시료(웰 당 3 ㎍ 단백질) 및 단백질 마커(웰 당 5 ㎕)(prestained broad range protein maker, Bio-Rad, 미국)는 5% stacking gel(pH 6.8)에 로딩하여 12% separating gel(pH 8.8)에서 분리되었다. 전기영동은 Mini-PROTEAN^®tetra electrophoresis cell(Bio-Rad)과 PowerPac^TM Basic(Bio-Rad)을 이용하여 150V에서 1시간 30분 동안 수행하였다.

전기영동 후 겔은 염색 용액(EZblue^TM gel staining reagent, Sigma)을 사용하여 염색하고, 물로 탈색시켰다. 또 다른 겔은 웨스턴 블롯 분석에 사용되었다. 12% separating gel에서 분리된 단백질은 MiniTrans-Blot unit(Bio-Rad)을 이용하여 100V에서 1시간 동안 나이트로셀룰로스 멤브레인(nitrocellulose membrane, Bio-Rad)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인은 블로킹 용액(3% skim milk)으로 37℃에서 1시간 동안 블로킹한 후 PBST로 3번 세척하였다. 항체를 생산하는 하이브리도마 세포 배양액(1:4 in 3% skim milk)에 멤브레인을 37℃에서 1시간 동안 반응시키고 PBST로 4번 세척한 후, 1:6,000으로 희석한 염소 항-마우스 IgG 알칼리포스파타제 콘쥬게이트(goat anti-mouse IgG alkaline phosphatase conjugate, Bio-Rad)에 반응시켰다. 상기 멤브레인은 ECL(PerkinElmer, 미국)을 첨가하여 발광시킨 후 이미지 분석 장치를 통해 확인하였다.

실시예 1. 면역원으로서의 땅콩 내 열 안정성 수용성 단백질(thermal stable-soluble protein) 준비

SDS-PAGE로 비열처리 및 열처리 방법으로 추출된 땅콩 내 단백질의 발현 양상을 분석한 결과, 비열처리한 땅콩 시료의 단백질(레인 2) 발현과 열처리한 땅콩 시료의 단백질(레인 3) 발현은 큰 차이를 보이지 않았으며, 기타 모든 시료에서 15~100 kDa 범위에서 주 단백질 밴드가 나타난 것을 확인하였다. 이를 통해, 열처리 방법으로 추출된 땅콩 내에 열 안정성 수용성 단백질이 존재함을 확인하였다(도 1).

실시예 2. 땅콩 내 열 안정성 수용성 단백질에 대한 단일클론항체

0.1 M 탄산염 버퍼를 시료의 중량 대비 10배 혼합하여 유리 비이커에 넣고, 끓는 물에서 15분간 중탕하여 추출된 땅콩 추출물을 3 마리의 마우스에 면역하여 높은 항체가를 나타내는 마우스를 선별하였다. 선별된 마우스로부터 추출한 비장세포와 암세포를 융합시켜 선별된 하이브리도마 클론들의 땅콩 내 열 안정성 수용성 단백질에 대한 특이성을 분석하기 위해 웨스턴 블롯을 실시하였다.

웨스턴 블롯 분석 결과 땅콩의 열 안정성 단백질과 반응하는 항체들을 확인할 수 있었으며, 항체가 반응하는 단백질의 위치를 이전의 보고(Yapo-Crezoit et al., (2017) IOSR Journal of Pharmacy and Biological Sciences 12(1):31-36)를 참고하여 비교해 볼 때, RP Mab GNU-10 항체는 Ara h 1과 Ara h 3에 반응하며, RP Mab GNU-23 항체는 Ara h 1에, RP Mab GNU-30 항체는 Ara h 3에 특이적으로 반응하는 것으로 확인되었다(도 2). 특히, RP Mab GNU-30 항체가 36 kDa 크기의 Ara h 3에만 특이적인 반응을 보이는 것에 반해, RP Mab GNU-10 항체는 25, 36, 40 kDa의 Ara h3에 반응하여 Ara h 3에 대한 반응 민감도가 우수할 것으로 예측되었다.

실시예 3. 단일클론항체의 민감도 분석

다양한 땅콩 추출물 함량(100% (3 ㎎/㎖), 1%, 0.1%, 0.05%, 0.02%, 0.01%, 0.005%, 0.002% 0.001%, 0.0005%, 0.0002%, 0% v/v)에 따라 본 발명의 RP Mab GNU-10, RP Mab GNU-23 및 RP Mab GNU-30의 민감도(sensitivity)가 어떠한지를 간접 ELISA를 통해 측정하였다. 상기 각 단일클론항체는 황산암모늄 침전법으로 정제한 것으로, 항체(1 ㎎/㎖)를 PBS(pH 7.4)를 사용하여 1:10,000의 비율로 희석한 후 사용하였다.

그 결과, 생땅콩, 볶은 땅콩, 삶은 땅콩, 땅콩버터 추출물 시료 모두에서 Ara h 1과 Ara h 3을 동시에 검출할 수 있는 RP Mab GNU-10 항체가 Ara h 1 또는 Ara h 3을 단독으로 검출할 수 있는 Mab GNU-23 및 RP Mab GNU-30 항체에 비해 현저히 우수한 민감도를 보였다(도 3 및 도 4). 무처리 대조군(0%)의 흡광도와 비교한 결과, RP Mab GNU-10 항체는 0.001% 함량까지 생땅콩, 볶은 땅콩 및 삶은 땅콩 추출물에 대한 검출이 가능하였으며, 땅콩 버터 추출물은 0.0002% 함량까지 검출이 가능한 것으로 확인되었다. 이를 통해, 본 발명에서 개발된 RP Mab GNU-10 하이브리도마 세포에서 생산된 단일클론항체가 땅콩의 열 안정성 단백질에 매우 특이적으로 반응함을 알 수 있었다.

실시예 4. 단일클론항체 RP Mab GNU-10의 검출 한계 확인

상기 실시예 3을 통해 땅콩의 열 안정성 단백질에 특이성이 우수한 것으로 확인된 RP Mab GNU-10를 이용하여 검출 한계(Limit of detection, LOD)를 분석하였다. 분석 방법은 땅콩 추출물(3 ㎎/㎖)을 0.01%, 0.003%, 0.001% 0.0003%, 0.0001%, 0.00003%, 0.00001%, 0.000003%, 0.000001%, 0% (v/v)으로 준비한 후 간접 ELISA를 수행하였다. 상기 RP Mab GNU-10 항체는 1:100, 1:200, 1:500 및 1:1,000의 비율로 희석하여 사용하였다. 그 결과, 단일클론항체 RP Mab GNU-10의 LOD는 0.000001%로 확인되었으며, 상기 LOD 값이 항체의 희석 배율에 상관없이 동일하게 나타나, 본 발명의 RP Mab GNU-10의 땅콩 추출물 내 열 안정성 단백질의 극미량에도 매우 민감하게 반응하는 것을 알 수 있었다(도 5).

또한, 땅콩 외 다른 견과류에 대한 단일클론항체 RP Mab GNU-10의 반응성을 간접 ELISA로 확인한 결과, 월넛(walnut), 아몬드(almond), 캐슈넛(cashew nut), 팥(red bean), 대두(soybean) 및 탈지유(skim milk) 추출물 시료에 대해서는 반응 결과가 확인되지 않아 단일클론항체 RP Mab GNU-10의 특이성이 매우 우수함을 알 수 있었다(도 6). 이를 통해, 본 발명에서 개발된 RP Mab GNU-10 하이브리도마 세포에서 생산된 단일클론항체는 땅콩의 열 안정성 단백질에 높은 특이성과 민감도를 가지고 반응함을 알 수 있어, 추후 땅콩 유래 알레르겐 검사를 위한 면역센서 또는 바이오 센서 개발에 유용하게 사용될 것으로 예측되었다.

한국생명공학연구원

KCTC14185BP

20200512

Claims

기탁번호가 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주에 의하여 생산되고, 땅콩 유래 Ara h 1(Arachis hypogaea 1) 및 Ara h 3에 특이적으로 결합하는 단일클론항체.
제1항의 단일클론항체를 생산하는 기탁번호가 KCTC 14185BP인 하이브리도마 세포주.
제1항의 단일클론항체를 포함하는 식품 내 땅콩 혼입 여부 판별용 조성물.
제1항의 단일클론항체를 검체 시료와 접촉시켜 형성된 항원-항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는 식품 내 땅콩 혼입 여부의 판별방법.
제4항에 있어서, 상기 항원-항체 복합체의 검출은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 식품 내 땅콩 혼입 여부의 판별방법.
제1항의 단일클론항체를 포함하는 식품 내 땅콩 혼입 여부 판별용 키트.
제6항에 있어서, 상기 단일클론항체는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 및 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 표지체로 표지된 것을 특징으로 하는 식품 내 땅콩 혼입 여부 판별용 키트.