KR20210147977A - 신규한 항염증성 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본원은, 서열번호 1 내지 63의 아미노산 서열 및 이들의 변형된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 항염증용 펩타이드, 이를 포함하는 항염증용 조성물 및 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본원의 일 구현예에 따른 항염증용 펩타이드는 세포 독성이 없으며, MAVS 활성화, 면역/염증 활성화 반응 기전, 염증성 사이토카인 및 인플라마좀의 발현 또는 활성 등을 억제하는 효과를 갖는 바, 상기 펩타이드는 항염증 또는 염증성 질환 치료용 조성물에 응용될 수 있다.

Description

신규한 항염증성 펩타이드 및 이의 용도{A NOVEL ANTI-INFLAMMATORY PEPTIDES AND USE THEREOF}
본원은, 서열번호 1 내지 63의 아미노산 서열 및 이들의 변형된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 항염증용 펩타이드, 이를 포함하는 항염증용 조성물 및 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
최근 경제 발전에 따른 의료기술의 발달 및 평균수명의 연장으로 고령자 비율이 계속하여 증가하고 있으며, 환경오염 및 스트레스 증가에 따른 면역계 이상으로 염증반응의 만성화가 진행되어 아토피, 천식 등의 만성 염증성 질환이 증가하고 있는 추세이다 (Chang et al., 1994, Korean J. Gastroentrol., 26:907-918.; Heinzemann and Daser, 2002, Int. Arch. Allergy Immunol. 127:170-180.; Song et al., 1998, Korean J. Intern. Med., 55:158-168.; Sung et al., 2012, J. Ethnopharmacol. 144:94-100.).
일반적으로 염증반응은 세균 또는 바이러스 감염과 같은 외부자극 (병원체연관 분자유형, pathogen-associated molecular pattern, PAMP)이나 조직 손상에 따른 생체 내 대사산물과 같은 내부자극 (손상연관 분자유형, danger-associated molecular pattern, DAMP)에 대한 생체조직의 방어기전으로써, 세포 내 다양한 염증조절인자들인 TNF-α (tumor necrosis factor-α), IL-1β (interleukin-1β), IL-6 (interleukin-6) 등과 같은 여러 사이토카인 (cytokine) 및 산화질소 (nitric oxide, NO)가 생성되면서 발생한다. 내독소로 알려진 지질다당체 (lipopolysaccharide, LPS)는 대표적인 병원체연관 분자유형의 일례로, 그람 음성균의 세포 외막에 존재하며, 대식세포 또는 단핵세포에서 세포내 전사요소인 NF-κB (nuclear factor-κB)의 활성화를 유도함으로써 염증성 사이토카인, iNOS (inducible nitric oxide synthase), COX-2 (cyclooxygenase-2)의 유전자 발현을 유도하며 염증 매개물질을 생성한다. 따라서, 병원체연관 분자유형 또는 손상연관 분자유형에 의한 염증반응 (예를 들어, iNOS, COX-2, 또는 NF-κB의 발현, 및 사이토카인과 산화질소의 분비, 등)을 조절하는 물질이 염증질환의 예방 및 치료제로서 최근 주목받고 있다 (Dela Cruz and Kang, 2018, Mitochondrion, 41:37-44; Kim et al, 2013b, J. Korean Med. Ophthalmol. Otolaryngol. Dermatol., 26:54-64.).
현재 항염의 목적으로 이용되고 있는 물질로는 비스테로이드 계통인 플루페나믹산 (flufenamic acid), 이부프로펜 (ibuprofen), 벤지다민 (benzydamine), 인도메타신 (indomethacin) 등; 스테로이드 계통으로 프레드니솔론 (prednisolone), 덱사메타손 (dexamethasone), 베타메타손 (betamethasone), 하이드로코티손 (hydrocortisone) 등이 있으나, 이들 물질은 독성이 강하며, 간 손상, 암, 뇌졸중과 같은 여러 심각한 부작용을 초래하여 사용시 제한이 따른다. 또한, 염증 원인 물질에 선택적으로 작용하지 못하여 심한 면역억제를 유발하는 문제가 생기는 경우도 있다. 이에 생체에 안전하고, 종래 의약품에 비해 장기간 섭취가 용이한 장점을 가지고 있는 천연물을 이용한 염증 치료제의 개발이 이루어지고 있으나, 천연물로부터 추출한 항염증 물질의 경우 효능을 나타내는 유효농도가 약하고, 농경지 등에서 재배하여야 하므로 생산비용이 많이 소요되는 등의 문제가 있다.
상기와 같은 문제점을 개선하기 위해 기존의 화학적 염증 치료제 또는 천연물을 이용한 염증 치료제의 대안으로 새로운 개념의 항염증제가 개발되고 있으며, 특히 항염증 활성을 가지는 펩타이드의 합성에 많은 연구가 이루어지고 있다.
그러나, 일반적으로 합성된 펩타이드는 시험관내 (in vitro) 실험에서 아주 좋은 항염증 활성을 가지고 세포독성을 나타내지 않지만, 실제로 생체내 (in vivo) 실험에서는 항염증 효과가 미미한 경우가 많다.
이는 여러 가지 이유가 있지만, 주로 생체내의 생리 및 해부학적 조건이 시험관내 실험 조건과 많이 다르기 때문이다. 첫째, 생리조건인 염 (salt)이 존재하면 양전하가 낮은 펩타이드는 활성이 현저히 저해된다. 둘째, 펩타이드는 작은 분자량과 사이즈를 가지기 때문에 신장에서 거의 흡수되어 체외로 배출된다. 셋째, 생체내의 모든 조직이나 세포, 체액 및 혈액 등에 존재하는 단백질 및 펩타이드 분해효소 (protease 및 peptidase)에 의해 쉽게 잘려서 활성을 잃어버린다.
이에 본 발명자들은 상기한 문제를 해결하면서 우수한 항염증 활성을 나타내는 물질을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 일반적인 아미노산 잔기 5 내지 15개를 사용하여 경제적인 대량생산이 가능한 펩타이드를 개발하였으며, 상기 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않으며, 우수한 항염증 활성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본원은, 서열번호 1 내지 63의 아미노산 서열 및 이들의 변형된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 항염증용 펩타이드, 이를 포함하는 항염증용 조성물 및 염증 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하고자 한다.
그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본원의 제1측면은, 서열번호 1 내지 63의 아미노산 서열 및 이들의 변형된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 항염증용 펩타이드를 제공한다.
본원의 제2측면은, 본원의 항염증용 펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본원의 제3측면은, 본원의 항염증용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 조성물을 제공한다.
본원의 제4측면은, 본원의 항염증용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본원의 일 구현예에 따른 항염증용 펩타이드는 세포 독성이 없으며, Mitochondrial Antiviral Signaling Protein (MAVS) 활성화, 면역/염증 활성화 반응 기전, 염증성 사이토카인 및 인플라마좀의 발현 또는 활성 등을 억제하는 효과를 갖는 바, 상기 펩타이드는 항염증 또는 염증성 질환 치료용 조성물에 응용될 수 있다.
도 1a 내지 1f는, 본원에서 개발한 신규한 항염증성 펩타이드의 구조를 나타낸 도면이다.
도 2는, 본원 항염증성 펩타이드의 MAVS 응집 억제 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3a 및 3b는, 본원 항염증성 펩타이드의 polyinosinic:polycytidylic acid (polyIC)에 의해 유도된 IFN-β에 대한 발현 억제 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는, 본원 항염증성 펩타이드의 세포 독성을 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 5a 내지 5c는, 본원 항염증성 펩타이드의 LPS 또는 bacterial outer membrane vesicle (OMV)에 의해 유도된 IL-1β에 대한 발현 억제 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 6a 및 6b는, 본원 항염증성 펩타이드의 LPS에 의해 유도된 IL-6 및 TNF-α에 대한 발현 억제 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은, 본원 항염증성 펩타이드의 LPS에 의해 유도된 NF-κB 인산화 억제 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은, 본원 항염증성 펩타이드의 변형을 통한 단백질 분해효소 저항성 증대 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a 내지 9c는, 본원 항염증성 펩타이드 MQP-37 및 MQP-Y9의 각 서열을 알라닌 (alanine)으로 치환한 펩타이드의 LPS/ATP 또는 polyIC에 의해 유도된 IL-1b 또는 IFN-b 생성 억제 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 10a 및 10b는, 본원 항염증성 펩타이드 MQP-37의 첫번째 또는 여섯 번째 서열을 다른 19개의 아미노산으로 치환한 펩타이드의 LPS/ATP 또는 polyIC에 의해 유도된 IL-1b 또는 IFN-b 생성 억제 효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 11은, 본원 항염증성 펩타이드 MQP-37과 MQP-37A6의 MAVS 단백질과의 결합력을 비교확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 12a 및 12b는, 본원 항염증성 펩타이드 MQP-37과 MQP37-A6의 생리활성 (LPS 또는 LPS/nigericin에 의한 IL-6 및 IL-1b 생성량, LPS에 의한 NF-kB 인산화) 효과를 비교확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 13a 및 13b는, 본원 항염증성 펩타이드 MQP-37과 MQP-37D6Y, MQP-36D6W 및 QP-37D6H의 생리활성 (polyIC에 의한 IFN-b 생성량 및 세포사멸) 효과를 비교확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 14는, 본원 항염증성 펩타이드 MQP-37 및 MQP-37A6의 LPS에 의해 유도된 마우스 패혈증 동물 모델에서 패혈증 치료효과를 확인한 실험 결과를 나타낸 도면이다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 “연결”되어 있다고 할 때, 이는 “직접적으로 연결”되어 있는 경우뿐만 아니라, 그 중간에 다른 링커 등의 물질을 사이에 두고 “간접적으로 연결”되어 있는 경우도 포함한다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 제 1 측면은, 서열번호 1 내지 63의 아미노산 서열 및 이들의 변형된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 항염증용 펩타이드를 제공한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "펩타이드 (peptide)"는 펩타이드 결합 (-CO-NH-)에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본원의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술 (solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술 (US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있으며, 본원의 펩타이드를 구성하는 아미노산 잔기는 천연 또는 비-천연 아미노산 잔기일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 1 내지 63의 아미노산 서열 및 이들의 변형된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 변형된 아미노산 서열은 주요 활성에 변화를 주지 않고 유지하거나, 향상된 활성을 나타내는 것일 수 있으며, 자연적 변이 또는 인공적 변이에 의하여 상기 아미노산 서열의 일부가 변이되거나, 상기 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 중 하나 이상이 다른 종류의 아미노산으로 치환된 것을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 변형된 아미노산 서열은, 서열번호 1 내지 63의 아미노산 서열을 구성하는 아미노산 중 하나 이상이 감마아미노부탄산, 글루타민 (Gln, Q), 글루탐산 (Glu, E), 글라이신 (Gly, G), 라이신 (Lys, K), 류신 (Leu, L), 메티오닌 (Met, M), (Val, V), 세린 (Ser, S), 셀레노메티오닌, 셀레노시스테인 (Sec, U), 시스테인 (Cys, C), 시트룰린, 아르지닌 (Arg, R), 아스파라진 (Asn, N), 아스파트산 (Asp, D), 알라닌 (Ala, A), 오르니틴, 아이소류신 (Ile, I), 타우린, 트레오닌 (Thr, T), 트립토판 (Trp, W), 타이로신 (Tyr, Y), 페닐알라닌 (Phe, F), 프롤린 (Pro, P), 피롤라이신 (Pyr, O), 히스티딘 (His, H) 및 비천연 아미노산으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상으로 치환되는 것일 수 있다.본원의 일 구현예에 따른 펩타이드들은 각각의 펩타이드들과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 한, 기재된 서열번호뿐만 아니라, 상기 아미노산 서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 나타내는 펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 펩타이드와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다. 예를 들면, 점수 (score), 동일성 (identity) 및 유사도 (similarity) 등의 매개 변수 (parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건 (stringent condition)하에서 썼던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 통상의 기술자에게 잘 알려진 방법 [예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York]으로 결정될 수 있다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "엄격한 조건"이란 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 예를 들어, 이러한 조건은 문헌 [예컨대, J. Sambrook et al., 상동]에 구체적으로 기재되어 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "항염증"은, 염증을 억제하거나 감소시키는 작용을 의미하며, 상기 용어 "염증"은 생체 조직이 손상을 입었을 때에 체내에서 일어나는 방어적 반응으로, 염증성 질환을 유발하는 원인이다. 따라서, 본원의 항염증용 펩타이드는 염증을 억제하거나 감소시키는 활성을 나타냄으로써 염증성 질환의 예방, 치료 또는 개선 (증상의 경감)에 이용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 세포 투과성 펩타이드를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "세포 투과성 펩타이드"는 세포막을 투과하여 세포 내부로 침투할 수 있는 능력 또는 성질을 갖는 펩타이드로서, 세포 투과성 및/또는 피부 투과성을 나타내는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 종래 공지된 세포 투과성 펩타이드 또는 피부 투과성 펩타이드로부터 유래된 서열의 일부 또는 그 전부를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어 dNP2, penetratin, Tat, transpotan, MAP, KALA, P1, MPG, Pep-1, Arg(7, 8, 9, 10, 11), hCT, pVEC, SPEH, YARA, WLR, VP22, MTS, FHV coat, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있고, 구체적으로 Arg(8) 펩타이드 (R8 펩타이드)일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 항염증용 펩타이드에 두 번 이상 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 세포 투과성 펩타이드는 두 번, 세 번, 다섯 번, 일곱 번 또는 열 번 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 항염증용 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 것일 수 있으며, 구체적으로 N-말단에 연결된 것일 수 있으나, 상기 펩타이드의 약리활성을 저해하지 않으면서, 세포 투과성 또는 피부 투과성을 향상시킬 수 있는 한 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 세포 투과성 펩타이드는 상기 항염증용 펩타이드와 링커를 통해 결합된 것일 수 있고, 또는 직접적으로 연결된 것일 수 있다. 또한, 상기 링커는 세포내 또는 피부내에서 효소 작용 등의 다양한 생물학적, 화학적 작용에 의해 절단 또는 분해되는 것일 수 있으며, 상기 링커의 절단 또는 분해에 따라 상기 세포 투과성 펩타이드와 상기 항염증용 펩타이드는 목적하는 세포내 또는 피부내에서 서로 분리되는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항염증용 펩타이드를 구성하는 아미노산은 L형 또는 D형일 수 있으며, 구체적으로 D형일 수 있으나, 상기 펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않는 한 이에 제한되지 않는다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항염증용 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜 (polyethylene glycol, PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있으며, 상기 보호기는 상기 펩타이드의 활성에 영향을 미치지 않는 한 이에 제한되지 않는다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드 또는 이를 구성하는 아미노산은 상기의 보호기 결합뿐만 아니라 아세틸화 (acetylation) 또는 아민화 (amidation) 될 수 있으며, 상기의 변형은 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 것으로서, 상기 안정성은 생체내 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미하며, 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 분해효소의 공격으로부터 본원의 펩타이드를 보호하는 작용을 하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 MAVS (mitochondrial antiviral-signaling) 단백질의 응집 (aggregation) 및/또는 상기 단백질의 기능을 억제하는 것일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "MAVS (mitochondrial antiviral-signaling) 단백질"은 항-바이러스 선천성 면역에 필수적인 신호전달 단백질로서, 미토콘드리아의 외막, 과산화소체 (peroxisome), 소포체 (endoplasmic reticulum, ER)에 존재하는 것으로 알려져 있다. 상기 MAVS 단백질은 바이러스 감염 시, 바이러스의 존재를 감지하는 세포질 단백질군에 의해 응집체(집합체)를 이루며 활성화되며, 활성화된 MAVS는 인터페론 및 사이토카인을 분비하도록 유도하는 방식으로 면역반응을 유도한다. 그러나, MAVS 단백질이 계속 활성화되어 인터페론과 사이토카인의 생산이 과도하게 증가하면, 오히려 체내의 세포를 공격하여 다양한 병리학적 이상과 면역질환을 유발할 수 있다. 따라서, MAVS 단백질의 활성화를 적절히 조절하는 작용이 필요하다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항염증성 펩타이드는 MAVS 응집 또는 활성화 억제를 통해, MAVS 활성화로 인해 유도되는 염증/면역 활성화 반응 기전 및 염증/면역 반응을 억제할 수 있을 뿐만 아니라, MAVS 응집에 의해 발병할 수 있는 증세 또는 질환을 치료, 예방 또는 개선할 수 있다.
본원의 일 실시예에 있어서, 본원의 항염증성 펩타이드는 세균 및 바이러스에서 유래된 병원체연관 분자유형 (PAMP)에 의해 유도되는 MAVS 응집을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였는 바, 이를 토대로 본원의 항염증성 펩타이드는 MAVS 활성 억제를 통해 효과적으로 염증 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 염증성 사이토카인 또는 인플라마좀(inflammasome)의 발현, 생성, 활성 등을 억제하거나 염증 세포의 증식을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 상기 염증성 사이토카인은 IFN-β, IL-1β, IL-6 및 TNF-α로 구성된 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 당업계의 기술상식상 염증 반응을 일으키는 것으로 알려져 있는 물질이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "인플라마좀(inflammasome)"은 세포의 감염이나 스트레스 등 선천성 면역 방어체계 (innate immune defenses)와 관련된 IL-1와 같은 염증성 사이토카인의 성숙을 유도하는 물질로서, 케스페이즈 (caspase)-1-활성화 단백질 복합체로, 1) 감각 단백질 (sensor protein)인 NLRP3 (NOD-like receptor family, pyrin domain-containing 3), 2) 연결 단백질 (adaptor protein)인 ASC (adaptor protein apoptosis-associated spec-like protein containing a caspase-recruitment domain) 및 3) 이펙터 단백질인 비활성 형태의 케스페이즈-1 (inactive caspase-1)으로 구성된다. 상기 인플라마좀 구성 성분들은 세균 또는 바이러스 등의 미생물의 감염이나 조직의 상해가 발생한 경우에 조립되는데, 세포질에서 조립에 의해 활성화된 인플라마좀은 비활성 형태의 케스페이즈-1을 활성화 형태의 케스페이즈-1(active caspase-1)으로 변환시킨다. 변환된 활성화 형태의 케스페이즈-1은 전구체 형태의 IL-1β 또는 IL-18을 절단하여 활성화된 IL-1β 또는 IL-18을 만들고, 세포 밖으로 분비하여 숙주의 선천 면역 방어기능을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본원의 일 실시예에 있어서, 본원의 항염증성 펩타이드는 다양한 염증성 사이토카인 및 인플라마좀의 발현 수준을 억제하는 것을 확인하였는 바, 이를 토대로 본원의 항염증성 펩타이드는 효과적으로 염증 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 염증/면역 활성화 반응의 기전을 억제하는 것일 수 있으며, 상기 기전은 케스페이즈-1(caspase-1), 인터페론 조절 인자 3(interferon regulatory factor 3, IRF3), 또는 핵인자 카파비(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)일 수 있으나, 당업계의 기술상식상 염증/면역 반응을 일으키는 것으로 알려져 있는 기전이라면 이에 제한되는 것은 아니다.
본원의 일 실시예에 있어서, 본원의 항염증성 펩타이드는 NF-κB의 인산화를 억제함으로서 NF-κB 신호전달 기전의 활성을 저해하는 것을 확인하였는 바, 이를 토대로 본원의 항염증성 펩타이드는 효과적으로 염증 반응을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 세균 또는 바이러스에 의해 유발된 염증을 억제하는 것일 수 있으며, 구체적으로 세균 또는 바이러스에서 유래된 병원체연관 분자유형 (PAMP)에 의해 유발되는 염증을 억제하는 것일 수 있다. 또한, 세균 또는 바이러스 감염으로 발생하는 세포의 손상을 통해 세포 밖으로 분비되는 손상연관 분자유형 (DAMP)에 의해 유발되는 염증을 억제하는 것일 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "병원체연관 분자유형 (pathogen-associated molecular pattern, PAMP)"는　병원체에서 유래하여　면역　반응을 일으키는 분자로서,　면역계가 갖고 있는　패턴 인식 수용체는 특정한 분자 유형에 반응하여　식작용을 통해 감염원을 없애거나　항체를 형성하도록 유도하므로 패턴 인식 수용체가 반응하는 감염원 공통의 분자유형이 병원체 연관 분자유형이라고 할 수 있다. 상기 병원체 연관 분자유형은 내독소 (endotoxin), 외독소 (exotoxin), LPS (lipopolysaccharide), LTA (lipoteichoic Acid), MDP (muramyl dipeptide), 니제리신 (nigericin), dsRNA (polyIC 등), dsDNA (polydAdT 등), OMV (outer membrane vesicle), 및 플라젤린 (flagellin) 등일 수 있으나, 당업계의 기술상식상 병원체에서 유래되어 염증/면역 반응을 일으킬 수 있다고 알려진 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "손상연관 분자유형 (danger-associated molecular pattern, DAMP)"는 세포 내 대사산물 또는 단백질로서 세포의 손상에 의해 세포 밖으로 분비되어 주변 세포에서 면역반응이 일어나도록 하는 분자이다. 상기 손상연관 분자유형은 ATP, histone 단백질, HMGB1 (high mobility group box 1), mtDNA (mitochondrial DNA), uric acid 등일 수 있으나, 당업계의 기술상식상 세포 내에서 유래되어 염증/면역 반응을 일으킬 수 있다고 알려진 물질이라면 이에 제한되지 않는다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 펩타이드는 염증 반응을 억제하거나, 염증 반응에 의해 유발되는 질환의 증상을 치료 또는 완화시킬 수 있으며, 구체적으로 상기 펩타이드는 항염증용 약학 조성물, 식품 조성물, 화장료 조성물, 건강기능식품 조성물, 사료 조성물 등 다양한 조성물에 포함될 수 있다.
본원의 제2측면은, 본원의 항염증용 펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 제1측면과 중복되는 내용은 제2측면의 폴리뉴클레오타이드에도 공히 적용된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “폴리뉴클레오티드”란, 뉴클레오티드가 결합한 고분자 물질로서, 유전 정보를 코딩하고 있는 DNA를 의미한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1 내지 서열번호 63의 아미노산 서열 중 하나 이상을 암호화하는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항염증용 펩타이드를 코딩하는 염기 서열은 각 서열번호로 기재한 아미노산을 코딩하는 염기 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 펩타이드와 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열이라면 제한 없이 포함한다. 또한 상기 서열과 상동성을 가지는 서열로서 실질적으로 기재된 서열번호의 펩타이드와 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 가지는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 경우도 역시 본 발명의 범주에 포함됨은 자명하다. 또한, 상기 펩타이드들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인하여 상기 펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 따라서, 상기 폴리뉴클레오티드는 각 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이면 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 공지의 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이브리드화하여, 상기 펩타이드의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다.
본원 명세서에서 사용되는 용어 “엄격한 조건”이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌 (예컨대, Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던(southern) 하이브리드화의 세척 조건인 60℃, 1X SSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1X SSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1X SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다. 혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 폴리뉴클레오티드가 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, “상보적”은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 폴리뉴클레오티드 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55 ℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60 ℃, 63 ℃ 또는 65 ℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본원의 제2측면의 다른 양태로서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "발현벡터"는, 적당한 숙주세포에 도입되어 목적 단백질을 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 “작동가능하게 연결된(operably linked)”는, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 할 수 있다.
본원의 적합한 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있고, 원핵 세포의 경우에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터, 진핵세포의 경우에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들어 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터 등이 있지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선택마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터가 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.
외래 유전자를 삽입하기 위한 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터를 사용할 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 제한되지 않지만, 구체적으로 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 이용될 수 있다.
본원의 따른 항염증성 펩타이드를 발현시키기 위하여, 다양한 숙주와 벡터의 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이에 제한되지 않지만, SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열 등이 포함될 수 있다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터로는 이에 제한되지 않지만, pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 또는 이들의 유도체 등을 포함하는 대장균 (Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10, λgt11 또는 NM989 등의 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지 등이 포함될 수 있다. 효모 세포에는 2℃ 플라스미드 또는 그의 유도체 등이 사용될 수 있으며, 곤충 세포에는 pVL941 등이 사용될 수 있다.
본원의 제2측면의 다른 양태로서, 상기 발현벡터를 포함하는 인간을 제외한 형질전환체를 제공한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "형질전환체"는, 상기 발현 벡터가 도입될 수 있는 숙주의 세포일 수 있다. 구체적으로, 본원의 형질전환체는 인간을 제외한 형질전환체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 벡터의 도입에 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포일 수 있다. 또한, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 또는 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등 진핵 세포, 식물 또는 곤충의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포일 수 있다. 또한, 포유동물의 세포일 수 있으며, 구체적으로 원숭이 신장 세포 7(COS7: monkey kidney cells) 세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 또는 HEK293 세포 등을 이용할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본원의 형질전환 방법은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함하며, 당 분야에서 공지된 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.
본원의 제2측면의 다른 양태로서, 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 항염증성 펩타이드의 제조방법을 제공한다.
상기 항염증성 펩타이드의 제조방법은 본원의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하며, 구체적으로 상기 항염증성 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 상기 배양된 형질전환체로부터 항염증성 펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함할 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 형질전환체를 영양배지에서 배양함으로써 펩타이드를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.
상기와 같이 재조합적으로 생산된 펩타이드 또는 단백질은 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있다. 막 결합형인 경우, 적합한 계면활성제 용액 (예, 트리톤-X100)을 사용하거나 또는 효소적 절단에 의해 막으로부터 유리될 수 있다. 항-오스카 항체 또는 이의 단편 발현에 사용된 세포는 동결-해동 순화, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 분해제와 같은 다양한 물질적 또는 화학적 수단에 의해 파괴될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용 가능하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원의 제3측면은, 본원의 항염증용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 조성물을 제공한다. 제1측면 및 제2측면과 중복되는 내용은 제3측면의 조성물에도 공히 적용된다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항염증용 조성물은 약학, 의약외품, 화장료, 식품 및 사료 조성물로 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 염을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로, 상기 약학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 염산염, 황산염, 인산염, 초산염, 구연산염, 주석산염, 숙신산염, 젖산염, 말레산염, 푸마르산염, 옥살산염, 메탄술폰산염, 또는 파라톨루엔술폰산염 등을 들 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함하여 당업계에 공지된 통상의 방법으로 투여 경로에 따라 경구용 제형 또는 비경구용 제형으로 제조될 수 있다. 여기서 "약학적으로 허용되는" 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용 (처방) 대상이 적응 가능한 이상의 독성을 지니지 않는다는 의미이다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제제화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물을 제제화할 경우, 일반적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 또는 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물이 경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 현탁액, 웨이퍼 등의 제형으로 제조될 수 있다. 이때 약학적으로 허용되는 적합한 담체의 예로서는 락토스, 글루코스, 슈크로스, 덱스트로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 등의 당류, 옥수수 전분, 감자 전분, 밀 전분 등의 전분류, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스류, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트, 광물유, 맥아, 젤라틴, 탈크, 폴리올, 식물성유 등을 들 수 있다. 제제화할 경우 필요에 따라 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 및/또는 부형제를 포함하여 제제화할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물이 비경구용 제형으로 제조될 경우, 적합한 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 주사제, 경피 투여제, 비강 흡입제 및 좌제의 형태로 제제화될 수 있다. 주사제로 제제화할 경우 적합한 담체로서는 멸균수, 에탄올, 글리세롤이나 프로필렌 글리콜 등의 폴리올 또는 이들의 혼합물을 들 수 있으며, 바람직하게는 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline)나 주사용 멸균수, 5% 덱스트로스 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 경피 투여제로 제제화할 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태로 제제화될 수 있다. 비강 흡입제의 경우 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로 에탄, 이산화탄소 등의 적합한 추진제를 사용하여 에어로졸 스프레이 형태로 제제화될 수 있으며, 좌제로 제제화할 경우 그 기제로는 위텝솔 (witepsol), 트윈 (tween) 61, 폴리에틸렌글리콜류, 카카오지, 라우린지, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트류, 소르비탄 지방산 에스테르류 등이 사용될 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 상기 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본원의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본원의 약학 조성물은 단독으로 투여하거나 공지된 장 질환에 대한 치료 효과를 나타내는 것으로 알려진 성분과 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 1,000 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 100 mg/kg로 투여할 수 있고, 본원의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량 또는 투여횟수는 어떠한 면으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본원의 제4측면은, 본원의 항염증용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 제1측면 내지 제3측면과 중복되는 내용은 제4측면의 조성물에도 공히 적용된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "치료"는, 본원의 조성물의 투여에 의해 염증성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "예방"은, 본원의 조성물의 투여에 의해 염증성 질환 또는 이의 발병 가능성이 억제되거나 지연되는 모든 행위를 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어, "염증성 질환"은 외부의 물리·화학적 자극 또는 세균, 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염 또는 자가면역에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 염증 반응이 일으키는 병리적 증상으로서 정의될 수 있다. 이러한 염증 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소 (예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비 (예컨대, NO, TNF-α, IL-6 등의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 염증성 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크, 전신 염증반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome), 급성 호흡 부전 증후군 (acute respiratory distress syndrome), 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 특발성 폐섬유화증 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염 (예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 전신 홍반 루프스 (systemic lupus erythematosus, SLE) 및 다발성 경화증 등으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것일 수 있으며, 염증 반응에 의해 유발되는 질환, 구체적으로 세균 또는 바이러스 감염에 의한 염증 반응에 의해 유발되는 질환이라면, 이에 제한되지 않는다.
본원의 제5측면은, 본원의 항염증용 조성물 또는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 염증 또는 염증성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 제1측면 내지 제4측면과 중복되는 내용은 제5측면의 방법에도 공히 적용된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "개체"는 염증 반응 또는 염증성 질환이 발병되거나 발병할 위험이 있는 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 개체는 인간을 제외하는 것일 수 있다.
본원의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 염증 또는 염증성 질환을 예방 또는 치료하기 위하여 약학적으로 효과적인 양의 조성물이 투여될 수 있으며, 염증 반응 또는 염증성 질환의 진행 정도, 환자의 연령, 체중, 증상의 특성 및 정도, 현재 치료법의 종류, 치료 회수, 투여 형태 및 경로 등 다양한 요인에 따라 달라질 수 있으며, 해당 분야의 전문가들에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본원의 조성물은 상기한 약리학적 또는 생리학적 성분을 함께 투여하거나 순차적으로 투여할 수 있으며, 또한 추가의 종래의 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 이러한 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 용어 "투여"란, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본원의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 그러나 경구 투여시, 단백질은 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본원의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하나, 하기의 실시예는 본원의 이해를 돕기 위하여 예시하는 것일 뿐, 본원의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 항염증 효과를 갖는 신규 펩타이드 합성
선천면역(innate immune) 반응 기전에 주요 허브(hub) 단백질로 알려진 MAVS(mitochondrial anti-viral signaling) 단백질의 응집 현상을 억제하여 염증 반응을 완화할 수 있는 항염증용 펩타이드를 개발하기 위해, 하기와 같은 방식으로 MAVS 신호전달 억제 항염증용 펩타이드 서열을 도출하였다.
구체적으로, 단백질의 생체 내 합성은 이중나선구조로 이루어진 DNA의 5'-3' 방향의 한쪽 DNA로부터 전사 RNA(mRNA)가 만들어지고 이를 통해 단백질이 합성된다. 그러나, 다른 방향 (3'-5')의 상보적인 DNA 서열을 원 단백질이 합성되는 방향으로 전사하여 새로운 단백질을 합성할 경우, 원 단백질이 가지는 정전기적 성질과는 반대의 성질을 가지는 것으로 나타나 상호간의 결합이 특이적으로 이루어지는 현상이 알려져 있다(hydropathic complementarity). 또한, MAVS 단백질이 외부 자극을 받아 활성화되는 단계에서 응집현상이 일어나는데, 이 단계에서 핵심적인 역할을 할 것으로 보이는 MAVS 단백질의 도메인의 일부 서열들을 앞서 언급한 hydropathic complementarity 이론에 입각하여 해당 아미노산 서열에 상보적인 새로운 펩타이드를 합성하였다(서열번호 1~4, 48~52).
실시예 2: 신규 펩타이드의 MAVS 응집 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 신규 펩타이드들이 MAVS 단백질의 응집 현상을 억제하는 효능이 있는지를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, MAVS 단백질의 응집현상을 유도하기 위해, 병원체연관 분자유형 (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)을 이용하여 자극하였으며, 상기 병원체연관 분자유형의 일 예로 내독소 (lipopolysaccharide, LPS) 및 니제리신(nigericin)을 사용하였다. 먼저, 내독소 1 mg/ml을 포함한 무혈청(serum-free) 세포배양액에 MQP-15, MQP-23, MQP-31 또는 MQP-37을 5 mM 첨가하여 생쥐 복강 유래 대식세포주(mouse peritoneal macrophage cell line, IC21) 1 x 105 세포에 4시간 동안 처리하였다. 이 후, 니제리신 5 mM을 포함한 무혈청 세포배양액에 MQP-15, MQP-23, MQP-31 또는 MQP-37 5 mM 첨가하여 추가로 1시간 동안 생쥐 복강 유래 대식세포주에 처리하였다. 다음으로, 저삼투압 버퍼(hypotonic buffer) 및 원심분리 등을 통해 대식세포주 내 미토콘드리아를 분리하였다. 다음으로, MAVS 응집 결과를 웨스턴 블랏팅(western blot) 방법으로 확인하기 위해, 상기 분리된 미토콘드리아에 반변성세제(semi-denaturating detergent)를 이용하여 샘플을 제조하고, 전기영동을 실시하였다. 전기영동으로 분리된 미토콘드리아 단백질을 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene difluoride, PVDF) 박막(membrane)에 옮긴 후, MAVS 단백질을 인식하는 1차 항체 및 상기 1차 항체를 인식하는 2차 항체를 추가 처리하였다. 이 후, 2차 항체에 대한 화학발광(chemiluminescence) 반응 유도를 통해 MAVS 단백질의 응집현상을 확인하였다.
그 결과, 내독소와 니제리신을 처리한 대조군에서 나타나는 MAVS 단백질의 응집현상이 MQP-15, MQP-23, MQP-31 또는 MQP-37을 처리한 실험군에서는 감소한 것을 확인하였는 바(도 2), 본원에서 제작한 MQP-15, MQP-23, MQP-31 또는 MQP-37은 효과적으로 MAVS 단백질의 응집현상을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 3: 신규 펩타이드의 항바이러스 반응 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 신규 펩타이드들이 바이러스 감염에 의한 항바이러스 반응을 억제하는 효능이 있는지를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 바이러스 감염 반응을 유도하기 위해, 병원체연관 분자유형 중 바이러스 감염과 관련된 것으로 알려진, 합성 리보 핵산으로서 인터페론 (interferon) 생산을 촉진하고 RNA 바이러스 유전자 유사체인 폴리 IC (polyinosinic:polycytidylic acid, polyIC)를 사용하였다. 먼저, 폴리 IC 5 mg/ml과 MQP-15, MQP-23, MQP-31, MQP-37, MQP-Y9, 또는 MQP-T234을 첨가한 무혈청 세포배양액을 생쥐 폐상피세포주(mouse lung epithelial cell line, MLE-12) 1 x 105개의 세포에 16시간 동안 처리하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, 효소결합면역흡착검사법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 인터페론-베타(interferon-beta, IFN-b)의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 폴리 IC 만을 처리한 대조군보다, MQP-15, MQP-23, MQP-31, MQP-37, MQP-Y9, 또는 MQP-T234을 처리한 경우 IFN-b의 발현 수준이 감소된 것을 확인하였으며, 특히, MQP-37의 경우 다른 펩타이드들 보다 현저히 IFN-b의 발현 수준을 감소시키는 것을 확인하였다(도 3a의 A). 또한, 효과가 우수한 MQP-37의 다양한 농도로 상기와 동일한 실험을 수행한 결과, IFN-b의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 3a의 B). MQP-Y9 펩타이드를 다양한 농도로 상기와 동일한 실험을 수행한 결과, IFN-b의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였으며(도 3b의 C), MQP-T234 펩타이드를 처리한 동일한 실험에서도 IFN-b 의 발현양을 감소하였다(도 3b의 D). 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 MQP-15, MQP-23, MQP-31, MQP-37, MQP-Y9, 또는 MQP-T234은 효과적으로 바이러스 감염에 의한 항바이러스 반응을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 4: 신규 펩타이드의 세포 독성 확인
상기 실시예 1에서 제작한 신규 펩타이드들의 염증 저해 활성이 펩타이드 자체의 세포 독성에 의한 결과인지 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 펩타이드들의 세포 독성을 확인하기 위해, 세포 내 미토콘드리아의 활성을 측정하는 XTT 실험법을 사용하였다. 먼저, MQP-15, MQP-23, MQP-31 또는 MQP-37 5 mM을 첨가한 무혈청 세포배양액을 생쥐 복강 유래 대식세포주에 16시간 동안 처리하였다. 이 후, XTT를 1시간 동안 처리하고 미토콘드리아 내 탈수소효소(dehydrogenase)에 의해 환원되어 생성되는 수용성 formazan의 양을 측정하였다.
그 결과, 본원의 신규 펩타이드들에 의한 세포 독성은 세포 실험에 사용한 농도 범위에서는 나타나지 않는 것을 확인하였으며(도 4의 A), 특히 polyIC에 의한 염증반응을 매우 효과적으로 억제하는 펩타이드로 밝혀진 MQP-37 및 MQP-Y9의 경우, 10 mM의 농도에서도 세포 독성이 나타나지 않음을 확인하였다(도 4의 B 및 C). 따라서, 상기의 염증 반응 억제 효과는 자체적인 세포 독성에 의한 것이 아니며, 상기 펩타이드들을 의약품으로 이용하는 경우에도 개체에 유해하지 않는다는 것을 알 수 있다.
실시예 5: 신규 펩타이드의 인플라마좀 반응 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 신규 펩타이드들의 세균 감염에 의한 인플라마좀(inflammasome) 반응 억제 효과를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응을 유도하기 위해, 내독소로서 LPS(lipopolysaccharide) 및 그람음성균 유래 세포밖 소포체(outer membrane vesicle, OMV)를 사용하였다. 먼저, LPS 또는 OMV 0.1 mg/ml 각각을 포함한 무혈청 세포배양액에 MQP-15, MQP-23, MQP-31 또는 MQP-37 5 mM을 첨가하여 생쥐 복강 유래 대식세포주 1 x 105개의 세포에 6시간 동안 처리하였다. 또한, LPS 1 mg/ml와 nigericin 5 mM을 포함한 무혈청 세포배양액에 MQP-37 또는 MQP-Y9을 첨가하여 생쥐 복강 유래 대식세포주에 5시간 동안 처리(LPS 처리 - 4시간; nigericin 처리 - 1 시간)하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, ELISA을 이용하여 인터루킨-1베타(interleukin-1beta, IL-1b)의 발현 수준을 확인하였으며, 세포를 용해하여 SDS-PAGE를 진행하고 인플라마좀 인자들에 대해 웨스턴 블랏팅 (western blot)을 진행하였다.
그 결과, LPS 또는 OMV 만을 처리한 대조군보다, 본원의 신규 펩타이드들을 처리한 경우 IL-1b의 발현 수준이 감소된 것을 확인하였으며, 특히, MQP-37의 경우 다른 펩타이드들보다 현저히 IL-1b의 발현 수준을 감소시키는 것을 확인하였다(도 5a의 A 및 도 5b의 C). 또한, 효과가 우수한 MQP-37의 다양한 농도로 상기와 동일한 실험을 수행한 결과, LPS 처리에 의한 IL-1b의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 5a의 B). LPS 및 nigericin 처리에 의한 IL-1b 생성은 MQP-Y9 농도의존적으로 억제됨을 확인할 수 있었으며(도 5b의 D), 또한 MQP-37 처리에 의한 caspase-1의 활성화 억제를 확인할 수 있었다(도 5c의 E). 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 신규 펩타이드들은 효과적으로 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 신규 펩타이드의 염증 반응 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 신규 펩타이드들의 염증 반응 억제 효과를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세균 감염에 의한 염증 반응을 유도하기 위해, LPS를 사용하였다. 먼저, LPS 0.1 mg/ml을 포함한 무혈청 세포배양액에 MQP-15, MQP-23, MQP-31, MQP-37, 또는 MQP-Y9 을 첨가하여 생쥐 복강 유래 대식세포주 1 x 105개의 세포에 6시간 동안 처리하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, ELISA을 이용하여 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6) 및 종양괴사인자 알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-a)의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, LPS만을 처리한 대조군보다, 본원의 신규 펩타이드 중 MQP-37의 경우 현저히 IL-6 및 TNF-a의 발현 수준을 감소시키는 것을 확인하였다(도 6a의 A 및 도 6b의 C). 또한, 효과가 우수한 MQP-37의 다양한 농도로 상기와 동일한 실험을 수행한 결과, LPS 처리에 의한 IL-6의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 6a의 B). 다양한 농도의 MQP-Y9을 상기와 동일한 실험을 수행한 결과, LPS 처리에 의한 IL-6의 발현 수준이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인하였다(도 6b의 D). 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 신규 펩타이드들은 효과적으로 염증 반응을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 7: 신규 펩타이드의 면역 활성화 반응 기전 억제 효능 확인
상기 실시예 1에서 제작한 신규 펩타이드들의 면역 활성화 반응 기전 억제 효과를 확인하기 위해, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세균 감염에 의한 면역 활성화 반응을 유도하기 위해, LPS를 사용하였으며, 면역 활성화 반응의 기전을 확인하기 위해, 핵인자 카파비 (Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-kB) 인산화를 확인하였다. 먼저, 내독소 10 ng/ml을 포함한 무혈청 세포배양액에 MQP-15, MQP-23, MQP-31, MQP-37, MQP-Y9, MQP-91, MQP-T234, 또는 MQP-341 5 mM을 첨가하여 생쥐 복강 유래 대식세포주 1 x 106개의 세포에 6시간 동안 처리하였다. 이 후, PBS 용액으로 세포를 세척한 다음, 리파 버퍼 (RIPA buffer)를 통해 세포를 용해하고 상층액을 분리하였다. 분리한 상층액으로 핵인자 카파비 단백질의 인산화 양의 변화를 측정하기 위해, 상기 실시예 2와 같이 웨스턴 블랏을 수행하였다.
그 결과, LPS만을 처리한 대조군보다, 본원의 신규 펩타이드들 중, MQP-37 및 MQP-Y9의 경우 현저히 NF-kB의 인산화 수준을 감소시키는 것을 확인하였다 (도 7). 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 신규 펩타이드들은 효과적으로 면역 활성화 반응의 기전을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 8: D형 신규 펩타이드의 단백질 분해 효소 저항성 향상 확인
상기 실시예 2부터 7까지 실험을 통해 항염증 활성이 확인된 신규 펩타이드 MQP-37의 단백질 분해 효소에 대한 저항성을 높이기 위해 D형 아미노산으로 합성하였으며, 단백질 분해 효소에 대한 저항성을 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세균 감염에 의한 염증 반응을 유도하기 위해, LPS를 사용하였다. 먼저, LPS 0.1 mg/ml을 무혈청 세포배양액 또는 10%의 혈청 (fetal bovine serum, FBS) 세포배양액에 혼합하였다. 이어서, LPS를 포함하는 각각의 세포배양액에 L형 MQP-37 펩타이드 5 mM과 D형 MQP-37 펩타이드 5 mM을 첨가하여 생쥐 복강 유래 대식세포주 1 x 105 개의 세포에 6시간동안 처리하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, ELISA를 이용하여 인터루킨-6 (IL-6) 및 종양괴사인자 알파 (TNF-a)의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, LPS만을 처리한 대조군보다, 본원의 신규 펩타이드 L 형과 D 형 모두 단백질 분해 효소가 없는 조건인 무혈청 세포배양액 조건에서 동일한 염증 억제 반응을 나타내는 것을 확인하였다. 그러나, 단백질 분해 효소가 존재하는 조건인 10% 혈청이 포함된 세포배양액 조건에서는 본원의 신규 펩타이드 L 형은 항염증 활성이 나타나지 않는 반면, D 형 신규 펩타이드는 항염증 활성이 여전히 남아 있음을 확인하였다 (도 8). 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 D 형 신규 펩타이드는 단백질 분해 효소 존재 유무에 관계없이 효과적으로 염증 반응을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 9: 알라닌 치환 신규 펩타이드의 항염증 효과 향상 확인
상기 실시예 2부터 8까지 실험을 통해 항염증 활성이 확인된 신규 펩타이드 MQP-37 및 MQP-Y9의 핵심 아미노산을 확인하기 위해 각 서열을 순차적으로 알라닌으로 치환한 펩타이드를 합성하였으며 (MQP-37 알라닌 치환 펩타이드 [MQP-37 derivatives] - 서열번호 5~11; MQP-Y9 알라닌 치환 펩타이드 [MQP-Y9 derivatives] - 서열번호 53~62), 항염증 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응을 유도하기 위해, LPS와 ATP를 사용하였으며, 바이러스 감염에 의한 염증 반응을 유도하기 위해, polyIC를 사용하였다. 먼저, LPS 1 mg/ml과 알라닌 치환 신규 펩타이드 5 mM 또는 1 mM을 무혈청 세포배양액에 혼합한 다음, 1 x 105 cells의 마우스 복강 유래 대식세포주에 처리하였다. 이 후, ATP 5 mM과 알라닌 치환 신규 펩타이드 5 mM 또는 1 mM을 무혈청 세포배양액에 혼합하고 30분 동안 처리하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, ELISA을 이용하여 인터루킨-1베타 (interleukin-1beta, IL-1b)의 발현 수준을 확인하였다. 또한, polyIC 5 mg/ml과 알라닌 치환 신규 펩타이드 25 mM 또는 2 mM을 무혈청 세포배양액에 혼합하고, 생쥐 폐상피세포주 (mouse lung epithelial cell line, MLE-12) 1 x 105개의 세포에 16시간 동안 처리하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, ELISA을 이용하여 인터페론-베타 (interferon-beta, IFN-b)의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 1번째 및 6번째 위치한 아미노산을 알리닌으로 치환한 MQP-37 (A1 및 A6)는 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응 및 바이러스 감염에 의한 염증 반응을 MQP-37 원본 펩타이드에 비해 월등하게 개선하는 효과를 확인하였다(도 9a의 A 및 B). 또한, 2번째, 7번째, 9번째 아미노산을 알라닌으로 치환한 MQP-Y9 (A2, A7, 및 A9)의 경우, 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응을 원형에 비해 우수한 염증 억제 반응을 보이는 것을 확인하였으며(도 9b의 C), 10번째 아미노산을 알라닌으로 치환한 MQP-Y9 (A10)의 경우, 바이러스 감염에 의한 염증 반응을 원형에 비해 더 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 9c의 D). 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 알라닌 치환 신규 펩타이드들은 효과적으로 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응 및 바이러스 감염에 의한 염증 반응을 억제하는 것을 알 수 있다(서열번호 5~11; 53~62).
실시예 10: 첫 번째 및 여섯 번째 아미노산 서열을 다른 아미노산으로 치환한 신규 펩타이드들의 항염증 효과 확인
실시예 9의 실험을 통해 항염증 활성 개선 효과가 확인된 신규 펩타이드 MQP-37A6(서열번호 9)의 첫 번째 위치를 세린 (serine)이 아닌 다른 19개의 아미노산으로 치환하여 합성하였다. (MQP-37A1 derivatives - 서열번호 12~29, 63). 또한 MQP-37A6의 여섯 번째 위치를 아스파르트산 (aspartic acid)을 제외한 18개의 아미노산으로 치환하여 합성하고 (MQP-37A6 derivatives - 서열번호 30~47), 상기 펩타이드들의 항염증 개선 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응을 유도하기 위해, LPS와 ATP를 사용하였으며, 바이러스 감염에 의한 염증 반응을 유도하기 위해, polyIC를 사용하였다. 먼저, LPS 1 mg/ml과 아미노산 치환 신규 펩타이드 2 mM을 무혈청 세포배양액에 혼합한 다음, 1 x 105 cells의 마우스 복강 유래 대식세포주에 처리하였다. 이 후, ATP 5 mM과 아미노산 치환 신규 펩타이드 2 mM을 무혈청 세포배양액에 혼합하고 30분 동안 처리하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, ELISA을 이용하여 인터루킨-1베타(interleukin-1beta, IL-1b)의 발현 수준을 확인하였다. 또한, polyIC 5 mg/ml과 아미노산 치환 신규 펩타이드 2 mM을 무혈청 세포배양액에 혼합하고, 생쥐 폐상피세포주(mouse lung epithelial cell line, MLE-12) 1 x 105개의 세포에 16시간 동안 처리하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, ELISA을 이용하여 인터페론-베타(interferon-beta, IFN-b)의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, MQP-37A6의 첫 번째 아미노산을 알라닌으로 치환한 MQP-37A1이 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응을 가장 효과적으로 저해하였으며, 페닐알라닌 (phenylalanine, F), 루이신(leucin, L), 아르기닌(arginine, R), 타이로신(tyrosine, Y)으로 치환한 경우에도 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 10a의 A). 또한, MQP-37의 여섯 번째 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 경우, 도 10a의 B와 같이 알라닌(alanine, A), 페닐알라닌(phenylalanine, F), 히스티딘(histidine, H), 루이신(leucin, L), 메티오닌(methionine, M) 등이 효과적으로 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응을 효과적으로 억제하였으며, 그 중에서도 알라닌으로 치환한 신규 펩타이드가 가장 효과적으로 저해하였음을 확인하였다. 바이러스 감염에 의한 염증반응은 MQP-37의 여섯 번째 아미노산을 트립토판(tryptophan, W) 또는 타이로신(tyrosine, Y)으로 치환하였을 경우, 낮은 펩타이드 농도에서도 원형 펩타이드에 비해 바이러스 감염에 의한 염증 반응을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다(도 10b의 C). 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 아미노산 치환 신규 펩타이드들은 효과적으로 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응 및 바이러스 감염에 의한 염증 반응을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 11: 신규 펩타이드 MQP-37과 알라닌 치환 신규 펩타이드 MQP-37A6의 결합력 비교 확인
상기 실시예 9부터 10까지의 실험을 통해 항염증 활성이 확인된 알라닌 치환 신규 펩타이드 MQP-37A6의 MAVS 단백질과의 결합력을 원본 펩타이드인 MQP-37과 비교하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, MAVS 단백질과의 결합력을 확인하기 위해 재조합 MAVS 단백질과 형광표지된 MQP-37 및 MQP-37A6 펩타이드를 사용하였다. 먼저 재조합 MAVS 단백질 250 ng을 ELISA용 96-well plate에 코팅한 다음, 1% BSA/PBS 용액으로 blocking을 하였다. 이 후, 다양한 농도의 형광표지된 펩타이드를 넣고 2시간 동안 반응시킨 다음, MAVS 단백질과 결합한 펩타이드의 양을 형광 측정을 통해 확인하였다.
그 결과, MQP-37을 농도별로 처리하여 MAVS 단백질과의 결합력을 측정하였을 경우, 결합력 (binding affinity, Kd)은 약 16 mM로 측정된 반면, MQP-37A6의 경우 결합력이 약 0.75 mM로 측정되어 약 20배의 강한 결합력을 가지는 것으로 확인되었다 (도 11). 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 신규 펩타이드 MQP-37A6는 MAVS 단백질과의 결합력이 개선되었음을 알 수 있다.
실시예 12: 신규 펩타이드 MQP-37과 알라닌 치환 신규 펩타이드 MQP-37A6의 생리활성 비교 확인
상기 실시예 9부터 10까지의 실험을 통해 항염증 활성이 확인된 알라닌 치환 신규 펩타이드 MQP-37A6의 생리활성을 원본 펩타이드인 MQP-37과 비교하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세균 감염에 의한 염증 반응을 유도하기 위해, LPS를 사용하였다. 먼저, LPS 0.1 mg/ml을 포함한 무혈청 세포배양액에 MQP-37 또는 MQP-37A6를 첨가하여 생쥐 복강 유래 대식세포주 1 x 105개의 세포에 6시간 동안 처리하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, ELISA을 이용하여 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)의 발현 수준을 확인하였다. 또한, 면역 활성화 반응의 기전을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯을 수행하고 핵인자 카파비(Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-kB) 인산화를 확인하였다. 다음으로 세균 감염에 의한 인플라마좀 반응을 유도하기 위해, LPS와 ATP를 사용하였다. 먼저, LPS 1 mg/ml과 L형 또는 D형 MQP-37 및 MQP-37A6를 무혈청 세포배양액에 혼합하고, 1 x 105 cells의 마우스 복강 유래 대식세포주에 처리하였다. 이 후, ATP 5 mM과 MQP-37 또는 MQP-37A6를 무혈청 세포배양액에 혼합하여 30분 동안 처리하였다. 상층액을 수득하여, ELISA을 이용하여 인터루킨-1베타(interleukin-1beta, IL-1b)의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, L형 및 D형 모두 여섯 번째 아미노산이 알라닌으로 치환된 MQP-37A6가 원형인 MQP-37에 비해, 세균 감염에 의한 염증 반응(도 12a의 A) 및 인플라마좀 반응(도 12a의 B 및 C), 그리고 면역 활성화 반응(NF-kB 인산화, 도 12b의 D 내지 F)을 보다 효과적으로 억제하고 있음을 확인하였다. 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 알라닌 치환 신규 펩타이드(MQP-37A6)는 효과적으로 염증 반응을 억제하는 것을 알 수 있다.
실시예 13: 신규 펩타이드 MQP-37과 아미노산 치환 신규 펩타이드 MQP-37D6Y, MQP-37D6W, MQP-37D6H의 바이러스 염증 반응 비교 확인
상기 실시예 10의 실험을 통해 바이러스 염증 반응 억제 활성이 확인된 아미노산 치환 신규 펩타이드 MQP-37D6Y, MQP-37D6W의 활성을 원본 펩타이드인 MQP-37과 비교하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 바이러스 감염 반응을 유도하기 위해 polyIC를 사용하였다. 먼저, polyIC 5 mg/ml과 MQP-37, MQP-37A6, MQP-37D6W, MQP-37D6Y, MQP-37D6H, MQP-37D6K, MQP-37D6R, 또는 MQP-37D6V를 첨가한 무혈청 세포배양액을 생쥐 폐상피세포주(mouse lung epithelial cell line, MLE-12) 1 x 105개의 세포에 16시간 동안 처리하였다. 이 후, 상층액을 수득하여, 효소결합면역흡착검사법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 이용하여 인터페론-베타(interferon-beta, IFN-b)의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, MQP-37D6W 및 MQP-37D6Y의 경우, MQP-37 및 MQP-37A6에 비해 월등한 바이러스 감염에 의한 염증 반응 억제 효과를 농도 의존적으로 보임을 확인하였으며(도 13a의 A 및 B). 또한 MQP-37D6Y의 경우, polyIC에 의한 세포사멸 효과를 효과적으로 억제하고 있음을 확인하였으며(도 13b의 E), 실험에 사용한 MQP-37D6Y의 최대 농도에서 세포 독성을 보이지 않음을 확인하였다(도 13b의 F). 그리고, MQP-37D6H의 경우도 바이러스 감염에 의한 염증반응을 농도 의존적으로 억제하고 있음을 확인하였다(도 13a의 C 및 D). 상기 결과를 토대로, 본원에서 제작한 MQP-37D6Y를 비롯한 아미노산 치환 신규 펩타이드들은 바이러스 감염에 의한 염증반응을 효과적으로 저해하고 있음을 알 수 있다.
실시예 14: 신규 펩타이드의 마우스 패혈증 동물 모델에서의 효과 확인
상기 실시예 2부터 12까지의 실험을 통해 세균 감염에 의한 염증 반응을 억제하는 활성이 확인된 D형 또는 L형 MQP-37 및 MQP-37A6의 마우스 패혈증 동물 모델에서의 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, 7주령의 C57BL/6 야생형 마우스 복강에 2 mg/kg 및 5 mg/kg LPS를 6시간 간격으로 투여하고, 1시간 뒤 마우스 복강에 0.4 mg/kg, 2 mg/kg, 및 10 mg/kg 신규 펩타이드를 추가로 투여하였다. 이 후, 4일간 마우스의 생존 여부를 확인하였다.
그 결과, 0.4 mg/kg를 투여한 경우 40~80%의 생존률을 보이는 반면, 2 mg/kg 및 10 mg/kg를 투여한 경우 100%의 마우스가 생존하는 것을 확인하였다 (도 14의 A 내지 C). 또한, 혈액 내 염증성 사이토카인인 IL-6의 양이 신규 펩타이드를 처리한 군에서 대조군에 비해 감소해 있음을 확인하였다 (도 14의 D). 상기 결과를 토대로, D형 또는 L형 MQP-37 및 MQP-37A6은 염증성 질환인 패혈증의 치료 효과가 있음을 알 수 있다.
전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> MITOQUEST <120> A novel anti-inflammatory peptides and use thereof <130> DP20200182KR <150> KR 10-2020-0064483 <151> 2020-05-28 <160> 63 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-15 <400> 1 Leu Lys Ser Leu Lys Thr Leu His 1 5 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-23 <400> 2 Leu Gln His Leu Glu Asp Gly Met 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-31 <400> 3 Asp Gly Thr Glu Cys Arg 1 5 <210> 4 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-37 <400> 4 Ser Leu Val Leu Ala Asp Ala Arg Trp 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-37A1 <400> 5 Ala Leu Val Leu Ala Asp Ala Arg Trp 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-37A2 <400> 6 Ser Ala Val Leu Ala Asp Ala Arg Trp 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-37A3 <400> 7 Ser Leu Ala Leu Ala Asp Ala Arg Trp 1 5 <210> 8 <211> 9 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<210> 56 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-Y9A4 <400> 56 Lys Arg Leu Ala Phe Trp Ile Phe Ile Lys 1 5 10 <210> 57 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-Y9A5 <400> 57 Lys Arg Leu Leu Ala Trp Ile Phe Ile Lys 1 5 10 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-Y9A6 <400> 58 Lys Arg Leu Leu Phe Ala Ile Phe Ile Lys 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-Y9A7 <400> 59 Lys Arg Leu Leu Phe Trp Ala Phe Ile Lys 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-Y9A8 <400> 60 Lys Arg Leu Leu Phe Trp Ile Ala Ile Lys 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-Y9A9 <400> 61 Lys Arg Leu Leu Phe Trp Ile Phe Ala Lys 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-Y9A10 <400> 62 Lys Arg Leu Leu Phe Trp Ile Phe Ile Ala 1 5 10 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MQP-37S1A <400> 63 Ala Leu Val Leu Ala Ala Ala Arg Trp 1 5

Claims (10)

  1. 서열번호 1 내지 63의 아미노산 서열 및 이들의 변형된 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는, 항염증용 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 서열번호 4, 9, 47 및 48의 아미노산 서열로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 항염증용 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 세포 투과성 펩타이드를 추가로 포함하는 것인, 항염증용 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 MAVS (mitochondrial antiviral-signaling) 단백질의 응집 및 기능을 억제하는 것인, 항염증용 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 염증성 사이토카인 또는 인플라마좀의 발현을 억제하는 것인, 항염증용 펩타이드.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 세균 또는 바이러스에 의해 유발된 염증을 억제하는 것인, 항염증용 펩타이드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항염증용 펩타이드를 암호화하는, 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항염증용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항염증용 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항염증용 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 패혈증, 패혈성 쇼크, 전신 염증반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome), 급성 호흡 부전 증후군 (acute respiratory distress syndrome), 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 특발성 폐섬유화증 (idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염 (예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티스성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 전신 홍반 루프스 (systemic lupus erythematosus, SLE) 및 및 다발성 경화증으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것인, 조성물.
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