KR20210147774A - 신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법 - Google Patents

신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210147774A
KR20210147774A KR1020200065498A KR20200065498A KR20210147774A KR 20210147774 A KR20210147774 A KR 20210147774A KR 1020200065498 A KR1020200065498 A KR 1020200065498A KR 20200065498 A KR20200065498 A KR 20200065498A KR 20210147774 A KR20210147774 A KR 20210147774A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
paeoniflorin
paoniflorin
present
peony
Prior art date
Application number
KR1020200065498A
Other languages
English (en)
Inventor
김창진
이종민
김춘식
박동진
Original Assignee
한국생명공학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국생명공학연구원 filed Critical 한국생명공학연구원
Priority to KR1020200065498A priority Critical patent/KR20210147774A/ko
Priority to PCT/KR2021/006692 priority patent/WO2021242051A1/ko
Publication of KR20210147774A publication Critical patent/KR20210147774A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • C12P19/46—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides having an oxygen atom of the saccharide radical bound to a cyclohexyl radical, e.g. kasugamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 패오니플로린을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환시키는 생물전환능을 나타내는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 류코노스톡 속 LN180020 균주는 패오니플로린을 생리활성이 향상된 β-젠티오비오실 패오니플로린으로 전환하는 생물전환능이 매우 우수하기 때문에, 당뇨, 비만 등을 포함한 다양한 질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법{A novel Leuconostoc sp. strain and method for paeoniflorin-biotransforming using the same}
본 발명은 신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 패오니플로린을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환시키는 생물전환능을 나타내는 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법에 관한 것이다.
패오니플로린(Paeoniflorin)은 한약재명으로 작약으로 불리는 함박꽃과의 여러해살이 식물인 함박꽃(Paeonia lactiflora Pall.)의 뿌리에서 추출된 배당체(Tetrahedron 25(9):1825-38)이다.
패오니플로린의 효능에 대해서는 난소의 안드로젠 생산을 억제한다는 보고, 허혈 증상이 있는 쥐모델에서 말초 신경과 뇌의 염증반응을 저해하여 뇌졸중에 대한 뇌신경 보호작용과 미세교세포의 활성화를 선택적으로 억제함으로써 모르핀에 대한 내성을 약화시킨다는 보고를 비롯하여 항당뇨 및 항비만과 같은 대사증후군 예방 효과가 있다는 것이 알려져 있다.
하지만, 패오니플로린의 이와 같은 활성은 생리학적으로 유효한 효과를 나타내기에는 충분하지 못하다는 한계가 있었다.
이에 본 발명자들은 작약 추출물을 대사 또는 개량함으로써 작약의 지표물질인 패오니플로린의 생리활성이 향상된 새로운 전환체를 개발하기 위해 예의 연구를 거듭한 결과, 김치로부터 분리된 류코노스톡 속 (Leuconostoc sp.) LN180020(KCTC 13719BP)로 작약 추출물을 발효시키는 경우 패오니플로린이 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환되고, 상기 β-젠티오비오실 패오니플로린이 패오니플로린과 비교해 향상된 생리학적 활성을 나타낸다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 기탁번호 KCTC13719BP로 기탁된 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 패오니플로린(paeoniflorin)을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환하는 생물 전환용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 패오니플로린(paeoniflorin)을 포함하는 조성물에 상기 균주 또는 이의 배양액을 접종하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 수득물을 배양하여 발효시키는 단계를 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 작약(Paeonia lactiflora)의 분말, 엑기스 또는 추출물에 상기 균주 또는 이의 배양액을 접종하고 발효시키는 방법에 따라 제조된 작약의 발효물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 기탁번호 KCTC13719BP로 기탁된 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020 균주를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 패오니플로린(paeoniflorin)을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환하는 생물 전환용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 패오니플로린(paeoniflorin)을 포함하는 조성물에 상기 균주 또는 이의 배양액을 접종하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 수득물을 배양하여 발효시키는 단계를 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 작약(Paeonia lactiflora)의 분말, 엑기스 또는 추출물에 상기 균주 또는 이의 배양액을 접종하고 발효시키는 방법에 따라 제조된 작약의 발효물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 기탁번호 KCTC13719BP로 기탁된 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020 균주를 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 류코노스톡 속 LN180020 균주는 패오니플로린(paeoniflorin) 생물전환능을 나타내는 것을 특징한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 류코노스톡 속 LN180020 균주는 패오니플로린(paeoniflorin)을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환시키는 생물전환능을 나타내는 것을 특징으로 한다.
패오니플로린 및 β-젠티오비오실 패오니플로린의 화학구조를 각각 아래 화학식 1 및 화학식 2에 나타내었다:
[화학식 1]
Figure pat00001
[화학식 2]
Figure pat00002
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 류코노스톡 속 LN180020 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 류코노스톡 속 LN180020 균주는 그 출처가 제한되지 않으나, 발효식품으로부터 분리된 것일 수 있으며, 예를 들어 김치, 된장, 고추장, 간장, 치즈, 젓갈 등을 들 수 있으며, 바람직하게는 김치에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 본 발명자들은 패오니플로린의 생리활성을 향상시킬 수 있는 생물전환능을 나타내는 미생물을 탐색하기 위하여, 김치로부터 미생물을 순수 분리하고 이들의 작약 추출물 발효능을 평가하였다. 그 결과, 김치로부터 분리된 균주들 중에서 류코노스톡 속 균주를 접종한 작약 추출물에서 특이적으로 패오니플로린이 감소하는 것으로 확인되었으며, 보다 구체적으로는 패오니플로린이 β-젠티오비오실 패오니플로린으로 전환되는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 실시예에서, 패오니플로린을 β-젠티오비오실 패오니플로린으로 전환하는 활성을 나타내는 류코노스톡 속 균주의 genome 서열을 분석해 본 결과, Leuconostoc citreum KM20과 99.38%, Leuconostoc citreum EFEL 2700와 99.34%의 상동성을 지님을 확인하였고, 상기 신규한 균주를 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020으로 명명하고 2018년 11월 20일자로 한국생명공학연구원에 기탁하였다(기탁번호 KCTC13719BP).
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 동정된 신균주인 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020으로 발효한 작약 추출물의 발효물은 작약 추출물과 비교해 현저히 향상된 항당뇨 및 항비만 효과를 나타내는 것으로 확인되었다. 또한, 상기 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020 균주에 의해 패오니플로린이 생물전환되어 생성된 β-젠티오비오실 패오니플로린은 패오니플로린과 비교해 현저히 향상된 항비만 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 상기 신균주는 생리학적 활성이 향상된 작약 추출물의 발효물을 제조하거나, 패오니플로린을 β-젠티오비오실 패오니플로린으로 생물전환하는 용도로 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 류코노스톡 속 LN180020의 배양물을 제공한다.
본 발명에서 용어 '배양'이란 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육시키기 위하여 수행하는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서는 '발효'를 포함하는 개념이다.
상기 '류코노스톡 속 LN180020'의 균체는 배양 배지로부터 수득된 생균 그 자체뿐만 아니라, 당업자에게 알려진 유산균에 대한 임의의 가공형태를 포함하는 것으로 예를 들어 균체 파쇄물, 건조물, 동결물 등을 포함하며 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 용어 '배양물' 또는 ‘배양액’은 '발효물'을 포함하는 의미이며, 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리 하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등의 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다.
본 발명은 또한 류코노스톡 속 LN180020 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 패오니플로린을 β-젠티오비오실 패오니플로린으로 전환하는 생물 전환용 조성물을 제공한다.
본 발명의 균주 또는 이의 배양액은, 본 발명의 조성물에 10 내지 20 중량부로 포함되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 배양액은 본 발명의 균주를 배양한 배양원액 및 상기 균주를 제거한 배양 상등액을 희석하는 것을 포함하는 것이 바람직하며, 구체적으로 0.5 내지 500 배로 희석하여 포함하는 것이 더욱 바람직하다.
상기 배양액의 조성은 통상의 류코노스톡 속 균주의 성장과 유지에 필요한 영양 성분뿐만 아니라, 류코노스톡 속 균주의 생장에 상승적으로 작용하는 것으로 공지된 모든 성분을 추가적으로 포함되는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 (a) 패오니플로린(paeoniflorin)을 포함하는 조성물에 류코노스톡 속 LN180020 균주 또는 이의 배양액을 접종하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 수득물을 배양하여 발효시키는 단계를 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 패오니플로린을 포함하는 조성물은 패오니플로린을 포함하는 원물의 추출물일 수 있으며, 바람직하게는 작약(Paeonia lactiflora) 또는 작약속 (Paeonia) 식물의 분말, 엑기스 또는 추출물일 수 있다. 배양을 용이하게 하기 위하여 바람직하게는 패오니플로린을 포함하는 조성물은 액상일 수 있다.
본 명세서에서 상기 '작약'은 학명 Paeonia lactiflora를 가지는 식물의 뿌리, 바람직하게는 약재로 사용되는 Paeonia lactiflora의 뿌리를 의미하는 것이다. 약재로서의 작약은 Paeoniae Radix 또는 Peony root라고 불리기도 하며, 보다 상세하게는 약용부위로 사용되는 작약 Paeonia lactiflora Pallas 또는 기타동속근연식물 (작약과 Paeoniaceae)의 뿌리를 나타낸다.
본 발명에서 상기 작약 추출물은 당업계에 공지된 용매 추출법에 의해 추출된 것일 수 있다. 추출 용매로는 이에 제한되지는 않으나, 물, 탄소수 1(C1) 내지 6개(C6)의 저급 알콜, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 사용할 수 있다. 탄소수 1(C1) 내지 6개(C6)의 저급 알콜은 이에 제한되지는 않으나, 메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올일 수 있고, 유기용매는 이에 제한되지는 않으나, 아세톤, 에틸아세테이드, n-핵산, 디에틸에테르, 아세톤, 벤젠일 수 있다. 바람직하게는 물 또는 탄소수 1 내지 6개의 알콜 또는 이의 혼합용매로 추출할 수 있고, 더 바람직하게는 물, 에탄올 또는 주정일 수 있다. 알콜에는 흡습성 등 물리화학적 성질을 반영하기 위하여 소량의 물(예를 들어, 95% 에탄올, 99% 에탄올의 형태)이 첨가된 형태일 수도 있다.
추출온도 및 시간은 활성성분의 추출의 목적이 달성되는 한 특별히 제한되지는 않으나, 30℃ 내지 121℃에서 10분 내지 12시간 동안 추출된 것일 수 있다. 추출시 활성성분의 추출을 용이하게 하기 위하여 가압하여 추출할 수도 있다. 한편, 추출은 이산화탄소 등 적절한 용매를 사용하여 초임계 추출 또는 아임계 추출에 의할 수도 있다.
상기 (a) 단계에서 접종하는 균주의 양은 1 x 108 내지 1 x 1011의 균주를 조성물 자체 또는 조성물이 포함된 배지에 첨가하거나 전배양된 균주 배양액을 1 내지 5%(v/v)정도로 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 류코노스톡 속 LN180020 균주 또는 이의 배양액의 접종 후의 (b)단계의 배양은 당업계에 공지된 유산균 배양방법에 의할 수 있다. 예를 들면, 상기 발효는 10 내지 45℃ 및 pH 3 내지 9의 조건에서 10시간 이상 배양하는 방법에 의해서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
아울러, 배양배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지 또는 유성분을 이용한 유청배지, 탈지유 배지 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 탄소원으로 이용 가능한 것은, 글루코스, 수크로스, 말토스, 프럭토스, 락토스, 자일로스, 갈락토스, 아라비노스 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 수크로스, 프럭토스, 글루코스, 갈락토스, 아라비노스 및 락토스로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직하게는 글루코스이다. 본 발명의 배양물 생산을 위한 배지에서 상기 질소원으로 이용 가능한 것은, 효모 추출물, 소이톤(soytone), 펩톤, 비프 추출물(beef extract), 트립톤, 카시톤 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 바람직하게는 효모 추출물, 펩톤, 트립톤 및 소이톤으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상이며, 보다 바람직하게는 효모 추출물 또는 소이톤이다.
유산균의 배양 및 발효는 당업계에 알려진 밀크 포함 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 과정은 당업자라면 선택되는 균주에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 이러한 다양한 방법은 다양한 문헌(예를 들면, James et al., Biochemical Engineering, Prentice-Hall International Editions)에 개시되어 있다. 세포의 성장방식에 따라 현탁배양과 부착배양을 배양방법에 따라 회분식과 유가식 및 연속배양식의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 방법에 따르면 패오니플로린이 β-젠티오비오실 패오니플로린으로 전환되는 것으로 결과적으로 패오니플로린이 감소된다.
본 발명은 또한 상기 방법에 따라 제조된 작약의 발효물을 제공한다.
상기 작약의 발효물은 작약(Paeonia lactiflora)의 분말, 엑기스 또는 추출물의 발효물일 수 있으며, 작약의 분말, 엑기스 또는 추출물에 포함된 패오니플로린이 β-젠티오비오실 패오니플로린으로 전환되어 패오니플로린의 함량은 낮거나 없고, β-젠티오비오실 패오니플로린의 함량이 증가되어 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 류코노스톡 속 LN180020 균주에 의해 발효된 작약 추출물의 발효물은 작약 추출물과 비교해 현저히 향상된 항당뇨 및 항비만 효과를 나타내는 것으로 확인되어 당뇨 및 비만을 포함하는 대사증후군 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명이 제공하는 류코노스톡 속 LN180020 균주는 패오니플로린을 생리활성이 향상된 β-젠티오비오실 패오니플로린으로 전환하는 생물전환능이 매우 우수하기 때문에, 당뇨, 비만 등을 포함한 다양한 질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 비발효 작약 추출물(non-fermented, (a)) 및 작약 추출물의 유산균 발효물(fermented, (b)) 내의 지표 물질과 새로운 유용물질의 함량을 나타내는 HPLC 크로마토그램이다.
도 2는 작약 추출물의 유산균 발효물 및 비발효 작약 추출물의 세포 독성(cell viability)을 확인한 결과이다.
도 3은 비발효 작약 추출물(non-fermented), 작약 추출물의 유산균 발효물(fermented) 및 양성대조군(olistat)의 리파아제 저해 활성을 평가한 결과이다.
도 4는 작약 추출물의 유산균 발효물 및 비발효 작약 추출물의 근육세포로의 포도당 흡수율(relative glucose uptake)을 확인한 결과이다.
도 5는 류코노스톡 속 LN180020(KCTC 13719BP)의 계통을 분석한 계통도이다.
도 6은 류코노스톡 속 LN180020의 게놈 서열 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 비발효 작약 추출물(non-fermented) 및 작약 추출물의 유산균 발효물(fermented)에서 각각 생물전환 전의 작약 지표 물질(패오니플로린, paeoniflorin)과 생물전환 후 물질을 분리, 정제하여 LC-MS을 수행한 결과이다.
도 8은 작약 내 생물전환 전, 후 물질의 H, C, HMBC NMR spectral data를 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 김치로부터 식물성 유산균의 분리
김치 유래의 식물성 유산균을 분리하기 위해, 멸균수를 이용하여 다양한 김치원 시료를 단계적으로 희석하고 MRS(Man Rogosa and Sharpe) 배지에 도말하여 28℃에서 2일간 배양한 후 형태학적 특징을 통해 유산균을 분리하였으며, 16s rRNA 서열 분석을 통해 분리된 균주를 동정하고 20% 글리세롤을 이용하여 -70℃에서 보관하였다.
균주 동정 결과, 락토바실러스 속(Lactobacillus), 페티오코커스 속(Pediococcus), 웨이셀라 속(Weissella), 류코노스톡 속(Leuconostoc) 및 엔테로코커스 속(Enterococcus)에 포함되는 39종(species)의 193개의 균주가 분리되었다.
실시예 2: 작약 추출물의 유산균 발효물 제조
건조된 작약 뿌리를 파쇄하여 분말화한 후 분말 중량 대비 10배의 물을 혼합하여 121℃에서 15분 동안 열수 추출하였으며, 상기 열수 추출물에 탄산나트륨(Na2CO3)을 처리하여 pH 3.6~6.8로 맞추었다. 유산균은 28℃에서 48시간 동안 배양한 후 6×109 CFU/㎖의 농도로 작약 열수 추출물에 접종한 후 28℃에서 48시간 동안 정치 발효시켜 상등액(작약 추출물의 유산균 발효물)을 수득하였다. 이 후 수득한 작약 추출물 및 작약 추출물의 유산균 발효물을 감압농축하여 분말화하였다.
실시예 3: 패오니플로린 대사능을 보유한 유산균 균주의 동정
작약의 추출물이나 작약의 지표성분 중 하나인 패오니플로린 (paeoniflorin)은 비만 관련 활성이 알려져 있으나 비만을 치료 활성은 충분하지는 않다고 판단되었기 때문에 본 발명자들은 작약 내 지표성분의 생물전환 활성을 가진 균주를 탐색하고자 하였다.
이러한 균주의 탐색을 위해 작약 건조 중량 1g에 10배의 (w/v) 물을 첨가하여 121도에서 15분간 추출하여 작약 추출물을 제조하였고, 실시예 1에서 분리된 각 균주들을 2 x 109 CFU/ml 농도로 접종하여 28도 배양실에서 48시간 정치배양 하였다. 이 후 배양물 (상등액)을 50% 에탄올로 추출하여 TSK-GEL ODS-100V 5㎛ column (4.6mm×15cm)을 이용한 HPLC를 통해 UV 235nm, 15~100% methanol gradient 조건 하에서 크로마토그램 변화를 분석하였다 (도 1 참조).
그 결과 분리된 균주 중 류코노스톡 속 LN180020을 처리한 작약 추출물에서 특이적으로 패오니플로린으로 예상되는 약 15분 근처의 피크가 줄어들고 14.2분에서 새로운 물질이 피크가 증가하는 것을 확인 하였다 (도 1 참조).
실시예 4: 작약 추출물의 류코노스톡 속( Leuconostoc sp.) LN180020 발효물의 세포 독성 및 항비만 효과 확인
4-1: 세포 독성 확인
작약 추출물의 유산균 발효물의 세포 독성을 확인하기 위해, 마우스 L6 근관세포(myotube)에서 작약 추출물의 유산균 발효물을 농도별(3 및 30 ㎍／㎖)로 처리하고 24시간 이후에 MTT 분석법을 수행하였다.
그 결과, 마우스 L6 근관세포에서 무처리 대조군, 비발효 작약 추출물 처리군 및 작약 추출물의 유산균 발효물 처리군 모두에서 세포 증식에 별다른 영향을 미치지 않는 것을 확인하였고, 이를 통해 작약 추출물의 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020(KCTC 13719BP) 발효물은 세포독성이 없음을 알 수 있었다(도 2).
4-2: 항비만 효과 확인
작약 추출물의 유산균 발효물의 항비만 효과를 확인하기 위해 리파아제 저해 활성을 평가하였다.
리파아제 저해 활성은 다음과 같이 측정하였다. 150ul의 반응용액 (100mM Tris-Hcl, pH 8.2)에 5mg/ml의 리파아제를 녹인 후, 각각의 실험 샘플(작약 추출물 유산균 발효물, 작약 추출물 및 Orlistat)을 100uM로 녹인 용액을 섞어, 37℃에서 5분간 반응. 이 후 5mM sodium acetate (pH 5.0) 용액에 기질 p-nitrophenyl palmitate (PNPP) 또는 4-nitrophenyl dodecanoate (PNPD)를 0.1% (W/V)로 녹인 용액을 30ul 첨가후, 37℃에서 12시간 반응. 결과는 409nm 파장에서 spectrophotometer로 측정하였다. 대조군으로 Orlistat를 사용하였으며, 실험 샘플은 작약 추출물과, 작약 추출물 유산균 발효물을 각각 사용하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 리파아제 저해 활성 결과 양성대조군으로 사용된 Orlistat는 PNPP, PNPD 기질에 대해 각각 61.7%, 50.4%의 저해 활성을 나타내었으며, 발효 후 샘플에서는 각각 53.5%, 38.4% 의 저해 활성을 나타내었다. 반면 발효전 (non-fermented extract)의 경우 PNPP, PNPD 기질에 대해 각각 40.1%, 21.8%의 저해활성을 나타내어 이는 발효 후 추출물에서 리파아제 활성 저해 효과가 유의적으로 증가하였음을 확인하였다(도 3).
4-3: 항당뇨 효과 확인
작약 추출물의 유산균 발효물의 항당뇨 효과를 확인하기 위해 마우스 L6 근원세포(myoblast)를 24-웰 배양용기에 세포수 5×105 개/㎖로 분주한 후 2일에 한 번씩 분화배지(low glucose (5mM) DMEM, 2% Fetal Bovine Serum, 1% penicillin/streptomyc)로 교체해주며 배양하였다. 배양한지 7일째에 작약 추출물의 유산균 발효물을 농도별(3 및 30 ㎍/㎖)로 전처리하고 30분간 반응시킨 후 [14C]2-Deoxy-D-glucose를 처리하여 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 마우스 L6 근원세포로 흡수되어 형태가 전환된 [14C]2-deoxy-D-glucose-6-phosphate를 방사선 측정기로 측정하여 포도당 흡수율을 측정하였다. 양성 대조군으로는 100 nM 농도의 인슐린(porcine insulin)을 사용하였다.
그 결과, 작약 추출물의 유산균 발효물이 처리된 군에서는 L6 근원세포 내의 [14C]2-deoxy-D-glucose-6-phosphate 함량이 무처리 대조구에 비해 약 55%~80% 증가하였고, 비발효 작약 추출물 처리군에 비해 약 25~35% 증가한 것을 확인하였다. 이는 유산균을 이용하여 작약 추출물을 발효시킬 경우 비발효 작약 추출물에 비해 근육세포로의 포도당 흡수를 촉진시켜 항당뇨 활성을 증가시킬 수 있음을 나타내었다. 더욱이, 양성 대조군으로 사용된 인슐린(porcine insulin) 100 nM은 실제 당뇨 치료제로 사용되고 있는 로시글리타존(rosiglitazone) 10 μM(3.57 ㎍/㎖)과 거의 동등한 항당뇨 효과를 나타낸다고 볼 수 있는데, 저농도(3 ㎍/㎖)의 작약 추출물의 유산균 발효물을 처리한 군의 [14C]2-deoxy-D-glucose-6-phosphate 함량은 인슐린 100 nM 처리군과 유사하였고, 고농도(30 ㎍/㎖)의 작약 추출물의 유산균 발효물을 처리한 군의 [14C]2-deoxy-D-glucose-6-phosphate 함량은 인슐린 100 nM 처리군에 비해 유의적으로 증가하였다(도 4).
실시예 5: 류코노스톡 속( Leuconostoc sp.) LN180020 유산균의 계통 분석
이에 본 발명의 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020(KCTC 13719BP) 유산균을 추가적으로 동정하고, 항비만 활성이 증가를 보이게 한 새로운 물질을 동정하고자 하였다.
류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020(KCTC 13719BP)의 계통 분석을 위해 류코노스톡 속 LN180020의 게놈 DNA를 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 프라이머 세트(표 1)를 이용하여 증폭시켰으며, 16S rRNA의 염기 서열(서열번호 1)을 확인한 후 기존에 알려져 있는 류코노스톡 속 서열과 비교하였다.
Figure pat00003
상기 류코노스톡 속 LN180020의 16S rRNA 염기서열은 BigDye (R) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits(Applied Biosystems)를 통해 확인하였고, 기존에 알려진 류코노스톡 속 서열은 NCBI 데이터베이스(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), EzTaxon-e server(https://www.eztaxon-e.ezcloud.net/) 및 LPSN( https://www.bacterio.net/nocardioides.html) 데이터베이스를 참조하였으며, 서열 비교 분석은 BioEdit v7.2.6.1, MEGA7 프로그램을 이용하여 수행하였다.
그 결과, 류코노스톡 속 LN180020은 류코노스톡 시트레움(L. citreum) ATCC 49370T와 99.86%로 가장 높은 16S rRNA 서열 상동성을 보였고, 그 다음으로 류코노스톡 홀잡펠리(L. holzapfelii) BFE 7000T과 99.78%; 류코노스톡 락티스(L. lactis) JCM 6123T 및 류코노스톡 팔마에(L. palmae) TMW 2.694T와 98.92%; 류코노스톡 김치(L. kimchii) IMSNU 11154T와 98.49%; 류코노스톡 겔리둠 subsp. 가시코미타툼(L. gelidum subsp. gasicomitatum) LMG 18811T과 98.14%; 류코노스톡 메센테로이데스 subsp. 메센테로이데스(L. mesenteroides subsp. mesenteroides) ATCC 8293T과 97.85%; 류코노스톡 슈도메센테로이데스(L. pseudomesenteroides) NRIC 1777T과 97.71%; 및 류코토스톡 라피(L. rapi) LMG 27676T과 97.63%의 16s rRNA 서열 상동성을 보였으며, 이를 통해 김치 유래 류코노스톡 속 LN180020은 류코노스톡 시트레움 ATCC 49370T와 계통학적으로 가장 가까운 종임을 알 수 있었다(도 5).
또한, 게놈 서열 분석 결과, 류코노스톡 속 LN180020의 게놈 사이즈는 1,906,090로 G+C content는 39.1% 였다. 1,869개의 protein coding sequence를 포함하고 있으며, 12개의 rRNA genes, 69개의 tRNA genes을 가지고 있었고, 3개의 플라스미드를 보유하고 있었다(표 2).
Figure pat00004
근연종과의 게놈 서열 비교 결과, Leuconostoc citreum KM20과 99.38%, Leuconostoc citreum EFEL 2700와 99.34%의 상동성을 지님을 확인하였으며, 게놈 사이즈는 류코노스톡 속 LN180020과 각각 9.476bp, 17740bp의 차이를 확인하였다 (도 6).
상기 동정된 신균주 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020을 2018년 11월 20일자로 한국생명공학연구원에 기탁하였다(기탁번호 KCTC13719BP).
실시예 6: 작약 추출물 유산균 발효물의 생물전환 성분 분석
상기 수득된 상등액에 동량의 에탄올을 첨가하여 추출한 후 TSK-GEL ODS-100V 5 ㎛ 컬럼(4.6 mm×15 cm), 25℃, UV 230 nm, 15~100% methanol gradient 조건으로 HPLC(High-performance liquid chromatography)를 수행하여 생물전환 유무를 분석하였다. 상기 생물전환된 물질 규명을 위한 LC-MS(Liquid chromatography mass spectrometry) 분석은 상등액을 메탄올에 용해시키고 Turbolon Spray source(AB SCIEX, Singapore)와 함께 QTrap 3200이 연결된 HPLC 시스템(Luna C18 (2), 100×2.0 mm, 3 μm; guard cartridge system, security guard #KJ 0-4282; Phenomenex, 미국)을 이용하여 수행되었다. 컬럼은 100% 메탄올(A) 및 0.04% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)을 함유하는 HPLC water(B)를 1.0 ㎖/min의 유속으로 25℃에서 유지시켰으며, 샘플은 처음 5분 동안 15 % 메탄올을 흘려준 후 5분에서 20분까지 15%에서 100%까지 메탄올 농도를 순차적으로 증가시켰으며, 20분에서 25분은 100% 메탄올로 유지시키고, 25분에서 35분까지 100%에서 15%까지 메탄올 농도를 감소시켰으며, 이 후 5분 동안은 15% 메탄올로 유지시키며 측정하였다(표 3).
Figure pat00005
류코노스톡 속 LN180020에 의해서 전환된 성분을 분석하기 위해 HPLC를 수행한 결과, 작약 추출물 발효물의 보유시간 약 15분 근처에서 지표 물질이 감소하였고(도 1), 약 14.2분에서 새로운 유용성분에 해당하는 피크가 증가한 것을 확인하였다. 또한, 상기에서 감소된 지표물질과 새로운 유용성분을 확인하기 위해 각 해당 피크를 silica gel 60G F254 glass plate를 이용한 얇은 막 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography) 방법으로 전개용매 메탄올:클로로포름 (1.5:5)에서 분리 및 정제하여 LC-MS 분석을 수행한 결과, 약 15분 근처의 지표물질이 분자량 480.3의 패오니플로린(paeoniflorin)임을 알 수 있었고, 약 14.2분에서의 전환 후 새로운 유용성분 물질은 분자량 642.3으로 확인 되었다(도 7).
상기 패오니플로린이 전환된 새로운 유용 성분 물질의 구조는 Proton, Carbon, TOCSY, HSQC, HMBC NMR로 동정하였으며 도 8에 그 결과를 나타내었다. 구조 동정 결과, 패오니플로린의 생물전환으로 생성된 물질은 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 확인되었다(도 8).
본 발명이 제공하는 류코노스톡 속 LN180020 균주는 패오니플로린을 생리활성이 향상된 β-젠티오비오실 패오니플로린으로 전환하는 생물전환능이 매우 우수하기 때문에, 당뇨, 비만 등을 포함한 다양한 질환의 예방 또는 치료제 개발에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
한국생명공학연구원 KCTC13719BP 20181120
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A novel Leuconostoc sp. strain and method for paeoniflorin-biotransforming using the same <130> NP20-0046 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1474 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Leuconostoc sp. LN180020 <400> 1 ucaggaugaa cgcuggcggc gugccuaaua caugcaaguc gaacgcgcag cgagaggugc 60 uugcaccuuu caagcgagug gcgaacgggu gaguaacacg uggauaaccu gccucaaggc 120 uggggauaac auuuggaaac agaugcuaau accgaauaaa acuuaguauc gcaugauauc 180 aaguuaaaag gcgcuacggc gucaccuaga gauggauccg cggugcauua guuaguuggu 240 gggguaaagg cuuaccaaga cgaugaugca uagccgaguu gagagacuga ucggccacau 300 ugggacugag acacggccca aacuccuacg ggaggcugca guagggaauc uuccacaaug 360 ggcgcaagcc ugauggagca acgccgcgug ugugaugaag gcuuucgggu cguaaagcac 420 uguuguaugg gaagaaaugc uaaaauaggg aaugauuuua guuugacggu accauaccag 480 aaagggacgg cuaaauacgu gccagcagcc gcgguaauac guaugucccg agcguuaucc 540 ggauuuauug ggcguaaagc gagcgcagac gguugauuaa gucugaugug aaagcccgga 600 gcucaacucc ggaauggcau uggaaacugg uuaacuugag uguuguagag guaaguggaa 660 cuccaugugu agcgguggaa ugcguagaua uauggaagaa caccaguggc gaaggcggcu 720 uacuggacaa caacugacgu ugaggcucga aagugugggu agcaaacagg auuagauacc 780 cugguagucc acaccguaaa cgaugaauac uagguguuag gagguuuccg ccucuuagug 840 ccgaagcuaa cgcauuaagu auuccgccug gggaguacga ccgcaagguu gaaacucaaa 900 ggaauugacg gggacccgca caagcggugg agcauguggu uuaauucgaa gcaacgcgaa 960 gaaccuuacc aggucuugac auccuuugaa gcuuuuagag auagaagugu ucucuucgga 1020 gacaaaguga cagguggugc auggucgucg ucagcucgug ucgugagaug uuggguuaag 1080 ucccgcaacg agcgcaaccc uuauuguuag uugccagcau ucaguugggc acucuagcga 1140 gacugccggu gacaaaccgg aggaaggcgg ggacgacguc agaucaucau gccccuuaug 1200 accugggcua cacacgugcu acaauggcgu auacaacgag uugccaaccu gcgaagguga 1260 gcuaaucucu uaaaguacgu cucaguucgg acugcagucu gcaacucgac ugcacgaagu 1320 cggaaucgcu aguaaucgcg gaucagcacg ccgcggugaa uacguucccg ggucuuguac 1380 acaccgcccg ucacaccaug ggaguuugua augcccaaag ccgguggccu aaccuucggg 1440 agggagccgu cuaagcagga cagaugacug gggu 1474 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F-1492R_F <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F-1492R_R <400> 3 cggttacctt gttacgactt 20

Claims (9)

  1. 기탁번호 KCTC13719BP로 기탁된 류코노스톡 속(Leuconostoc sp.) LN180020 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 패오니플로린(paeoniflorin) 생물전환능을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 패오니플로린(paeoniflorin)을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환시키는 생물전환능을 나타내는 것을 특징으로 하는 균주.
  4. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 패오니플로린(paeoniflorin)을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환하는 생물 전환용 조성물.
  6. (a) 패오니플로린(paeoniflorin)을 포함하는 조성물에 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 이의 배양액을 접종하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 수득물을 배양하여 발효시키는 단계를 포함하는, 패오니플로린(paeoniflorin)을 β-젠티오비오실 패오니플로린(β-gentiobiosyl paeoniflorin)으로 전환하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 패오니플로린을 포함하는 조성물은 작약(Paeonia lactiflora)의 분말, 엑기스 또는 추출물인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 발효는 10 내지 45℃ 및 pH 3 내지 9에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항의 방법에 따라 제조된 작약의 발효물.
KR1020200065498A 2020-05-29 2020-05-29 신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법 KR20210147774A (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200065498A KR20210147774A (ko) 2020-05-29 2020-05-29 신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법
PCT/KR2021/006692 WO2021242051A1 (ko) 2020-05-29 2021-05-28 신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020200065498A KR20210147774A (ko) 2020-05-29 2020-05-29 신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210147774A true KR20210147774A (ko) 2021-12-07

Family

ID=78744763

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020200065498A KR20210147774A (ko) 2020-05-29 2020-05-29 신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR20210147774A (ko)
WO (1) WO2021242051A1 (ko)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2467695C (en) * 2003-05-20 2010-03-16 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Isomaltooligosaccharides from leuconostoc as neutraceuticals
KR101253875B1 (ko) * 2011-04-05 2013-05-22 가천대학교 산학협력단 진세노사이드의 생물전환능을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 와이엘비팔
KR101461589B1 (ko) * 2011-12-15 2014-11-20 한국 한의학 연구원 소청룡탕 또는 소청룡탕 유산균 발효물을 포함하는 간독성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물
KR20160006812A (ko) * 2014-07-09 2016-01-20 가천대학교 산학협력단 작약 추출물을 포함하는 당뇨 예방 및 치료용 조성물
KR102026934B1 (ko) * 2018-06-25 2019-09-30 충북대학교 산학협력단 재조합 목적단백질 고효율 생산을 위한 신규 류코노스톡 시트리움 efel 2701 균주 및 이의 용도
WO2020116962A1 (ko) * 2018-12-06 2020-06-11 한국생명공학연구원 작약 추출물의 유산균 발효물을 유효성분으로 포함하는 당뇨병의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021242051A1 (ko) 2021-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101753077B1 (ko) 발효 인삼추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물
KR100866504B1 (ko) 홍삼 발효용 미생물 및 발효 홍삼을 함유하는 식품 조성물
KR101330864B1 (ko) 펙티나아제를 이용한 진세노사이드 Rd가 강화된 발효인삼 또는 발효홍삼의 제조방법
KR101822024B1 (ko) 효소전환과 유산균 발효를 이용한 화합물 k의 함량이 강화된 발효홍삼 농축액의 제조방법 및 그 제조방법에 의해 제조된 발효홍삼 농축액을 유효성분으로 함유하는 제품
US11279961B2 (en) Aspergillus oryzae BLCY-006 strain and application thereof in preparation of galactooligosaccharide
KR100837213B1 (ko) 산삼배양근의 유효성분인 진세노사이드의 체내흡수율을증진시키는 발효 및 숙성 처리방법
KR101879501B1 (ko) 생물전환기술을 이용한 특이 진세노사이드 화합물 k 고함량 제조기술
KR101671435B1 (ko) 진세노사이드 생물전환능을 갖는 균주 및 이를 이용한 발효홍삼 추출물의 제조방법
CN113604395B (zh) 一株可发酵石斛且其发酵液可改善皮肤质量的植物乳杆菌
KR20130003944A (ko) 발효 인삼추출물의 제조방법
KR20090132065A (ko) 발효인삼, 발효홍삼의 제조방법 및 이에 적합한 청국장유래의 바실러스 서브스틸리스 신균주
KR20120125113A (ko) 인삼 발효능을 갖는 신규 락토바실러스 플랜타럼 ｃｒｎｂ?２２ 〔ｋｃｔｃ１１９３１ ｂｐ〕균주 및 이를 이용한 사포닌 전환 방법
WO2011115341A1 (ko) 발효홍삼의 제조방법
KR101980450B1 (ko) 진세노사이드 Rd와 컴파운드 케이, 클로르제닉산 및 쿼르세틴이 증진된 활성산양삼 조성물 및 그 제조방법
CN113952285A (zh) 一种多重菌株发酵技术及发酵产物
KR20130107940A (ko) 발효 홍삼 제조방법
KR100935362B1 (ko) 발효인삼 또는 홍삼의 제조방법
KR20210147774A (ko) 신규한 류코노스톡 속 균주 및 이를 이용한 패오니플로린의 생물전환방법
CN115029279B (zh) 植物乳植杆菌mb11及其在生物转化制备稀有人参皂苷中的应用
KR20210058416A (ko) 진세노사이드 컴파운드 케이 전환 효소를 생산하는 신규 누룩균 아스퍼질러스 나이거 c2-2 균주 및 이의 이용
CN116103161A (zh) 一种产泽兰素的植物内生真菌及其应用
KR100965385B1 (ko) 홍삼 발효용 미생물, 이를 이용한 발효 홍삼의 제조방법
KR101771488B1 (ko) 신규한 바실러스 코아귤란스 nrr1207 균주, 이를 이용한 발효 인삼과 프로바이오틱스 생균제제 조성물
KR102243418B1 (ko) 신규한 초산발효균주 및 이를 이용한 콤부차 음료의 제조방법
KR102218224B1 (ko) 곤달비잎의 발효물을 유효성분으로 함유하는 피부염증 또는 피부노화의 예방 또는 개선용 화장료 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination