KR20210146463A - 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고의 제조방법 - Google Patents
항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 청폐 경옥고 유효 성분을 물과 에탄올 혼합 용매로 추출한 후 리파아제를 가하여 지질 성분을 분해시키고 효모 균주로 발효시켜 단백다당체 성분을 분해함으로써 청폐 경옥고 내의 약리활성 성분을 추출 여과 농축시킨 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고의 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 청폐 경옥고 유효 성분을 물과 에탄올 혼합 용매로 추출한 후 리파아제를 가하여 지질 성분을 분해시키고 효모 균주로 발효시켜 단백다당체 성분을 분해함으로써 청폐 경옥고 내의 약리활성 성분을 추출 여과 농축시킨 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고의 제조방법에 관한 것이다.
경옥고는 동의보감에 보혈 강장 허약체질 개선제로 기재되어 있으며 그 주요 성분은 인삼, 복령, 꿀, 생지황의 약재를 넣고 제조한 고형상 제제이다. 통상 경옥고는 생지황즙과 꿀을 혼합하여 증숙시킨 후 세절된 인삼 분말과 복령 분말을 첨가시켜 혼합 교반시키고 중탕하여 제조한다.
최근 경옥고에 대한 약리활성 연구가 활발히 진행되고 있고 원기회복과 노화예방에 효과적이며 항염증, 항진통, 위궤양 억제, 혈당저하, 고지혈증 완화 등에 효과가 있는 것으로 밝혀지고 있다.
인삼의 약효는 강장, 강심, 건위, 보정, 진정약으로 상용화되고 있고 원기를 보하고 신체허약, 권태, 피로, 식욕부진, 구토, 설사에도 유효한 한약재로 알려져 있다.
또한 복령은 소나무를 벌채한 뒤 3∼10년이 지난 뒤 뿌리에서 기생하여 성장하는 균핵으로 형체는 일정하지 않으나 표면은 암갈색이고 내부는 회백색의 육질과립상으로 신선한 냄새를 지닌다. 완만한 이뇨작용이 있어 신장염, 방광염, 요도염에 효과적이며 거담작용이 있어 가래가 많이 분비되고 호흡이 곤란한 증상인 만성 기관지염과 기관지 확장증에도 사용되고 있다.
또한 꿀은 일반 허약자에게 보약으로 통용되어 위통, 변비, 기침, 구내염, 목이 붓고 아픈데, 화상, 동상, 피부염 등에 사용한다. 만성 위염, 위십이지장 궤양, 만성 기관지염, 세균성 적리, 신경쇠약, 폐결핵, 고혈압에도 적용되고 있다.
한편 생지황의 추출물은 혈액응고를 촉진시키고 쇠약한 심장에 대하여 심장근육의 수축력을 증대시켜 주며 이뇨작용과 해열의 효과도 나타난다. 실험적으로 유발시킨 고혈당을 억제하고 정상적인 토끼의 혈당도 강하시킴이 개시되어 있다.
대한본초학회지 제34권 제2호(2019년 3월)에 게재된 '전통적인 한방 처방 경옥고의 면역 증강 효과'에 따르면 마우스 동물 모델에서 메토트렉세이트(MTX) 투여로 인해 감소된 혈장 내 면역 사이토카인이 경옥고 투여 후 정상적으로 회복됨을 측정함으로써 경옥고의 면역증강 효과를 동물실험을 통해 확인하였다고 개시하고 있다(노성수 외 4인, Kor. J. Herbol. 2019 : 34(2) : 41-47).
한편 최근 이러한 경옥고의 조성에 청폐 성분인 길경, 사삼, 갈근, 상백피, 오미자 등의 성분을 추가시킨 청폐 경옥고가 상업적으로 판매되고 있다.
그러나 이러한 청폐 경옥고의 경우 각각의 한약재 내의 당지질 등의 성분이 제거되지 않아 약리활성 성분을 효과적으로 인체 내로 흡수시킬 수 없는 문제점이 있었다.
이에 본 발명자들은 청폐 경옥고의 약리활성 성분을 물과 에탄올 혼합 용매로 추출하고 여기에 리파아제를 가하여 지질 성분을 분해시키고 다시 효모 균주 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주로 발효시켜 단백다당체 성분을 분해함으로써 청폐 경옥고 내의 약리활성 성분을 추출, 여과 및 농축시킨 효모 균주로 발효시킨 청폐 경옥고의 제조방법을 개발한 바 있으며 이를 대한민국 특허출원 제10-2020-54285호 '효모 균주로 발효시킨 청폐 경옥고의 제조방법'으로 특허출원한 바 있다.
그런데 본 발명자들이 상기 특허문헌에 개시된 효모 균주로 발효시킨 청폐 경옥고의 약리활성을 추가로 시험하던 중 상기 조성물이 항바이러스 활성을 지님을 측정함으로써 본 발명을 완성하게 된 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 청폐 경옥고의 약리활성 성분을 물과 에탄올 혼합 용매로 추출하고 여기에 리파아제를 가하여 지질 성분을 분해시키고 효모 균주 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주로 발효 후 단백다당체 성분을 분해시켜 약리활성 성분을 추출, 여과 및 농축시킨 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고를 개발코자 한 것이다.
본 발명의 목적은 ⅰ) 복령 10~14 중량%, 생지황즙 35~40 중량%, 길경 23~27 중량%, 사삼 6~8 중량%, 갈근 6~8 중량%, 상백피 6~9 중량%, 오미자 3~4 중량%를 세절시켜 혼합시킨 100 중량부의 한약재에 50~200 중량부의 물과 에탄올 혼합 용액(1:1)을 첨가한 후, 15~20℃에서 12~18시간 원재료를 추출하는 단계; ⅱ) 상기 추출물에 0.01~1.0 중량부의 리파아제를 가하여 지질 성분을 효소 분해하고, 다시 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주로 24~36시간 발효시켜 단백다당체 성분을 발효 분해하는 단계; 및 ⅲ) 단계 ⅱ)에서 수득된 발효 브로스에 물과 에탄올 혼합 용액(1:1) 100 중량부를 가하여 잔사를 여과 제거시키고, 수득된 물과 에탄올 혼합 용액 추출물을 농축 건조시키는 단계; 로 제조된 발효 청폐 경옥고에 있어서, 상기 발효 청폐 경옥고는 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 항바이러스 활성을 지님을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고를 제공하는 것이다.
이때 상기 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주는 미국 Imperial Yeast 사에서 상품화한 맥주 효모 균주 상품명 Cablecar L05를 모균주로 하여 1 중량%의 단백다당체를 추가로 첨가시킨 PDA(Potato dextrose agar) 배지에서 최적 성장을 나타내는 콜로니를 분리한 후 3회 계대 배양시켜 단백다당체 추가 PDA 배지에서 최적 성장하는 균주를 분리한 효모 균주이고, 상기 리파아제는 상품명 Lipozyme TL 100 L 리파아제 임을 특징으로 한다.
또한 상기 발효 청폐 경옥고 0.1g과 생리식염수 0.1ml를 혼합시킨 후 시험관 내에서 105 TCID50/ml 역가의 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 감염 24시간 경과 후 마우스 대식세포주 RAW 264.7의 생존능은 대조군인 생리식염수 0.1ml의 시험관 내에서 105 TCID50/ml 역가의 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 감염 24시간 경과 후 마우스 대식세포주 RAW 264.7의 생존능에 비해 약 20% 이상 증가함을 특징으로 한다.
또한 상기 발효 청폐 경옥고 0.1g과 생리식염수 0.1ml를 혼합시킨 후 시험관 내에서 105 TCID50/ml 역가의 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 24시간 경과 후 마우스 대식세포주 RAW 264.7의 생존능은 대조군인 생리식염수 0.1ml의 시험관 내에서 105 TCID50/ml 역가의 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 24시간 경과 후 마우스 대식세포주 RAW 264.7의 생존능에 비해 약 20% 이상 증가함을 특징으로 한다.
본 발명의 효과는 청폐 경옥고의 약리활성 성분을 물과 에탄올 혼합 용매로 추출하고 여기에 리파아제를 가하여 지질 성분을 분해시키고 효모 균주 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주로 발효 후 단백다당체 성분을 분해시켜 약리활성 성분을 추출, 여과 및 농축시킨 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고의 제조방법을 제공하는 것이다.
도 1은 SIV-GFP(돼지 인플루엔자 바이러스-녹색 형광 단백질)에 의한 본 발명의 발효 청폐 경옥고 시험군, 비교시험군 1, 비교시험군 2, 대조군 등의 항바이러스 활성 비교 실험결과를 나타낸 도면이다. 도 1a는 바이러스 활성을 측정한 녹색형광단백질(GFP)의 상대 단위를 나타낸 도면이고, 도 1b는 대식세포 RAW 264.7의 생존능으로 항바이러스 활성을 나타낸 도면이다.
도 2는 HIV-GFP(인간면역결핍 바이러스-녹색 형광 단백질)에 대한 본 발명의 발효 청폐 경옥고 시험군, 비교시험군 1, 비교시험군 2, 대조군 등의 항바이러스 활성 비교 실험결과를 나타낸 도면이다. 도 2a는 바이러스 활성을 측정한 녹색형광단백질(GFP)의 상대 단위를 나타낸 도면이고, 도 2b는 대식세포 RAW 264.7의 생존능으로 항바이러스 활성을 나타낸 도면이다.
도 2는 HIV-GFP(인간면역결핍 바이러스-녹색 형광 단백질)에 대한 본 발명의 발효 청폐 경옥고 시험군, 비교시험군 1, 비교시험군 2, 대조군 등의 항바이러스 활성 비교 실험결과를 나타낸 도면이다. 도 2a는 바이러스 활성을 측정한 녹색형광단백질(GFP)의 상대 단위를 나타낸 도면이고, 도 2b는 대식세포 RAW 264.7의 생존능으로 항바이러스 활성을 나타낸 도면이다.
본 발명은 ⅰ) 복령 10~14 중량%, 생지황즙 35~40 중량%, 길경 23~27 중량%, 사삼 6~8 중량%, 갈근 6~8 중량%, 상백피 6~9 중량%, 오미자 3~4 중량%를 세절시켜 혼합시킨 100 중량부의 한약재에 50~200 중량부의 물과 에탄올 혼합 용액(1:1)을 첨가한 후, 15~20℃에서 12~18시간 원재료를 추출하는 단계; ⅱ) 상기 추출물에 0.01~1.0 중량부의 리파아제를 가하여 지질 성분을 효소 분해하고, 다시 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주로 24~36시간 발효시켜 단백다당체 성분을 발효 분해하는 단계; 및 ⅲ) 단계 ⅱ)에서 수득된 발효 브로스에 물과 에탄올 혼합 용액(1:1) 100 중량부를 가하여 잔사를 여과 제거시키고, 수득된 물과 에탄올 혼합 용액 추출물을 농축 건조시키는 단계; 로 제조된 발효 청폐 경옥고에 있어서, 상기 발효 청폐 경옥고는 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 항바이러스 활성을 지님을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
인삼, 복령, 꿀, 생지황의 약재를 고형상으로 제조한 경옥고에 청폐 성분인 길경, 사삼, 갈근, 상백피, 오미자 등을 첨가하여 환제로 제조된 청폐 경옥고가 현재 시판 중에 있다.
그런데 이러한 청폐 경옥고를 경구로 투여하는 경우 경옥고 내부에 각종 지질 성분 및 당단백 성분이 청폐 경옥고의 약리활성 성분과 혼재되어 있어 청폐 경옥고 약리활성 성분만의 인체 내 흡수가 원활치 못한 문제가 있었다.
따라서 본 발명은 청폐 경옥고의 약리활성 성분을 더욱 용이하게 인체 내에 흡수할 수 있도록 청폐 경옥고 내의 지질 성분 및 당단백 성분을 효소 분해 및 발효를 통해 제거시켜 청폐 경옥고 약리활성 성분만을 여과 농축시켜 환제화 함으로써 현재 시판 중인 청폐 경옥고의 생체 이용률을 증대시킨 새로운 형태의 청폐 경옥고를 개발한 것이다.
또한 본 발명의 효모 균주로 발효시킨 청폐 경옥고는 종래의 시판되는 청폐 경옥고에 비해 월등한 항바이러스 활성을 나타내는 것을 시험관 내 실험을 통해 확인하였다.
본 발명의 항바이러스 활성을 지니는 발효 청폐 경옥고의 각각 공정의 특징을 상세히 살펴보면 다음과 같다.
1. 원재료 추출 공정
원재료 추출 공정은 복령 10~14 중량%, 생지황즙 35~40 중량%, 길경 23~27 중량%, 사삼 6~8 중량%, 갈근 6~8 중량%, 상백피 6~9 중량%, 오미자 3~4 중량%를 세절시켜 혼합시킨 100 중량부의 한약재에 50~200 중량부의 물과 에탄올 혼합 용액(1:1)을 첨가한 후, 15~20℃에서 12~18시간 원재료를 추출하는 단계이다.
통상의 한약재 추출은 열수로 추출하나 본 발명에서는 물과 에탄올 혼합 용액(1:1)을 추출 용매로 사용하여 15~20℃에서 12~18시간 냉침하여 추출한다. 이러한 추출용매로 냉침시키면 약리활성 성분의 분해 또는 변형이 거의 발생하지 않는다.
2. 효소 분해 및 발효 공정
효소 분해 및 발효 공정은 원재료 추출 공정에서 수득된 추출물에 0.01~1.0 중량부의 리파아제를 가하여 지질 성분을 효소 분해하고, 다시 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주로 24~36시간 발효시켜 단백다당체 성분을 발효 분해하는 단계이다.
이때 사용하는 리파아제는 상품명 Lipozyme TL 100 L 리파아제가 바람직하다. Lipozyme TL 100 L 리파아제를 사용하여 지질 성분을 효소 분해하는 것이 가장 효율적이다.
또한 상기 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주는 미국 Imperial Yeast 사에서 상품화한 맥주 효모 균주 상품명 Cablecar L05를 모균주로 하여 1 중량%의 단백다당체를 추가로 첨가시킨 PDA(Potato dextrose agar) 배지에서 최적 성장을 나타내는 콜로니를 분리한 후 3회 계대 배양시켜 단백다당체 추가 PDA 배지에서 최적 성장하는 균주를 분리한 효모 균주이다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주의 일반적 균학적 특성은 사카로마이세스속 맥주 효모 균주와 유사하였다. 다만 PDA 배지 내에 1 중량%의 단백다당체를 추가로 첨가시킨 배지 내에서 모균주 맥주 효모 균주 상품명 Cablecar L05에 비해 높은 성장을 나타내었다. 이를 통해 본 발명의 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주는 모균주 보다 단백다당체와 높은 동화성을 지니는 것으로 판명되었다.
이와 같은 효모 균주의 발효를 통해 원재료 추출물 중에 함유된 단백다당체 성분이 발효 분해된다.
3. 여과 농축 건조 공정
여과 농축 건조 공정은 효소 분해 및 발효 공정에서 수득된 발효 브로스에 물과 에탄올 혼합 용액(1:1) 100 중량부를 가하여 잔사를 여과 제거시키고, 수득된 물과 에탄올 혼합 용액 추출물을 농축 건조시키는 단계이다. 여과 농축 건조 공정을 통해 청폐 경옥고의 약리활성 성분만을 여과 농축 건조하게 된다.
상기 공정으로 수득된 본 발명의 발효 청폐 경옥고는 돼지 인플루엔자 바이러스 및 인간면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 항바이러스 효과를 측정함으로써 항바이러스 효과를 확인하였다.
돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus)는 오르토믹소 바이러스과 인플루엔자 바이러스속에 속하는 A형 인플루엔자 바이러스의 아형으로서, 대표주로는 H1N1이 있다. 바이러스에 감염된 돼지의 예후는 양호하지만 전파성은 강하다. 발열, 호흡속박, 기침, 눈물, 쇠약, 식욕부진 등이 나타난다.
인간면역결핍 바이러스(HIV)는 인간의 면역체계를 파괴하는 렌티바이러스속 바이러스이다. HIV에는 HIV-1, HIV-2 2종류가 있으며 HIV-1이 독성과 감염력이 더 강하고 HIV 감염의 주요원인이 된 바이러스이다. HIV-1의 감염은 CD4+ T 세포 수의 점진적인 감소와 바이러스 양의 증가를 수반하여 인체 면역체계를 파괴한다.
상기 돼지 인플루엔자 바이러스 및 인간면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 본 발명의 발효 청폐 경옥고의 항바이러스 효과는 마우스 대식세포주 RAW 264.7의 생존능을 통해 측정하였으며 바이러스 활성은 녹색 형광 단백질의 상대단위로 측정하였다.
이러한 본 발명의 발효 청폐 경옥고는 그대로 복용할 수도 있으나 예를 들면 빵, 초콜렛, 과자, 라면, 아이스크림, 육가공 제품, 낙농 제품 또는 올리고당, 과당 또는 설탕과 같은 정량의 감미료, 향미료, 비타민, 무기질 및 색소 등을 첨가하여 음료로 개발 음용할 수도 있다.
또한 본 발명의 발효 청폐 경옥고는 약제학적으로 허용되는 통상의 담체, 부형제 및 희석제를 포함시켜 의약품 제제 형태로 개발, 투여, 복용할 수 있다.
이러한 본 발명의 발효 청폐 경옥고의 투여 용량은 복용자의 상태, 연령, 성별 및 질환 정도 등의 다양한 요인에 따라 결정될 수 있지만 통상 성인 1kg/day 당 1~100 mg, 바람직하게는 5~30 mg 정도이다.
이하 본 발명을 제조실시예, 제조비교예 및 실시예를 통해 더욱 상세히 설명한다.
(제조실시예) 본 발명의 발효 청폐 경옥고의 제조
복령 131.5 g, 생지황즙 380 g, 길경 260 g, 사삼 75 g, 갈근 75 g, 상백피 75 g, 오미자 3.5 g을 세절시켜 혼합시킨 한약재 1000 g에 물과 에탄올 혼합 용액(1:1) 1 L를 첨가한 후, 15~20℃에서 12~18시간 원재료를 추출하였다. 상기 추출물에 0.1~10 g의 리파아제(상품명 : Lipozyme TL 100 L)를 가하여 지질 성분을 효소 분해하고, 다시 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주로 24~36시간 발효시켜 단백다당체 성분을 발효 분해시켰다. 상기 수득물에 물과 에탄올 혼합 용액(1:1) 1 L를 가하여 잔사를 여과 제거시키고, 수득된 물과 에탄올 혼합 용액 추출물을 농축 건조시켜 본 발명의 발효 청폐 경옥고를 수득하였다.
(제조비교예 1) 청폐 경옥고의 제조 (발효공정 미포함) (비교시험군 1)
복령 131.5 g, 생지황즙 380 g, 길경 260 g, 사삼 75 g, 갈근 75 g, 상백피 75 g, 오미자 3.5 g을 세절시켜 혼합시킨 한약재 1000 g에 물과 에탄올 혼합 용액(1:1) 1 L를 첨가한 후, 15~20℃에서 12~18시간 원재료를 추출하였다. 상기 추출물에 0.1~10 g의 리파아제(상품명 : Lipozyme TL 100 L)를 가하여 지질 성분을 효소 분해시켰다. 상기 수득물에 물과 에탄올 혼합 용액(1:1) 1 L를 가하여 잔사를 여과 제거시키고, 수득된 물과 에탄올 혼합 용액 추출물을 농축 건조시켜 청폐 경옥고를 수득하였다.
(제조비교예 2) 시판 중인 청폐 경옥고의 제조 (비교시험군 2)
복령 131.5 g, 생지황즙 380 g, 길경 260 g, 사삼 75 g, 갈근 75 g, 상백피 75 g, 오미자 3.5 g을 세절 혼합시킨 후, 꿀 800~1000 g 및 인삼 100~120 g을 가하여 제형화시켰다.
(실시예 1) 돼지 인플루엔자 항바이러스 활성 측정
(시험군) 본 발명의 제조실시예에서 제조된 발효 청폐 경옥고 0.1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주한 후 SIV 바이러스를 접종하였다.
(비교시험군 1) 제조비교예 1에서 제조된 청폐 경옥고 0.1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주한 후 SIV 바이러스를 접종하였다.
(비교시험군 2) 제조비교예 2에서 제조된 청폐 경옥고 1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주한 후 SIV 바이러스를 접종하였다.
(대조군) 생리식염수(PBS) 0.1 ml 만을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주하고 SIV 바이러스를 접종하였다.
돼지 인플루엔자 바이러스(SIV)에 대한 본 발명의 발효 청폐 경옥고의 항바이러스 시험을 하기 방법으로 수행하였다.
마우스 대식세포주인 RAW 264.7을 1×106 cell/well의 농도로 6-웰 TC 플레이트에 배양한 후, FBS가 10 %(v/v) 첨가된 DMEM를 제조실시예에서 제조된 발효 청폐 경옥고 0.1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액(시험군), 제조비교예 1에서 제조된 청폐 경옥고 0.1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액(비교시험군 1), 제조비교예 2에서 제조된 청폐 경옥고 1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액(비교시험군 2), 생리식염수(대조군)에 각각 분주하였다.
시험군, 비교시험군 1, 비교시험군 2의 농도가 50㎍/㎖가 되도록 처리하였다. 시험군, 비교시험군 1, 비교시험군 2 및 대조군 처리 12시간 후, 105 TCID50/ml 역가의 SIV 바이러스를 포함하는 SIV-GFP(MOI:1)를 RAW 264.7 세포에 접종하였다. 접종 2시간 후 접종액을 제거하고 PBS로 RAW 264.7 세포를 3회 세척하고 FBS가 10% 첨가된 신선한 DMEM으로 교환한 후 12~24 시간 후에 자외선(345 nm) 필터를 이용하여 바이러스 감염 정도를 현미경 관찰하고 이를 측정하였다.
또한, 각 조건에서의 GFP 형광 발현량을 보다 정확하게 비교하기 위해, GFP 발현량 확인 시스템을 통해 확인하였다. 이때 GFP의 발현량은 바이러스의 활성을 의미한다.
도 1a는 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 활성을 GFP 발현량으로 측정한 데이터를 나타낸다.
도 1a에 나타난 바와 같이 본 발명 시험군의 SIV-GFP 상대단위는 비교시험군 1, 비교시험군 2의 SIV-GFP 상대단위보다 상당히 감소되었다. 이는 본 발명의 시험군에서 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV)의 활성이 저하됨을 의미하는 것이다.
상기 바이러스 감염 상태에서의 RAW 264.7 세포 생존능을 MTT 어세이를 통해 확인하였다. MTT 어세이를 수행하기 위해서는, RAW 264.7을 96웰 플레이트에 이식시키고 시험군의 발효 청폐 경옥고, 비교시험군 1의 청폐 경옥고, 비교시험군 2의 시판 청폐 경옥고 및 대조군의 생리식염수에 GFP 발현 바이러스를 각각 처리시킨 후 48시간 후 100 ㎕의 1 ㎎/㎖ MTT 용액을 세포에 가하여 4시간 동안 반응시켰다. 이 후 DMSO 150 ㎕를 가하여 세포 내에 생성된 포마잔염을 용해시킨 후, 이 포마잔의 양을 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
도 1b는 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV)에 대한 RAW 264.7의 12시간 및 24시간 세포 생존능을 나타낸 것으로 본 발명의 발효 청폐 경옥고를 분주시킨 시험군의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 12시간 생존능은 92%, 24시간 생존능은 85%를 나타내었다. 비교시험군 1의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 12시간 생존능은 85%, 24시간 생존능은 78%를 나타내었다. 비교시험군 2의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 12시간 생존능은 81%, 24시간 생존능은 72%를 나타내었다. 생리식염수만을 분주한 대조군의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 12시간 생존능은 72%, 24시간 생존능은 61%를 나타내었다.
이를 통해 본 발명의 시험군은 SIV 바이러스만을 접종시킨 대조군보다 12시간 후 20%의 대식세포주인 RAW 264.7의 생존능을 증가시켰으며 24시간 후에는 24% 생존능을 증가시켰다. 본 발명의 시험군에 의한 대식세포주인 RAW 264.7 생존능의 증가는 비교시험군 1, 2에 비해서도 12시간 후에 각각 7% 및 11%의 대식세포주 생존능의 증가, 24시간 후에 각각 7% 및 13%의 대식세포주 생존능의 증가를 나타낸 것이다. 이는 본 발명의 발효 청폐 경옥고의 SIV 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 확인한 것이다.
(실시예 2) 인간면역결핍 항바이러스 활성 측정
(시험군) 본 발명의 제조실시예에서 제조된 발효 청폐 경옥고 0.1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주한 후 HIV 바이러스를 접종하였다.
(비교시험군 1) 제조비교예 1에서 제조된 청폐 경옥고 0.1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주한 후 HIV 바이러스를 접종하였다.
(비교시험군 2) 제조비교예 2에서 제조된 청폐 경옥고 1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주한 후 HIV 바이러스를 접종하였다.
(대조군) 생리식염수(PBS) 0.1 ml 만을 마우스 대식세포주인 RAW 264.7에 분주하고 HIV 바이러스를 접종하였다.
인간면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 본 발명의 발효 청폐 경옥고의 항바이러스 시험을 하기 방법으로 수행하였다.
마우스 대식세포주인 RAW 264.7을 1×106 cell/well의 농도로 6-웰 TC 플레이트에 배양한 후, FBS가 10 %(v/v) 첨가된 DMEM를 제조실시예에서 제조된 발효 청폐 경옥고 0.1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액(시험군), 제조비교예 1에서 제조된 청폐 경옥고 0.1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액(비교시험군 1), 제조비교예 2에서 제조된 청폐 경옥고1 g과 생리식염수(PBS) 0.1 ml를 혼합시킨 혼합액(비교시험군 2), 생리식염수(대조군)에 각각 분주하였다.
시험군, 비교시험군 1, 비교시험군 2의 농도가 50㎍/㎖가 되도록 처리하였다. 시험군, 비교시험군 1, 비교시험군 2 및 대조군 처리 12시간 후, 105 TCID50/ml 역가의 HIV 바이러스를 포함하는 HIV-GFP(MOI:1)를 RAW 264.7 세포에 접종하였다. 접종 2시간 후 접종액을 제거하고 PBS로 RAW 264.7 세포를 3회 세척하고 FBS가 10% 첨가된 신선한 DMEM으로 교환한 후 12~24 시간 후에 자외선(345 nm) 필터를 이용하여 바이러스 감염 정도를 현미경 관찰하고 이를 측정하였다.
또한, 각 조건에서의 GFP 형광 발현량을 보다 정확하게 비교하기 위해, GFP 발현량 확인 시스템을 통해 확인하였다. 이때 GFP의 발현량은 바이러스의 활성을 의미한다.
도 2a는 인간면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 GFP 발현량을 측정한 데이터를 나타낸다.
도 2a에 나타난 바와 같이 본 발명 시험군의 HIV-GFP 상대단위는 비교시험군 1, 비교시험군 2의 HIV-GFP 상대단위보다 상당히 감소되었다. 이는 본 발명의 시험군에서 인간면역결핍 바이러스(HIV)의 활성이 저하됨을 의미하는 것이다.
상기 바이러스 감염 상태에서의 RAW 264.7 세포 생존능을 MTT 어세이를 통해 확인하였다. MTT 어세이를 수행하기 위해서는, RAW 264.7을 96웰 플레이트에 이식시키고 시험군의 발효 청폐 경옥고, 비교시험군 1의 청폐 경옥고, 비교시험군 2의 시판 청폐 경옥고 및 대조군의 생리식염수에 GFP 발현 바이러스를 각각 처리시킨 후 48시간 후 100 ㎕의 1 ㎎/㎖ MTT 용액을 세포에 가하여 4시간 동안 반응시켰다. 이 후 DMSO 150 ㎕를 가하여 세포 내에 생성된 포마잔염을 용해시킨 후, 이 포마잔의 양을 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
도 2b는 인간면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 RAW 264.7의 12시간 및 24시간 세포 생존능을 나타낸 것으로 본 발명의 발효 청폐 경옥고를 분주시킨 시험군의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 12시간 생존능은 91%, 24시간 생존능은 83%를 나타내었다. 비교시험군 1의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 12시간 생존능은 84%, 24시간 생존능은 76%를 나타내었다. 비교시험군 2의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 12시간 생존능은 80%, 24시간 생존능은 69%를 나타내었다. 생리식염수만을 분주한 대조군의 경우 마우스 대식세포주인 RAW 264.7의 12시간 생존능은 68%, 24시간 생존능은 62%를 나타내었다.
이를 통해 본 발명의 시험군은 HIV 바이러스만을 접종시킨 대조군보다 12시간 후 23%의 대식세포주인 RAW 264.7의 생존능을 증가시켰으며 24시간 후에는 21% 생존능을 증가시켰다. 본 발명의 시험군에 의한 대식세포주인 RAW 264.7 생존능의 증가는 비교시험군 1, 2에 비해서도 12시간 후에 각각 7% 및 11%의 대식세포주 생존능의 증가, 24시간 후에 각각 7% 및 14%의 대식세포주 생존능의 증가를 나타낸 것이다. 이는 본 발명의 발효 청폐 경옥고의 HIV 바이러스에 대한 항바이러스 효과를 확인한 것이다.
Claims (4)
- ⅰ) 복령 10~14 중량%, 생지황즙 35~40 중량%, 길경 23~27 중량%, 사삼 6~8 중량%, 갈근 6~8 중량%, 상백피 6~9 중량%, 오미자 3~4 중량%를 세절시켜 혼합시킨 100 중량부의 한약재에 50~200 중량부의 물과 에탄올 혼합 용액(1:1)을 첨가한 후, 15~20℃에서 12~18시간 원재료를 추출하는 단계;
ⅱ) 상기 추출물에 0.01~1.0 중량부의 리파아제를 가하여 지질 성분을 효소 분해하고, 다시 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주로 24~36시간 발효시켜 단백다당체 성분을 발효 분해하는 단계; 및
ⅲ) 단계 ⅱ)에서 수득된 발효 브로스에 물과 에탄올 혼합 용액(1:1) 100 중량부를 가하여 잔사를 여과 제거시키고, 수득된 물과 에탄올 혼합 용액 추출물을 농축 건조시키는 단계;
로 제조된 발효 청폐 경옥고에 있어서,
상기 발효 청폐 경옥고는 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 항바이러스 활성을 지님을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고.
- 제 1항에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비지에 Yoo-102 균주는 미국 Imperial Yeast 사에서 상품화한 맥주 효모 균주 상품명 Cablecar L05를 모균주로 하여 1 중량%의 단백다당체를 추가로 첨가시킨 PDA(Potato dextrose agar) 배지에서 최적 성장을 나타내는 콜로니를 분리한 후 3회 계대 배양시켜 단백다당체 추가 PDA 배지에서 최적 성장하는 균주를 분리한 효모 균주이고, 상기 리파아제는 상품명 Lipozyme TL 100 L 리파아제 임을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발효 청폐 경옥고 0.1g과 생리식염수 0.1ml를 혼합시킨 후 시험관 내에서 105 TCID50/ml 역가의 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 감염 24시간 경과 후 마우스 대식세포주 RAW 264.7의 생존능은 대조군인 생리식염수 0.1ml의 시험관 내에서 105 TCID50/ml 역가의 돼지 인플루엔자 바이러스(SIV) 감염 24시간 경과 후 마우스 대식세포주 RAW 264.7의 생존능에 비해 약 20% 이상 증가함을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 발효 청폐 경옥고 0.1g과 생리식염수 0.1ml를 혼합시킨 후 시험관 내에서 105 TCID50/ml 역가의 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 24시간 경과 후 마우스 대식세포주 RAW 264.7의 생존능은 대조군인 생리식염수 0.1ml의 시험관 내에서 105 TCID50/ml 역가의 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염 24시간 경과 후 마우스 대식세포주 RAW 264.7의 생존능에 비해 약 20% 이상 증가함을 특징으로 하는 항바이러스 활성을 지닌 발효 청폐 경옥고.
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