KR20210137798A

KR20210137798A - Her2 복제수 변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트

Info

Publication number: KR20210137798A
Application number: KR1020200056096A
Authority: KR
Inventors: 김성수; 정윤정
Original assignee: (재)록원바이오융합연구재단
Priority date: 2020-05-11
Filing date: 2020-05-11
Publication date: 2021-11-18
Also published as: KR102353064B1

Abstract

본 발명은 HER2 유전자의 CNV 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물과 이를 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 CNV 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 이용하여 HER2가 발현되는 암 환자의 예후 또는 돌연변이 발생 위험도 예측이 가능하며, 암의 표적 치료에 필요한 정보를 제공할 수 있어 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

HER2 복제수 변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트{Composition for detecting copy number variation of HER2 and kit comprising the same}

본 발명은 HER2 복제수 변이 검출용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 HER2 복제수 변이 검출용 프라이머, 프로브 세트 조성물, 상기 조성물을 포함하는 HER2 복제수 변이 검출용 키트, 상기 조성물을 이용한 암의 예후 평가, 돌연변이 발생 위험도 예측 또는 표적치료에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

복제수 변이(copy number variation, CNV)는 인간 유전체의 개인별 변이에서 구조 변이에 해당하는 것으로, 인간 유전자의 다형성의 주요 부분에 대해 설명하고 일반적인 질병에 대한 유전적 민감성에 중요한 역할을 한다는 것이 예측되어왔다. 복제수 변이는 오직 하나의 염기에만 영향을 주는 단일 염기 다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)을 넘어서는 유망한 구조적 변형의 한 종류이다. 복제수 변이는 사이즈 면에서 ~1 키로베이스(kilobase) 내지 여러 메가베이스(megabase)로 다양하다.

HER2 (Human epidermal growth factor receptor 2)는 Tyrosine kinase activity를 갖는 185 kDa크기의 세포 표면의 당단백질이며, 이는 세포 성장 및 분화 조절에 결정적인 역할을 한다. HER2는 유방암에서 매우 중요한 바이오마커이며, HER2의 과발현은 유방암 환자의 20~30%에서 관찰되며, 이 과발현이 있는 유방암 환자는 전이의 위험이 증가하며 예후가 좋지 않다고 알려져 있다. 그러나, 1998년에 FDA의 허가를 받고 등장한 HER2 단백질에 대한 단일클론 항체치료제인 Herceptin (Trastuzumab)을 이용한 표적치료로 인하여 HER2 과발현 유방암 환자의 치료에 획기적인 성공을 가져오게 되었다. HER2의 증폭 또는 과발현은 유방암 이외에도 난소암, 전립선암, 대장암, 췌장암, 폐암, 위암 등에서도 보고가 되어 있고, 특히 위암과 위식도암에서 HER2의 과발현의 빈도는 4.4% ~ 53.4%이며 평균 17.9%의 빈도로 과발현이 관찰 되고 있다.

지금까지 HER2의 증폭 또는 과발현 검사는 주로 면역조직화학염색(IHC, Immunohistochemistry) 또는 형광동소보합법 (FISH, Fluorescent in situ hybridization)이 사용되었다. 그러나 형광동소보합법 같은 경우는 높은 시험 비용 및 시간소비와 고가의 형광 현미경이 필요하고, FISH와 IHC간의 높은 일치성이 이미 문헌으로 많이 보고된 바, 일반 병리 실험실에서 가장 친숙하고 쉽게 운영 할 수 있는 방법인 IHC를 많이 선호 하고 있다.

그러나 조직을 이용한 검사는 조직 채취 당시의 바이오마커 상태를 반영하고, 조직을 채취하기 위하여 침습적인 방법 (Biopsy, Resection 등)사용되기 때문에 환자에게 매우 큰 위험을 초래할 가능성이 존재한다. 또한, 종양 이질성 (Tumor heterogeneity)으로 인하여, 결과의 해석이 어려운 경우가 있으며, 개인 맞춤화 의료를 위한 정확한 진단에 있어 매우 큰 장애물이 되고 있다. 또한, 표적치료를 포함한 항암 치료에 대한 치료 효과 모니터링 측면에서도 매우 제한적인 방법이다.

현재 정밀의료를 위한 환자군 선택을 위해 사용하는 바이오마커 진단방법으로는 위와 같은 면역조직화학염색, 형광동소보합법 등과 같은 조직기반의 검사법이 사용되고 있으나, 종양조직을 얻어 진행하는 검사는 조직 채취 당시의 상태만을 반영하기 때문에 치료제의 효과에 의한 돌연변이의 변화를 추적 관찰하기에는 매우 제한적이다. 또한, 추가적인 생검으로 인한 환자의 육체적, 정신적 고통이 수반되고 진행성 암환자의 30~50% 에서는 추가적인 생검이 불가능하다.

따라서 액상생검이라는 방법을 통하여 얻어진 혈액, 기타 체액 등에 소량으로 존재하는 바이오마커를 분리하여 암 진단 및 예후, 항암제 효과 모니터링 등에 활용하기 위한 노력이 진행되고 있다. 특히 혈액 내 cell free-DNA 와 CTC를 이용한 바이오마커 검사는 조직검사의 한계인 종양이질성을 극복할 수 있을 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 발명자들은 액상생검 기반의 샘플로 HER2 CNV를 신속하고 정량적으로 산출할 수 있는 방법을 연구하던 중, 몇가지 유전자를 조합하여 HER2 CNV를 검출할 수 있는 방법을 개발하고, 이를 과발현되는 HER2 유전자의 CNV를 신속하게 검출할 수 있는 것으로 실증하여 이에 적합한 키트 및 이를 이용한 암의 예후 평가, 돌연변이 발생 위험도 예측 또는 표적치료에 필요한 정보 제공 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 RPP30, PPIA, AP3B1 및 BTF3P14 유전자로 이루어진 것을 특징으로 하는 HER2 유전자 복제수 변이 검출용 표준 유전자 세트 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 HER2 유전자 복제수 변이 여부를 판별하는 방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 또다른 목적은 HER2 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 HER2 복제수 변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 HER2 복제수 변이 검출용 키트를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RPP30, PPIA, AP3B1 및 BTF3P14 유전자로 이루어진 것을 특징으로 하는 HER2 유전자 복제수 변이 검출용 표준 유전자 세트 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HER2 유전자 복제수 변이 여부를 판별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HER2 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HER2 복제수 변이 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 HER2 복제수 변이 검출용 키트를 제공한다.

다른 정의가 없는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 동일한 의미를 가진다. 다음의 참고문헌은 본 발명의 명세서에 사용된 여러 용어들의 일반적인 정의를 갖는 기술(skill)의 하나를 제공한다: Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOTY(2th ed. 1994); THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walkered., 1988); 및 Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 RPP30, PPIA, AP3B1 및 BTF3P14 유전자로 이루어진 것을 특징으로 하는 HER2 복제수 변이 검출용 표준 유전자 세트 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “유전자 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV)”는 2개 이상의 유전체를 비교하여 발견된 복제수의 차이를 보이는 DNA 조각을 의미하며, 새로 생기기도 하고 유전되기도 한다. 인간 유전체에서 약 35만개의 CVN loci가 보고되어 있으며, 40 내지 100 kb 정도의 크기로 존재하며 CNV 영역(region)은 인간 유전체에서 약 600 Mb(~2%)정도 차지한다. 이러한 CNV(삽입(Insertion), 제거(Deletion), 중복(Duplication))은 표현형에 영향을 주며, 암의 발생에 영향을 준다. 암이 발생하는 과정에서 특정 유전자의 변이는 한번에 오지 않고 여러 단계에 걸쳐서 온다. 예를 들어 대장암이 일어나는 단계에 있어서, 정상 세포에서부터 여러 유전자의 변이들이 생겨 점막의 과증식 및 용종(adenoma)이 생기고, 다시 주요 암 억제 유전자의 변이를 거쳐서 최종적으로 대장암이 발병하게 된다. 각 암종마다 주요 유전자가 관여하는데 이들 유전자의 변이만 알면 암의 진행단계를 알 수 있다. 이 뿐만 아니라, 같은 장기의 암이어도 유전자의 변이가 모두 다르므로(heterogeneity) 이런 차이에 따라 암의 예후, 치료, 재발 등을 다르게 적용할 수 있다.

한편, 본 발명에서의 복제수 변이 여부의 판별은 시료 (바람직하게는 인간으로부터 분리된 시료)에서 복제수 변이 검출 대상 유전자 및 본 발명에서의 표준 유전자 세트의 카피수를 측정하고, 이를 배율을 비교함으로서 이루어 질 수 있다.

따라서, 본 발명은

(a) 시료에서 HER2 유전자 및 RPP30, PPIA, AP3B1 및 BTF3P14 유전자로 이루어진 표준 유전자 세트의 카피수를 측정하는 단계;

(b) 표준 유전자 세트의 각 유전자의 카피수의 평균값을 산출하는 단계; 및

(c) HER2 유전자의 카피수를 상기 (b) 단계에서 산출된 평균값으로 나누어 값을 산출하는 단계를 포함하며,

상기 (c) 단계에서 산출된 값을 2와 비교하여 복제수 변이 여부를 판별하는 것을 특징으로 하는 HER2 유전자의 복제수 변이 여부를 판별하는 방법을 제공한다.

상기 방법에서 (b) 단계의 평균값은 산술 평균값인 것이 바람직하며, 표준 유전자 세트의 각 유전자의 전체 측정값에 대한 산술 평균값이며, 측정시 미측정 또는 측정오류는 평균 계산시 배제될 수 있다.

HER2 복제수 변이 여부를 판별하는 것은 상기 (c) 단계의 산출값이 2보다 큰 경우에 복제수 변이가 있는 것으로 판별하고, 2 이하인 경우 복제수 변이가 없는 것으로 판별할 수 있다.

또한, 상기 표준 유전자 세트에 HER2 유전자와 동일한 염색체 내에 위치하는 유전자가 포함되어 있는 경우 다배체 염색체 (다염색체성, polysomy)에 의한 부정확한 판별을 막을 수 있도록 HER2 유전자와 동일한 염색체 내에 위치하는 BTF3P14 유전자 및 동일하지 않은 염색체 내에 위치하는 RPP30, PPIA, AP3B1유전자를 각각 포함하여, 복제수 변이 검출 대상 유전자의 카피수를 동일한 염색체 내에 위치하는 유전자의 카피수로 나눈 값은 1.5 내지 2.5이며, 복제수 변이 검출 대상 유전자의 카피수를 동일하지 않은 염색체 내에 위치하는 유전자의 카피수로 나눈 값은 2보다 큰 경우 복제수 변이가 있는 것으로 판별하며, 2 이하인 경우 복제수 변이가 없는 것으로 판별할 수 있다.

한편, 본 발명은 HER2 유전자의 복제수 변이 검출을 위하여, ⅰ) 서열번호 2의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 1의 프로브로 이루어진 HER2 검출용 폴리뉴클레오티드 세트;

ii) 서열번호 5의 프라이머, 서열번호 6의 프라이머 및 서열번호 4의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 서열번호 8의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머 및 서열번호 7의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 서열번호 11의 프라이머, 서열번호 12의 프라이머 및 서열번호 10의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 14의 프라이머, 서열번호 15의 프라이머 및 서열번호 13의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 HER2 유전자 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “HER2”는 human epidermal growth factor receptor type2의 약어로서 세포의 생산에 관여하는 사람의 매우 유사한 구조를 갖춘 유전자단백질(gene protein)이다. HER2 단백질은 정상적인 세포에도 근소하게 존재하여 세포의 증식조절기능(growth regulatory function)을 담당하기도 하지만, 과잉하게 발현 또는 활성화하여 세포의 증식 또는 악성화에 관여하는 것으로 알려져 있다 (생명과학대사전, 초판 2008, 개정판 2014, 강영희).

상기 HER2 유전자의 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV)를 검출할 수 있는 본 발명의 조성물은 이에 제한되지는 않으나, HER2가 발현되는 암의 예후 평가 또는 돌연변이 발생 위험도 예측에 필요한 정보를 제공하는데 활용될 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 HER2가 발현되는 암의 표적 치료에 필요한 정보를 제공하기 위하여 활용될 수 있다.

본 발명의 복제수 검출용 조성물에서‘암(cancer)’은 HER2가 발현되는 암을 의미하며, 위암, 유방암, 난소암, 선암, 자궁내막암, 전립선암, 대장암, 췌장암, 폐암, 위식도암, 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

본 발명에서 “프로브”는 정량적 PCR에 이용되는 taqman probe의 일종으로 디자인된 것이다. 바람직하게는 프로브에는 형광 물질(HEX, VIC, FAM dye)를 부착하였으며, 모든 프로브의 3'쪽에는 ??쳐(quencher)로 BHQ1이 이용될 수 있다. TaqMan probe는 일반적으로 5‘ 말단을 형광 물질로, 3’ 말단을 quencher 물질로 tagging한 oligonucleotide이며, TaqMan probe는 annealing step에서 template DNA에 특이적으로 hybridization하지만, probe의 3‘ 말단에 quencher가 있기 때문에 빛을 주어도 형광을 발하지 못하지만, 다음 과정인 extension step에서 Taq DNA polymerase가 가지고 있는 5’→3‘ exonuclease 활성에 의해, 주형에 hybridization한 TaqMan probe가 분해되면 형광물질이 probe로부터 분리되어 quencher에 의한 억제가 해제되고 형광을 발하게 되는 원리에 의해서 PCR 반응에 따른 형광이 정량적으로 발하게 된다.

본 발명에서 프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 HEX(hexachlorofluorescein), FAM(fluorescein amidite), EverGreen 형광염료가 결합되는 것을 특징으로 한다.

구체적으로 프로브에 FAM, HEX 형광염료(형광물질) 또는 EvaGreen 형광염료가 결합된 형태를 사용하였으므로 이들에 대한 형광을 측정하는 것에 의해서 수행될 수 있다. 이와 같은 과정은 상용의 검출장치(예를 들어, biorad사의 Droplet Reader)에 의해서 수행될 수 있으며, 해당 장치내에서 각각의 샘플의 droplet 형광 신호를 각각 감지 및 positive와 negative droplet의 수를 세어 자동으로 분석까지 완료될 수 있다.

이 때 검출을 위해서 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브 및 표준 PCR 반응 용액에 첨가되는 프로브는 각각 상이한 형광물질과 결합되어 있을 수 있다.

본 발명은 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 HER2 유전자 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명은 ⅰ) 서열번호 2의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 1의 프로브로 이루어진 HER2 검출용 폴리뉴클레오티드 세트;

ii) 서열번호 5의 프라이머, 서열번호 6의 프라이머 및 서열번호 4의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 서열번호 8의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머 및 서열번호 7의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 서열번호 11의 프라이머, 서열번호 12의 프라이머 및 서열번호 10의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 14의 프라이머, 서열번호 15의 프라이머 및 서열번호 13의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 HER2 유전자 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 바람직하게는 본 발명의 프라이머/프로브 세트를 이용한 PCR 반응에 의한 HER2 유전자의 CNV 검출에 이용될 수 있다. 본 발명의 키트는 PCR 이나 이의 검출에 사용되는 당 업계에 공지된 도구 및/또는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 기재한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명의 키트는 RUO(research use only) 또는 IVD(in vitro diagnostics) 키트일 수 있다. IVD 키트에는 IVD-CDx(in vitro companion diagnostics) 키트도 포함된다.

본 발명의 키트는 qPCR (quantitative PCR) 또는 droplet digital PCR 방법에 사용되는 것이다.

본 발명의 키트에 적용 가능한 주형은 HER2 유전자의 CNV 검출이 필요하며, PCR 반응이 가능한 것이라면 제한 없이 사용될 수 있으나, 바람직하게는 혈액에서 분리된 무세포 DNA(cell-free DNA, cfDNA), 순환종양세포 (circulating tumor cell, CTC)로부터 유래된 ctDNA (circulating tumor DNA) 또는 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed paraffin embedded. FFPE) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA(complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 한다.

인간 혈장에서 순환하는 cfDNA는 염증성 장애, 산화 스트레스 및 악성 종양 등의 다양한 생리학적 및 병리학적 병태들에서 연구되고 있다. cfDNA의 혈류 방출과 관련된 정확한 기전은 불확실하지만, 아마도 세포자살, 세포괴사 및 세포로부터의 능동적인 방출이 종합적으로 작용하는 것으로 보인다. 혈관을 통해 순환하는 cfDNA는 잠재적으로 유용한 바이오마커이다. DNA 수준과 단편화 패턴은 진단 및 예후 예측 목적으로 흥미로운 가능성을 제시한다. 특히 환자의 혈액에서 간단히 검출할 수 있다는 점에서 삶의 질을 크게 훼손하지 않고 간편하고 신속하게 바이오마커를 검출할 수 있다는 유용성이 있다.

아울러, 본 발명의 키트는 혈액에서 분리된 CTC(circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 CTC 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA를 주형으로 할 수 있다. CTC는 악성 종양 환자의 말초혈액에서 발견되는 종양세포이다. CTC가 암전이 과정에서 중요한 역할을 하기 때문에 CTC는 암의 연구, 진단 등에 있어서 매우 중요하게 여겨지고 있으나, 말초혈액 내 순환종양세포 존재 수가 매우 드물어, 수백만 개 이상의 정상 혈구세포에 섞여 있는 수십 개 이하의 종양세포를 검출할 수 있는 정도의 민감도가 요구되는 검출 시스템이 필요하다.

생검 후 환자에게서 얻은 조직은 통상적으로 포르말린(포름알데히드) 등에 의해서 고정화한다. 고정화한 생물학적 샘플은 일반적으로 탈수시키고, 파라핀 등의 고체 지지체에 포매하며, 이렇게 제조된 시료를 FFPE 시료라고 한다. FFPE 시료 상의 핵산, 특히 DNA는 고정된 세포에 존재하고, 단편화 되어 있거나 포르말린에 의해 교차 결합되어 있으므로 파라핀을 제거하고 고정된 세포를 용해하여 DNA를 비롯한 핵산을 세포 내에서 용출시킬 필요가 있다.

본 발명에 있어서 용어 “파라핀”은 형태학적, 면역조직화학적 및 효소조직화학적인 해석을 포함하는 모든 해석에 있어서 사용되는 생체시료의 포매 매체를 포괄적으로 말하는 것이다. 즉, 본 발명에 있어서의 파라핀은 석유계 파라핀 왁스 단체(單體)여도 되고, 당해 석유계 파라핀 왁스를 기제(基劑)로 하여, 포매 매체의 품질향상 등의 목적으로 첨가될 수 있는 모든 다른 성분을 포함한 것이어도 된다. 여기서, 석유계 파라핀 왁스는 석유에 유래하는 상온에서 고형인 탄화수소류의 혼합물을 말한다.

일반적으로 FFPE 처리된 암 환자의 검체 시료를 회전식 미세톱(rotary microtome)으로 5~10μm 의 두께로 절단한 다음 상용의 FFPE 용 핵산 분리 키트 또는 이를 활용하는 장치를 통해 DNA를 포함하는 핵산을 분리할 수 있다. FFPE에서 핵산을 분리하는 키트/장치는 예를 들어 지멘스사의 Tissue Preparation System 및 이와 관련된 시약 (VERSANT tissue preparation reagents)을 들 수 있다.

본 발명의 시료에서 분리되는 핵산은 게놈 DNA인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 CNV를 보유하고 있을 것으로 추정되는 게놈 DNA이다.

본 발명의 조성물 또는 키트는 바람직하게는 자동화 또는 반자동화된 방법의 HER2 유전자의 CNV 검출에 이용될 수 있다. 상기에서 자동화는 샘플(시료)의 투입; 추출, 분리, 반응이 완료된 기재(예를 들어, 튜브, 플레이트)의 재배치 또는 이동; 시약, 버퍼의 스톡(stock)에의 투입, 보충; 장비의 유지관리를 제외한 전부 또는 대부분 과정이 인간 이외의 수단(예를 들어, 로봇)을 통해서 이루어지는 것을 의미한다.

참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990); Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons(1997); Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67(1987); De Andres et al., BioTechniques 18: 42044(1995); Held et al., Genome Research 6:986-994(1996); T.E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91(2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29(2001)).

본 발명의 상기 ‘시료’는 혈액 및 생물학적 기원의 기타 액상 시료, 생검 표본，조직 배양과 같은 고형 조직 시료 또는 이로부터 유래된 세포가 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면 이에 한정되지는 않으나 조직, 추출물，세포 용해물，전혈，혈장, 혈청，침，안구액，뇌척수액, 땀, 뇨，젖，복수액, 활액，복막액 등일 수 있다. 상기 시료는 동물, 바람직하게는 포유동물로부터 수득될 수 있으며，가장 바람직하게는 인간으로부터 수득될 수 있다. 또한 상기 시료는 검출에 사용하기 전에 전처리할 수 있다. 예를 들어，여과，증류，추출，농축，방해 성분의 불활성화，시약의 첨가 등을 포함할 수 있다. 바람직하게는 환자로부터 획득한 CTC(circulating tumor cell), 혈액, FFPE(formalin fixed paraffin embedded), cfDNA(cell-free DNA), 신선한 표본(fresh sample) 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 환자로부터 획득한 혈액 또는 FFPE(formalin fixed paraffin embedded)일 수 있고, 전술한 바와 같이 상기 시료로부터 게놈 DNA 또는 CNV를 보유하고 있을 것으로 추정되는 DNA를 분리하여 HER2 유전자의 CNV 검출에 사용할 수 있다.

본 발명의 검출방법은 앞서 설명한 바와 같이, qPCR(quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법으로 HER2 유전자의 CNV를 검출할 수 있다.

따라서, 본 발명은 HER2 유전자의 CNV 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물과 이를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 방법은 HER2가 발현되는 암 환자의 예후 또는 돌연변이 발생 위험도 예측이 가능하며, 암의 표적 치료에 필요한 정보를 제공할 수 있어 항암치료제의 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 HER2 유전자의 CNV 검출을 위한 프라이머, 프로브 선정 실험에 대해 나타낸 것이다.
도 2 및 도 3는 HER2 Amplification 세포주에서 예상 CNV 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 간섭반응 실험 결과 및 CNV 값을 나타낸 것이다.
도 5은 표준물질과 human gDNA 검체에서 간섭반응을 반복실험한 후 CNV값을 확인하여 LOB 값을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 20개의 FFPE Sample에 따른 LOB 값의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 human gDNA와 표준물질의 input DNA양을 연속희석하여 검출되는 최소 농도를 알아보기 위하여 LOD 실험을 반복 수행한 결과이다.
도 8은 HER2 amplification이 있는 SKBR3 세포주 human gDNA양을 연속희석하여 검출되는 최소 농도를 알아보기 위하여 LOD 실험을 반복 수행한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: HER2 CNV 검출을 위한 프라이머와 프로브의 선정

pUC57-Amp vector에 돌연변이를 포함한 300bp의 유전자를 합성, 총 3kb의 clone을 제작하였다. 형질전환 및 배양 후 maxi-prep을 진행하였고, M13F, M13R 프라이머를 통해 전체 서열을 확인하였다. 정제된 DNA를 Hind Ⅲ restriction enzyme을 이용하여 digestion을 진행하였고, 전기영동 결과로 Linearized DNA를 확인하였다. Forward primer 2개, Reverse primer 3개를 디자인하여, 총 4쌍의 primer와 1개의 probe로 선정 실험을 하기 [도 1]과 같이 진행하였다.

실시예 2 : HER2 CNV 검출을 위한 레퍼런스(Reference) 유전자 검증

HER2 유전자의 CNV 검출을 위해 확립된 총 4개의 레퍼런스 유전자에 대해서 TCGA(The Cancer Genome Atlas) 데이터베이스를 사용하여 완전성(Integrity, 무결성, 실제 레퍼런스로의 적합성 조사)조사를 수행하였다. 이때 RNase P(Ribonuclease P)와 LINE-1(Long Interspersed Element-1)은 TCGA 데이터베이스에 없어서 분석에서 제외하였다.

보다 상세하게는 심층 제거(Deep deletion), 절단형 돌연변이(Truncating mutation), 과오돌연변이(missense mutation)의 존재에 대하여 분석하였다.

분석 결과 TERT(telomerase reverse transcriptase)와 GUSB(canine beta-glucuronidase gene)을 제외하고 나머지 유전자들은 11개의 대표 암 종에서 안정적으로 발현되는 것을 확인하였다. 이를 기반으로 선정된 레퍼런스 유전자의 정보는 하기와 같다.

레퍼런스 유전자 1은 공지된 문헌 1(Cancer Sci 105 (2014) 1032-1039)에서 발췌하여 선정된 레퍼런스 유전자로, Reference gene2와 마찬가지로 Internal amplification control(IAC) list에 기재되어 있다. 또한 chromosome 10 에 위치하며 7,243 개의 변이 (ENST00000371703.7 기준) 를 가지고 있다. 전체 7,243 개의 변이 중 병원성 변이는 존재하지 않아 참고유전자로 선정하였다.

레퍼런스 유전자 2는 공지된 문헌 2(BMC Molecular Biology. 2009)에서 house keeping gene 후보군 중 하나로 c-MET과 같은 염색체 위치에 있는걸 선별하여 선택하였고, 표준화에 사용되는 일반적인 유전자로 알려져 있다. 또한 chromosome 7 에 위치하며 14,775개의 변이 (ENST00000310581.9 기준) 를 가지고 있다. 전체 14,775개의 변이 중 병원성 변이는 47개가 존재하지만 해당 변이들이 extremely rare frequency (<0.0001) 를 보이고 있어서 참고유전자로 선정하였다.

레퍼런스 유전자 3은 공지된 문헌 3(PLOS ONE | DOI:10.1371 / journal. pone.0146784 January 14, 2016)에서 발췌하여 선정된 레퍼런스 유전자로 Copy number variation에 쓰이는 유전자로 기재되어 있다. 또한 해당 키트에 대한 실험기법에 알맞은 레퍼런스 유전자로 알려져 있다. 또한 chromosome 5 에 위치하며 67,275 개의 변이 (ENST00000255194.10 기준) 를 가지고 있다. 전체 67,275개의 변이 중 병원성 변이는 12개가 존재하지만 해당 변이들이 extremely rare frequency (<0.0001) 를 보이고 있어서 참고유전자로 선정하였다.

본 연구에서 사용될 레퍼런스 유전자의 병원성 변이의 판단기준과 관련하여, Ensembl (http://ensembl.org) 에서 제공하는 각 유전자의 임상정보(Clin. Sig.)가 “pathogenic”, “likely pathogenic”, “likely benign~pathogenic” 에 해당하며, 그에 해당하는 변이가 0.01 이상의 frequency (gmaf_freq) 를 가질 경우를 병원성 변이로 판정하였다.

또한 HER2 CNV 검출을 위해 추가적으로 1개의 레퍼런스 유전자(BTF3P14)에 대해서 TCGA database를 사용하여 Integrity (무결성, 실제 Reference로의 적합성 조사) 조사를 수행하였다.

실시예 3 : HER2 CNV 검출을 위한 패널의 확정

레퍼런스 유전자 혼합실험 및 간섭반응을 통해 HER2 CNV 검출을 할 수 있는 안정적인 패널을 완성하였다(표 1, 패널은 MMX라 명명). 레퍼런스 유전자를 4개로 선별하고 Target HER2는 exon24로 결정하였다. 이 때 CNV 검출을 위하여 하기 표 2의 프로브 및 프라이머를 사용하였다.

MMX	Detection	Channel
1	HER2 Target (ch.17)	FAM
1	Reference 1	HEX
2	Reference 2	FAM
2	Reference 3	HEX
3	Reference 4	FAM
3

MMX	Gene	Name	Sequence	서열번호
1	ERBB2	ERBB2 WTP1	CCAAAGCCAACAAAGAAATCT	1
		ERBB2 F1	GGGGAGAATGTGAAAATTCCA	2
		ERBB2 WR1	AGAGGGTGGAGGGGCTTA	3
	RPP30	RPP30-1 P1	GGAATTGTCAAACTGACTCCTTTTCC	4
		RPP30-1 F1	ATTTTAGGATGTTTTTCGCATCTG	5
		RPP30-1 R1	TGGCAGAATTTGTTCCTATGC	6
2	PPIA	PPIA P2	TTGGATGGCAAGCATGTGGT	7
		PPIA F3	GTTGCCAGTCATAGTGATTGTTC	8
		PPIA R3	GGCCTCCACAATATTCATGC	9
	AP3B1 (type 2)	AP3B1 P4	CAGCAGTGAGGACTCCTCCA	10
		AP3B1 F4	AAGTGGAGAACAAGGCGAAA	11
		AP3B1 R4	CCGTCCACTCTCACTGTCCT	12
3	BTF3P14	BT P1	GACACAGCAGCTGATGGAAA	13
		BT F1	CAGTGATCCGCTTTAACAATCCT	14
		BT R1	GTCTGCATCTCACCGGCTTAA	15

CNV 표준화는 4개의 레퍼런스 유전자의 평균 copy수를 기준으로 계산하였다(수학식 1). 이 때 CNV가 2이상일 경우 CNV가 있다고 판단하기로 하였다.

검증된 다수의 레퍼런스 유전자의 copy 평균값을 통한 CNV 산출값을 통해 기본적인 하나의 유전자로 계산되어지는 CNV 산출값의 신뢰도보다 더 나은 신뢰성을 가진 CNV값을 산출 할 수 있다. 또한 염색체의 위치가 다른 레퍼런스 유전자의 조합으로 인해 기존에 알려진 레퍼런스 유전자의 신빙성을 최소화 할 수 있다고 판단되었다.

[수학식 1]

레퍼런스 유전자를 활용한 판단방법

인 경우, HER2에 CNV가 있다고 판단.

더불어 HER2의 다염색체성(polysomy)을 확인하기 위해 추가 계산법을 도입하였다(수학식 2). 같은 염색체(Chromosome)에 위치하고 있는 레퍼런스 유전자를 기준으로 CNV를 계산하였을 시 CNV값이 2에 근접할 경우와 나머지 3개의 레퍼런스 유전자의 CNV값이 2이상일 경우(예상 CNV>4) 다염색체성이 있다고 판단하였다.

[수학식 2]

다염색체성을 확인 할 때의 레퍼런스 유전자를 활용한 판단방법

일 경우, 다염색체성이 있다고 판단.

HER2 Amplification이 있다고 알려진 SKBR3 Cell line (DNA)에서 확정된 패널을 이용하여 실험한 결과 양성의 값이 나오는 것을 확인하였다.

실시예 4 : 확정된 패널에 대한 검증

각각의 확정된 MMX 패널에 대해 사전 분석 검증을 시행하였으며 우선적으로 교차반응을 통해 간섭반응의 유무를 확인하였다. 검체들은 표준물질로 확인하였다.

간섭반응 실험결과 및 CNV값은 [도 4]에 나타내었다.

또한 표준물질과 공지된 human gDNA 검체에서 7번 이상 반복 실험한 결과, [도 5]와 같이 CNV 값이 2 fold로 안정적인 LOB(lateral organ boundary) 값이 검출되는 것을 확인하였다.

더불어 [도 6]과 같이 정상 FFPE Sample (N=20)을 통해 CNV값이 2> 값으로 LOB값이 검출되는 것을 확인하였다.

또한 human gDNA input DNA양을 연속희석하여 검출되는 최소 농도를 알아보기 위한 LOD(limit of detection, 검출한계) 실험을 진행하였다.

3번 반복실험을 통해서 도출된 각각의 카피수를 평균을 내어 CNV값을 검출하였으며 CNV값은 2를 기준으로 하였고, 그 결과는 [도 7]에 나타내었다.

4개의 레퍼런스 유전자에 대한 CNV값을 검출한 결과 안정적으로 검출되는 최소 농도(LOD)는 0.1ng/well로 확인되었다.

또한 HER2 amplification이 있는 SKBR3 세포주 gDNA양을 연속희석 하여 검출되는 최소 농도를 알아보기 위한 LOD실험을 진행하였다. 3번 반복실험을 통해서 각각의 copy수를 평균을 내어 CNV값을 검출하였고 그 결과는 [도 8]에 나타내었다.

3번 반복실험을 통해서 도출된 각각의 카피수를 평균을 내어 CNV값을 검출하였으며, 4개의 레퍼런스 유전자에 대한 CNV값을 검출한 결과 0.1ng/well이였을 때 CNV 계산은 가능하나 레퍼런스유전자 copy수가 Human gDNA만 넣어 주었을 때보다 흔들리는 값을 나타냈고, 안정적으로 검출되는 최소 검출 농도(LOD)는 0.2ng/well로 확인되었다.

실시예 5 : 임상 적용 가능성 평가

임상 검체 적용 가능성 평가를 위해 200bp 크기에서도 본 발명에 따른 HER2 유전자 CNV 검출 키트가 실제 CNV를 검출할 수 있을지 확인하였다. 이를 통해 혈액에 있는 cfDNA에서 CNV 검출이 가능한지 간접적으로 확인하였다.

SKBR3(ERBB2, CNV Breast cancer cell line gDNA)를 cfDNA size인 200bp 로 단편화하여 ddPCR 에 사용하였다. 희석에는 MCF7(CNV가 없는 breast cancer cell line gDNA, CNV=1)와 promega WT gDNA(CNV=2)를 사용하였고, 그 결과는 [표 3]과 [표 4]에 나타내었다.

희석 vol	SKBR3	MCF7	예상 CNV
	1	0	23.38
S1	1	0.1	20.23
S2	1	1	10.07
S3	1	1.55	7.99
S4	1	2.55	5.98
S5	1	5	3.99

희석 vol	SKBR3	gDNA	예상 CNV
	1	0	23.38
S1	1	0.1	19.55
S2	1	0.9	9.88
S3	1	1.4	7.98
S4	1	2.45	6.00
S5	1	5.5	4.04

cfDNA size로 단편화된 DNA에서도 마찬가지로 HER2 CNV가 성공적으로 관찰 되었다. 이는 추후 혈액의 cfDNA에서도 HER2 CNV를 관찰 할 수 있음을 증명하는 데이터임을 의미한다.

더불어 CNV가 있는 것으로 알려진 세포주(SKBR3, Breast cancer cell line)과 human gDNA를 섞었을 때 어느 비율까지 CNV가 검출되는지 확인하였다. CNV가 있다고 알려진 세포주에서 DNA를 추출하여 농도 고정하고 CNV가 없는 표준물질 및 세포주 gDNA로 희석하여 진행하였다.

결과적으로 CNV(CNV>4)가 있다고 판단되는 정도는 3.3ng input DNA양을 넣어주었을 시 20-25%까지 검출이 가능함을 확인하였다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명에 따른 HER2 유전자 CNV 검출용 조성물 및 키트는 HER2 유전자의 CNV를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 이를 통해 암 환자 예후 또는 돌연변이 발생 위험도 예측이 가능하며, 암의 표적 치료에 필요한 정보를 제공할 수 있어 항암치료제 투여 필요성 판단을 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 목적 및 암의 전이 또는 재발에 대한 모니터링 하는 데에 유용하게 이용될 수 있다.

<110> Logone Bio Convergence Research Foundation <120> Composition for detecting copy number variation of HER2 and kit comprising the same <130> NP20-0021 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB2 WTP1 <400> 1 ccaaagccaa caaagaaatc t 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB2 F1 <400> 2 ggggagaatg tgaaaattcc a 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ERBB2 WR1 <400> 3 agagggtgga ggggctta 18 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPP30-1 P1 <400> 4 ggaattgtca aactgactcc ttttcc 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPP30-1 F1 <400> 5 attttaggat gtttttcgca tctg 24 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RPP30-1 R1 <400> 6 tggcagaatt tgttcctatg c 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPIA P2 <400> 7 ttggatggca agcatgtggt 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPIA F3 <400> 8 gttgccagtc atagtgattg ttc 23 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPIA R3 <400> 9 ggcctccaca atattcatgc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP3B1 P4 <400> 10 cagcagtgag gactcctcca 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP3B1 F4 <400> 11 aagtggagaa caaggcgaaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AP3B1 R4 <400> 12 ccgtccactc tcactgtcct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BT P1 <400> 13 gacacagcag ctgatggaaa 20 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BT F1 <400> 14 cagtgatccg ctttaacaat cct 23 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BT R1 <400> 15 gtctgcatct caccggctta a 21

Claims

RPP30, PPIA, AP3B1 및 BTF3P14 유전자로 이루어진 것을 특징으로 하는 HER2 복제수 변이 검출용 표준 유전자 세트 조성물.
(a) 시료에서 HER2 유전자 및 RPP30, PPIA, AP3B1 및 BTF3P14 유전자로 이루어진 표준 유전자 세트의 카피수를 측정하는 단계;
(b) 표준 유전자 세트의 각 유전자의 카피수의 평균값을 산출하는 단계; 및
(c) HER2 유전자의 카피수를 상기 (b) 단계에서 산출된 평균값으로 나누어 값을 산출하는 단계를 포함하며,
상기 (c) 단계에서 산출된 값을 2와 비교하여 복제수 변이 여부를 판별하는 것을 특징으로 하는 HER2 유전자의 복제수 변이 여부를 판별하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 (b) 단계의 평균값은 산술 평균값인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 복제수 변이 여부를 판별하는 것은 상기 (c) 단계의 산출값이 2보다 큰 경우에 복제수 변이가 있는 것으로 판별하고, 2 이하인 경우 복제수 변이가 없는 것으로 판별하는 것임을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 표준 유전자 세트는 HER2 유전자와 동일한 염색체 내에 위치하는 BTF3P14 유전자 및 동일하지 않은 염색체 내에 위치하는 RPP30, PPIA, AP3B1 유전자를 각각 포함하며,
HER2 유전자의 카피수를 동일한 염색체 내에 위치하는 유전자의 카피수로 나눈 값은 1.5 내지 2.5이며, HER2 유전자의 카피수를 동일하지 않은 염색체 내에 위치하는 유전자의 카피수로 나눈 값은 2보다 큰 경우 복제수 변이가 있는 것으로 판별하며, 2 이하인 경우 복제수 변이가 없는 것으로 판별하는 것임을 특징으로 하는 방법.
ⅰ) 서열번호 2의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 1의 프로브로 이루어진 HER2 검출용 폴리뉴클레오티드 세트;
ii) 서열번호 5의 프라이머, 서열번호 6의 프라이머 및 서열번호 4의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 서열번호 8의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머 및 서열번호 7의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 서열번호 11의 프라이머, 서열번호 12의 프라이머 및 서열번호 10의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 14의 프라이머, 서열번호 15의 프라이머 및 서열번호 13의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 HER2 유전자 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출용 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
제6항에 있어서, 상기 HER2 유전자 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출은 암의 예후 평가 또는 돌연변이 발생 위험도를 예측하기 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
제6항에 있어서, 상기 HER2 유전자 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출은 암의 표적 치료에 필요한 정보를 제공하기 위한 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 암은 위암, 유방암, 난소암, 선암, 자궁내막암, 전립선암, 대장암, 췌장암, 폐암, 위식도암, 방광암으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
제6항에 있어서, 상기 프로브는 형광물질과 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
제10항에 있어서, 상기 형광물질은 VIC, HEX, FAM, EverGreen dye로 이루어진 군에서 선택된 하나이상인 것임을 특징으로 하는 프라이머 및 프로브 세트 조성물.
제6항에 따른 프라이머 및 프로브 세트 조성물을 유효성분으로 포함하는 HER2 유전자 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출용 키트.
제12항에 있어서, 상기 키트는 RUO (research use only) 또는 IVD (in vitro diagnostic) 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
ⅰ) 서열번호 2의 프라이머, 서열번호 3의 프라이머 및 서열번호 1의 프로브로 이루어진 HER2 검출용 폴리뉴클레오티드 세트;
ii) 서열번호 5의 프라이머, 서열번호 6의 프라이머 및 서열번호 4의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 서열번호 8의 프라이머, 서열번호 9의 프라이머 및 서열번호 7의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 서열번호 11의 프라이머, 서열번호 12의 프라이머 및 서열번호 10의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 및 서열번호 14의 프라이머, 서열번호 15의 프라이머 및 서열번호 13의 프로브로 이루어진 폴리뉴클레오티드 세트; 로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 폴리뉴클레오티드 세트를 유효성분으로 포함하는 HER2 유전자 복제수 변이(Copy Number Variation, CNV) 검출용 키트.
제14항에 있어서, 상기 키트는 qPCR (quantitative PCR) 또는 digital PCR 방법에 사용되는 것임을 특징으로 하는 키트.
제14항에 있어서, 상기 키트는 혈액에서 분리된 cfDNA(cell-free DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
제14항에 있어서, 상기 키트는 FFPE (formalin fixed parafin embedded) 조직에서 분리된 DNA 또는 상기 조직 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA (complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.
제14항에 있어서, 상기 키트는 혈액에서 분리된 CTC (circulating tumor cell)에서 분리된 DNA 또는 상기 CTC 유래의 RNA로부터 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA (complementary DNA)를 주형으로 하는 것을 특징으로 하는 키트.