KR20210131998A - 키메라 항원 수용체(car) 및 의약에서의 이의 용도 - Google Patents

키메라 항원 수용체(car) 및 의약에서의 이의 용도 Download PDF

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KR20210131998A
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car
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osteosarcoma
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엘세 마리트 인데르베르그
세바스틴 밸흘리
외이빈드 에스 브룰랜트
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오슬로 유니버시테시케후스 에이치에프
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Abstract

신규한 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공된다. 본원의 CAR이 면역 세포의 표면에서 발현되는 경우, 상기 면역 세포는 본 발명자의 생체 내 데이터로 입증된 바와 같이 골육종 세포로 향할 수 있다. 뮤린 복강 내 모델에서, 종양 성장은 TP1 또는 TP3 항체로부터의 scFv를 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포에 대해 유의하게 지연되었다. 본원의 CAR을 발현하는 면역 세포는 전이성 골육종을 시뮬레이션하는 뮤린 모델에서 감소된 종양 부피의 형태로 치료 효과를 나타낸다. 건강한 골수로부터의 줄기 세포가 임의의 CAR을 발현하는 T 세포에 의해 유의하게 영향을 받지 않는다는 발견과 조합하여, 본 발명의 개시는 골육종의 치료를 위한 매력적인 세포 치료적 대안을 제공한다.

Description

키메라 항원 수용체(CAR) 및 의약에서의 이의 용도
본 발명은 세포 요법 분야에 관한 것이다. 특히, 이는 키메라 항원 수용체(CAR), CAR을 인코딩하는 핵산, 이들을 발현하는 면역 세포 및 골육종 치료를 위한 의약에서의 이들의 유용성에 관한 것이다.
골육종(OS)은 가장 흔한 원발성 골암이며, 소아 및 청소년에서 8번째로 흔한 형태의 암이다. OS는 5년 전체 생존율이 60%로 낮은 공격적인 유형의 암이다. 이러한 수치는 70년대에 화학요법이 도입된 이후로 개선되지 않았다. 혁신적인 해법으로 임상 시험을 실행하기 위해 많은 국제 컨소시엄이 만들어졌지만, 지금까지 보고된 결과는 좋지 않았다. 이들 부정적인 결과의 이유는 OS의 생물학과 관련이 있다. 대부분의 환자는 대부분 화학내성인 폐 전이로 인해 이들의 암에 굴복할 것이다. 상기 분야에서 분명한 충족되지 않은 요구가 있다.
CAR을 발현하는 자가 T 세포에 의한 HER2의 표적화에 기초하여 골육종 환자를 포함하는 육종 환자에 관한 한 가지 임상 시험이 보고되었다(Ahmed et al. 2015, J Clin Oncol. 2015 May 20;33(15):1688-96). HER2는 다양한 유형의 암에 존재하지만, 건강한 조직도 HER2를 발현한다. CAR T 세포를 정맥 내 투여받은 환자는 세포 주입 후 15분 이내에 호흡 곤란을 겪었고, 집중적인 의학적 개입에도 불구하고, 환자는 치료 5일 후에 사망하였다( Morgan et al . Mol Ther. 2010 Apr;18(4):843-51).
치료용 CAR T 세포를 달성하기 위해, 세포는 세포막에서 충분한 양으로 CAR을 발현시킬 필요가 있으며, 항원 결합 도메인은 CAR 작제물에서 충분한 친화성 및 특이성을 전달해야 한다. 힌지의 미세한 차이조차도 표적 세포 상의 표적 에피토프에 도달하고 이후에 면역 세포로 신호를 전달하는 CAR의 능력에 영향을 미칠 수 있다.
시험관 내 CAR T 세포의 활성은 물론 생체 내 활성의 지표일 수 있다. 그러나, 문헌[Long et al, Cancer Immunol Res. 2016 Oct; 4(10): 869-880]에 개시된 바와 같이, CAR T 세포의 시험관 내 활성은 반드시 생체 내 효능으로 해석되는 것은 아니며, 특히 OS에 대한 생체 내 효능으로 해석되는 것은 아니다: "그러나, 생체 내에서, GD2-CAR T 세포는 신경모세포종 이종이식에 대해 강력한 항종양 활성을 매개했지만, 골육종 이종이식에 대해서는 최소한의 활성만을 매개하였다. 항종양 활성의 결여는 인간 T 세포를 억제하는 CD11b+Ly6G+ 뮤린 MDSC의 상당한 확장과 관련되었다". 또한, 심각한 부작용이 문헌[ Mount et al, Nature Medicine volume 24, pages 572-579 (2018)]에 개시된 바와 같이 발생할 수 있으며, 여기서 GD2-CAR T 세포 투여는 동소 이종이식을 갖는 대부분의 마우스에서 용인되었다. 항종양 활성의 급성기 동안 종양주위 신경염증은 일부 동물에서 치명적인 수두증을 발생시켰다.
또한, 고형 종양에 대한 CAR T 세포 요법은 혈액 악성종양과 비교하여 극복해야할 상이한 세트의 장애물을 제공한다. 문헌[Srivastava and Riddle, J Immunol 2018; 200:459-468]에 기재된 바와 같이; 상기 장애물은 불량한 트래피킹(trafficking), 면역억제 분자 및 세포의 향상된 발현, 면역 체크포인트를 포함한다. 예를 들어, CAR T 세포의 종양으로의 트래피킹은 종양에 의해 분비되는 케모카인에 대한 수용체의 발현에 의존한다. 항원 활성화된 CAR T 세포는 억제 수용체의 발현을 상향조절하는 것으로 추가로 나타나며, 이는 T 세포 기능장애를 유발할 수 있다. 면역억제 분자 및 세포는 종양 성장을 촉진하고, T 세포 활성을 직접적으로 및 간접적으로 억제할 수 있다. 따라서, CAR T 세포가 고형 종양에서 효과적이기 위해서는 다양한 장애물이 극복되어야 할 것이다.
또 다른 문제는 표적 부위에서 CAR T 세포의 효율적인 접근과 관련이 있다. 혈액학적 악성종양과 달리, 고형 종양의 인식은 혈액에서 종양 부위로의 탈출을 필요로 하며, 많은 악성종양이 진화하여 T 세포 침윤이 능동적으로 방해된다.
시험관 내 활성을 갖는 CAR T 세포의 일부만이 생체 내에서 종양 전이로 성공적으로 이동하고 OS와 같은 고형 종양의 적대적인 종양 미세환경에 침투할 것으로 예상될 수 있다. 또한, CAR T 세포는 생체 내에서 치료 효과를 제공하기 위해 시간이 지남에 따라 이들의 활성을 유지해야 할 가능성이 있을 것이다. 문헌[Quintarelli et al, ONCOIMMUNOLOGY 2018, VOL. 7, NO. 6]에 개시된 바와 같이, CAR 작제물의 신호전달 도메인은 중요하다: "그럼에도 불구하고, 이종이식 NSG 마우스 모델에서 2개의 상이한 공동자극 신호전달 도메인을 갖는 III CAR.GD2 T 세포가 시험된 경우, 우리는 CARGD2.28.4-1BBz T 세포만이 생체 내에서 지속적인 항종양 효과를 매개한다는 것을 관찰하였다(도 2D-F). [...] 지금까지 GD2를 표적으로 하는 1세대 17,18 및 3세대(CD28.OX40) 21 CAR 둘 모두를 사용하여 NB를 갖는 아동에서 수행된 임상 시험은 제한된 효능만을 입증하였다."
따라서, 면역 세포의 세포막에서 발현되는 경우에 생체 내에서 OS에 대한 치료 효과를 제공할 수 있는 신규한 CAR을 획득하는 것은 사소한 것이 아니라 매우 바람직하다.
신규한 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공된다. 본원의 CAR을 발현하는 면역 세포는 전이성 OS를 시뮬레이션하는 뮤린 모델, 즉, 폐에 확립된 OS 종양을 갖는 마우스에서 치료 효과를 나타낸다, 도 7, 8 및 9 참조. OS는 고형 종양으로, 종종 치명적인 결과와 함께 폐로 퍼진다. 본원에 제시된 CAR은 이전에 매우 특이적인 것으로 나타난 폐 전이 특이적 마커를 인식한다. 또한, 본 발명자는 건강한 조직에 대한 이들의 반응성을 시험하여 CAR 안전성을 평가하였다. 건강한 골수로부터의 줄기 세포가 임의의 CAR을 발현하는 T 세포에 의해 유의하게 영향을 받지 않는다는 발견과 조합하여, 본 발명의 개시는 인간 환자에서 OS의 치료를 위한 매력적인 세포 치료적 대안을 제공한다. 또한, CAR을 발현하는 면역 세포는 또한 미세전이성 OS를 시뮬레이션하는 모델에서 활성을 나타낸다(도 10 참조).
본원의 CAR이 면역 세포의 표면에서 발현되는 경우, 상기 면역 세포는 본 발명자의 생체 내 데이터로 입증된 바와 같이 OS 세포로 향할 수 있다. 여러 이종이식 OS 모델에서 치료 효과가 입증되었다. 뮤린 복강 내 모델에서, 종양 성장은 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2를 포함하는 항원 결합 도메인(TP1 scFv-단편)을 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포에 대해 유의하게 지연되었다. 동일한 모델에서, 종양 성장은 SEQ ID NO 3 및 SEQ ID NO 4를 포함하는 항원 결합 도메인(TP3 scFv-단편)을 포함하는 CAR을 발현하는 T 세포에 대해 본질적으로 회피되었다. 또한, 어느 한 CAR을 발현하는 T 세포를 투여받은 마우스의 경우 전체 생존이 유의하게 개선되었다. OSCAR1 또는 OSCAR3을 발현하는 T 세포의 정맥 내 투여는 매우 공격적인 OSA 폐 종양을 갖는 마우스에서 치료 효과 및 연장된 생존을 제공하였고, 심지어 골 전이를 예방하는 것으로 보였다(도 7 및 8 참조). OSCAR1 또는 OSCAR3을 발현하는 T 세포의 정맥 내 투여는 또한 LM-7 폐 종양을 갖는 마우스에서 연장된 치료 효과를 제공하였다(도 9 참조).
제1 양태에서, 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이 제공되며; 상기 항원 결합 도메인은 TP1 scFv-단편을 포함하거나, 상기 항원 결합 도메인은 TP3 scFv-단편을 포함하고; 상기 힌지 도메인은 CD8α 힌지 도메인을 포함하고, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 모데인을 포함한다.
상기 힌지 도메인은 SEQ ID NO 5로 표시될 수 있다.
상기 막횡단 도메인은 SEQ ID NO 6로 표시될 수 있다.
상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인 및 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.
상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.
상기 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인으로 구성될 수 있다.
상기 항원 결합 도메인은 펩티드 링커에 의해 연결된 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 도메인은 펩티드 링커에 의해 연결된 SEQ ID NO 3 및 SEQ ID NO 4를 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 도메인은 펩티드 링커에 의해 연결된 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2를 포함할 수 있고, 힌지 도메인은 SEQ ID NO 5로 표시될 수 있고, 막횡단 도메인은 SEQ ID NO 6로 표현될 수 있고, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.
상기 항원 결합 도메인은 펩티드 링커에 의해 연결된 SEQ ID NO 3 및 SEQ ID NO 4를 포함할 수 있고, 힌지 도메인은 SEQ ID NO 5로 표시되는 CD8α 힌지 도메인일 수 있고, 막횡단 도메인은 SEQ ID NO 6로 표시되는 CD8α 막횡단 도메인일 수 있고, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함할 수 있다.
제2 양태에서, 제1 양태에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산이 제공된다.
제3 양태에서, 제2 양태에 따른 핵산으로 형질도입된 면역 세포가 제공된다.
제4 양태에서, 제1 양태에 따른 CAR을 발현하는 면역 세포가 제공된다.
제5 양태에서, 제3 또는 제4 양태에 따른 면역 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
상기 약학적 조성물은 골육종의 치료에 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 전이성 골육종의 치료에 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 미세전이성 골육종의 치료에 사용될 수 있다.
전이성 골육종의 치료에서 사용하기 위한 키메라 항원 수용체(CAR)를 세포막에서 발현하는 면역 세포가 또한 입증되며, 상기 CAR은 TP1 scFv-단편 또는 TP3 scFv-단편을 포함하는 항원 결합 도메인; 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 세포 내 신호전달 도메인, 및 선택적으로 하나 이상의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
또한, 약학적으로 효과적인 용량의 제5 양태에 따른 약학적 조성물을 환자에 정맥 내 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 골육종을 치료하는 방법이 제공된다.
또한, 약학적으로 효과적인 용량의 제5 양태에 따른 약학적 조성물을 환자에 정맥 내 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 전이성 골육종을 치료하는 방법이 제공된다.
도 1은 둘 모두의 CAR 작제물(OSCAR1 및 OSCAR3)이 레트로바이러스적으로 형질도입된 일차 T 세포에서 잘 발현되고, 항-마우스 Fab 항체로 검출될 수 있음을 제시한다.
도 2는 BioPlex에 의해 검출된 세포 배지에서의 사이토카인 방출을 제시한다. 더 어두운 색은 24시간 후의 상층액에서의 더 높은 사이토카인 수준을 나타낸다. 제시된 바와 같이, OSCAR 리디렉션된 세포는 골육종 세포주로부터의 자극시 TNFα 및 IFNγ 방출에 대해 강하게 활성화되었다.
도 3a는 OSCAR1 또는 OSCAR3를 발현하거나 모의 형질감염된 일차 T 세포에 의한 OHS 세포의 시험관 내 사멸(BLI-검정)을 나타낸다.
도 3b는 OSCAR1 또는 OSCAR3를 발현하거나 모의 형질감염된 일차 T 세포에 의한 OSA 세포의 시험관 내 사멸(BLI-검정)을 나타낸다.
도 3c는 OSCAR1 또는 OSCAR3를 발현하거나 모의 형질감염된 일차 T 세포에 의한 SAOS 세포의 시험관 내 사멸(BLI-검정)을 나타낸다.
도 4a는 실시예 4에 기재된 바와 같은 복강 내 마우스 모델에 대한 치료 프로토콜을 도시한다.
도 4b는 실시예 4에 기재된 바와 같이 처리된 마우스의 20일째의 OHS 종양 부하(IVIS에 의해 검출된 루시페라제 신호 검출) 및 생존을 도시한다.
도 4c는 실시예 4에 기재된 바와 같이 처리된 각각의 마우스에 대한 루시페라제 신호의 스파이더 플롯(spider plot)이다. OSCAR1 및 OSCAR3는 대부분의 동물에서 종양 성장을 제어할 수 있었던 반면, 종양 재발은 모의 T 세포로 처리된 동물(대조군)과 비교하여 OSCAR3 처리된 동물에 대해 관찰되었다.
도 4d는 실시예 4에 기재된 바와 같이 처리된 마우스의 생존 곡선(카플란-마이어)이다. OSCAR1을 발현하는 T 세포는 종점에서 마우스의 80%를 생존시켰다. OSCAR3을 발현하는 T 세포는 모의 및 식염수 처리된 동물보다 더 잘 수행되었다.
도 5a는 실시예 5에 기재된 바와 같은 폐 전이 종양 모델에 대한 치료 프로토콜을 도시한다.
도 5b는 실시예 5에 기재된 바와 같이 처리된 마우스에서의 종양 진행을 도시한다. 제시된 바와 같이, OSA 종양 성장은 모의 또는 배지 처리 동물에 비해 OSCAR1 또는 OSCAR3를 발현하는 T 세포에 의해 더 오랜 시간 동안 제어되었다.
도 6a는 OSCAR1 또는 OSCAR3를 일시적으로 발현하는 T 세포가 전구 혈액 세포의 콜로니 형성에 어떠한 유의한 영향도 미치지 않았음을 입증한다.
도 6b는 OSCAR1 또는 OSCAR3를 안정적으로 발현하는 T 세포가 전구 혈액 세포의 콜로니 형성에 어떠한 유의한 영향도 미치지 않았음을 입증한다. 콜로니 형성 단위(CFU)-적혈구(E) 적색, CFU-과립구 대식세포(GM) 백색 콜로니, CFU 과립구, 적혈구, 단핵구, 거대핵세포(GEMM) 혼합 콜로니.
도 7은 폐 전이를 시뮬레이션하기 위해 OSA 세포를 사용하는 두 번째 실험에서 OSCAR1 또는 OSCAR3를 발현하는 T 세포의 치료 효과를 입증한다. 사진은 3, 11 및 20일에 촬영된 것이다. 여기서, 대조군 동물에서 골 전이(*)가 검출될 수 있었다.
도 8은 실시예 7의 카플란-마이어 곡선이다.
도 9는 LM-7 세포주를 사용한 또 다른 폐 전이 모델의 생체 내 실험이다. 사진은 13, 21 및 28일에 촬영된 것이다.
도 10은 스페로이드(spheroid)에서 OSCAR1 또는 OSCAR3를 발현하는 T 세포의 세포독성 효과를 입증하며, 여기서 중간의 백색 스팟은 종양 세포(OHS 세포주)를 나타낸다. 맨 위 행은 형질도입되지 않은 T 세포(모의)의 효과를 나타낸다.
도 11은 N-말단에서 C-말단으로의 OSCAR1 및 OSCAR3의 개략적 구조를 시각화한다. 둘 모두의 CAR은 CD8α 힌지에 연결된 scFv를 포함하며, 이는 차례로 CD8α 막횡단 도메인에 연결된다. 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 키메라 항원 수용체(CAR)는 세포 외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 수용체이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 항원 결합 도메인은 생리학적 조건, 특히 종양 환경의 생리학적 조건하에서 세포 외 표적 에피토프에 결합할 수 있는 단백질 모이어티이다. 항원 결합 도메인은 2개의 서열을 포함한다: 항체 경쇄로부터의 하나의 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄로부터의 하나의 가변 도메인(VH). 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본원의 항원 결합 도메인의 표적은 p80일 수 있다. 이러한 항원은 종양과 관련된 신진 모세혈관(budding capillaries)뿐만 아니라 암세포에 의해 발현되는 것으로 보이기 때문에 이는 OS 요법에 대한 적합한 표적으로 생각된다.
VH 및 VL 서열은 이황화 브릿지 또는 펩티드 링커에 의해 연결될 수 있다. 대안적으로, 2개의 서열은 항체의 Fab-단편에 매립될 수 있다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VL-링커-VH를 포함하거나 이로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 항원 결합 도메인은 VH-링커-VL을 포함하거나 이로 구성된다. 상기 항원 결합 도메인은 종종 단일쇄 Fv-단편(scFv)으로 언급된다. 링커는 VH 및 VL이 기능성 항원 결합 도메인을 형성할 수 있도록 특정 길이를 가져야 한다. 일 구현예에서, 링커는 10 내지 30개의 아미노산 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, 링커는 15 내지 25개의 글리신 및/또는 세린 잔기를 포함한다. 일 구현예에서, 링커는 서열
Figure pct00001
(SEQ ID NO 9)로 표시된다.
각각의 VL 및 VH는 프레임워크 서열이 측면에 있는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 프레임워크 서열은 표적 항원에 대한 특이성 및 친화성을 파괴하지 않으면서 일부 변이를 용인할 수 있을 것으로 예상될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기의 치환은 아미노산 잔기의 결실 또는 첨가보다 더 잘 용인될 수 있다. 그러나, CDR은 일반적으로 더 민감하지만, 때때로 특이성 및 친화성을 파괴하지 않고 보존적 치환이 도입될 수 있다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 TP1 scFv-단편을 포함한다. TP1 scFv-단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 TP1 VL 및 TP1 VH를 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 1 또는 SEQ ID NO 1에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 2 또는 SEQ ID NO 2에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 1 또는 SEQ ID NO 1에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 2 또는 SEQ ID NO 2에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하지만; 단, 상기 서열에 대한 임의의 차이는 아미노산 잔기의 보존적 치환의 형태이다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 1 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 1에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 2 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 2에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 1 또는 SEQ ID NO 1에 대해 95% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 2 또는 SEQ ID NO 2에 대해 95% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하지만; 단, 상기 서열에 대한 임의의 차이는 아미노산 잔기의 보존적 치환의 형태이다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 TP3 scFv-단편을 포함한다. TP3 scFv-단편은 링커에 의해 연결된 TP3 VL 및 TP3 VH를 포함한다. 일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 또는 SEQ ID NO 3에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 4 또는 SEQ ID NO 4에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 또는 SEQ ID NO 3에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 4 또는 SEQ ID NO 4에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하지만; 단, 상기 서열에 대한 임의의 차이는 아미노산 잔기의 보존적 치환의 형태이다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 3에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 4 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 4에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 또는 SEQ ID NO 3에 대해 95% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 4 또는 SEQ ID NO 4에 대해 95% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하지만; 단, 상기 서열에 대한 임의의 차이는 아미노산 잔기의 보존적 치환의 형태이다.
본원에서 사용되는 용어 "보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 아미노산 치환을 나타낸다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산은 유사한 특성을 갖는 경향이 있으며, 따라서 폴리펩티드의 구조 또는 기능에 중요한 아미노산의 보존적 치환은 동일 위치에서 비-보존적 아미노산 치환보다 폴리펩티드 구조/기능에 덜 영향을 미칠 것으로 예상될 수 있다. 염기성 측쇄(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄(예를 들어, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신), 비-극성 측쇄(예를 들어, 글리신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판) 및 방향족 측쇄(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함하는 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리가 당 분야에 정의되어 있다. 따라서, 보존적 아미노산 치환은 특정 아미노산 잔기가 동일한 패밀리의 상이한 아미노산 잔기로 치환되는 치환으로 간주될 수 있다.
신규한 키메라 항원 수용체(CAR)가 제공된다. 본원의 CAR이 면역 세포의 표면에서 발현되는 경우, 상기 면역 세포는 의약에 사용될 수 있다. 특히, 상기 면역 세포는 골육종의 치료에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 면역 세포는 전이성 골육종의 치료에 사용된다.
본 발명의 개시의 CAR은 상기 언급된 임의의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 개시의 CAR은 CD8α 힌지에 연결된 상기 언급된 임의의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 개시의 CAR은 CD8α 힌지에 연결된 상기 언급된 임의의 항원 결합 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 CAR은 막횡단 도메인을 추가로 포함하고, 여기서 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 및 OX40 및 CD3ζ 신호전달 도메인으로부터 선택되는 하나의 공동자극 도메인을 포함하거나 이로 구성된다.
일 특정 구현예에서, CAR은 TP1 scFv-단편 또는 TP3 scFv-단편을 포함하는 항원 결합 도메인, 항원 결합 도메인에 연결된 CD8α 힌지 도메인, 힌지 도메인에 연결된 막횡단 도메인 및 막횡단 도메인에 연결된 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하는 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다.
2개의 CAR의 효능 및 안전성이 실시예에서 입증된다. OSCAR1으로 언급되는 하나의 CAR은 N-말단에서 C-말단으로 SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 9-SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 5-SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 7-SEQ ID NO 8로 구성된다. OSCAR3로 언급되는 다른 CAR은 N-말단에서 C-말단으로 SEQ ID NO 3-SEQ ID NO 9-SEQ ID NO 4-SEQ ID NO 5-SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 7-SEQ ID NO 8로 구성된다. OSCAR1 및 OSCAR3의 개략적 구조는 도 11에 시각화되어 있다.
항원 결합 도메인은 막횡단 도메인에 직접 부착될 수 있다. 그러나, CAR은 항원 결합 도메인을 막횡단 도메인에 연결하는 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 따라서, 힌지 도메인은 항원 결합 도메인의 입체적인 입체형태에 영향을 미칠 수 있다. 이는 차례로 표적 에피토프에 결합하고 이후 면역 세포로의 신호전달을 촉발시키는 CAR의 능력에 영향을 미칠 수 있다. 표적 에피토프가 표적 세포의 세포막에서 너무 멀리 위치하고 있거나, 그렇지 않으면 표적 에피토프가 숨겨진 경우, CAR을 발현하는 면역 세포가 효율적이지 않을 수 있다. 따라서, 표적 에피토프는 CAR을 발현하는 면역 세포에 대해 충분히 접근 가능한 것이 바람직하다. 본원에 개시된 CAR에서 SEQ ID NO 5로 표시되는 CD8α 힌지 도메인은 항원 결합 도메인이 표적 에피토프에 결합하도록 하고, 이를 발현하는 면역 세포의 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 다른 CD8α 힌지는 항원 결합 도메인의 유사한 입체적인 입체형태를 허용한다면 잘 작동할 수 있다. 특히, 상기 힌지는 SEQ ID NO 5로 표시되는 CD8α 힌지와 대략 동일한 수의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 특히, CD8α 힌지는 SEQ ID NO 5 또는 이에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열로 표시될 수 있다. 일 구현예에서, 힌지 도메인은 CD28로부터의 것이 아니다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "X% 서열 동일성"은 blastp 알고리즘을 갖는 BLAST®에 의해 정렬되고 비교되는 경우 아미노산 잔기의 X%가 2개의 서열 사이에 동일함을 의미한다.
막횡단 도메인은 세포 외 도메인을 세포 내 신호전달 도메인에 연결한다. 항원 결합 도메인 및 힌지 도메인 둘 모두는 세포 외 도메인이며, 즉, 이들은 일반적으로 면역 세포의 세포막에서 발현되는 경우 세포 외 환경에 직면한다. 본원에서 사용되는 바와 같은, "막횡단 도메인"은 면역 효과기 세포에 의해 발현되는 경우 세포막에 매립되는 경향이 있는 CAR의 일부를 의미한다. 적합한 막횡단 도메인은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 특히, CD8α, CD28 또는 ICOS로부터의 막횡단 도메인이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 막횡단 도메인은 CD28로부터의 것이 아니다. 막횡단 도메인은 항원 결합 도메인에 의한 표적의 결합시 면역 세포로 신호를 전달하는 것으로 생각된다. SEQ ID NO 6으로 표시되는 CD8α 막횡단 도메인은 표적의 결합시 면역 세포로의 신호전달을 허용하는 것으로 밝혀졌다.
"세포 내 신호전달 도메인"은 CAR이 세포막에서 발현되는 경우 면역 세포 내부에 위치한 CAR의 일부를 나타낸다. 이들 도메인은 표적의 결합시 신호 전달에 참여한다. 다양한 신호전달 도메인이 공지되어 있으며, 이들은 면역 세포에서 내인성 신호전달 기구에 맞도록 조합되고 맞춤화될 수 있다.
일 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ, FcR-γ, CD3ε 등으로부터 획득 가능한 신호전달 도메인과 같은 "신호 1" 도메인을 포함한다. 일반적으로, "신호 1" 도메인(예를 들어, SEQ ID NO 8로 표시되는 CD3ζ 신호전달 도메인)은 항원 결합시 신호를 전달하는 것으로 생각된다.
또 다른 구현예에서, 세포 내 신호전달 도메인은 공동자극 도메인을 포함한다. 상기 도메인은 널리 공지되어 있으며, 종종 "신호 2" 도메인으로 언급되며, 이들은 "신호 1" 도메인에 후속하여 공동자극 분자를 통해 신호를 전달하는 것으로 생각된다. "신호 2"는 신호의 유지 및 세포의 생존에 중요하다. 부재하는 경우, 1세대 CAR에서와 같이, 리디렉션된 세포는 사멸 및 초기 사이토카인 방출에 효율적일 수 있지만, 종종 시간이 지남에 따라 고갈될 것이다. 상기 일반적으로 사용되는 "신호 2" 도메인의 예는 4-1BB 신호전달 도메인, CD28 신호전달 도메인, 4-1BB 신호전달 도메인 및 ICOS 신호전달 도메인을 포함한다.
특히, 본원의 CAR을 발현하는 세포독성 면역 세포는 세포 내 신호전달 도메인이 CD3ζ 신호전달 도메인(SEQ ID NO 8) 및 4-1BB 공동자극 도메인(SEQ ID NO 7)을 포함하거나 이로 구성되는 경우 OS 모델에서 생체 내 효과를 제공하는 것으로 밝혀졌다.
본원의 CAR을 발현하는 면역 세포는 백혈구성분채집술 또는 다른 적합한 방법에 의해 환자 또는 적합한 공여자로부터 분리될 수 있다. 상기 일차 세포는, 예를 들어, T 세포 또는 NK 세포일 수 있다. 특히, 자가 T 세포(세포독성 T 세포, T 헬퍼 세포 또는 이들의 혼합물 모두)는 세포를 포함하는 약학적 조성물이 환자에 다시 투여되기 전에 CAR을 인코딩하는 핵산으로 형질도입될 수 있다. CAR을 발현하는 면역 세포는 또한 NK-92 세포와 같은 임상 용도에 적합한 세포주일 수 있다. 물론, 의도된 환자가 인간인 경우 바람직한 세포는 인간 세포이다. 그러나, OS가 개에게도 영향을 미치기 때문에, 본원의 CAR을 발현하는 개 세포는 개에서 OS의 치료에 사용될 수 있다.
본원의 약학적 조성물은 환자에게 치료 세포를 투여하기에 적합한 임의의 조성물일 수 있다. CAR T 세포에 대한 가장 일반적인 투여 경로는 정맥 내 투여이다. 따라서, 상기 약학적 조성물은, 예를 들어, 중성 pH를 갖는 멸균 수용액일 수 있다. 예를 들어, 환자의 말초 혈액 단핵 세포는 표준 백혈구성분채집술 절차를 통해 획득될 수 있다. 단핵 세포는 렌티바이러스 벡터 또는 CAR을 인코딩하는 mRNA로 이들을 형질도입시키기 전에 T 세포에 대해 농축될 수 있다. 이후, 상기 세포는 항-CD3/CD28 항체 코팅된 비드로 활성화될 수 있다. 형질도입된 T 세포는 세포 배양에서 확장되고, 세척되고, 동결보존될 수 있는 멸균 현탁액으로 제형화될 수 있다. 그렇다면, 제품은 투여 전에 해동된다.
골육종의 표적 부위에서 CAR T 세포의 효율적인 접근과 관련된 한 가지 문제는 고형 종양으로부터의 방어를 우회한다는 것이다. 혈액학적 악성종양과 달리, 고형 종양의 인식은 혈액에서 종양 부위로의 탈출을 필요로 하며, 많은 악성종양이 진화하여 T 세포 침윤이 능동적으로 방해된다. 종양이 국소화된 상황에서, 효능을 개선하기 위해 상이한 투여 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, CAR T 세포의 전신 투여보다는 국소 투여가 효능을 향상시킬 수 있다.
약학적 조성물은 약학적으로 효과적인 용량의 본원의 면역 세포를 포함할 수 있다. 약학적으로 효과적인 용량은, 예를 들어, 1 x 106 내지 1 x 109개의 CAR을 발현하는 면역 세포의 범위일 수 있다. 약학적으로 효과적인 용량은, 예를 들어, 1 x 107 내지 5 x 108개의 CAR을 발현하는 T 세포의 범위일 수 있다.
면역 세포에서 청구된 CAR의 효율적인 발현을 위해, 통상적인 선도 펩티드(즉, 신호 펩티드 또는 L-사슬)가 세포막에서의 위치선정을 용이하게 하기 위해 N-말단으로 도입될 수 있다. 선도 펩티드는 잘려진 것으로 생각되며, 세포막의 기능성 CAR에 존재하지 않을 가능성이 높을 것이다. 본원의 CAR을 인코딩하는 핵산은 성공적으로 전사되고, CAR은 선도 펩티드가 SEQ ID NO 10으로 표시되는 경우 세포막으로 성공적으로 전위되는 것으로 밝혀졌다. 이는 도 1에서 시각화된다. 청구된 CAR을 인코딩하는 핵산은, 예를 들어, mRNA 또는 DNA 발현 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터와 같은 널리 공지된 RNA의 형태일 수 있다. 그러나, TP3 scFv를 포함하는 CAR(예를 들어, OSCAR3)은 이를 인코딩하는 mRNA로 형질도입된 T 세포에서 TP1 scFv를 포함하는 달리 동일한 CAR(예를 들어, OSCAR1)보다 더 잘 발현된 것으로 밝혀졌다. 따라서, TP3 scFv를 포함하는 CAR은 mRNA 형질도입을 통한 면역 세포에서의 일시적인 발현에 바람직할 것이다. 특히, OSCAR3를 인코딩하는 mRNA는 T 세포에서 일시적인 발현에 바람직할 수 있다. mRNA 형질도입을 통한 CAR의 일시적 발현은 레트로바이러스 CAR 발현 시스템에 비해 안전성 장점을 갖는다.
또한, TP1 scFv를 포함하는 CAR(예를 들어, OSCAR1)이 공격적인 전이성 OS 모델에서 개선된 장기 생존을 제공한 것으로 밝혀졌다. 따라서, TP1 scFv를 포함하는 CAR은 면역 세포에서 레트로바이러스 발현에 바람직할 수 있다. 특히, OSCAR1을 인코딩하는 레트로바이러스 벡터는 T 세포에서의 장기 발현에 바람직할 수 있다.
일 구현예에서, 핵산은 L-사슬-VL-링커-VH-CD8α 힌지 도메인-CD8α 막횡단 도메인-4-1BB 공동자극 도메인-CD3ζ 신호전달 도메인을 인코딩한다. 일 구현예에서, 핵산은 L-사슬-VH-링커-VL-CD8α 힌지 도메인-CD8α 막횡단 도메인-4-1BB 공동자극 도메인-CD3ζ 신호전달 도메인을 인코딩한다. 일 구현예에서, 골육종의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 항원 결합 도메인이 TP1scFv-단편인 CAR을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, TP1 scFv-단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 TP1 VL 및 TP1 VH를 포함한다.
일 특정 구현예에서, 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2를 포함하고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 골육종의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 TP3 scFv-단편임)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, TP3 scFv-단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 TP3 VL 및 TP3 VH를 포함한다.
일 특정 구현예에서, 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 및 SEQ ID NO 4를 포함하는 scFv이고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 TP1 scFv-단편임)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, TP1 scFv-단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 TP1 VL 및 TP1 VH를 포함한다.
일 특정 구현예에서, 전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2를 포함하는 scFv이고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 TP3 scFv-단편임)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, TP3 scFv-단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 TP3 VL 및 TP3 VH를 포함한다.
일 특정 구현예에서, 전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 및 SEQ ID NO 4를 포함하는 scFv이고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 특정 구현예에서, 전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 또는 이에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열 및 SEQ ID NO 4 또는 이에 대해 80% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 scFv이고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 미세전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 TP1 scFv-단편을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, TP1 scFv-단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 TP1 VL 및 TP1 VH를 포함한다.
일 특정 구현예에서, 미세전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2를 포함하는 scFv이고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 미세전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 TP3 scFv-단편을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일 구현예에서, TP3 scFv-단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 TP3 VL 및 TP3 VH를 포함한다.
일 특정 구현예에서, 미세전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 및 SEQ ID NO 4를 포함하는 scFv이고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 특정 구현예에서, 인간 환자에서 전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 1 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 1에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 2 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 2에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 인간 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 특정 구현예에서, 인간 환자에서 전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 3에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 4 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 4에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 인간 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 특정 구현예에서, 개에서 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 1 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 1에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 2 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 2에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 개 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
일 특정 구현예에서, 개에서 골육종의 치료에 사용하기 위한 CAR(여기서, 항원 결합 도메인은 SEQ ID NO 3 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 3에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열; 및 SEQ ID NO 4 또는 CDR이 변형되지 않는 경우 SEQ ID NO 4에 대해 90% 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 CAR은 CD8α 힌지 도메인, CD8α 막횡단 도메인을 포함하고, 세포 내 신호전달 도메인은 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함함)을 발현하는 약학적으로 효과적인 용량의 개 T 세포 또는 NK 세포를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
국소화된 OS로 진단 받은 많은 환자는 OS 전이가 발달한다. 전이성 OS는 처음에 영향을 받은 뼈에서 기원 부위에서 먼 신체의 하나 이상의 부위로 퍼진 골육종이다. 검출 가능한 OS 전이는 일차 진단 당시 대부분의 환자에 존재한다. 상기 검출된 폐 전이의 외과적 절제에도 불구하고, 임의의 남아 있는 미세전이는 후속 재발 및 궁극적으로 사망을 유발할 수 있다. OS 미세전이는 검출된 폐 전이의 수술적 절제 후 대부분의 환자에 존재하는 것으로 생각된다. 미세전이성 종양은 이들의 작은 크기 때문에 현재 절차에 의해 대부분 검출될 수 없으므로 이름이 미세전이성 OS이다. 그러나, 정맥 내 주입시, 본원의 CAR 발현 면역 세포는 폐로 이동하여 상기 미세전이성 종양에 침투할 수 있다. 특히, CAR T 세포가 OS 미세전이성 종양에서 이들의 표적에 성공적으로 결합하고, T 세포가 성공적으로 활성화되는 경우, 세포독성 효과가 촉발될 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 약학적 조성물은 전이성 OS 및/또는 미세전이성 OS의 대체 요법을 제공할 수 있다.
일 특정 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 골육종의 치료 방법이 제공된다:
a) TP1 scFv-단편을 포함하는 CAR을 인코딩하는 바이러스 벡터로 NK 세포 및/또는 T 세포 집단을 형질도입시키는 단계,
b) 단계 a)의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 골육종으로 진단된 환자에 투여하는 단계.
일 특정 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 골육종의 치료 방법이 제공된다:
a) OSCAR1을 인코딩하는 바이러스 벡터로 NK 세포 및/또는 T 세포 집단을 형질도입시키는 단계,
b) 단계 a)의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 골육종으로 진단된 환자에 정맥 내 투여하는 단계.
일 특정 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 전이성 골육종의 치료 방법이 제공된다:
a) OSCAR1을 인코딩하는 바이러스 벡터로 NK 세포 및/또는 T 세포 집단을 형질도입시키는 단계,
b) 단계 a)의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 전이성 골육종으로 진단된 환자에 정맥 내 투여하는 단계.
일 특정 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 미세전이성 골육종의 치료 방법이 제공된다:
a) OSCAR1을 인코딩하는 바이러스 벡터로 NK 세포 및/또는 T 세포 집단을 형질도입시키는 단계,
b) 단계 a)의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 이전에 전이성 골육종으로 진단된 환자에 투여하는 단계로서, 여기서 검출 가능한 전이가 현재 검출되지 않는, 단계.
일 특정 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 골육종의 치료 방법이 제공된다:
a) TP3 scFv-단편을 포함하는 CAR을 인코딩하는 mRNA로 NK 세포 및/또는 T 세포 집단을 형질도입시키는 단계,
b) 단계 a)의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 골육종으로 진단된 환자에 투여하는 단계.
일 특정 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 골육종의 치료 방법이 제공된다:
a) OSCAR3를 인코딩하는 mRNA로 NK 세포 및/또는 T 세포 집단을 형질도입시키는 단계,
b) 단계 a)의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 골육종으로 진단된 환자에 투여하는 단계.
일 특정 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 전이성 골육종의 치료 방법이 제공된다:
a) OSCAR3를 인코딩하는 mRNA로 NK 세포 및/또는 T 세포 집단을 형질도입시키는 단계,
b) 단계 a)의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 전이성 골육종으로 진단된 환자에 투여하는 단계.
일 특정 구현예에서, 하기 단계를 포함하는 미세전이성 골육종의 치료 방법이 제공된다:
a) OSCAR3를 인코딩하는 mRNA로 NK 세포 및/또는 T 세포 집단을 형질도입시키는 단계,
b) 단계 a)의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 이전에 전이성 골육종으로 진단된 환자에 투여하는 단계로서, 여기서 검출 가능한 전이가 현재 검출되지 않는, 단계.
서열:
SEQ ID NO 1 (박스로 표시된 CDR을 갖는 TP1 VL)
Figure pct00002
SEQ ID NO 2 (박스로 표시된 CDR을 갖는 TP1 VH)
Figure pct00003
SEQ ID NO 3 (박스로 표시된 CDR을 갖는 TP3 VL)
Figure pct00004
SEQ ID NO 4 (박스로 표시된 CDR을 갖는 TP3 VH)
Figure pct00005
SEQ ID NO 5 CD8α 힌지 도메인
Figure pct00006
SEQ ID NO 6 CD8α 막횡단 도메인
Figure pct00007
SEQ ID NO 7 4-1BB 공동자극 도메인
Figure pct00008
SEQ ID NO 8 CD3ζ 신호전달 도메인
Figure pct00009
SEQ ID NO 9 링커
Figure pct00010
SEQ ID NO 10 L-사슬
Figure pct00011
실시예
실시예 1
CAR 설계
2개의 신규한 2세대 CAR을 pENTR 벡터(Invitrogen)에 클로닝하고, 본 발명자의 이전 간행물(
Figure pct00012
et al, PLoS One. 2011;6(11): e27930 및 Inderberg E.M.,
Figure pct00013
S. (2019) Chimeric Antigen Receptor preparation from hybridoma to T-cell expression. Antibody Therapeutics, Volume 2, Issue 2, April 2019, Pages 56-63)에 따라 Gateway 시스템 상용성 발현 벡터, 레트로바이러스 작제물 pMP71 및 mRNA 합성 작제물 pCIpA102로의 재조합에 의해 추가로 서브클로닝하였다.
벡터에 의해 인코딩된 CAR 서열은 L-사슬-VL-사슬-링커-VH-사슬-CD8α 힌지 도메인-CD8α 막횡단 도메인-4-1BB 공동자극 도메인-CD3ζ 신호전달 도메인이었다.
따라서, OSCAR1을 발현시키기 위한 벡터는 SEQ ID NO 10-SEQ ID NO 1-SEQ ID NO 9-SEQ ID NO 2-SEQ ID NO 5-SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 7-SEQ ID NO 8을 인코딩하였다.
OSCAR3를 발현시키기 위한 벡터는 SEQ ID NO 10-SEQ ID NO 3-SEQ ID NO 9-SEQ ID NO 4-SEQ ID NO 5-SEQ ID NO 6-SEQ ID NO 7-SEQ ID NO 8을 인코딩하였다.
실시예 2:
CAR 발현
실시예 1로부터의 OSCAR1 및 OSCAR3의 레트로바이러스 입자를 제조하고, 건강한 공여자 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리된 일차 T 세포를 널리 공지된 방법에 의해 형질도입시켰다(
Figure pct00014
et al, PLoS One. 2011;6(11):e27930). 48시간 후, CAR의 존재를 항-마우스 Fab 항체(항-CAR)를 사용한 흐름세포측정법에 의해 분석하였다. 결과는 도 1에 포함되어 있다.
하기 실시예에서, OSCAR1 또는 OSCAR3를 발현하는 T 세포를 형질도입되지 않은 T 세포(모의)와 비교한다. T 세포는 일부 도면에서 Tc로 약칭된다. 따라서, "OSCAR1 Tc" 및 "Tc OSCAR-1" 둘 모두는 OSCAR1을 발현하는 T 세포를 의미한다. 따라서, "OSCAR3 Tc" 및 "Tc OSCAR-3" 둘 모두는 OSCAR3을 발현하는 T 세포를 의미한다.
실시예 3
시험관 내 CAR 기능(사멸 및 사이토카인 방출)
T 세포 단독(모의), OSCAR1을 발현하는 T 세포 및 OSCAR3를 발현하는 T 세포를 표시된 표적 세포와 함께 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 상층액을 수확하고, 사이토카인 존재를 BioPlex에 의해 검출하였다. 제시된 바와 같이, OSCAR 리디렉션된 세포는 특정 자극시 TNFα 및 IFNγ 방출에 대해 강하게 활성화되었다.
표적 세포주의 시험관 내 사멸:
20시간 동안 OSCAR1 또는 OSCAR3를 발현하는 T 세포와 골육종 세포주(OHS, SAOS-2, OSA)를 인큐베이션함으로써 표적 세포주의 시험관 내 사멸이 입증되었다. 모든 표적 세포는 GFP에 융합된 루시페라제 유전자를 항시적으로 발현하였으며, 루시페라제의 존재는 공지된 방법에 의해 루시페라제 기질의 첨가시 세포 사멸을 검출하는 데 사용된다(Walseng et al, Sci Rep. 2017 Sep 6;7(1):10713). T 세포 사멸을 표적 세포에서 루시페라제 신호의 변화를 측정함으로써 모니터링하였다(BLI 검정). 결과는 도 3a, 3b 및 3c에 제시된다.
실시예 4
생체 내 CAR 기능(이종이식 모델)
CAR 효능을 평가하기 위해, 인간 골육종 세포주가 마우스에 생착된 동물 모델을 사용하였다. 생착을 루시페라제 유전자를 발현하는 106개의 OHS 세포의 복강 내 주사에 의해 수행하였다. 종양이 만져질 수 있게 되는 경우, 마우스를 무작위하하고, OSCAR1 또는 OSCAR3로 리디렉션되거나 리디렉션되지 않은 T 세포로 처리하거나 처리하지 않았다. 10X106 T 세포의 3회 주사를 수행하고, 종양 성장을 IVIS(루시페라제 신호 검출)로 모니터링하였다. 또한, 마우스 생존을 또한 연구하였다. 조건: 그룹 당 5마리의 마우스, N=2.
도 4a는 치료의 프로토콜 및 타임 라인을 도시한다. 도 4b는 좌측에 표시된 바와 같이 처리된 마우스의 IVIS 사진(여기서는 20일)의 예이다. 제시된 바와 같이, OSCAR1 및 OSCAR3 처리된 동물은 20일에 매우 낮거나 검출 불가능한 종양 부하를 나타내었다. 도 4c는 각각의 동물에 대한 루시페라제 신호의 스파이더 플롯이며, 이는 OSCAR 작제물이 종양 발달을 제어할 수 있었음을 제시한다. 이는 도 4d의 생존 곡선(카플란-마이어)과 일치하였으며, 이는 OSCAR1 처리된 동물의 80%가 종점에서 살아 있었음을 제시한다. OSCAR3 처리된 동물은 모의 및 식염수 처리된 동물보다 더 잘 수행하였고, 생존 곡선에서 OSCAR1 동물과 통계적으로 상이하지 않았다.
실시예 5
생체 내 CAR 기능(이종이식 모델)
본 발명자는 또한 nod-scid 마우스가 도 5a에 도시된 바와 같이 OSA(루시페라제 +) 세포주로 정맥 내(iv) 주사된 폐 전이 종양 모델을 사용하였다. 이러한 세포주는 폐에서 콜로니화하였고, 약 25-30일 후에 동물 사망을 초래하는 공격적인 종양을 확립하였다. 4일 후, 종양 부하는 폐에서 검출 가능하였고, 마우스를 무작위화하고, OSCAR T 세포로 처리하였다. 106개의 OSCAR-리디렉션된 T 세포를 마우스에 4회 iv 주사하였고, 종양 진행을 IVIS로 분석하였다. 제시된 바와 같이, 종양 성장은 모의 또는 배지 처리된 동물과 비교하여 OSCAR1 및 OSCAR3에 의해 더 긴 시간 동안 제어되었지만, 동물은 결국 종양을 발달시켰다. 카플란 마이어 곡선은 이러한 공격적 모델에서 동물을 구제할 수 없었지만 상기 보호 효과를 통계적으로 확인한다.
실시예 6
CAR 안전성
CAR 요법은 위험한 요법으로 간주될 수 있다. 이는 주로 제공된 작제물이 건강한 조직에 대해 가질 수 있는 예측할 수 없는 표적화 때문이다. OSCAR1 및 OSCAR3의 특이성을 시험하기 위해, 조혈 세포에 대한 일련의 시험을 수행하였다. 검정은 줄기 세포의 공급원으로서 공여자로부터 골수를 분리하는 것으로 구성된다. 동일한 공여자로부터의 혈액을 채취하고, T 세포를 분리하고, 줄기 세포와 공동 인큐베이션하기 전에 관심 CAR로 변형시켰다. 이후, 콜로니를 각각의 유형의 혈액 전구세포를 확장하기 위해 상이한 배지에서 성장하도록 두었다. 콜로니가 보여지는 경우, 이들을 계수하고 대조군과 비교하였다.
2명의 공여자로부터의 T 세포를 표시된 CAR 작제물의 mRNA로 전기천공하거나 모의 전기천공하였다. 도 6a에 제시된 바와 같이, OSCAR1 또는 OSCAR3은 콜로니 형성에 어떠한 영향도 미치지 않았으며, 이는 이들의 표적이 전구 혈액 세포에 존재하지 않음을 시사한다. 본 발명자는 OSCAR1 또는 OSCAR3를 안정적으로 발현하는 자가 T 세포를 사용하는 경우 이들 데이터를 확인하였으며, 여기서 다시 통계적 효과가 검출되지 않았으며(도 6b 참조), 이는 OSCAR이 조혈 줄기 세포를 사멸시키지 않았음을 시사한다.
실시예 7
사진이 제시(도 7 참조)된 실시예 5와 동일한 실험은 대조군 동물(*)에서 골 전이의 존재를 입증하는 반면, OSCAR 처리된 동물은 종양 발달을 제어하였다.
실시예 8
실시예 7에 기초한 카플란-마이어 생존 곡선은 OSCAR1 및 OSCAR3 둘 모두가 폐에서 종양 성장을 제어할 수 있고, 따라서 동물 생존을 연장시킬 수 있음을 입증한다(도 8 참조). OSA는 매우 공격적인 세포주이며(Lauvrak et al. Br J Cancer. 2013 Oct 15; 109(8): 2228-2236.), 이러한 실험은 상기 모델에서 CAR T 세포의 효능을 처음으로 입증할 수 있음을 주목한다.
실시예 9
본 발명자는 대안적이고 덜 공격적인 폐 전이 종양 모델을 사용하였다. Nod-scid 마우스는 LM-7(루시페라제 +) 세포주를 정맥 내(iv) 주사하였고, 이는 또한 시험관 내에서 OSCAR1 및 OSCAR3에 의해 인식되고, OSA보다 느린 폐 전이를 형성한다. iv 주사 후, 이러한 세포주는 폐에서 콜로니화하였고, 약 40-50일 후에 동물 사망을 초래하는 공격적인 종양을 확립하였다. 마우스를 처리 5일 후에 무작위하하였고, OSCAR T 세포로 처리하였다. 106개의 OSCAR-리디렉션된 T 세포를 마우스에 4회 iv 주사하였고, 종양 진행을 IVIS로 분석하였다. 도 9에 제시된 바와 같이, 종양 성장은 모의에 비해 OSCAR에 의해 제어되었으며, 이는 형질도입된 세포의 우수한 효능을 뒷받침한다.
실시예 10
5천개의 골육종 세포(OHS 세포주) 유래 종양 스페로이드를 7일 동안 성장시키고, 형광의 살아 있는 세포 현미경검사(GFP=백색)로 모니터링하였다. T 세포(모의 또는 OSCAR 발현)를 첨가하고, GFP 신호를 분석하기 위해 정기적인 시점에 사진을 찍었다. 도 10에 제시된 바와 같이, OSCAR1 또는 OSCAR3를 발현하는 T 세포는 스페로이드 내부의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Oslo Universitetssykehus HF <120> New CARs and their use in medicine <130> P26318PC00 <160> 10 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> TP1 immunoglobulin light chain variable region <400> 1 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Gly Val Gly Ser Ala 20 25 30 Ile Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Thr Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Trp Ala Ser Ile Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> TP1 immunoglobulin heavy chain variable region <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Gly 20 25 30 Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Asp Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 His Leu Lys Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Ala Tyr Tyr Gly Ser Ser Leu Ser Met Gly Asn Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Ala Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 111 <212> PRT <213> TP3 immunoglobulin light chain variable region <400> 3 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Gly 20 25 30 Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro 65 70 75 80 Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Glu 85 90 95 Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110 <210> 4 <211> 125 <212> PRT <213> TP3 immunoglobulin heavy chain variable region <400> 4 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asp Ile Asn Pro Asn Tyr Asp Ser Thr Arg Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Val Ser Ser Tyr Gly His Asp Tyr Ala Met 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 5 <211> 55 <212> PRT <213> CD8alpha hinge domain <400> 5 Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro 1 5 10 15 Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 20 25 30 Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 35 40 45 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 50 55 <210> 6 <211> 21 <212> PRT <213> CD8alpha transmembrane domain <400> 6 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr 20 <210> 7 <211> 47 <212> PRT <213> 7 4-1BB costimulatory domain <400> 7 Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe 1 5 10 15 Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly 20 25 30 Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 45 <210> 8 <211> 113 <212> PRT <213> CD3zeta signaling domain <400> 8 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 50 55 60 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu 65 70 75 80 Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr 85 90 95 Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro 100 105 110 Arg <210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Linker <400> 9 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 10 <211> 20 <212> PRT <213> L-chain <400> 10 Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Ser Thr Gly 20

Claims (15)

  1. 항원 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    상기 항원 결합 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결된 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2를 포함하고,
    상기 힌지 도메인이 CD8α 힌지 도메인을 포함하고,
    상기 세포 내 신호전달 도메인이 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR).
  2. 제1항에 있어서, 힌지 도메인이 SEQ ID NO 5로 표시되는 CAR.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 막횡단 도메인이 SEQ ID NO 6로 표시되는 CAR.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 신호전달 도메인이 CD3ζ 신호전달 도메인 및 공동자극 도메인을 포함하는 CAR.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 신호전달 도메인이 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하는 CAR.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 내 신호전달 도메인이 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 공동자극 도메인으로 구성되는 CAR.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항원 결합 도메인이 펩티드 링커에 의해 연결된 SEQ ID NO 1 및 SEQ ID NO 2를 포함하고, 힌지 도메인이 SEQ ID NO 5로 표시되고, 막횡단 도메인이 SEQ ID NO 6로 표시되고, 세포 내 신호전달 도메인이 4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인을 포함하는 CAR.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 인코딩하는 핵산.
  9. 제8항에 따른 핵산으로 형질도입된 면역 세포.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 CAR을 발현하는 면역 세포.
  11. 면역 세포가 T 세포 또는 NK 세포인 제9항 또는 제10항에 따른 면역 세포를 포함하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 골육종의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  13. 제11항에 있어서, 전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 미세전이성 골육종의 치료에 사용하기 위한 약학적 조성물.
  15. a) 제8항에 정의된 핵산으로 NK 세포 및/또는 T 세포 집단을 형질도입시키는 단계, 및
    b) 약학적으로 효과적인 용량의 단계 a)의 세포를 포함하는 약학적 조성물을 전이성 골육종으로 진단된 환자에 정맥 내 투여하는 단계를 포함하는,
    전이성 골육종의 치료 방법.
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