KR20210129696A - 안정적인 단백질 제형 (Stable Protein Formulations) - Google Patents

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테오도어 에스. 리오타스
케이타 오쿠다
Original Assignee
아마노 엔자임 유에스에이 씨오., 엘티디.
아마노 엔자임 가부시키가이샤
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Abstract

본 명세서에 기술된 것은 pH가 약 3.5 내지 약 7.0이고 단백질의 침전에 대해 안정적인 단백질 용액, 뿐만 아니라 그러한 안정적인 단백질 용액을 제조하는 방법, 및 그러한 안정적인 단백질 용액을 포함하는 인간 또는 동물의 소비를 위한 음료 및 음료 첨가제이다. 이러한 안정적인 단백질 용액은 단백질, 안정제 및 단백질 탈아미드화 효소를 포함한다.

Description

안정적인 단백질 제형 (Stable Protein Formulations)
본 발명은 단백질의 침전에 대해 안정적이며 pH 7 이하를 갖는 단백질 용액 및 그의 제조 방법과, 그것이 음료 혹은 음료 첨가물에 쓰이는 용도에 관한 것이다. 본 출원은 2019년 2월 26일에 출원된 WO 특허 출원 제 2020/176469A1 호에 기초한 우선권을 주장하는 것이며, 당해 특허 출원의 전체 내용은 참조에 의해 원용된다.
최근 단백질이 풍부한 식품과 단백질이 풍부한 채식 및 비건 제품에 대한 수요가 증가하고 있다. 특히 식물성 단백질 및 기타 비 동물성 단백질을 포함하는 단백질이 풍부한 음료 및 음료 첨가제에 대한 수요가 증가하고 있다. 한편, 이러한 단백질을 용액, 특히 음료에 일반적으로 사용되는 pH 7 이하의 용액 내에서 제조하는 것은 단백질의 pH 7 이하라는 낮은 용해도 때문에 어렵다. 따라서, pH 7 이하에서 단백질의 침전에 대해 안정적인 단백질 용액이 필요하다.
미국 등록특허 제 6,756,221호 미국 등록특허 제 6,251,651호 미국 등록특허 제 7,462,477호 미국 등록특허 제 8,735,131호
본 명세서에 기술된 안정적인 단백질 용액은 음료 및 음료 첨가제의 일반적인 pH인 pH 7 이하의 용액에서 단백질을 제형화하는 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 예를 들어, 기능성 음료 및 스포츠 음료를 포함한 많은 음료는 과즙 및/또는 야채즙 또는 그 향을 함유하고 pH가 약 7에서 약 3.5와 같이 pH가 7 이하로, 이러한 음료에 단백질이 제형화되면 용액에서 침전되는 경향이 있다. 이론에 얽매이지 않고 보면, 이러한 침전은 음료의 pH가 단백질의 등전점에 가까워 단백질의 불안정화와 침전 및 침강(sedimentation)을 유발하기 때문인 것으로 추측된다. 단백질 침전은 소비자가 이용하기에 적합하지 않을뿐더러 풍미 마스킹 (flavor-masking) 옵션 및 기타 제형 옵션을 제한한다. 본 명세서에 기술된 용액의 안정성은과일 주스와 같은 산성 주스에서 단백질 용액을 산성 pH에서도 제형화할 수 있게 해준다. 뒤의 예시들에서 도시되듯이, 본 명세서에 기술된 용액은 산성 pH에서의 침전에도 안정적이다. 그러므로 본 명세서에 기술된 용액은, 단백질이 들어 있는 과일즙 음료, 과일향 음료 또는 음료 첨가제를 제공하기 위해, 과일 즙 같은 산성 즙에서 단백질 용액을 제형화할 수 있게 한다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 명세서에 기술된 단백질 용액은 (i) 단백질; (ii) 안정제; 및 (iii) 단백질 탈아미드 효소를 포함하며 약 3.5 내지 약 7.0의 pH를 갖고 단백질의 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 (i) 용액의 부피를 기준으로 약 0.1% 내지 약 30% w/v의 단백질; (ii) 용액의 부피를 기준으로 약 0.001% 내지 5% w/v의 안정제; 및 (iii) 용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 0.5 U 내지 50 U 단백질 탈아미드 효소 활성 또는 약 0.1% 내지 10% w/w의 단백질 탈아미드 효소를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 (i) 용액의 부피를 기준으로 약 0.1% 내지 30% w/v의 단백질, (ii) 용액의 부피를 기준으로 약 0.001% 내지 약 1% w/v의 안정제, (iii) 용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 5 U 내지 약 50 U의 단백질 탈아미드 효소 활성 또는 약 1% 내지 10% w/w 의 단백질 탈아미드 효소를 포함한다. 일부 실시 예에서 상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 약 5% 내지 15% w/v의 단백질을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 약 0.02% 내지 0.5% w/v의 안정제를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 1% w/w 내지 약 5% w/w의 단백질 탈아미드 효소를 포함한다.
일부 실시 예에서, 상기 단백질은 식물 단백질 (예: 콩, 완두콩, 렌틸콩, 병아리 완두콩, 레귐, 대마, 쌀, 견과류, 밀 및 땅콩 단백질과 아몬드 단백질을 포함하는 글루텐 단백질), 유제품 단백질 (예: 유청 단백질) 및 곤충 단백질 (예: 귀뚜라미, 땅강아지, 누에, 붉은야자나무바구미, 메뚜기, 전갈, 잠수 딱정벌레, 잔날개바퀴, 지렁이, 갈색거저리 및 거미 단백질 중 하나 이상) 에서 선택된 하나 이상을 포함한다.
일부 실시 예에서, 상기 안정제는 하나 이상의 잔탄검, 젤란검, 카라기난검, 카시아검, 로커스트콩검, 타라 검, 사일리움씨드검, 젤라틴, 타마린드씨검, 아라비아검, 알지네이트, 프로필렌글리이콜알지네이트, 펙틴, 갈락토만난 (구아검), 풀루란, 메틸 셀룰로오스 (MC), 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 및 이들의 유도체 또는 조합과 같이 하나 이상의 검 성분, 다당류 및 콜라겐을 포함한다.
일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질의 아스파라긴 및/또는 글루타민 잔기의 아미도기를 탈아미드화하며, 예컨대 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 또는 단백질 아스파라기나제 탈아미드효소이다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 크리세오박테리움(Chryseobacterium), 플라보박테리움 (Flavobacterium), 엔페도박터(Enpedobacter), 스핑고박테리움(Sphingobacterium), 아우레오박테리움(Aureobacterium), 미로이데스(Myroides), 사이토파갈레스(Cytophagales), 방선균(Actinomycetes) 및 플라보박테리아과(Flavobacteriaceae) 중 선택된 박테리아에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 페니실리움 (Penicillium) 미생물에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소인 프로테인 글루타미나아제 아마노 500 (PGA 500)이다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소인 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성이 있고 단백질 탈아미드 효소 활성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35, 38-43, 45, 46, 49, 79-84, 103-106, 117, 142, 143, 146, 166, 또는 185에서 하나 이상의 치환 또는 결실을 갖는 서열 번호 1의 변이 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%의 동일성을 가지며 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35, 38-43, 45, 46, 49, 79-84, 103-106, 117, 142, 143, 146, 166, 185에서 하나 이상의 치환 또는 결실을 갖고 단백질 탈아미드 효소 활성이 있는 서열 번호 1의 변이 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시 예에서, 상기 용액은 약 4.0 내지 약 7.0 또는 약 4.0 내지 약 5.0의 pH를 갖는다.
일부 실시 예에서, 상기 용액은 7일, 14일, 21일, 1개월, 2개월, 6개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월 및 12개월 중 선택되는 기간 동안 4 ° C에서 저장 후 단백질의 가시적인 침전에 대해 안정적이다.
일부 실시 예에서, 상기 용액은 인간 또는 동물의 소비를 위한 음료 또는 음료 첨가제로 제형화된다.
또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 안정적인 단백질 용액을 포함하는, 인간 또는 동물의 소비를 위한 음료 또는 음료 첨가제가 제공된다. 일부 실시 예에서, 상기 음료 또는 음료 첨가제는 영양 음료, 스포츠 음료, 기능성 단백질 음료, 유제품 음료, 유제품 스무디, 과일 음료, 과일 스무디, 커피 음료, 차 음료, 식물성 우유, 유제품 크리머 및 비유제품 크리머 중에서 선택된다. 일부 실시 예에서, 상기 음료 또는 음료 첨가제는 하나 이상의 산성 즙, 과일즙, 산성 농축물 또는 과일즙 농축물을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 음료 또는 음료 첨가제는 하나 이상의 야채 즙 또는 야채 농축물을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 음료 또는 음료 첨가제는 하나 이상의 산성 과일 또는 야채 즙, 또는 산성 과일 또는 야채 즙 농축물을 포함한다.
또한, (a) 상기 단백질 및 상기 안정제를 포함하는 용액에 단백질 탈아미드 효소를 첨가하여 혼합물을 수득하는 단계, (b) 상기 혼합물을 배양하는 단계; 및 (c) 상기 혼합물을 산성화하여 pH가 약 3.5 내지 약 7.0 인 용액을 얻는 단계를 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같은 안정적인 단백질 용액, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 음료 또는 음료 첨가제를 제조하는 방법이 제공된다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 (i) 상기 단백질을 포함하는 용액 및 (ii) 상기 안정제를 포함하는 용액을 혼합하여 준비된다. 일부 실시 예에서, 상기 배양은 상기 효소 반응이 원하는 수준에 도달할 때까지 수행되며, 이는 상기 용액 내 유리 암모늄 이온의 농도에 의해 임의로 결정된다. 일부 실시 예에서, 상기 배양은 약 30 ° C 내지 약 70 ° C의 온도 및 약 0.5시간 내지 약 48시간의 기간 동안 필요에 따라 교반하며 약 3.0 내지 약 8.0의 pH에서 선택적으로 이루어진다. 일부 실시 예에서, 상기 배양은 약 40 ° C 내지 약 60 ° C의 온도 및 약 3시간 내지 약 24시간의 기간 동안 필요에 따라 교반하며 약 5.0 내지 약 8.0의 pH에서 선택적으로 이루어진다. 일부 실시 예에서, 상기 산성화는 산성 즙 또는 농축물을 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 프로테인 글루타미나아제 아마노 500 (PGA 500)이고/이거나, 본 명세서에 기재된 바와 같은 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 변이체를 갖고, 상기 배양은 3시간 동안 50°C에서 이루어진다.
일부 실시 예에서, 상기 공정은 상기 용액을 약 10분 동안 약 85°C에서 열처리하는 것을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 공정은 균질화, 저온 살균 및 멸균 중 하나 이상의 처리 방법을 상기 용액에 적용하는 것을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 균질화는 약 2,000 psi 내지 약 2,500 psi를 포함하여 약 2,000 psi 내지 약 20,000 psi의 압력에서 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 저온 살균은 약 100°C에서 약 10초 내지 약 20초 동안 고온단시간살균(HTST), 약 120°C에서 약 1초 내지 약 3초 동안 초고온 살균(UHT), 또는 약 75°C 내지 약 85°C에서 약 10분 내지 약 20분 동안 저온 장시간 (LTLT) 저온 살균을 사용하여 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 멸균은 고압 (hyperbaric) 멸균을 사용하여 수행된다.
실시 예에서 명시된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 용액은 산성 pH에서도 침전에 대해 안정적이다. 따라서, 본 명세서에 기술된 용액은 산성 즙에서 또는 산성 즙과 함께 단백질을 포함하는 과일 즙 음료, 과일 향 음료 또는 음료 첨가제를 제공하기 위해 산성 액체에서 단백질 용액을 제형화할 수 있게 한다.
도 1은 (i) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 및 검 성분; (ii) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소; (iii) 검 성분을 포함하는; 및 (iv) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소와 검 성분이 포함되지 않은 완두콩 단백질 제형의 pH에 따른 흡광도이다.
도 2는 (i) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 및 검 성분; (ii) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소; (iii) 검 성분을 포함하는; 및 (iv) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소와 검 성분이 포함되지 않은 대두 단백질 제형의 pH에 따른 흡광도이다.
도 3은 (i) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 및 검 성분; (ii) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소; (iii) 검 성분을 포함하는; 및 (iv) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소와 검 성분이 포함되지 않은 대마 단백질 제형의 pH에 따른 흡광도이다.
도 4는 (i) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 및 검 성분; (ii) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소; (iii) 검 성분을 포함하는; 및 (iv) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소와 검 성분이 포함되지 않은 땅콩 단백질 제형의 pH에 따른 흡광도이다.
도 5는 (i) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 및 검 성분; (ii) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소; (iii) 검 성분을 포함하는; 및 (iv) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소와 검 성분이 포함되지 않은 귀뚜라미 단백질 제형의 pH에 따른 흡광도이다.
도 6은 (i) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 및 검 성분; 및 (ii) 검 성분을 (단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 제외) 단독으로 포함하는 균질화된 완두콩 단백질 제형의 흡광도이다.
도 7은 (i) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 및 검 성분; 및 (ii) 검 성분을 (단백질 글루타미나제 탈아미드 효소 제외) 단독으로 포함하는 즙 농축물을 함유한 균질화된 대두 단백질 제형의 흡광도이다.
도 8은 (i) 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 및 검 성분; 및 (ii) 검 성분을 단독으로 (단백질 글루타미나아제 탈아미드화 효소 없음) 포함하는 즙 농축물을 함유한 균질화된 땅콩 단백질 제형의 흡광도이다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 본 명세서에서는 당업자에게 알려진 다양한 방법을 참조한다. 당업자에게 공지된 적합한 재료 및/ 또는 공정은 본 개시를 수행하는데 이용될 수 있다. 그러나 본 명세서에서 특정된 재료 및 공정은 설명 용으로만 설명된다. 하기 설명 및 실시 예에서 언급된 물질, 시약 등은 달리 언급하지 않는 한 상업적 공급원으로부터 얻을 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 단수만을 지정하도록 명시적으로 언급되지 않는 한 단수 및 복수를 모두 지정한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 숫자 또는 범위가 제시된 정확한 숫자 또는 범위로 제한되지 않고, 다음에 따라 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 인용된 숫자 또는 범위 주위의 값을 포함함을 의미한다. 숫자 또는 범위가 사용되는 문맥. 문맥 또는 당업계의 관례에서 달리 명백하지 않는 한, "약"은 특정 항목의 최대 플러스 또는 마이너스 10%를 의미한다.
단백질, 안정화제, 및 단백질 탈아미드화 효소를 포함하는 안정적인 단백질 용액이 본 명세서에 기술되며, 여기서 상기 단백질 용액은 pH가 약 3.5 내지 약 7.0이고 단백질의 침전에 대해 안정적이다. 또한 이러한 용액을 포함하는 음료 및 음료 첨가제가 본 명세서에 기재되어 있으며, 이러한 안정적인 단백질 용액의 제조 방법 및 이를 포함하는 음료 또는 음료 첨가제의 제조 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "단백질의 침전에 대해 안정적이다"는 단백질의 가시적인 침전이 없음을 의미한다. 일부 실시 예에서, 약 280nm에서의 흡광도를 평가함으로써 가시적 침전이 확인되지 않으며, 여기서 증가된 흡광도는 가용화된 단백질 및 침전이 나타나지 않는 것과 상관관계가 있다. 본 명세서에 기재된 단백질 농도(침전이 없는 상태)를 갖는 용액의 경우, 약 280nm에서의 전형적인 흡광도는 약 8 내지 50 mg 단백질/mL 범위이다.
본 명세서에 기술된 안정적인 단백질 용액은 단백질 탈아미드 효소와 안정제의 독특한 조합을 사용하여 상기에서 언급된 문제를 해결한다. 프로테아제 효소는 이전에 사용되어 왔지만, 기질 단백질의 효소 분해로 인한 원치 않는 풍미를 가진 화합물의 형성으로 인해 사용이 제한된다. 특정 검 안정제 및 유화제는 이전에 사용되었지만, 이들은 응고, 층화 및 침전과 같은 원치 않는 현상이 나타나는 고농도 (예: 2-5% w/v)에서만 효과적이다. 또한 이러한 고농도에서 안정제를 사용하면 소비자가 사용하기에 바람직하지 않은 고점도의 최종 제품이 생성된다. 반면 본 명세서에 기술된 용액은 약 10 내지 약 250 mPa·s 범위의 점도와 같은 음료 및 음료 첨가제에 사용하기에 허용 가능한 점도를 갖는다. (참고로 우유는 점도가 약 2-3 mPa·s이고, 대부분의 식물성 기름은 점도가 약 40-50 mPa.s이며, 초콜릿 소스는 점도가 약 280 mPa·s이다.)
이론에 얽매이지 않고 보면, 본 명세서에 기술된 상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질에서 글루타민 및/또는 아스파라긴 잔기와 같은 아미노산 잔기를 탈아미드화하여, 단백질의 음전하를 증가시키며 단백질의 등전점을 감소시키고 산성 pH 값에서 용해도를 증가시키는 것으로 알려져 있다. 결과적으로 산성 pH에서 단백질 용해도가 향상된다. 또한 이론에 얽매이지 않고 보면, 본 명세서에 기술된 특정 단백질 탈아미드화 효소는 단백질의 글루타민 잔기를 글루탐산으로 및/또는 단백질의 아스파라긴 잔기를 아스파르트산으로 전환하는 것을 포함하여, 단백질에서 아미노산 잔기의 아미도 그룹을 탈아미드화하는 것과 같이 펩티드 결합을 파괴하지 않고 단백질을 탈아미드화함으로써, 원치 않는 풍미 화합물을 생성하지 않고도 단백질 용해도를 증가시킨다.
효소 처리만으로도 단백질 용해도를 어느 정도 높일 수 있지만, 전형적인 소비자 음료 및 음료 첨가제의 장기 보관 방법과 같이, 장기간에 걸쳐 pH 7 이하에서 단백질 침전에 대해 안정적인 용액을 제공하려면 추가적인 제형화 접근법이 필요하다. 따라서 본 명세서에 기재된 용액은 단백질 용액의 안정성을 추가로 촉진하고, 4 °C 에서 4개월 또는 8개월과 같이 7일, 14일, 21일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 12개월과 같은 장기간 냉장 조건 하에서 pH가 약 3.5 내지 약 7이며 단백질의 침전에 대해 안정적인 용액의 제조를 허용하는 안정제를 포함한다. 이전에 기술된 제형과 달리, 본 명세서에 기술된 상기 용액은 상대적으로 적은 양의 안정제만을 필요로 하기 때문에, 본 명세서에 기술된 안정제의 사용은 용액의 물리 화학적 특성을 손상시키거나 소비자가 사용하기에 적합하지 않도록 하는 응고, 층화, 침전, 또는 고점도와 같은 현상을 유발하지 않도록 한다.
본 명세서에 기재된 용액은 균질화될 수 있고, 하기 실시 예에 예시된 바와 같이 균질화 후 단백질 침전에 대한 안정성을 나타낼 수 있다. 따라서 상기 균질화 과정이 단백질-단백질 상호 작용의 변화를 유발할 수 있지만, 본 명세서에 기술된 용액에 제형화된 단백질은 균질화 후에도 용액에 남아있을 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 특정 실시 예에 따라, (i) 단백질; (ii) 안정제; 및 (iii) 단백질 탈아미드 효소를 포함하며 약 3.5 내지 약 7.0의 pH를 갖는 단백질의 침전에 대해 안정적인 단백질 용액이 제공된다. 본 발명의 구체적인 실시 예는 아래에서 더 상세히 논의된다.
단백질
본 명세서에 기술된 바와 같이 제형화될 수 있는 단백질은 제한되어 있지 않지만, 구체적인 실시 예는 인간 또는 동물의 소비에 적합한 동물, 식물, 유제품 및 곤충 단백질을 포함하여 인간 또는 동물 소비에 적합한 단백질을 포함한다. 일부 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 용액은 식물 단백질, 유제품 단백질 및 곤충 단백질로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함한다.
적합한 식물 단백질의 예는 콩, 완두콩, 렌틸콩, 병아리콩, 레귐, 대마, 쌀, 견과류, 밀 및 글루텐 단백질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시 예에서, 상기 식물 단백질은 콩, 완두콩, 렌틸콩, 병아리콩, 레귐, 대마, 쌀, 견과류, 밀 및 글루텐 단백질 중 하나 이상으로부터 선택된다. 일부 실시 예에서, 상기 견과류는 땅콩, 아몬드 또는 개암이다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질은 완두콩 단백질을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질은 대두 단백질을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질은 땅콩 단백질을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질은 대마 단백질을 포함한다.
적합한 유제품 단백질의 예는 유청 단백질을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질은 유청 단백질을 포함한다.
적합한 곤충 단백질의 예는 귀뚜라미, 땅강아지, 누에, 붉은야자나무바구미, 메뚜기, 전갈, 잠수 딱정벌레, 잔날개바퀴, 지렁이, 갈색 거저리 및 거미 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질은 귀뚜라미, 땅강아지, 누에, 붉은야자나무바구미, 메뚜기, 전갈, 잠수 딱정벌레, 잔날개바퀴, 지렁이, 갈색 거저리 및 거미 단백질 중 하나 이상으로부터 선택된 곤충 단백질을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질은 귀뚜라미 단백질을 포함한다.
안정제
위에서 언급한 바와 같이, 본 명세서에서 기술된 상기 용액은 안정제를 포함한다. 적합한 안정제의 예는 하이드로콜로이드 (검류), 다당류 및 콜라겐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시 예에서, 상기 안정제는 검, 다당류 및 콜라겐 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 안정제는 잔탄검, 젤란검, 카라기난검, 카시아검, 로커스트콩검, 타라검, 사일리움씨드검, 젤라틴, 타마린드시드검, 아라비아검, 알지네이트, 프로필렌글리이콜알지네이트, 펙틴, 갈락토만난 (구아검), 풀루란, 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 메틸셀룰로오스 (MC) 및 이들의 유도체 또는 조합 중 하나 이상을 포함한다. 특정 실시 예에서, 상기 안정제는 잔탄검, 젤란검, 카라기난검, 타라검, 펙틴, 알지네이트 및 CMC 중 선택된다. 일부 실시 예에서, 상기 안정제는 젤란검을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 안정제는 카라기난검을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 안정제는 펙틴검을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 안정제는 잔탄검을 포함한다. 하기 예에서 예시된 바와 같이, 상이한 안정제는 상이한 pH 범위 또는 값에서 더 효과적일 수 있으므로 안정제의 선택은 최종 제품의 pH에 따라 결정될 수 있다.
단백질 탈아미드 효소
상기에서 언급된 바와 같이, 본 명세서에 기재된 상기 용액은 단백질 탈아미드 효소를 포함한다. 본 명세서에 사용된 "단백질 탈아미드 효소"는 단백질의 아미노산 잔기의 아미도기를 탈아미드화시키는 효소이다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질의 아스파라긴 및/또는 글루타민 잔기의 아미도기를 탈아미드화한다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질의 글루타민 잔기의 아미도기를 탈아미드화한다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질의 아스파라긴 잔기의 아미도기를 탈아미드화한다. 적합한 단백질 탈아미드 효소의 예는 미국 특허 번호 6,756,221, 미국 특허 번호 6,251,651, 미국 특허 번호 7,462,477 및 미국 특허 번호 8,735,131에 기술되어 있다. (상기 특허들의 전체 내용 및 특히 단백질 탈아미드 효소에 대해 개시된 내용은 본 명세서에서 참조하고 있다).
일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 크리세오박테리움, 플라보박테리움, 엔페도박터, 스핑고박테리움, 아우레오박테리움, 미로이데스, 사이토파갈레스, 방선균 및 플라보 박테리아과로부터 선택된 박테리아에 의해 또는 페니실리움 미생물에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 크리세오박테리움의 박테리아에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 플라보박테리움의 박테리아에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 엔페도박터의 박테리아에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 스핑고박테리움의 박테리아에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 아우레오박테리움의 박테리아에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 미로이데스의 박테리아에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 사이토파갈레스의 박테리아에 의해 생산된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 방선균의 박테리아에 의해 생성된다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 플라보박테리아과의 박테리아에 의해 생성된다.
일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 프로테인 글루타미나아제 아마노 500 (PGA 500)이며, Amano Enzyme에서 시판된다.
일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소인 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 90 % 이상, 95 % 이상, 97 % 이상, 98 % 이상, 또는 적어도 99 % 상동성을 갖고 단백질 탈아미드 효소 활성을 가지는 서열을 갖거나 포함한다. 상기 단백질 탈아미드 효소의 활성도는 단백질 탈아미드 효소의 기능을 발휘할 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소와 동등하거나 그 이상인 것이 바람직하다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 아미노산 잔기 35, 38-43, 45, 46, 49, 79-84, 103, 106, 117, 142, 143, 146, 166, 또는 185에서 하나 이상의 치환 또는 결실을 갖는 서열 번호 1의 변이 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 예에서, 미국 특허 제 8,735,131호에 기술된 바와 같이 상기 단백질 탈아미드 효소는 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 85 %, 적어도 90 %, 적어도 95 %, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 갖고, 서열 번호 1인 아미산의 아미노산 잔기 35, 38, 40-43, 45, 46, 49, 80-84, 103-106, 또는 117에서 하나 또는 하나 이상의 치환 또는 결실과 같이 39, 40, 41, 43, 79-82, 142, 143. 146, 166, 또는 185에서 하나 또는 하나 이상의 치환 또는 결실을 갖는 서열 번호 1의 변이 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시 예에서, 미국 특허 제 8,735,131호에 기술된 바와 같이 상기 단백질 탈아미드 효소는 서열 번호 1인 아미노산의 아미노산 잔기 82에서의 세린 치환과 같은 서열 번호 1인 아미노산의 아미노산 잔기 82의 치환 및/또는 아미노산 잔기 84에서의 아스파르트산 치환과 같은 서열 번호 1의 아미노산 잔기 84에서의 치환과 같이 서열 번호 1의 변이 아미노산을 갖거나 포함한다.
안정적인 단백질 용액
상기에서 언급한 바와 같이, 일부 실시 예에서, 본 명세서에 기재된 상기 안정적인 단백질 용액은 다음을 포함한다: (i) 용액의 부피를 기준으로 약 0.1% 내지 약 30% w/v의 단백질; (ii) 용액의 부피를 기준으로 약 0.001% 내지 약 1 %를 포함하여 약 0.001% 내지 약 5% w/v의 안정제; 및 (iii) 용액 내 단백질 중량을 기준으로, 약 0.5U 내지 약 50U의 단백질 탈아미드 효소 활성 또는 약 0.1% 내지 약 10% (약 1% 내지 약 10% w/w의 단백질 탈아미드 효소 포함), 단백질 탈아미드 효소 활성은 하기 실시 예 16의 분석에 따라 결정될 수 있다.
따라서, 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액의 부피 (예를 들어, 용액의 최종 부피)를 기준으로 약 0.1% 내지 약 30% w/v의 단백질, 또는 약 0.5% 내지 약 30% w/w 또는 약 5% 내지 약 25% w/w, 또는 약 10% 내지 약 20% w/w를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 약 1% 내지 약 15% w/v의 단백질을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 약 5% 내지 약 15% w/v의 단백질을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 20%, 25% 또는 30% w/v를 포함하여 용액의 부피를 기준으로 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 20%, 약 25% 또는 약 30% w/v의 단백질을 포함한다.
일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 약 0.001% 내지 약 1.5%, 약 0.001% 내지 약 2%, 약 0.001% 내지 약 3%, 및 약 0.001% 내지 약 4% w/v의 안정제를 포함하고, 용액의 부피를 기준으로 약 0.001% 내지 약 5% w/v의 안정제를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 약 0.001% 내지 약 1% w/v의 안정제, 예컨대 용액의 부피를 기준으로 약 0.01% 내지 약 1%, 약 0.01% 내지 약 0.5%, 및 0.02% 내지 약 0.5% w/v의 안정제를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.4%, 0.45%, 또는 0.5% w/v의 안정제를 포함하여 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09%, 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5% w/v 의 안정제를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06%, 0.07%, 0.08%, 0.09%, 0.1%, 0.15%, 0.2%, 0.25%, 0.3%, 0.35%, 0.4%, 0.45%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.5%, 2%, 3%, 4% 및 5% w/v의 안정제를 포함하여, 용액의 부피를 기준으로 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 약 0.07%, 약 0.08%, 약 0.09% 약 0.1%, 약 0.2%, 약 0.3%, 약 0.4%, 약 0.5%, 약 0.6%, 약 0.7%, 약 0.8%, 약 0.9%, 약 1.0%, 약 1.5%, 약 2%, 약 3%, 약 4% 또는 약 5% w/v의 안정제를 포함한다. 일 실시 예에서, 사용된 비교적 적은 양의 안정제는 음료 및 음료 첨가제에 대해 소비자가 수용할 수 있는 점도, 예를 들어 약 10 내지 약 250 mPaㆍs의 점도를 갖는 용액을 생성한다.
일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 0.1% w/w 내지 약 1.0% w/w, 약 0.5% 내지 약 1.0% w/w, 약 0.1% w/w, 약 0.2% w/w, 약 0.3 % w/w, 약 0.4% w/w, 약 0.5% w/w, 약 0.6% w/w, 약 0.7% w/w, 약 0.8% w/w, 또는 약 0.9% w/w를 포함하여, 용액 내 단백질 중량을 기준으로 약 0.1% w/w 내지 약 1.0 % w/w를 포함하는 약 0.1 % w/w 내지 약 10 % w/w의 단백질 탈아미드 효소를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 1% w/w 내지 약 10% w/w의 단백질 탈아미드 효소를 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 약 1% w/w 내지 약 5% w/w의 단백질 탈아미드 효소, 예컨대 용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%를 포함하는 1% w/w, 약 2% w/w, 약 3% w/w, 약 4% w/w, 약 5% w/w의 단백질 탈아미드 효소를 포함한다.
일부 실시 예에서, 상기 용액은 약 0.5 내지 약 5.0U, 약 2.5 내지 약 5.0U, 약 0.5U, 약 1.0U, 약 2.0U, 약 2.5U, 약 3.0U, 약 4.0U, 또는 약 5.0U를 포함하는 약 0.5U 내지 약 50U의 단백질 탈아미드 효소 활성을 포함한다. 일부 실시 예에서, 용액은 약 5U 내지 약 50U의 단백질 탈아미드 효소 활성을 포함한다. 일부 실시 예에서, 용액은 약 5U 내지 약 25U의 단백질 탈아미드 효소 활성, 예컨대 5U, 10U, 15U, 20U, 25U, 30U, 35U, 40U, 45U, 또는 50U를 포함하는, 약 5U, 약 10U, 약 15U, 약 20U, 또는 약 25U의 단백질 탈아미드 효소 활성을 포함한다. 단백질 탈아미드 효소 활성은 하기 실시 예 16에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다.
일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)의 pH는 약 3.5 내지 약 7 (3.5 내지 7 포함), 예컨대 약 3.5 내지 약 5.5 (3.5 내지 5.5 포함)이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 4.0 내지 5.0을 포함하여 약 4.0 내지 약 5.0의 pH를 갖는다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 약 4.0 내지 약 7.0, 예를 들어 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 또는 7.0을 포함하여 약 3.5, 약 4.0, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 또는 약 7.0의 pH를 갖는다.
일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서 에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)의 점도는 10 내지 250 mPa·s을 포함하여 약 10 내지 약 250 mPa·s이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)의 점도는 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240 또는 250mPa·s을 포함하여 약 10, 약 20, 약 30, 약 40, 약 50, 약 60, 약 70, 약 80, 약 90, 약 100, 약 110, 약 120, 약 130 약 140, 약 150, 약 160, 약 170, 약 180, 약 190, 약 200, 약 210, 약 220, 약 230, 약 240, 또는 약 250mPa·s이다. 점도는 실온 (~20°C)에서 스핀들 S61을 사용하는 AMETEK BROOKFIELD 점도계를 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 7일, 14일, 21일, 1개월, 2개월, 및 6개월로부터 선택된 기간 동안 4°C에서 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 7일, 14일, 21일, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월 및 12개월, 예컨대 4개월 또는 8개월로부터 선택된 기간 동안 4°C에서 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 7일 동안 4°C에서 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 14일 동안 4°C에서 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 21일 동안 4°C에서 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 1개월 동안 4 °C에서 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 4°C에서 2개월 동안 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 4개월 동안 4°C에서 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 6개월 동안 4°C에서 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 일부 실시 예에서, 상기 용액 (또는 본 명세서에 기재된 용액을 포함하는 음료 또는 음료 첨가제)은 8개월 동안 4°C에서 저장된 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적이다. 상기에서 언급하고 하기 예에서 기술된 바와 같이, 침전에 대한 안정성은 280nm에서 흡광도를 측정하여 평가할 수 있으며, 더 높은 흡광도는 가용화된 단백질과 상관 관계가 있으므로 침전이 감소하거나 전혀 없다.
음료 또는 음료 첨가제
본 명세서에 기재된 상기 단백질 용액은 인간 또는 동물 소비를 위한 음료 또는 음료 첨가제로 제형화될 수 있거나, 인간 또는 동물 소비를 위한 음료 또는 음료 첨가제를 제조하는 데 사용될 수 있다. 음료 또는 음료 첨가제의 예에는 영양 음료, 스포츠 음료, 기능성 단백질 음료, 유제품 음료, 유제품 스무디, 과일 음료, 과일 스무디, 커피 음료, 차 음료, 식물성 우유, 유제품 크리머 및 비 유제품 크리머를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시 예에서, 상기 음료 또는 음료 첨가제는 영양 음료, 스포츠 음료, 기능성 단백질 음료, 유제품 음료, 유제품 스무디, 과일 음료, 과일 스무디, 커피 음료, 차 음료, 식물 우유, 유제품 크리머 및 비 유제품 크리머 중에서 선택된다. 상기 음료 또는 음료 첨가제는 하나 이상의 과즙, 비타민 및 향미제를 더 포함할 수 있다.
상기에서 언급한 바와 같이, 일부 실시 예에서, 상기 음료 또는 음료 첨가제는 산성 과일 즙 및/또는 산성 야채 즙을 포함하는 과일 및 야채 즙의 혼합물을 포함하는 하나 이상의 과일 또는 야채 즙과 같은 하나 이상의 산성 즙을 포함한다. 이러한 즙의 예는 사과 즙, 체리 즙, 크랜베리 즙, 포도 즙, 파인애플 즙, 석류 즙, 자몽 즙, 구아바 즙, 감로 메론 즙, 라임 즙, 레몬 즙, 블랙베리 즙, 오렌지 즙, 파인애플 즙, 라즈베리 즙, 바나나 퓌레, 살구 즙, 복숭아 즙, 아사이 퓌레, 아사이 즙, 키위 즙, 사탕 수수 즙, 딸기 즙, 수박 즙, 패션프루트 즙, 셀러리 즙, 당근 즙, 감자 즙, 비트 즙, 파슬리 즙, 토마토 즙, 물냉이 즙과 순무 즙을 포함한다. 상기에서 언급한 바와 같이, 산성 pH에서 침전에 대해 안정적인 단백질 용액에 대한 본 발명은, 가령 과일 및/또는 야채, 혹은 과일 및/또는 야채 즙을 기반으로 하는 단백질 함유 과일 및/또는 야채 향 음료 또는 음료 첨가제를 제공하기 위해, 과일 및/또는 야채 즙에 또는 그와 함께 단백질 용액을 제형하는 것을 허용한다.
준비 방법
본 명세서에 기술된 바와 같은 안정적인 단백질 용액을 제조하는 방법과 음료 및 음료 첨가제를 제조하는 방법이 본원에 기술된다. 상기 방법은 (a) 상기 단백질 및 안정제를 포함하는 용액에 단백질 탈아미드 효소를 첨가하여 혼합물을 수득하는 단계; (b) 상기 혼합물을 배양하는 단계; 및 (c) 상기 혼합물을 산성화하여 pH가 약 3.5 내지 약 7.0인 용액을 얻는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 (i) 상기 단백질을 포함하는 용액 및 (ii) 상기 안정제를 포함하는 용액을 혼합하여 제조된다. 상기 방법은 상기 단백질 및 안정제를 포함하는 혼합물을 제공하고, 단백질 탈아미드 효소를 상기 혼합물에 첨가하고 상기 혼합물을 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 배양은 효소 반응이 원하는 수준의 완료에 도달할 때까지 수행되며, 선택적으로 용액 내 유리 암모늄 이온의 농도에 의해 결정된다. 상기 방법은 일반적으로 상기 단백질을 포함하는 용액을 상기 안정제를 포함하는 용액과 혼합하여, 상기 단백질 및 안정제를 포함하는 혼합물을 제공하고, 상기 단백질 탈아미드 효소를 상기 혼합물에 첨가하고 그 혼합물을 배양하는 것을 포함할 수 있다. 상기 혼합 및 첨가는 임의의 순서로 수행할 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 혼합은 효소가 첨가되기 전에 완료된다.
상기 방법은 가령 상기 용액을 약 3.5 내지 약 7.0의 pH로 산성화함으로써, 상기 용액의 pH를 약 3.5 내지 약 7.0의 pH로 조정하는 것 또한 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 용액을 산성화하는 것은 산성 과일 즙 또는 산성 과일 즙 농축물 및/또는 산성 야채 즙, 또는 산성 야채 즙 농축물과 같은 산성 즙 또는 즙 농축물을 첨가하는 것을 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 용액은 예를 들어 산성 첨가제 및 산성 즙 또는 즙 농축물과 같은 하나 이상의 산성화제에 의해 산성화된다. 일부 실시 예에서, 상기 산성화제는 용액에 향미를 추가하거나 영양 또는 기능 식품 함량을 향상시키기 위한 것과 같은 다른 목적을 위해 첨가되며, 산성 pH는 그 목적을 위해 첨가된 산성화제의 양으로부터 발생한다.
상기 배양 조건은 사용된 특정 단백질 탈아미드 효소(들)에 적합한 임의의 배양 조건, 예컨대 효소가 활성을 나타내는 임의의 온도 및 pH와 임의의 시간, 원하는 수준의 탈아미드화를 달성하는 데 필요한 시간일 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 탈아미드화 반응의 진행은 용액 내 유리 암모늄 이온의 농도를 측정하는 것과 같은 방식으로 모니터링된다. 예를 들어, 용액의 유리 암모늄 이온 농도가 특정 수준에 도달하면 반응이 완료된 것으로 간주할 수 있다. 본 명세서에 기재된 단백질의 양을 갖는 용액의 경우, 용액의 유리 암모늄 이온 농도가 용액의 부피를 기준으로 약 0.002% 내지 약 0.07% w/v, 예컨대 용액의 부피를 기준으로 약 0.002%, 약 0.003%, 약 0.004%, 약 0.005%를 포함하여 0.002% 내지 0.07% w/v로, 약 0.006%, 약 0.007%, 약 0.008%, 약 0.009%, 약 0.01%, 약 0.02%, 약 0.03%, 약 0.04%, 약 0.05%, 약 0.06%, 또는 약 0.07% w/v, 또는 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.009%, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.06% 또는 0.07% w/v를 포함하여 0.002% 내지 0.007% w/v 에 도달하면 반응이 완료된 것으로 간주될 수 있다. 상기 배양 조건은 교반을 포함할 수 있다. 상기 교반은 느리거나 (예를 들어, 약 150 내지 약 250 rpm) 빠르게 (예를 들어, 약 3,000 내지 약 5,000 rpm) 수행될 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 교반은 약 150 내지 약 250 rpm 범위에서 셰이커 테이블을 사용해 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 교반은 약 3,000 내지 약 5,000 rpm 범위에서 셰이커 테이블을 사용해 수행된다.
상기 배양 단계는 약 30°C 내지 약 70°C의 온도에서, 약 3.0 내지 약 8.0의 pH에서 약 0.5시간 내지 약 48시간 동안 이루어질 수 있다. 일반적으로, 상기 배양은 약 40°C 내지 약 60°C의 온도에서, 그리고 약 3시간 내지 약 24시간 동안, 약 5.0 내지 약 8.0의 pH에서 이루어진다. 일부 실시 예에서, 상기 배양은 약 30°C, 약 35°C, 약 40°C, 약 45°C, 약 50°C, 약 55°C, 약 60°C, 약 65°C, 또는 약 70°C 의 온도에서 진행된다. 일부 실시 예에서, 상기 배양은 약 0.5시간, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간 동안, 약 4시간, 약 5시간, 약 6시간, 약 7시간, 약 8시간, 약 9시간, 약 10시간, 약 11시간, 약 12시간, 약 13시간, 약 14시간, 약 15시간, 약 16시간, 약 17시간, 약 18시간, 약 19시간, 약 20시간, 약 21시간, 약 22시간, 약 23시간, 약 24시간, 약 48시간에 동안 이루어진다. 일부 실시 예에서, 상기 배양은 약 3, 약 3.5, 약 4, 약 4.5, 약 5.0, 약 5.5, 약 6.0, 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5 또는 약 8.0의 pH에서 이루어진다.
일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 프로테인 글루타미나아제 아마노 500 (PGA 500)이고, 상기 배양은 약 5.0 내지 약 8.0의 pH에서 3시간 동안 50°C에서 이루어진다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖거나 이를 포함하고, 상기 배양은 약 5.0 내지 약 8.0의 pH에서 3시간 동안 50°C에서 이루어진다. 일부 실시 예에서, 상기 단백질 탈아미드 효소는 본 명세서에 기재된 바와 같은 서열 번호 1의 변이체이고, 상기 배양은 약 5.0 내지 약 8.0의 pH에서 3시간 동안 50°C에서 이루어진다.
상기 용액은 하나 이상의 향미료 또는 영양 성분의 첨가, 열처리, 균질화, 여과, 저온 살균 및 멸균 중 하나 이상과 같은 하나 이상의 추가적인 처리 단계를 거칠 수 있다.
일부 실시 예에서, 상기 제조 방법은 상기 용액을 약 5분 내지 약 20분 동안 약 75°C 내지 약 95°C의 열처리와 같은 열 처리에 적용하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 열 처리는 약 75°C, 약 80°C, 약 85°C, 약 90°C, 또는 약 95°C에서 약 5분, 10분, 15분 또는 약 20분 동안 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 열 처리는 약 85°C에서 약 10분 동안 수행된다.
일부 실시 예에서, 상기 공정은 상기 용액을 균질화시키는 것을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 균질화는 약 2,000 psi 내지 약 20,000 psi, 예컨대 약 2,000 psi 내지 약 2,500 psi의 압력에서 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 균질화는 약 2,000 psi, 약 5,000 psi, 약 10,000 psi, 약 15,000 psi 또는 약 20,000 psi의 압력에서 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 균질화는 약 2,000 psi, 약 2,500 psi, 약 3,000 psi, 약 3,500 psi, 약 4,000 psi, 약 4,500 psi 또는 약 5,000 psi의 압력에서 수행된다.
일부 실시 예에서, 상기 공정은 상기 용액을 저온 살균하는 것을 더 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 저온 살균은 고온단시간살균 (HTST), 초고온 살균 (UHT), 또는 저온장시간살균 (LTLT)을 사용하여 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 저온 살균은 고온 단시간살균 (HTST)을 사용하여 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 저온 살균은 약 90°C 내지 약 110°C에서 약 5초 내지 약 30초 동안 고온단시간살균 (HTST)을 사용하여 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 저온 살균은 약 100°C에서 약 10초 내지 약 20초 동안 고온단시간살균(HTST)을 사용하여 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 저온 살균은 초고온 살균 (UHT)을 사용하여 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 저온 살균은 약 110°C 내지 약 130°C에서 약 1초 내지 약 10초 동안 초고온 살균 (UHT)을 사용하여 수행된다. 일부 실시 예에서, 상기 저온 살균은 약 1초 내지 약 3초 동안 약 120°C에서 초고온 살균(UHT)을 사용하여 수행된다. 일부 실시 예에서, 저온 장시간 살균(LTLT)을 사용하여 상기 저온 살균이 수행된다. 일부 실시 예에서, 저온 장기간 살균(LTLT)을 사용하여 약 65°C 내지 약 95°C에서 약 5분 내지 약 30분 동안 상기 저온 살균을 수행한다. 일부 실시 예에서, 저온 장시간 살균 (LTLT)을 사용하여 약 75°C 내지 약 85°C에서 약 10분 내지 약 20분 동안 상기 저온 살균을 수행한다.
일부 실시 예에서, 상기 공정은 상기 용액을 멸균 처리하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시 예에서, 상기 멸균은 고압 (hyperbaric) 멸균을 사용하여 수행된다.
본 명세서에 기재된 바와 같은 음료 또는 음료 첨가제의 제조 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 안정적인 단백질 용액을 음료 또는 음료 첨가제 조성물에 첨가하거나, 본 명세서에 기재된 바와 같은 용액을 음료 또는 음료 첨가제로서 제형화하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 안정적인 단백질 용액은 상기 음료 또는 음료 첨가제에 원하는 양의 단백질을 제공하기 위해 미리 제조된 영양 음료, 스포츠 음료, 기능성 단백질 음료, 유제품 음료, 유제품 스무디, 과일 음료, 과일 스무디, 커피 음료, 차 음료, 식물 우유, 유제품 크리머 또는 비 유제품 크리머에 첨가될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기술된 안정적인 단백질 용액은 예를 들어, 영양 음료, 스포츠 음료, 기능성 단백질 음료, 유제품 음료, 유제품 스무디, 과일 음료, 과일 스무디, 커피 음료, 차 음료, 식물성 우유, 유제품 크리머, 또는 비 유제품 크리머로 제형화되며, 이러한 음료 및 음료 첨가제의 다른 성분과 원하는 양의 단백질을 포함할 수 있다.
일부 실시 예에서, 최종 용액, 음료 또는 음료 첨가제는 용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 30% w/w를 포함하여 최대 약 30% w/w의 단백질 함량을 갖는다. 일부 실시 예에서, 상기 최종 용액, 음료 또는 음료 첨가제는 용액 내 단백질의 중량을 기준으로 0.5 내지 30% w/w, 또는 약 5 내지 약 25% w/w, 또는 약 10 내지 약 20% w/w 를 포함하는 약 0.5 내지 약 30% w/w의 단백질 함량을 갖는다. 일부 실시 예에서, 상기 최종 용액, 음료 또는 음료 첨가제는 용액 내 단백질 중량을 기준으로 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 11%, 약 12%, 약 13%, 약 14%, 약 15%, 약 16%, 약 17%, 약 18%, 약 19%, 약 20%, 약 21%, 약 22%, 약 23%, 약 24%, 약 25%, 약 26%, 약 27%, 약 28%, 약 29% 또는 약 30% w/w의 단백질 함량을 갖는다.
임의의 실시 예에서, 상기 음료 또는 음료 첨가제는 하나 이상의 과일 또는 야채 즙, 비타민, 영양 보충제, 향미제, 색소 및 방부제를 포함하여 이러한 음료 또는 음료 첨가제에 전형적으로 포함되는 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시 예에서, 상기 음료 또는 음료 첨가제는 사과 즙, 체리 즙, 크랜베리 즙, 포도 즙, 파인애플 즙, 석류 즙, 자몽 즙, 구아바 즙, 감로 메론 즙, 라임 즙, 레몬 즙, 블랙베리 즙, 오렌지 즙, 파인애플 즙, 라즈베리 즙, 바나나 퓌레, 살구 즙, 복숭아 즙, 아사이 퓌레, 아사이 즙, 키위 즙, 사탕 수수 즙, 딸기 즙, 수박 즙, 패션프루트 즙, 셀러리 즙, 당근 즙, 감자 즙, 비트 즙, 파슬리 즙, 토마토 즙, 물냉이 즙 및 순무 즙으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는, 하나 이상의 산성 과일 즙을 포함하는 하나 이상의 산성 즙 또는 하나 이상의 과일 및 야채 즙을 포함한다.
다음의 특정 예는 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법의 실시 예로서 포함된다. 이들 예는 본 개시 내용의 범위를 제한하려는 의도가 아니며 본 개시 내용의 다른 측면은 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 당업자에게 명백할 것이다.
실시 예
실시 예 1: 완두콩 단백질 용액 (제형 1-4)
아래 표에 나와 있는 것처럼, 완두콩 단백질 용액은 분말 형태 (NOW Foods)의 완두콩 단백질 분리물을 단백질로 사용하고, 젤란검 (TIC Gums의 하이아실(High Acyl) 젤란검인 Ticagel® Gellan HS NGMO)을 안정제로 사용하거나 사용하지 않고, PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)을 단백질 탈아미드 효소로 사용하거나 사용하지 않고 제조했다.
예를 들어, 물에 녹인 완두콩 단백질의 10% (w/v) 용액을 준비하고 물에 녹인 0.2% (w/v) 젤란검 용액과 혼합하여 3% (w/v)의 완두콩 단백질 및 0.03-0.05 % (w/v) 젤란검을 포함한 용액을 얻는다. 상기 PGA 500을 함유한 용액의 경우, 효소를 단백질의 2% (w/w) 양으로 첨가하고 50°C에서 3시간 동안 배양하였다. PGA 500을 포함하지 않는 제형의 경우, 용액을 배양하지 않고 50°C로 가열하였다. 용액을 구연산을 사용해 pH 4.0-4.5로 산성화한 후 85°C에서 10분간 열처리 하였다. 다른 제형들은 유사한 공정으로 만들어졌다.
생성된 용액들을 실험실 VWR 냉장고에 4°C에서 보관하고 24시간 및 72시간 후에 (1) 육안 검사, (2) 280 nm에서 상층 액의 흡광도를 측정해 가용성 단백질 함량 측정, (3) 점도계 (AMETEK BROOKFIELD)를 사용한 점도 측정 (4) pH 측정을 통해 평가했다. 결과는 아래 표에 보고되어 있다.
제형 1 2 3 4
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 - + + -
젤란검 - + - +
육안 검사 용액 분리 용액 분산 용액 분리 용액 분리
흡광도 (280nm) 1.0 27.6 0.9 0.9
점도 (mPa·s) 2.1 25.2 1.8 3.3
pH 4.5 4.5 4.6 4.4
결과는 약 4.5의 pH에서, 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함한 제형 (제형 2)이 육안 검사를 했을 때 외관상 분리되지 않고 분산된 것과, 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정된 것을 바탕으로 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다.
실시 예 2: 대두 단백질 제형 (제형 5-12)
아래 표에 나와 있는 것과 같이, 단백질로 분리된 분말 형태의 콩 단백질 (NOW Foods)을 사용하여 대두 단백질 용액을 제조하고, 대두 단백질 용액은 젤란검 (TIC Gums의 Ticagel® Gellan HS NGMO)을 안정제로 사용하거나 사용하지 않고, 단백질 탈아미드 효소로서 PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)을 사용하거나 사용하지 않고 제조되었다.
예를 들어, 10% (w/v) 물에 녹인 대두 단백질 용액을 준비하고 0.2% (w/v) 물에 녹인 젤란검 용액과 혼합하여 3% (w/v)의 대두 단백질 및 0.10% (w/v)의 젤란검을 포함한 수용액을 얻는다. 상기 PGA 500 함유 제형의 경우 효소를 단백질의 2% (w/w) 양으로 첨가하고 50°C에서 3시간 동안 배양하였다. PGA 500을 포함하지 않는 제형의 경우, 용액을 배양하지 않고 50°C로 가열했다. 용액을 구연산으로 pH 4.0-4.6까지 산성화한 후 85°C에서 10분간 열처리 하였다. 다른 제형들은 유사한 공정으로 만들어졌다.
생성된 용액들을 실험실 VWR 냉장고에 4°C에서 저장하고 상기 실시 예 1에 기술한 바와 같이 평가했다. 결과는 하기 표에 명시되어 있다.
제형 5 6 7 8 9 10 11 12
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 - + + - - + + -
젤란검 - + - + - + - +
육안 검사 용액
분리		 용액
분산		 용액
분리		 침강 용액
분리		 용액
분산		 용액
분리		 용액
분리
흡광도 (280nm) 3.3 25.4 3.7 4.2 3.1 40.4 3.6 2.6
점도 (mPa·s) 2.1 39.6 2.7 1.4 1.8 191.1 2.7 44.4
pH 4.5 4.6 4.5 4.4 3.9 4.1 4.1 4.0
결과는 산성 pH (약 4.0 내지 4.5)에서, 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함하는 제형 (제형 6 및 10)이 외관상 분리되지 않고 분산된 것과, 더 높은 흡광도가 측정된 것을 바탕으로 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다.
실시 예 3: 땅콩 단백질 제형 (제형 13-16)
하기 표에 표시된 대로 땅콩 단백질 분말 (Tru-Nut Company)을 단백질로 사용하고, 젤란검 (TIC Gums의 Ticagel® Gellan HS NGMO)을 안정제로 사용하거나 사용하지 않고, 단백질 탈아미드 효소로 PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)을 사용하거나 사용하지 않고 땅콩 단백질 용액을 제조했다.
예를 들어, 물에 녹인 땅콩 단백질의 10% (w/v) 용액을 준비하고 물에 녹인 0.2% (w/v) 젤란검 용액과 혼합하여 3% (w/v)의 땅콩 단백질 및 0.02% (w/v)의 젤란검을 포함한 수용액을 얻는다. 상기 PGA 500 함유 제형의 경우 효소를 단백질의 2% (w/w) 양으로 첨가하고 50°C에서 3시간 동안 배양 하였다. PGA 500을 포함하지 않는 제형의 경우, 용액을 배양하지 않고 50°C로 가열했다. 용액을 구연산을 사용하여 pH 4.0-4.5로 산성화한 후 85°C에서 10분간 열처리하였다. 다른 제형은 유사한 공정으로 만들어졌다.
생성된 용액들을 실험실 VWR 냉장고에 4°C에서 저장하고 상기 실시 예 1에 기술한 바와 같이 평가했다. 결과는 하기 표에 명시되어 있다.
제형 13 14 15 16
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 - + + -
젤란검 - + - +
육안 검사 용액 분리 경미한 침전 용액 분리 용액 분리
흡광도 (280nm) 5.8 10.7 6.0 6.4
점도 (mPa·s) 1.5 12.6 3.6 4.8
pH 4.4 4.2 4.6 4.4
결과는 산성 pH (약 4.0)에서 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함하는 제형 (제형 14)이 다른 제형과 비교했을 때, 더 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정되어 단백질의 침전에 대해 더 안정적이라는 것을 보여준다. 다른 제형에 비해, 경미한 침전물이 관찰되었으며 이는 땅콩 단백질의 특성과 처리 조건이 땅콩 단백질에 최적화되지 않았기 때문일 수 있다.
실시 예 4: 귀뚜라미 단백질 제형 (제형 17-24)
하기 표에 명시된 것과 같이, 귀뚜라미 단백질 용액은 68% (w/w)의 귀뚜라미 단백질 (LITHIC)을 포함하는 귀뚜라미 가루를 사용하여 제조되었으며, 안정제로서 젤란검 (TIC Gums의 Ticagel® Gellan HS NGMO)을 포함하거나 포함하지 않고 단백질 탈아미드 효소로서 PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)을 포함하거나 포함하지 않는다.
예를 들어, 귀뚜라미 가루의 10% (w/v) 용액을 물에 넣고 0.2% (w/v)의 물에 녹인 젤란검 용액과 혼합하여 3% (w/v)의 귀뚜라미 가루 및 0.03% (w/v)의 젤란검을 포함한 수용액을 얻는다. 상기 PGA 500 함유 용액의 경우, 효소를 단백질의 2% (w/w) 양으로 첨가하고 50°C에서 3시간 동안 배양하였다. PGA 500을 포함하지 않는 제형의 경우, 용액을 배양하지 않고 50°C로 가열했다. 용액을 구연산을 사용하여 pH 4.0-4.5로 산성화한 후 85°C에서 10분간 열처리 하였다. 다른 제형들은 유사한 공정으로 만들어졌다.
생성된 용액들을 실험실 VWR 냉장고에 4°C에서 저장하고 상기 실시 예 1에 기술한 바와 같이 평가했다. 결과는 하기 표에 명시되어 있다.
제형 17 18 19 20 21 22 23 24
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 - + + - - + + -
젤란검 - + - + - + - +
육안 검사 용액
분리		 용액
분산		 용액
분리		 침강 용액
분리		 용액
분산		 용액
분리		 용액
분리
흡광도 (280nm) 17.1 40.5 16.5 32.4 17.4 29.9 16.1 17.1
점도 (mPa·s) 1.8 10.8 1.2 2.1 1.4 2.1 1.5 2.2
pH 4.3 4.5 4.3 4.5 4.1 4.0 3.9 4.0
결과는 산성 pH (약 4.0 내지 약 4.5)에서, 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함한 제형 (제형 18 및 22)이 더 높은 흡광도 값으로 보여주는 바와 같이 더 가용화된 단백질이 많아, 다른 제형에 비해 단백질의 침전에 대해 더 안정적이라는 것을 알 수 있다. 제형 17 내지 20은 pH 4.5 (일부 측정 오류 포함)에서 제형화되는 반면, 제형 21 내지 24는 pH 4.0 근처, 제형 22 (pH 4.0)는 제형 18 (pH 4.5)를 비교했을 때 더 낮은 pH로 인해 더 적은 단백질이 현탁액에 있기 때문에 제형 22에서 관찰된 낮은 흡광도와 점도를 설명한다.
실시 예 5: 대마 단백질 제형 (제형 25-28)
하기 표에 명시된 것과 같이, 대마 단백질 분말 (Nutiva)을 단백질로 사용하고, 카라기난검 (TIC Gums의 Ticaloid® 750)을 안정제로 사용하거나 사용하지 않고, 단백질 탈아미드 효소로 PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)을 사용하거나 사용하지 않고 대마 단백질 용액을 제조했다.
예를 들어, 물에 담긴 대마 단백질의 10% (w/v) 용액을 준비하고 물에 카라기난검의 1.0% (w/v) 용액과 혼합하여 대마 단백질 3% (w/v)과 0.5% (w/v) 카라기난 검이 들어 있는 수용액을 얻는다. 상기 PGA 500 함유 용액의 경우, 효소를 단백질의 2% (w/w) 양으로 첨가하고 50 ° C에서 3시간 동안 배양하였다. PGA 500이 포함되지 않은 제형의 경우 배양하지 않고 용액을 50°C에서 가열하였다. 용액을 구연산을 사용하여 pH 4.0-4.5로 산성화한 후 85°C에서 10분간 열처리 하였다. 다른 제형들은 유사한 공정으로 만들어졌다.
생성된 용액들을 실험실 VWR 냉장고에 4°C에서 저장하고 상기 실시 예 1에 기술한 바와 같이 평가했다. 결과는 하기 표에 명시되어 있다.
제형 25 26 27 28
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 - + + -
카리기난검 - + - +
육안 검사 용액 분리 용액 분산 용액 분리 침강
흡광도 (280nm) 4.2 9.3 3.5 13.2
점도 (mPa·s) 1.6 132.0 4.8 42.9
pH 4.7 4.6 4.6 4.8
결과는 산성 pH (약 4.5)에서, 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함한 제형 (제형 26)이 육안 검사를 했을 때 외관상 분리되지 않고 분산된 것과, 더 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정된 것을 바탕으로 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다.
실시 예 6: pH 3.5 내지 7.0의 완두콩 단백질 용액 (제형 29-37)
하기 표와 같이, 완두콩 단백질 용액은 단백질로 분말 형태 (NOW Foods)의 완두콩 단백질 분리물 (NOW Foods)을 사용하여, 안정제로 검을 포함하거나 포함하지 않고, 단백질 탈아미드 효소로 PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)을 사용하거나 사용하지 않고 준비되었다. TIC Gums의 젤란검(Ticagel® Gellan HS NGMO), 펙틴 (Pre Hydrated® Pectin 1694 Powder, 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC, Pre-Hydrated® Ticalose® CMC 2500 Powder), 알지네이트 (TICA-algin® HG) -400 파우더) 및 타라검 (TIC Pretested® Tara Gum 100)이 사용되었다.
예를 들어, 10% (w/v)의 물에 녹인 완두콩 단백질의 용액을 준비하고 물에 녹인 검 용액과 혼합하여 3% (w/v)의 완두콩 단백질를 포함한 수용액을 얻었으며 검의 농도는 (% w/v) 아래 표에 나와 있다. 상기 PGA 500 함유 제형 (표의 "A"제형)의 경우, 효소를 단백질의 2% (w/w) 양으로 첨가하고 50°C에서 3시간 동안 배양했다. PGA 500을 포함하지 않는 제형 (아래 표의 "B"제형)의 경우, 용액을 배양하지 않고 50°C로 가열했다. 용액을 구연산을 사용하여 표에 나타난 바와 같이 3.5 내지 7 범위의 pH로 산성화한 다음, 85°C에서 10분 동안 열처리 하였다. 다른 제형들은 유사한 공정으로 만들어졌다.
생성된 용액들을 실험실 VWR 냉장고에 4°C에서 보관하고 처음에 24시간 후 평가한 다음 최대 2개월 동안 정기적으로 평가했으며 (1) 육안 검사, (2) 280 nm에서 상청액의 흡광도를 측정해 가용성 단백질 함량 측정, (3) pH 측정을 통해 평가했다. 결과는 아래 표에 보고되어 있다.
제형 29A 30A 31A 32A 33A 34A 35A 36A 37A
효소* + + + + + + + + +
검 젤란검 0.01% 젤란검 0.01% 젤란검 0.015% 젤란검 0.03% 젤란검 0.05%
펙틴/
0.62%		 젤란검 0.05%

CMC 0.07%		 젤란검 0.05%

알지네이트
0.062%		 펙틴
0.6%

CMC
0.4%		 펙틴
0.6%

CMC
0.5%

타라검
0.1%
육안검사 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액 분산 용액
분산
흡광도(280nm) 33.0 26.2 23.8 27.6 20.6 12.4 13.2 32.8 28.9
pH 6.9 5.9 5 4.5 4 4 4 3.5 3.6
(효소*= 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 PGA 500)
제형 29B 30B 31B 32B 33B 34B 35B 36B 37B
효소* - - - - - - - - -
검 젤란검 0.01% 젤란검 0.01% 젤란검 0.015% 젤란검 0.03% 젤란검 0.05%
펙틴/
0.62%		 젤란검 0.05%

CMC 0.07%		 젤란검 0.05%

알지네이트
0.062%		 펙틴
0.6%

CMC
0.4%		 펙틴
0.6%

CMC
0.5%

타라검
0.1%
육안검사 침강 침강 침강 용액
분리		 용액
분리		 용액
분리		 용액
분리		 침강 침강
흡광도(280nm) 19.2 11.6 4.6 0.9 2.9 0.9 1.2 15.4 13.1
pH 6.9 5.9 5 4.3 4 4 4 3.5 3.6
(효소*= 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 PGA 500)
결과는 약 3.5 내지 약 7의 pH에서 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함한 제형 (제형 29A-37A)이 외관상 분리되지 않고 분산된 것과, 더 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정된 것을 바탕으로 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다. 반면에, 단백질 탈아미드 효소가 포함되지 않은 제형은 약 4.0 미만의 pH에서 덜 안정적이었다.
실시 예 7: pH 3.5 내지 7.0의 대두 단백질 용액 (제형 38-45)
분말 형태의 분리된 콩 단백질 (NOW Foods)을 단백질로 사용하여, 실시 예 6에 기재된 바와 같이 콩 단백질 용액을 제조하고 평가하였다. 결과는 아래 표에 보고되며 도 2에 도시되어 있다.
제형 38A 39A 40A 41A 42A 43A 44A 45A
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 + + + + + + + +
검 젤란검0.015% 젤란검
0.02%		 젤란검
0.02%		 젤란검
0.02%		 젤란검
0.03%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.6%		 젤란검
0.03%

펙틴
0.6%		 펙틴
0.6%

CMC
0.4%
육안 검사 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액 분산
흡광도 (280nm) 43.6 47.0 30.5 24.3 25.4 21.4 18.7 21.4
pH 6.9 6.9 6.1 5.2 4.6 4.0 4.0 3.5
제형 38B 39B 40B 41B 42B 43B 44B 45B
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 - - - - - - - -
검 젤란검0.015% 젤란검
0.02%		 젤란검
0.02%		 젤란검
0.02%		 젤란검
0.03%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.6%		 젤란검
0.03%

펙틴
0.6%		 펙틴
0.6%

CMC
0.4%
육안 검사 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분리		 용액
분리		 용액
분리		 침강
흡광도 (280nm) 30.4 23.9 20.8 20.3 4.2 5.3 8.1 13.5
pH 7 7 6 5.2 4.4 4 4.1 3.5
결과는 약 3.5 내지 약 7의 pH에서 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함한 제형 (제형 38A-45A)이 외관상 분리되지 않고 분산된 것과, 더 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정된 것을 바탕으로 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다. 반면에, 단백질 탈아미드 효소가 포함되지 않은 제형은 5.2 미만의 pH에서 덜 안정적이었다 (pH4.4-3.5에 대해 보고된 결과 참조).
실시 예 8: pH 3.5 내지 6.5의 대마 단백질 용액 (제형 46-52)
대마 단백질 분말 (Nutiva)을 단백질로 사용하여 실시 예 6에 기재된 바와 같이 대마 단백질 용액을 제조하고 평가하였다. 결과는 아래 표에 보고되었으며 도 3에 도시되어 있다.
제형 46A 47A 48A 49A 50A 51A 52A
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 + + + + + + +
검 젤란검0.015% 젤란검
0.02%

CMC
0.2%		 젤란검
0.015%

CMC
0.2%		 젤란검
0.02%

CMC
0.2%		 젤란검
0.02%

CMC
0.2%		 젤란검
0.09%
 젤란검
0.1%
육안 검사 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산
흡광도 (280nm) 53.9 68.0 73.2 75.0 66.8 55.7 53.8
pH 6.1 4.9 4.5 4.5 4.0 3.5 3.5
제형 46B 47B 48B 49B 50B 51B 52B
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 - - - - - - -
검 젤란검0.015% 젤란검
0.02%

CMC
0.2%		 젤란검
0.015%

CMC
0.2%		 젤란검
0.02%

CMC
0.2%		 젤란검
0.02%

CMC
0.2%		 젤란검
0.09%
 젤란검
0.1%
육안 검사 침강 침강 침강 용액
분산		 침강 용액
분리		 용액
분리
흡광도 (280nm) 18.4 26.3 25.2 26.6 25.1 17.0 19.3
pH 6.4 5 4.5 4.4 4.1 3.4 3.6
결과는 약 3.5 내지 약 7의 pH에서, 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함한 제형 (제형 46A-52A)이 육안 검사를 했을 때 외관상 분리되지 않고 분산된 것과, 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정된 것을 바탕으로 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다.
실시 예 9: pH 3.5 내지 7.0의 땅콩 단백질 용액 (제형 53-59)
땅콩 단백질 분말 (Tru-Nut Company)을 단백질로 사용하고 잔탄검 (TIC Gums의 Pre-Hydrated® Ticaxan® Xanthan EC NGMO)을 사용하여 실시 예 6에 기재된 바와 같이 땅콩 단백질 용액을 제조하고 평가했다. 결과는 아래 표에 보고되었으며 도 4에 도시된다.
제형 53A 54A 55A 56A 57A 58A 59A
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 + + + + + + +
검 젤란검0.02% 젤란검
0.01%

CMC
0.1%		 젤란검
0.018%		 젤란검
0.06%		 젤란검
0.04%		 잔탄검
0.3%

CMC
0.2%		 펙틴
0.6%

CMC
0.2%
육안 검사 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산
흡광도 (280nm) 38.8 34.6 37.7 52.5 44.4 41.5 35.5
pH 6.9 6.0 5.0 4.5 4.5 4.2 3.5
제형 53B 54B 55B 56B 57B 58B 59B
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 - - - - - - -
검 젤란검0.02% 젤란검
0.01%

CMC
0.1%		 젤란검
0.018%		 젤란검
0.06%		 젤란검
0.04%		 잔탄검
0.3%

CMC
0.2%		 펙틴
0.6%

CMC
0.2%
육안 검사 용액 분산 용액 분산 침강 용액 분리 용액 분리 용액 분리 침강
흡광도 (280nm) 24.6 23.9 20.7 6.8 6.0 5.3 4.2
pH 7.0 6.1 5.0 4.5 4.4 4.1 3.5
결과는 약 3.5 내지 약 7의 pH에서, 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함한 제형 (제형 53A-59A)이 육안 검사를 했을 때 외관상 분리되지 않고 분산된 것과, 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정된 것을 바탕으로 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다. 반면, 다른 제형들은 특히 더 낮은 pH에서 덜 안정적이었다.
실시 예 10: pH 3.5 내지 7.0의 귀뚜라미 단백질 용액 (제형 60-67)
귀뚜라미 단백질 용액을 68% (w/w)의 귀뚜라미 단백질 (LITHIC)을 함유하는 귀뚜라미 가루를 사용하여 실시 예 6에 기재된 것과 동일한 방식으로 제조하고 평가하였다. 결과는 아래 표에 보고되며 도 5에 도시된다.
제형 60A 61A 62A 63A 64A 65A 66A 67A
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 + + + + + + + +
검 젤란검0.02% 젤란검
0.02%		 젤란검
0.0075%		 잔탄검
0.15%		 젤란검
0.03%		 젤란검
0.07%		 CMC
0.2%		 펙틴/
0.5%

젤란검/
0.05%
육안 검사 용액
분산		 용액
분산		 침강 용액
분산		 용액
분산		 용액
분산		 용액 분산 용액
분산
흡광도 (280nm) 39.9 31.5 31.0 33.6 29.9 20.7 33.5 25.0
pH 6.9 6.1 5.1 4.6 4.0 3.6 3.5 3.6
제형 60B 61B 62B 63B 64B 65B 66B 67B
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 - - - - - - - -
검 젤란검0.02% 젤란검
0.02%		 젤란검
0.0075%		 잔탄검
0.15%		 젤란검
0.03%		 젤란검
0.07%		 CMC
0.2%		 펙틴/
0.5%

젤란검/
0.05%
육안 검사 용액
분산		 침강 침강 용액
분산		 용액
분리		 용액
분리		 용액 분리 용액
분리
흡광도 (280nm) 37.2 38.7 31.4 31.9 17.1 16.4 19.5 18.2
pH 6.9 6.0 5.1 4.4 4.0 3.7 3.5 3.4
결과는 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함하는 제형(제형 60A-67A)이 외관상 분산되었으며 더 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도를 보여 약 3.5 내지 약 7의 pH 범위에서 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다. 침전물은 제형 62A에서 관찰되었으며, 이는 특정 양의 젤란검이 pH 5.1에서 사용된 단백질 침전을 완전히 방지하기에 충분하지 않았기 때문일 수 있다. 대부분의 다른 제형은 특히 더 낮은 pH 값 (약 4.5 미만)에서 덜 안정적이었다. 이론에 얽매이려는 것은 아니나, 사용된 귀뚜라미 단백질은 순수한 귀뚜라미 단백질이 아니라 비 단백질 불순물을 포함한 불순물을 포함하고 있을 수 있기 때문에 이러한 결과가 관찰된 것일 수 있다.
실시 예 11: 균질화된 완두콩 단백질 용액 (제형 68-71)
하기 표에 명시된 것과 같이, 분말 형태의 완두콩 단백질 분리물 (NOW Foods)을 단백질로 사용하고, 안정제로서 검 (젤란검: Ticagel® Gellan HS NGMO; 펙틴: Pre Hydrated® Pectin 1694 Powder; 둘 다 TIC Gums 시판)을 사용하거나 사용하지 않고 단백질 탈아미드 효소로서 PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)를 사용하거나 사용하지 않고 완두콩 단백질 용액을 제조하였다.
예를 들어, 0.075% (w/w) 젤란검과 0.45% (w/w) 펙틴을 물에 수화시켜 용액을 제조했다. 완두콩 단백질을 첨가하여 아래 표와 같이 완두콩 단백질의 양이 다른 완두콩 단백질 용액을 얻었다. 상기 PGA 500 함유 제형의 경우 단백질 0.67% ~ 1.8% (w/w)의 효소를 첨가하고 50°C에서 3시간 동안 배양하였다. PGA 500을 포함하지 않는 제형의 경우, 용액을 배양하지 않고 50°C로 가열했다. 산성화를 위해 1M (몰) 구연산을 사용하여 지정된 pH를 얻었다. 산성화된 용액을 2,000 ~ 2,500 psi로 균질화한 후 85°C에서 10분간 열처리 하였다. 다른 제형들은 유사한 공정으로 만들어졌다.
단백질 탈아미드화 효소의 활성은 실시 예 16에 따라 결정되었다.
생성된 용액들을 실험실 VWR 냉장고에 4°C에서 저장하고 상기 실시 예 6에 기술한 바와 같이 평가했다. 결과는 하기 표에 명시되어 있으며 도 6에 도시된다.
제형 68A 68B 69A 69B 70A 70B 71A 71B
% 단백질 3.6% 3.6% 4.0% 4.0% 5.0% 5.0% 6.0% 6.0%
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 (%-단백질) - 1.8% - 0.67% - 0.67% - 0.67%
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 (u/300mL sol) - 150U - 60U - 75U - 90U
검 젤란검0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%
육안 검사 침강 용액
분산		 침강 용액
분산		 침강 용액
분산		 침강 용액
분산
흡광도 (280nm) 30.6 123.2 41.2 92.8 81.2 141.0 140.4 156.2
pH 4.0 4.2 4.2 4.3 4.3 4.4 4.4 4.5
(u/300mL sol= 용액 300ml 당 단위 (효소 활성))
결과는 산성 pH (약 4.0 내지 약 4.5)에서, 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함하는 제형 (제형 68B-71B)이 외관상 분산되고 더 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정되어 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다. 이러한 결과는 본 명세서에 개시된 제형으로 얻어진 개선된 안정성이 균질화 후에도 유지된다는 것을 보여준다.
실시 예 12: 균질화 및 농축 즙을 포함하는 대두 단백질 용액 (제형 72-74)
하기 표에 나타난 것과 같이, 대두 단백질 용액은 분말 형태의 분리된 콩 단백질 (NOW Foods)을 단백질로 사용하고 안정제로서 검을 (젤란검: Ticagel® Gellan HS NGMO; 펙틴: Pre Hydrated® Pectin 1694 분말; 둘 다 TIC Gums에서 시판) 사용하거나 사용하지 않고 단백질 탈아미드 효소로서 PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)를 사용하거나 사용하지 않고 준비하였다.
예를 들어, 0.06% 또는 0.075% (w/w) 젤란검과 0.45% (w/w) 펙틴을 물에 수화시켜 용액을 제조했다. 아래 표와 같이 대두 단백질의 양이 다른 대두 단백질 용액을 얻기 위해 대두 단백질 분리물을 첨가했다. 상기 PGA 500 함유 제형의 경우 단백질 0.67% ~ 2.4% (w/w)의 효소를 첨가하고 50°C에서 3시간 동안 배양하였다. PGA 500을 포함하지 않는 제형의 경우, 용액을 배양하지 않고 50°C로 가열했다. 산성화를 위해 베리 즙 농축액 (Old Orchard의 65 Brix에서 100 % Juice Berry Blend 농축액)을 1:2 w/w 비율로 첨가했다. 산성화된 용액을 2,000 ~ 2,500 psi로 균질화한 후 85°C에서 10분간 열처리하였다. 다른 제형들은 유사한 공정으로 만들어졌다. 단백질 탈아미드 효소의 활성은 실시 예 16에 따라 결정되었다.
생성된 용액을 실험실 VWR 냉장고에 4°C에서 저장하고 상기 실시 예 6에 대해 설명된 바와 같이 평가하였다. 결과는 아래 표에 보고되며 도 7에 도시된다.
제형 72A 72B 73A 73B 74A 74B
% 단백질 4.2% 4.2% 5.0% 5.0% 6.0% 6.0%
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 (%-단백질) - 2.4% - 0.67% - 0.67%
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 (u/300mL sol) - 224U - 75U - 90U
검 젤란검0.04%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.04%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%		 젤란검
0.05%

펙틴
0.3%
육안 검사 침강 용액 분산 침강 용액 분산 침강 용액 분산
흡광도 (280nm) 41.3 90.4 76.2 85.8 84.6 106.8
pH 4.1 4.3 4.3 4.4 4.4 4.6
결과는 산성 pH (약 4.0 내지 약 4.5)에서, 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함한 제형 (제형 72B-74B)이 외관상으로 분산되었으며 더 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정되어 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다. 이러한 결과는 본 명세서에 개시된 제형으로 얻어진 개선된 안정성이 균질화 후에도 유지된다는 것을 보여준다.
실시 예 13: 균질화 및 즙 농축물을 갖는 땅콩 단백질 용액 (제형 75-77)
하기 표와 같이, 땅콩 단백질 분말 (Tru-Nut Company)을 단백질로 사용하고, 검을 (젤란검: Ticagel® Gellan HS NGMO; 펙틴: Pre-Hydrated® Pectin 1694 Powder; 둘 다 TIC Gums에서 제공) 포함하거나 포함하지 않으며 단백질 탈아미드화 효소로서 PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)를 사용하거나 사용하지 않고 땅콩 단백질 용액을 제조했다.
예를 들어, 아래 표와 같이 젤란과 펙틴을 물에서 수화시켜 용액을 제조하였다. 하기 표와 같이 땅콩 단백질의 양이 다른 땅콩 단백질 용액을 얻기 위해 땅콩 단백질을 첨가했다. 상기 PGA 500 함유 제형의 경우 단백질 0.67% ~ 3.6% (w/w)의 양으로 효소를 첨가하였으며, 50°C에서 3시간 동안 배양했다. PGA 500이 포함되지 않은 제형의 경우, 용액을 배양하지 않고 50°C로 가열했다. 산성화를 위해 베리 즙 농축액 (Old Orchard의 65 Brix에서 100% 베리 블렌드 농축액)을 1:2 w/w의 비율로 첨가했다. 산성화된 용액을 2,000 ~ 2,500 psi로 균질화한 후 85°C에서 10분간 열처리하였다. 다른 제형들은 유사한 공정으로 만들어졌다. 단백질 탈아미드 효소의 활성은 실시 예 16에 따라 결정되었다.
생성된 용액을 실험실 VWR 냉장고에 4 °C에서 저장하고 상기 실시 예 6에 대해 설명된 바와 같이 평가하였다. 결과는 아래 표에 보고되며 도 8에 제시되어 있다.
제형 75A 75B 76A 76B 77A 77B
% 단백질 2.8% 2.8% 4.0% 4.0% 5.0% 5.0%
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 (%-단백질) - 3.6% - 0.67% - 0.67%
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 (u/300mL sol) - 224U - 60U - 75U
검 젤란검0.04%

펙틴
0.6%		 젤란검
0.04%

펙틴
0.6%		 젤란검
0.02%

펙틴
0.6%		 젤란검
0.02%

펙틴
0.6%		 젤란검
0.03%

펙틴
0.6%		 젤란검
0.03%

펙틴
0.6%
육안 검사 침강 용액 분산 침강 용액 분산 침강 용액 분산
흡광도 (280nm) 43.7 113.4 48.0 137.4 38.9 125.6
pH 3.9 4.0 4.2 4.3 4.1 4.2
결과는 산성 pH (약 4.0 내지 약 4.5)에서, 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검 포함 제형 (제형 75B-77B)이 외관상 분산되며 더 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정되어 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다. 이러한 결과는 본 명세서에 개시된 제형으로 얻어진 개선된 안정성이 균질화 후에도 유지된다는 것을 보여준다.
실시 예 14: 균질화된 아몬드 단백질 용액 (제형 78-79)
하기 표와 같이, 아몬드 단백질 용액은 아몬드 단백질 분말 (Noosh Brands)을 단백질로 사용하고 검을 (젤란검: Ticagel® Gellan HS NGMO; 펙틴: Pre-Hydrated® Pectin 1694 Powder; 둘 다 TIC Gums에서 제공) 안정제로 포함하거나 포함하지 않고 단백질 탈아미드 효소로서 PGA 500 (Amano Enzyme Inc.)를 사용하거나 사용하지 않고 제조했다.
예를 들어, 0.06% (w/w) 젤란검 또는 0.45% (w/w) 펙틴을 물에 수화시켜 용액을 제조했다. 아몬드 단백질이 3% (w/w)인 아몬드 용액을 얻기 위해 아몬드 단백질이 첨가되었다. 상기 PGA 500 함유 제형의 경우 단백질의 3.3% (w/w) 효소를 첨가하고 50°C에서 3시간 동안 배양하였다. PGA 500을 포함하지 않는 제형의 경우, 용액을 배양하지 않고 50°C로 가열했다. 산성화를 위해 베리 즙 농축액 (Old Orchard의 65 Brix에서 100 % Juice Berry Blend 농축액)을 1:2 w/w 비율로 첨가했다. 산성화된 용액을 2,000 ~ 2,500 psi로 균질화한 후 85°C에서 10분간 열처리하였다. 탈아미드 효소인 단백질의 활성은 실시 예 16에 따라 결정하였다.
생성된 용액을 실험실 VWR 냉장고에 4 ° C에서 저장하고 상기 실시 예 6에 대해 설명된 바와 같이 평가하였다. 결과는 아래 표에 보고되어 있다.
제형 78A 78B 79A 79B
% 단백질 3.0% 3.0% 3.0% 3.0%
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소 (%-단백질) - 3.3% - 3.3%
단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소(u/300mL sol) - 224U - 224U
검 젤란검0.04% 젤란검
0.04%		 펙틴
0.3%		 펙틴
0.3%
육안 검사 용액 분리 용액 분산 용액 분리 용액 분산
흡광도 (280nm) 24.4 132.8 21.5 244.4
pH 4.0 4.2 4.0 4.2
결과는 산성 pH (약 4.0)에서 본 개시 내용에 따라 PGA 500 및 검을 포함하는 제형 (제형 78B-79B)이 외관상 분산되며 더 가용화된 단백질이 많아 더 높은 흡광도가 측정되어 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다. 이러한 결과는 본 명세서에 개시된 제형으로 달성된 개선된 안정성이 균질화 후에도 유지된다는 것을 보여준다.
또한 약 4.0 내지 약 4.2의 pH에서, 검을 포함하는 PGA 500 제형 (제형 78B 및 79B)이 모두 안정적이라는 것은 높은 흡광도 값 (더 가용화된 단백질)이 측정되었으며, PGA 500이 없지만 검을 함유한 다른 제형 (제형 78A 및 79A)에 비해 침전 및 침강이 덜 나타난다는 점에서 볼 수 있다. 이러한 결과는 PGA 500과 검의 조합에서 관찰된 안정성이 균질화 후에도 유지된다는 것을 보여준다.
실시 예 15: 장기 안정성 연구
장기 안정성 연구는 다음과 같이 수행되고 있다. 아래에 설명된 제형은 상업적으로 저온 살균되고 안정적인 제품을 생산하기 위해 인증된 시험 공장에서 혼합되었으며 무균 포장되었고, 냉장 조건 (4°C)에서 최대 6개월 동안 보관되었다. 이러한 제품은 단백질 침전에 대해 안정적일 것이다.
구성요소 대조 제형 단백질 탈아미드
효소 제형
완두콩 단백질 4.0% 4.0%
PGA-500
(Amano Enzyme Inc.)		 -- 1.0%
젤란검 (Ticalgel ® ) 0.04% 0.04%
펙틴 0.4% 0.4%
색소 1.0% 1.0%
즙 농축물 9.84% 9.84%
물 84.72% 83.72%
예를 들어, 상업적으로 살균된 제형을 준비하기 위해 다음과 같은 공정이 사용될 수 있다:
1. 펙틴검, 젤란검, 물, 완두콩 단백질의 무게를 잰다.
2. 전단력이 높은 조건에서 검과 물을 혼합한다.
3. 85°C로 가열하고 온도를 유지하여 용액에서 검을 활성화한다.
4. 검을 100L 용기의 물에 옮기고 단백질을 추가한다.
5. 효소를 용기에 넣고 완전히 섞는다. 50°C에서 3시간 동안 수행되는 배양을 위해 용액을 용기로 옮긴다.
6. 농축 즙과 식용 색소의 무게를 잰다.
7. 용액을 100L 용기에 다시 넣고 농축 즙과 식용 색소를 추가한다.
8. 적절하게 혼합되면 혼합물을 살균하기 위해 초고온살균 (UHT, 약 120°C에서 약 1초 내지 약 3초 동안)/ 고온단시간살균 (HTST, 예를 들어 100°C 약 10초 내지 약 20초 동안) 처리한다.
9. 살균된 제품을 2000 PSI에서 균질화하기 위해 균질화기에 공급한다.
10. 멸균 환경에서 제품을 병에 옮긴 후 뚜껑을 덮은 다음 보관을 위해 상자로 옮긴다.
지금까지의 안정성 연구에 따르면 위에서 설명한 단백질 탈아미드 효소 제형은 4°C에서 25주 동안 보관한 후에도 안정적이다.
실시 예 16: 단백질 탈아미드 효소 활성 분석
단백질 탈아미드 효소의 활성은 단백질 글루타미나아제 탈아미드화 활성과 관련하여 예시된 다음 방법에 의해 결정될 수 있다. 단백질 아스파라기나아제 탈 아미드화에 적합한 기질 (예를 들어, Z-Asn-Gly)을 사용하여 단백질 아스파라기 나아제 탈아미드화 활성에 대해 유사한 분석을 수행할 수 있다.
30mM Z-Gln-Gly (단백질 글루타미나아제 탈아미드화 활성 분석을 위한 기질)를 함유하는 0.2M 인산 버퍼(pH 6.5) 1ml에 단백질 탈아미드 효소를 함유하는 수용액 0.1mL를 첨가하여 시험 용액을 준비하고 37 ° C에서 10분 동안 배양한다. 0.4M 트리클로로아세트산 (TCA) 용액 1mL를 첨가하여 반응을 종료한다. 30mM Z-Gln-Gly (단백질 글루타미나아제 탈아미드 활성 분석용)를 함유하는 0.2M 인산 버퍼(pH 6.5) 1ml를 함유하고 0.4M 트리클로로 아세트산 (TCA) 용액 1mL를 포함하는 용액에 단백질 탈아미드 효소를 함유하는 수용액 0.1mL를 첨가하여 블랭크 용액을 제조하고 37 °C에서 10분 동안 배양한다. 상기 시험 용액에서 상기 반응에 의해 생성된 암모니아의 양은 암모니아 테스트 와코 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd 제품)를 사용하여 측정된다. 암모니아 농도는 암모니아 표준 용액 (염화 암모늄)을 사용하여 준비된 흡광도 (630nm에서) 대 암모니아 농도의 검량선을 사용하여 결정된다. 단백질 탈아미드 효소의 활성은 다음과 같이 계산할 수 있다 (1 단위 = 분당 1μmol의 암모니아를 생성하는 데 필요한 효소의 양).
효소 활성 (μ / mL) = (반응 용액의 암모니아 농도 (mg / L)) x (1 / 17.03) x (2.1 / 0.1) x (1/10) x Df 여기서 :
17.03은 암모니아의 분자량이고;
2.1은 위 프로토콜에서 효소 반응 시스템의 유체 부피 (mL),
0.1은 위 프로토콜에서 효소 용액 (ML)의 부피,
10은 상기 프로토콜의 반응 시간 (분)이고;
Df는 효소 용액의 희석률이다.
종합적으로, 이들 실시 예는 다양한 공급원으로부터의 다양한 단백질에 대해 본 명세서에 기재된 바와 같은 안정적인 단백질 용액이 제조될 수 있고, 그러한 단백질 용액이 과일 즙 농축물로 산성화된 제형을 포함하여 산성 pH에서 단백질의 침전에 대해 안정적이라는 것을 보여준다. 위 실시 예들은 또한 단백질 용액이 본 명세서에 기재된 바와 같이 균질화 후 안정적임을 보여준다.
<110> AMANO ENZYME USA CO., LTD. AMANO ENZYME INC. <120> STABLE PROTEIN FORMULATIONS <130> KL-P-03136-IC <150> US 62/810,891 <151> 2019-02-26 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 185 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chryseobacterium proteolyticum <400> 1 Leu Ala Ser Val Ile Pro Asp Val Ala Thr Leu Asn Ser Leu Phe Asn 1 5 10 15 Gln Ile Lys Asn Gln Ser Cys Gly Thr Ser Thr Ala Ser Ser Pro Cys 20 25 30 Ile Thr Phe Arg Tyr Pro Val Asp Gly Cys Tyr Ala Arg Ala His Lys 35 40 45 Met Arg Gln Ile Leu Met Asn Asn Gly Tyr Asp Cys Glu Lys Gln Phe 50 55 60 Val Tyr Gly Asn Leu Lys Ala Ser Thr Gly Thr Cys Cys Val Ala Trp 65 70 75 80 Ser Tyr His Val Ala Ile Leu Val Ser Tyr Lys Asn Ala Ser Gly Val 85 90 95 Thr Glu Lys Arg Ile Ile Asp Pro Ser Leu Phe Ser Ser Gly Pro Val 100 105 110 Thr Asp Thr Ala Trp Arg Asn Ala Cys Val Asn Thr Ser Cys Gly Ser 115 120 125 Ala Ser Val Ser Ser Tyr Ala Asn Thr Ala Gly Asn Val Tyr Tyr Arg 130 135 140 Ser Pro Ser Asn Ser Tyr Leu Tyr Asp Asn Asn Leu Ile Asn Thr Asn 145 150 155 160 Cys Val Leu Thr Lys Phe Ser Leu Leu Ser Gly Cys Ser Pro Ser Pro 165 170 175 Ala Pro Asp Val Ser Ser Cys Gly Phe 180 185

Claims (39)

  1. 용액의 부피를 기준으로 약 0.1% 내지 약 30% w/v의 단백질;
    용액의 부피를 기준으로 약 0.001% 내지 약 5% w/v의 안정제; 및
    용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 0.5 U 내지 약 50 U의 단백질 탈아미드 효소 활성 또는 약 0.1% 내지 약 10% w/w의 단백질 탈아미드 효소를 포함하고,
    약 3.5 내지 약 7.0의 pH를 가지며 단백질의 침전에 대해 안정적인 단백질 용액.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질의 글루타민 잔기의 아미도기를 탈아미드화시키는 단백질 글루타미나아제 탈아미드 효소인, 용액.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단백질 탈아미드 효소는 단백질의 아스파라긴 잔기의 아미도기를 탈아미드화시키는 단백질 아스파라기나제 탈아미드 효소인, 용액.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질이 식물 단백질, 유제품 단백질 및 곤충 단백질 중 하나 이상을 포함하는, 용액.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 단백질은 콩, 완두콩, 렌틸콩, 병아리콩, 레귐, 대마, 쌀, 견과류, 밀 및 글루텐 단백질 중 하나 이상을 포함하는 용액.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 견과류는 땅콩, 아몬드 또는 개암인, 용액.
  7. 제4항에 있어서,
    상기 단백질이 유청 단백질을 포함하는, 용액.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 단백질이 귀뚜라미, 땅강아지, 누에, 붉은야자나무바구미, 메뚜기, 전갈, 잠수 딱정벌레, 잔날개바퀴, 지렁이, 갈색 거저리 및 거미 단백질 중 하나 이상의 곤충 단백질을 포함하는, 용액.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 안정제가 검 성분, 다당류 및 콜라겐 중 하나 이상을 포함하는, 용액.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 안정제가 잔탄검, 젤란검, 카라기난검, 카시아검, 로커스트콩검, 타라검, 사일리움씨드검, 젤라틴, 타마린드시드검, 아라비아검, 프로필렌글리이콜알지네이트, 펙틴, 갈락토만난(구아검), 풀루란, 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC), 메틸셀룰로오스 (MC), 및 이들의 유도체 또는 조합 중 하나 이상을 포함하는, 용액.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 탈아미드 효소가 크리세오박테리움, 플라보박테리움, 엔페도박터, 스핑고박테리움, 아우레오박테리움, 미로이데스, 사이토파갈레스, 방선균 및 플라보 박테리아에서 선택되는 박테리아에 의해 생성되는, 용액.
  12. 제 1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 탈아미드 효소가 페니실리움 미생물에 의해 생성되는, 용액.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 탈아미드 효소가 프로테인 글루타미나아제 아마노 500 (PGA 500)인, 용액.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 탈아미드 효소가 서열 번호 1의 아미노산 서열, 또는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 의 상동성을 가지며 단백질 탈아미드 효소 활성을 갖는 서열을 포함하는, 용액.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 탈아미드 효소가 단백질 탈아미드 효소 활성을 갖고 서열 번호 1의 아미노산 잔기 35, 38-43, 45, 46, 49, 79-84, 103-106, 117, 142, 143, 146, 166 또는 185에서 하나 이상의 치환 또는 결실을 갖는 서열 번호 1의 변이 아미노산 서열을 포함하며, 상기 변이 서열은 선택적으로 서열 번호 1과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한, 용액.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 약 0.001% 내지 약 1% w/v의 안정제; 및
    용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 5 U 내지 약 50 U의 단백질 탈아미드 효소 활성 또는 약 1% 내지 약 10% w/w의 단백질 탈아미드 효소를 포함하는, 용액.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액은 약 10 내지 약 250 mPa·s의 점도를 갖는, 용액.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 약 5% 내지 약 15% w/v의 단백질을 포함하는, 용액.
  19. 제17항에 있어서,
    상기 용액은 용액의 부피를 기준으로 약 0.01% 내지 약 1% w/v, 또는 약 0.02% 내지 약 0.5% w/v의 안정제를 포함하는, 용액.
  20. 제17항에 있어서,
    상기 용액은 용액 내 단백질의 중량을 기준으로 약 5 U 내지 약 25 U의 단백질 탈아미드 활성 또는 약 1% w/w 내지 약 5% w/w의 단백질 탈아미드 효소를 포함하는, 용액.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액은 약 4.0 내지 약 7.0 또는 약 4.0 내지 약 5.0 인 pH를 갖는, 용액.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액은 7일, 14일, 21일, 1개월, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월 중 선택되는 기간 동안 4°C에서 보관 후 단백질의 가시적 침전에 대해 안정적인, 용액.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액은 인간 또는 동물의 소비를 위한 음료 또는 음료 첨가제로 제형화되는, 용액.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 용액을 포함하는, 인간 또는 동물의 소비를 위한, 음료 또는 음료 첨가제.
  25. 제24항에 있어서,
    영양 음료, 스포츠 음료, 기능성 단백질 음료, 유제품 음료, 유제품 스무디, 과일 음료, 과일 스무디, 커피 음료, 차 음료, 식물성 우유, 유제품 크리머 및 비 유제품 크리머 중에서 선택되는, 음료 또는 음료 첨가제.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서,
    과일 즙, 과일 즙 농축물, 야채 즙 및 야채 즙 농축물 중 하나 이상을 더 포함하는, 음료 또는 음료 첨가제.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 조성물은 산성 즙 또는 즙 농축물을 포함하는, 음료 또는 음료 첨가제.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 용액 또는 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항의 음료 또는 음료 첨가제를 제조하는 방법으로서,
    (a) 상기 단백질 및 상기 안정제를 포함하는 용액에 상기 단백질 탈아미드 효소를 첨가하여 혼합물을 얻는 단계;
    (b) 상기 혼합물을 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 혼합물을 산성화하여 pH가 약 3.5 내지 약 7.0 인 용액을 얻는 단계를 포함하는, 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    단계 (a) 전에 (i) 상기 단백질을 포함하는 용액 및 (ii) 상기 안정제를 포함하는 용액을 혼합하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 배양은 약 30°C 내지 약 70°C 에서 약 0.5시간 내지 약 48시간 동안 약 3.0 내지 약 8.0의 pH로 교반하며 진행되는, 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 배양은 약 40°C 내지 약 60°C의 온도에서 약 5.0 내지 약 8.0의 pH로 천천히 교반하면서 약 3시간 내지 약 24시간 동안 진행되는, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양은 상기 용액 내 유리 암모늄 이온의 농도에 의해 결정된 바와 같이, 효소 반응이 원하는 수준의 완료에 도달할 때까지 수행되는, 방법.
  33. 제28항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 산성화가 산성 즙 또는 즙 농축물을 첨가하는 것을 포함하는, 방법.
  34. 제28항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단백질 탈아미드 효소가 프로테인 글루타미나아제 "아마노" 500 (PGA 500)이고/이거나 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖고, 상기 배양이 50°C에서 3시간 동안 수행되는, 방법.
  35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액을 약 10분 동안 약 85°C의 열처리로 저온 살균하는 단계를 더 포함하는, 방법.
  36. 제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용액을 균질화, 저온 살균 및 멸균 중 선택된 하나 이상의 처리에 적용하는 것을 더 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 용액이 약 2,000 psi 내지 약 20,000 psi의 압력에서 균질화되는, 방법.
  38. 제36항에 있어서,
    상기 용액은 약 100°C에서 약 10초 내지 약 20초 동안의 고온단시간살균 (HTST), 약 120°C에서 약 1초 내지 약 3초 동안의 초고온 살균(UHT), 또는 약 75°C 내지 약 85°C에서 약 10분 내지 약 20분 동안의 장시간 저온 살균(LTLT)을 이용하여 저온 살균되는, 방법.
  39. 제36항에 있어서,
    상기 용액은 고압 (hyperbaric) 멸균 처리되는, 방법.
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