KR20210126264A

KR20210126264A - 글루타민 수송체 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역관문 억제제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20210126264A
Application number: KR1020200043827A
Authority: KR
Inventors: 박근규; 최연경; 변준규; 박미향
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2021-10-20
Also published as: KR102320885B1

Abstract

본 발명은 글루타민 수송체 억제제를 이용한 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물 등에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 조성물은 면역관문 억제제에 의한 항암 작용에 있어서 T 세포의 활성을 증가시키고 종양 내 T 세포의 침윤 반응을 증가시킴으로써, 항암 효과를 현저하게 향상시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 기존의 면역관문 억제제 단독 투여만으로는 치료 효과를 보이지 않은 암 환자를 포함하여 다양한 암 환자를 치료하기 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

글루타민 수송체 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역관문 억제제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물 {Pharmaceutical Composition for Enhancing Anti-Cancer Effect of Immune Checkpoint Inhibitors Comprising Glutamine Transporter Inhibitor as an Active Ingredient}

본 발명은 글루타민 수송체 억제제를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물 등에 관한 것이다.

우리나라 국민의 가장 주요한 사망원인 중 하나는 악성신생물(malignant neoplasm, 암)에 의한 것이다. 면역관문 억제제(CTLA4, PD-L1, 또는 PD-1에 대한 단클론항체)는 암 자체를 공격하는 기존 항암제와는 달리 면역체계를 자극함으로써 면역세포가 선택적으로 암세포만을 공격하도록 유도한다. 면역관문 억제제는 다양한 암종에서 임상적으로 큰 성공을 거두었으나, 치료 반응이 다양하여 많은 환자들이 치료에 불응하거나 재발을 경험할 수 있다. 면역 항암제에 대한 약물 내성 메커니즘은 아직 잘 알려지지 않았지만, 면역억제성 종양 미세환경(immunosuppressive tumor microenvironment)이 관여된다고 알려져 있다. 따라서 표적치료 또는 고식적 항암요법 등과의 병용치료가 면역세포 매개의 항암작용을 촉진하는 잠재적 치료 전략으로서 주목 받고 있다.

한편, 글루타민은 암 대사(metabolism)에서 필수적인 영양소로서 암세포의 주 에너지원이며 빠른 증식에 필요한 생합성 과정에서 질소원으로 작용한다. 이를 바탕으로 글루타민 대사를 제어하는 전략들이 여러 암종에서 시도되어 왔으나 임상적으로 성공하지 못하였다. 글루타민 대사를 차단하더라도 암세포는 다양한 경로를 통해 대사적 적응을 일으켜 생존하고 증식을 지속하기 때문인데, 아직까지 글루타민 대사의 변화가 항종양 면역반응에 미치는 영향에 대한 연구는 부족한 실정이다.

Shukla, K., Ferraris, D. V., Thomas, A. G., Stathis, M., Duvall, B., Delahanty, G., Alt, J., Rais, R., Rojas, C., Gao, P., et al. (2012). Design, synthesis, and pharmacological evaluation of bis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide 3 (BPTES) analogs as glutaminase inhibitors. Journal of medicinal chemistry 55, 10551-10563.

이에 본 발명자들은 글루타민 수송체 억제제(Glutamine transporter inhibitor)가 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitors)의 항암 효과를 효과적으로 증진시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 글루타민 수송체 억제제를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제(Glutamine transporter inhibitor)를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitors)의 항암 효과 증진용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역관문 억제제의 항암 효과 증진 방법을 제공한다.

더욱이, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제의, 면역관문 억제제 항암 효과 증진 용도를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제의, 암의 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공한다.

더욱이, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제의 암에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 글루타민 수송체는 나트륨 의존성 중성 아미노산 수송체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 글루타민 수송체 억제제는 글루타민 수송체에 대한 역작용제(inverse agonist) 또는 길항제(antagonist), 또는 글루타민 수송체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머(aptamer)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 글루타민 수송체 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 0 또는 1이고; 및 R은 각각 독립적으로 H, F, Cl, CF₃, OH, 탄소수 1 내지 6의 분지 또는 직쇄의 알킬기(alkyl group), 또는 탄소수 1 내지 4의 분지 또는 직쇄의 알콕시기(alkoxy group)이다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 V-9302[(2S)-2-Amino-4-(bis(2-((3-methylbenzyl)oxy)benzyl)amino)butanoic acid] 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1 및 PD-L1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 항체는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 또는 더발루맙(Durvalumab)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 T 세포의 활성 또는 침윤 반응의 증가를 유도하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 조성물은 면역관문 억제제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 의하면, 글루타민 수송체 억제제는 면역관문 억제제에 의한 항암 작용에 있어서 T 세포의 활성을 증가시키고 종양 내 T 세포의 침윤 반응을 증가시킴으로써, 항암 효과를 현저하게 향상시키는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 α-PD-L1 항체와 같은 면역관문 억제제의 항암 효과를 증진시켜 다양한 암을 치료하기 위한 조성물로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a 내지 도 1c는 글루타민이 결핍된 환경에서 암 세포의 PD-L1 발현이 변화하는지 여부를 확인한 도이다: (도 1a) 폐암 세포주 H460 및 대장암 세포주 CT26에서 글루타민 농도에 따른 PD-L1 단백질 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 실험 결과; (도 1b) 글루타민 이외의 아미노산 결핍이 암 세포에서 PD-L1 발현에 미치는 영향을 확인한 웨스턴 블롯 실험 결과; (도 1c) 암 세포 표면의 PD-L1 발현 수준을 유세포 분석기를 이용하여 확인한 결과.
도 2a 및 도 2b는 암 세포주에서 글루타민 대사를 억제하였을 때 PD-L1 발현이 변화하는지 여부를 확인한 도이다: (도 2a) 글루타민 수송체 억제제 V-9302를 처리한 경우의 PD-L1 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 실험 결과; (도 2b) 글루타미나아제 1 억제제 BPTES를 처리한 경우의 PD-L1 발현 수준을 확인한 웨스턴 블롯 실험 결과.
도 3a 내지 도 3d는 V-9302와 α-PD-L1 항체가 T 세포 유도의 암 세포 사멸에 미치는 영향을 확인한 도이다: (도 3a 및 도 3b) V-9302 및/또는 α-PD-L1 항체 투여시 말초혈액 단핵세포(PBMC)의 존재 유무에 따른 H460 세포주(도 3a) 및 CT26 세포주(도 3b)에서 카스파제 3/7의 활성도를 비교한 그래프; (도 3c 및 도 3d) V-9302 및/또는 α-PD-L1 항체 투여시 T 세포의 존재 유무에 따른 H460 세포주(도 3c) 및 CT26 세포주(도 3d)에서 세포 수를 비교한 그래프.
도 4a 및 도 4b는 V-9302와 α-PD-L1 항체의 종양 성장 억제 효과를 확인한 도이다: (도 4a) T 세포 결핍 누드마우스에서 V-9302의 종양 억제 효과를 나타낸 그래프; (도 4b) 정상 BALB/c 마우스에서 V-9302 및/또는 α-PD-L1 항체의 종양 억제 효과를 비교한 그래프.
도 5a 내지 5d는 V-9302와 PD-L1 항체가 종양 내 PD-L1 단백질의 발현과 T 세포 활성화에 미치는 영향을 확인한 도이다: (도 5a 및 도 5b) V-9302 및/또는 α-PD-L1 항체 투여 후 Ki67 및 절단된(cleaved) 카스파제-3 양성 세포를 면역화학염색을 통해 확인한 현미경 사진(도 5a) 및 정량화한 그래프(도 5b); (도 5c 및 도 5d) V-9302 및/또는 α-PD-L1 항체 투여 후 PD-L1, CD8 및 그랜자임 B 양성 세포를 면역화학염색을 통해 확인한 현미경 사진(도 5c) 및 정량화한 그래프(도 5d).

본 발명은 글루타민 수송체 억제제(Glutamine transporter inhibitor)를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitors)의 항암 효과 증진용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 글루타민의 결핍에 의해 암 세포에서 PD-L1의 발현이 상향 조절되며, 암 세포에서 글루타민의 대사를 억제한 경우 PD-L1의 발현 수준이 증가함을 확인하였다(실시예 1 참조).

또한, 본 발명의 일 실시예에서는 α-PD-L1 항체 단독요법은 면역세포에 의한 암 세포 사멸에 큰 영향을 미치지 못하였지만, V-9302와 병용 투여한 경우에는 면역세포에 의한 암세포 사멸이 극대화됨을 확인하였다(실시예 2 참조).

뿐만 아니라, 본 발명의 일 실시예에서는 V-9302와 α-PD-L1 항체의 병용 요법이 종양 내 T 세포의 침윤 반응과 활성도를 증가시켜 항암 효과를 현저하게 상승시킴을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명에 있어서, 상기 글루타민 수송체는 나트륨 의존성 중성 아미노산 수송체(예를 들어 SLC1A5)일 수 있으나, 글루타민을 세포 내로 흡수(uptake)하는 것이라면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 글루타민 수송체 억제제는 글루타민 수송체에 대한 역작용제(inverse agonist) 또는 길항제(antagonist), 또는 글루타민 수송체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머(aptamer)일 수 있으나, 글루타민의 흡수를 방해할 수 있는 물질이라면 상기 열거한 물질의 형태로 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어, “역작용제(Inverse agonist)” 또는 “길항제(antagonist)”는 수송체의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로 감소시킬 수 있는 분자를 의미하며, 수송체의 리간드와 함께 사용하는 경우에 상기 리간드의 결합 및/또는 흡수를 감소시킬 수 있는 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, “항체”는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미하는데, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, “앱타머(aptamer)”는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학 합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다. 앱타머는 표적에 특이적으로 결합하고 표적의 활성을 조정할 수 있는데, 예컨대, 결합을 통하여 표적이 기능하는 능력을 차단할 수 있다.

상기 역작용제 및 길항제는 화합물일 수 있다.

특히, 상기 글루타민 수송체 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:

[화학식 1]

보다 구체적으로, 상기 화학식 1에서 R은 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 분지 또는 직쇄의 알킬기일 수 있으며, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로프-1-일, 프로프-2-일, 1-메틸-프로프-1-일, 2-메틸-프로프-2-일, 2,2-디메틸-프로프-1-일, 부트-1-일, 부트-2-일, 3-메틸-부트-1-일, 3-메틸-부트-2-일, 펜트-1-일, 펜트-2-일, 펜트-3-일, 헥스-1-일, 헥스2-일, 및 헥스-3-일 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 화학식 1에서 R은 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 4의 분지 또는 직쇄의 알콕시기일 수 있으며, 예를 들면 -O-R'의 구조를 갖으며 여기서 R'는 탄소수 1 내지 4의 분지 또는 직쇄의 알킬기를 의미한다. 바람직한 알콕시기는 예를 들면, 메톡시기, 에톡시기, 페녹시기 등을 포함한다.

상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 글루타민 수송체 억제제로서 당업계에 공지되어 있다. 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 대표적인 예시로서 하기 열거한 화합물들은 기존에 발표된 논문 등을 통하여 글루타민 수송체 억제 활성이 확인된 것으로, 쉽게 입수할 수 있는 화합물들이다.

[화학식 1로 표시되는 화합물의 대표적인 예]

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본 명세서에서 사용된 용어, “약학적으로 허용 가능한”이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제점이나 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체(예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 화합물 또는 조성물을 의미한다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용할 수 있다.

산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산 또는 아인산과 같은 무기산류와 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류와 같은 무독성 유기산으로부터 얻을 수 있다.

이러한 약학적으로 무독한 염류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트 또는 만델레이트를 포함한다.

본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법, 예를 들면, 상기 화학식 1의 화합물을 산 수용액 중에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시키거나 또는 석출된 염을 흡입 여과시켜 제조할 수도 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수도 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면, 상기 화학식 1의 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약 상 적합할 수 있다. 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 화학식 1로 표시되는 화합물의 범위에는 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 이성질체, 수화물 및 용매화물이 모두 포함될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “예방”이란, 암 세포의 증식 전에 선제적으로 본 발명에 따른 약학적 조성물을 투여하여 암 세포의 증식을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “항암 효과 증진”이란, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암 종양의 크기가 감소하는 것을 포함하여 암의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 상태를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 “치료”란, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 암에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 V-9302[(2S)-2-Amino-4-(bis(2-((3-methylbenzyl)oxy)benzyl)amino)butanoic acid] 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. V-9302는 하기 화학식 2의 구조를 가지고 있으며, 본 발명에 따른 효과를 나타내는 한 하기 화학식 2로 표시되는 화합물의 유사체, 유도체 또는 대사체 등이 이용될 수 있다.

[화학식 2]

본 발명에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1 및 PD-L1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 물질일 수 있다. 일 특정예에서, 상기 물질은 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항체 분자의 항원 결합 부위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어, “면역관문 억제제”는 일부 암세포가 체내 면역세포인 T 세포의 면역 체크포인트를 활용하면서 면역을 회피하는 경우에, T 세포 억제에 관여하는 면역 체크포인트 단백질(Immune Checkpoint Protein)의 활성화를 차단하여 T 세포를 활성화시켜 암세포를 공격하는 작용을 하는 면역 항암제의 일종으로서, CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4) 억제제, PD-1(Programmed cell death protein 1) 억제제, PD-L1(Programmed death-ligand 1) 억제제, LAG-3(Lymphocyte-activation gene 3) 억제제, TIM-3(T-cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3) 억제제, TIGIT(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains) 억제제 및 VISTA(V-domain Ig suppressor of T cell activation) 억제제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 면역관문 억제제는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으며, 상기 항체의 예로는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 또는 더발루맙(Durvalumab) 등을 들 수 있다. 또한, 상기 항체의 범위에는 완전한 형태의 항체뿐만 아니라, 항체 분자의 항원 결합 부위도 포함된다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암일 수 있으나, 면역관문 억제제는 기본적으로 암 세포에 대한 인체의 면역작용을 강화하여 항암 효과를 발휘하는 원리에 근거하므로, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 암의 종류에 관계 없이 모든 종류의 암에 대하여 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명에 따른 조성물은 T 세포의 활성 또는 침윤 반응의 증가를 유도하는 것일 수 있다. 이를 통하여 T 세포성 항암 효과를 유의하게 증가시킬 수 있음은 본 명세서의 실시예를 통하여 증명하였다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 약학적 조성물은 면역관문 억제제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다.

상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들면, 경구 투여, 비강 내 투여, 경기관지 투여, 동맥 주사, 정맥 주사, 피하 주사, 근육 주사 또는 복강 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루 일회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역관문 억제제의 항암 효과 증진 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제의, 면역관문 억제제 항암 효과 증진 용도를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제의, 면역관문 억제제 항암 효과 증진에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공할 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제를 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제의, 암의 예방, 개선 또는 치료 용도를 제공할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제의 암에 이용되는 약제를 생산하기 위한 용도를 제공할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, “개체”란 질병의 예방, 치료 또는 치료 증진을 필요로 하는 대상을 의미한다. 예를 들어, 상기 개체는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐, 개, 고양이, 말, 양 및 소를 포함하는 포유류일 수 있다.

본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실험예. 실험 방법 및 재료

1. 생체 외(in vitro) 실험

본 발명의 세포 실험은 폐암 세포주(H460) 및 대장암 세포주(CT26)를 이용하여 수행하였다. 세포 배양액에서 글루타민을 제거하고 배양하는 방법, 글루타미나아제(glutaminase) 1 억제제인 BPTES[bis-2-(5-phenylacetamido-1,2,4-thiadiazol-2-yl)ethyl sulfide] 또는 글루타민 수송체 억제제인 V-9302[(2S)-2-Amino-4-(bis(2-((3-methylbenzyl)oxy)benzyl)amino) butanoic acid]를 사용함으로써 글루타민이 결핍된 환경을 유발하였다. 상기와 같은 조건에서 각 암 세포주 내의 PD-L1 수준 변화를 웨스턴 블롯(western blot)과 FACs(fluorescence-activated cell sorter)를 이용한 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 통해 분석하였다.

웨스턴 블롯은 세포 용해물로부터 추출한 단백질을 NuPAGE^TM 12% 겔(Thermo Fisher Scientific, 미국)에 로딩하고 러닝이 끝난 겔은 전달 버퍼를 이용하여 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후 PD-L1 항체와 반응시켜 발현을 분석하였다. Membrane PD-L1을 분석하기 위해, 세포를 염색 완충액 중 PE-접합 PD-L1 항체(Thermo Fisher Scientific)와 반응시켜 실온에 30분 배양한 후 염색된 세포는 cold staining buffer로 2회 세척하여 BD Accuri C6 유세포 분석기(BD Bioscience, 미국)를 이용하여 분석하였다.

2. 생체 내(in vivo) 실험

동물 실험에서는, BALB/c 마우스의 비장(spleen)에서 T 세포를 분리하여 암 세포와 함께 배양하고 세포 사멸의 정도를 평가하기 위해 카스파제 Glo 3/7 용액(promega, 미국)을 혼합하여 15시간 동안 반응시킨 후 발광도를 루미노미터(luminometer)를 이용하여 측정함으로써 카스파제 3/7의 활성도를 확인하였다.

또한, T 세포가 결핍된 누드마우스와 면역체계가 손상 받지 않은 BALB/c 마우스에 암 세포 주입(tumor injection)을 이용한 동종이식(allograft)을 수행하였다. 구체적으로, 동종이식한 종양이 촉진되면 누드 마우스에는 비히클(vehicle) 또는 V-9302(25 mg/kg)를 매일 복강내 주사(intra-peritoneal injection)로 투여하였으며, BALB/c 마우스에는 비히클 또는 V-9302(25 mg/kg)를 매일 투여하거나 랫트 IgG(대조군; 200 μg) 또는 α-PD-L1 항체(200 μg) 를 3일 간격으로 복강내 주사로 주입하였다. 실험 종료 시점에 종양의 크기를 측정하였고, 조직을 적출하여 4% 파라포름알데하이드로 고정하고 파라핀에 포매하여 조직 절편을 제작하였다. 파라핀을 제거하고 3% H₂O₂ 용액으로 10분간 내인성 퍼옥시다제(endogenous peroxidase)를 제거한 후, cleaved caspase-3(Cell Signaling Technology, 미국), 마우스 PD-L1, Ki 67(Thermo Fisher Scientific, 미국), CD8(Novus Biologicals, 미국), 그랜자임 B (Santa Cruz, 미국) 항체를 사용하여 면역조직화학(immunohistochemistry) 염색을 시행하였다. 이를 통해 PD-L1의 발현 정도 및 T 세포의 활성화를 평가하였다.

실시예 1. 글루타민 결핍에 따른 암 세포의 PD-L1 상향 조절 확인

1.1. 글루타민 결핍에 따른 PD-L1 발현 변화 확인

먼저, 본 발명자들은 글루타민이 결핍된 환경에서 암 세포의 PD-L1 발현이 변화하는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 글루타민이 제거된 세포 배양액에 글루타민을 농도 별로 첨가하여 세포를 24시간 동안 배양하였다.

그 결과 도 1a 내지 도 1c에 나타난 바와 같이, 글루타민의 농도가 낮을수록 폐암 및 대장암 세포주 모두에서 PD-L1의 발현 수준이 증가하는 것을 확인하였다(도 1a). 상기 결과와는 대조적으로 글루타민 이외의 아미노산이 결핍된 환경에서는 암 세포에서 PD-L1의 발현 수준이 유의하게 증가되지 않았다(도 1b). 이러한 결과를 통해 PD-L1의 발현 조절은 글루타민 특이적임을 확인하였다.

다음으로, 글루타민 결핍 환경에서 암 세포 표면의 PD-L1 발현 수준을 유세포 분석기를 이용하여 확인하였다. 그 결과 도 1c에 나타난 바와 같이, 글루타민이 결핍된 경우 암 세포 표면에서 PD-L1의 발현 수준이 증가한 것을 확인하였다.

1.2. 글루타민 대사 억제에 따른 PD-L1 발현 변화 확인

본 발명자들은 글루타민의 대사를 억제함으로써 암 세포에서 글루타민 결핍 환경을 만들고, 이 경우 PD-L1의 발현이 변화하는지 여부를 확인하였다.

그 결과 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이, 글루타미나아제 1 억제제인 BPTES 또는 글루타민 수송체 억제제인 V-9302를 처리한 경우, 약물을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 각 암 세포주에서 PD-L1의 발현 수준이 증가함을 확인하였다.

상기와 같은 결과는 암 세포에서 글루타민 대사와 PD-L1의 발현이 밀접한 연관성을 가지고 있음을 시사하는 것이다.

실시예 2. V-9302 투여가 T 세포 유도 암 세포 사멸에 미치는 영향 확인

면역관문 억제제는 T 세포의 활성을 증가시킴으로써 항암 효과를 나타낸다. 이에 V-9302의 병용 투여가 T 세포에 의해 유도되는 암 세포의 사멸에 미치는 영향을 알아보기 위해, T 세포 또는 말초혈액 단핵세포(Peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)가 존재하거나 부재한 환경에서 PD-L1, V-9302 또는 이들을 병용 투여하여 카스파제(capase) 3/7의 활성 및 세포 수를 측정하였다.

그 결과 도 3a 내지 도 3d에 나타난 바와 같이, 말초혈액 단핵세포 또는 T 세포가 없는 조건에서는 V-9302가 암 세포주의 caspase 3/7를 활성화시키지 않으면서(도 3a 및 도 3b) 암 세포주 증식만을 감소시켰다(도 3c 및 도 3d). 그러나 V-9302는 말초혈액 단핵세포나 T 세포 매개의 암 세포 사멸 작용을 약화시켰으며(도 3c 및 도 3d), 이를 통해 V-9302가 항종양 면역반응에 대한 내성을 유도함을 확인할 수 있었다. 또한, α-PD-L1 항체 단독요법은 면역세포에 의한 암 세포 사멸에 큰 영향을 미치지 못하였지만, V-9302와 병용 투여한 경우에는 면역세포에 의한 암세포 사멸이 극대화됨을 확인하였다(도 3c 및 도 3d).

실시예 3. 동물 모델에서 V-9302 및 α-PD-L1 항체의 병용 투여 효과 확인

CT26 세포주를 이용한 동물 모델에서 V-9302 및 α-PD-L1 항체의 병용 투여 효과를 확인하기 위해, 각각 T 세포가 결핍된 누드마우스와 정상적인 면역체계를 갖는 BALB/c 마우스에 CT26 암 세포주를 동종이식(allograft)하고, 각 약물을 투여하였다.

그 결과 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, V-9302는 T 세포가 결핍된 누드마우스의 경우 종양의 성장을 현저하게 억제하였으나, 면역이 손상되지 않은 BALB/c 마우스에서는 유의한 종양 성장 억제 효과가 없음을 확인하였다(도 4a). 또한, α-PD-L1 항체 단독으로는 종양 크기를 유의하게 감소시키지 못하였으나, α-PD-L1 항체 및 V-9302의 병용 요법에서는 α-PD-L1 항체 또는 V-9302 단독 요법과 비교하여 종양의 크기가 현저하게 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(도 4b).

또한, 도 5a 내지 도 5d에서 확인할 수 있는 바와 같이, 정상적인 면역체계를 가지고 있는 BALB/c 마우스에서는 V-9302 또는 α-PD-L1 항체의 단독 투여만으로는 종양 조직에서의 세포증식 표지인자인 Ki67를 감소시키지 못하였고, 절단된 카스파제-3(cleaved caspase-3) 또한 증가시키지 못하였다. 반면에 α-PD-L1 항체 및 V-9302를 병용 투여한 경우에는 절단된 카스파제가 크게 증가함을 면역화학염색을 통해 확인하였다(도 5a 및 도 5b). 또한, 상기 실시예 1 및 2의 세포 실험 결과와 일치되게, V-9302는 종양 내 PD-L1 단백질의 발현을 상향 조절시켰으며, α-PD-L1 항체와 병용시 CD8 양성 T 세포 수가 증가하였고, T 세포의 활성도를 나타내는 그랜자임 B(granzyme B)가 상향조절 됨을 확인하였다(도 5c 및 도 5d).

상기와 같은 결과를 종합하면, V-9302에 의한 종양 내 PD-L1 단백질의 상향 조절이 T 세포 매개성 항종양 면역반응을 억제하며, V-9302와 α-PD-L1 항체의 병용 요법이 종양 내 T 세포의 침윤반응과 활성도를 증가시킴을 보여주었다. 이로써 두 약제의 병용 투여가 T 세포 매개의 암 세포 사멸을 유의하게 증가시켜 각 약제의 단독 요법보다 우수한 항암효과가 있음을 실험적으로 증명하였다. 결론적으로, 상기 실시예를 통해 글루타민 수송체 억제제 또는 글루타민 대사 억제제와 α-PD-L1 항체의 병용 치료가 항암 면역치료의 유망한 전략이 될 수 있을 것으로 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

글루타민 수송체 억제제(Glutamine transporter inhibitor)를 유효성분으로 포함하는, 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitors)의 항암 효과 증진용 약학적 조성물.
글루타민 수송체 억제제; 및 면역관문 억제제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 글루타민 수송체는 나트륨 의존성 중성 아미노산 수송체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 글루타민 수송체 억제제는 글루타민 수송체에 대한 역작용제(inverse agonist) 또는 길항제(antagonist), 또는 글루타민 수송체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 앱타머(aptamer)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 글루타민 수송체 억제제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 0 또는 1이고; 및 R은 각각 독립적으로 H, F, Cl, CF₃, OH, 탄소수 1 내지 6의 분지 또는 직쇄의 알킬기(alkyl group), 또는 탄소수 1 내지 4의 분지 또는 직쇄의 알콕시기(alkoxy group)이다.
제5항에 있어서,
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 V-9302[(2S)-2-Amino-4-(bis(2-((3-methylbenzyl)oxy)benzyl)amino)butanoic acid] 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1 및 PD-L1으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 단백질에 특이적으로 결합하는 물질인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 면역관문 억제제는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제8항에 있어서,
상기 항체는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab) 또는 더발루맙(Durvalumab)인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 암은 폐암, 위암, 신경교종, 간암, 흑색종, 신장암, 요로상피암, 두경부암, 메르켈세포종(Merkel-cell carcinoma), 전립선암, 혈액암, 유방암, 대장암, 결장암, 직장암, 췌장암, 뇌암, 난소암, 방광암, 기관지암, 피부암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 갑상선암, 골암 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 조성물은 T 세포의 활성 또는 침윤 반응의 증가를 유도하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 면역관문 억제제와 동시에(simultaneous), 별도로(separate) 또는 순차적(sequential)으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.