KR20240004519A - 면역관문 억제제와 함께 akr1c3-활성화 화합물을 사용하는 병용 요법 - Google Patents

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Abstract

화합물 1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트, 및 화학요법제 또는 생물학적 제제를 포함하는 적어도 하나의 치료제를 포함하는 약학적 조성물, 및 그의 의학적 용도가 제공된다.

Description

면역관문 억제제와 함께 AKR1C3-활성화 화합물을 사용하는 병용 요법
본 발명은 화학요법제 또는 생물학적 제제를 포함하는 적어도 하나의 치료제와 조합된 화합물 1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트를 포함하는 조성물 및 그의 의학적 이용에 관한 것이다.
암은 인간의 질병률 및 사망률의 주요 원인 중 하나이다. 암 치료는 정상 세포를 손상시키거나 죽이지 않고 암세포를 죽이는 것이 어렵기 때문에 어렵다. 암 치료 중 정상세포를 손상시키거나 죽이는 것은 환자에게 부작용을 일으키는 원인이 되며, 암환자에게 투여되는 화학요법제의 양을 제한할 수 있다.
알도-케토 환원효소(aldo-keto reductase) 패밀리 1 멤버인 C3(AKR1C3)은 인간에서 AKR1C3 유전자에 의해 코딩되는 효소이다. 이 유전자는 40개 이상의 알려진 효소와 단백질로 구성된 알도/케토 환원효소 슈퍼패밀리의 멤버를 인코딩한다. 이들 효소는 NADH 및/또는 NADPH를 보조인자로 활용하여 알데히드와 케톤을 상응하는 알코올로 전환시키는 것을 촉매한다. 이는 타입 5, 17β-히드록시스테로이드 탈수소효소(17β-HSD) 및 프로스타글란딘 F 합성효소로도 알려져 있다. AKR1C3은 알도-케토 환원효소(AKR)의 15개 유전자 패밀리 중 하나이다. AKR1C3은 원래 인간 전립선(1) 및 태반(2) cDNA 라이브러리로부터 클로닝되었다. AKR1C3은 323개의 아미노산과 37kDa의 분자량을 갖는 단량체성 세포질 NAD(P) (H)-의존성 산화환원효소이다(1). AKR1C3은 AKR1C1, AKR1C2 및 AKR1C4를 포함하는 관련된 인간 AKR1C 패밀리와 높은 서열 상동성을 공유한다. AKR1C3은 안드로겐, 에스트로겐, 프로게스테론 및 프로스타글란딘(PG) 대사를 촉매하고, 이어서 핵수용체 활성의 조절에 관여한다(3,4). AKR1C3은, 간, 신장 및 소장을 제외하고, 스테로이드 호르몬-의존성 및 스테로이드 호르몬-비의존성 세포들을 포함하는 정상 조직에서 낮은 평균 발현 수준으로 발현된다(5). 많은 연구에서 AKR1C3이 많은 악성 고형 종양 및 혈액 종양에서 비정상적으로 과발현된다는 사실이 입증되었다. 데이터는 간암, 방광암, 신장암 및 위암의 50% 이상이 0 내지 6점 척도에서 면역조직화학 점수(IHC 점수)≥4의 높은 AKR1C3 발현으로 검출되었음을 보여준다(6). AKR1C3은 비소세포폐암(NSCLC)에서는 높게 발현되지만, 소세포폐암에서는 발현되지 않는다(7).
암에서의 AKR1C3 상향조절(upregulation)은 거세저항성 전립선암(CRPC(8)) 및 대장암(CRC(9))의 전이와 연관되어 있는 것으로 보고되었으며, 또한 불량한 예후 및 낮은 생존율과 연관되어 있다(10,11). 또한, 많은 유형의 치료 저항성은 AKR1C3의 과발현에 기인한다. 독소루비신(12,13), 엔잘루타마이드(14), 아비라테론(15) 및 메토트렉세이트(16)에 대한 화학요법 저항성은 세포에서의 높은 AKR1C3 발현과 직접적으로 관련이 있는 것으로 보고되었다. 식도암(17), 전립선암(18) 및 NSCL 암세포(19)의 방사선요법 저항성은 AKR1C3 과발현과 연관되어 있다. 전리 방사선에 대한 AKR1C3의 주요 작용 메커니즘은 세포의 ROS(활성산소종)를 감소시키고 PGF2a를 증가시켜, 결과적으로 MAP 키나제 활성화 및 PPARγ 억제를 유도하여 DNA 손상을 크게 감소시킨다(18). 면역요법 저항성은 또한 AKR1C3의 높은 발현에 기인한다. 한 연구에 따르면, AKR1C3의 높은 발현은, 전체 게놈 마이크로어레이 및 다중 정량적 (q)RT-PCR 유전자 발현 분석을 기반으로 한, 진행성 신장 세포 암종(RCC) PD-L1 양성 환자에서의 PD-1 표적 치료법의 실패와 관련이 있는 것으로 나타났다(20). AKR1C3의 종양 특이적 과발현으로 인해, AKR1C3 활성화 전구약물의 설계는 암을 특이적으로 표적으로 삼는 매력적인 접근법이 된다. 그러한 하나의 예는, AKR1C3 활성화 전구약물인 PR104인데, 이는 원래는 저산소증 활성화 전구약물로 설계되었지만(22-24), 시험관 내 및 생체 내에서 우수한 항종양 활성을 나타내었다(6,21).
본 출원의 화학식 Ⅰ-1의 항암 전구약물(본 명세서에서는 OBI-3424로 표기)은, NADPH의 존재 하에서 AKR1C3에 의한 세포독성 아지리딘(본 명세서에서는 OBI-2660으로 표기)으로 선택적으로 절단되는 화학적으로 합성된 강력한 질소 머스타드이다. OBI-3424에 의해 방출된 활성 분자 OBI-2660은 표준 화학요법 약물인 티오테파 및 미토마이신 C와 유사하며, 이는 구아닌의 N7(또는 06) 위치에서 DNA의 알킬화 및 가교를 유도한다. 전구약물 OBI-3424는 현재 악성 종양 치료를 위해 아시아 국가에서는 Ascentawits Pharmaceuticals, LTD에서 개발 중이며, 아시아 이외 국가에서는 OBI Pharma, Inc.(약물코드 OBI-OBI-3424)에서 개발 중이다. 전구약물 OBI-3424는, 고형 종양 및 혈액 악성 종양을 포함하는 14종 이상의 인간 암을 치료하기 위해, 현재 미국(NCT04315324 & NCT03592264) 및 중국(CXHL1900137 & CXHL2000263)에서의 여러 임상 1상 시험에서 조사 중이다. 종양에서의 AKR1C3의 높은 발현으로 인해, 전구약물 OBI-3424는 종양에서는 특이적으로 활성화되지만 정상 세포들에서는 낮은 수준의 AKR1C3을 발현하여, 종양-특이적 표적화를 달성하도록 설계되었다. 또한, OBI-3424의 종양 선택적 활성화는 시클로포스파미드 및 이포스파미드와 같은 전통적인 비선택적 알킬화제와 구별되며, 이는 OBI-3424가 광범위하고 선택성이 높은 항종양 약물이 될 가능성이 있음을 나타낸다. 전구약물 OBI-3424는 시험관 내 및 생체 내에서 T-ALL의 전임상 모델에 대해 강력한 효능을 나타내는 것으로 보고되었다(25,26).
NADPH의 존재 하에서 OBI-3424의 환원은 AKR1C3에 의해 매개되어 아지리딘 비스-알킬화제인 세포독성 모이어티 OBI-2660을 방출하여, 구아니딘의 N7(또는 06) 위치에서 DNA의 가교를 유도하여, 세포사멸을 유도한다.
OBI-3424 환원적 활성화 경로의 반응식
암세포를 표적으로 삼도록 고안된 전구약물은 최근 몇 년간 암 치료를 위한 매력적인 전략으로 등장하였다. 그러나, 환자를 선택하는 데 유효한 바이오마커가 부족하여 많은 전구약물이 3상 임상시험에서 실패하였다(27). AKR1C3 발현이 RT-PCR 또는 면역조직화학을 사용하여 평가될 수 있다는 점을 고려하면, OBI-3424는 AKR1C3 발현이 높고 전구약물에 반응할 가능성이 가장 높은 환자를 선택함으로써 임상적으로 효율적인 방식으로 개발될 수 있다. AKR1C3은 화학저항성(13,14), 방사선저항성(19) 및 면역저항성(20)의 획득에 따라 과발현되는 것으로 입증되었다. 또한, 난소암, 유방암, 췌장암과 같은 상동재조합 결핍증(HRD)이 있는 암들은 DNA 손상 인자에 민감한 것으로 알려져 있다(28). DNA 알킬화제로서, OBI-3424는 또한 AKR1C3 발현을 갖는 HRD 암들을 치료하기 위한 좋은 후보 약물일 수 있다.
선택적 AKR1C3 환원효소 활성화 전구약물인 암 환자 치료에 적합한 화합물 및 신규하고 선택적이며 광범위한 항암제가 여전히 요구된다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시킨다.
프로그램 사멸 1(PD-1; program death 1)은 T 세포, B 세포 또는 단핵구에서 발현되는 억제 수용체이다(29, 30). PD-L1 또는 PD-L2는, PD-1에 결합 시 T 세포 활성화 및 사이토카인 분비를 하향조절하는 것으로 확인된 PD-1에 대한 리간드들이다(31,32). PD-1에 PD-L1 또는 PD-L2가 결합하면 면역 반응이 하향 조절된다. 따라서, PD-1/PD-L1 경로의 차단은 암에 대한 중추 면역 반응 및 말초 면역 반응을 약화시키기 위해 제안되었다. PD1 및 PD-L1 경로를 표적화하는 것은, 흑색종, 비소세포폐암(NSCLC), 신장세포암종(RCC), 방광암종 및 호지킨 림프종을 포함하는 15개 이상의 암 유형에서 임상적 효능을 보여주었다(33). 그러나, 여전히 반응하지 않는 환자가 많고, 일부 환자들은 초기 반응을 보였지만 시간이 지남에 따라 저항성이 생겼다. 따라서, 병용 요법에 대한 저항성의 메커니즘을 밝혀야 될 긴급한 필요성이 있다.
본 발명은, PCT 특허출원 번호 PCT/US2016/062114(WO2017087428 A1)에 개시된 바와 같은 화합물들 또는 그들의 약학적으로 허용가능한 염들 또는 용매화물들을 기반으로 하여, 상기 화합물들의 의학적 용도를 제공하고, 상기 화합물들 또는 그들의 약학적으로 허용가능한 염들, 동위원소 변이체들 또는 용매화물들 및 그들의 항암 의학적 용도를 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명은, 환자의 암 치료용 약제의 제조에 있어서, 화학식 I로 표시되는(본 명세서에서는 OBI-2870으로 표기) 화합물 1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트(1-(3-(3-N,N-dimethylaminocarbonyl)phenoxyl-4-mtrophenyl)-1-ethyl-N,N'-bis(ethylene)phosphoramidate), 그의 약학적으로 허용가능한 염, 동위원소 변이체 또는 용매화물의 이용을 제공하고, 여기서 상기 암의 AKR1C3 환원효소 수준은 AKR1C3 단백질 수준 또는 RNA 수준으로 표시되며, 이는 미리 결정된 값 이상이다. AKR1C3 수준은 당업자에게 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 측정된다.
화학식 I
(OBI-2870)
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 상기 화합물은 화학식 Ⅰ-1로 표시되는 (S)-1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트(본 명세서에서는 OBI-3424로 표기), 또는 화학식 Ⅰ-2로 표시되는(R)-1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N' -비스(에틸렌)포스포르아미데이트(본 명세서에서는 OBI-3423으로 표기)이다.
화학식 I-1 화학식 I-2
(OBI-3424) (OBI-3423)
상기 화학식 I, 화학식 I-1 또는 화학식 I-2의 화합물의 제조는 PCT 특허출원 번호 PCT/US2016/062114(WO2017087428 A1)에 개시되어 있으며, 이의 개시는 그 전체 내용이 본 명세서에 참조로 포함된다. 본 명세서에서, 화합물 OBI-2870은 R-거울상이성질체 OBI-3423과 S-거울상이성질체 OBI-3424의 1:1 비율의 라세미 혼합물이다.
본 명세서에서, 상기 염들은 염기성 염들일 수 있으며, 이는 (알칼리 금속수산화물 및 알칼리 토금속수산화물과 같은) 무기 염기 또는 (모노에탄올아민, 디에탄올아민 또는 트리에탄올아민과 같은) 유기 염기과 상기 화합물들의 염들을 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 염들은 (염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 질산, 과염소산, 황산 또는 인산과 같은) 무기산과 상기 화합물의 염 또는 (메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산, 푸마르산, 옥살산, 말레산 및 구연산과 같은) 유기산과 상기 화합물들의 염들을 포함하는 산성 염들일 수 있다. 당분야에서, 화합물의 허용가능한 염들, 용매화물들 등을 선택하고 제조하는 것은 잘 알려진 기술이다.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 상기 화학식 I-1 또는 화학식 I-2의 화합물은 80% 이상의 거울상이성질체 과잉율(enantiomeric excess)을 갖는다. 바람직하게는, 상기 화합물은 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 거울상이성질체 과잉율을 갖는다.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 화학식 I-1 또는 화학식 I-2의 화합물은 실질적으로 순수하다.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 상기 암은 간암, 간세포암종(HCC), 폐암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 백혈병, 식도암, 신장암, 위암, 결장암, 뇌암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 두경부암, 자궁내막암, 췌장암, 육종암 또는 직장암이다.
본 발명의 특정 구체들예에 따르면, 상기 암은 간암이다.
암의 치료에 사용되는 의약 투여량, 또는 상기 화합물 또는 그의 염, 동위원소 변이체 또는 용매화물, 또는 의약에 함유된 기타 화학요법제의 투여량은 일반적으로, 적용된 특정 화합물, 환자, 특정 질병 또는 상태 및 그 중증도, 투여 경로 및 투여 횟수 등에 따라 다르고, 특정 상태에 따라 주치의가 결정해야 한다. 본 발명의 목적을 위해 전형적인 1일 투여량은, 위에서 언급한 요인들에 따라, 약 0.1 ㎍/kg 내지 1 ㎍/kg, 약 0.1 ㎍/kg 내지 10 ㎍/kg, 약 0.1 ㎍/kg 내지 100 ㎍/kg, 0.1 ㎍/kg 내지 1 mg/kg, 0.1 ㎍/kg 내지 10 mg/kg, 약 0.1 ㎍/kg 내지 100mg/kg, 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 상태에 따라 수일 이상 반복 투여하는 경우에는, 상기 치료는 원하는 증상 억제가 나타날 때까지 또는 암 또는 그의 증상을 완화시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 지속된다. 예시적인 투여 요법은, 약 0.1 mg/kg, 0.2 mg/kg, 0.3 mg/kg, 0.4 mg/kg, 0.5 mg/kg, 0.6 mg/kg, 0.7 mg/kg, 0.8 mg/kg, 0.9 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg 또는 그 이상의 초기 투여량을 투여한 후 매주 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 의사가 달성하고자 하는 약동학적 약화(pharmacokinetic decay) 패턴에 따라 다른 용량 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 일주일에 1~4회 투여하는 것이 고려된다. 특정 구체예들에서, 투여 빈도는 매주마다, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 또는 10주마다 1회; 또는 매월마다, 2개월마다, 또는 3개월마다 또는 그 이상의 기간마다 1회이다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 기술들 및 분석법들을 통해 쉽게 모니터링할 수 있다.
약제는 정제, 좌제, 분산성 정제, 장용 코팅 정제, 씹어먹는 정제, 구강 붕해 정제, 캡슐, 당 코팅제, 과립, 건조 분말, 경구 용액, 주사용 작은 바늘, 동결건조된 주사용 분말 또는 주입 용액과 같은 임상 투여를 위한 임의의 투여 형태일 수 있다.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 상기 치료법은 AKR1C3 항체들을 사용하여 환자에서 암세포들의 AKR1C3 환원효소 함량을 측정하는 단계를 더 포함하고, 여기서 AKR1C3 환원효소 함량은 미리 결정된 값 이상인 것으로 측정되며, 상기 화합물은 환자에게 투여된다.
다른 측면에서, 본 발명은, 유효량의 화학식 I로 표시되는 화합물 1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 동위원소 변이체 또는 용매화물을 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다; 여기서, 상기 세포의 AKR1C3 환원효소 수준은 AKR1C3 단백질 수준 또는 RNA 수준으로 표시되고, 미리 결정된 값 이상이다.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 상기 방법은 AKR1C3 항체들을 이용하여 세포의 AKR1C3 환원효소 함량을 측정하는 단계를 더 포함하고, 여기서 AKR1C3 환원효소 함량은 미리 결정된 값 이상인 것으로 측정되며, 상기 화합물은 상기 세포와 접촉된다.
다른 측면에서, 본 발명은, 세포의 성장을 억제하기 위한 약제의 제조에 있어서, 화학식 I로 표시되는 화합물 1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트 또는 그의 약제학상 허용가능한 염, 동위원소 변이체 또는 용매화물의 이용을 제공한다; 여기서, 상기 세포의 AKR1C3 환원효소 수준은 AKR1C3 단백질 수준 또는 RNA 수준으로 표시되고, 미리 결정된 값 이상이다.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 상기 세포는 암세포이다.
다른 측면에서, 본 발명은 다음을 포함하는 조성물을 제공한다:
(1) 화학식 I로 표시되는 화합물 1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 동위원소 변이체(isotopic variant) 또는 용매화물(solvate); 및
(2) 화학요법제(chemotherapeutic agent) 또는 생물학적 제제(biological agent)를 포함하는 적어도 하나의 치료제.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 상기 화합물은 하기 화학식 I-1로 표시되는 (S)-1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트, 또는 화학식 I-2로 표시되는 (R)-1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트이다.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 항-PD-1/PD-L1 항체는 Bavencio® (아벨루맙; avelumab), Opdivo® (니볼루맙; nivolumab), Keytruda® (펨브롤리주맙; pembrolizumab), Imfinzi® (두르발루맙; durvalumab) 및/또는 Tecentriq® (아테졸리주맙; atezolizumab)이다.
본 발명의 특정 구체예들에 따르면, 암이 간암인 경우, 항-PD-1 항체는 Keytruda® (펨브롤리주맙)이고, 항-PD-1 항체는 Bavencio®(아벨루맙)이다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함한다. 바람직하게는, 상기 부형제는 불활성 희석제, 분산제 및/또는 과립화제, 계면활성제 및/또는 유화제, 붕해제, 결합제, 보존제, 완충제, 윤활제 및 오일로부터 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은 환자에게 유효량의 본 발명에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료가 필요한 환자에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, 상기 방법은 AKR1C3 항체들을 사용하여 환자에서 암세포의 AKR1C3 환원효소의 함량을 측정하는 단계를 더 포함하고, 여기서 상기 AKR1C3 환원효소의 함량은 미리 결정된 값 이상으로 측정되고, 상기 조성물은 상기 환자에게 투여된다.
따라서, 본 발명의 구체예들은 화학식 I(OBI-2870), 화학식 I-1(OBI-3424) 또는 화학식 I-2(OBI-3423)의 화합물 및 적어도 하나의 억제성 면역관문 항원의 억제제를 포함하는 조합물에 관한 것이다. 임의의 특정 구체예들에서, 상기 면역관문 억제제는 상기 억제성 면역관문 항원을 억제/차단하는 항-면역관문 항체이다.
일 구체예에서, 상기 억제성 면역관문 항원은 PD-1/PD-L1 항원, CTLA-4(세포독성 T-림프구 관련 단백질 4), LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIGIT(T-세포 면역글로불린 및 면역수용체 티로신계 억제 모티프 도메인), Ceacam 1(암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1), LAIR-1(백혈구-관련 면역글로불린 유사 수용체-1), TIM-3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-3), VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제), KIR(킬러-세포 면역글로불린 유사 수용체), IDO(인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제), B7-H3 (CD276), A2AR(아데노신 A2A 수용체) 또는 CD47으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구체예에서, 상기 항-면역관문 항체는 항-PD-1/PD-L1 항체, 항-CTLA-4(세포독성 T-림프구 관련 단백질 4) 항체, 항-LAG-3(림프구 활성화 유전자 3) 항체, 항-TIGIT(T-세포 면역글로불린 및 면역수용체 티로신계 억제 모티프 도메인) 항체, 항-Ceacam 1(암배아 항원-관련 세포 부착 분자 1) 항체, 항-LAIR-1(백혈구-관련 면역글로불린 유사 수용체-1) 항체, 항-TIM-3(T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인-3) 항체, 항-VISTA(T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제제) 항체, 항-KIR(킬러-세포 면역글로불린 유사 수용체) 항체, 항-IDO(인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나아제) 항체, 항-B7-H3 (CD276) 항체, 항-A2AR(아데노신 A2A 수용체) 항체 또는 항-CD47 항체이다.
일 구체예에서, 상기 항-PD-1/PD-L1 항체는 Bavencio® (아벨루맙), Opdivo® (니볼루맙), Keytruda® (펨브롤리주맙), Imfinzi® (두르발루맙) 및/또는 Tecentriq® (아테졸리주맙)이다.
도 1. 실시예 1의 각 그룹의 평균 체중. 비히클 그룹, 단일 치료 그룹 및 병용 치료 그룹의 체중을 35일까지 매주 2회 기록하였다. 인간화 마우스를 보유하는 인간 간세포 암종 HepG2 종양의 모든 치료 그룹들에서 체중 감소는 나타나지 않았다. 데이터는 평균±SEM(각 그룹에 대해 N=5)으로 표시되었다. 통계적 분석은 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)에 의해 수행되었다.
도 2. 실시예 1의 각 그룹의 평균 종양 중량. 종양 세포 접종 후 36일째에 마우스를 희생시키고, 비히클 그룹, 단일 치료 그룹 및 병용 치료 그룹에서 마우스의 종양 중량을 기록하였다. OBI-3424(G2) 치료 그룹 및 OBI-3424＋항-hPD-1/항-hPD-L1(G5/G6) 병용 치료 그룹의 종양 중량은 비히클(G1) 그룹의 종양 중량과 비교하여 유의하게 억제되었다(p＜0.001). 또한, OBI-3424＋항-hPD-1/항-hPD-L1(G5/G6) 병용 치료 그룹들에서의 종양 중량은 항-hPD-1/항-hPD-L1(G3/G4) 치료 그룹들의 종양 중량과 비교하여 유의하게 억제되었다(p＜0.05). 데이터는 평균±SEM(각 그룹에 대해 N=5)으로 표시되었다. 통계적 분석은 스튜던트 t-테스트로 수행되었다. P값＜0.05은 유의미한 것으로 간주되었다. 단일 별표시는 0.05＜P＜0.001을 나타내고, 이중 별표시는 P＜0.001를 나타낸다.
도 3. 실시예 1의 각 그룹의 평균 종양 부피. 비히클 그룹, 단일 치료 그룹 및 병용 치료 그룹에서 마우스의 종양 부피를 35일까지 매주 2회 기록하였다. OBI-3424(G2) 및 OBI-3424＋항-hPD-1/항-hPD-L1(G5/G6) 병용 치료 그룹들에서의 종양 부피는 비히클(G1) 그룹과 비교하여 상당히 억제되었다. 데이터는 평균±SEM(각 그룹에 대해 N=5)으로 표시되었다. 통계적 분석은 스튜던트 t-테스트로 수행되었다.
도 4. 실시예 2의 각 그룹의 평균 체중. 비히클 그룹, OBI-3424 저용량 치료 그룹 및 고용량 치료 그룹, OBI-3424＋PD-1 항체 병용 치료 그룹의 체중을 30일까지 주 2회 기록하였다. 인간화 마우스를 보유하는 인간 간세포 암종 HepG2 종양의 비히클 그룹, OBI-3424 단일 항체 치료 그룹 또는 OBI-3424＋PD-1 항체 병용 치료 그룹에서 체중 감소는 나타나지 않았다. 데이터는 평균±SEM(각 그룹에 대해 N=5)으로 표시되었다. 통계적 분석은 스튜던트 t-테스트로 수행되었다.
도 5. 실시예 2의 각 그룹의 평균 종양 중량. 시험 제제 투여 후 30일째에 마우스를 희생시켰고, OBI-3424 저용량(G2) 치료, 고용량 치료(G3) 및 OBI-3424＋PD-1 항체 병용 치료(G5-G7)에서 마우스의 종양 중량은 비히클(G1) 그룹에 비해 유의하게 억제되었다(p＜0.05). 또한, 고용량 OBI-3424＋PD-1 항체 병용 치료(G6)에서 종양 중량은 고용량 OBI-3424 단일 치료(G3)에 비해 유의하게 감소하였다(p＜0.05). 데이터는 평균±SEM으로 표시되었다. 통계적 분석은 스튜던트 t-테스트로 수행되었다. P값＜0.05는 유의미한 것으로 간주되었다. 단일 별표시는 0.05＜P＜0.001을 나타내고, 이중 별표시는 P＜O.OOl을 나타낸다.
도 6. 실시예 2의 각 그룹의 평균 종양 부피. 비히클 그룹, OBI-3424 저용량 치료 그룹 및 고용량 치료 그룹, OBI-3424＋PD-1 항체 병용 치료 그룹에서 마우스의 종양 부피를 30일까지 매주 2회 기록하였다. OBI-3424 고용량 치료(G3) 및 OBI-3424＋항-hPD-1(G5-G7) 병용 치료 그룹들에서의 종양 부피는 비히클(G1) 그룹의 종양 부피와 비교하여 유의하게 억제되었다. 데이터는 평균±SEM(각 그룹에 대해 N=5)으로 표시되었다. 통계적 분석은 스튜던트 t-테스트로 수행되었다.
이하, 구체적인 실시예를 참조하여 본 발명을 설명한다. 당업자는 이러한 실시예가 단지 본 발명을 설명하기 위해 사용되었으며, 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
정의
독자를 돕기 위해 다음의 정의들이 제공된다. 달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 또는 의학 용어들은 화학 및 의학 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는 것으로 의도되었다. 일부의 경우, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어들은 명확성 및/또는 용이한 참조를 위해 본 명세서에서 정의되며, 본 명세서에 이러한 정의가 포함된다고 해서 당분야에서 일반적으로 이해되는 용어의 정의에 대해 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
모든 수치 지정, 예를 들어 각각의 범위를 포함하는 pH, 온도, 시간, 농도 및 중량은 일반적으로 0.1, 1.0 또는 10.0의 증분으로 (+) 또는 (-) 변경될 수 있는 근사치이다. 모든 수치 지정은 용어 "약"이 앞에 오는 것으로 이해될 수 있다. 본 명세서에 기재된 시약들은 예시적이며, 그 균등물들은 당업계에 공지되어 있을 수 있다.
용어 "하나", "한" 및 "그(the)"는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 따라서, 예를 들어 화합물에 대한 언급은 하나 이상의 화합물 또는 적어도 하나의 화합물을 의미한다. 따라서, 용어 "하나"(또는 "한"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
"약" 또는 "대략"이라는 용어는 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대해 허용 가능한 오류를 의미하며, 이는 부분적으로 값이 측정되거나 결정되는 방법에 따라 달라진다. 특정 구체예들에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 1, 2, 3 또는 4 표준 편차 이내를 의미한다. 특정 구체예들에서, 용어 "약" 또는 "대략"은 50%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.05%의 특정 값 또는 범위 이내를 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "포함하는" 또는 "함유하는"은 조성물 및 방법이 언급된 요소를 포함하지만, 다른 요소를 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. 구성 및 방법을 정의하는 데 사용된 "본질적으로 구성되는"은 구성 또는 방법에 임의의 본질적으로 중요한 다른 요소를 제외하는 것을 의미한다. "구성된"은 청구된 조성물 및 실질적인 방법 단계에 대해 기타 성분의 미량 이상의 요소들을 제외하는 것을 의미한다. 이들 호환 용어들 각각에 의해 정의되는 구체예들은 본 발명의 범위 내에 있다. 따라서, 방법 및 조성물은 추가 단계들 및 구성요소들을 포함할 수 있고(포함/함유함), 또는 중요하지 않은 단계들 및 구성요소들을 포함할 수 있고(본질적으로 구성됨), 또는 명시된 방법 단계들 또는 조성물만을 의도(구성됨)할 수 있는 것으로 의도된다.
환자에게 약물을 "투여하는" 또는 "투여"라는 용어(및 이 문구의 문법적 동의어)는 의료 전문가에 의해 환자에게 투여되거나 자가 투여일 수 있는 직접 투여, 및/또는 약물을 처방하는 행위일 수 있는 간접 투여를 의미한다. 예를 들어, 환자에게 약물을 자가 투여하도록 지시하고/하거나 환자에게 약물 처방을 제공하는 의사는 환자에게 약물을 투여하는 것이다.
용어 "항체"는 항체들, 및 각각 본 발명의 항암 항체로부터 유래된 적어도 하나의 CDR을 함유하는 단쇄 항체들 및 그의 단편들을 포함하는 항암 항체 또는 그의 특정 단편 또는 일부의 구조 및/또는 기능을 모방하는 항체 모방체들 또는 항체의 부분들을 포함하는, 그의 소화 단편, 그의 특정 부분들 및 변이체들을 포함하는 것으로 의도된다.
"생물학적 제제"라는 용어에는 펩타이드, 단백질, 항체, 호르몬, 시토카인, 케모카인 및 이들의 임의의 조합이 포함된다.
"암"이라는 용어는 백혈병, 림프종, 암종, 및 고형 종양을 포함하여 침습에 의해 국소적으로 그리고 전이에 의해 전신으로 확장될 수 있는 잠재적으로 무제한 성장이 가능한 기타 악성 종양을 의미한다. 암의 예에는, 제한되지는 않지만, 부신암, 뼈암, 뇌암, 유방암, 기관지암, 결장암 및/또는 직장암, 담낭암, 두경부암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암, 신경조직암, 췌장암, 전립선암, 부갑상선암, 피부암, 위암 및 갑상선암이 포함된다. 암의 다른 특정 예에는, 제한되지는 않지만, 급성 및 만성 림프구 및 과립구 종양, 선암종, 선종, 기저 세포 암종, 자궁경부 이형성증 및 상피내 암종, 유잉 육종, 표피양 암종, 거대세포종, 다형성교모세포종, 털상세포종, 장신경절신경종, 과형성각막신경종양, 섬세포암종, 카포시육종, 평활근종, 백혈병, 림프종, 악성 유암종, 악성 흑색종, 악성 고칼슘혈증, 마파노이드 습관성 종양, 수질 암종, 전이성 피부암종, 점막 신경종, 골수종, 균상 식육종, 신경모세포종, 골육종, 골형성 및 기타 육종, 난소 종양, 크롬친화세포종, 적혈구체열증, 원발성 뇌종양, 소세포 폐종양, 궤양성 및 유두성 편평 세포 암종 유형, 증식, 정상피종, 연조직 육종, 망막모세포종, 횡문근육종, 신장 세포 종양, 국소 피부 병변, 수포 세포 육종 및 윌름 종양이 포함된다.
본 명세서에서 사용된 용어 "화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예에는, 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 메르탄신(DM1), 안트라사이클린, 피롤로벤조디아제핀, α-아마니틴, 튜불리신, 벤조디아제핀, 에를로티닙, 보르테조밉, 풀베스트란트, 수니티닙, 레트로졸, 이마티닙 메실레이트, PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴, 류코보린, 라파마이신, 라파티닙, 로나파르닙(SARASAR®, SCH66336), 소라페닙, 게피티닙, AG1478, AG1571, 알킬화제, 알킬설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸아멜라민, 아세토게닌, 캄프토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 크립토피신, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘류테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕틴, 스폰지스타틴, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리케아미신, 디네미신, 클로드로네이트, 에스페라미신, 네오카르지노스타틴 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 유트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실(5-FU), 데노프테린, 프테롭테린, 트리메트렉세이트, 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아민프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄, 프롤린산, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트락세이트, 디포파민, 데메콜신, 디아지쿠온, 엘포르미틴, 엘립티늄 아세테이트, 에포틸론, 에토글루시드, 질산갈륨, 하이드록시우레아, 렌티난, 로니다이닌, 메이탄신, 안사미토신, 미토구아존, 미톡산트론, 모피단몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로속산트론, 포도필린산, 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 라족산, 리족신, 시조피란, 스피로게르마늄, 테누아존산, 트리아지쿠온, 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민, 트리코테센, 우레탄, 빈데신, 다카르바진, 만노무스틴, 미토브로니톨, 미토락톨, 피포브로만, 가시토신, 아라비노사이드, 시클로포스파미드, 티오테파, 탁소이드, 파클리탁셀, 독세탁셀, 클로란부실, 젬시타빈, 6-티오구아닌, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 카보플라틴, 빈블라스틴, 백금, 에토포사이드, 이포스파마이드, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론, 테니포사이드, 에다트렉세이트, 다우노마이신, 아미노프테린, 젤로다, 이반드로네이트, 토포이소머라제 억제제, 디플루오로메틸오르니틴(DMFO), 레티노이드 및 카페시타빈이 포함된다.
용어 "병용(combination)"은 OBI-3423/OBI-3424 화합물의 양, 및/또는 치료 주기 중 (공동 투여 및/또는 병용 투여로) 같은 날에 또는 다른 날에 순차적으로 또는 동시에 함께 투여될 때 치료적으로 효과적이며 치료적 부가 이상의 시너지 효과를 갖는 다른 생물학적 또는 화학적 약물의 양일 수 있는 조합 치료법을 의미한다.
용어 "접촉하는" 또는 "접촉"은 이러한 접촉의 결과로 생리학적 및/또는 화학적 효과가 발생하도록 치료제와 세포 또는 조직이 접촉하는 것을 의미한다. 접촉은 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 발생할 수 있다. 일 구체예에서, 치료제는 세포 배양물(시험관내)에서 세포와 접촉되어 세포에 대한 치료제의 효과를 결정한다. 또 다른 구체예에서, 치료제를 세포 또는 조직과 접촉시키는 것은 접촉될 세포 또는 조직을 갖는 대상체에 치료제를 투여하는 것을 포함한다.
"광학 활성"이라는 용어는 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 91% 이상, 약 92% 이상, 약 93% 이상, 약 94% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 약 99.8% 이상, 또는 약 99.9% 이상의 거울상 이성질체 과잉률을 갖는 분자들의 집합을 의미한다. 특정 구체예들에서, 광학 활성 화합물에 대한 거울상이성질체 과잉률은 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 또는 약 99% 이상이다. 화합물의 거울상이성질체 과잉률은, 제한되지는 않지만, 광학 활성 고정상을 사용하는 키랄성 크로마토그래피(가스 크로마토그래피, 고성능 액체 크로마토그래피 및 박층 크로마토그래피), 동위원소 희석, 전기영동, 열량측정, 편광측정, 키랄 유도체화를 사용하는 NMR 분해 방법, 키랄 용매화제 또는 키랄 이동제를 사용하는 NMR 방법을 포함하는, 당분야의 통상의 기술자에 의해 사용되는 임의의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다.
광학 활성 화합물을 기술할 때, 접두사 R 및 S는 키랄 중심(들)을 중심으로 한 분자의 절대 배열을 나타내기 위해 사용된다.
"실질적으로 순수한"이란 용어는, 제한되지는 않지만, 박층 크로마토그래피(TLC), 젤 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 가스 크로마토그래피(GC), 핵자기 공명(NMR) 및 질량 분석법(MS)을 포함하는, 당분야의 통상의 기술자에 의해 사용되는 표준 분석 방법에 의해 결정되는 쉽게 검출가능한 불순물이 없어 보일 정도로 충분히 균질하거나; 또는, 추가 정제로 인해 해당 물질의 효소적 활성 및 생물학적 활성과 같은 물리적, 화학적, 생물학적 및/또는 약리학적 특성들이 검출가능하게 변경되지 않을 정도로 충분히 순수한 것을 의미한다. 특정 구체예들에서, "실질적으로 순수한"은, 표준 분석 방법에 의해 결정된 바에 따라, 해당 분자의 적어도 약 50중량%, 적어도 약 70중량%, 적어도 약 80중량%, 적어도 약 90중량%, 적어도 약 95중량%, 적어도 약 98중량%, 적어도 약 99중량%, 또는 적어도 약 99.5중량%가 단일 거울상이성질체인 분자들의 집합을 의미한다.
"환자" 및 "대상체"는 암 치료가 필요한 포유동물을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 일반적으로 환자는 인간이다. 일반적으로, 환자는 암 진단을 받은 인간이다. 특정 구체예들에서, "환자" 또는 "대상체"는 약물 및 치료법을 스크리닝하고, 특성화하고, 평가하는데 사용되는 비인간 포유동물, 예를 들어 비인간 영장류, 개, 고양이, 토끼, 돼지, 마우스 또는 쥐를 지칭할 수 있다.
용어 "전구약물(prodrug)"은 투여 후에 적어도 하나의 특성과 관련하여 생물학적으로 활성이 있거나 더 활성인 화합물(또는 약물)로 대사되거나 전환되는 화합물을 의미한다. 전구약물은 해당 약물에 비해 덜 활성이거나 불활성이 되도록 하는 방식으로 화학적으로 변형되지만, 상기 화학적 변형은 전구약물이 투여된 후에 대사 또는 다른 생물학적 과정에 의해 상응하는 약물이 생성되도록 하는 것이다. 전구약물은 활성 약물에 비해 변경된 대사 안정성 또는 전달 특성, 더 적은 부작용 또는 더 낮은 독성, 또는 개선된 풍미를 가질 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참고문헌으로 통합된, Nogrady, 1985, Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, New York, 페이지 388-392 참조). 전구약물은 상응하는 약물 이외의 시약들을 사용하여 합성될 수 있다.
용어 "고형 종양"은, 제한되지는 않지만, 뼈, 뇌, 간, 폐, 림프절, 췌장, 전립선, 피부 및 연조직(육종)에서의 전이성 종양을 포함하는 고형 종양을 의미한다.
약물의 "치료 유효량"이라는 용어는, 암 환자에게 투여될 때, 의도된 치료 효과, 예를 들어 환자에서 암의 하나 이상의 징후를 완화, 개선, 경감 또는 제거하는 약물의 양을 의미한다. 치료 효과는 반드시 1회 용량 투여로 나타나는 것은 아니며, 일련의 용량을 투여한 후에만 나타날 수도 있다. 따라서, 치료 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다.
상태 또는 환자의 "치료"라는 용어는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 얻기 위한 단계를 취하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과에는, 제한되지는 않지만, 암의 하나 이상의 증상의 완화 또는 개선; 질병 정도의 감소; 질병 진행의 지연 또는 둔화; 질병 상태의 완화, 경감 또는 안정화; 또는 기타 유익한 결과가 포함된다.
"종양 세포"라는 용어는 임의의 적절한 종, 예를 들어 쥐, 개, 고양이, 말 또는 인간과 같은 포유동물의 종양 세포를 의미한다.
"동위원소 변이체"라는 용어는 이러한 화합물을 구성하는 하나 이상의 원자에 비천연 비율의 동위원소를 함유하는 화합물을 지칭한다. 특정 구체예들에서, 화합물의 "동위원소 변이체"는, 제한되지는 않지만, 수소(1H), 중수소(2H), 삼중수소(3H), 탄소-11(11C), 탄소-12(12C), 탄소-13(13C), 탄소-14(14C), 질소-13(13N), 질소-14(14N), 질소-15(15N), 산소-14(140), 산소-15(150), 산소-16(160), 산소-17(17O), 산소-18(18O), 불소-17(17F), 불소-18(18F), 인-31(31P), 인-32(32P), 인-33(33P), 황-32(32S), 황-33(33S), 황-34(34S), 황-35(35S), 황-36(36S), 염소-35(35C1), 염소-36(36C1), 염소-37(37C1), 브롬-79(79Br), 브롬-81(81Br), 요오드-123(123I), 요오드-125(125I), 요오드-127(127I), 요오드-129(129I) 및 요오드-131(131I)을 포함하는, 비천연 비율의 하나 이상의 동위원소를 포함한다. 특정 구체예들에서, 화합물의 "동위원소 변이체"는 안정한 형태, 즉 비방사성 형태이다. 특정 구체예들에서, 화합물의 "동위원소 변이체"는, 제한되지는 않지만, 수소(1H), 중수소(2H), 탄소-12(12C), 탄소-13(13C), 질소-14(14N), 질소-15(15N), 산소-16(16O), 산소-17(170), 산소-18(18O), 불소-17(17F), 인-31(31P), 황-32(32S), 황-33(33S), 황-34(34S), 황-36(36S), 염소-35(35C1), 염소-37(37C1), 브롬-79(79Br), 브롬-81(81Br), 요오드-127(127I)를 포함하는, 비천연 비율의 하나 이상의 동위원소를 포함한다. 특정 구체예들에서, 화합물의 "동위원소 변이체"는 불안정한 형태, 즉 방사성이다. 특정 구체예들에서, 화합물의 "동위원소 변이체"는 삼중수소(3H), 탄소-11(11C), 탄소-14(14C), 질소-13 (13N), 산소-14(14O), 산소-15(15O), 불소-18(18F), 인-32(32P), 인-33(33P), 황-35(35S), 염소-36(36C1), 요오드-123(123I), 요오드-125(125I), 요오드-129(129I) 및 요오드-131(131I)을 포함하는, 비천연 비율의 하나 이상의 동위원소를 포함한다. 기술자의 판단에 따라 가능하게는, 본 명세서에 제공된 화합물에서, 임의의 수소는 예를 들어 2H일 수 있고, 또는 임의의 탄소는 예를 들어 13C일 수 있으며, 또는 임의의 질소는 예를 들어 15N일 수 있고, 임의의 산소는 18O일 수 있음이 이해될 것이다. 특정 구체예들에서, 화합물의 "동위원소 변이체"는 비천연 비율의 중수소를 함유한다.
용어 "용매화물(solvate)"은, 화학양론적 또는 비화학양론적 양으로 존재하는, 하나 이상의 용질 분자, 예로서 본 명세서에 제공된 화합물과 하나 이상의 용매 분자에 의해 형성된 복합체(complex) 또는 집합체(aggregate)를 의미한다. 적합한 용매로는, 제한되지는 않지만, 물, 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올 및 아세트산이 포함된다. 특정 구체예들에서, 상기 용매는 약학적으로 허용가능한 것이다. 일 구체예에서, 상기 복합체 또는 집합체는 결정질 형태이다. 다른 구체예에서, 상기 복합체 또는 집합체는 비결정질 형태이다. 상기 용매가 물인 경우, 상기 용매화물은 수화물이다. 수화물의 예로는, 제한되지는 않지만, 반수화물, 일수화물, 이수화물, 삼수화물, 사수화물 및 오수화물이 포함된다.
"약학적으로 허용가능한 부형제"라는 용어는 액체 필러 또는 고체 필러, 희석제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 일 구체예들에서, 각 성분은 약학적 제제의 다른 성분들과의 상용성의 관점에서 "약학적으로 허용가능"하고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 없이 인간 및 동물의 조직 또는 기관과 접촉하여 사용하기에 적합하다.
억제성 면역관문 시스템을 억제/차단하는 분자인 "면역관문 억제제"라는 용어는 진행성 신생물에 대한 효과적인 치료법으로 등장하였다. 이들 중에는 세포독성 T 림프구 관련 항원 4(CTLA4)와 프로그램화된 세포사멸 단백질 1(PD-1)을 차단하는 치료 항체가 있으며, 이는 여러 종양에 사용되었다(34). B7/CD28 수용체 계열의 멤버인 PD-1(프로그램화된 세포사멸 단백질, CD279)은 T, B, NK 및 골수 유래 억제 세포를 비롯한 활성화된 백혈구의 세포 표면에서 발현되는 단량체 분자이다. 그 발현은 유전적 메커니즘과 후생적 메커니즘 사이의 상호 작용에 의해 정밀하게 조절된다. PD-1의 알려진 리간드는 PD-L1과 PD-L2이다(35).
PD-L1(프로그램화된 세포사멸 단백질 리간드 1, B7H1, CD274)은 T, B, 골수 및 수지상 세포를 포함하는 조혈 세포들 및 비-조혈 세포들(예로서, 폐, 심장, 내피, 췌장섬 세포들, 각질세포들) 및 특히 암세포들에서, 낮은 수준으로 발현되고, 세포 활성화에 따라 상향 조절된다. PD-L2(프로그램화된 세포사멸 단백질 리간드 2, B7-DC, CD273)는 대식세포, 수지상 세포(DC)들, 활성화된 CD4+ 및 CD8+ 림프구 및 일부 고형 종양들(난소 암종, 소세포 폐암, 식도암)에서 발현된다. PD-L1 및 PD-L2 발현은 또한 정상 섬유아세포 및 암-관련 섬유아세포에서도 검출되었다. PD-L1 및 PD-L2는 모두 대식세포들 및 다른 세포 유형들에서 발현되는 추가 수용체들과 상호작용한다: PD-L1은 CD28 리간드 CD80과 상호작용하고, PD-L2는 반발유도분자(RGM) b와 상호작용한다. PD-1의 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)에는 면역수용체 티로신계 억제 모티프(ITIM)와 면역수용체 티로신계 스위치 모티프(ITSM)가 포함되어 있다. T 림프구에서, PD-1과 그의 리간드와의 상호작용은 PD-1의 세포질 꼬리에 있는 2개의 티로신의 인산화를 초래한다; SH2 도메인 함유 단백질 티로신 포스파타제(SHP-1 및/또는 SHP-2)를 PD-1의 ITSM 세포질 영역으로 모집하면, T 세포 수용체의 하류 신호가 억제됨으로써 T 세포 증식 및 사이토카인 생산이 억제된다. PD-1은 T 세포들에 대해 다른 효과들도 발휘한다: 예를 들어, Akt 및 Ras 경로를 억제함으로써 PD-1 유발(triggering)은 유비퀴틴 리가제 성분 SKP2의 전사를 억제한다: 이는 사이클린-의존성 키나아제인 p27(kipl)의 SKP2에 의해 매개된 분해를 손상시키는 결과를 초래함으로써, 세포주기 진행을 차단한다. 또한, PD-1은 하나 이상의 메커니즘에 의해 세포사멸을 촉진할 수 있다. T 세포 활성화를 직접적으로 억제하는 것 외에, PD-L1에 의한 PD-1 유발은, 작동자(effector) T 세포들을 적극적으로 억제하는 말초성 면역내성(peripheral tolerance)의 핵심 매개체인 T 조절 세포들(Treg)의 발달을 유도할 수 있다. PD-1 유발에 의한 Treg 유도는 PTEN의 PD-1 유도성 활성에 의해 수준이 낮게 유지되는 phospho-Akt와 같은 주요 신호 분자의 조절에 의해 매개된다. 여러 유형의 암세포들이 PD-L1을 발현한다. 또한, 종양 미세환경에서 비종양 세포들(내피세포들, 백혈구들, 섬유아세포들)도 PD-L1을 발현할 수 있다. 이는, 그들이 종양 침윤성 PD-1+ T 림프구(TIL)들을 견딜 수 있고, 그리고/또는 Treg 발달을 유도할 수 있음을 시사한다; 실제로 일부 암 유형(흑색종, 신장암종, 비소세포폐암 등)에 의해 영향받는 환자들을 항-PD-1/PD-L1 단일클론 항체(mAb)들로 치료하면 종양 성장을 감소시킬 수 있음을 보여주는 증거가 늘어나고 있다.
면역관문 억제제는 인간에게 일부 항종양 활성을 제공하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 부분적인 항종양 활성은 치료된 대상체의 일부에서만 관찰된다. 관문 억제제는 아미노산 잔기들을 포함하여 단백질, 폴리펩티드 및 단일클론 또는 다중클론 항체들을 포함하거나 제외할 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물들은 하나 이상의 관문 억제제를 포함하거나 이와 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예들에서, 관문 억제제들은 CD28/CTLA-4를 비롯한 임의의 T 세포 조절자 계열에서 발견되는 리간드들 또는 단백질들에 결합한다. 관문 억제제들의 표적들은, 면역계 작동자 또는 조절자 세포들(예로서, T 세포들)에서 발현된 수용체들 또는 공수용체(co-receptor)들(예로서, CTLA-4; CD8); 항원 제시 세포들의 표면에서 발현된(즉, PD-1, PD-2, PD-L1 및 PD-L2를 포함하거나 제외할 수 있는 활성화된 T 세포들의 표면에서 발현된) 단백질들; 대사 효소들, 또는 종양 및 종양 침윤성 세포들 모두에 의해 발현되는 대사 효소들(예를 들어, 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제(IDO), IDO1 및 ID02와 같은 동형 단백질들 포함); 면역글로불린 슈퍼패밀리에 속하는 단백질들(예를 들어, LAG3으로도 알려진 림프구 활성화 유전자 3); B7 수퍼패밀리에 속하는 단백질들(예로서, B7-H3/CD276 또는 이의 동족체들)을 포함하거나 제외할 수 있다. B7 단백질들은 활성화된 항원 제시 세포들 및 T 세포들 모두에서 발견될 수 있다. 일부 구체예들에서, 2개 이상의 관문 억제제가 조합되거나 함께 쌍을 이룰 수 있다. 예를 들어, 항원 제시 세포에서 발견되는 B7 계열 관문 억제제는 T 세포 표면에서 발현된 CD28 또는 CTLA-4 억제제와 쌍을 이루어서, 상기 두 유형의 세포들 사이의 활성을 감소시키기 위한 공동-억제 신호를 생성한다. 공수용체들은, 외부 리간드에 결합한 후 내부 세포 과정을 조절할 수 있는, 동일한 세포에 위치한 두 개의 서로 다른 수용체의 존재를 의미한다. 공수용체는 자극적이거나 억제적일 수 있다. 공수용체는 보조 수용체 또는 공동 신호 수용체라고도 한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "공동-억제(co-inhibitory)"는 하나 이상의 분자가 세포 표면의 각각의 수용체에 결합하여 세포내 과정이 일어나는 것을 늦추거나 방지하는 결과를 의미한다.
특정 구체예들에서, 면역관문 억제제는 PD-1 또는 CTLA-4 경로를 억제하는 억제 수용체의 길항제, 예컨대 항-PD-1, 항-PD-L1 또는 항-CTLA-4 항체 또는 억제제를 포함할 수 있다. PD-1 억제제 또는 PD-L1 억제제의 예로는, 제한되지는 않지만, 인간 PD-1을 차단하는 인간화 항체들, 예를 들어 람롤리주맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Keytruda®) 또는 피딜리주맙(항-PD-1 Ab), Bavencio®(항-PD-L1 Ab, 아벨루맙), Imfinzi®(항-PD-L1 Ab, 두르발루맙) 및 Tecentriq®(항-PD-L1 Ab, 아테졸리주맙)뿐 아니라 니볼루맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Opdivo®)을 포함할 수 있다. 다른 PD-1 억제제로는, 제한되지는 않지만, B7-DC-Ig 또는 AMP-244로도 알려진 PD-L2 Fc 융합 단백질 및 현재 치료법에서의 사용을 위해 연구 및/또는 개발 중인 다른 PD-1 억제제들을 포함하는 가용성 PD-1 리간드의 제시예들이 포함될 수 있다. 또한, 면역관문 억제제에는, 제한되지는 않지만, 두르발루맙 및 MIH1과 같은 PD-L1을 차단하는 인간화 항체 또는 완전 인간 항체 및 현재 연구 중인 다른 PD-L1 억제제들이 포함될 수 있다. 일부 구체예들에서, 면역관문 억제제는 CTLA-4 항체, PD-L1 항체 또는 PD-1 항체이다. 일부 구체예들에서, PD-1 억제제 또는 CTLA-4 억제제에는, 제한되지는 않지만, 인간 PD-1을 차단하는 인간화 항체들, 예를 들어 람롤리주맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Keytruda) 또는 피딜리주맙(항-PD-1 Ab), 니볼루맙(항-PD-1 Ab, 상표명 Opdivo), 티실리무맙(항-CTLA-4 Ab), 이필리무맙(항-CTLA-4 ab), MPDL3280A, BMS-936559,　AMP-224, IMP321(ImmuFact),　MGA271,　인독시모드(Indoximod), 및 INCB024360이 포함된다.
실시예
실시예 1. HepG2 종양 보유 인간화 마우스 모델에서 OBI-3424 + 항-PD-1(펨브롤리주맙) 또는 항-PD-L1 항체(아벨루맙)의 효능 평가
본 연구의 목적은 HepG2 종양 보유 인간화 마우스 모델에서 항-hPD-1 항체 또는 항-hPD-L1 항체의 존재 하에서 시험물질인 OBI-3424 단일 치료법 또는 병용 치료법의 효능을 평가하는 것이다.
재료 물질
1. OBI-3424-DP
로트 번호: FLC-INJ-1711-01
시험물질 수: 2 바이알/바이알당 1mL
성분: DNA 알킬화제
농도: 10 mg/mL
물리적 외관: 투명한 액체
보관 조건: -20℃
2. 항-인간 PD-1, 펨브롤리주맙, Merck & Co., Inc.
로트 번호: 7302614A13
시험물질 수: 1 바이알/바이알당 1.2mL
성분:항체
농도: 25 mg/mL
물리적 외관: 투명한 액체
보관 조건: 2-8℃
3. 항-인간 PD-L1, 아벨루맙, Merck & Co., Inc.
로트 번호: AU024788
시험물질 수 : 1개 튜브/튜브당 1.5 mL
성분 : 항체
농도: 20 mg/mL
물리적 외관: 투명한 액체
보관 조건: 2-8℃
4. 멸균 식염수(Taiwan Biotech Co., LTD)
로트 번호 : 1PD2A054
시험물질 수 : 20mL 튜브 6개
농도: 0.9% 염화나트륨
물리적 외관: 투명한 액체
용해도: 제공되지 않음
보관 조건: 실온
5. 마트리겔(Corning, Cat. No.: 354248, Lot No.: 8228001)
6. 인간 PBMC (로트: PBMC102219D, Zenbio, USA)
7. 콜라게나제(Sigma Aldrich, C5138), DNase I(Sigma Aldrich, D5025), 히알루로니다제(Sigma Aldrich, H6254)
8. RBC 적혈구 용해 완충액(Biolegend, 420302)
9. 세포 염색 완충액(Biolegend, 420201)
10. 인간 TruStain FcX™(Fc 수용체 차단 용액)(Biolegend, 422302)
11. 항체:
항-인간 CD45 항체(Beckman, IM0782U), 항-인간 CD8 항체(Beckman, IM0452U 및 Biolegend, 300911), 항-인간 CD4 항체(Beckman, B16491), 항-인간 CD56 항체(Beckman, IM2474U), 항-인간 CD16 항체(Beckman, IM1238U), 항-인간 CD25 항체(Beckman, IM0479U).
마우스
1. 종: 생쥐(Mus musculus)
계통: 진행성 면역결핍 마우스.
(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg)
출처 : 트리네오바이오테크놀로지(주)
성별: 암컷
연구 시작 시 연령: 6-8주
연구 시작 시 체중 범위: 17-28g
2. 번호 부여 및 식별: 각 마우스에 귀 태그로 번호를 매겼다. 하우징 케이지는 연구 번호, 케이지 번호, 동물 수, 성별, 투여량 수준 등을 포함하는 정보가 포함된 케이지 카드로 식별되었다.
동물 그룹화: 마우스를 6개 그룹으로 나누었다: G1(비히클), G2(OBI-3424), G3(항-hPD-1), G4(항-hPD-L1), G5(OBI-3424＋항-hPD-1), G6(OBI-3424＋항-hPD-L1). 각 그룹에는 5마리의 쥐가 포함되어 있다. 인간 간세포암종 세포주인 HepG2를 진행성 면역결핍 마우스에 피하 접종하였다. 이 연구에는 총 30마리의 마우스가 포함되었다.
3. 동물선정 이유 : TFDA에서 발표한 약물 제안의 비임상 안전성 연구 중 항암제의 비임상 연구 가이드라인에 따르면, 동물 이종이식 종양 모델을 이용하여 신약 또는 신약 항암제의 효능을 평가할 수 있다. 일반적으로 사용되는 마우스 계통은 BALB/c, C57BL/6을 포함하나, 원하는 약물의 항종양 효과를 평가하기 위해 일반적으로 BALB/c 누드, Nu/Nu 및 NOD/SCID 마우스가 선택된다. 상기 계통들은 잘 알려진 유전적 배경 및 품종 배경을 바탕으로 전세계적으로 관리되며, 이는 인체 내에서의 적절한 반응의 기능적 중요성에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다.
4. 순응 기간: 마우스를 무작위화하기 전에 적어도 3일 동안 순응시켰다. 순응 기간 동안 임상 관찰 및 체중 측정을 수행하였다. 이 기간 동안 동물들은 질병의 징후나 행동 변화를 보이지 않았다.
5. 동물 사육 조건: 마우스를 온도 22±3℃, 상대 습도 50±20% 및 12/12시간 명/암 주기로 통제된 환경에서 멸균 침구(10054, Andersons, USA)가 있는 개별 환기 케이지(IVC)에서 사육하였다. 전체 연구 기간 동안 사료(LabDiet 5010, PMI, USA)와 물(멸균 RO수)을 자유롭게 제공하였다.
6. 무작위화: 모든 동물의 체중을 측정하고, 연구 전에 건강한 상태를 관찰하였다. 실험에는 비정상적인 임상 징후가 없는 동물이 선택되었다. 건강한 동물은 그룹 간 체중의 유의한 차이 없이 서로 다른 그룹으로 무작위 배정되었다. 동물의 체중 변화는 평균 체중의 ±20%를 초과해서는 안된다. 절차는 실험실 동물 관행의 표준을 따랐다.
7. IACUC 승인번호: IACUC-2020-SH-016
장비
세포 배양 인큐베이터(Shel Lab/3552)
생물안전 캐비닛(BAKER/SG604)
전자저울(PRECISA/XS 225A-SCS)
피펫(Thermo/Finnpipette FI)
격리된 양압/음압 검증 케이지 하우징 시스템(Allentown/NEXGEN)
분석 저울(PRECISA/XS3250C-SCS)
동물 안락사 장비 (Forward Biotech Supply)
유세포 분석기(Beckman Coulter/Navios EX)
버니어(Vernier)(미쓰도요/CD-6"ASX)
방법
실험 설계
1. 샘플링: 실험 설계, 실험 그룹, 주사 투여량 및 부피, 투여 경로 및 동물 수는 표 1에 나열되어 있다.
표 1. 투여 요법 및 샘플링

그룹
시험물질의
투여 경로
주사 투여량
(mg/kg)
주사 부피
(mg/kg)
동물 수

G1: 비히클
IV 및 IP
N/A
5＋10
5

G2: OBI-3424
IV
1
5
5

G3: 항-hPD-1
IP
10 (D15부터 20＊)
5
5

G4: 항-hPD-L1
IP
10 (D15부터 20＊)
10
5

G5: OBI-3424＋
항-hPD-1
IV 및 IP
10 (D15부터 20＊)
5+10
5

G6: OBI-3424＋ 항-hPD-L1
IV 및 IP
1＋10 (D15부터 20＊)
5+10
5

정맥내 주사(IV): 주사 부피는 5 mL/kg
복강내 주사 (IP): 주사 부피는 10 mL/kg
＊ 15일차부터 복강주사 투여량을 20mg/kg으로 변경하였다.
2. 이종이식 마우스 모델의 확립
2.1. 동물 제모: 인간 간암종 세포주인 HepG2를 주입하기 전에, 오른쪽 옆구리 털만 클리핑으로 제거하였다.
2.2. 종양 세포의 피하 접종: 1×107 HepG2 세포들을 0.25×107 hPBMC(세포 수 비율 4:1)와 미리 혼합한 후 마트리겔(부피비 1:1)(Corning, Cat. No.: 354248, Lot No.: 8228001)과 혼합하였다. 피하 주사 부피는 200 μL/마우스였다.
3. 시험물질의 경로 및 투여:
3.1. 시험물질인 항-hPD-1 항체 또는 참조물질(reference)을 종양 세포 접종 후 8일째에 마우스에 복강내 주사하였다. 주사는 인슐린 주사기를 이용하여 10 mg/kg의 투여량(주사 투여량은 15일째부터 20 mg/kg으로 변경됨) 및 주사 부피 10 mL/kg으로 수행되었다. 시험물질인 항-hPD-1 항체는 G3 및 G5에 대해 8일, 11일, 15일, 18일, 22일, 25일, 29일 및 32일에 지속적으로 투여되었다. 참조물질은 G1에 대해 투여되었다. 절차는 샘플 투여 표준을 따랐다.
3.2. 시험물질인 항-hPD-L1 항체 또는 참조물질을 종양 세포 접종 후 8일째에 마우스에 복강내 주사하였다. 주사는 인슐린 주사기를 이용하여 10 mg/kg의 투여량(주사 투여량은 15일째부터 20 mg/kg으로 변경됨) 및 주사 부피 10 mL/kg으로 수행되었다. 시험물질인 항-hPD-L1은 G4 및 G6에 대해 8일, 11일, 15일, 18일, 22일, 25일, 29일 및 32일에 지속적으로 투여되었다. 참조물질은 Gl에 대해 투여되었다. 절차는 샘플 투여 표준을 따랐다.
3.3. 시험물질인 OBI-3424 및 참조물질을 종양 세포 접종 후 14일째에 마우스에 정맥 주사하였다. 주사는 인슐린 주사기를 사용하여 1 mg/kg의 투여량 및 5 mL/kg의 주사 부피로 수행되었다. 시험물질인 OBI-3424를 G2, G5 및 G6에 대해 14일, 21일, 28일 및 35일에 지속적으로 투여하였다. 참조물질은 Gl에 대해 투여되었다. 절차는 샘플 투여 표준을 따랐다.
3.4. 시험물질 또는 참조물질 준비:
투여 전에 시험물질을 참조물질로 희석하였다. 시험물질인 OBI-3424의 용액 농도는 0.2 mg/mL이었고, 시험물질 항-hPD-1 및 시험물질 항-hPD-L1의 농도는 1 mg/mL였다(15일차부터 2 mg/mL).
4. 체중 측정:
측정은 접종 다음날부터 실시하였다. 동물 체중을 매주 2회 측정하고 기록하였다.
5. 종양 직경 측정:
측정은 접종 다음날부터 수행하였다. 종양 부피는 일주일에 두 번(월요일, 목요일) 측정하고 기록하였다. 종양 부피는 기록에 따라 타원체 방정식((장축×단축×단축)×(π/6))으로 계산되었다.
6. 종양 성장 억제율 계산:
종양 부피를 사용하여 다음 공식에 따라 종양 성장 억제(TGI) 비율을 계산하였다: TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Ci-CO)] × 100, 여기서 Ti 및 Ci는 실험 종료 시(35일)에 처리 그룹 및 비히클 그룹의 평균 종양 부피를 나타낸다. 반면, TO 및 CO는 실험 시작 시(1일)의 치료 그룹 및 비히클 그룹의 평균 종양 부피를 나타낸다.
7. 혈액 샘플링:
종료 시에, 턱밑 혈액 샘플을 수집하였다. 희생 시에, 심장 천자를 사용하여 혈액 샘플을 수집할 수 있다. 수집된 혈액 샘플을 4±2℃, 1500xg에서 15분간 원심분리하여 혈청과 펠릿을 분리하였다. 상부 혈청을 수집하여 -70℃ 이하의 온도에서 보관하였다. 절차는 동물 혈액 샘플링 표준을 따랐다.
8. 연구 종료점 결정:
연구는 36일에 종료되었다.
9. 종양 절제:
연구 기간이 끝날 때 마우스를 CO2 안락사로 희생시키고, 종양 주변의 결합 조직을 절제하였다. 그런 다음, 종양 샘플을 제거하고 무게를 측정하였다. 반쪽 조직을 10% 포름알데히드에 고정한 후 파라핀에 묻었다. 나머지 절반은 종양 침윤 림프구(TIL)의 분리를 위해 준비되었다.
10. 종양 침윤 림프구(TIL)의 분리:
마우스 종양의 절반을 메스를 사용하여 더 작은 조각으로 절개한 다음 콜라게나제, DNase I 및 히알루로니다제(콜라게나제 #C5138, DNase I #D5025, 히알루로니다제 #H6254, SigmaAldrich)의 혼합물로 최소 2시간 동안 소화하였다. 이어서, 종양 소화물을 주사기 플런저를 사용하여 70㎛ 메쉬 세포 여과기(Falcon #352350)에 통과시키고, PBS로 세척하였다. 세포들을 RBC 적혈구 용해 완충액(Biolegend #420302)으로 처리하여, 유세포 분석용 단일 세포 현탁액을 제조하였다.
11. TIL 집단의 유세포 분석:
세포를 염색 완충액(Biolegend #420201)으로 세척하고, Fc 수용체 차단 용액(Biolegend #422302)을 함유하는 염색 완충액에 재현탁시키고, 4℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포들을 형광 접합된 표면 항체들로 염색하고, 4℃에서 30분 동안 배양한 다음 유세포 분석을 위해 염색 완충액에 재현탁하였다. Navios EX 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 데이터는 Kaluza Analysis 소프트웨어(Beckman Coulter)를 사용하여 분석되었다.
12. 통계 분석:
결과는 평균 및 평균의 표준 오차(Mean±SEM)로 표시되었다. 각 처리군에 대해 수집된 모든 데이터와 동시 음성 대조군 데이터의 비교는 스튜던트 t-테스트(Microsoft Excel, 2007)를 사용하여 계산되었다. P≤0.05는 유의미한 것으로 간주된다.
결과
그룹 체중의 요약이 표 2에 제시되어 있다. 연구 시작 시의 그룹 간 평균 체중에서 통계학적으로 유의미한 차이는 관찰되지 않았다. 연구 종료 시점에서 G5(OBI-3424＋항-hPD-1) 및 G6(OBI-3424＋항-hPD-L1)의 체중은 다른 그룹들에 비해 약간 증가하였다(도 1 및 표 2). 종양 반응은 다양한 시험물질들에서 검사되었으며, 평균 종양 반응은 1, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32 및 35일에 기록되었다(도 3 및 표 3).
표 2. 체중 요약
그룹 동물
번호		 체중(g)
0일 1일 4일 7일 11일 14일 18일 21일 25일 28일 32일 35일
G1:
비히클		 MI039 24.99 24.93 25.83 25.32 25.81 24.73 24.63 24.55 24.60 23.64 24.15 23.62
MI047 20.78 20.80 21.81 22.05 22.97 23.69 23.28 23.07 22.91 22.23 23.04 22.58
MI049 23.24 22.25 23.62 22.65 24.47 24.98 24.70 23.99 23.91 23.77 24.10 23.87
MI057 22.07 22.32 23.10 23.14 22.35 21.86 23.11 23.13 23.22 23.31 23.02 22.01
MI059 23.33 22.89 24.40 24.24 24.12 24.30 24.12 23.80 24.02 23.35 24.16 24.20
Mean 22.88 22.64 23.75 23.48 23.94 23.91 23.97 23.71 23.73 23.26 23.69 23.26
SEM 0.70 0.67 0.67 0.58 0.60 0.56 0.33 0.28 0.30 0.27 0.27 0.41
G2:
OBI-3424		 MI035 24.96 22.46 22.37 22.47 23.94 24.07 24.35 24.16 24.25 23.76 24.05 24.05
MI036 24.90 25.09 24.64 24.34 25.49 25.93 25.50 25.46 26.12 24.92 24.28 23.62
MI040 22.27 22.27 23.03 23.05 23.21 23.33 22.61 22.60 22.64 20.15 22.28 21.87
MI051 22.28 22.08 22.64 23.08 25.15 25.28 24.90 24.19 24.16 24.19 25.24 24.53
MI053 22.68 22.05 23.02 23.25 23.92 23.25 23.80 23.77 24.18 24.28 24.80 24.42
Mean 23.42 22.79 23.14 23.24 24.34 24.37 24.23 24.04 24.27 23.46 24.13 23.70
SEM 0.62 0.58 0.39 0.31 0.42 0.53 0.49 0.46 0.55 0.85 0.51 0.48
G3:
항-hPD-1		 MI031 24.48 23.77 24.37 24.33 25.23 25.73 25.52 25.31 25.35 24.05 23.93 24.51
MI041 22.83 22.64 23.22 23.26 23.13 23.05 24.00 23.64 23.30 21.35 21.55 21.67
MI055 22.77 22.39 23.69 23.03 22.86 22.58 23.68 23.07 23.44 22.97 23.13 23.02
MI058 22.35 22.37 23.44 23.66 24.79 24.78 24.66 24.39 24.30 23.07 23.22 23.30
MI060 21.75 21.18 22.64 23.10 23.48 23.54 23.64 21.55 20.71 21.15 20.92 21.34
Mean 22.84 22.47 23.47 23.48 23.90 23.94 24.30 23.59 23.42 22.52 22.55 22.77
SEM 0.45 0.41 0.28 0.24 0.47 0.58 0.36 0.63 0.77 0.55 0.56 0.58
G4:
항-hPD-L1		 MI037 23.68 23.15 23.83 23.75 24.89 25.06 24.70 24.14 24.47 23.71 23.83 23.41
MI046 25.61 25.88 26.01 26.73 26.45 26.71 26.09 26.11 25.74 25.42 25.58 24.98
MI048 23.03 22.46 23.49 23.02 23.97 23.84 24.20 24.05 24.60 22.64 22.43 22.69
MI052 21.27 21.36 21.62 21.92 22.76 22.29 22.27 21.02 22.60 21.81 18.37 *
MI062 20.75 20.78 21.66 22.00 22.78 20.81 20.56 21.51 21.07 24.27 22.52 22.32
Mean 22.87 22.73 23.32 23.48 24.17 23.74 23.56 23.37 23.70 23.57 22.55 23.35
SEM 0.87 0.89 0.81 0.88 0.70 1.03 0.97 0.94 0.83 0.63 1.19 0.59
G5:
OBI-3424＋ 항-hPD-1		 MI034 24.95 24.33 25.05 24.40 25.22 25.31 24.96 24.83 24.70 24.33 25.61 25.91
MI042 25.59 25.08 25.58 25.24 24.20 24.12 24.42 24.53 25.02 25.15 25.57 26.42
MI050 22.28 22.34 23.28 23.74 25.05 25.31 24.89 25.38 25.09 25.13 25.75 26.23
MI054 23.20 23.02 23.81 23.75 22.96 23.02 22.93 22.61 23.68 23.46 23.66 23.62
MI056 22.96 21.62 22.27 22.67 23.69 24.00 23.47 23.02 23.08 23.81 23.66 24.08
Mean 23.80 23.28 24.00 23.96 24.22 24.35 24.13 24.07 24.31 24.38 24.85 25.25
SEM 0.63 0.63 0.60 0.42 0.42 0.44 0.40 0.54 0.40 0.34 0.49 0.58
G6:
OBI-3424＋ 항-hPD-L1		 MI033 24.49 24.60 25.89 25.25 25.37 24.64 24.78 24.95 25.59 25.71 25.99 26.47
MI038 22.81 22.96 24.01 24.22 24.80 24.30 24.40 24.38 24.70 24.18 24.12 24.45
MI043 21.17 21.04 22.06 21.83 21.70 22.36 22.13 22.13 22.31 23.00 22.71 23.24
MI044 24.26 23.76 25.16 24.35 25.05 25.46 24.03 24.15 24.37 24.80 25.51 25.78
MI045 23.88 23.67 24.74 24.22 24.62 25.02 25.30 25.75 25.26 25.12 26.14 26.98
Mean 23.32 23.21 24.37 23.97 24.31 24.36 24.13 24.27 24.45 24.56 24.89 25.38
SEM 0.61 0.60 0.65 0.57 0.66 0.54 0.54 0.60 0.57 0.46 0.65 0.68
＊: MI052는 34일째에 죽은 채 발견되었다.
표 3. 종양 부피 및 무게 요약
그룹 동물
번호		 종양 부피(mm3) 종양
중량
(mg)		 TGI (%)
D1 D4 D7 D11 D14 D18 D21 D25 D28 D32 D35 D35
G1:
비히클		 MI039 273.66 265.50 334.42 388.44 462.39 600.99 954.55 1033.73 1246.21 1698.35 1833.05 1064.10 N/A
MI047 300.06 222.20 246.06 268.86 333.72 538.18 716.42 1405.89 1582.38 1771.38 2073.85 1704.60
MI049 322.78 280.12 289.67 292.95 321.52 372.96 523.55 557.61 670.58 796.22 940.35 638.90
MI057 482.26 362.35 332.03 382.50 404.25 465.56 639.62 955.72 991.31 1159.28 1357.04 995.80
MI059 576.81 357.00 292.38 349.42 380.15 405.82 464.71 544.77 906.23 1171.66 1488.24 933.90
Mean 391.11 297.43 298.91 336.43 380.41 476.70 659.77 899.54 1079.34 1319.38 1538.51 1067.46
SEM 58.97 27.15 16.25 23.93 25.43 41.91 85.77 161.30 155.84 182.90 195.78 175.01
G2: OBI-3424 MI035 336.94 248.60 247.70 272.45 316.87 443.46 495.51 530.21 534.09 458.78 326.08 187.80 83.13
MI036 416.45 319.17 329.31 403.25 450.69 595.27 703.20 1087.59 929.53 802.95 875.83 442.00
MI040 374.19 317.11 337.59 346.18 410.20 558.01 847.55 1133.30 1088.12 1097.24 1092.67 575.30
MI051 431.65 274.75 282.91 337.46 361.93 491.94 487.42 479.83 505.34 313.47 325.92 74.00
MI053 426.18 316.40 293.88 361.50 385.75 588.12 603.56 635.01 537.45 543.00 332.59 93.10
Mean 397.08 295.20 298.28 344.17 385.09 535.36 627.45 773.19 718.91 643.09 590.62 274.44
SEM 18.11 14.31 16.31 21.19 22.50 29.34 67.74 140.13 121.11 138.64 164.32 99.79
G3: 항-hPD-1 MI031 317.46 236.70 257.47 308.80 397.01 693.99 881.79 1085.08 1583.17 1923.48 2446.76 2447.20 -9.69
MI041 272.82 209.94 296.62 308.98 339.27 629.12 1133.34 1200.68 1453.15 1801.67 2416.49 2501.20
MI055 354.07 270.30 282.75 291.53 334.80 515.62 545.25 648.40 782.93 970.79 1023.97 447.30
MI058 458.23 341.42 343.00 412.75 473.75 891.77 904.48 901.39 1044.52 1211.89 1248.89 655.20
MI060 371.40 288.50 328.21 375.46 423.96 944.97 935.49 904.19 991.40 923.05 930.75 281.50
Mean 354.80 269.37 301.61 339.50 393.76 735.09 880.07 947.95 1171.03 1366.17 1613.37 1266.48
SEM 30.89 22.54 15.41 23.27 26.24 80.53 94.85 93.94 149.72 209.37 338.07 496.67
G4:
항-hPD-L1		 MI037 311.93 275.12 258.52 261.37 274.59 334.71 560.79 596.92 636.51 844.25 1122.20 960.10 35.60
MI046 470.43 344.51 365.09 379.77 444.66 599.46 759.83 849.43 918.32 1330.79 1513.23 1437.50
MI048 376.06 275.94 275.91 328.38 353.38 481.58 589.05 897.19 949.94 1161.94 1337.47 1190.20
MI052 413.00 384.63 326.38 445.55 490.86 624.77 1049.86 1294.64 1343.20 1884.53 * *963.00
MI062 477.14 300.15 296.62 299.06 293.86 415.39 417.12 426.57 486.86 557.69 621.65 455.10
Mean 409.71 316.07 304.50 342.83 371.47 491.18 675.33 812.95 866.97 1155.84 1148.64 * 1010.73
SEM 30.77 21.27 18.90 32.15 42.04 54.72 108.32 147.72 147.29 225.44 193.00 209.29
G5:
OBI-3424＋항-hPD-1		 MI034 255.56 235.32 259.12 316.52 319.27 406.87 333.76 271.54 259.90 317.15 388.43 124.30 109.71
MI042 365.53 303.74 314.43 364.96 412.55 508.29 322.13 314.43 298.78 320.28 245.14 53.70
MI050 450.24 376.72 371.44 372.22 438.22 579.37 570.71 493.70 503.36 367.28 242.18 102.40
MI054 445.96 267.88 273.95 314.86 334.05 384.14 295.90 243.93 211.39 196.54 198.00 53.1
0
MI056 376.86 279.26 300.66 327.56 347.38 423.68 432.55 417.39 229.54 257.99 263.40 65.70
Mean 378.83 292.58 303.92 339.23 370.30 460.47 391.01 348.20 300.59 291.85 267.43 79.84
SEM 35.34 23.74 19.47 12.24 23.28 36.38 50.54 46.82 52.81 29.47 32.10 14.29
G6:
OBI-3424+ 항-hPD-L1		 MI033 383.35 290.41 302.58 412.69 451.18 568.41 452.77 375.48 426.92 519.39 396.47 147.70 97.11
MI038 286.46 235.58 260.09 326.89 435.04 570.91 615.63 595.06 735.67 793.12 773.46 429.20
MI043 516.08 320.84 267.89 306.21 340.88 695.17 687.48 641.22 565.46 512.11 366.43 132.80
MI044 418.50 332.14 388.79 389.37 484.13 672.17 688.96 406.06 259.81 281.58 341.67 86.90
MI045 493.81 349.65 306.13 389.67 478.67 548.76 623.49 413.49 504.75 501.25 385.72 145.60
Mean 419.64 305.72 305.09 364.96 437.98 611.08 613.66 486.26 498.52 521.49 452.75 188.44
SEM 41.15 20.01 22.83 20.48 25.88 30.10 43.07 54.70 78.38 81.19 80.72 61.18
＊ MI052는 죽은 채로 발견되었으며, 종양 중량은 34일에 기록되었다. MI052는 평균 종양 중량 통계 계산에 포함되지 않았다.
우선, G1(비히클), G2(OBI-3424), G3(항-hPD-1) 및 G4(항-hPD-L1)에서 모든 시험물질들이 종양 반응에 미치는 영향을 조사하였다. 35일차에 OBI-3424의 존재 하에 평균 종양 부피의 유의한 감소가 관찰되었다(G1 비히클: 1538.51±195.78mm3, G2 OBI-3424: 590.62±164.32mm3, p=0.003＜0.05). 35일차에 항-hPD-1 및 항-hPD-L1의 치료에서는 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되지 않았다(G1 비히클: 1538.51±195.78mm3, G3 항-hPD-1: 1613.37±338.07mm3, G4 항-hPD-L1: 1148.64 ±193.00mm3).
또한, G5(항-hPD-1＋OBI-3424) 및 G6(항-hPD-L1＋OBI-3424)의 병용 치료에 의한 결과는 35일차에 평균 종양 부피가 유의하게 감소한 것으로 나타났고(G1 비히클: 1538.51±195.78mm3, G5 항-hPD-1+OB 1-3424: 267.43±32.10mm3, p=0.0001＜0.001, G6 항-hPD-L1＋OBI-3424: 452.75±80.72mm3, p=0.0005＜0.001 ), 한편, G3와 G5 사이에서 35일차 평균 종양 부피는 유의하게 감소하였다(G3 항-hPD-1: 1613.37±338.07mm3, G5 항-hPD-1+OBI-3424: 267.43±32.10mm3, p=0.002＜0.05). 또한, G4와 G6 사이의 35일차 종양 부피도 35일차 평균 종양 부피의 유의한 감소를 보여주었다(G4 항-hPD-L1: 1148.64±193.00mm3, G6 항-hPD-L1+OBI-3424: 452.75±80.72mm3, p=0.004＜0.05)(도 3 및 표 3). 종양 중량에서도 비슷한 경향이 관찰되었다(도 2 및 표 3). 게다가, G4(항-hPD-L1)의 마우스 한마리는 34일째에 죽은 상태로 발견되었고, 종양 중량은 동일자에 기록되었다.
종양 침윤 림프구(TIL)를 신선한 종양 조직으로부터 분리하고, 유세포 분석기로 그룹 간 표면 마커 CD45, CD4, CD8, CD56, CD16, CD25, PD-1 및 PD-L1의 발현 수준을 측정하였다. 개별 마우스에 대한 수치 데이터는 표 4-7에 제시되어 있다. 이는, 비히클과 비교했을 때, OBI-3424 처리(G2) 후 종양에서 CD8+ 세포독성 T 세포(CTL)의 세포 집단이 유의하게 증가했음을 나타냈지만, 이러한 증가는 항-PD-1(G3) 또는 항-PD-L1(G4) 처리 후의 종양에서는 관찰되지 않았다. 그러나, OBI-3424＋항-PD-1(G5) 및 OBI-3424＋항-PD-L1(G6) 처리 후의 종양에서는, 두 그룹 모두에서 CTL 집단이 유의하게 증가한 것으로 나타났다. 이는, 증가된 CTL 집단이 항-PD-1 또는 항-PD-L1 치료가 아닌 OBI-3424에 의해 유발되었음을 시사하였다. 게다가, CD4+ T 보조 세포 집단은 G5 및 G6 종양에서 유의하게 증가하였다. NK 세포 집단은 비히클과 각 치료군 간에 유의미한 차이가 없었다.
표 4. TIL들 내의 CTL 세포들의 백분율 요약
그룹 동물
번호		 세포
농도		 총
세포		 생존력 CTL 세포
(CD45+CD8+)		 CD25+ CTL 세포 (CD45+ CD8+ CD25+) PD-1+ CTL 세포
(CD45+ CD8+ PD-1+)
×
(105/
mL) 		×
106 		% 총% CD45+
게이트
%		 세포수
(x105)		 총% CTL
게이트
%		 세포수
(x105)		 총% CTL
게이트
%		 세포수
(x105)
G1:
비히클		 MI039 5.87 10.50 55.90 9.21 53.75 9.67 0.40 4.35 0.42 13.93 95.18 14.63
MI047 8.63 13.10 65.88 10.71 41.07 14.03 0.35 3.27 0.46 10.06 90.88 13.18
MI049 5.16 12.30 41.95 6.62 51.92 8.14 0.85 12.84 1.05 5.85 80.80 7.20
MI057 5.53 9.62 57.48 7.90 37.24 7.60 0.07 0.89 0.07 20.46 95.45 19.68
MI059 12.30 19.00 64.74 14.06 37.94 26.71 0.19 1.35 0.36 13.78 90.03 26.18
G2:
OBI-3424		 MI035 2.85 4.36 65.37 20.93 49.08 9.13 0.27 1.27 0.12 21.41 92.13 9.33
MI036 2.81 7.37 38.13 12.12 66.81 8.93 0.30 2.48 0.22 12.30 91.25 9.07
MI040 5.72 8.18 69.93 21.14 72.14 17.29 0.77 3.64 0.63 20.63 99.25 16.88
MI051 1.91 2.44 78.28 45.53 74.09 11.11 0.52 1.13 0.13 41.26 91.79 10.07
MI053 3.22 4.06 79.31 36.08 57.70 14.65 0.28 0.78 0.11 28.90 85.06 11.73
G3:
항-hPD-1		 MI031 20.80 30.40 68.42 9.30 36.10 28.27 0.26 2.80 0.79 10.83 89.36 32.92
MI041 23.00 35.10 65.53 6.22 34.75 21.83 0.10 1.53 0.35 9.53 84.37 33.45
MI055 6.17 9.53 64.74 21.30 75.47 20.30 0.65 3.05 0.62 15.71 66.70 14.97
MI058 7.72 12.90 59.84 11.17 53.85 14.41 0.84 7.48 1.08 10.88 66.59 14.04
MI060 4.45 6.79 65.54 24.91 55.75 16.91 0.41 1.65 0.28 14.41 57.38 9.78

G4:
항-hPD-L1		 MI037 8.66 12.20 70.98 14.00 57.51 17.08 0.27 1.93 0.33 17.16 97.44 20.94
MI046 15.00 22.00 68.18 18.51 57.17 40.72 0.30 1.59 0.66 16.84 88.98 37.05
MI048 11.60 17.70 65.54 11.85 56.56 20.97 0.21 1.77 0.37 12.16 94.63 21.52
MI062 3.28 7.22 45.43 16.01 70.33 11.56 0.63 3.90 0.45 16.68 98.61 12.04
G5:
OBI-3424＋ 항-hPD-1		 MI034 2.00 2.90 68.97 30.12 56.19 8.73 0.64 2.13 0.19 15.92 52.86 4.62
MI042 0.24 0.49 48.28 25.43 46.84 1.25 0.20 0.77 0.01 11.13 35.95 0.55
MI050 1.71 2.91 58.76 20.78 59.78 6.05 0.44 2.09 0.13 11.90 52.33 3.46
MI054 0.89 1.21 73.88 31.55 63.27 3.82 0.58 1.84 0.07 16.88 48.79 2.04
MI056 2.06 3.13 65.81 30.09 55.23 9.42 0.37 1.23 0.12 12.41 39.23 3.88
G6:
OBI-3424＋ 항-hPD-L1		 MI033 2.16 3.20 67.50 27.93 65.90 8.94 0.30 1.07 0.10 25.02 87.30 8.01
MI038 4.46 5.69 78.38 31.74 49.21 18.06 0.39 1.23 0.22 30.71 97.65 17.47
MI043 3.20 4.50 71.11 40.03 69.67 18.01 0.28 0.69 0.13 25.12 66.20 11.30
MI044 1.06 1.81 58.56 22.68 53.32 4.11 0.33 1.43 0.06 20.46 89.05 3.70
MI045 3.28 4.20 78.10 32.10 61.60 13.48 0.27 0.83 0.11 29.07 93.11 12.21
CD45+ 게이트(Gated)% = 게이트 CD45+ 세포들
세포수(×l04) = 총 세포 × 총% × 10
CTL 게이트% = 게이트 CD45+CD8+ 세포들
표 5. TIL들 내의 TH 세포들의 백분율 요약
그룹 동물
번호		 세포
농도		 총
세포		 생존력 TH 세포
(CD45+CD4+)		 CD25+ TH 세포
(CD45 +CD4 +CD25+)		 PD-1+ TH 세포
(CD45+ CD4+ PD-1+)
×
(105/
mL) 		×
106 		% 총% CD45+
게이트
%		 세포수(x105) 총% TH
게이트
%		 세포수(x105) 총% TH
게이트
%		 세포수(x105)
G1:
비히클		 MI039 5.87 10.50 55.90 6.86 40.03 7.20 0.59 8.61 0.62 7.13 99.30 7.49
MI047 8.63 13.10 65.88 15.84 60.74 20.75 0.77 4.86 1.01 14.43 98.23 18.90
MI049 5.16 12.30 41.95 5.60 43.88 6.89 0.58 10.28 0.71 5.47 98.20 6.73
MI057 5.53 9.62 57.48 11.34 53.43 10.91 0.39 3.40 0.38 15.83 99.94 15.23
MI059 12.30 19.00 64.74 17.72 47.82 33.67 0.77 4.35 1.46 18.40 99.00 34.96
G2:
OBI-3424		 MI035 2.85 4.36 65.37 18.53 43.45 8.08 1.06 5.70 0.46 19.45 99.46 8.48
MI036 2.81 7.37 38.13 9.14 50.36 6.74 0.68 7.39 0.50 9.29 98.15 6.85
MI040 5.72 8.18 69.93 14.30 48.78 11.70 0.82 5.74 0.67 13.77 99.75 11.26
MI051 1.91 2.44 78.28 14.34 23.33 3.50 0.52 3.63 0.13 15.00 97.06 3.66
MI053 3.22 4.06 79.31 16.81 26.88 6.82 0.53 3.15 0.22 16.75 97.78 6.80
G3:
항-hPD-1		 MI031 20.80 30.40 68.42 19.18 74.49 58.31 0.71 3.70 2.16 20.78 96.11 63.17
MI041 23.00 35.10 65.53 11.07 61.90 38.86 0.67 6.05 2.35 11.99 90.08 42.08
MI055 6.17 9.53 64.74 9.76 34.59 9.30 0.82 8.35 0.78 9.21 83.23 8.78
MI058 7.72 12.90 59.84 11.17 53.85 14.41 1.28 11.42 1.65 11.61 82.55 14.98
MI060 4.45 6.79 65.54 18.23 40.81 12.38 0.45 2.44 0.31 15.49 85.27 10.52
G4:
항-hPD-L1		 MI037 8.66 12.20 70.98 9.82 40.34 11.98 1.19 12.12 1.45 10.85 99.40 13.24
MI046 15.00 22.00 68.18 12.42 38.36 27.32 1.34 10.75 2.95 11.67 99.02 25.67
MI048 11.60 17.70 65.54 6.81 32.51 12.05 1.01 14.76 1.79 6.66 99.40 11.79
MI062 3.28 7.22 45.43 15.92 69.93 11.49 1.14 7.16 0.82 15.38 99.19 11.10
G5:
OBI-3424＋ 항-hPD-1		 MI034 2.00 2.90 68.97 31.40 58.59 9.11 1.49 4.73 0.43 29.96 89.25 8.69
MI042 0.24 0.49 48.28 29.46 54.25 1.45 0.60 2.02 0.03 28.73 86.08 1.42
MI050 1.71 2.91 58.76 14.65 42.15 4.26 0.94 6.42 0.27 13.65 87.05 3.97
MI054 0.89 1.21 73.88 22.65 45.42 2.74 1.62 7.13 0.20 20.44 83.31 2.47
MI056 2.06 3.13 65.81 24.15 44.32 7.56 0.85 3.50 0.27 22.53 87.16 7.05
G6:
OBI-3424＋ 항-hPD-L1		 MI033 2.16 3.20 67.50 14.36 33.88 4.60 0.56 3.90 0.18 15.43 98.75 4.94
MI038 4.46 5.69 78.38 43.37 67.24 24.68 3.95 9.11 2.25 41.44 99.72 23.58
MI043 3.20 4.50 71.11 19.38 33.73 8.72 0.53 2.71 0.24 20.71 99.00 9.32
MI044 1.06 1.81 58.56 19.02 44.72 3.44 0.94 4.94 0.17 21.16 99.18 3.83
MI045 3.28 4.20 78.10 20.28 38.91 8.52 0.59 2.91 0.25 21.10 99.67 8.86
CD45+ 게이트% = 게이트 CD45+ 세포들
세포수(×l04) = 총 세포 × 총% × 10
TH 게이트% = 게이트 CD45+CD4+ 세포들
표 6. TIL들 내의 NK 세포들의 백분율 요약
그룹 동물 번호 세포 농도 총
세포		 생존력 NK 세포
(CD45+CD56+)		 CD16+ NK 세포
(CD45+CD56+ CD16+)		 PD-1+ NK 세포
(CD45+ CD56+ PD-1+)
×
(105/
mL) 		×
106 		% 총% CD45+
게이트
%		 세포수
(x105)		 총% NK
게이트
%		 세포수
(x105)		 총% NK
게이트
%		 세포수
(x105)
G1:
비히클		 MI039 5.87 10.50 55.90 1.26 9.08 1.32 0.16 12.30 0.17 1.89 99.74 1.98
MI047 8.63 13.10 65.88 2.62 9.86 3.43 1.01 38.43 1.32 1.68 94.10 2.20
MI049 5.16 12.30 41.95 2.78 23.40 3.42 0.69 24.82 0.85 1.04 66.77 1.28
MI057 5.53 9.62 57.48 0.74 3.67 0.71 0.26 34.46 0.25 1.91 100.00 1.84
MI059 12.30 19.00 64.74 0.72 1.96 1.37 0.18 24.48 0.34 3.36 94.12 6.38
G2:
OBI-3424		 MI035 2.85 4.36 65.37 2.47 6.06 1.08 0.39 15.62 0.17 3.26 88.81 1.42
MI036 2.81 7.37 38.13 1.62 9.96 1.19 0.21 12.65 0.15 1.51 88.82 1.11
MI040 5.72 8.18 69.93 1.15 4.16 0.94 0.24 20.43 0.20 1.63 97.60 1.33
MI051 1.91 2.44 78.28 2.73 5.20 0.67 0.21 7.71 0.05 2.76 90.05 0.67
MI053 3.22 4.06 79.31 1.39 2.33 0.56 0.17 11.87 0.07 2.38 83.33 0.97
G3:
항-hPD-1		 MI031 20.80 30.40 68.42 2.91 12.27 8.85 0.41 13.94 1.25 2.67 99.81 8.12
MI041 23.00 35.10 65.53 1.08 6.34 3.79 0.32 29.77 1.12 1.13 100.00 3.97
MI055 6.17 9.53 64.74 3.01 12.96 2.87 0.44 14.48 0.42 2.36 87.08 2.25
MI058 7.72 12.90 59.84 1.93 9.57 2.49 0.32 16.58 0.41 1.46 98.31 1.88
MI060 4.45 6.79 65.54 4.76 12.69 3.23 0.79 16.61 0.54 1.78 64.90 1.21
G4:
항-hPD-L1		 MI037 8.66 12.20 70.98 1.67 9.51 2.04 0.44 26.13 0.54 2.28 99.56 2.78
MI046 15.00 22.00 68.18 2.61 10.84 5.74 0.80 30.65 1.76 2.28 97.23 5.02
MI048 11.60 17.70 65.54 1.42 12.49 2.51 0.62 43.46 1.10 2.10 88.77 3.72
MI062 3.28 7.22 45.43 1.80 8.78 1.30 0.48 26.39 0.35 1.78 91.52 1.29
G5:
OBI-3424＋ 항-hPD-1		 MI034 2.00 2.90 68.97 3.12 6.58 0.90 0.40 12.82 0.12 2.46 65.29 0.71
MI042 0.24 0.49 48.28 5.87 10.28 0.29 0.80 13.54 0.04 2.83 63.38 0.14
MI050 1.71 2.91 58.76 3.98 12.46 1.16 0.82 20.50 0.24 2.11 68.62 0.61
MI054 0.89 1.21 73.88 4.04 8.60 0.49 0.59 14.60 0.07 1.99 70.82 0.24
MI056 2.06 3.13 65.81 3.66 7.72 1.15 0.43 11.76 0.13 1.99 62.09 0.62
G6:
OBI-3424＋ 항-hPD-L1		 MI033 2.16 3.20 67.50 1.71 4.79 0.55 0.39 22.81 0.12 2.57 85.50 0.82
MI038 4.46 5.69 78.38 3.94 7.12 2.24 0.77 19.42 0.44 4.00 90.69 2.28
MI043 3.20 4.50 71.11 3.32 11.18 1.49 0.40 11.90 0.18 4.01 67.25 1.80
MI044 1.06 1.81 58.56 3.01 8.98 0.54 0.46 15.28 0.08 2.79 85.43 0.50
MI045 3.28 4.20 78.10 3.09 6.87 1.30 0.71 23.01 0.30 4.69 90.36 1.97
CD45+ 게이트% = 게이트 CD45+ 세포들
세포수(×l04) = 총세포 × 총% × 10
NK 게이트% = 게이트 CD45+CD56+ 세포들
표 7. TIL들 내의 PD-L1 세포들의 백분율 요약
그룹 동물 번호 세포 농도 총세포 생존력 CD45+ 세포 총세포 총 PD-L1+ 세포
(PD-L1+)
×
(105/
mL) 		×
106 		% 총% 게이트
%		 세포수
(x106)		 총% 게이트
%		 세포수
(x106)		 총% 총
세포
게이트
%		 세포수
(x105)
G1:
비히클		 MI039 5.87 10.50 55.90 17.13 30.98 1.80 53.73 53.73 5.64 3.80 7.06 3.99
MI047 8.63 13.10 65.88 26.08 37.00 3.42 82.52 82.52 10.81 7.38 8.94 9.67
MI049 5.16 12.30 41.95 12.75 18.11 1.57 81.77 81.77 10.06 24.44 29.89 30.06
MI057 5.53 9.62 57.48 21.22 39.14 2.04 46.07 46.07 4.43 0.70 1.51 0.67
MI059 12.30 19.00 64.74 37.05 53.59 7.04 78.60 78.60 14.93 3.86 4.90 7.33
G2:
OBI-3424		 MI035 2.85 4.36 65.37 42.64 58.88 1.86 87.63 87.63 3.82 4.97 5.67 2.17
MI036 2.81 7.37 38.13 18.14 28.16 1.34 79.89 79.89 5.89 19.30 24.15 14.22
MI040 5.72 8.18 69.93 29.31 40.69 2.40 84.57 84.57 6.92 5.09 6.02 4.16
MI051 1.91 2.44 78.28 61.46 79.75 1.50 94.06 94.06 2.30 1.08 1.15 0.26
MI053 3.22 4.06 79.31 62.53 79.11 2.54 94.44 94.44 3.83 0.62 0.65 0.25
G3:
항-hPD-1		 MI031 20.80 30.40 68.42 25.75 41.15 7.83 53.84 53.84 16.37 3.47 6.45 10.55
MI041 23.00 35.10 65.53 17.89 30.42 6.28 51.71 51.71 18.15 3.89 7.52 13.65
MI055 6.17 9.53 64.74 28.22 47.95 2.69 67.88 67.88 6.47 2.50 3.68 2.38
MI058 7.72 12.90 59.84 20.74 36.87 2.68 77.26 77.26 9.97 6.05 7.83 7.80
MI060 4.45 6.79 65.54 44.68 63.31 3.03 89.23 89.23 6.06 6.21 6.95 4.22
G4:
항-hPD-L1		 MI037 8.66 12.20 70.98 24.35 34.93 2.97 77.18 77.18 9.42 1.11 1.43 1.35
MI046 15.00 22.00 68.18 32.38 47.08 7.12 75.98 75.98 16.72 1.81 2.38 3.98
MI048 11.60 17.70 65.54 20.95 31.41 3.71 74.62 74.62 13.21 8.80 11.79 15.58
MI062 3.28 7.22 45.43 22.77 28.59 1.64 88.63 88.63 6.40 16.86 19.02 12.17
G5:
OBI-3424＋
항-hPD-1		 MI034 2.00 2.90 68.97 53.60 70.26 1.55 88.56 88.56 2.57 0.85 0.96 0.25
MI042 0.24 0.49 48.28 54.30 81.64 0.27 53.73 53.73 0.26 1.46 2.72 0.07
MI050 1.71 2.91 58.76 34.76 53.31 1.01 50.19 50.19 1.46 2.12 4.21 0.62
MI054 0.89 1.21 73.88 49.86 70.32 0.60 49.84 49.84 0.60 1.86 3.73 0.23
MI056 2.06 3.13 65.81 54.48 78.32 1.71 90.68 90.68 2.84 2.12 2.34 0.66
G6:
OBI-3424＋ 항-hPD-L1		 MI033 2.16 3.20 67.50 42.38 60.88 1.36 72.79 72.79 2.33 1.67 2.29 0.53
MI038 4.46 5.69 78.38 64.51 81.40 3.67 80.45 80.45 4.58 0.74 0.92 0.42
MI043 3.20 4.50 71.11 57.46 79.35 2.59 88.15 88.15 3.97 1.48 1.67 0.67
MI044 1.06 1.81 58.56 42.53 64.37 0.77 89.54 89.54 1.62 2.50 2.79 0.45
MI045 3.28 4.20 78.10 52.11 72.03 2.19 93.65 93.65 3.93 1.00 1.06 0.42
상기 결과는 항-hPD-1 또는 항-hPD-L1의 투여가 종양 성장에 영향을 미치지 않음을 나타냈다. 대조적으로, OBI-3424의 투여, OBI-3424와 항-hPD-1의 병용 치료, 또는 OBI-3424와 항-hPD-L1의 병용 치료는 HepG2 인간화 마우스 모델에서 종양 성장에 대한 효율적인 항종양 효과를 입증했다.
실시예 2. HepG2 종양 보유 인간화 마우스 모델에서 OBI-3424 + 항-PD-1(펨브롤리주맙)의 효능 평가
본 연구의 목적은 HepG2 인간화 마우스 모델에서 항-PD-1 항체(펨브롤리주맙)의 존재 하에 종양 성장에 대한 다양한 투여량의 시험물질 OBI-3424의 효능 및 병용 치료(OBI-3424/항-PD-1)의 항종양 효과에 미치는 CD8+ T 세포 고갈의 효과를 평가하기 위한 것이다.
재료 물질
1. OBI-3424-DP
로트 번호: FLC-INJ-1711-01
시험물질 수: 2 바이알/바이알당 1mL
성분: DNA 알킬화제
농도: 10mg/mL
물리적 외관: 투명한 액체
보관 조건: -20℃
2. 항-인간 PD-1, 펨브롤리주맙, Merck 0026# Co., Inc.
로트 번호: 7006846900
시험물질 수: 1 바이알/바이알당 100mg
성분: 항체
농도: 25mg/mL
물리적 외관: 투명한 액체
보관 조건: 2-8℃
3. 등장성 염화나트륨 용액(Taiwan Biotech Co., LTD)
로트 번호: 1OP2A092
농도: 0.9% 염화나트륨
물리적 외관: 투명한 액체
용해도: 제공되지 않음
보관 조건: 실온
4. 마트리겔(코닝, 카탈로그 번호: 354248, 로트 번호: 0261002)
5. 인간 PBMC(로트: PBMC102219D, Zenbio, USA)
6. 콜라게나제(Sigma Aldrich, C5138), DNase I(Sigma Aldrich, D5025), 히알루로니다제(Sigma Aldrich, H6254)
7. RBC 적혈구 용해 완충액(Biolegend, 420302)
8. 세포 염색 완충액(Biolegend, 420201)
9. 인간 TruStain FcX™(Fc 수용체 차단 용액)(Biolegend, 422302)
10. 항체: 항-인간 CD45 항체(Biolegend, 368508), 항-인간 CD8 항체(Biolegend, 344710), 항-인간 CD4 항체(Biolegend, 317429), 항-인간 CD56 항체(Biolegend, 318332) , 항-인간 CD11c 항체(Biolegend, 301614), 항-인간 CD25 항체(Biolegend, 302610), 항-인간 CD69 항체(Biolegend, 310914), 항-인간 CD86 항체(Biolegend, 305406), 항-인간 CD91 항체( Invitrogen, 46-0919-42), 항-인간 Foxp3 항체(Biolegend, 320108), 항-인간 IFN-γ 항체(Biolegend, 506507), 항-인간 그랜자임 B 항체(Biolegend, 372204), 항-인간 칼레티쿨린(Calreticulin) 항체 (Abeam, ab209577), 항-인간 PD-1 항체(Biolegend, 329907), 항-인간 PD-L1 항체(Biolegend, 329738) 및 ViaKrome 405(Biolegend, 302610)
마우스
1. 종: 생쥐(Mus musculus)
계통: 진행성 면역결핍 마우스.
(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg)
출처: 트리네오 바이오테크놀로지(주)
성별: 암컷
연구 시작 시 연령: 6-8주
연구 시작 시 체중 범위: 17-30g
2. 번호 부여 및 식별: 각 마우스에 귀 태그로 번호를 매겼다. 하우징 케이지는 연구 번호, 케이지 번호, 동물 수, 성별, 투여량 수준 등을 포함하는 정보가 포함된 케이지 카드로 식별되었다.
동물 그룹화: 마우스를 9개 그룹으로 나누었다: G1(비히클), G2(OBI-3424 0.3mg/kg), G3(OBI-3424 1mg/kg), G4(항-hPD-1), G5(OBI-3424 0.3mg/kg＋항-hPD-1), G6(OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1) 및 G7(OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1, CD8+ PBMC 제외). 각 그룹에는 6마리의 쥐가 포함되어 있다. 인간 간세포 암종 세포주인 HepG2를 진행성 면역 결핍 마우스에 피하 접종하였다. 본 연구에는 총 42마리의 마우스가 포함되었다.
3. 동물선정 이유: TFDA에서 발표한 약물 제안의 비임상 안전성 연구 중 항암제의 비임상시험 가이드라인에 따르면, 동물 이종이식 종양모델을 활용하여 신약 또는 항암제 신약의 효능을 평가할 수 있다. 일반적으로 사용되는 마우스 계통은 BALB/c, C57BL/6을 포함하나, 원하는 약물의 항종양 효과를 평가하기 위해 BALB/c 누드, Nu/Nu 및 NOD/SCID 마우스가 일반적으로 선택된다. 상기 계통들은 잘 알려진 유전적 배경 및 품종 배경을 바탕으로 전세계적으로 관리되며, 이는 인체 내에서의 적절한 반응의 기능적 중요성에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있다.
4. 순응 기간: 마우스를 무작위화하기 전에 적어도 3일 동안 순응시켰다. 순응 기간 동안 임상 관찰 및 체중 측정을 수행하였다. 이 기간 동안 동물들은 질병의 징후나 행동 변화를 보이지 않았다.
5. 동물 사육 조건: 마우스를 온도 22±3℃, 상대습도 50±20% 및 12/12시간 명/암 주기로 통제된 환경에서 멸균 침구(10054, Andersons, USA)가 있는 개별 환기식 케이지(IVC)에 사육하였다. 전체 연구 기간 동안 사료(LabDiet 5010, PMI, USA)와 물(멸균 RO수)을 자유롭게 제공하였다.
6. 무작위화: 모든 동물의 체중을 측정하고, 연구 전에 건강한 상태를 관찰하였다. 실험에는 비정상적인 임상 징후가 없는 동물이 선택되었다. 건강한 동물은 그룹 간 체중의 유의한 차이 없이 서로 다른 그룹으로 무작위 배정되었다. 동물의 체중 변화는 평균 체중의 ±20%를 초과해서는 안된다. 절차는 실험실 동물 관행의 표준을 따랐다.
7. IACUC 승인번호 : IACUC-2020-SH-024
장비
세포 배양 인큐베이터(Shel Lab/3552)
생물안전 캐비닛(BAKER/SG604)
전자저울(PRECISA/XS 225A-SCS)
피펫(Thermo/Finnpipette Ft)
격리된 양압/음압 검증 케이지 하우징 시스템(Allentown/NEXGEN)
분석 저울(PRECIS A/XS3250C-SCS)
동물 안락사 장비(Forward Biotech Supply)
유세포 분석기(Beckman Coulter/Navios EX)
버니어(미쓰도요/CD-6”ASX)
방법
실험 설계
샘플링: 실험 설계, 실험 그룹, 주사 투여량 및 부피, 투여 경로 및 동물 수는 표 8에 나열되어 있다.
표 8. 투여 요법 및 샘플링

그룹
시험물질의
투여경로
주사 투여량
(mg/kg)
주사 부피
(mg/kg)		 동물
번호

G1: 비히클
IV
N/A
5
6

G2: OBI-3424
IV
0.3
5
6

G3: OBI-3424
IV
1
5
6

G4: 항-hPD-1
IP
20
10
6

G5: OBI-3424＋PD-1
IV 및 IP
0.3＋20
5＋10
6

G6: OBI-3424＋PD-1
IV 및 IP
1＋20
5＋10
6

G7: OBI-3424＋PD-1
(CD8+ PBMC 제외)
IV 및 IP
1＋20
5＋10
6

정맥내 주사(IV): 주사 부피는 5 mL/kg
복강내 주사 (IP): 주사 부피는 10 mL/kg
2. 이종이식 마우스 모델의 확립
2.1. 동물 제모: 인간 간암종 세포주인 HepG2를 주입하기 전에, 오른쪽 옆구리 털만 클리핑으로 제거하였다.
2.2. 종양 세포의 피하 접종: 1×107 HepG2 세포들을 0.25×107 hPBMC(세포 수 비율 4:1)와 미리 혼합한 후 마트리겔(부피비 1:1)(Corning, Cat. No.: 354248, Lot No.: 8228001)과 혼합하였다. 피하 주사 부피는 200 μL/마우스였다.
종양 세포 주입일을 잠복기(L0)의 첫날로 표시하였다.
3. 시험물질의 경로 및 투여:
3.1. 시험항목 OBI-3424 또는 참조물질을 0일차에 마우스에 정맥내 주사하였다. 주사는 인슐린 주사기를 사용하여 0.3 mg/kg 또는 1 mg/kg의 투여량 및 주사 부피 5 mL/kg으로 수행하였다. 시험물질인 OBI-3424는 G2, G3, G5, G6 및 G7에 대해 7일, 14일, 21일 및 28일에 지속적으로 투여되었다. 참조물질은 Gl에 대해 투여되었다. 절차는 샘플 투여 표준을 따랐다. 시험물질 투여 시작일을 첫 번째 실험일(DO)로 표시하였다.
3.2. 시험물질인 항-hPD-1 항체를 2일차에 마우스에 복강내 주사하였다. 주사는 인슐린 주사기를 사용하여 20mg/kg의 투여량 및 10mL/kg의 주사 부피로 수행하였다. 시험물질인 항-hPD-1 항체는 G4, G5, G6 및 G7에 대해 5, 9, 12, 16, 19, 23 및 26일에 지속적으로 투여되었다. 절차는 샘플 투여 표준을 따랐다.
3.3. 시험물질 또는 참조물질 준비:
투여 전에 시험물질을 참조물질로 희석하였다. 시험물질인 OBI-3424의 용액 농도는 0.06 mg/mL 및 0.2 mg/mL이었고, 시험물질 항-hPD-1은 2 mg/mL이었다.
4. 체중 측정:
측정은 접종 다음날부터 실시하였다. 동물 체중을 매주 2회 측정하고 기록하였다.
5. 종양 직경 측정:
접종 다음날부터 측정을 수행하였다. 종양 부피는 일주일에 두 번(월요일, 목요일) 측정하고 기록하였다. 종양 부피는 기록에 따라 타원체 방정식((장축×단축×단축)×(π/6))으로 계산되었다.
6. 종양 성장 억제율 계산:
종양 부피를 사용하여 다음 공식에 따라 종양 성장 억제(TGI) 비율을 계산하였다: TGI(%) = [1-(Ti-T0)/(Ci-CO)] × 100, 여기서 Ti 및 Ci는 실험 종료 시(30일)에 처리 그룹 및 비히클 그룹의 평균 종양 부피를 나타낸다. 반면, TO 및 CO는 실험 시작 시(0일)의 치료 그룹 및 비히클 그룹의 평균 종양 부피를 나타낸다.
7. 혈액 샘플링:
종료 시에, 턱밑 혈액 샘플을 수집하였다. 희생 시에, 심장 천자를 사용하여 혈액 샘플을 수집할 수 있다. 수집된 혈액 샘플을 4±2℃, 1500xg에서 15분간 원심분리하여 혈청과 펠릿을 분리하였다. 상부 혈청을 수집하여 -70℃ 이하의 온도에서 보관하였다. 절차는 동물 혈액 샘플링 표준을 따랐다.
8. 연구 종료점 결정:
연구는 30일에 종료되었다.
9. 종양 절제:
연구 기간이 끝날 때 마우스를 CO2 안락사로 희생시키고, 종양 주위의 결합 조직을 절제하였다. 그런 다음, 종양 샘플의 무게를 측정하고, 종양 무게가 400mg을 초과하는 경우 3개의 섹션으로 동일하게 절단하였다. 종양 조직은 종양 침윤 림프구(TIL)의 분리를 위해 준비되었다. 한 섹션의 나머지 부분은 10% 포름알데히드에 고정하고 파라핀에 묻었고; 다른 하나는 -70℃ 이하의 온도에서 보관되었다.
10. 종양 침윤 림프구(TIL)의 분리:
종양 샘플을 메스를 사용하여 더 작은 조각으로 절개한 후 콜라게나제, DNase I 및 히알루로니다제(Collagenase #C5138, DNase I #D5025, 히알루로니다제 6254, SigmaAldrich)의 혼합물로 최소 2시간 동안 소화하였다. 이어서, 종양 소화물을 주사기 플런저를 사용하여 70㎛ 메쉬 세포 여과기(Falcon #352350)에 통과시키고, PBS로 세척하였다. 세포들을 RBC 적혈구 용해 완충액(Biolegend #420302)으로 처리하여, 유세포 분석용 단일 세포 현탁액을 제조하였다.
11. TIL 집단의 유세포 분석:
세포를 염색 완충액(Biolegend #420201)으로 세척하고, Fc 수용체 차단 용액(Biolegend #422302)을 함유하는 염색 완충액에 재현탁시키고, 4℃에서 15분 동안 배양하였다. 세포들을 형광 접합된 표면 항체들로 염색하고, 4℃에서 30분 동안 배양한 다음 유세포 분석을 위해 염색 완충액에 재현탁하였다. Navios EX 유세포 분석기(Beckman Coulter)를 사용하여 유세포 분석을 수행하였다. 데이터는 Kaluza Analysis 소프트웨어(Beckman Coulter)를 사용하여 분석되었다.
12. 통계 분석:
결과는 평균 및 평균의 표준 오차(Mean±SEM)로 표시되었다. 각 처리군에 대해 수집된 모든 데이터와 동시 음성 대조군 데이터의 비교는 스튜던트 t-테스트(Microsoft Excel, 2007)를 사용하여 계산되었다. P≤0.05는 유의미한 것으로 간주된다.
결과
그룹 체중의 요약이 표 9에 제시되어 있다. 연구 시작 시 또는 희생 시의 그룹 G1-G7 사이의 평균 체중에서 통계학적으로 유의미한 차이는 관찰되지 않았다(도 4 및 표 9).
표 9. 체중 요약
그룹 동물 번호 체중(g)
L0 L1 L3 L7 D2 D6 D9 D13 D16 D20 D23 D27 D30



G1:
비히클		 MI031 22.05 21.73 22.89 22.36 23.62 25.05 24.09 24.58 24.59 24.56 24.44 24.68 22.93
MI033 20.51 19.87 20.11 19.94 19.10 20.14 20.06 22.19 21.81 22.02 21.24 21.69 20.11
MI054 23.71 23.62 23.44 22.98 23.28 24.10 23.93 24.23 24.65 23.87 23.06 22.54 21.47
MI058 24.10 24.35 24.34 24.45 24.28 24.34 24.03 24.98 25.02 25.30 25.31 25.50 24.29
MI070 20.37 19.72 20.50 20.71 20.18 23.10 20.59 23.14 23.13 23.53 21.78 20.73 20.37
MI079 19.28 20.19 21.02 21.52 21.78 22.78 22.54 23.33 24.20 24.51 23.71 24.04 22.57
Mean 21.67 21.58 22.05 21.99 22.04 23.25 22.54 23.74 23.90 23.97 23.26 23.20 21.96
SEM 0.79 0.82 0.71 0.66 0.84 0.71 0.74 0.42 0.49 0.46 0.64 0.75 0.66
G2:
OBI-3424
(0.3mg/kg)		 MI036 20.66 20.85 21.84 21.82 21.10 21.72 20.84 21.95 21.66 22.00 21.53 21.32 20.17
MI042 21.24 21.28 21.89 23.06 22.12 23.84 23.67 23.82 23.93 24.14 23.32 23.24 22.36
MI048 23.04 22.53 23.06 23.01 22.75 23.46 22.94 23.20 23.72 23.44 23.35 23.18 21.65
MI061 22.63 23.02 23.57 23.62 23.28 24.10 24.14 23.96 24.02 24.21 23.91 23.92 22.81
MI090 25.00 25.12 24.12 23.73 23.23 23.68 23.38 23.82 24.56 23.98 23.98 23.80 22.44
MI093 23.36 23.18 23.45 23.44 23.55 24.82 24.58 24.87 24.17 23.75 23.72 23.94 22.94
Mean 22.66 22.66 22.99 23.11 22.67 23.60 23.26 23.60 23.68 23.59 23.30 23.23 22.06
SEM 0.64 0.62 0.38 0.28 0.38 0.42 0.54 0.40 0.42 0.34 0.37 0.41 0.42
G3:
OBI-3424
(1mg/kg)		 MI038 21.11 20.59 20.70 22.50 21.69 21.91 22.01 22.55 22.68 22.87 23.02 22.66 22.31
MI039 21.33 21.16 22.24 22.44 22.40 23.15 23.65 24.14 23.51 23.39 24.10 24.41 23.72
MI056 23.07 22.18 22.28 22.31 22.55 23.56 22.70 23.60 23.20 24.21 23.75 23.42 23.08
MI060 24.07 23.34 24.21 24.22 23.34 24.29 24.85 25.97 25.06 25.53 25.37 24.68 23.90
MI077 19.46 20.56 20.80 21.42 20.20 21.84 21.52 22.22 22.25 21.98 22.89 22.84 22.02
MI089 22.68 23.40 24.01 25.55 24.22 24.90 23.72 24.68 23.35 24.69 25.12 24.66 23.87
Mean 21.95 21.87 22.37 23.07 22.40 23.28 23.08 23.86 23.34 23.78 24.04 23.78 23.15
SEM 0.67 0.53 0.62 0.62 0.56 0.51 0.50 0.57 0.39 0.53 0.42 0.38 0.34
G4:
PD-1
(20mg/kg)		 MI030 21.15 22.22 22.28 22.27 22.72 23.42 23.27 23.91 24.02 23.53 24.14 23.57 22.68
MI035 21.19 20.61 21.38 21.44 21.11 21.38 21.52 21.90 21.33 22.00 21.15 19.29 18.42
MI045 21.82 21.84 22.87 23.16 22.69 23.51 23.58 23.56 24.01 24.34 23.47 23.24 22.49
MI047 21.03 20.64 21.14 22.30 21.97 22.44 21.24 21.85 21.00 20.52 19.43 19.43 18.28
MI053 22.27 22.00 22.64 22.76 22.88 23.38 23.19 23.60 23.33 24.43 24.46 24.74 24.00
MI087 23.11 22.72 23.21 24.04 23.93 24.02 23.71 24.09 23.04 22.69 21.87 19.83 19.38
Mean 21.76 21.67 22.25 22.66 22.55 23.03 22.75 23.15 22.79 22.92 22.42 21.68 20.88
SEM 0.33 0.35 0.34 0.36 0.39 0.39 0.44 0.41 0.54 0.61 0.80 0.99 1.01
G5:
OBI-3424＋ PD-1
(0.3mg/kg
＋20mg/kg)		 MI029 20.81 21.05 21.58 21.21 21.99 22.57 22.26 22.94 23.38 23.34 22.84 22.12 21.45
MI032 20.96 21.45 22.27 22.62 23.34 23.63 23.65 23.46 24.27 24.53 24.34 24.51 23.89
MI049 23.40 22.90 23.13 23.49 23.00 24.07 24.30 24.48 24.34 24.57 24.17 25.20 25.43
MI062 22.36 21.91 22.25 23.49 23.07 23.28 23.39 23.33 23.16 23.38 23.24 23.21 22.79
MI064 21.01 20.89 21.73 21.74 21.87 22.91 23.70 23.88 24.66 23.54 24.37 23.81 22.50
MI076 18.35 18.83 19.93 20.92 20.68 21.15 20.75 21.24 21.70 21.41 21.08 21.23 20.31
Mean 21.15 21.17 21.82 22.25 22.33 22.94 23.01 23.22 23.59 23.46 23.34 23.35 22.73
SEM 0.70 0.55 0.44 0.46 0.41 0.42 0.53 0.45 0.45 0.47 0.52 0.61 0.73
G6:
OBI-3424＋ PD-1
(1mg/kg
＋20mg/kg)		 MI034 20.15 19.74 20.75 21.61 21.05 21.96 21.26 21.82 23.03 22.78 21.12 21.90 21.32
MI041 21.74 21.58 23.24 23.66 23.68 24.37 24.27 24.74 24.45 25.08 24.09 25.08 24.33
MI046 20.48 19.99 21.39 22.05 21.59 22.18 21.14 22.18 22.59 22.68 22.49 23.38 22.13
MI059 21.61 21.78 22.69 22.56 22.69 22.46 22.64 23.04 23.84 23.62 23.58 23.76 23.73
MI088 22.82 22.81 21.54 22.64 22.44 23.25 23.03 23.26 22.89 23.39 23.74 24.35 23.76
MI095 23.26 22.67 22.61 23.43 23.01 24.34 23.94 22.66 22.80 22.97 23.04 23.23 22.41
Mean 21.68 21.43 22.04 22.66 22.41 23.09 22.71 22.95 23.27 23.42 23.01 23.62 22.95
SEM 0.50 0.53 0.39 0.32 0.39 0.44 0.54 0.42 0.29 0.36 0.44 0.44 0.48
G7:
OBI-3424＋ PD-1
(1mg/kg
＋20mg/kg)
(CD8+PBMC 제외)		 MI066 23.91 23.62 24.10 24.30 24.26 25.08 24.84 25.43 24.90 25.28 25.31 25.50 24.54
MI067 21.49 21.56 22.25 22.47 22.97 23.44 23.23 24.16 24.11 24.43 24.52 25.14 23.89
MI068 20.43 19.82 20.13 20.79 20.59 21.24 21.40 21.21 21.20 22.13 22.40 22.23 22.02
MI069 21.89 21.28 22.28 23.53 22.75 23.31 22.84 23.04 22.84 23.65 23.51 23.80 23.61
MI078 19.10 18.53 19.45 19.76 19.41 20.48 20.25 20.27 20.13 20.12 19.83 20.15 19.32
MI091 25.33 25.36 24.88 24.91 23.78 23.98 23.71 24.11 24.00 24.24 23.75 25.17 23.88
Mean 22.03 21.70 22.18 22.63 22.29 22.92 22.71 23.04 22.86 23.31 23.22 23.67 22.88
SEM 0.93 1.01 0.87 0.83 0.77 0.71 0.67 0.80 0.76 0.77 0.79 0.86 0.79
종양 반응을 다양한 시험물질들에서 검사하였고, 평균 종양 반응은 종양 세포 주입 후 L1, 3 및 7에 기록되었고, 시험물질 투여 후 O, 2, 6, 9, 13, 16, 20, 23, 27, 30일에 기록되었다(도 6 및 표 10).
우선, G1(비히클), G2(OBI-3424 0.3mg/kg), G3(OBI-3424 1mg/kg), G4(항-hPD-1, 20mg/kg)에서 종양 반응에 대한 시험물질들의 효과를 조사하였다. 평균 종양 부피의 투여량-관련 감소는 D30에 OBI-3424의 존재 하에 관찰되었다(G1 비히클: 882.92±158.14mm3, G2 OBI-3424 0.3mg/kg: 716.44±31.12mm3, G3 OBI-3424 1mg/kg: 216.90±22.20mm3, p=0.00096＜0.001). D30에 항-hPD-1의 치료에서는 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다(G1 비히클: 882.92±158.14mm3, G4 항-hPD-1: 983.84±266.44 mm3).
G5(OBI-3424 0.3mg/kg＋항-hPD-1 20mg/kg), G6(OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1 20mg/kg) 및 G7(OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1 20mg/kg, CD8+ PBMC 제외)의 병용 치료의 결과는 이들 그룹 모두에서 D30에 평균 종양 부피가 비히클 그룹에 비해 유의하게 감소되었음을 보여주었다(G1 비히클: 882.92±158.14mm3, G5 OBI-3424 0.3mg/kg＋항-hPD-1: 429.41±106.14mm3, p=0.0193＜0.05, G6 OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1: 197.74±19.62mm3, p=0.00078＜0.001, G7 OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1, CD8+ PBMC 제외: 374.44±36.97mm3, p=0.0053＜0.05).
단일 치료와 비교하여, 병용 치료는 D30에 G2와 G5 사이, 그리고 G3과 G6 사이에서 평균 종양 부피의 억제 효과를 향상시키는 경향이 있었지만, 이러한 감소는 유의미하지 않았다(G2 OBI-3424 0.3mg/kg: 716.44±31.12mm3, G5 OBI-3424 0.3mg/kg＋항-hPD-1: 429.41±106.14mm3; G3 OBI-3424 1mg/kg: 216.90±22.20mm3, G6 OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1: 197.74±19.62mm3). 또한, 치료 효과를 정량화하기 위해 종양 성장 억제(TGI) 비율을 계산하였다. 저투여량 및 고투여량 OBI-3424를 사용한 단일 치료의 결과는 각각 27.82% 및 113.27%의 TGI였다. 저투여량 및 고투여량 OBI-3424와 항-hPD-1의 병용 치료는 각각 77.22% 및 117.66% TGI를 나타냈다(도 6 및 표 10).
그럼에도 불구하고, G6(OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1)과 G7(OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1, CD8+ PBMC 제외)을 비교하면, CD8+ 세포의 고갈은 D30에 평균 종양 부피의 유의미한 증가를 초래하였고(G6 OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1: 197.74±19.62 mm3, G7 OBI-3424 1mg/kg＋항-hPD-1, CD8+ PBMC 제외: 374.44±36.97mm3, p=0.00088＜ 0.001), TGI 백분율은 동일한 투여량의 병용 요법에도 불구하고 117.66%에서 87.35%로 감소되었다(도 6 및 표 10). 유사한 경향이 종양 중량에서도 관찰되었다(도 5 및 표 10)
표 10. 종양 부피 및 중량 요약
그룹 동물 번호
종양 부피(mm3)		 종양
중량
(mg)		 TGI (%)
L1 L3 L7 D0 D2 D6 D9 D13 D16 D20 D23 D27 D30 D30
G1:
MI031 537.1 527.4 303.8 314.2 317.2 328.7 417.9 528.2 724.3 804.6 830.3 868.4 1015. 615.80 N/A
MI033 398.9 395.5 278.0 285.4 286.1 287.5 320.9 335.6 424.2 529.0 543.8 563.1 673.3 486.20
MI054 352.0 347.2 276.2 277.9 279.7 281.1 390.3 520.1 569.8 641.1 817.8 841.5 867.3 805.90
MI058 485.4 463.9 368.9 373.9 375.1 378.1 403.4 418.1 421.6 422.0 422.4 422.4 423.7 91.20
MI070 251.6 251.4 215.7 217.0 222.1 292.5 317.2 407.6 632.0 789.9 916.4 1085. 1562. 942.50
MI079 354.0 297.0 302.9 311.8 312.9 316.9 338.8 353.9 442.6 500.7 535.2 659.7 755.3 544.80
Mean 396.5 380.4 290.9 296.7 298.9 314.1 364.8 427.3 535.7 614.6 677.7 740.1 882.9 581.07
SEM 41.81 42.23 20.35 21.07 20.63 14.80 18.10 33.20 51.68 64.53 82.33 97.39 158.1 120.09
G2:
OBI-3424
(0.3
mg/kg)		 MI036 501.6 474.1 278.0 280.0 283.9 289.0 375.6 569.5 714.1 808.4 889.2 926.9 1012. 445.50 27.82
MI042 529.3 501.4 273.7 279.4 281.1 293.9 367.0 452.6 528.0 658.4 661.3 527.6 468.2 223.90
MI048 346.7 337.6 216.4 226.0 230.6 241.0 395.2 528.9 714.4 854.0 890.1 909.1 882.8 327.90
MI061 442.3 401.2 336.7 353.6 354.0 356.0 367.9 388.3 405.8 419.5 297.5 205.1 181.5 63.40
MI090 597.1 491.4 313.3 317.7 321.0 330.5 388.9 590.7 749.1 751.9 842.6 848.5 850.4 449.00
MI093 493.5 461.1 301.9 303.0 334.4 336.3 437.7 524.2 591.5 721.3 884.2 886.5 903.5 317.00
Mean 485.1 444.5 286.7 293.3 300.8 307.8 388.7 509.0 617.1 702.3 744.1 717.3 716.4 304.45
SEM 34.55 25.76 16.95 17.53 18.24 16.99 10.83 30.95 54.63 62.98 96.27 119.0 131.1 59.47
G3:
OBI-3424
(1mg/kg)		 MI038 448.8 395.2 273.6 290.8 295.5 297.0 337.5 341.3 359.9 345.0 260.7 246.4 185.2 62.40 113.27
MI039 449.7 447.9 315.2 318.0 322.4 328.4 468.5 492.3 556.8 552.1 544.3 426.0 295.5 101.90
MI056 394.4 373.2 278.1 286.8 292.9 304.4 334.0 362.5 465.2 465.2 419.2 295.9 215.0 105.20
MI060 244.8 244.1 219.0 233.0 238.8 240.6 301.7 342.7 343.3 343.7 343.7 327.7 197.1 90.30
MI077 508.7 446.7 300.7 306.6 310.3 312.8 337.3 352.9 354.8 355.2 355.2 252.6 145.5 69.80
MI089 410.4 379.8 332.7 332.7 334.6 338.1 416.4 422.6 429.4 425.6 360.3 341.1 262.8 76.80
Mean 409.5 381.2 286.5 294.7 299.1 303.6 365.9 385.7 418.2 414.4 380.6 315.0 216.9 84.40
SEM 36.68 30.45 16.27 14.16 13.69 14.02 25.72 24.60 33.95 34.15 38.76 27.16 22.20 7.14
G4:
PD-1
(20
mg/kg)		 MI030 585.9 550.0 299.8 300.3 303.5 305.3 433.1 485.3 516.7 522.8 525.5 446.8 342.6 166.60 - 15.29
MI035 508.2 411.4 273.3 277.4 280.5 284.0 469.1 934.7 982.0 1192. 1346. 1629. 1673. 1230.8
MI045 554.1 364.6 280.8 283.7 285.9 288.1 339.5 382.0 382.6 391.8 416.4 600.5 674.1 453.90
MI047 400.6 393.3 332.0 345.0 346.9 348.5 552.4 762.2 772.3 1032. 1076. 1076. 1093. 676.50
MI053 326.5 323.9 242.4 324.7 328.3 331.6 382.0 366.3 356.9 333.6 317.7 310.1 310.1 108.20
MI087 506.8 431.1 316.9 316.7 318.5 321.9 389.3 671.7 690.8 1015. 1089. 1730. 1808. 1541.7
Mean 480.4 412.4 290.9 308.0 310.6 313.2 427.6 600.4 616.9 748.1 795.2 965.6 983.8 696.28
SEM 40.04 31.49 13.18 10.51 10.43 10.33 30.89 92.87 99.24 152.6 174.4 249.6 266.4 237.06
G5:
OBI-3424＋PD-1
(0.3 mg/kg
＋20 mg/kg)		 MI029 575.5 511.0 269.1 276.3 279.9 283.4 365.0 432.8 490.6 523.4 561.4 565.7 567.2 284.00 77.22
MI032 410.1 393.6 317.4 323.5 325.6 326.8 367.2 397.3 424.8 432.7 432.7 348.6 203.6 77.30
MI049 527.7 452.6 331.3 338.1 345.1 348.9 424.6 433.2 437.4 441.7 442.5 314.1 237.6 87.30
MI062 392.7 318.9 242.9 248.4 252.5 254.4 283.4 386.4 390.9 426.4 430.7 399.8 305.0 149.00
MI064 364.1 346.6 286.4 295.5 298.7 301.9 373.1 469.4 475.2 555.2 573.0 427.5 372.4 173.40
MI076 464.4 397.7 298.1 293.1 296.3 297.4 399.6 500.9 539.8 640.5 690.6 799.1 890.3 609.80
Mean 455.8 403.4 290.9 295.8 299.7 302.1 368.8 436.7 459.8 503.3 521.8 475.8 429.4 230.13
SEM 33.69 28.57 13.15 13.15 13.37 13.48 19.49 17.60 21.65 34.93 42.90 73.72 106.1 81.77
G6:
OBI-3424＋PD-1
(1mg/kg
+20 mg/kg)		 MI034 403.6 365.0 245.5 271.9 277.1 280.2 322.4 410.6 417.8 395.8 357.2 317.5 267.7 76.20 1 17.66
MI041 431.2 427.1 293.8 298.0 301.8 303.3 346.5 368.4 373.1 359.4 306.5 197.8 185.5 59.30
MI046 484.8 472.0 326.2 328.4 330.0 241.5 254.9 260.8 377.3 389.9 403.1 331.0 238.4 73.60
MI059 315.5 314.3 268.4 274.3 276.5 279.3 319.6 335.2 335.8 330.2 303.5 193.0 162.1 69.20
MI088 440.6 413.0 288.4 297.3 302.9 305.1 344.2 362.6 371.1 370.8 297.0 278.3 138.0 45.20
MI095 586.6 568.9 331.0 337.3 342.7 345.8 365.3 465.9 471.9 333.2 314.2 241.2 194.5 66.20
Mean 443.7 426.7 292.2 301.2 305.2 292.5 325.5 367.3 391.2 363.2 330.3 259.8 197.7 64.95
SEM 36.66 36.01 13.45 11.03 11.03 14.19 15.70 28.28 19.33 11.32 17.00 24.07 19.62 4.63
G7:
OBI-3424＋PD-1
(1mg/kg
＋20 mg/kg)
(CD8+ PBMC
제외)		 MI066 373.0 371.9 295.3 298.1 304.0 307.0 422.4 466.3 472.2 473.1 475.1 475.6 356.3 85.30 87.35
MI067 350.1 347.3 247.0 262.5 268.3 274.2 369.0 377.4 386.5 387.4 387.4 333.1 268.0 93.60
MI068 338.4 336.6 323.7 354.0 356.0 358.0 412.1 428.2 437.2 445.7 468.4 471.5 390.8 124.20
MI069 364.3 356.6 249.3 256.3 262.9 264.5 301.9 359.9 360.6 382.0 386.1 379.4 325.8 50.60
MI078 387.0 382.9 293.1 304.8 309.2 311.4 363.6 457.0 458.0 524.0 534.9 535.4 537.7 255.60
MI091 343.3 342.5 324.5 325.6 328.8 330.7 380.8 447.2 451.4 488.5 497.6 501.2 367.8 133.40
Mean 359.4 356.3 288.8 300.2 304.8 307.6 374.9 422.7 427.6 450.1 458.3 449.4 374.4 118.78
SEM 7.66 7.33 13.99 15.18 14.50 14.22 17.49 17.99 18.03 23.12 24.52 31.45 36.97 24.53
종양 침윤 림프구(TIL)를 신선한 종양 조직으로부터 분리하고, 그룹들 중에서 표면 마커 CD45, CD4, CD8, CD56, CDllc, CD69, CD25, CD86, CD91, 그랜자임 B, IFN-γ, Foxp3, 칼레티쿨린(Calreticulin), PD-1 및 PD-L1의 발현 수준을 유세포 분석기로 측정하였다. 개별 마우스에 대한 수치 데이터를 표 11-표 16에 나타내었다. 세포독성 림프구(CTL) 세포들(CD45+CD8+ T 세포들) 및 T 보조(TH) 세포들(CD45+CD4+ T 세포들)의 집단은, 비히클 그룹과 비교하여, 고투여량 OBI-3424 단독 치료 또는 이것과 항-hPD-1의 병용 치료에서 유의하게 더 높았다(CTL 세포들: G1 비히클: 15.53±5.66%, G3 OBI-3424 1mg/kg: 33.50±3.38%, p=0.0107＜0.05, G6 OBI-3424 lmg/kg＋항-hPD-1: 38.46±2.63%, p= 0.00215＜0.05; TH 세포들: G1 비히클: 14.59±2.00%, G3 OBI-3424 1mg/kg: 25.05±2.08%, p=0.0023＜0.05, G6 OBI-3424 lmg/kg＋항-hPD-1: 30.62±2.07%, p=0.00012＜0.001)(표 13-표 14).
표 11. TIL 내의 칼레티쿨린 세포의 백분율 요약
그룹 동물
번호		 세포
농도		 총
세포		 생존
력		 총 CD45- 세포
(CD45-)		 CD45-
라이브 세포
(CD45-
ViaKrome405weak)		 칼레티쿨린
세포
(CD45-
칼레티쿨린＋)
×
(106/
mL) 		×
106 		% 총% CD45+
게이트
%		 세포수
(x105)		 총% CTL
게이트
%		 세포수
(x105)		 총% CTL
게이트
%		 세포수
(x105)
G1: 비히클 MI031 2.33 23.30 52.58 34.52 51.85 80.43 15.84 45.89 36.91 0.67 4.24 1.56
MI033 2.60 25.95 62.24 34.54 45.88 89.63 13.47 39.00 34.95 0.87 6.44 2.26
MI054 2.56 25.60 64.65 30.47 41.12 78.00 15.06 49.43 38.55 0.91 6.06 2.33
MI058 0.73 7.30 67.53 18.76 21.62 13.69 8.71 46.41 6.36 0.45 5.19 0.33
MI070 2.43 24.30 74.90 40.29 48.60 97.90 19.59 48.62 47.60 1.11 5.68 2.70
MI079 4.42 44.20 72.29 28.66 36.41 126.68 16.05 56.01 70.94 1.50 9.32 6.63
Mean 2.51 25.11 65.70 31.21 40.91 81.06 14.79 47.56 39.22 0.92 6.16 2.63
SEM 0.48 4.78 3.25 2.98 4.46 15.26 1.47 2.26 8.53 0.15 0.71 0.87




G2:
OBI-3424
(0.3mg/kg)		 MI036 1.95 19.45 64.78 36.29 50.59 70.58 20.24 55.78 39.37 2.85 14.09 5.54
MI042 2.05 20.45 62.35 22.44 29.66 45.89 12.36 55.07 25.28 0.62 5.02 1.27
MI048 5.40 54.00 80.46 24.15 28.87 130.41 15.52 64.29 83.81 1.90 12.21 10.26
MI061 0.21 2.14 72.34 10.20 12.41 2.18 6.30 61.79 1.35 0.28 4.51 0.06
MI090 2.47 24.65 80.93 26.47 31.01 65.25 12.13 45.83 29.90 0.45 3.69 1.11
MI093 0.73 7.25 71.03 14.28 21.40 10.35 8.10 56.69 5.87 0.26 3.21 0.19
Mean 2.14 21.32 71.98 22.31 28.99 54.11 12.44 56.58 30.93 1.06 7.12 3.07
SEM 0.74 7.41 3.15 3.77 5.18 19.06 2.06 2.61 12.12 0.44 1.94 1.66
G3:
OBI-3424
(1mg/kg)		 MI038 0.29 2.90 68.97 8.45 9.67 2.45 5.94 70.28 1.72 0.17 2.90 0.05
MI039 1.26 12.62 80.03 12.06 13.99 15.22 7.66 63.52 9.67 0.20 2.61 0.25
MI056 0.71 7.06 65.44 16.62 19.95 11.73 11.16 67.13 7.88 1.25 11.18 0.88
MI060 0.99 9.88 73.48 11.79 13.15 11.65 9.18 77.84 9.07 0.25 2.75 0.25
MI077 0.74 7.44 64.52 11.27 12.84 8.38 7.02 62.30 5.22 0.26 3.65 0.19
MI089 0.81 8.10 84.69 11.04 12.22 8.94 8.30 75.12 6.72 0.15 1.83 0.12
Mean 0.80 8.00 72.86 11.87 13.64 9.73 8.21 69.37 6.71 0.38 4.15 0.29
SEM 0.13 1.32 3.32 1.09 1.40 1.76 0.74 2.55 1.19 0.17 1.43 0.12
G4: PD-1
(20mg/kg)		 MI030 3.86 38.55 66.41 30.12 39.67 116.11 18.34 60.90 70.70 0.55 2.99 2.12
MI035 10.32 103.20 64.44 16.86 35.97 174.00 7.84 46.50 80.91 0.29 3.72 2.99
MI045 2.67 26.65 63.41 44.65 67.00 118.99 27.23 60.98 72.57 0.42 1.53 1.12
MI047 24.70 247.00 73.48 17.29 27.78 427.06 11.87 68.63 293.19 0.34 2.83 8.40
MI053 2.84 28.35 72.84 17.20 20.43 48.76 8.94 51.99 25.34 0.17 1.88 0.48
MI087 7.96 79.60 44.22 13.96 28.78 111.12 4.37 31.30 34.79 0.30 6.78 2.39
Mean 8.73 87.23 64.13 23.35 36.61 166.01 13.10 53.38 96.25 0.35 3.29 2.92
SEM 3.43 34.33 4.34 4.85 6.67 54.67 3.41 5.43 40.43 0.05 0.77 1.16
G5:
OBI-3424
＋PD-1
(0.3mg/kg
＋20mg/kg)		 MI029 6.00 60.00 65.75 18.72 22.49 112.32 12.14 64.85 72.84 0.56 4.58 3.36
MI032 0.69 6.86 61.81 11.22 12.86 7.70 8.70 77.57 5.97 0.27 3.13 0.19
MI049 0.94 9.44 59.96 10.46 11.76 9.87 7.77 74.33 7.33 0.58 7.51 0.55
MI062 2.40 24.00 47.08 42.80 50.53 102.72 8.18 19.12 19.63 0.24 2.93 0.58
MI064 2.52 25.20 62.22 24.16 28.02 60.88 10.99 45.49 27.69 0.80 7.31 2.02
MI076 3.17 31.65 47.71 35.75 52.15 113.15 18.92 52.91 59.88 0.99 5.22 3.13
Mean 2.62 26.19 57.42 23.85 29.64 67.77 11.12 55.71 32.23 0.57 5.11 1.64
SEM 0.78 7.82 3.26 5.37 7.30 20.23 1.71 8.87 11.41 0.12 0.81 0.57
G6:
OBI-3424
＋PD-1
(1mg/kg ＋20
mg/kg)		 MI034 0.70 7.00 58.57 11.25 13.01 7.88 7.08 62.92 4.96 0.36 5.14 0.25
MI041 0.75 7.54 48.01 12.45 14.26 9.39 9.13 73.31 6.88 0.23 2.50 0.17
MI046 0.95 9.50 54.32 10.29 12.12 9.78 6.32 61.43 6.00 0.26 4.05 0.25
MI059 0.54 5.36 48.88 10.13 11.15 5.43 7.00 69.15 3.75 0.25 3.54 0.13
MI088 0.28 2.84 44.23 8.02 8.81 2.28 5.55 69.11 1.58 0.43 7.71 0.12
MI095 0.74 7.38 59.08 18.72 20.88 13.82 15.58 83.21 11.50 0.17 1.08 0.13
Mean 0.66 6.60 52.18 11.81 13.37 8.09 8.44 69.86 5.78 0.28 4.00 0.18
SEM 0.09 0.93 2.48 1.51 1.68 1.61 1.51 3.22 1.37 0.04 0.93 0.02
G7:
OBI-3424
＋PD-1
(1mg/kg ＋20mg/kg)
(CD8+PBMC
제외)		 MI066 1.40 14.02 51.93 24.34 27.12 34.12 19.92 81.85 27.93 1.13 5.68 1.58
MI067 1.22 12.16 59.05 8.22 9.18 10.00 6.57 79.95 7.99 0.06 0.85 0.07
MI068 2.64 26.40 60.15 6.81 7.56 17.98 5.17 75.97 13.65 0.20 3.94 0.53
MI069 0.47 4.72 38.31 6.71 7.57 3.17 4.82 71.75 2.28 0.15 3.16 0.07
MI078 2.54 25.40 71.65 16.11 18.71 40.92 11.09 68.84 28.17 0.87 7.86 2.21
MI091 1.20 11.96 75.92 17.00 19.44 20.33 14.21 83.62 17.00 0.26 1.83 0.31
Mean 1.58 15.78 59.50 13.20 14.93 21.09 10.30 77.00 16.17 0.45 3.89 0.80
SEM 0.35 3.46 5.55 2.91 3.29 5.82 2.44 2.39 4.28 0.18 1.05 0.36
CD45- 게이트% = 게이트 CD45- 세포들
라이브(live) 게이트% = 게이트 CD45 ViaKrome405weak 세포들
세포수(×l05)= 총 세포 × 총% × 10
표 12. TIL 내의 PD-L1+ 세포의 백분율 요약
그룹 동물
번호		 세포
농도		 총
세포		 생존력 총 세포 총 PD-L1+ 세포
(PD-L1+)		 PD-L1+ 세포
(CD45- PD-L1+)
×
(106/mL) 		×
106 		% 총% 게이트
%		 세포수
(x105)		 총% 총
세포
게이트%		 세포수
(x105)		 총% CD45-
게이트
%		 세포수
(x105)
G1:
비히클		 MI031 2.33 23.30 52.58 48.90 48.90 113.94 3.28 6.70 7.64 1.97 7.65 4.59
MI033 2.60 25.95 62.24 67.54 67.54 175.27 3.61 5.35 9.37 1.88 6.67 4.88
MI054 2.56 25.60 64.65 62.60 62.60 160.26 4.06 6.49 10.39 1.96 8.58 5.02
MI058 0.73 7.30 67.53 88.24 88.24 64.42 2.07 2.35 1.51 0.56 3.81 0.41
MI070 2.43 24.30 74.90 78.33 78.33 190.34 3.32 4.24 8.07 1.75 5.20 4.25
MI079 4.42 44.20 72.29 74.74 74.74 330.35 1.67 2.23 7.38 0.58 2.34 2.56
Mean 2.51 25.11 65.70 70.06 70.06 172.43 3.00 4.56 7.39 1.45 5.71 3.62
SEM 0.48 4.78 3.25 5.57 5.57 36.74 0.38 0.80 1.27 0.28 0.97 0.74
G2:
OBI-3424
(0.3
mg/kg)		 MI036 1.95 19.45 64.78 62.65 62.65 121.85 7.42 11.84 14.43 4.84 15.51 9.41
MI042 2.05 20.45 62.35 74.17 74.17 151.68 2.94 3.97 6.01 1.01 5.86 2.07
MI048 5.40 54.00 80.46 82.83 82.83 447.28 4.56 5.50 24.62 1.98 9.64 10.69
MI061 0.21 2.14 72.34 93.16 93.16 19.94 1.34 1.44 0.29 0.35 4.13 0.07
MI090 2.47 24.65 80.93 83.93 83.93 206.89 4.33 5.16 10.67 2.69 12.53 6.63
MI093 0.73 7.25 71.03 68.08 68.08 49.36 2.15 3.16 1.56 0.84 7.23 0.61
Mean 2.14 21.32 71.98 77.47 77.47 166.17 3.79 5.18 9.60 1.95 9.15 4.91
SEM 0.74 7.41 3.15 4.60 4.60 62.69 0.88 1.46 3.72 0.67 1.75 1.89
G3:
OBI-3424
(1mg/kg)		 MI038 0.29 2.90 68.97 94.96 94.96 27.54 1.58 1.66 0.46 0.27 4.18 0.08
MI039 1.26 12.62 80.03 94.48 94.48 119.23 1.19 1.26 1.50 0.24 2.31 0.30
MI056 0.71 7.06 65.44 86.71 86.71 61.22 2.88 3.32 2.03 0.58 3.76 0.41
MI060 0.99 9.88 73.48 95.07 95.07 93.93 1.71 1.80 1.69 0.52 4.37 0.51
MI077 0.74 7.44 64.52 93.62 93.62 69.65 2.24 2.39 1.67 0.66 7.16 0.49
MI089 0.81 8.10 84.69 94.29 94.29 76.37 2.86 3.03 2.32 0.58 4.63 0.47
Mean 0.80 8.00 72.86 93.19 93.19 74.66 2.08 2.24 1.61 0.48 4.40 0.38
SEM 0.13 1.32 3.32 1.31 1.31 12.63 0.29 0.33 0.26 0.07 0.65 0.07
G4: PD-1
(20 mg/kg)		 MI030 3.86 38.55 66.41 79.18 79.18 305.24 2.73 3.45 10.52 1.07 3.76 4.12
MI035 10.32 103.20 64.44 37.54 37.54 387.41 2.44 6.49 25.18 1.20 8.16 12.38
MI045 2.67 26.65 63.41 62.56 62.56 166.72 2.54 4.07 6.77 1.47 3.98 3.92
MI047 24.70 247.00 73.48 60.73 60.73 1500.03 3.53 5.82 87.19 1.46 10.27 36.06
MI053 2.84 28.35 72.84 89.83 89.83 254.67 2.21 2.46 6.27 1.10 7.27 3.12
MI087 7.96 79.60 44.22 17.89 17.89 142.40 1.74 9.73 13.85 0.89 13.27 7.08
Mean 8.73 87.23 64.13 57.96 57.96 459.41 2.53 5.34 24.96 1.20 7.79 11.12
SEM 3.43 34.33 4.34 10.83 10.83 211.34 0.24 1.07 12.76 0.09 1.50 5.18
G5:
OBI-3424+ PD-1
(0.3 mg/kg
＋20 mg/kg)		 MI029 6.00 60.00 65.75 85.20 85.20 511.20 2.36 2.77 14.16 0.92 5.55 5.52
MI032 0.69 6.86 61.81 93.50 93.50 64.14 2.09 2.24 1.43 0.70 6.28 0.48
MI049 0.94 9.44 59.96 93.21 93.21 87.99 2.02 2.17 1.91 0.63 6.68 0.59
MI062 2.40 24.00 47.08 58.90 58.90 141.36 4.94 8.38 11.86 1.20 10.78 2.88
MI064 2.52 25.20 62.22 81.27 81.27 204.80 2.74 3.37 6.90 0.86 5.35 2.17
MI076 3.17 31.65 47.71 61.30 61.30 194.01 3.62 5.90 11.46 1.93 6.89 6.11
Mean 2.62 26.19 57.42 78.90 78.90 200.58 2.96 4.14 7.95 1.04 6.92 2.96
SEM 0.78 7.82 3.26 6.25 6.25 66.17 0.46 1.02 2.21 0.20 0.81 0.98
G6:
OBI-3424+ PD-1
(1mg/kg ＋20
mg/kg)		 MI034 0.70 7.00 58.57 91.38 91.38 63.97 2.62 2.87 1.83 0.71 7.78 0.50
MI041 0.75 7.54 48.01 93.44 93.44 70.45 1.96 2.09 1.48 0.33 2.81 0.25
MI046 0.95 9.50 54.32 94.93 94.93 90.18 1.88 1.98 1.79 0.50 7.52 0.48
MI059 0.54 5.36 48.88 94.81 94.81 50.82 2.83 2.99 1.52 0.81 7.96 0.43
MI088 0.28 2.84 44.23 95.18 95.18 27.03 2.02 2.12 0.57 0.56 10.01 0.16
MI095 0.74 7.38 59.08 95.84 95.84 70.73 1.35 1.41 1.00 0.42 2.43 0.31
Mean 0.66 6.60 52.18 94.26 94.26 62.20 2.11 2.24 1.36 0.56 6.42 0.35
SEM 0.09 0.93 2.48 0.66 0.66 8.74 0.22 0.24 0.20 0.07 1.26 0.06
G7:
OBI-3424+ PD-1
(1mg/kg +20
mg/kg)
(CD8+
PBMC
제외)		 MI066 1.40 14.02 51.93 93.45 93.45 131.02 3.06 3.27 4.29 0.81 3.39 1.14
MI067 1.22 12.16 59.05 95.47 95.47 116.09 1.10 1.15 1.34 0.13 1.56 0.16
MI068 2.64 26.40 60.15 95.72 95.72 252.70 1.79 1.87 4.73 0.40 5.38 1.06
MI069 0.47 4.72 38.31 95.30 95.30 44.98 1.41 1.48 0.67 0.28 4.39 0.13
MI078 2.54 25.40 71.65 91.26 91.26 231.80 2.42 2.65 6.15 0.77 5.35 1.96
MI091 1.20 11.96 75.92 93.52 93.52 111.85 1.17 1.25 1.40 0.10 0.61 0.12
Mean 1.58 15.78 59.50 94.12 94.12 148.07 1.83 1.95 3.09 0.42 3.45 0.76
SEM 0.35 3.46 5.55 0.70 0.70 32.25 0.32 0.35 0.92 0.13 0.81 0.31
CD45- 게이트% = 게이트 CD45- 세포들
세포수(×105) = 총 세포 × 총% × 10
표 13. TIL 내의 CTL 세포의 백분율 요약
그룹 동물
번호		 CTL 세포
(CD45+CD8+)		 PD-1+ CTL 세포
(CD45+CD8+ PD-1+) 		CD69+ CTL 세포
(CD45+
CD8+CD69+)		 CD25+ CTL 세포
(CD45+ CD8+CD25+)		 그랜자임 B+ CTL 세포
(CD45+ CD8+
GrB+)		 IFN-+ CTL 세포
(CD45+ CD8+ IFN-+)
총% CD45+
게이트
%		 세포
수
(x105)		 총% CTL 게이트
%		 세포수
(x105)		 총% CTL
게이트
%		 세포
수
(x105)		 총% CTL 게이트
%		 세포
수
(x105)		 총% CTL 게이
트
%		 세포
수
(x105)		 총% CTL 게이
트
%		 세포
수
(x105)
G1:
비히클		 MI031 5.09 33.26 11.86 4.99 97.96 11.63 3.94 60.23 9.18 1.33 20.28 3.10 6.11 91.66 14.24 0.13 1.98 0.30
MI033 12.58 43.90 32.65 11.28 89.64 29.27 7.98 59.50 20.71 0.73 5.43 1.89 12.87 99.84 33.40 0.28 2.17 0.73
MI054 11.35 39.92 29.06 10.31 90.87 26.39 8.02 64.46 20.53 0.66 5.31 1.69 13.11 98.26 33.56 0.30 2.28 0.77
MI058 42.94 75.72 31.35 26.06 60.69 19.02 29.48 78.49 21.52 0.98 2.60 0.72 34.50 88.28 25.19 0.24 0.62 0.18
MI070 6.94 21.57 16.86 6.12 88.19 14.87 2.35 41.51 5.71 0.30 5.30 0.73 6.01 94.83 14.60 0.14 2.27 0.34
MI079 14.27 40.45 63.07 11.14 78.05 49.24 7.84 53.18 34.65 0.51 3.45 2.25 16.20 99.14 71.60 0.06 0.37 0.27
Mean 15.53 42.47 30.81 11.65 84.23 25.07 9.94 59.56 18.72 0.75 7.06 1.73 14.80 95.34 32.10 0.19 1.62 0.43
SEM 5.66 7.39 7.31 3.08 5.38 5.55 4.03 5.00 4.20 0.15 2.69 0.37 4.28 1.89 8.64 0.04 0.36 0.10
G2:
OBI-3424
(0.3
mg/kg)		 MI036 8.21 43.92 15.97 7.87 95.86 15.31 5.21 62.46 10.13 0.98 11.79 1.91 5.97 66.16 11.61 0.18 2.04 0.35
MI042 26.79 72.25 54.79 18.38 68.60 37.59 23.86 73.01 48.79 1.90 5.81 3.89 33.78 97.44 69.08 0.23 0.66 0.47
MI048 31.80 73.64 171.72 23.04 72.47 124.42 22.84 61.79 123.34 1.43 3.87 7.72 36.33 95.50 196.18 0.20 0.54 1.08
MI061 45.54 66.97 9.75 22.62 49.67 4.84 35.19 85.14 7.53 1.62 3.93 0.35 30.78 85.88 6.59 0.13 0.36 0.03
MI090 26.88 60.34 66.26 25.86 96.18 63.74 17.92 68.69 44.17 1.27 4.86 3.13 28.03 99.84 69.09 0.31 1.10 0.76
MI093 17.47 46.12 12.67 12.75 73.00 9.24 16.34 67.19 11.85 0.80 3.31 0.58 22.98 99.74 16.66 0.15 0.64 0.11
Mean 26.12 60.54 55.19 18.42 75.96 42.52 20.23 69.71 40.97 1.33 5.60 2.93 26.31 90.76 61.54 0.20 0.89 0.47
SEM 5.18 5.27 25.24 2.82 7.24 18.66 4.04 3.52 18.05 0.17 1.29 1.11 4.49 5.35 29.31 0.03 0.25 0.16
G3:
OBI-3424
(1mg/kg)		 MI038 43.72 66.02 12.68 25.64 58.64 7.44 35.67 80.80 10.34 1.49 3.38 0.43 40.55 90.46 11.76 0.39 0.87 0.11
MI039 31.93 53.39 40.30 20.11 62.98 25.38 25.23 70.50 31.84 1.02 2.85 1.29 31.10 99.18 39.25 0.20 0.63 0.25
MI056 30.92 62.97 21.83 25.04 80.96 17.68 25.96 83.69 18.33 1.26 4.07 0.89 28.95 89.16 20.44 0.28 0.85 0.20
MI060 22.88 38.03 22.61 19.75 86.30 19.51 12.76 59.32 12.61 1.57 7.29 1.55 21.85 96.01 21.59 0.14 0.63 0.1
MI077 43.04 65.33 32.02 31.41 72.97 23.37 32.38 76.33 24.09 2.57 6.05 1.91 42.67 95.94 31.75 0.09 0.20 0.07
MI089 28.52 49.11 23.10 26.74 93.75 21.66 18.14 60.89 14.69 2.34 7.84 1.90 17.29 58.25 14.00 0.18 0.61 0.15
Mean 33.50 55.81 25.42 24.78 75.93 19.17 25.02 71.92 18.65 1.71 5.25 1.33 30.40 88.17 23.13 0.21 0.63 0.15
SEM 3.38 4.52 3.89 1.79 5.56 2.60 3.49 4.16 3.29 0.23 0.80 0.24 3.78 5.72 4.31 0.04 0.09 0.03
G4: PD-1
(20
mg/kg)		 MI030 20.34 62.25 78.41 6.46 31.77 24.90 14.94 75.13 57.59 2.23 11.21 8.60 17.56 98.76 67.69 0.07 0.38 0.27
MI035 8.15 58.12 84.11 5.62 68.92 58.00 9.40 52.94 97.01 1.12 6.33 11.56 16.76 96.54 172.96 0.10 0.55 1.03
MI045 7.63 43.67 20.33 6.86 89.83 18.28 5.25 68.03 13.99 1.00 13.01 2.67 7.08 87.71 18.87 0.08 0.99 0.21
MI047 10.44 35.54 257.87 8.64 82.69 213.41 5.14 24.85 126.96 2.05 9.91 50.64 17.18 93.27 424.35 0.16 0.85 3.95
MI053 37.52 64.31 106.37 8.16 21.75 23.13 31.34 74.74 88.85 1.66 3.96 4.71 42.68 98.96 121.00 0.11 0.25 0.31
MI087 3.74 50.11 29.77 2.90 77.62 23.08 6.08 54.03 48.40 0.93 8.28 7.40 7.23 64.06 57.55 0.18 1.60 1.43
Mean 14.64 52.33 96.14 6.44 62.10 60.13 12.03 58.29 72.13 1.50 8.78 14.26 18.08 89.88 143.74 0.12 0.77 1.20
SEM 5.11 4.61 35.06 0.84 11.59 31.22 4.15 7.78 16.39 0.23 1.35 7.38 5.31 5.44 60.25 0.02 0.20 0.59




G5:
OBI-3424
＋PD-1
(0.3
mg/kg
＋20
mg/kg)		 MI029 16.57 34.68 99.42 10.62 64.12 63.72 8.26 50.84 49.56 0.88 5.42 5.28 13.91 96.69 83.46 0.05 0.36 0.30
MI032 39.77 63.46 27.28 15.81 39.76 10.85 29.46 73.79 20.21 1.32 3.32 0.91 32.47 99.23 22.27 0.06 0.18 0.04
MI049 41.68 62.07 39.35 12.52 30.05 11.82 29.44 75.60 27.79 3.58 9.20 3.38 33.30 89.55 31.44 0.08 0.23 0.08
MI062 18.13 50.51 43.51 7.14 39.41 17.14 11.02 69.86 26.45 1.98 12.55 4.75 16.71 99.78 40.10 0.10 0.60 0.24
MI064 16.60 36.40 41.83 7.24 43.61 18.24 9.53 55.76 24.02 1.48 8.68 3.73 15.12 99.92 38.10 0.05 0.32 0.13
MI076 10.51 51.48 33.26 7.30 69.47 23.10 7.28 60.72 23.04 0.98 8.20 3.10 9.90 90.63 31.33 0.08 0.73 0.25
Mean 23.88 49.77 47.44 10.11 47.74 24.14 15.83 64.43 28.51 1.70 7.90 3.52 20.24 95.97 41.12 0.07 0.40 0.17
SEM 5.44 5.00 10.68 1.46 6.33 8.12 4.34 4.15 4.35 0.41 1.31 0.62 4.11 1.92 8.85 0.01 0.09 0.04
G6:
OBI-3424
＋PD-1
(1mg/kg ＋20
mg/kg)		 MI034 38.17 61.22 26.72 13.21 34.60 9.25 24.82 71.33 17.37 1.94 5.56 1.36 33.88 96.68 23.72 0.13 0.38 0.09
MI041 36.57 60.58 27.57 13.06 35.70 9.85 28.01 76.61 21.12 2.87 7.85 2.16 27.28 91.46 20.57 0.15 0.51 0.11
MI046 47.52 71.66 45.14 5.80 12.20 5.51 38.01 79.06 36.11 2.05 4.26 1.95 48.90 99.20 46.46 0.11 0.23 0.10
MI059 44.53 65.11 23.87 21.69 48.72 11.63 31.83 72.07 17.06 2.77 6.28 1.48 35.22 82.90 18.88 0.11 0.25 0.06
MI088 32.19 44.50 9.14 14.83 46.07 4.21 21.54 74.67 6.12 2.88 10.00 0.82 15.89 52.69 4.51 0.09 0.29 0.03
MI095 31.76 53.09 23.44 16.37 51.54 12.08 14.80 46.63 10.92 1.98 6.25 1.46 29.71 94.29 21.93 0.08 0.27 0.06
Mean 38.46 59.36 25.98 14.16 38.14 8.75 26.50 70.06 18.12 2.42 6.70 1.54 31.81 86.20 22.68 0.11 0.32 0.08
SEM 2.63 3.87 4.71 2.11 5.90 1.32 3.30 4.83 4.20 0.19 0.81 0.19 4.42 7.08 5.53 0.01 0.04 0.01
G7:
OBI-3424
＋PD-1
(1mg/kg ＋20
mg/kg)
(CD8+
PBMC
제외)		 MI066 7.49 16.15 10.50 6.13 81.85 8.59 2.88 42.02 4.04 0.89 13.00 1.25 4.77 75.68 6.69 0.10 1.59 0.14
MI067 11.27 17.67 13.70 6.64 58.94 8.07 7.44 64.95 9.05 0.84 7.30 1.02 10.92 98.66 13.28 0.17 1.52 0.21
MI068 3.79 5.74 10.01 3.22 85.02 8.50 1.32 44.96 3.48 0.38 12.94 1.00 1.68 71.87 4.44 0.12 5.32 0.32
MI069 13.88 20.93 6.55 11.49 82.82 5.42 4.65 36.73 2.19 0.74 5.88 0.35 2.17 17.23 1.02 0.12 0.92 0.06
MI078 3.20 5.84 8.13 2.49 77.88 6.32 0.87 34.72 2.21 0.45 17.92 1.14 1.59 91.47 4.04 0.15 8.76 0.38
MI091 7.51 14.95 8.98 4.62 61.50 5.53 3.56 51.33 4.26 0.50 7.16 0.60 5.97 98.87 7.14 0.06 0.99 0.07
Mean 7.86 13.55 9.65 5.77 74.67 7.07 3.45 45.79 4.21 0.63 10.70 0.89 4.52 75.63 6.10 0.12 3.18 0.20
SEM 1.70 2.59 0.99 1.32 4.68 0.61 0.98 4.54 1.03 0.09 1.91 0.14 1.48 12.58 1.69 0.02 1.30 0.05
CD45- 게이트 % = 게이트 CD45' 세포들
CTL 게이트% = 게이트 CD45+CD8+ 세포들
세포수(×105) = 총 세포 × 총% × 10
표 14. TIL 내의 TH 세포의 백분율 요약
그룹 동물
번호		 TH 세포
(CD45+CD4+)		 PD-1+ TH 세포
(CD45+CD4+ PD-1+) 		CD69+ TH 세포
(CD45+CD4+CD69+)		 CD25+ TH 세포
(CD45+CD4+CD25+)		 Foxp3+ Treg 세포
(CD45+CD4+CD25+
Foxp3+)
총% CD45+
게이트
%		 세포
수
(x105)		 총
%		 TH
게이트
%		 세포수
(x105)		 총% TH
게이트
%		 세포
수
(x105)		 총% TH
게이트
%		 세포수
(x105)		 총% TH
게이트
%		 세포
수
(x105)
G1:
비히클		 MI031 9.47 61.88 22.07 9.32 98.44 21.72 8.27 59.31 19.27 3.46 24.81 8.06 0.05 1.50 0.12
MI033 11.45 39.95 29.71 11.40 99.51 29.58 6.84 46.34 17.75 1.41 9.53 3.66 0.10 7.10 0.26
MI054 15.68 55.17 40.14 15.58 99.34 39.88 9.07 48.48 23.22 1.88 10.07 4.81 0.13 6.79 0.3
MI058 13.00 22.91 9.49 12.26 94.31 8.95 7.88 64.02 5.75 1.42 11.50 1.04 0.08 5.37 0.06
MI070 23.53 73.10 57.18 23.16 98.45 56.28 11.02 54.44 26.78 1.32 6.54 3.21 0.07 5.14 0.17
MI079 14.43 40.91 63.78 14.23 98.61 62.90 5.57 35.29 24.62 1.22 7.71 5.39 0.04 3.62 0.18
Mean 14.59 48.99 37.06 14.33 98.11 36.55 8.11 51.31 19.56 1.79 11.69 4.36 0.08 4.92 0.19
SEM 2.00 7.33 8.50 1.98 0.78 8.42 0.76 4.18 3.08 0.35 2.72 0.96 0.01 0.85 0.04
G2:
OBI-3424
(0.3 mg/kg)		 MI036 11.03 59.01 21.45 10.86 98.48 21.12 7.64 63.07 14.86 2.23 18.38 4.34 0.11 5.03 0.21
MI042 9.70 26.17 19.84 7.88 81.16 16.11 6.79 71.55 13.89 1.66 17.49 3.39 0.13 7.95 0.27
MI048 7.52 17.42 40.61 7.14 94.89 38.56 5.20 57.32 28.08 1.65 18.21 8.91 0.08 5.08 0.43
MI061 22.11 32.52 4.73 20.09 90.86 4.30 15.65 75.09 3.35 2.12 10.15 0.45 0.13 6.05 0.03
MI090 13.12 29.44 32.34 13.06 99.60 32.19 6.87 49.45 16.93 4.23 30.45 10.43 0.16 3.69 0.39
MI093 13.82 36.50 10.02 13.65 98.76 9.90 8.60 44.32 6.24 2.84 14.61 2.06 0.11 3.81 0.08
Mean 12.88 33.51 21.50 12.11 93.96 20.36 8.46 60.13 13.89 2.46 18.22 4.93 0.12 5.27 0.24
SEM 2.07 5.74 5.47 1.92 2.88 5.35 1.51 4.95 3.56 0.40 2.76 1.60 0.01 0.65 0.07
G3:
OBI-3424
(1mg/kg)		 MI038 25.00 37.76 7.25 24.22 96.86 7.02 16.35 61.50 4.74 1.46 5.51 0.42 0.07 4.64 0.02
MI039 24.72 41.33 31.20 23.33 94.38 29.44 15.22 60.62 19.21 2.88 11.47 3.63 0.06 2.22 0.08
MI056 17.44 35.50 12.31 16.66 95.57 11.76 13.01 67.91 9.19 2.69 14.05 1.90 0.10 3.57 0.07
MI060 24.40 40.55 24.11 24.05 98.57 23.76 11.04 45.46 10.91 5.06 20.81 5.00 0.12 2.45 0.12
MI077 25.26 38.34 18.79 24.52 97.07 18.24 16.92 68.87 12.59 4.55 18.53 3.39 0.06 1.41 0.04
MI089 33.47 57.62 27.11 33.34 99.62 27.01 20.76 63.43 16.82 3.26 9.97 2.64 0.13 3.92 0.11
Mean 25.05 41.85 20.13 24.35 97.01 19.54 15.55 61.30 12.24 3.32 13.39 2.83 0.09 3.04 0.07
SEM 2.08 3.27 3.72 2.17 0.78 3.61 1.37 3.45 2.14 0.50 2.13 0.64 0.01 0.46 0.01
G4: PD-1
(20 mg/kg)		 MI030 12.78 39.13 49.27 9.19 71.87 35.43 8.75 63.85 33.73 3.08 22.44 11.87 0.10 3.38 0.39
MI035 6.23 44.45 64.29 5.61 90.05 57.90 5.80 44.44 59.86 1.30 9.95 13.42 0.07 5.23 0.72
MI045 11.05 63.24 29.45 9.68 87.55 25.80 6.80 60.36 18.12 2.74 24.33 7.30 0.04 1.31 0.11
MI047 19.16 65.22 473.25 18.33 95.66 452.75 5.43 20.34 134.12 4.77 17.86 117.82 0.16 3.27 3.95
MI053 17.34 29.71 49.16 14.42 83.20 40.88 10.05 56.98 28.49 2.21 12.52 6.27 0.08 3.80 0.23
MI087 4.73 63.41 37.65 4.03 85.19 32.08 9.41 60.75 74.90 1.81 11.70 14.41 0.23 12.58 1.83
Mean 11.88 50.86 117.18 10.21 85.59 107.47 7.71 51.12 58.20 2.65 16.47 28.51 0.11 4.93 1.20
SEM 2.36 6.17 71.38 2.19 3.26 69.20 0.80 6.75 17.45 0.50 2.45 17.91 0.03 1.61 0.61

G5:
OBI-3424
＋PD-1
(0.3 mg/kg
＋20
mg/kg)		 MI029 26.12 54.68 156.72 23.73 90.86 142.38 9.50 37.70 57.00 1.93 7.67 11.58 0.06 3.31 0.36
MI032 24.04 38.35 16.49 19.71 81.99 13.52 15.02 65.21 10.30 2.29 9.94 1.57 0.08 3.32 0.05
MI049 24.72 36.82 23.34 19.89 80.46 18.78 15.43 67.23 14.57 4.06 17.69 3.83 0.11 2.76 0.10
MI062 16.62 46.31 39.89 11.64 70.04 27.94 7.18 59.46 17.23 3.31 27.44 7.94 0.08 2.29 0.19
MI064 21.51 47.16 54.21 19.37 90.05 48.81 8.30 39.40 20.92 2.68 12.74 6.75 0.04 1.34 0.10
MI076 12.90 63.18 40.83 9.65 74.81 30.54 12.65 73.71 40.04 3.52 20.51 11.14 0.10 2.84 0.32
Mean 20.99 47.75 55.24 17.33 81.37 46.99 11.35 57.12 26.68 2.97 16.00 7.14 0.08 2.64 0.19
SEM 2.12 4.07 21.03 2.23 3.36 19.71 1.44 6.16 7.38 0.33 3.00 1.62 0.01 0.30 0.05
G6:
OBI-3424＋PD-1
(1mg/kg ＋20
mg/kg)		 MI034 32.23 51.69 22.56 24.70 76.63 17.29 17.76 60.04 12.43 3.09 10.44 2.16 0.07 2.20 0.05
MI041 25.80 42.74 19.45 20.10 77.89 15.16 15.91 61.65 12.00 3.39 13.13 2.56 0.12 3.54 0.09
MI046 23.78 35.87 22.59 14.56 61.24 13.83 15.23 67.57 14.47 2.81 12.46 2.67 0.08 2.99 0.08
MI059 31.85 46.58 17.07 26.28 82.51 14.09 20.82 68.88 11.16 4.28 14.15 2.29 0.09 2.06 0.05
MI088 37.77 52.21 10.73 28.20 74.67 8.01 23.50 69.63 6.67 6.21 18.40 1.76 0.15 2.38 0.04
MI095 32.31 54.02 23.84 26.32 81.47 19.42 11.71 37.95 8.64 3.13 10.14 2.31 0.10 3.32 0.07
Mean 30.62 47.19 19.37 23.36 75.74 14.63 17.49 60.95 10.90 3.82 13.12 2.29 0.10 2.75 0.06
SEM 2.07 2.83 2.00 2.09 3.14 1.58 1.72 4.87 1.14 0.52 1.23 0.13 0.01 0.25 0.01
G7:
OBI-3424
＋PD-1
(1mg/kg ＋20
mg/kg)
(CD8+
PBMC
제외)		 MI066 32.30 69.63 45.28 27.95 86.55 39.19 16.28 49.59 22.82 4.90 14.94 6.87 0.08 1.63 0.11
MI067 50.70 79.45 61.65 39.02 76.97 47.45 32.52 61.40 39.54 3.32 6.26 4.04 0.12 3.62 0.1
MI068 56.19 85.06 148.34 45.95 81.78 121.31 19.64 40.53 51.85 3.83 7.91 10.11 0.14 3.55 0.37
MI069 57.47 86.67 27.13 45.08 78.43 21.28 23.64 43.70 11.16 2.62 4.84 1.24 0.11 4.13 0.05
MI078 38.81 70.85 98.58 25.46 65.62 64.67 10.75 26.95 27.31 4.36 10.94 11.07 0.11 2.47 0.28
MI091 34.79 69.23 41.61 25.26 72.62 30.21 21.56 52.60 25.79 2.99 7.29 3.58 0.07 2.41 0.08
Mean 45.04 76.82 70.43 34.79 77.00 54.02 20.73 45.80 29.74 3.67 8.70 6.15 0.11 2.97 0.17
SEM 4.54 3.25 18.51 3.97 2.97 14.77 2.99 4.80 5.77 0.35 1.50 1.59 0.01 0.39 0.05
CD45- 게이트% = 게이트 CD45' 세포들
TH 게이트% = 게이트 CD45+CD4+ 세포들
세포수(×105) = 총 세포 × 총% × 10
표 15. TIL 내의 NK 세포의 백분율 요약
그룹 동물
번호		 세포
농도		 총
세포		 생존력 NK 세포
(CD45+CD56+)		 PD-1+ NK 세포
(CD45+CD56+PD-1+)
×
(106/mL) 		×
106 		% 총% CD45+
게이트
%		 세포수
(x105)		 총% NK
게이트
%		 세포수
(x105)
G1: 비히클 MI031 2.33 23.30 52.58 0.57 3.74 1.33 0.50 88.11 1.17
MI033 2.60 25.95 62.24 3.32 11.57 8.62 1.64 49.46 4.26
MI054 2.56 25.60 64.65 1.92 6.74 4.92 1.04 54.49 2.66
MI058 0.73 7.30 67.53 4.38 7.72 3.20 1.57 35.80 1.15
MI070 2.43 24.30 74.90 1.33 4.13 3.23 0.77 57.83 1.87
MI079 4.42 44.20 72.29 2.66 7.53 11.76 1.08 40.51 4.77
Mean 2.51 25.11 65.70 2.36 6.91 5.51 1.10 54.37 2.65
SEM 0.48 4.78 3.25 0.56 1.16 1.60 0.18 7.55 0.64
G2:
OBI-3424
(0.3mg/kg)		 MI036 1.95 19.45 64.78 1.18 6.33 2.30 0.85 71.96 1.65
MI042 2.05 20.45 62.35 3.26 8.78 6.67 1.08 33.17 2.21
MI048 5.40 54.00 80.46 3.83 8.87 20.68 2.01 52.46 10.85
MI061 0.21 2.14 72.34 6.83 10.05 1.46 1.44 21.08 0.31
MI090 2.47 24.65 80.93 1.00 2.25 2.47 0.88 87.65 2.17
MI093 0.73 7.25 71.03 2.54 6.70 1.84 1.14 44.79 0.83
Mean 2.14 21.32 71.98 3.11 7.16 5.90 1.23 51.85 3.00
SEM 0.74 7.41 3.15 0.87 1.14 3.06 0.18 10.05 1.60
G3:
OBI-3424
(1mg/kg)		 MI038 0.29 2.90 68.97 2.64 3.99 0.77 0.91 34.34 0.26
MI039 1.26 12.62 80.03 3.38 5.65 4.27 1.30 38.34 1.64
MI056 0.71 7.06 65.44 2.95 6.00 2.08 1.44 48.85 1.02
MI060 0.99 9.88 73.48 2.44 4.05 2.41 1.79 73.40 1.77
MI077 0.74 7.44 64.52 2.63 3.99 1.96 1.40 53.12 1.04
MI089 0.81 8.10 84.69 2.46 4.24 1.99 2.18 88.62 1.77
Mean 0.80 8.00 72.86 2.75 4.65 2.25 1.50 56.11 1.25
SEM 0.13 1.32 3.32 0.14 0.35 0.46 0.16 7.94 0.24
G4: PD-1
(20mg/kg)		 MI030 3.86 38.55 66.41 5.98 18.31 23.05 0.53 8.83 2.04
MI035 10.32 103.20 64.44 0.66 4.68 6.81 0.40 60.98 4.13
MI045 2.67 26.65 63.41 0.82 4.67 2.19 0.26 32.35 0.69
MI047 24.70 247.00 73.48 1.41 4.81 34.83 0.97 68.84 23.96
MI053 2.84 28.35 72.84 3.60 6.18 10.21 0.70 19.53 1.98
MI087 7.96 79.60 44.22 0.57 7.62 4.54 0.20 34.51 1.59
Mean 8.73 87.23 64.13 2.17 7.71 13.60 0.51 37.51 5.73
SEM 3.43 34.33 4.34 0.89 2.17 5.20 0.12 9.51 3.67
G5:
OBI-3424
＋PD-1
(0.3mg/kg
＋20mg/kg)		 MI029 6.00 60.00 65.75 1.63 3.42 9.78 0.97 59.56 5.82
MI032 0.69 6.86 61.81 3.28 5.23 2.25 0.71 21.59 0.49
MI049 0.94 9.44 59.96 6.65 9.90 6.28 0.73 10.95 0.69
MI062 2.40 24.00 47.08 6.30 17.57 15.12 0.75 11.93 1.80
MI064 2.52 25.20 62.22 2.82 6.19 7.11 0.81 28.75 2.04
MI076 3.17 31.65 47.71 1.05 5.15 3.32 0.39 36.88 1.23
Mean 2.62 26.19 57.42 3.62 7.91 7.31 0.73 28.28 2.01
SEM 0.78 7.82 3.26 0.96 2.12 1.91 0.08 7.45 0.80
G6:
OBI-3424
＋PD-1
(1mg/kg＋
20mg/kg)		 MI034 0.70 7.00 58.57 5.74 9.20 4.02 0.63 10.95 0.44
MI041 0.75 7.54 48.01 2.06 3.41 1.55 0.48 23.54 0.36
MI046 0.95 9.50 54.32 4.30 6.49 4.09 0.30 7.06 0.29
MI059 0.54 5.36 48.88 3.70 5.40 1.98 1.11 30.09 0.59
MI088 0.28 2.84 44.23 3.52 4.86 1.00 0.86 24.57 0.24
MI095 0.74 7.38 59.08 2.35 3.93 1.73 0.43 18.37 0.32
Mean 0.66 6.60 52.18 3.61 5.55 2.40 0.64 19.10 0.37
SEM 0.09 0.93 2.48 0.55 0.85 0.54 0.12 3.57 0.05
G7:
OBI-3424＋
PD-1
(1mg/kg＋
20mg/kg)
(CD8+PBMC
제외)		 MI066 1.40 14.02 51.93 3.44 7.42 4.82 0.60 17.56 0.84
MI067 1.22 12.16 59.05 5.44 8.53 6.62 0.75 13.74 0.91
MI068 2.64 26.40 60.15 3.62 5.47 9.56 0.96 26.66 2.53
MI069 0.47 4.72 38.31 10.72 16.16 5.06 2.25 20.98 1.06
MI078 2.54 25.40 71.65 4.04 7.38 10.26 0.60 14.74 1.52
MI091 1.20 11.96 75.92 8.08 16.08 9.66 0.76 9.41 0.91
Mean 1.58 15.78 59.50 5.89 10.17 7.66 0.99 17.18 1.30
SEM 0.35 3.46 5.55 1.20 1.92 1.00 0.26 2.47 0.27
CD45+ 게이트% = 게이트 CD45+ 세포들
NK 게이트% = 게이트 CD45+CD56+ 세포들
세포수(×l05) = 총 세포 × 총% × 10
표 16. TIL 내의 수지상 세포의 백분율 요약
그룹 동물
번호		 세포
농도		 총
세포		 생존력 DC 세포
(CD45+CD11c+)		 CD86+ DC 세포
(CD45+CD11c+CD86+)		 CD91+ DC 세포
(CD45+CD11c+CD91+)
×
(106/
mL) 		×
106 		% 총% CD45+
게이트
%		 세포수(x105) 총% CTL
게이트
%		 세포수(x105) 총% CTL
게이트%		 세포수(x105)
G1:
비히클		 MI031 2.33 23.30 52.58 5.45 26.37 12.70 2.98 54.77 6.94 0.07 1.32 0.16
MI033 2.60 25.95 62.24 13.15 41.24 34.12 6.38 48.51 16.56 0.10 0.79 0.26
MI054 2.56 25.60 64.65 10.61 34.69 27.16 3.87 36.50 9.91 0.14 1.28 0.36
MI058 0.73 7.30 67.53 11.86 20.97 8.66 5.36 45.23 3.91 0.08 0.67 0.06
MI070 2.43 24.30 74.90 4.68 15.74 11.37 2.54 54.19 6.17 0.08 1.62 0.19
MI079 4.42 44.20 72.29 10.37 30.75 45.84 5.20 50.10 22.98 0.04 0.39 0.18
Mean 2.51 25.11 65.70 9.35 28.29 23.31 4.39 48.22 11.08 0.09 1.01 0.20
SEM 0.48 4.78 3.25 1.42 3.78 6.08 0.61 2.76 2.98 0.01 0.19 0.04
G2:
OBI-3424
(0.3mg/kg)		 MI036 1.95 19.45 64.78 5.46 32.90 10.62 3.27 59.93 6.36 0.09 1.61 0.18
MI042 2.05 20.45 62.35 11.42 30.81 23.35 7.01 61.40 14.34 0.08 0.70 0.16
MI048 5.40 54.00 80.46 19.59 44.83 105.79 5.11 26.07 27.59 0.10 0.51 0.54
MI061 0.21 2.14 72.34 12.80 19.60 2.74 5.82 45.47 1.25 0.08 0.63 0.02
MI090 2.47 24.65 80.93 10.32 24.30 25.44 6.34 61.42 15.63 0.09 0.85 0.22
MI093 0.73 7.25 71.03 12.66 36.70 9.18 6.50 51.39 4.71 0.06 0.44 0.04
Mean 2.14 21.32 71.98 12.04 31.52 29.52 5.68 50.95 11.65 0.08 0.79 0.19
SEM 0.74 7.41 3.15 1.87 3.65 15.66 0.55 5.62 3.92 0.01 0.17 0.08
G3:
OBI-3424
(1mg/kg)		 MI038 0.29 2.90 68.97 15.16 23.54 4.40 7.68 50.65 2.23 0.14 0.90 0.04
MI039 1.26 12.62 80.03 18.68 31.09 23.57 8.39 44.92 10.59 0.08 0.41 0.10
MI056 0.71 7.06 65.44 19.60 41.01 13.84 7.73 39.45 5.46 0.09 0.45 0.06
MI060 0.99 9.88 73.48 12.37 19.89 12.22 6.81 55.03 6.73 0.08 0.68 0.08
MI077 0.74 7.44 64.52 22.41 35.18 16.67 9.38 41.86 6.98 0.06 0.29 0.04
MI089 0.81 8.10 84.69 17.47 28.58 14.15 8.78 50.27 7.11 0.07 0.41 0.06
Mean 0.80 8.00 72.86 17.62 29.88 14.14 8.13 47.03 6.52 0.09 0.52 0.06
SEM 0.13 1.32 3.32 1.33 2.90 2.54 0.34 2.24 1.11 0.01 0.08 0.01
G4: PD-1
(20mg/kg)		 MI030 3.86 38.55 66.41 9.61 32.74 37.05 3.50 36.43 13.49 0.04 0.37 0.15
MI035 10.32 103.20 64.44 3.99 34.88 41.18 1.25 31.29 12.90 0.04 1.00 0.41
MI045 2.67 26.65 63.41 4.92 38.28 13.11 1.99 40.37 5.30 0.02 0.49 0.05
MI047 24.70 247.00 73.48 5.24 25.68 129.43 2.40 45.76 59.28 0.13 2.52 3.21
MI053 2.84 28.35 72.84 9.27 16.68 26.28 3.84 41.48 10.89 0.04 0.39 0.11
MI087 7.96 79.60 44.22 0.78 13.45 6.21 0.44 56.41 3.50 0.04 5.64 0.32
Mean 8.73 87.23 64.13 5.64 26.95 42.21 2.24 41.96 17.56 0.05 1.74 0.71
SEM 3.43 34.33 4.34 1.37 4.14 18.29 0.53 3.51 8.51 0.02 0.85 0.50
G5:
OBI-3424＋ PD-1
(0.3mg/kg
＋20mg/kg)		 MI029 6.00 60.00 65.75 10.77 23.07 64.62 6.36 59.06 38.16 0.04 0.33 0.24
MI032 0.69 6.86 61.81 10.83 16.62 7.43 6.15 56.79 4.22 0.04 0.41 0.03
MI049 0.94 9.44 59.96 11.79 18.07 11.13 5.30 44.96 5.00 0.03 0.24 0.03
MI062 2.40 24.00 47.08 9.62 30.34 23.09 4.71 48.94 11.30 0.11 1.16 0.26
MI064 2.52 25.20 62.22 15.61 32.00 39.34 7.50 48.07 18.90 0.08 0.54 0.20
MI076 3.17 31.65 47.71 5.96 34.00 18.86 3.20 53.62 10.13 0.08 1.34 0.25
Mean 2.62 26.19 57.42 10.76 25.68 27.41 5.54 51.91 14.62 0.06 0.67 0.17
SEM 0.78 7.82 3.26 1.28 3.04 8.72 0.61 2.23 5.18 0.01 0.19 0.05
G6:
OBI-3424+ PD-1
(1mg/kg
＋20
mg/kg)		 MI034 0.70 7.00 58.57 10.74 18.16 7.52 5.54 51.56 3.88 0.10 0.97 0.07
MI041 0.75 7.54 48.01 8.66 15.07 6.53 4.54 52.35 3.42 0.11 1.29 0.08
MI046 0.95 9.50 54.32 16.79 26.86 15.95 7.56 45.00 7.18 0.08 0.45 0.08
MI059 0.54 5.36 48.88 13.35 19.71 7.16 5.70 42.69 3.06 0.07 0.54 0.04
MI088 0.28 2.84 44.23 15.24 21.31 4.33 8.17 53.62 2.32 0.04 0.29 0.01
MI095 0.74 7.38 59.08 9.55 16.02 7.05 5.83 61.08 4.30 0.03 0.34 0.02
Mean 0.66 6.60 52.18 12.39 19.52 8.09 6.22 51.05 4.03 0.07 0.65 0.05
SEM 0.09 0.93 2.48 1.33 1.74 1.64 0.56 2.68 0.69 0.01 0.16 0.01
G7:
OBI-3424+ PD-1
(1mg/kg
＋20
mg/kg)
(CD8+PBMC
제외)		 MI066 1.40 14.02 51.93 12.46 26.87 17.47 7.73 62.04 10.84 0.09 0.74 0.13
MI067 1.22 12.16 59.05 15.61 24.15 18.98 10.54 67.54 12.82 0.08 0.49 0.10
MI068 2.64 26.40 60.15 10.93 16.58 28.86 8.14 74.42 21.49 0.10 0.91 0.26
MI069 0.47 4.72 38.31 13.43 19.06 6.34 10.18 75.82 4.80 0.09 0.66 0.04
MI078 2.54 25.40 71.65 10.68 19.89 27.13 6.91 64.72 17.55 0.10 0.97 0.25
MI091 1.20 11.96 75.92 18.70 36.18 22.37 13.58 72.58 16.24 0.08 0.43 0.10
Mean 1.58 15.78 59.50 13.64 23.79 20.19 9.51 69.52 13.96 0.09 0.70 0.15
SEM 0.35 3.46 5.55 1.25 2.90 3.31 1.00 2.28 2.38 0.00 0.09 0.04
CD45+ 게이트% = 게이트 CD45+ 세포들
DC 게이트% = 게이트 CD45+CDllc+ 세포들
세포수(×l05) = 총 세포 × 총% × 10
상기 결과들은 OBI-3424의 투여가 종양 성장을 상당히 더 큰 정도로 억제하고, 항종양 활성에 있어서 용량 의존적 경향을 보여줌을 나타냈다. 또한, 항-hPD-1 치료와 결합된 고투여량 OBI-3424는 HepG2 인간화 마우스 모델에서 종양 성장에 대해 가장 효율적인 항종양 효과를 나타냈다. 그러나, CD8+ 세포의 고갈로 인해 병용 치료의 항종양 효능이 크게 손상되었다.
본 발명의 구체예들에 대한 상기 설명은 본 발명을 제한하지 않는다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명에 따라 다양한 수정 및 변경을 할 수 있으며, 본 발명의 기술사상의 범위 내에서 어떠한 수정 및 변경이라도 본 발명의 첨부된 특허청구범위에 속한다.
본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 법이 허용하는 전체 범위까지 참고로서 본 명세서에 포함된다. 이러한 참고문헌에 대한 논의는 단지 해당 저자의 주장을 요약하기 위한 것이다. 어떠한 참고문헌(또는 참고문헌의 일부)도 관련 선행 기술인 것으로 인정되지 않는다. 출원인은 인용된 임의의 참고문헌의 정확성과 타당성에 대해 이의를 제기할 권리를 보유한다.
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Claims (20)

  1. 다음을 포함하는 약학적 조성물:
    (1) 하기 화학식 I로 표시되는 화합물인 1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트,

    화학식 I
    또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 동위원소 변이체 또는 용매화물; 및
    (2) 화학요법제 또는 생물학적 제제를 포함하는 적어도 하나의 치료제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화학식 I-1로 표시되는 (S)-1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트,

    화학식 I-1
    또는, 하기 화학식 I-2로 표시되는 (R)-1-(3-(3-N,N-디메틸아미노카르보닐)페녹실-4-니트로페닐)-1-에틸-N,N'-비스(에틸렌)포스포르아미데이트인 약학적 조성물:

    화학식 I-2.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 화학요법제는 모노메틸아우리스타틴 E(MMAE), 모노메틸아우리스타틴 F(MMAF), 메르탄신(DM1), 안트라사이클린, 피롤로벤조디아제핀, α-아마니틴, 튜불리신, 벤조디아제핀, 에를로티닙, 보르테조밉, 풀베스트란트, 수니티닙, 레트로졸, 이마티닙 메실레이트, PTK787/ZK 222584, 옥살리플라틴, 류코보린, 라파마이신, 라파티닙, 로나파르닙, 소라페닙, 게피티닙, AG1478, AG1571, 알킬화제, 알킬설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민, 메틸아멜라민, 아세토게닌, 캄프토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 크립토피신, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엘류테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕틴, 스폰지스타틴, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민옥사이드 염산염, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드, 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 칼리케아미신, 디네미신, 클로드로네이트, 에스페라미신, 네오카르지노스타틴 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 유트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실(5-FU), 데노프테린, 프테롭테린, 트리메트렉세이트, 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아민프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄, 프롤린산, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트락세이트, 디포파민, 데메콜신, 디아지쿠온, 엘포르미틴, 엘립티늄 아세테이트, 에포틸론, 에토글루시드, 질산갈륨, 하이드록시우레아, 렌티난, 로니다이닌, 메이탄신, 안사미토신, 미토구아존, 미톡산트론, 모피단몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로속산트론, 포도필린산, 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, 라족산, 리족신, 시조피란, 스피로게르마늄, 테누아존산, 트리아지쿠온, 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민, 트리코테센, 우레탄, 빈데신, 다카르바진, 만노무스틴, 미토브로니톨, 미토락톨, 피포브로만, 가시토신, 아라비노사이드, 시클로포스파미드, 티오테파, 탁소이드, 파클리탁셀, 독세탁셀, 클로란부실, 젬시타빈, 6-티오구아닌, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 카보플라틴, 빈블라스틴, 백금, 에토포사이드, 이포스파마이드, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 노반트론, 테니포사이드, 에다트렉세이트, 다우노마이신, 아미노프테린, 젤로다, 이반드로네이트, 토포이소머라제 억제제, 디플루오로메틸오르니틴(DMFO), 레티노이드 및 카페시타빈으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 제제는 펩타이드, 단백질, 항체, 호르몬, 시토카인 또는 케모카인으로부터 선택되는 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 항체는 억제성 면역관문 항원을 억제/차단하는 항-면역관문 항체인 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 항-면역관문 항체는 항-PD-1/PD-L1 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIGIT 항체, 항-Ceacam 1 항체, 항-LAIR-1 항체, 항-TIM-3 항체, 항-VISTA 항체, 항-KIR 항체, 항-IDO 항체, 항-CD276 항체, 항-A2AR 항체 또는 항-CD47 항체인 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항-PD-1/PD-L1 항체는 아벨루맙, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 두르발루맙 및/또는 아테졸리주맙인 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는, 약학적 조성물.
  9. 환자의 암을 치료하기 위한 의약의 제조에 있어서의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 이용.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 암은 AKR1C3 환원효소를 과발현하는 암인, 약학적 조성물의 이용.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 암은 간암, 간세포암종(HCC), 폐암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 백혈병, 식도암, 신장암, 위암, 결장암, 뇌암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 두경부암, 자궁내막암, 췌장암, 육종암 또는 직장암인, 약학적 조성물의 이용.
  12. 치료 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 약학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료가 필요한 환자에서의 암의 치료 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 치료 유효량은 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg인, 암의 치료 방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 암은 AKR1C3 환원효소를 과발현하는 암인, 암의 치료 방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 암은 간암, 간세포암종(HCC), 폐암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 백혈병, 식도암, 신장암, 위암, 결장암, 뇌암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 두경부암, 자궁내막암, 췌장암, 육종암 또는 직장암인, 암의 치료 방법.
  16. 면역관문 억제제와 조합된 하기 화학식 I-1 또는 화학식 I-2로 표시되는 화합물을 포함하는 약학적 조성물의 치료 유효량을, 암 세포들의 성장 억제가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 암 세포들의 성장 억제 방법:

    화학식 I-1 화학식 I-2.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 면역관문 억제제와 상기 화합물의 조합은 공동적으로 또는 상승적으로 T 세포 불활성화를 막고 치료 효능을 향상시키도록 작용하는, 암 세포들의 성장 억제 방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상기 면역관문 억제제는 항-PD-1/PD-L1 항체인, 암 세포들의 성장 억제 방법.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 암은 AKR1C3 환원효소를 과발현하는 암인, 암 세포들의 성장 억제 방법.
  20. 제16항에 있어서,
    상기 암은 간암, 간세포암종(HCC), 폐암, 흑색종, 전립선암, 유방암, 백혈병, 식도암, 신장암, 위암, 결장암, 뇌암, 방광암, 자궁경부암, 난소암, 두경부암, 자궁내막암, 췌장암, 육종암 또는 직장암인, 암 세포들의 성장 억제 방법.
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