KR20210126086A - 포유동물 세포의 보존액 - Google Patents

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토모히로 시게모리
나츠키 와타나베
타이치 타케나와
치카게 시라카와
마스히로 니시무라
야스타카 후지타
오사무 사와모토
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가부시키가이샤 메가카리온
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Abstract

본 발명은 비동결 상태로 포유동물 세포를 장기간 보존하기 위한, 신규 보존액을 제공하는 것을 과제로 한다. 아스코르브산 및/또는 나이아신을 등장액에 첨가하여 보존액을 조제하고, 이러한 보존액과 혈소판을 혼합하여 진탕 보존함으로써, 적어도 10일간은 혈소판의 기능이나 생존율의 저하를 억제할 수 있다. 또한, 상기 보존액과 중간엽 줄기세포, 거핵구, 또는 T 세포를 혼합하여, 비동결 상태로 보존함으로써, 이들 세포의 기능이나 생존율의 저하를 적어도 수 일 내지 수십 일 동안 억제할 수 있다.

Description

포유동물 세포의 보존액
본 발명은, 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염(이하, '나이아신류'라고 총칭하는 경우가 있음), 및 항산화제를 포함하는 포유동물 세포의 보존액이나, 그 보존액을 조제하기 위한 분말 제제나, 그 보존액을 이용한 포유동물 세포의 보존 방법에 관한 것이다.
혈소판 제제는, 수술이나 창상에 의한 출혈시 이외에, 혈소판 감소를 수반하는 환자에 대해 투여된다. 현재, 혈소판 제제는 헌혈에 의해 얻어진 혈액으로부터 제조되고 있으나, 인구 구성의 변화에 따라 헌혈량이 저감하여, 혈소판 제제가 부족할 것이 우려되고 있다.
또한, 헌혈 제공자가 세균 등의 감염증에 걸려 있을 경우, 혈액이 세균 오염되어 있을 가능성이 있기 때문에, 세균 오염된 혈소판 제제의 투여에 의한 감염증 리스크가 있다. 이로 인해, 인비트로에서 혈소판을 제조하는 방법이 개발되고(비특허문헌 1), 안정적인 대량 생산을 위한 다양한 기술이 확립되어 왔다(특허문헌 1 및 2).
혈소판 제제는, 혈소판을 적절한 보존액에 혼합하여 혈액백 등에 충전함으로써 제조된다. 혈소판의 형태 및 기능이 저온에 의해 급격히 변화되는 것으로 인해, 혈소판 제제는 실온(20∼24℃)에서 진탕 보존하여 사용된다. 그러나, 보존 중에 혈소판의 기능 저하 등의 여러 가지 문제가 일어난다는 것이 알려져 있어, 장기간의 보존이 불가능했다. 이로 인해, 혈소판의 기능 저하를 방지하고, 혈소판 제제의 보존 기간의 연장을 가능케 하는 보존액의 개발이 요구되고 있다.
또한, 중간엽 줄기세포는, 골수, 지방 조직 등에 존재하는 신체 줄기세포(somatic stem cell)이며, 뼈, 연골 및 지방 등으로 분화하는 능력을 갖는다. 이로 인해, 중간엽 줄기세포는, 이식 치료에서의 유망한 세포 소스로서 주목받고 있어, 배양 및 보존 방법의 개발이 진행되고 있다(특허문헌 3 및 4). 또한 최근에는 T 세포를 이용한 다양한 암 면역 치료가 개발되어, 임상 시험이 이루어지고 있다(비특허문헌 2). 그러나, T 세포를 동결 보존하면, T 세포막 상의 PD-1(면역 체크포인트 분자)의 발현이 현저히 저하된다는 것이 보고되어(비특허문헌 3), T 세포의 비동결 보존 방법의 개발이 요구되고 있다.
특허 문헌 1: WO2017/077964 특허 문헌 2: PCT/JP2018/034667 특허 문헌 3: WO2017/073656 특허 문헌 4: 일본 특허출원공개 공보 제2018-153196호
비특허 문헌 1: Takayama et. al., 2008, Blood, 111:5298-5306 비특허 문헌 2: Tyler et. al., 2013, Blood, 121:308-317 비특허 문헌 3: Campbell et. al., 2009, Clin vaccine immunol, 16:1648-53
본 발명의 과제는, 종래의 보존액보다 보존성이 우수하고, 포유동물 세포를 장기간 보존할 수 있는, 신규 보존액을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 거듭하던 중, (1) 아스코르브산(이하, '비타민 C' 또는 'VC'라고 칭하는 경우가 있음)을 첨가한 등장액 내에서 혈소판을 진탕 보존하면, 종래의 혈소판 보존액보다 혈소판의 열화가 억제된다는 것, (2) 나이아신(이하, '비타민 B3' 또는 'VB3'이라고 칭하는 경우가 있음)을 VC와 조합하여 등장액에 첨가하면, 혈소판의 열화가 보다 효율적으로 억제된다는 것, (3) VC 및 VB3을 첨가한 등장액이, 중간엽 줄기세포, 거핵구(megakaryocyte), T 세포 등의 다른 포유동물 세포의 비동결 보존에도 효과적이라는 것, (4) 상기와 같은 VC 및 VB3에 의한 세포 보존 효과가 리보플라빈(비타민 B2, 이하 'VB2'라고 칭하는 경우가 있음)에 의해 저해된다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은, (1) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제를 포함하는, 포유동물 세포의 보존액이나, (2) 항산화제가, 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염인, 상기 (1)에 기재된 보존액이나, (3) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 1∼10000mg/L인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 보존액이나, (4) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 30∼3000mg/L인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 보존액이나, (5) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 120∼1200mg/L인, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 보존액이나, (6) 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 1∼10000mg/L인, 상기 (2) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 보존액이나, (7) 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 30∼6000mg/L인, 상기 (2) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 보존액이나, (8) 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 300∼3000mg/L인, 상기 (2) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 보존액이나, (9) 포유동물 세포를 0∼40℃에서 보존하기 위한, 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 보존액이나, (10) 비타민 B2 혹은 그 유도체 또는 그들의 염을 포함하지 않는, 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 한 항에 기재된 보존액에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, (11) 포유동물 세포가, 혈소판 또는 거핵구인, 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 보존액이나, (12) 혈소판이, 이하의 (A) 및 (B)를 포함하는 방법에 의해 얻어진 정제 혈소판인, 상기 (11)에 기재된 보존액이나, (A) 거핵구의 배양물을 농축하는 농축 공정; (B) 얻어진 농축물로부터 혈소판을 원심 분리하는 원심 분리 공정; (13) 알부민을 더 포함하는, 상기 (11) 또는 (12)에 기재된 보존액이나, (14) 알부민의 농도가, 1.25∼10%(w/v)인, 상기 (13)에 기재된 보존액이나, (15) 당을 더 포함하는, 상기 (13) 또는 (14)에 기재된 보존액이나, (16) 당이, 포도당인, 상기 (15)에 기재된 보존액이나, (17) 혈소판 또는 거핵구를, 5∼10일간 보존하기 위한, 상기 (11) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 보존액에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, (18) 포유동물 세포가, 줄기세포 또는 면역세포인, 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 보존액이나, (19) 줄기세포가, 중간엽 줄기세포인, 상기 (18)에 기재된 보존액이나, (20) 면역세포가, T 세포인, 상기 (18)에 기재된 보존액이나, (21) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제를 등장액 내에 포함하는, 상기 (18) 내지 (20) 중 어느 한 항에 기재된 보존액이나, (22) 등장액이, 젖산 링거액인, 상기 (21)에 기재된 보존액이나, (23) 트레할로스를 더 포함하는, 상기 (21) 또는 (22)에 기재된 보존액이나, (24) 덱스트란을 더 포함하는, 상기 (21) 내지 (23) 중 어느 한 항에 기재된 보존액이나, (25) 줄기세포를, 1∼63일간 보존하기 위한, 상기 (18) 내지 (24) 중 어느 한 항에 기재된 보존액이나, (26) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제를 포함하는, 상기 (1) 내지 (25) 중 어느 한 항에 기재된 보존액을 조제하기 위한 분말 제제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, (27) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제를 포함하는 액 내에서, 포유동물 세포를 보존하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포의 보존 방법이나, (28) 항산화제가, 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염인, 상기 (27)에 기재된 방법이나, (29) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 1∼10000mg/L인, 상기 (27) 또는 (28)에 기재된 방법이나, (30) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 30∼3000mg/L인, 상기 (27) 또는 (28)에 기재된 방법이나, (31) 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 120∼1200mg/L인, 상기 (27) 또는 (28)에 기재된 방법이나, (32) 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 1∼10000mg/L인, 상기 (28) 내지 (31) 중 어느 한 항에 기재된 방법이나, (33) 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 30∼6000mg/L인, 상기 (28) 내지 (31) 중 어느 한 항에 기재된 방법이나, (34) 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 300∼3000mg/L인, 상기 (28) 내지 (31) 중 어느 한 항에 기재된 방법이나, (35) 포유동물 세포를 0∼40℃에서 보존하는 것을 특징으로 하는, 상기 (27) 내지 (34) 중 어느 한 항에 기재된 방법이나, (36) 액이, 비타민 B2 혹은 그 유도체 또는 그들의 염을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 상기 (27) 내지 (35) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은, (37) 포유동물 세포가, 혈소판 또는 거핵구인, 상기 (27) 내지 (36) 중 어느 한 항에 기재된 방법이나, (38) 혈소판이, 이하의 (A) 및 (B)를 포함하는 방법에 의해 얻어진 정제 혈소판인, 상기 (37)에 기재된 방법이나, (A) 거핵구의 배양물을 농축하는 농축 공정; (B) 얻어진 농축물로부터 혈소판을 원심 분리하는 원심 분리 공정; (39) 액 내에 알부민을 더 포함하는, 상기 (37) 또는 (38)에 기재된 방법이나, (40) 알부민의 농도가, 1.25∼10%(w/v)인, 상기 (39)에 기재된 방법이나, (41) 액 내에 당을 더 포함하는, 상기 (39) 또는 (40)에 기재된 방법이나, (42) 당이, 포도당인, 상기 (41)에 기재된 방법이나, (43) 혈소판 또는 거핵구를, 5∼10일간 보존하는 것을 특징으로 하는, 상기 (37) 내지 (42) 중 어느 한 항에 기재된 방법이나, (44) 포유동물 세포가, 줄기세포 또는 면역세포인, 상기 (27) 내지 (36) 중 어느 한 항에 기재된 방법이나, (45) 줄기세포가, 중간엽 줄기세포인, 상기 (44)에 기재된 방법이나, (46) 면역세포가, T 세포인, 상기 (44)에 기재된 방법이나, (47) 액이, 등장액인, 상기 (44) 내지 (46) 중 어느 한 항에 기재된 방법이나, (48) 등장액이, 젖산 링거액인, 상기 (47)에 기재된 방법이나, (49) 액 내에 트레할로스를 더 포함하는, 상기 (47) 또는 (48)에 기재된 방법이나, (50) 액 내에 덱스트란을 더 포함하는, 상기 (47) 내지 (49) 중 어느 한 항에 기재된 방법이나, (51) 줄기세포를, 1∼63일간 보존하는 것을 특징으로 하는, 상기 (44) 내지 (50) 중 어느 한 항에 기재된 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 다른 양태로는, i) 포유동물 세포의 보존에 이용하기 위한, 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제나, ii) 포유동물 세포의 보존액의 조제에 이용하기 위한, 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제의 사용을 들 수 있다.
본 발명에 의하면, 종래의 보존액과 비교하여, 보존 중인 포유동물 세포에서의 기능이나 생존율의 저하를 효율적으로 억제할 수 있다. 이로 인해, 본 발명에 의하면, 혈소판 등의 동결 보존이 어려운 포유동물 세포를 장기간 보존하는 것이 가능해지고, 의료에서의 양질의 이식용 세포 함유액을 제공할 수 있다.
도 1은 본원 실시예에서 사용된 iPS 세포 유래 혈소판의 농축 시스템을 나타내는 모식도이다.
도 2는 5일간 보존 후의 혈소판의 Annexin V 양성률, 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '2.5% HSA BRS 20% ACD-A' 및 '2.5% HSA BRS 10% ACD-A(GLU)'는 종래의 보존액을, 'VC 제제 첨가 10% ACD-A(GLU)(300mg/L)', 'VC 제제 첨가 10% ACD-A(GLU)(1000mg/L)', 및 'VC 제제 첨가 10% ACD-A(GLU)(3000mg/L)'는, 300∼3000mg/L의 VC를 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 3은 5일간 보존 후의 혈소판의 Annexin V 양성률에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제1 세대+VC'는 1000mg/L의 VC를 포함하는 본 발명의 보존액을, '제1 세대+VC, VB3(=제2 세대)'은 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 4는 5일간 보존 후의 혈소판의 젖산 생성에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제1 세대+VC'는 1000mg/L의 VC를 포함하는 본 발명의 보존액을, '제1 세대+VC, VB3(=제2 세대)'은 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 5는 5일간 보존 후의 혈소판의 회수율에 미치는, VC 및/또는 VB3(니코틴산) 첨가 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '+VC'는 1000mg/L의 VC를 포함하는 본 발명의 보존액을, '+VC, VB3M'은 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 6은 5 또는 10일간 보존 후의 혈소판 샘플의 젖산 농도 및 pH에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제1 세대+VC'는 1000mg/L의 VC를 포함하는 본 발명의 보존액을, '제2 세대(제1 세대+VC+VB3)'는 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 7은 5 또는 10일간 보존 후의 혈소판의 Annexin V 양성률, 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제1 세대+VC'는 1000mg/L의 VC를 포함하는 본 발명의 보존액을, '제2 세대(제1 세대+VC+VB3)'는 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 8은 5 또는 10일간 보존 후의 혈소판 샘플 내의 혈소판 회수율에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제1 세대+VC'는 1000mg/L의 VC를 포함하는 본 발명의 보존액을, '제2 세대(제1 세대+VC+VB3)'는 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다. 또한, 도면 중, 'plt/mL'은 샘플 내의 혈소판 농도를, '%'는 혈소판 회수율을 각각 나타낸다.
도 9는 5 또는 10일간 보존 후의 혈소판의 응집능에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 이 실험에서는 자극제로서 TRAP-6을 이용했다. 도면 중, '신규 보존액'은 1000mg/L의 VC와 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 나타낸다.
도 10은 5 또는 10일간 보존 후의 혈소판의 응집능에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 이 실험에서는 자극제로서 Collagen을 이용했다. 도면 중, '신규 보존액'은 1000mg/L의 VC와 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 나타낸다.
도 11은 5 또는 10일간 보존 후의 혈소판의 응집능에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 이 실험에서는 자극제로서 ADP를 이용했다. 도면 중, '신규 보존액'은 1000mg/L의 VC와 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 나타낸다.
도 12는 5 또는 10일간 보존 후의 혈소판의 응집능에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 이 실험에서는 자극제로서 Collagen/ADP를 이용했다. 도면 중, '신규 보존액'은 1000mg/L의 VC와 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 나타낸다.
도 13은 5일간 보존 후의 혈소판의 Annexin V 양성률, 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제2 세대(니코틴산(400mg/L)'는 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을, '제2 세대(니코틴아미드(400mg/L)'는 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴아미드를 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 14는 5일간 보존 후의 혈소판의 Annexin V 양성률, 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 이 실험에서는, 첨가제를 포함하지 않는 VC 시약을 사용했다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제1 세대 VC 시약'은 1000mg/L의 VC를 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 15는 5일간 보존 후의 혈소판의 Annexin V 양성률, 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률에 미치는, 본 발명의 보존액 및 이미 알려진 보존액의 영향을 비교한 결과를 나타내는 도면이다. 도면 중, '신규 혈소판 보존액'은 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을, '일본 적십자사 혈소판 보존액'은 ACD-A액 및 중탄산 링거액을 약 1 대 20 으로 혼화한 보존액을 각각 나타낸다.
도 16은 본 발명의 보존액을 이용하여 조제된 혈소판 샘플에 의한 지혈 효과를 나타내는 도면이다. 도면 중, 'Vehicle'은 본 발명의 보존액만(혈소판을 포함하지 않음) 투여된 마우스를, 'Platelets'는 본 발명의 보존액을 이용하여 조제된 혈소판 샘플이 투여된 마우스를 각각 나타낸다.
도 17은 중간엽 줄기세포의 생존율 및 생세포 회수율에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '+용매'란 CSP-01 용액에 물을 첨가한 보존액을, '+VC+니코틴산'이란 CSP-01 용액에 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 18은 거핵구의 Annexin V 음성률에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제2 세대'는 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 19는 48시간 보존 후의 T 세포의 생존율 및 생세포 회수율에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다.
도 20은 24 또는 48시간 보존 후의 T 세포의 생존율 및 생세포 회수율에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다.
도 21은 혈소판의 Annexin V 양성률에 미치는 VB2의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제1 세대+수용성 비타민'은 VB2를 포함하는 9종의 수용성 비타민을 포함하는 본 발명의 보존액을, '제1 세대+수용성 비타민(VB2 제외)'은 VB2를 포함하지 않는 8종의 수용성 비타민을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 22는 혈소판의 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률에 미치는, VB2의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '제1 세대'는 종래의 보존액을, '제1 세대+수용성 비타민'은 VB2를 포함하는 9종의 수용성 비타민을 포함하는 본 발명의 보존액을, '제1 세대+수용성 비타민(VB2 제외)'은 VB2를 포함하지 않는 8종의 수용성 비타민을 포함하는 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 23은 중간엽 줄기세포의 생존율 및 생세포 회수율에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '+용매'란 CSP-01 용액에 물을 첨가한 보존액을, '+VC+니코틴산'이란 CSP-01 용액에 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 첨가한 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 24는 중간엽 줄기세포의 생존율 및 생세포 회수율에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, 'CSP-01+VC+니코틴산'이란, CSP-01 용액에 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 첨가한 본 발명의 보존액을, '젖산 링거액+VC+니코틴산'이란, 젖산 링거액에 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 첨가한 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 25는 중간엽 줄기세포의 생존율 및 생세포 회수율에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, 'CSP-01+VC+니코틴산'이란, CSP-01 용액에 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 첨가한 본 발명의 보존액을, 'CSP-01+VC'란, CSP-01 용액에 1000mg/L의 VC를 첨가한 본 발명의 보존액을, 'CSP-01+니코틴산'이란, CSP-01 용액에 400mg/L의 니코틴산을 첨가한 본 발명의 보존액을 각각 나타낸다.
도 26은 새끼돼지 골수 중간엽 줄기세포의 생존율 및 생세포 회수율에 미치는, 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, '무첨가'란, CSP-01 용액을 나타내고, '+VC+니코틴산'이란, CSP-01 용액에 1000mg/L의 VC 및 400mg/L의 니코틴산을 첨가한 본 발명의 보존액을 나타낸다.
도 27은 T 세포의 생존율에 미치는 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 도면 중, 'Pre'란, 보존 개시 전의 T 세포의 생존율을 나타낸다. 또한, 도면 중, 'LR'이란 젖산 링거액을 나타내고, 또한, 'GLC'는 80mg/dL의 글루코스를, 'VC'는 1000mg/L의 VC를, 니코틴산은 400mg/L의 니코틴산을 각각 나타낸다.
도 28은 T 세포 생세포 회수율에 미치는 본 발명의 보존액의 영향을 나타내는 도면이다. 또한, 도면 중, 'LR'이란 젖산 링거액을 나타낸다. 또한, 'GLC'는 80mg/dL의 글루코스를, 'VC'는 1000mg/L의 VC를, '니코틴산'은 400mg/L의 니코틴산을 각각 나타낸다.
본 발명의 포유동물 세포의 보존액(이하, '본 발명의 보존액'이라고 칭하는 경우가 있음)은, 나이아신류 및/또는 항산화제를 포함하는 것으로, '포유동물 세포의 보존'이라는 용도에 한정된 것이면 특별히 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 분말 제제로는, 본 발명의 보존액을 조제하기 위한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 또한, 본 발명의 포유동물 세포의 보존 방법으로는, 본 발명의 보존액 내에서, 포유동물 세포를 보존하는 공정을 포함하는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 여기에서 '포유동물 세포의 보존'이란, 대상이 되는 포유동물 세포의 (i) 생존을 유지하는 것, (ii) 열화를 억제하는 것, (iii) 원하는 기능을 유지하는 것, 및/또는, (iv) 분화 혹은 증식을 억제하는 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 보존액이란, 포유동물 세포와 혼합했을 경우에 상기 보존 효과를 발휘하는 용액을 의미하고, 본 발명의 보존액에는, 보존 대상 세포를 아직 포함하지 않은 보존액의 양태 이외에, 보존 대상 세포를 이미 포함하는 보존액의 양태도 포함된다. 또한, 본 발명의 보존액은, 포유동물 세포의 보존을 위한 유효 성분으로서, 나이아신류를 단독으로 포함하는 것일 수도, 항산화제를 단독으로 포함하는 것일 수도 있으나, 나이아신류와 항산화제를 조합하여 포함하는 것이 바람직하다. 이하, 나이아신류 및/또는 항산화제를 '본 발명의 필수 보호 성분'이라고 하는 경우가 있다. 또한, 본 발명의 보존액 또는 분말 제제를 조제하기 위한 첨가제도 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 첨가제로는, 본 발명의 필수 보호 성분을 반드시 포함한다. 본 발명의 첨가제에는, 후술하는 '임의의 유효 성분'은 포함하지 않을 수도 있다.
상기 '나이아신류'에서의 나이아신(VB3)이란, 니코틴산 및/또는 니코틴아미드를 의미한다. 즉, 상기 본 발명의 보존액은, 니코틴산을 포함하는 보존액, 니코틴아미드를 포함하는 보존액, 및, 니코틴산 및 니코틴아미드를 포함하는 보존액의 어떠한 것일 수도 있으나, 니코틴산을 포함하는 보존액인 것이 바람직하다. 또한, 나이아신(VB3)은, 화학 합성 등에 의한 이미 알려진 방법에 의해 제조할 수 있으나, 시판품을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 니코틴산 주사 제제(토아에이요사(TOA EIYO LTD.) 제품), 니코틴아미드(후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) 제품) 등의 시판품을 들 수 있다.
상기 '나이아신류'에서의 나이아신 유도체로는, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 토코페롤 니코틴산 에스테르, 니세리트롤, 니코몰, 이노시톨헥사니코틴산 에스테르, 2-클로로 니코틴아미드, 6-메틸 니코틴아미드, 6-아미노 니코틴아미드, N-메틸 니코틴아미드, N,N-디메틸 니코틴아미드, N-(히드록시메틸) 니코틴아미드, 퀴놀린산 이미드, 니코틴아닐리드, N-벤질 니코틴아미드, N-에틸 니코틴아미드, 니페나존, 니코틴알데히드, 이소니코틴산, 메틸 이소니코틴산, 티오니코틴아미드, 니알라마이드, 2-머캅토 니코틴산, 니아프라진, 니코틴산 메틸, 니코틴산 나트륨 등을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 상기 '나이아신류'에서의 '나이아신 또는 그 유도체의 염'으로는, 특별히 제한되지 않으나, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리토금속염 암모늄염, 트리알킬아민염 등의 유기염기염, 염산염, 황산염 등의 무기산염, 아세트산염 등의 유기산염 등을 바람직하게 들 수 있다.
또한, 상기 '항산화제'로는, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 아스코르브산(VC), 슈퍼옥시드 디스무타아제 1, 슈퍼옥시드 디스무타아제 2, 슈퍼옥시드 디스무타아제 3, 글루타티온, 리포산, 에피갈로카테킨 갈레이트, 커큐민, 멜라토닌, 히드록시티로솔, 유비퀴논, 카탈라아제, 비타민 E, 요산 등, 그들의 유도체, 또는 그들의 염을 바람직하게 들 수 있으며, 그 중에서도, 아스코르브산(VC) 혹은 그 유도체 또는 그들의 염(이하, '아스코르브산류'라고 총칭하는 경우가 있음)을 바람직하게 들 수 있고, 아스코르브산(VC)을 특히 바람직하게 들 수 있다. 아스코르브산(VC)은, 화학 합성 등에 의한 이미 알려진 방법에 의해 제조할 수 있으나, 시판품을 이용할 수도 있다. 예를 들면, 아스코르브산 주사액(사와이세이야쿠 가부시키가이샤(Sawai Pharmaceutical Co., Ltd.) 제품), L(+)-아스코르브산 표준품(후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤 제품) 등의 시판품을 들 수 있다.
상기 '아스코르브산류'에서의 아스코르브산(VC)의 유도체로는, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 아스코르브산 2-인산, 아스코르브산 2-황산, 아스코르빌-2-글루코시드, 아스코르빌-6-글루코시드 등을 바람직하게 들 수 있다. 또한, 상기 '아스코르브산류'에서의 아스코르브산(VC) 또는 그 유도체의 염으로는, 특별히 제한되지 않으나, 나트륨염, 칼륨염 등의 알칼리금속염, 칼슘염, 마그네슘염 등의 알칼리토금속염 암모늄염, 트리알킬아민염 등의 유기염기염, 염산염, 황산염 등의 무기산염, 아세트산염 등의 유기산염 등을 바람직하게 들 수 있다.
본 발명의 보존액에 포함되는 나이아신류의 농도로는, 예를 들면, 니코틴산 환산으로, 1∼10000mg/L의 범위 내이면 되고, 구체적으로는, 10∼5000mg/L, 20∼8000mg/L, 30∼6000mg/L, 30∼4000mg/L, 30∼3000mg/L, 30∼2000mg/L, 30∼1500mg/L, 30∼1200mg/L를 예로 들 수 있으나, 그 중에서도, 120∼1200mg/L의 범위 내인 것이 바람직하다.
본 발명의 보존액에 포함되는, 아스코르브산류의 농도로는, 예를 들면, 아스코르브산 환산으로, 1∼10000mg/L의 범위 내이면 되고, 예를 들면, 10∼8000mg/L, 20∼7000mg/L, 30∼6000mg/L, 30∼5000mg/L, 30∼4000mg/L, 30∼3000mg/L, 50∼3000mg/L, 100∼3000mg/L를 들 수 있으나, 그 중에서도, 300∼3000mg/L의 범위 내인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 보존액은, 본 발명의 필수 보호 성분을 등장액 내에 포함하는 것일 수도 있다. 상기 '등장액'으로는, 체액이나 세포액의 삼투압과 거의 같아지도록 나트륨이온, 칼륨이온, 칼슘이온 등에 의해 염 농도 또는 당 농도 등을 조정한 등장액이면 특별히 제한되지 않으며, 구체적으로는, 생리 식염수나, 완충 효과가 있는 생리 식염수(인산 완충 생리 식염수[Phosphate buffered saline; PBS], 트리스 완충 생리 식염수[Tris Buffered Saline; TBS], HEPES 완충 생리 식염수 등), 링거액, 젖산 링거액, 아세트산 링거액, 중탄산 링거액 등을 들 수 있으나, 그 중에서도, 중탄산 링거액 또는 젖산 링거액인 것이 바람직하다. 등장액은, 이미 알려진 조성을 바탕으로 제조할 수 있으나, 시판품을 이용할 수도 있다. 시판중인 것으로는, 예를 들면, 오오츠카 생식주(Otsuka Normal Saline, 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤(Otsuka Phamaceutical Factory, Inc.) 제품)(생리 식염액), 링거액 '오오츠카'(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)(링거액), 락텍(Lactec, 등록 상표)주(注)(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)(젖산 링거액), 빈(Veen, 등록 상표) F 수액(후소약쿠힌코교 가부시키가이샤(Fuso Pharmaceutical Indurties, Ltd.) 제품)(아세트산 링거액), 비카네이트(BICANATE, 등록 상표) 수액(오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)(중탄산 링거액) 등의 시판품을 들 수 있다. 본 명세서에서 '등장'이란, 삼투압이 250∼380mOsm/L의 범위 내인 것을 의미한다.
또한, 본 발명의 보존액은, 포유동물 세포의 보존을 위한 임의의 유효 성분으로서, 알부민 또는 당을 포함하고 있을 수도 있다. 본 명세서에서 '임의의 유효 성분'이란, 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있는 성분을 의미한다. 또한, 알부민 및/또는 당을 '본 발명의 임의 보호 성분'이라고 하는 경우가 있다. 상기 '알부민'으로는, 예를 들면, 인간 혈청 알부민(HSA), 소 혈청 알부민(BSA), 소 태아 혈청 알부민(FBS) 등을 들 수 있으나, HSA인 것이 바람직하다. 상기 본 발명의 보존액에 알부민을 포함하는 경우, 알부민의 농도로는, 0.1∼30(w/v)%의 범위 내이면 되고, 예를 들면, 1.0∼20(w/v)%, 1.0∼15(w/v)%, 1.0∼10(w/v)%, 1.25∼10(w/v)%, 1.25∼7.25(w/v)%, 1.5∼5.0(w/v)%, 1.5∼2.5(w/v)%, 2.0∼2.5(w/v)%를 들 수 있다.
상기 '당'으로는, 예를 들면, 포도당(글루코스), 트레할로스, 덱스트란, 히드록시에틸 전분 등을 들 수 있다. 상기 본 발명의 보존액에 포도당을 포함하는 경우, 포도당의 농도로는, 1∼10000mg/L의 범위 내이면 되고, 예를 들면, 10∼8000mg/L, 20∼6000mg/L, 30∼6000mg/L, 40∼6000mg/L, 50∼6000mg/L, 100∼6000mg/L, 200∼6000mg/L, 500∼6000mg/L, 1000∼6000mg/L, 2000∼6000mg/L, 2000∼5000mg/L를 들 수 있다. 상기 본 발명의 보존액에 트레할로스를 포함하는 경우, 트레할로스의 농도로는, 0.1∼100g/L, 5∼80g/L, 20∼60g/L를 들 수 있다. 상기 본 발명의 보존액에 덱스트란을 포함하는 경우, 덱스트란의 농도로는, 0.1∼100g/L, 5∼80g/L, 40∼70g/L를 들 수 있다. 상기 본 발명의 보존액에 히드록시에틸 전분을 포함하는 경우, 히드록시에틸 전분의 농도로는, 1∼500g/L, 10∼100g/L를 들 수 있다.
본 발명의 보존액은, (a) 비타민 B2(VB2, 리보플라빈이라고도 함) 혹은 그 유도체 또는 그들의 염(이하, '비타민 B2류'라고 칭하는 경우가 있음), (b) 배지 혹은 그 필수 성분, 또는 (c) 세포 분화 촉진제를 포함하지 않는 것이 바람직하다. 상기 (a) 의 '비타민 B2류'에서의 비타민 B2의 유도체로는, 예를 들면, 플라빈 모노뉴클레오티드, 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드, 리보플라빈 테트라부티레이트, 부티르산 리보플라빈, 인산 리보플라빈(리보플라빈 인산 에스테르) 등을 들 수 있고, 비타민 B2 또는 그 유도체의 염으로는, 예를 들면, 나트륨염 등을 들 수 있다.
상기 (b) 의 '배지'란, 인비트로 환경하에서 세포의 유지 및 증식에 필요한 영양소를 제공하는 세포 배양용 용액을 의미하고, 예를 들면, 이글 최소 필수(EME) 배지, 이스코브 변형 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium, IMDM), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, DMEM), TC199 배지, α-최소 필수 배지(α-MEM), RPMI 1640, Ham-F-12, E199, MCDB, 라이보비츠 L-15(Leibovitz's L-15), 윌리엄 E 배지 등을 들 수 있다. 또한, 상기 (b)의 '배지의 필수 성분'이란, 수성 영양소 및 전해액, 글리코사미노글리칸, 탈종창제(脫腫脹劑), 에너지원, 완충제, 항산화제, 막 안정제, 항생물질(혹은 항진균제), ATP 전구물질, 세포 영양 보조제, 및/또는 pH 지시약을 의미하고, 예를 들면, 상기 '수성 영양소 및 전해액'으로는, 상기 배지로부터 선택되는 1 또는 2 이상의 배지를, 상기 '글리코사미노글리칸'으로는, 황산 콘드로이틴, 황산 데르마탄, 황산 데르마틴, 황산 헤파린, 황산 헤파란, 황산 케라틴, 황산 케라탄, 또는 히알루론산을, 상기 '탈종창제'로는, 덱스트란, 황산 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌글리콜, 아세트산 폴리비닐, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 또는 카르복시프로필메틸 셀룰로스를, 상기 '에너지원'으로는, 피루베이트, 수크로스, 프럭토스, 또는 덱스트로스를, 상기 '완충제'로는, 탄산수소염 완충액 또는 HEPES 완충액을, 상기 '항산화제'로는, 2-머캅토 에탄올, 글루타티온, 또는 α-토코페롤을, 상기 '막 안정제'로는, 비타민 A, 레티노산, 에탄올아민, 포스포에탄올아민, 셀레늄, 또는 트랜스페린을, 상기 '항생물질 및/또는 항진균제'로는, 암포테리신 B, 황산 겐타마이신, 황산 카나마이신, 황산 네오마이신, 니스타틴, 페니실린, 토브라마이신, 또는 스트렙토마이신을, 상기 'ATP 전구물질'로는, 아데노신, 이노신, 또는 아데닌을, 상기 '세포 영양 보조제'로는, 콜레스테롤, L-히드록시프롤린, d-비오틴, 칼시페롤, 나이아신, p-아미노벤조산, 염산 피리독신, 비타민 B12, Fe(NO3)3, 또는 비필수 아미노산을, 상기 'pH 지시약'으로는 페놀레드를 각각 들 수 있다.
상기 (c)의 '세포 분화 촉진제'로는, 분화능을 갖는 세포로부터 원하는 형태의 세포를 얻기 위해 배지 등에 첨가되는 약제를 의미하고, 예를 들면, 레티놀, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 K, 레티노산, 아연, 아연 화합물, 칼슘, 칼슘 화합물, 히드로코르티손, 덱사메타손, L-글루타민, 에틸렌글리콜 4아세트산(EGTA), 프롤린, 비필수 아미노산(NEAA), β-머캅토 에탄올, 디부틸 사이클릭아데노신 모노포스페이트(db-cAMP), 모노티오글리세롤(MTG), 푸트레신, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 히포크산틴, 아데닌, 포스콜린, 실로스타미드, 3-이소부틸 1-메틸크산틴, 5-아자시티딘, 피루베이트, 오카다산, 리놀레산, 에틸렌디아민 4아세트산(EDTA), 항응고제 시트르산 덱스트로스 제제 A(ACDA), EDTA 2나트륨, 부티르산 나트륨, 글리세로포스페이트, G418, 겐타마이신, 펜톡시필린(1-(5-옥소헥실)-3,7-디메틸크산틴), 인도메타신, 조직 플라스미노겐 활성화 인자(TPA) 등을 들 수 있다. 상술한 바와 같이, 본 발명에서, 나이아신류, 및 항산화제(아스코르브산류를 포함함)는, 포유동물 세포의 보존을 위해 이용되고 있으며, 분화 촉진제로서 이용되는 것은 아니다.
본 발명의 보존액의 대상이 되는 '포유동물 세포'란, 포유동물에서 유래되는 살아있는 세포이면 특별히 제한되지 않으며, 생물 개체로부터 얻어진 초대 세포(primary cell)일 수도, 초대 세포를 1세대 또는 복수 세대 배양하여 증식시킨 세포일 수도 있으나, 구체적으로는, 질환·외상의 치료 등에 이용되는 혈소판이나, 그 제조에 사용되는 거핵구 이외에, 재생 의료·면역 요법 등에 이용되는 줄기세포나 면역세포 등을 바람직하게 예시할 수 있다. 또한, 상기 '포유동물'로는, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그 등의 설치류, 토끼 등의 토끼목, 돼지, 소, 염소, 말, 양 등의 유제목(有蹄目), 개, 고양이 등의 고양이목, 인간, 원숭이, 붉은털 원숭이, 게잡이 원숭이, 마모셋, 오랑우탄, 침팬지 등의 영장류 등을 예시할 수 있으며, 그 중에서도, 인간을 바람직하게 예시할 수 있다.
상기 '혈소판'이란, 혈액내 세포 성분 중의 하나이며, CD41a 및 CD42b가 양성인 세포 성분을 의미한다. 본 발명의 보존액의 대상이 되는 혈소판은, 포유동물의 혈액(전혈)으로부터 적혈구 및 백혈구를 제거함으로써 얻어진 농축 혈소판일 수도, 인비트로에서 배양한 거핵구로부터 인공적으로 제조된 정제 혈소판일 수도 있으나, 정제 혈소판인 것이 바람직하다. 상기 정제 혈소판의 제조 방법으로는, 특별히 제한되지 않으나, (A) 거핵구의 배양물을 농축하는 농축 공정; 및 (B) 얻어진 농축물로부터 혈소판을 원심 분리하는 원심 분리 공정; 의 공정 (A) 및 (B)를 포함하는 방법을 바람직하게 예시할 수 있다. 또한, 이러한 혈소판 제조 방법에도 이용되는 '거핵구'는, 유도 만능 줄기세포(iPS 세포), 배아 줄기세포(ES 세포), ntES 세포(nuclear transfer Embryonic Stem Cell), 생식 줄기세포(EG 세포), 신체 줄기세포, 배성 종양세포 등의 다능성 세포로부터 유도할 수 있는 것 이외에, 골수, 제대혈, 말초혈 등으로부터 단리한 조혈 줄기세포, 조혈 전구세포, CD34 양성세포, 거핵구·적혈구 전구세포, 거핵구 전구세포 등으로부터 유도할 수도 있다.
또한, 상기 '줄기세포'란, 자기 복제능 및 분화·증식능을 갖는 미숙한 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라, 다능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 복능성 줄기세포(multipotent stem cell), 단능성 줄기세포(unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 다능성 줄기세포란, 그 자체로는 개체가 될 수 없지만, 생체를 구성하는 모든 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하고, 복능성 줄기세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수 종류의 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미하고, 단능성 줄기세포란, 특정 조직이나 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 본 발명의 보존액의 보존 대상이 되는 줄기세포는, 다능성 줄기세포, 복능성 줄기세포, 및 단능성 줄기세포의 어떠한 것일 수도 있고, 예를 들면, iPS 세포, ES 세포, ntES 세포, EG 세포 등의 다능성 줄기세포나, 중간엽 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 골수 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 신체 줄기세포를 들 수 있으나, 그 중에서도, 중간엽 줄기세포인 것이 바람직하다. 중간엽 줄기세포는, 포유동물의 골수, 지방 조직, 말초혈, 제대혈 등으로부터 공지의 일반적인 방법으로 채취할 수 있는 것 이외에, 골수 천자 후의 조혈 줄기세포 등의 배양, 계대에 의해 인간 중간엽 줄기세포를 단리할 수 있다. 그 중에서도, 인간 골수 유래의 중간엽 줄기세포나 새끼돼지 골수 유래의 중간엽 줄기세포를 바람직하게 예시할 수 있다.
또한, 상기 '면역세포'란, 혈액이나 림프액 내에 존재하는, 면역 시스템에 관여하는 세포를 의미한다. 본 발명의 보존액의 보존 대상이 되는 면역세포로는, 예를 들면, T 세포, 대식세포, 수지상세포, B 세포, NK 세포, 호중구, 호산구, 골수 유래 억제 세포(MDSC) 등을 들 수 있으나, 그 중에서도, T 세포인 것이 바람직하다. 'T 세포'란, 표면에 T 세포 수용체(TCR)라고 불리는 항원 수용체를 발현하고 있는 세포를 의미하고, 예를 들면, CD8 양성 세포인 세포 상해성 T 세포, CD4 양성 세포인 헬퍼/제어성 T 세포, 나이브 T 세포(CD45RA+CD62L+세포), 센트럴 메모리 T 세포(CD45RA-CD62L+세포), 이펙터 메모리 T 세포(CD45RA-CD62L-세포), 및 말단 이펙터 T 세포(CD45RA+CD62L-세포)를 들 수 있다. T 세포는, 포유동물의 말초혈, 림프절, 골수, 흉선, 비장, 제대혈 등으로부터 공지의 일반적인 방법으로 채취할 수 있는 것 이외에, 시판품을 이용할 수도 있다.
본 발명의 보존액은, 포유동물을 비동결 상태로 보존하기 위해 사용할 수 있다. 본 발명을 이용하여 포유동물 세포를 보존할 때의 온도는, 보존 대상 세포의 종류에 따라 적절한 온도를 임의로 선택할 수 있으나, 0∼40℃의 범위 내인 것이 바람직하다. 예를 들면, 본 발명의 보존액을 이용하여 혈소판이나 거핵구를 보존할 때의 온도는, 바람직하게는 15∼30℃이며, 보다 바람직하게는 20∼24℃이며, 가장 바람직하게는 21∼23℃이다. 또한, 본 발명의 보존액을 이용하여 중간엽 줄기세포나 T 세포를 보존할 때의 온도는, 바람직하게는 1∼38℃이며, 보다 바람직하게는 1∼30℃이며, 특히 바람직하게는 1∼15℃이며, 가장 바람직하게는 1∼5℃이다. 또한, 본 발명을 이용하여 포유동물 세포를 보존할 때의 온도는, 0∼40℃의 범위 내에서 변화시킬 수도 있다. 예를 들면, 이하의 실시예에서도 나타나는 바와 같이, 본 발명의 보존액을 이용하여 T 세포를 보존할 때에는, 저온(예를 들면, 1∼5℃, 바람직하게는 5℃)에서 일정 기간 보존한 후에, 실온(예를 들면, 20∼26℃, 바람직하게는 22∼25℃, 보다 바람직하게는 25℃)에서 수 시간 더 보존할 수 있다. 또한, 본 발명의 보존액은, 포유동물 세포를 수 시간∼수십 일 동안 보존하기 위해 이용할 수 있다. 보존 기간은, 보존 대상 세포의 종류에 따라 다르나, 이하의 실시예에 나타난 바와 같이, 혈소판이나 거핵구이면 1∼15일간, 바람직하게는 1∼10일간, 중간엽 줄기세포이면 1∼63일간, 바람직하게는 1∼35일간, 보다 바람직하게는 1∼30일간, 보다 바람직하게는 1∼28일간, 더욱 바람직하게는 1∼14일간, T 세포이면 1∼30일간, 바람직하게는 1∼14일간, 보다 바람직하게는 1∼2일간, 더욱 바람직하게는 30시간 보존할 수 있다.
본 발명의 보존액은, 포유동물 세포를 포유동물에 투여한다 라는 용도로 사용될 수도 있다. 즉, 본 발명의 보존액과 포유동물 세포를 포함하는 혼합액을 소정 조건하에서 보존한 후에, 그 혼합액을 포유동물의 생체 내에 그대로 투여(예를 들면, 정맥 투여)할 수도 있다. 이로 인해, 본 발명의 보존액은, 포유동물의 생체 내에 투여했을 때, 포유동물의 생체에 악영향을 미칠 수 있는 성분을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 이러한 '악영향을 미칠 수 있는 성분'으로는, 예를 들면, 폴리비닐 피롤리돈, 2-머캅토 에탄올, 오카다산, 부티르산 나트륨, G418 등을 들 수 있다.
본 발명의 일 양태로서, 본 발명의 필수 보호 성분을 포함하는 포유동물 열화 억제제를 들 수 있다. 이러한 열화 억제제는, 본 발명의 임의 보호 성분을 더 포함하는 것일 수도 있다. 본 발명의 포유동물 열화 억제제는, 상기 등장액에 첨가하여 본 발명의 보존액을 조제하기 위해 사용할 수 있는 것 이외에, 이미 알려진 포유동물 보존액에 첨가하여 그 보존성을 높이기 위해 이용할 수도 있다. 또한, 본 발명은, 본 발명의 보존액 또는 분말 제제가 봉입된 포유동물 세포 보존 용기에 관한 것이기도 하다. 본 발명의 보존 용기로는, 포유동물 세포의 현탁액을 주입한 후에 무균성을 유지할 수 있는 용기이면 어떠한 형태일 수도 있고, 예를 들면, 혈액백, 수액백, 시린지, 앰플, 바이알 등을 들 수 있으나, 혈액백인 것이 바람직하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 기술적 범위는 이들 예시에 한정되는 것은 아니다.
[iPS 세포 유래 혈소판의 제작]
PCT/JP2018/034667에 기재된 방법에 따라 iPS 세포 유래 혈소판을 제작했다. 구체적인 순서를 이하의 (1-1) 내지 (1-12)에 나타낸다.
(1-1) iPS 세포로부터의 조혈 전구세포의 조제
Takayama 외(J. Exp. Med., 2010, vol. 13, 2817-2830) 방법에 따라, 인간 iPS 세포(TKDN SeV2 및 NIH5: 센다이 바이러스를 이용하여 수립된 인간 태아 피부 섬유아세포 유래 iPS 세포)로부터 혈구세포로의 분화 배양을 실시했다. 상세하게는, 인간 ES/iPS 세포 콜로니를, 20ng/mL의 VEGF(R&D SYSTEMS사 제품)의 존재하에서, C3H10T1/2 피더세포와 함께 14일간 공배양하여 조혈 전구세포(Hematopoietic Progenitor Cells; HPC)를 제작했다. 상기 배양은, 37℃, 20% O2, 5% CO2의 조건으로 실시했다.
(1-2) 유전자 도입 시스템
유전자 도입 시스템은, 렌티바이러스 벡터 시스템을 이용했다. 렌티바이러스 벡터는, Tetracycline 제어성 Tet-on(등록 상표) 유전자 발현 유도 시스템 벡터이다. LV-TRE-mOKS-Ubc-tTA-I2G(Kobayashi 외, Cell, 2010, vol. 142, No. 5,787-799)의 mOKS 카세트를, c-MYC, BMI1, 또는 BCL-xL로 재편성함으로써 제작했다. c-MYC, BMI1, 또는 BCL-xL이 도입된 벡터를, 각각, LV-TRE-c-Myc-Ubc-tTA-I2G, LVTRE-BMI1-Ubc-tTA-I2G, 및 LV-TRE-BCL-xL-Ubc-tTA-I2G로 했다. c-MYC, BMI1, 및 BCL-xL 바이러스는, 293T 세포에 상기 렌티바이러스 벡터로 유전자 도입함으로써 제작했다. 얻어진 바이러스를 목적 세포에 감염시킴으로써, c-MYC, BMI1, 및 BCL-xL 유전자가 목적 세포의 게놈 서열에 도입된다. 안정적으로 게놈 서열에 도입된 이들 유전자는, 배지에 독시사이클린(clontech #631311)을 가함으로써 강제 발현시킬 수 있다.
(1-3) 조혈 전구세포에의 c-MYC 및 BMI1 바이러스의 감염
미리 C3H10T1/2 피더세포를 파종한 6웰 플레이트 상에, 상기 (1-1)의 방법으로 얻어진 HPC를 5×104cells/웰이 되도록 파종하고, BMI1 바이러스 및 c-MYC 바이러스를 이용한 렌티바이러스법으로 c-MYC 및 BMI1을 강제 발현시켰다. 이때, 세포주 1종류에 대해 6웰씩 사용했다. 구체적으로는, 각각 MOI(multiplicity of infection) 20이 되도록 배지 내에 바이러스 입자를 첨가하고, 스핀 인펙션(32℃, 900rpm, 60분간 원심)으로 감염시켰다. 상기 스핀 인펙션은, 12시간 간격으로 2회 실시했다. 배지는, 기본 배지(15% Fetal Bovine Serum(GIBCO사 제품), 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine(GIBCO사 제품), 1% Insulin, Transferrin, Selenium Solution(ITS-G)(GIBCO사 제품), 0.45mmol/L 1-Thioglycerol(Sigma-Aldrich사 제품), 50μg/mL L-Ascorbic Acid(Sigma-Aldrich사 제품)를 함유하는 IMDM(Sigma-Aldrich사 제품))에, 50ng/mL Human thrombopoietin(TPO)(R&D SYSTEMS사 제품), 50ng/mL Human Stem Cell Factor(SCF)(R&D SYSTEMS사 제품) 및 2μg/mL Doxycycline(DOX, clontech사 제품, #631311)을 첨가한 배지에(이하, '분화 배지'라고 칭함), Protamine을 최종 농도가 10μg/mL가 되도록 더 첨가하여 이용했다.
(1-4) 거핵구 자기증식주의 제작 및 유지 배양
상기 (1-3)의 방법으로 c-MYC 및 BMI1 바이러스의 감염을 실시한 날을 감염 0일째로 하여, 이하와 같이, c-MYC 유전자 및 BMI1 유전자가 도입된 HPC를 배양함으로써, 거핵구 자기증식주를 각각 제작했다. c-MYC 유전자 및 BMI1 유전자의 강제 발현은, 배지에 1μg/mL DOX를 첨가함으로써 실시했다.
감염 2일째∼감염 11일째:
감염 2일째에, 피펫팅으로 상기 방법에 의해 얻어진 바이러스 감염이 완료된 혈구세포를 회수하여, 1200rpm, 5분간 원심 조작을 수행하여 상청을 제거한 후, 새로운 분화 배지로 현탁하여 새로운 C3H10T1/2 피더세포 상에 파종했다(6웰 플레이트). 감염 9일째에 동일한 조작을 함으로써 계대를 실시했다. 상기 재파종시에는, 세포수를 계측한 후, 1×105cells/2mL/웰이 되도록 C3H10T1/2 피더세포 상에 파종했다(6웰 플레이트).
감염 12일째∼감염 13일째:
감염 2일째와 동일한 조작을 실시했다. 세포수를 계측한 후, 3×105cells/10mL/100mm dish가 되도록, C3H10T1/2 피더세포 상에 파종했다(100mm dish).
감염 14일째:
바이러스 감염이 완료된 혈구세포를 회수하여, 세포 1.0×105개당, 2μL의 항인간 CD41a-APC 항체(BioLegend사 제품), 1μL의 항인간 CD42b-PE 항체(eBioscience사 제품), 및 1μL의 항인간 CD235ab-pacific blue 항체(BioLegend사 제품)를 각각 이용하여, 상기 혈구세포와 항체를 반응시켰다. 상기 반응 후, FACS Verse(상표)(BD Biosciences사 제품)를 이용하여 해석했다. 감염 14일째에서, CD41a 양성률이 50% 이상인 세포를, 거핵구 자기증식주로 했다.
(1-5) 거핵구 자기증식주에의 BCL-xL 바이러스 감염
상기 감염 14일째의 거핵구 자기증식주에, BCL-xL 바이러스를 이용한 렌티바이러스법으로 BCL-xL을 유전자 도입했다. MOI 10이 되도록 배지 내에 바이러스 입자를 첨가하고, 스핀 인펙션(32℃, 900rpm, 60분간 원심)으로 감염시켰다. BCL-xL 유전자의 강제 발현은, 배지에 1μg/mL DOX가 되도록 DOX를 첨가함으로써 실시했다.
(1-6) 거핵구 불멸화주의 제작 및 유지 배양
감염 14일째∼감염 18일째:
상기 (1-5)의 방법으로 얻어진 BCL-xL 유전자를 도입한 거핵구 자기증식주를 회수하여, 1200rpm, 5분간 원심 조작을 수행했다. 상기 원심 후, 침전된 세포를 새로운 분화 배지로 현탁한 후, 새로운 C3H10T1/2 피더세포 상에 2×105cells/2mL/웰이 되도록 파종했다(6웰 플레이트).
감염 18일째(계대):
BCL-xL 유전자를 도입한 후의 거핵구 자기증식주를 회수하여, 세포수를 계측한 후, 3×105cells/10mL/100mm dish가 되도록 파종했다.
감염 24일째(계대):
BCL-xL 유전자를 도입한 후의 거핵구 자기증식주를 회수하여, 세포수를 계측한 후, 1×105cells/10mL/100mm dish가 되도록 파종했다. 이후, 4-7일마다 동일한 방법으로 계대를 수행하고, 유지 배양을 수행했다. 아울러, 계대시에는, 새로운 분화 배지에 현탁한 후에 파종했다.
감염 24일째에 BCL-xL을 유전자 도입한 거핵구 자기증식주를 회수하여, 세포 1.0×105개당, 2μL의 항인간 CD41a-APC 항체(BioLegend사 제품), 1μL의 항인간 CD42b-PE 항체(eBioscience사 제품), 및 1μL의 항인간 CD235ab-Pacific Blue 항체(Anti-CD235ab-PB; BioLegend사 제품)를 이용하여 면역 염색한 후에, FACS Verse(상표)를 이용하여 해석했다. 그리고, 감염 24일째에서, CD41a 양성률이 50% 이상인 주를 불멸화 거핵구 세포주로 했다. 감염 후 24일 이상 증식할 수 있었던 이들 세포를, 불멸화 거핵구 세포주 SeV2-MKCL 및 NIH5-MKCL로 했다. 얻어진 SeV2-MKCL 및 NIH5-MKCL을, 10cm 디쉬(10mL/디쉬)에서 정치 배양했다. 배지는, IMDM을 기본 배지로 하여, 이하의 성분을 가했다(농도는 마지막 농도). 배양 조건은, 27℃, 5% CO2로 했다.
FBS(sigma사 제품, #172012, lot. 12E261) 15%
L-Glutamin(Gibco사 제품, #25030-081) 2mmol/L
ITS(Gibco사 제품, #41400-045) 100배 희석
MTG(monothioglycerol, sigma사 제품, #M6145-25ML) 450μmol/L
아스코르브산(sigma사 제품, #A4544) 50μg/mL
Puromycin(sigma사 제품, #P8833-100MG) 2μg/mL
SCF(와코준야쿠 가부시키가이샤 제품, #193-15513) 50ng/mL
TPO 유사 작용 물질 200ng/mL
(1-7) 거핵구의 배양물의 생산
DOX를 포함하지 않는 배지에서 배양함으로써 강제 발현을 해제했다. 구체적으로는, 상기 (1-6)의 방법으로 얻은 불멸화 거핵구 세포주(SeV2-MKCL 및 NIH5-MKCL)를, PBS(-)로 2회 세정하고, 하기 혈소판 생산 배지에 현탁했다. 세포의 파종 밀도는, 1.0×105cells/mL로 했다. 그리고, 상기 혈소판 생산 배지의 존재하에서 6일간 배양하여, 혈소판을 생성시킴으로써, 거핵구의 배양물을 생산시켰다. 또한, 상기 혈소판 생산 배지는, IMDM을 기본 배지로 하여, 이하의 성분을 가했다(농도는, 마지막 농도).
human plasma 5%
L-Glutamin(Gibco사 제품, #25030-081) 4mmol/L
ITS(Gibco사 제품, #41400-045) 100배 희석
MTG(monothioglycerol, sigma사 제품, #M6145-25ML) 450μmol/L
아스코르브산(sigma사 제품, #A4544) 50μg/mL
SCF(와코준야쿠 가부시키가이샤 제품, #193-15513) 50ng/mL
TPO 유사 작용 물질 200ng/mL
ADAM 저해제 15μmol/L
GNF351(Calbiochem사 제품, #182707) 500nmol/L
Y39983(Chemscene LLC사 제품, #CS-0096) 500nmol/L
Urokinase 5U/mL
저분자 heparin(SANOFI사 제품, 클렉산(Clexane)) 1U/mL
(1-8) 거핵구의 배양물의 농축
상기 (1-7)에서 얻어진 거핵구의 배양물로부터, 혈소판을 제조(정제)했다. 아울러, 동일한 정제를 2회 실시했다. 구체적으로는, 상기 (1-7)에서 얻어진 거핵구의 배양물에 대해, 배양물백에 도입했다. 그리고, 상기 배양물백에 대해, 도 1과 같이, 농축 시스템에 접속했다. 도 1에서, 세정 보존액백 1 및 2는, 세정 보존액을 포함한다. 상기 세정 보존액은, 비카네이트 수액(오오츠카세이야쿠 가부시키가이샤 제품)에 20% ACD 및 2.5% 인간 혈청 알부민을 첨가하고, NaOH로 pH 7.2로 조정한 것을 사용했다. 그리고, 하기 표 1에 따라, 중공사막(플라즈마 플로우 OP, 아사히카세이메디칼 가부시키가이샤(Asahi Kasei Medical Co., Ltd.) 제품)을 이용하여, 상기 거핵구의 배양물을 농축하고, 얻어진 거핵구의 배양물의 농축액을 저장백에 회수했다.
순서 개방 밸브 펌프 1(rpm) 펌프 2(rpm) 내용
1 2, 3, 4 - - 세정 보존액백 1로부터 세정 보존액 50mL를 도입
2 1, 3, 4 - - 세정 보존액백 1로부터 세정 보존액 50mL를 도입
3 5, 6 - 100 세정 보존액백 2로부터 세정 보존액 50mL를 도입
펌프 2를 1분간 작동
4 4, 7 50 - 세정 보존액백 1로부터 세정 보존액 50mL를 도입
펌프 1을 1분간 작동
5 1, 3, 6, 8 100 100 배양물을 중공사막에 도입
6 2, 3, 6, 8 100 100 농축물을 저장백에 도입
7 2, 3, 4 - - 세정 보존액백 1로부터 세정 보존액 50mL를 도입
8 4, 8 50 - 세정 보존액백 1로부터 세정 보존액 50mL를 도입
(1-9) 배양물의 원심 분리
먼저, 무균 접합 장치를 이용하여, ACP215 디스포저블 세트의 폐액백을 회수용백으로 치환했다. 상기 회수용백은, HICALIQ IVH백(Terumo사 제품, HC-B3006A)을 이용했다. 다음으로, 상기 거핵구의 배양물의 농축액에 대해 10% 양의 ACD-A액(Terumo사 제품)을 첨가했다. 상기 첨가 후, ACD-A액을 첨가한 농축액을, 세포백에 주입했다. 상기 세포백은, HICALIQ IVH백(Terumo사 제품, HC-B3006A)을 이용했다.
또한, 무균 접합 장치를 이용하여, ACD-A액을 첨가한 배양물을 포함하는 세포백을 ACP215 디스포저블 세트에 접합했다. 그리고, ACP215를 서비스 모드로 기동시키고, 회전수를 2500rpm(350×g)으로 세팅했다. ACP215를 스타트시키고, 상기 세포백 내의 배양물을 약 100mL/min으로 분리 볼(bowl)에 도입했다. 상기 분리 볼로부터 유출되는 액체 성분은, 회수백에 회수했다. 상기 세포백 내의 배양물 전량(全量)을 분리 볼에 도입한 후, 500mL의 세정 보존액을 상기 분리 볼에 더 도입했다. 상기 분리 볼에 상기 세정 보존액을 도입한 후, 원심을 멈추고 튜브 실러를 이용하여 회수액(혈소판을 포함하는 회수된 액체 성분)을 포함하는 회수백을 떼어냈다.
새로운 ACP215 디스포저블 세트에, 상기 무균 접합 장치를 이용하여 회수액(혈소판 포함)을 포함한 회수백을 접합했다. ACP215를 보통 모드로 기동시켰다. 프로그램 설정은 WPC를 선택하고, 기기의 지시에 따라, 상기 회수백을 접합한 ACP215 디스포저블 세트를 세팅했다. 아울러, 회수액을 포함한 회수백은 스탠드에 설치했다.
다음으로, ACP215의 원심 속도를 5000rpm(1398.8×g)으로 변경하고, 원심을 스타트시켰다. 상기 분리 볼에 상기 회수액이 도입되기 시작했을 때, 자동 주입에서 수동 주입으로 변경했다. 구체적으로는, 상기 회수액을 약 100mL/min의 도입 속도로 상기 분리 볼에 도입했다. 상기 회수액 전량을 분리 볼에 첨가한 후, 500mL의 세정 보존액을 더 추가했다.
(1-10) 배양물의 세정
세정은, ACP215의 프로그램에 따라, 2000mL의 상기 세정 보존액으로 세정했다.
(1-11)배양물의 회수
ACP215의 프로그램에 따라, 200mL의 세정 완료 배양물(혈소판 포함)을 혈소판 제제백에 회수했다.
(1-12)배양물의 분리
상기 혈소판 제제백에 대해, 상기 중공사막을 이용하여, 통상의 방법에 의해 혈소판을 분리하여, 회수용백에 회수했다.
[혈소판 보존액에의 비타민 C의 첨가]
(2-1) 혈소판 보존액의 조제
중탄산 링거액(비카네이트 수액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)(염화나트륨 5.84g/L, 염화칼륨 0.30g/L, 염화칼슘 수화물 0.22g/L, 염화마그네슘 0.20g/L, 탄산수소나트륨 2.35g/L, 및 시트르산나트륨 수화물 0.20g/L)에, 인간 혈청 알부민 제제(HSA; CSL Behring사 제품), 및, 혈액 보존액(ACD-A액; Terumo사 제품)(시트르산나트륨 수화물 2.20W/V%, 시트르산 수화물, 0.80W/V%, 및 포도당 2.20W/V%)을 가한 용액을 조제했다. 본 명세서에서는, 당해 용액을 '제1 세대 보존액'이라고도 한다. 또한, 제1 세대 보존액에 VC 제제(첨가제를 포함하는 주사 제제; 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품)를 가한 용액을 조제했다. 본 명세서에서는, 당해 용액을 'VC 첨가 보존액'이라고도 한다. 각 보존액에서의 상기 첨가제의 최종 농도를 이하의 표 2에 나타낸다. 또한, 보존액 모두 1M의 NaOH에 의해 pH 7.3±0.1이 되도록 조정하였으며, 사용시까지 1시간 이상 인큐베이팅했다(차광 아래, 실온, 5% CO2).
①제1 세대
보존액		 ②제1 세대
보존액		 ③VC 첨가
보존액		 ④VC 첨가
보존액		 ⑤VC 첨가
보존액
HSA
(w/v%)		 2.5% 2.5% 2.5% 2.5% 2.5%
ACD-A액
(v/v%)		 20% 10% 20% 20% 20%
VC 제제 - - 300mg/L 1000mg/L 3000mg/L
(2-2) 각 보존액을 이용한 혈소판 샘플의 제작
실시예 1에 의해 얻어진 배양물에 포함되는 혈소판의 농도를, FACS에 의해 측정했다. 필요량의 혈소판을 포함하는 배양물을 분취하여 ACD-A액(10v/v%) 및 PEG1(최종 농도 2μM; Cayman Chemical Company사 제품)을 첨가하고, 12분간 원심 분리(1200×g, 22℃)를 수행했다. 상청을 제거한 후에, 펠렛에 상기 (2-1)에서 조제한 보존액을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 0.3×109plts/mL). 각 현탁액을 24웰 플레이트에 파종하여 최장 5일간 수평 진탕 보존(차광 아래, 22도, 50rpm)한 후에, 이하의 (2-3) 및 (2-4)의 실험에 제공했다.
(2-3) 혈소판 샘플의 Annexin V 양성률
Annexin V는 혈소판의 열화(활성화)의 지표 중의 하나이며, 양성률이 높은 경우에는 혈소판이 열화되어 있거나, 또는 이상이 있다고 평가된다. 그리하여, 상기 (2-2)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 Annexin V 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
구체적으로는, 상기 (2-2)에 의해 얻어진 혈소판 샘플을 Annexin Buffer(Beckton Dickinson사 제품)로 500배 희석하여, 3개의 원심관에 분주했다(각각, 네거티브 컨트롤, 포지티브 컨트롤, 및 무자극 샘플). 네거티브 컨트롤 샘플에는 EDTA를, 포지티브 컨트롤 샘플에는 Ionomycin을 각각 첨가한 후에, 모든 샘플을 항CD41 항체(BioLegend사 제품) 및 Annexin V(Beckton Dickinson사 제품)에 의해 염색했다(차광 아래, 실온, 20분간). 염색 후에, Annexin Buffer를 가하여 신속히 FACS로 측정했다. 네거티브 컨트롤에서의 iPS 혈소판(CD41+ 분획) 내의 Annexin V 양성률을 1.0±0.1%로 하여, 무자극 샘플에서의 Annexin V 양성률을 산출했다.
결과를 도 2의 상단에 나타낸다(모두다, 5일간 보존 후 혈소판 샘플로부터 얻어진 결과). 혈소판(CD41+ 분획)의 Annexin V 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우에는 60.5±0.3∼64.4±0.1%이었던 것에 반해, VC 첨가 보존액을 이용했을 경우에는 53.9±2.1∼56.7±1.8%로서, VC 첨가에 의해 저하된다는 것이 명백해졌다. 이들 결과로부터, 300∼3000mg/L의 VC를 첨가함으로써, 혈소판 보존액의 혈소판 열화 억제 작용이 개선된다는 것이 명백해졌다.
(2-4) 혈소판 샘플의 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률
P-Selectin은 혈소판의 열화(활성화)의 지표 중의 하나이며, 무자극시의 P-Selectin 양성률이 높은 경우에는 혈소판이 열화 또는 이상이 있다고 평가된다. 그리하여, 상기 (2-2)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 P-Selectin 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
또한, 혈소판 기능의 보존 상태를 알기 위해, 혈소판 활성화제인 아데노신 2인산(ADP) 및 트롬빈 수용체 활성화 펩티드-6(TRAP-6)에 의해 각 혈소판 샘플을 자극했을 때의, PAC-1 및 P-Selectin 양성률을 조사했다(이하, ADP 및 TRAP-6의 조합을 'ATR'이라고 칭하는 경우가 있음).
구체적으로는, 상기 (2-2)에 의해 얻어진 혈소판 샘플을 Tyroad HEPES Buffer(THB)에 의해 500배 희석하여, 3개의 원심관에 분주했다(각각, 네거티브 컨트롤, 포지티브 컨트롤, 및 무자극 샘플). 포지티브 컨트롤 샘플에 ADP(Sigma사 제품, 최종 농도 20μM) 및 TRAP-6(BACHEM사 제품, 최종 농도 30μM)의 혼합액을 첨가하고, 자극 후의 포지티브 컨트롤 샘플 및 무자극 샘플을, 항CD41 항체(BioLegend사 제품), 항P-Selectin 항체(BioLegend사 제품), 및 항PAC-1 항체(Beckton Dickinson사 제품)에 의해 염색했다(차광 아래, 실온, 30분간). 또한, 네거티브 컨트롤 샘플은, 항CD41 항체(BioLegend사 제품), 항P-Selectin 항체의 아이소타입 컨트롤 항체(BioLegend사 제품), 및 항PAC-1 항체의 아이소타입 컨트롤 항체(BioLegend사 제품)으로 염색했다(차광 아래, 실온, 30분간). 염색 후의 샘플에 1% 파라포름알데히드를 가하여 고정하고(차광 아래, 4℃, 30분 이상), 그 후 24시간 이내에 FACS에 의해 P-Selectin 및/또는 PAC-1 양성률을 측정했다. 해석시에는, 네거티브 컨트롤 샘플에서의 iPS 혈소판(CD41+ 분획) 내의, P-Selectin 양성률 및 PAC-1 양성률이 1.0±0.1% 이하가 되도록 게이팅(gating)을 수행했다.
도 2의 중단에 무자극시의 P-Selectin 양성률을, 도 2의 하단에 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률을 각각 나타낸다(모두다, 5일간 보존 후 혈소판 샘플로부터 얻어진 결과). 무자극의 혈소판(CD41+ 분획)에서의 P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우에는 33.2±0.3∼45.6±1.2%이었던 것에 반해, VC 첨가 보존액을 이용했을 경우에는 13.0±0.2∼19.7±1.1%로서, VC 첨가에 의해 저하된다는 것이 명백해졌다. 또한, P-Selectin 양성률의 저하는, VC 첨가 농도에 의존하는 경향이 인정되었다. 이들 결과로부터, 300∼3000mg/L의 VC를 첨가함으로써, 혈소판 보존액의 혈소판 열화 억제 작용이 개선되는 것으로 나타났다.
또한, ATR 자극 후의 혈소판(CD41+ 분획)에서의 PAC-1/P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우에는 17.6∼20.8%이었던 것에 반해, VC 첨가 보존액을 이용했을 경우에는 23.9∼26.9%로서, VC 첨가에 의해 상승한다는 것이 명백해졌다. 이들 결과로부터, 300∼3000mg/L의 VC를 첨가함으로써, 혈소판 보존액의 혈소판 기능 유지 작용이 개선되는 것으로 나타났다.
[혈소판 보존액에의 VC 및 VB3의 첨가]
(3-1) 혈소판 보존액의 조제
VC 첨가 보존액에 니코틴산(니코틴산 주사 제제; 토아에이요사 제품)을 첨가한 용액을 조제했다. 아울러, 상술한 바와 같이, 본원 명세서에서, 'VB3'은 니코틴산 및/또는 니코틴아미드를 의미하지만, 실시예 3∼5, 및 8∼13에서는 VB3으로서 니코틴산이 사용되었으며, 실시예 6에서는 VB3으로서 니코틴산 또는 니코틴아미드가 사용되었다. 또한, 본 명세서에서는, VC 첨가 보존액에 VB3(니코틴산 또는 니코틴아미드)을 첨가한 용액을 'VC/VB3 첨가 보존액' 또는 '제2 세대 보존액'이라고도 한다. 각 보존액에서의, 상기 첨가제의 최종 농도는 이하의 표 3에 나타낸 바와 같다. 또한, 보존액 모두 1M의 NaOH에 의해 pH 7.3±0.1이 되도록 조정하였으며, 사용시까지 1시간 이상 인큐베이팅했다(차광 아래, 실온, 5% CO2).
제1 세대 보존액 VC 첨가 보존액 VC/VB3 첨가
보존액(제2 세대 보존액)
HSA
(w/v%)		 2.5% 2.5% 2.5%
ACD-A액(v/v%) 20% 20% 20%
VC - 1000mg/L 1000mg/L
니코틴산 - - 400mg/L
(3-2) 각 보존액을 이용한 혈소판 샘플의 제작
실시예 1에 기재된 방법에 의해 제작한 iPS 세포 유래 혈소판 제제에, 상기 (3-1)에서 조제한 보존액을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 0.3×109plts/mL). 각 현탁액을 즉시, 또는 24웰 플레이트에 파종하여 최장 5일간 수평 진탕 보존(차광 아래, 22도, 50rpm)한 후에, 이하의 (3-3) 내지 (3-5)의 실험에 제공했다.
(3-3) 혈소판 샘플의 Annexin V 양성률
실시예 2의 (2-3)에 기재된 방법에 의해, 상기 (3-2)에 의해 얻어진 혈소판 샘플(5일간 보존 후)에서의 Annexin V 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
결과를 도 3에 나타낸다. 혈소판(CD41+ 분획)의 Annexin V 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우에는 61.4±1.9%, VC 첨가 보존액을 이용했을 경우에는 46.3±0.7%, VC/VB3 첨가 보존액을 이용했을 경우에는 44.3±0.5%이었다. 이들 결과로부터, VC와 VB3을 조합하여 사용함으로써, VC뿐인 경우와 비교하여, 혈소판의 열화가 보다 강하게 억제된다는 것이 명백해졌다.
(3-4) 혈소판 샘플의 젖산 생성
보존 중인 혈소판 제제에서는 혐기적 대사에 의해 젖산이 생성되었으며, 젖산 농도의 상승에 따라 pH가 저하되고, 결과적으로 혈소판의 열화가 일어난다는 것이 알려져 있다. 그리하여, 상기 (3-2)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 젖산 농도를 측정하여, 각 보존액에 의한 젖산 생성 억제 작용을 조사했다.
구체적으로는, 상기 (3-2)에 의해 얻어진 혈소판 샘플(5일간 보존 후)을, 1.5mL 튜브에 넣어 원심 분리했다(1200×g, 22℃, 10분간). 상청을 회수하여 새로운 튜브에 넣고, 측정까지 -80℃에서 동결 보존했다. N-어세이 LLAC 닛토보(닛토보메디칼 가부시키가이샤(Nittobo Medical Co., Ltd.) 제품) 및 자동분석장치 7180(가부시키가이샤 히타치하이테크(Hitachi High-Technologies Corporation))을 이용하여, 상기 상청 내의 젖산 농도를 측정했다.
결과를 도 4에 나타낸다. 샘플 상청 내의 젖산 농도는, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우에는 0.35±0.01g/L, VC 첨가 보존액을 이용했을 경우에는 0.16±0.01g/L, VC/VB3 첨가 보존액을 이용했을 경우에는 0.13±0.01g/L이었다. 이들 결과로부터, VC와 VB3을 조합하여 사용함으로써, VC뿐인 경우와 비교하여, 보존 중인 혈소판에서의 혐기적 대사가 보다 강하게 억제된다는 것이 명백해졌다.
(3-5) 혈소판 샘플의 혈소판 회수율
보존시에서의 혈소판의 활성화는, 용기에의 부착이나, 응집 덩어리의 형성을 일으켜, 혈소판 회수율 저하의 원인이 된다고 여겨지고 있다. 그리하여, 상기 (3-2)에 의해 얻어진, 보존 전 및 보존 후의 혈소판 샘플에서의 혈소판 농도를 측정하여, 각 보존액에 의한 회수율의 변화를 조사했다.
구체적으로는, 상기 (3-2)에서 제작한 혈소판 샘플(보존 전, 및 5일간 보존 후)을 THB에 의해 500배 희석하여, TruCOUNT 튜브(Beckton Dickinson사 제품)에 분주했다. 항CD41 항체(BioLegend사 제품) 및 항CD42b 항체(BioLegend사 제품)에 의해 염색하고(차광 아래, 실온, 20분간), 재차 THB를 가한 후에 FACS로 측정했다. TruCOUNT 튜브의 비드 카운트값에 기초하여, CD41+ 세포(혈소판)의 농도를 산출했다. 각 혈소판 샘플에 대해, 보존 전의 혈소판 농도를 분모로 하고, 보존 후의 혈소판 농도를 분자로 하여, 회수율을 산출했다.
결과를 도 5에 나타낸다. 혈소판의 회수율은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우에는 102.0±4.2%, VC 첨가 보존액을 이용했을 경우에는 101.1±6.8%, VC/VB3 첨가 보존액을 이용했을 경우에는 99.9±3.9%이었다. 이들 결과로부터, VC 및/또는 VB3을 첨가해도, 회수율에 차이가 인정되지 않는다는 것이 명백해졌다.
[혈소판 보존액에의 VC 및 니코틴산의 첨가]
(4-1) 혈소판 보존액의 조제와, 혈소판 샘플의 제작
제1 세대 보존액(20%의 ACD-A액 포함)에, VC 제제(1000mg/L, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품)를 첨가하여, VC 첨가 보존액을 조제했다. 또한, 당해 VC 첨가 보존액에 니코틴산(400mg/L, 토아에이요사 제품)을 첨가하여, 제2 세대 보존액을 조제했다. 각 용액의 pH는 7.3±0.1이 되도록 조정했다. 이하의 표 4에, 본 실시예에서 사용한 제2 세대 보존액의 조성을 나타낸다.
MW 제2 세대 보존액 (mg/L)
NaCl 58.0 3953.68
KCl 75.0 203.10
CaCl2 ㆍ2H2O 147.0 148.94
MgCl2 95.2 135.40
시트르산 3나트륨 2수화물 294.1 4535.40
시트르산 1수화물 210.1 1600.00
NaHCO3 84.0 1590.95
NaOH 40.0 439.97
글루코스 180.0 4400.00
니코틴산(VB3) 123.1 400.00
비타민 C 176.1 1000.00
L-시스테인염산염 1수화물 175.6 8.00
피로아황산나트륨 190.1 8.00
벤질 알코올 108.1 120.00
알부민 25000
실시예 1에 기재된 방법에 의해 제작한 iPS 세포 유래 혈소판 제제에, 상기 보존액(제1 세대 보존액, VC 첨가 보존액, 또는 제2 세대 보존액)을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 1.0×109plts/mL). 각 현탁액을 즉시, 또는 혈액 보존백에 충전하여 5 혹은 10일간 수평 진탕 보존(차광 아래, 22℃, 50rpm)한 후에, 이하의 (4-2) 내지 (4-4)의 실험에 제공했다.
(4-2) 혈소판 샘플의 젖산 농도 및 pH
상기 (2-4)에서도 기술한 바와 같이, 보존 중인 혈소판 제제에서는 혐기적 대사에 의해 젖산이 생성되었으며, 그것이 pH 저하의 원인이 된다는 것이 알려져 있다. 본 실험에서는, 상기 (4-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 젖산 농도 및 pH를 측정하여, 각 보존액에 의한 젖산 생성 억제 작용을 조사했다.
구체적으로는, 상기 (4-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플(보존 전, 5일간 보존 후, 및 10일간 보존 후)을 1.5mL 튜브에 넣고, 세포 배양용 분석 장치 FLEX(Nova Biomedical사 제품)에 의해, 젖산 농도 및 pH를 측정했다.
결과를 도 6에 나타낸다. 도 6의 좌측 그래프에 나타낸 바와 같이, 젖산 농도는 어떠한 보존액을 이용했을 경우에도 시간 경과에 따라 상승하였으나, 제2 세대 보존액을 이용한 샘플에서는 상승 정도가 가장 낮았다. 또한, 도 6의 우측 그래프에 나타낸 바와 같이, pH는 어떠한 보존액을 이용했을 경우에도 시간 경과에 따라 저하되었으나, 제2 세대 보존액을 이용한 샘플에서는 저하 정도가 가장 낮았으며, 10일간 보존 후에도 중성으로 유지되었다.
(4-3) 혈소판 샘플의 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률
실시예 2의 (2-4)에서도 기술한 바와 같이, P-Selectin은 혈소판의 열화 마커로서 알려져 있으며, 또한, ATR(ADP/TRAP-6) 자극시의 PAC-1/P-Selectin은 혈소판의 반응성 마커로서 알려져 있다. 그리하여, 본 실험에서는, 실시예 2의 (2-4)에 기재된 방법에 의해, 상기 (4-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
도 7의 좌측에 무자극시의 P-Selectin 양성률을, 도 7의 우측에 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률을 각각 나타낸다. P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우, 보존 전(Day 1)이 18.0%이었던 것에 반해, 5일간 보존 후(Day 5)에는 33.0%, 10일간 보존 후(Day 10)에는 31.1%로 상승하였다. 한편, VC 첨가 보존액을 이용했을 경우, 5 및 10일간 보존 후의 P-Selectin 양성률 모두 제1 세대 보존액을 이용했을 경우와 비교하여 낮았으며, 각각 26.2%(Day 5) 및 24.4%(Day 10)이었다. 또한, 제2 세대 보존액을 이용했을 경우, 5 및 10일간 보존 후의 P-Selectin 양성률은, VC 첨가 보존액을 이용했을 경우보다 더 낮았으며, 각각 24.2%(Day 5) 및 19.3%(Day 10)이었다. 이상의 결과로부터, 제2 세대 보존액을 사용함으로써, 10일간 보존 후에도 혈소판의 열화가 억제된다는 것이 명백해졌다.
또한, ATR 자극 PAC-1/P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우, 보존 전(Day 1)에는 43.4%이었던 것에 반해, 5일간 보존 후(Day 5)에는 34.5%, 10일간 보존 후(Day 10)에는 5.9%로 급격히 저하되었다. 한편, VC 첨가 보존액, 또는 제2 세대 보존액을 이용했을 경우, ATR 자극 PAC-1/P-Selectin 양성률은, 5일간 보존 후(Day 5)에는 제1 세대 보존액을 이용했을 경우와 동일한 정도(각각, 35.9% 및 35.3%)였지만, 10일간 보존 후(Day 10)에는 제1 세대 보존액보다 현저히 높은 값을 나타냈다(각각, 19.4% 및 19.9%). 이상의 결과로부터, VC 첨가 보존액, 또는 제2 세대 보존액을 사용함으로써, 10일간 보존 후에도 혈소판의 반응성이 유지된다는 것이 명백해졌다.
(4-4) 혈소판 샘플의 혈소판 회수율
상기 (3-5)에 기재된 방법에 의해, 상기 (4-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 혈소판 농도 및 회수율을 측정했다.
결과를 도 8에 나타낸다. 제1 세대 보존액을 이용했을 경우의 혈소판 회수율은, 5일간 보존 후(Day 5)에는 85.4%, 10일간 보존 후(Day 10)에는 86.8%이었다. 한편, VC 첨가 보존액, 또는 제2 세대 보존액을 이용했을 경우에는, 10일간 보존 후(Day 10)에도 혈소판 회수율이 90% 이상이었다(각각, 90.0% 및 91.4%). 이들 결과는, VC 첨가 보존액, 또는 제2 세대 보존액을 사용함으로써, 보존시의 혈소판 활성화가 억제된다 라는 상기 (4-3)의 결과와 일치하는 것이다.
[혈소판 샘플의 응집능]
(5-1) 보존액 및 혈소판 샘플의 조제
실시예 3의 (3-1)에 기재된 방법에 의해, 제1 세대 보존액 및 제2 세대 보존액을 조제했다. 실시예 1에 기재된 방법에 의해 제작한 iPS 세포 유래 혈소판 제제에, 상기 보존액을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 1.0×109plts/mL). 각 현탁액을 즉시, 또는 혈액 보존백에 충전하여 5 혹은 10일간 수평 진탕 보존(차광 아래, 22도, 50rpm,)한 후에, 이하의 (5-2)의 실험에 제공했다.
(5-2) 혈소판 샘플의 응집능 측정
상기 (5-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플을 원심하여(1200×g, 실온, 10분간), 상청을 제거했다. 5% ACD-A를 포함하는 중탄산 링거액을 가하여, 세포 농도가 1.0×109plts/mL가 되도록 현탁했다. 얻어진 현탁액을 인간 혈장/CaCl2 용액(Cosmo Bio사 제품)에 의해 희석하고, 이하의 표 5에 나타낸 자극제를 첨가하여 자극했다. 자극 후의 각 샘플의 응집률을, 혈소판 응집능 측정 장치 PRP313M(TAIYO사 제품)에 의해 측정했다.
자극제명 최종 농도
TRAP-6 10μM
20μM
40μM
Collagen 2.5μg/mL
5μg/mL
10μg/mL
ADP 5μM
10μM
20μM
Collagen/ADP 2.5μg/mL, 5μM
5μg/mL, 5μM
도 9∼12에, 자극제로서 TRAP-6, Collagen, ADP, 및 Collagen/ADP를 이용한 결과를 각각 나타낸다. 제1 세대 보존액을 이용한 혈소판 샘플의 최대 응집률은, 어떠한 자극제를 이용했을 경우에도, 5∼10일간의 보존 중에 대폭 저하된다는 것이 명백해졌다(도 9∼12의 '종래 보존액(Day 10)'). 한편, 이러한 응집률의 급격한 저하는, 제2 세대 보존액을 이용한 혈소판 샘플에서는 인정되지 않았다(도 9∼12의 '신규 보존액(Day 10)'). 이상의 결과로부터, 제2 세대 보존액을 사용함으로써, 보존 중인 혈소판의 응집능(지혈능)을 10일 이상 유지할 수 있다는 것이 명백해졌다.
[보존액에의 니코틴산 또는 니코틴아미드의 첨가]
(6-1) 보존액 및 혈소판 샘플의 조제
제1 세대 보존액(20%의 ACD-A액 포함)에, VC(1000mg/L)와, 니코틴산(400mg/L; 후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤 제품) 또는 니코틴아미드(400mg/L; 후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤 제품)를 첨가하고, 1M NaOH를 이용하여 pH 7.3±0.1이 되도록 조정했다. 이하, 제1 세대 보존액에 VC 및 니코틴산을 첨가한 보존액을 '제2 세대 보존액(니코틴산)'이라고, 제1 세대 보존액에 VC 및 니코틴아미드를 첨가한 보존액을 '제2 세대 보존액(니코틴아미드)'이라고, 각각 칭하는 경우가 있다.
실시예 1에 기재된 방법에 의해 제작한 iPS 세포 유래 혈소판 제제에, 상기 보존액을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 0.3×109plts/mL). 각 현탁액을 즉시, 또는 24웰 플레이트에 파종하여 5일간 수평 진탕 보존(차광 아래, 22도, 50rpm)한 후에, 이하의 (6-2) 및 (6-3)의 실험에 제공했다.
(6-2) 혈소판 샘플의 Annexin V 양성률의 변화
실시예 2의 (2-3)에 기재된 방법에 의해, 상기 (6-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 Annexin V(열화 마커) 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
결과를 도 13의 상단에 나타낸다. 도면 중, 'Day 1'은 보존 전의 샘플을, '제1 세대', '제2 세대(니코틴산)', '제2 세대(니코틴아미드)'는 5일간 보존 후의 샘플을 각각 나타낸다. 혈소판(CD41+ 분획)의 Annexin V 양성률은, 니코틴산을 첨가한 보존액에서는 38.2±0.3%이었으며, 니코틴아미드를 첨가한 보존액에서는 38.5±0.3%이었다. 이들 값 모두, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우(53.1±0.4%)보다 낮았다. 이들 결과로부터, 넓게 비타민 B3(니코틴산 및/또는 니코틴아미드)에서도, 보존 중인 혈소판의 열화가 억제된다는 것이 명백해졌다.
(6-3) 혈소판 샘플의 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률에 미치는 각 보존액의 영향
실시예 2의 (2-4)에 기재된 방법에 의해, 상기 (6-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 무자극시의 P-Selectin(열화 마커) 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin(반응성 마커) 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
도 13의 중단에 무자극시의 P-Selectin 양성률을, 도 13의 하단에 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률을 각각 나타낸다. P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우, 보존 전(Day 1)의 11.6%에서 5일간 보존 후(Day 5)의 28.3±0.5%로 상승하였다. 한편, 니코틴산 또는 니코틴아미드를 첨가한 제2 세대 보존액을 이용했을 경우에는, 5일간 보존 후에도 9.4±0.2%∼10.6±0.2%로 낮게 억제되었다.
또한, ATR 자극 PAC-1/P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우에는 33.9±2.4%이었지만, 니코틴산 또는 니코틴아미드를 첨가한 제2 세대 보존액을 이용했을 경우에는 41.6±0.8%∼41.2±1.9%이었다. 이들 결과로부터, 니코틴산 또는 니코틴아미드에 의해 보존 중인 혈소판의 반응성이 유지된다는 것이 명백해졌다.
[보존액에의 VC 단독 첨가]
(7-1) 보존액 및 혈소판 샘플의 조제
상기 실시예 2∼6에서는, 'VC'로서 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품의 VC 제제를 이용했다. 당해 VC 제제에는, 피로아황산나트륨, L-시스테인염산염 1수화물 및 벤질알코올로 이루어지는 첨가물이 포함되어 있다는 점에서, 이들 첨가물이 실험 결과에 영향을 주지 않는지를, 이하의 실험에 의해 확인했다.
제1 세대 보존액(20%의 ACD-A액 포함)에, VC 시약(첨가제를 포함하지 않는 VC; 1000mg/L, 후지필름 와코준야쿠 가부시키가이샤 제품)을 첨가하고, pH 7.3±0.1이 되도록 조정했다. 이하, 이러한 보존액을 '제1 세대 보존액(VC 시약)'이라고 칭하는 경우가 있다. 실시예 1에 기재된 방법에 의해 제작한 iPS 세포 유래 혈소판 제제에, 상기 보존액을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 0.3×109plts/mL). 각 현탁액을 즉시, 또는 24웰 플레이트에 파종하여 5일간 수평 진탕 보존(차광 아래, 22도, 50rpm)한 후에, 이하의 (7-2) 및 (7-3)의 실험에 제공했다.
(7-2) 혈소판 샘플의 Annexin V 양성률
실시예 2의 (2-3)에 기재된 방법에 의해, 상기 (7-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 Annexin V(열화 마커) 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
결과를 도 14의 상단에 나타낸다(Day 1은 보존 전의 샘플을, 제1 세대 및 제1 세대 VC 시약은 5일간 보존 후의 샘플을 각각 나타낸다). 혈소판(CD41+ 분획)의 Annexin V 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우(53.1±0.4%)보다, 제1 세대 VC 시약을 이용했을 경우(38.9±0.4%) 쪽이 낮았다. 이들 결과로부터, VC만의 첨가(VB3을 포함하지 않음)에 의해, 보존 중인 iPS 유래 혈소판의 열화가 억제된다는 것이 명백해졌다.
(7-3) 혈소판 샘플의 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률
실시예 2의 (2-4)에 기재된 방법에 의해, 상기 (7-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 무자극시의 P-Selectin(열화 마커) 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin(반응성 마커) 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
도 14의 중단에 무자극시의 P-Selectin 양성률을, 도 14의 하단에 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률을 각각 나타낸다. 무자극시의 P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우(28.3±0.5%)보다, 제1 세대 VC 시약을 이용했을 경우(9.5±0.4%) 쪽이 낮았다. 이들 결과로부터, VC만의 첨가에 의해, 보존 중인 iPS 유래 혈소판의 열화가 억제된다는 것이 명백해졌다.
또한, ATR 자극 PAC-1/P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우(33.9±2.4%)보다, 제1 세대 VC 시약을 이용했을 경우(38.2±1.6%) 쪽이 높았다. 이들 결과로부터, VC 시약만의 첨가에 의해, 보존 중인 iPS 유래 혈소판의 반응성이 유지된다는 것이 명백해졌다. 즉, VC의 첨가 효과는, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품의 VC 제제에 포함되는 첨가제에 의한 것이 아니라는 것이 밝혀졌다.
[일본 적십자사 혈소판 세정액과의 비교]
(8-1) 보존액 및 혈소판 샘플의 조제
비카네이트 수액에, 이하의 표 6에 나타낸 첨가제를 첨가하여, 제2 세대 보존액을 조제했다. 또한, 이미 알려진 혈소판 보존액(일본 적십자사, 조사 세정 혈소판-LR '일본 적십자사'의 첨부 문서, 2016년 3월, 및, Japanese Journal of Transfusion and Cell Therapy, Vol. 59. No. 359(3):492-498, 2013)과 동일한 조성의 용액을 조제했다. 본 명세서에서는, 당해 이미 알려진 보존액을 '일본 적십자사 혈소판 세정액'이라고도 한다. 보존액 모두 1M의 NaOH에 의해 pH 7.3±0.1이 되도록 조정하였으며, 사용시까지 1시간 이상 인큐베이팅했다(차광 아래, 실온, 5% CO2). 실시예 1에 기재된 방법에 의해 제작한 iPS 세포 유래 혈소판 제제에, 상기 보존액을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 1.0×109plts/mL). 각 현탁액을 즉시, 또는 혈액 보존백에 충전하여 5일간 수평 진탕 보존(차광 아래, 22도, 50rpm)한 후에, 이하의 (8-2) 및 (8-3)의 실험에 제공했다.
제2 세대 보존액 일본 적십자사 혈소판 세정액
HSA
(w/v%)		 2.5% -
ACD-A액(v/v%) 20% 5%
VC 제제(사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품) 1000mg/L -
니코틴산
(토아에이요사 제품)		 400mg/L -
(8-2) 혈소판 샘플의 Annexin V 양성률
실시예 2의 (2-3)에 기재된 방법에 의해, 상기 (8-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 Annexin V(열화 마커) 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
결과를 도 15의 상단에 나타낸다('Day 1'은 보존 전의 샘플을, 'Day 5’는 5일간 보존 후의 샘플을 각각 나타낸다). 혈소판(CD41+ 분획)의 Annexin V 양성률은, 일본 적십자사 혈소판 세정액을 이용했을 경우(73.9%)보다, 제2 세대 보존액을 이용했을 경우(49.3%) 쪽이 낮았다. 이들 결과로부터, 제2 세대 보존액에 의해, 보존 중인 iPS 유래 혈소판의 열화가 억제된다는 것이 명백해졌다.
(8-3) 혈소판 샘플의 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률
실시예 2의 (2-4)에 기재된 방법에 의해, 상기 (8-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 무자극시의 P-Selectin(열화 마커) 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin(반응성 마커) 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
도 15의 중단에 무자극시의 P-Selectin 양성률을, 도 15의 하단에 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률을 각각 나타낸다. 무자극시의 P-Selectin 양성률은, 일본 적십자사 혈소판 세정액을 이용했을 경우(30.4%)보다, 제2 세대 보존액을 이용했을 경우(16.5%) 쪽이 낮았다. 이들 결과로부터, iPS 유래 혈소판의 보존에 있어서, 제2 세대 보존액은, 일본 적십자사 혈소판 세정액보다 우수한 열화 억제 효과를 발휘한다는 것이 명백해졌다.
또한, ATR 자극 PAC-1/P-Selectin 양성률은, 일본 적십자사 혈소판 세정액을 이용했을 경우(9.8%)보다, 제2 세대 보존액을 이용했을 경우(24.8%) 쪽이 높았다. 이들 결과로부터, iPS 유래 혈소판의 보존에 있어서, 제2 세대 보존액은, 일본 적십자사 혈소판 세정액보다 우수한 기능 유지 효과를 발휘한다는 것이 명백해졌다.
[혈소판 감소증 모델 마우스를 이용한 지혈 시험]
(9-1) 혈소판 샘플의 조제
실시예 1에 기재된 방법에 의해 제작한 iPS 세포 유래 혈소판 제제에, 제2 세대 보존액을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 1.0×109plts/mL). 각 현탁액을 즉시, 또는 혈액 보존백에 충전하여 수평 진탕 보존(차광 아래, 22도, 50rpm, 10일간)한 후에, 이하의 (9-2)의 실험에 제공했다.
(9-2) 지혈 시험
혈소판 감소증 모델 NOG 마우스의 꼬리정맥 내에, 상기 (9-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플을 투여했다(마우스 1마리당 200μL(2×108plts)). 투여 10분 후, 주사 바늘을 이용하여 배쪽 꼬리동맥에 절창(切創)을 만들었다. 절창은 1개체당 1개 부분으로 했다. 절창으로부터의 출혈을 확인한 후에, 절창 부분을 포함하는 꼬리 선단부를 37℃의 생리 식염수에 담그고, 지혈까지의 시간을 측정했다. 측정 시간은 최대 600초로 했다. 또한, 대조군(Vehicle)으로서, 제2 세대 보존액만(혈소판을 포함하지 않음)을 이용하여 동일한 시험을 수행했다.
결과를 도 16에 나타낸다. Vehicle 투여군에서는 모든 마우스에서, 600초간 이내에서의 지혈이 인정되지 않았다. 한편, 혈소판 투여군에서는, 지혈까지의 시간은 평균으로 391초였으며, 가장 짧은 개체에서는 130초였다. 이들 결과로부터, 본 발명의 제2 세대 보존액에 의해 보존된 iPS 세포 유래 혈소판이 지혈 효과를 갖는다는 것이 명백해졌다.
[인간 중간엽 줄기세포의 보존]
(10-1) 중간엽 줄기세포 보존액의 조제
젖산 링거액(락텍 수액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)에, 3% 트레할로스 및 5% 덱스트란을 첨가했다(이하, 이러한 용액을 'CSP-01 용액'이라고 칭하는 경우가 있다. 일본 특허출원공개 공보 제2012-115253호, 및 WO2014/208053 참조). 상기 CSP-01 용액에, VC 제제(1000mg/L, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품) 및 니코틴산(400mg/L, 토아에이요사 제품)을 가하여, 중간엽 줄기세포 보존액을 조제했다. 또한, CSP-01 용액에, VC 및 니코틴산 대신에 증류수(오오츠카 증류액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)를 가한 컨트롤 보존액을 조제했다.
(10-2) 중간엽 줄기세포의 보존
상기 (10-1)에 의해 조제한 보존액을 이용하여 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(Lonza사 제품)를 현탁했다(5×105세포/mL). 현탁액을 5℃에서 24, 48, 96, 및 168시간 정치한 후에, 현미경을 이용하여 전체 세포수 및 사(死)세포수를 계측했다. 각 시점에서의 세포 생존율(%) 및 생세포 회수율(%)을 이하의 식 1 및 2를 이용하여 산출했다.
[식 1]
세포 생존율(%)=(전체 세포수-사세포수)/전체 세포수×100
[식 2]
생세포 회수율(%)=각 시점의 생존 세포수/현탁 직후(보존 전)의 생존 세포수×100
결과를 도 1 7에 나타낸다. 컨트롤 보존액을 이용했을 경우, 세포 생존율 및 생세포 회수율은 48시간 보존 후에 급격히 저하된다는 것이 명백해졌다. 한편, VC 및 니코틴산 첨가 보존액을 이용했을 경우에는, 세포 생존율 및 생세포 회수율의 대폭적인 저하는 인정되지 않았으며, 168시간 후에도 보존 전과 동일한 정도로 유지된다는 것이 명백해졌다. 이들 결과로부터, VC 및 니코틴산은, 중간엽 줄기세포의 보존에 있어서도 우수한 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
[iPS 세포 유래 거핵구의 보존]
(11-1) iPS 세포 유래 거핵구의 조제
실시예 1에 의해 얻어진 배양물에 포함되는 혈소판의 농도를, FACS에 의해 측정했다. 필요량의 배양물을 분취하여 ACD-A액(10v/v%) 및 PEG1(마지막 농도 2μM; Cayman Chemical Company사 제품)을 첨가하고, 12분간의 원심 분리(1200×g, 22℃, 브레이크 최소)를 수행했다. 상청을 제거한 후에, 펠렛에 제1 세대 또는 제2 세대 보존액을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 1.3×109plts/mL). 각 현탁액을 즉시, 또는 혈액 보존백에 충전하여 5 또는 10일간 수평 진탕 보존(차광 아래, 22도, 50rpm)한 후에, 이하의 (11-2)의 실험에 제공했다.
(11-2) 거핵구 샘플의 Annexin V 음성률
Annexin V는, 아포토시스(apoptosis) 세포에서의 세포막의 변화(포스파티딜 세린의 세포막 외측으로의 표출)을 검출하는 프로브로서도 알려져 있다. 그리하여, 상기 (11-1)에 의해 얻어진 거핵구 샘플에서의 Annexin V 음성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 거핵구의 아포토시스 억제 효과를 조사했다.
구체적으로는, 상기 (11-1)에 의해 얻어진 거핵구 샘플(거핵구 및 혈소판을 포함하는 배양물)을 Annexin Buffer(Beckton Dickinson사 제품)로 500배 희석하여, 3개의 원심관에 분주했다(각각, 네거티브 컨트롤, 포지티브 컨트롤, 및 무자극 샘플). 네거티브 컨트롤 샘플에는 EDTA를, 포지티브 컨트롤 샘플에는 Ionomycin을 각각 첨가한 후에, 모든 샘플을 항CD41 항체(BioLegend사 제품) 및 Annexin V(Beckton Dickinson사 제품)에 의해 염색했다(차광 아래, 실온, 20분간). 염색 후에, Annexin Buffer를 가하여 신속히 FACS로 측정했다. 얻어진 FSC(전방 산란광) 및 SSC(측방 산란광)의 값에 기초하여 혈소판과 거핵구를 구분했다. 그리고, 네거티브 컨트롤에서의 iPS 혈소판(CD41+ 분획) 내의 Annexin V 양성률을 1.0±0.1%로 하여, 무자극 샘플에서의 거핵구의 Annexin V 음성률을 산출했다.
결과를 도 18에 나타낸다('Day 1'은 보존 전의 샘플을, 'Day 5’는 5일간 보존 후의 샘플을, 'Day 10'은 10일간 보존 후의 샘플을 각각 나타낸다). Annexin V 음성률은, 제1 세대 보존액을 이용한 샘플에서도, 제2 세대 보존액을 이용한 샘플에서도, 시간 경과에 따라 저하되었다. 그러나, 제2 세대 보존액을 이용했을 경우에는, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우보다, Annexin V 음성률의 저하가 억제된다는 것이 명백해졌다. 이들 결과로부터, 제2 세대 보존액을 이용한 샘플에서는, 아포토시스를 일으키지 않는, 세포막이 안정적인 생세포가 보다 높은 비율로 포함되는 것으로 나타났다. 따라서, 본 실시예에 의해, 제2 세대 보존액이 iPS 세포 유래 거핵구의 보존에도 효과적인 것으로 나타났다.
[T 세포의 보존]
(12-1) T 세포 보존액의 조제
젖산 링거액(락텍 수액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)에 3% 트레할로스를 첨가했다(이하, 이러한 용액을 'CSP-11 용액'이라고 칭하는 경우가 있음). 상기 CSP-11 용액에, VC 제제(1000mg/L, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품) 및/또는 니코틴산(400mg/L, 토아에이요사 제품)을 가하여, 이하의 4종류의 T 세포 보존액을 조제했다.
CSP-11
CSP-11+VC
CSP-11+니코틴산
CSP-11+VC+니코틴산
(12-2) T 세포의 보존
시판 중인 동결 CD8 양성 T 세포(Veritas사 제품)를 융해하여, 림프구 배양 배지(LGM3, Lonza사 제품)로 세정한 후에, 약 1시간 인큐베이팅했다(37℃, 5% CO2). 필요량의 CD8 양성 T 세포를 분취하여, 10분간의 원심 분리(300×g, 실온)를 수행했다. 상청을 제거한 후에, TLY CULTURE 키트25(GC Lymphotec사 제품)를 이용하여 세포를 부유시키고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 증식시켰다(T 세포 농도: 약 1.1×106cells/5ml). 확대 배양 개시로부터 7일 후에, CSP-11 용액으로 세포를 세정하여, 스템풀(stemfull) 튜브(스미토모 베이크라이트 가부시키가이샤(Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) 제품)에 분주하고, 10분간의 원심 분리(300×g, 실온)를 수행했다. 상청을 제거한 후에, 상기 (12-1)에서 조제한 보존액을 가하여 현탁했다(T 세포 농도: 약 5×105cells/1ml). 각 스템풀 튜브로부터 20μL의 세포 현탁액을 분취하여, 20μL 트리판 블루(gibco사 제품)를 혼합하고, 원셀 카운터(One Cell Counter)(바이오메디컬 사이언스사 제품)를 이용하여 생존율을 측정했다(1개 부분의 세포 계수부의 네 모퉁이의 세포 계수실의 에리어의 합계 세포수 및 사세포수를 계측했다). 또한, 상기 세포 현탁액을 5℃에서 48시간 보존한 후에, 동일하게 생존율을 측정했다.
결과를 도 19에 나타낸다. 보존 전의 생존율은, 각 보존액 사이에 차이가 인정되지 않았다(도 19). 한편, 48시간 보존 후에는, VC 단독, 또는 VC 및 니코틴산을 첨가한 보존액을 이용한 쪽이, 생존율이 유의미하게 높다는 것이 명백해졌다(도 19). 또한, VC 단독과 비교하여, VC 및 니코틴산을 첨가한 보존액을 이용한 쪽이, 유의미하게 높은 생존율을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 보존액은 T 세포의 냉장 보존에도 효과적인 것으로 나타났다.
[T 세포의 보존]
(13-1) T 세포 보존액의 조제
CSP-01 용액에, VC 제제(1000mg/L, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품), 니코틴산(400mg/L, 토아에이요사 제품), 및/또는 글루코스(80mg/dL, 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)를 가하여, 이하의 4종류의 T 세포 보존액을 조제했다.
CSP-01
CSP-01+VC+니코틴산
CSP-01+글루코스
CSP-01+글루코스+VC+니코틴산
(13-2) T 세포의 보존
시판 중인 동결 CD8 양성 T 세포(Veritas사 제품)를 융해하여, 림프구 배양 배지(LGM3, Lonza사 제품)로 세정한 후에, 약 6시간 인큐베이팅했다(37℃, 5% CO2). 필요량의 CD8 양성 T 세포를 분취하여, 10분간의 원심 분리(300×g, 실온)를 수행했다. 상청을 제거한 후에, TLY CULTURE 키트25(GC Lymphotec사 제품)를 이용하여 세포를 부유시키고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 증식시켰다(T 세포 농도: 약 1.2×106cells/5ml). 확대 배양 개시로부터 6일 후에, 3% 트레할로스 함유 젖산 링거액으로 세포를 세정하여, 스템풀 튜브(스미토모 베이크라이트 가부시키가이샤 제품)에 분주하고, 10분간의 원심 분리(300×g, 실온)를 수행했다. 상청을 제거한 후에, 상기 (12-1)에서 조제한 보존액을 가하여 현탁했다(T 세포 농도: 약 5×105cells/1ml). 각 스템풀 튜브로부터 20μL의 세포 현탁액을 분취하여, 20μL 트리판 블루(gibco사 제품)를 혼합하고, 원셀 카운터(바이오메디컬 사이언스사 제품)를 이용하여 생존율을 측정했다(1개 부분의 세포 계수부의 네 모퉁이의 세포 계수실의 에리어의 합계 세포수 및 사세포수를 계측했다). 또한, 상기 세포 현탁액을 5℃에서 24 또는 48시간 보존한 후에, 동일하게 생존율을 측정했다. 얻어진 각 시점에서의 생존율로부터, 이하의 식 3을 이용하여 생세포 회수율을 산출했다.
[식 3]
생세포 회수율(%)=(보존 후의 생세포수)÷(보존 전의 생세포수)×100
결과를 도 20에 나타낸다. 보존 전의 생존율은, 각 보존액 사이에 차이가 인정되지 않았다(도 20의 좌측 그래프). 한편, 24 및 48시간 보존 후에는, VC 및 니코틴산을 첨가한 보존액을 이용한 쪽이, 생존율 및 생세포 회수율이 높다는 것이 명백해졌다(도 20의 중앙 및 우측 그래프). 따라서, 본 발명의 보존액은 T 세포의 냉장 보존에도 효과적인 것으로 나타났다. 또한, VC 및 니코틴산에 더해, 글루코스를 첨가함으로써, 생존율 및 생세포 회수율이 향상되는 경향이 있다는 것이 명백해졌다.
[VB2에 의한 저해 작용]
(14-1) 수용성 비타민군을 첨가한 보존액의 조제
제1 세대 보존액(20%의 ACD-A액 포함)에, 수용성 비타민군(B1, VB2, VB3, VB5, VB6, VB7, VB9, VB12, 및 VC)을 첨가했다(이하, 이러한 보존액을 '제1 세대+수용성 비타민'이라고 칭하는 경우가 있음). 또한, 제1 세대 보존액(20%의 ACD-A액 포함)에, 상기 수용성 비타민군에서 VB2를 제외한 군(B1, VB3, VB5, VB6, VB7, VB9, VB12, 및 VC)을 첨가했다(이하, 이러한 보존액을 '제1 세대+수용성 비타민(VB2 제외)'이라고 칭하는 경우가 있음). 보존액 모두, 1M NaOH를 이용하여 pH 7.3±0.1이 되도록 조정했다.
실시예 1에 기재된 방법에 의해 제작한 iPS 세포 유래 혈소판 제제에, 상기 보존액을 가하고, 균일한 현탁액이 되도록 부드럽게 현탁했다(혈소판 농도: 약 0.3×109plts/mL). 각 현탁액을 즉시, 또는 24웰 플레이트에 파종하여 5일간 수평 진탕 보존(차광 아래, 22도, 50rpm)한 후에, 이하의 (13-2) 내지 (13-3)의 실험에 제공했다.
(14-2) 혈소판 샘플의 Annexin V 양성률의 변화
실시예 2의 (2-3)에 기재된 방법에 의해, 상기 (14-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 Annexin V(열화 마커) 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
결과를 도 21에 나타낸다. 도면 중, 'Day 1'은 보존 전의 샘플을, 'Day 5’는 5일간 보존 후의 샘플을 각각 나타낸다. 5일간 보존 후의 혈소판(CD41+ 분획)의 Annexin V 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우에는, 52.0%이었던 것에 반해, 수용성 비타민군을 첨가한 보존액에서는 43.0%로 저하되었다. 또한, Annexin V 양성률은, 수용성 비타민군(VB2 제외)을 첨가한 보존액에서는 더욱더 저하되었으며, 40.3%이었다. 이들 결과로부터, VC 및 VB3에 의한 혈소판 열화 억제 효과가, VB2에 의해 저해될 가능성이 나타났다.
(14-3) 혈소판 샘플의 무자극시의 P-Selectin 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률에 미치는 각 보존액의 영향
실시예 2의 (2-4)에 기재된 방법에 의해, 상기 (14-1)에 의해 얻어진 혈소판 샘플에서의 무자극시의 P-Selectin(열화 마커) 양성률, 및 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin(반응성 마커) 양성률을 측정하여, 각 보존액에 의한 혈소판의 열화 억제 효과를 조사했다.
도 22의 좌측에 무자극시의 P-Selectin 양성률을, 도 22의 우측에 ATR 자극시의 PAC-1/P-Selectin 양성률을 각각 나타낸다. P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우, 보존 전(Day 1)의 27.4%에서 5일간 보존 후(Day 5)의 42.9%로 상승하였다. 한편, 5일간 보존 후의 P-Selectin 양성률은, 수용성 비타민군을 첨가한 보존액을 이용했을 경우에는 34.9%로 낮게 억제되었으며, 수용성 비타민군(VB2 제외)을 첨가한 보존액을 이용했을 경우에는 24.0%로 더욱더 낮게 억제되었다.
또한, ATR 자극 PAC-1/P-Selectin 양성률은, 제1 세대 보존액을 이용했을 경우, 보존 전(Day 1)의 35.6%에서 5일간 보존 후(Day 5)의 32.4%로 저하되었다. 한편, 수용성 비타민군을 첨가한 보존액을 이용했을 경우에는, 5일간 보존 후에도 36.8%이었다. 또한, 수용성 비타민군(VB2 제외)을 첨가한 보존액을 이용했을 경우에는, 5일간 보존 후에 43.0%로 상승한다는 것이 명백해졌다. 이들 결과로부터, VC 및 VB3에 의한 혈소판 기능 유지 효과가, VB2에 의해 저해될 가능성이 나타났다.
[인간 중간엽 줄기세포의 장기 보존]
(15-1) 중간엽 줄기세포 보존액의 조제
실시예 10의 (10-1)의 기재에 따라 CSP-01 용액을 조제했다. 이러한 CSP-01 용액에, VC 제제(1000mg/L, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품) 및 니코틴산(400mg/L, 토아에이요사 제품)을 가하여, 중간엽 줄기세포 보존액을 조제했다. 또한, CSP-01 용액에, VC 및 니코틴산 대신에, 용매인 증류수(오오츠카 증류액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)를 가한 컨트롤 보존액을 조제했다.
(15-2) 중간엽 줄기세포의 보존
상기 (15-1)에 의해 조제한 보존액을 이용하여 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포(Lonza사 제품)를 현탁했다(5×105세포/mL). 현탁액을 5℃에서, 1, 2, 4, 7, 14, 21, 28, 35 및 63일간 정치한 후에, 현미경을 이용하여 전체 세포수 및 사세포수를 계측했다. 각 시점에서의 세포 생존율(%) 및 생세포 회수율(%)은, 실시예 10의 (10-2)에 기재된 식 1 및 2를 이용하여 산출했다.
결과를 도 23에 나타낸다. 컨트롤 보존액(도면 중에서는 '+용매')을 이용했을 경우, 세포 생존율 및 생세포 회수율은 2일간의 보존 후에 급격히 저하된다는 것이 명백해졌다. 한편, VC 및 니코틴산 첨가 보존액(도면 중에서는 '+VC+니코틴산')을 이용했을 경우에는, 세포 생존율 및 생세포 회수율의 급격한 저하는 인정되지 않았으며, 35일 후에도 보존 전과 동일한 정도로 유지된다는 것이 명백해졌다. 또한, VC 및 니코틴산 첨가 보존액을 이용했을 경우에는, 컨트롤 보존액과 비교하여, 63일간 보존 후에도 세포 생존율 및 생세포 회수율이 유의미하게 높은 것으로 나타났다. 이들 결과로부터, VC 및 니코틴산은, 중간엽 줄기세포의 장기간의 보존에 있어서도 우수한 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
[인간 중간엽 줄기세포의 장기 보존]
(16-1) 중간엽 줄기세포 보존액의 조제
CSP-01 용액 또는 젖산 링거액(락텍 수액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)에, VC 제제(1000mg/L, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품) 및 니코틴산(400mg/L, 토아에이요사 제품)을 가하여, 이하의 4종의 중간엽 줄기세포 보존액을 조제했다.
CSP-01
CSP-01+VC+니코틴산
젖산 링거액
젖산 링거액+VC+니코틴산
(16-2) 중간엽 줄기세포의 보존
상기 (16-1)에 의해 조제한 보존액을 이용하여 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(Lonza사 제품)를 현탁했다(5×105세포/mL). 현탁액을 5℃에서 7, 14, 21 및 28일간 정치한 후에, 현미경을 이용하여 전체 세포수 및 사세포수를 계측했다. 각 시점에서의 세포 생존율(%) 및 생세포 회수율(%)은, 실시예 10의 (10-2)에 기재된 식 1 및 2를 이용하여 산출했다.
결과를 도 24에 나타낸다. CSP-01 또는 젖산 링거액만을 이용했을 경우에는, 세포 생존율 및 생세포 회수율은 7일간 보존 후의 시점에서 현저히 저하되었다. 한편, VC 및 니코틴산을 첨가한 보존액을 이용했을 경우에는, 세포 생존율 및 생세포 회수율의 저하가 억제된다는 것이 명백해졌다. 특히, CSP-01+VC+니코틴산을 이용했을 경우에는, 28일간 보존 후에도, 세포 생존율 및 생세포 회수율 모두 높게 유지된다는 것이 명백해졌다. 또한, 젖산 링거액+VC+니코틴산을 이용했을 경우에는, 14일간 보존 후에도, 세포 생존율 및 생세포 회수율 모두 높게 유지된다는 것이 명백해졌다. 이들 결과로부터, VC 및 니코틴산은, 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포의 장기 보존에 있어서도 우수한 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
[인간 중간엽 줄기세포의 장기 보존]
(17-1) 중간엽 줄기세포 보존액의 조제
CSP-01 용액에, VC 제제(1000mg/L, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품) 및/또는 니코틴산(400mg/L, 토아에이요사 제품)을 가하고, 탄산수소나트륨 제제(Meylon 정주(靜注) 8.4%, 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)를 더 가하여 pH를 7.0∼7.3으로 조정했다. 또한, 컨트롤 보존액으로서, CSP-01 용액에, 탄산수소나트륨 제제(Meylon 정주 8.4%, 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)를 가하여 pH를 7.0∼7.3으로 조정했다. 이상과 같은 방식으로, 이하의 4종의 중간엽 줄기세포 보존액을 조제했다.
CSP-01
CSP-01+VC
CSP-01+니코틴산
CSP-01+VC+니코틴산
(17-2) 중간엽 줄기세포의 보존
상기 (17-1)에 의해 조제한 보존액을 이용하여 인간 지방 유래 중간엽 줄기세포(Lonza사 제품)를 현탁했다(5×105세포/mL). 현탁액을 5℃에서 7, 14, 21 및 28일간 정치한 후에, 현미경을 이용하여 전체 세포수 및 사세포수를 계측했다. 각 시점에서의 세포 생존율(%) 및 생세포 회수율(%)은, 실시예 10의 (10-2)에 기재된 식 1 및 2를 이용하여 산출했다.
결과를 도 25에 나타낸다. CSP-01+니코틴산을 이용했을 경우, 세포 생존율 및 생세포 회수율은 컨트롤(CSP-01)과 마찬가지로 직선적으로 저하되었다. 한편, CSP-01+VC를 이용했을 경우에는, 세포 생존율 및 생세포 회수율의 저하가 유의미하게 억제되었다. 또한, CSP-01+VC+니코틴산을 이용했을 경우에는, 세포 생존율 및 생세포 회수율이 보다 현저히 개선되었다. 이들 결과로부터, 중간엽 줄기세포의 장기 보존에 있어서, VC는 단독으로도 효과적이지만, VC와 니코틴산을 병용함으로써, 더욱더 우수한 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
[새끼돼지 골수 중간엽 줄기세포의 보존]
(18-1) 중간엽 줄기세포 보존액의 조제
CSP-01 용액에, VC 제제(1000mg/L, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품) 및 니코틴산(400mg/L, 토아에이요사 제품)을 가하여, 중간엽 줄기세포 보존액(CSP-01+VC+니코틴산)을 조제했다. 또한, 컨트롤 보존액으로서, CSP-01 용액만을 이용했다.
(18-2) 중간엽 줄기세포의 보존
Nishimura 외(Xenotransplantation. 2019 May; 26(3): e12501.) 방법에 따라, 새끼돼지 골수 유래 중간엽 줄기세포(np 중간엽 줄기세포)를 제작했다. 이러한 np 중간엽 줄기세포를, 상기 (18-1)에 의해 조제한 보존액을 이용하여 현탁했다(5×105세포/mL). 현탁액을 5℃에서 7, 14, 21 및 28일간 정치한 후에, 현미경을 이용하여 전체 세포수 및 사세포수를 계측했다. 각 시점에서의 세포 생존율(%) 및 생세포 회수율(%)은, 실시예 10의 (10-2)에 기재된 식 1 및 2를 이용하여 산출했다.
결과를 도 26에 나타낸다. CSP-01+VC+니코틴산을 이용했을 경우에는, 컨트롤(CSP-01)과 비교하여, 모든 보존 기간에서 np 중간엽 줄기세포의 생존율 및 생세포 회수율이 개선되었다. 또한, CSP-01+VC+니코틴산에 의해, 28일간 보존 후에도 np 중간엽 줄기세포의 생존율 및 생세포 회수율이 높게 유지된다는 것이 명백해졌다. 이들 결과로부터, VC 및 니코틴산을 첨가한 보존액은, np 중간엽 줄기세포의 보존에 있어서도 우수한 효과를 발휘하는 것으로 나타났다.
[T 세포의 보존]
(19-1) T 세포 보존액의 조제
젖산 링거액(락텍 수액; 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)에, VC 제제(1000mg/L, 사와이세이야쿠 가부시키가이샤 제품), 니코틴산(400mg/L, 토아에이요사 제품), 및/또는 글루코스(80mg/dL, 오오츠카세이야쿠코죠 가부시키가이샤 제품)를 가하여, 이하의 8종류의 T 세포 보존액을 조제했다.
LR
LR+글루코스
LR+VC
LR+니코틴산
LR+VC+니코틴산
LR+VC+글루코스
LR+니코틴산+글루코스
LR+VC+니코틴산+글루코스
(19-2) T 세포의 보존
시판 중인 동결 CD8 양성 T 세포(Veritas사 제품)를 융해하여, 림프구 배양 배지(LGM3, Lonza사 제품)로 세정한 후에, 1시간 인큐베이팅했다(37℃, 5% CO2). 필요량의 CD8 양성 T 세포를 분취하여, 10분간의 원심 분리(300×g, 실온)를 수행했다. 상청을 제거한 후에, TLY CULTURE 키트25(GC Lymphotec사 제품)를 이용하여 세포를 부유시키고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 증식시켰다(T 세포 농도: 약 8×105cells/5ml). 확대 배양 개시로부터 7일 후에, PBS(-)로 세포를 세정하여, 스템풀 튜브(스미토모 베이크라이트 가부시키가이샤 제품)에 분주하고, 10분간의 원심 분리(300×g, 실온)를 수행했다. 상청을 제거한 후에, 상기 (19-1)에서 조제한 보존액을 가하여 현탁했다(T 세포 농도: 약 5×105cells/1ml). 상기 세포 현탁액을 5℃에서 24시간 보존한 시점, 및, 그 후 25℃에서 6시간 더 보존한 시점(합계 30시간 보존 후)에서, 현미경을 이용하여 전체 세포수 및 사세포수를 계측했다. 각 시점에서의 세포 생존율(%) 및 생세포 회수율(%)은, 실시예 10의 (10-2)에 기재된 식 1 및 2를 이용하여 산출했다.
보존 후의 T 세포 생존율을 도 27에 나타낸다. 도 27의 상측 그래프에 나타낸 바와 같이, 5℃에서 24시간 보존 후의 생존율은, LR 보존액과 비교하여, VC 첨가 보존액(LR+VC, LR+VC+니코틴산, LR+VC+글루코스, 및 LR+VC+니코틴산+글루코스)을 이용했을 경우에 유의미하게 상승한다는 것이 명백해졌다. 또한, 도 27의 하측 그래프에 나타낸 바와 같이, 5℃에서 24시간+25℃에서 6시간 보존 후의 생존율은, LR 보존액과 비교하여, VC 및 글루코스 첨가 보존액(LR+VC+글루코스, 및 LR+VC+니코틴산+글루코스)을 이용했을 경우에 유의미하게 상승하였으며, 또한, VC 및 니코틴산 첨가 보존액(LR+VC+니코틴산)을 이용했을 경우에 상승 경향이 인정되었다.
보존 후의 T 세포의 생세포 회수율을 도 28에 나타낸다. 도 28의 상측 그래프에 나타낸 바와 같이, 5℃에서 24시간 보존 후의 생세포 회수율은, LR 보존액과 비교하여, VC 첨가 보존액(LR+VC, LR+VC+니코틴산, LR+VC+글루코스, 및 LR+VC+니코틴산+글루코스)을 이용했을 경우에 유의미하게 상승한다는 것이 명백해졌다. 그 중에서도, VC와 글루코스를 조합하여 첨가한 보존액(LR+VC+글루코스, 및 LR+VC+니코틴산+글루코스)에 있어서, 보다 현저한 생세포 회수율 개선 작용이 인정되었다. 또한, 도 28의 하측 그래프에 나타낸 바와 같이, 5℃에서 24시간+25℃에서 6시간 보존 후의 생세포 회수율은, LR 보존액과 비교하여, VC 및 글루코스 첨가 보존액(LR+VC+글루코스, 및 LR+VC+니코틴산+글루코스)을 이용했을 경우에 유의미하게 상승하였으며, 또한, VC 및 니코틴산 첨가 보존액(LR+VC+니코틴산)을 이용했을 경우에 상승 경향이 인정되었다.
이상의 결과로부터, T 세포를 5℃에서 보존한 후에, 25℃로 온도를 변화시켜 더 보존한다 라는, 실제로 T 세포 이식을 상정한 조건에서는, VC 및 니코틴산의 조합의 사용에 의해, 각각을 단독으로 사용하는 것보다, 생존율 및 생세포 회수율이 함께 향상되는 것으로 나타났다. 또한, VC 및 글루코스를 조합하여 사용함으로써, 생존율 및 생세포 회수율이 보다 향상된다는 것이 명백해졌다.
본 발명에 의하면, 혈소판의 기능을 유지한 채 적어도 10일간 진탕 보존하는 것이 가능하기 때문에, 질환이나 창상 치료를 위한 혈소판 제제의 제작에 유용하다. 또한, 본 발명에 의하면, 중간엽 줄기세포, 거핵구, T 세포 등의 비동결 보존에 있어서도, 장기간의 보존이 가능해지기 때문에, 재생 의료 등에서의 이식 의료 분야나 암 치료 분야에서 유용하다.

Claims (51)

  1. 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제를 포함하는, 포유동물 세포의 보존액.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항산화제가, 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염인, 보존액.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 1∼10000mg/L인, 보존액.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 30∼3000mg/L인, 보존액.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 120∼1200mg/L인, 보존액.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 1∼10000mg/L인, 보존액.
  7. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 30∼6000mg/L인, 보존액.
  8. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 300∼3000mg/L인, 보존액.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포를 0∼40℃에서 보존하기 위한, 보존액.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    비타민 B2 혹은 그 유도체 또는 그들의 염을 포함하지 않는, 보존액.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가, 혈소판 또는 거핵구인, 보존액.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 혈소판이, 이하의 (A) 및 (B)를 포함하는 방법에 의해 얻어진 정제 혈소판인, 보존액.
    (A) 거핵구의 배양물을 농축하는 농축 공정;
    (B) 얻어진 농축물로부터 혈소판을 원심 분리하는 원심 분리 공정;
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    알부민을 더 포함하는, 보존액.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 알부민의 농도가, 1.25∼10%(w/v)인, 보존액.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    당을 더 포함하는, 보존액.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 당이, 포도당인, 보존액.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈소판 또는 거핵구를, 5∼10일간 보존하기 위한, 보존액.
  18. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가, 줄기세포 또는 면역세포인, 보존액.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 줄기세포가, 중간엽 줄기세포인, 보존액.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 면역세포가, T 세포인, 보존액.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제를 등장액 내에 포함하는, 보존액.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 등장액이, 젖산 링거액인, 보존액.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    트레할로스를 더 포함하는, 보존액.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    덱스트란을 더 포함하는, 보존액.
  25. 제18항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기세포를, 1∼63일간 보존하기 위한, 보존액.
  26. 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제를 포함하는, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항의 보존액을 조제하기 위한, 분말 제제.
  27. 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염, 및 항산화제를 포함하는 액 내에서, 포유동물 세포를 보존하는 공정을 포함하는, 포유동물 세포의 보존 방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 항산화제가, 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염인, 방법.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    상기 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 1∼10000mg/L인, 방법.
  30. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    상기 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 30∼3000mg/L인, 방법.
  31. 제27항 또는 제28항에 있어서,
    상기 나이아신 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 120∼1200mg/L인, 방법.
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 1∼10000mg/L인, 방법.
  33. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 30∼6000mg/L인, 방법.
  34. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아스코르브산 혹은 그 유도체 또는 그들의 염의 농도가, 300∼3000mg/L인, 방법.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포를 0∼40℃에서 보존하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  36. 제27항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액이, 비타민 B2 혹은 그 유도체 또는 그들의 염을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 방법.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가, 혈소판 또는 거핵구인, 방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 혈소판이, 이하의 (A) 및 (B)를 포함하는 방법에 의해 얻어진 정제 혈소판인, 방법.
    (A) 거핵구의 배양물을 농축하는 농축 공정;
    (B) 얻어진 농축물로부터 혈소판을 원심 분리하는 원심 분리 공정;
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서,
    상기 액 내에 알부민을 더 포함하는, 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    상기 알부민의 농도가, 1.25∼10%(w/v)인, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서,
    상기 액 내에 당을 더 포함하는, 방법.
  42. 제41항에 있어서,
    상기 당이, 포도당인, 방법.
  43. 제37항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈소판 또는 거핵구를, 5∼10일간 보존하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  44. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유동물 세포가, 줄기세포 또는 면역세포인, 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 줄기세포가, 중간엽 줄기세포인, 방법.
  46. 제44항에 있어서,
    상기 면역세포가, T 세포인, 방법.
  47. 제44항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액이, 등장액인, 방법.
  48. 제47항에 있어서,
    상기 등장액이, 젖산 링거액인, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서,
    상기 액 내에 트레할로스를 더 포함하는, 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액 내에 덱스트란을 더 포함하는, 방법.
  51. 제44항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 줄기세포를, 1∼63일간 보존하는 것을 특징으로 하는, 방법.
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