CN115281180A

CN115281180A - 一种mRNA-血小板复合物冻存液及其制备方法

Info

Publication number: CN115281180A
Application number: CN202210779953.7A
Authority: CN
Inventors: 苏超
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2022-07-04
Filing date: 2022-07-04
Publication date: 2022-11-04

Abstract

本发明公开了一种mRNA‑血小板复合物冻存液及其制备方法。该冻存液包括以下组分：化学限定培养基、二甲基亚砜、人血清蛋白、海藻糖、氯化镁、甘油、tris溶液、柠檬酸钠。使用该冻存液后，与新鲜制备的mRNA‑血小板复合物相比较，冻存后复合物的完整性，表达特定标志物，以及生物学功能都相类似，能够达到低温冷冻保存的目的。该冻存液即能降低DMSO浓度，又不含动物源性血清，同时具备在深低温‑80度或‑168度液氮中保护血小板和mRNA的双重功能，该冻存液组合可直接用于下一步动物实验和临床研究。

Description

一种mRNA-血小板复合物冻存液及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物制剂技术领域，具体涉及一种mRNA-血小板复合物冻存液及其制备方法。

背景技术

mRNA疫苗是将RNA在体外进行相关的修饰后传递至机体细胞内表达并产生蛋白抗原，从而导机体产生针对该抗原的免疫应答，进而扩大机体的免疫能力。由于mRNA自身的稳定性差、易被组织内的核酸酶降解、进入细胞的效率较低、翻译效率较低等问题，这些缺陷限制了mRNA疫苗的应用，不同的递送载体对mRNA疫苗的稳定性和翻译效率也起到非常关键的作用，递送载体可分为病毒载体和非病毒载体(包括脂质体、非脂质体、病毒、纳米颗粒等)。因此，需要一个载体，能够通过脉管系统将mRNA载入肿瘤部位。

血小板是一种小而无核的细胞，在血液循环中呈凹形、椭圆形或圆盘状，通常其直径约2-5μm，厚度约0.5μm，是血液循环中最小的细胞，人体内血小板数量为每升150-400×109个，平均循环寿命为5-7天，由于其快速补充和适当的循环时间，可避免生物载体在体内的不良积蓄，因此，可作为一种安全的生物治疗载体。目前基于血小板的肿瘤靶向治疗策略有：血小板模拟纳米载体递药策略、血小板与纳米粒(nanoparticles,NPs)结合策略以及工程化血小板靶向策略。

血小板mRNA复合物是使用血小板装载mRNA，能够保护mRNA不被血液中和，增加mRNA发挥抗肿瘤作用的一种生物制剂，使得mRNA的应用场景不止局限于瘤内注射，有了血小板的装载，可以静脉使用mRNA，导向肿瘤细胞和组织。mRNA-血小板复合物目前处于基础研发阶段，该复合物的使用一般都是现场提取血小板进行制作，会造成批次间的不稳定性，因此，亟需研发一种能够低温保存mRNA-血小板复合物，可以规模化标准化制备的保护剂，该保护剂可以在低温环境下同时保存血小板和mRNA的功能，现有血小板冻存液对血小板有保护作用，但不适用于mRNA的保存，而mRNA的保存液对血小板低温冻存又没有作用。因此，需要一种能够保证两者活性的冻存液。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种mRNA-血小板复合物冻存液及其制备方法，以解决现有技术无法保存mRNA-血小板复合物的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种mRNA-血小板复合物冻存液，包括以下组分：化学限定培养基、二甲基亚砜、人血清蛋白、海藻糖、氯化镁、甘油、tris溶液和柠檬酸钠。

本发明的有益效果为：二甲基亚砜(DMSO)为临床级细胞冻存渗透性保护剂，人血清蛋白为保护该复合物的胶体渗透压，海藻糖为保护该复合物的表面稳定，柠檬酸钠抑制血小板活化，mRNA选自：mRNA、单纯疱疹病毒、麻疹病毒、慢病毒。使用该保护剂进行冻存复苏后，与新鲜制备的mRNA-血小板复合物相比，仍保持相同的外观特征，内部结构以及相同的生物学活性。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：

进一步，化学限定培养基包括氨基酸、维生素、无机盐和水。

进一步，化学限定培养基、二甲基亚砜、人血清蛋白、海藻糖、氯化镁、甘油和柠檬酸钠的质量比为90-99：1-5：1-10：1-5：0.5-4：0.2-7：0.5-4。

进一步，tris溶液pH值为6.8-8.0。

进一步，氨基酸为赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸中至少一种。

进一步，无机盐为钙、磷、钾、钠、氯、镁、硫的磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、碳酸盐和盐酸盐中至少一种。

本发明还提供上述mRNA-血小板复合物冻存液的制备方法，包括以下步骤：在化学限定培养基中加入二甲基亚砜、人血清蛋白、海藻糖、氯化镁、甘油、tris溶液和柠檬酸钠，制得mRNA-血小板复合物冻存液。

本发明还提供上述mRNA-血小板复合物冻存液在mRNA-血小板复合物保存方面的应用。

本发明具有以下有益效果：使用该冻存液后，与新鲜制备的mRNA-血小板复合物相比较，冻存后复合物的完整性，表达特定标志物，以及生物学功能都相类似，能够达到低温冷冻保存的目的。该冻存液即能降低DMSO浓度，又不含动物源性血清，同时具备在深低温-80度或-168度液氮中保护血小板和mRNA的双重功能，该冻存液组合可直接用于下一步动物实验和临床研究。

附图说明

图1为mRNA-血小板复合物冻存前后荧光显微镜外观图；

图2为mRNA-血小板复合物冻存前后扫描电子显微镜图；

图3为mRNA-血小板复合物冻存前后透射电子显微镜图；

图4为mRNA-血小板复合物冻存前后血小板表面标记物CD62表达情况；

图5为mRNA-血小板复合物冻存前后血小板平均分布宽度图；

图6为mRNA-血小板复合物冻存前后细胞杀伤功能图；

图7为mRNA-血小板复合物冻存前后动物实验降低肿瘤转移功能图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1：

冻存液的制备：冻存液主要成分如下：化学限定培养基的质量体积比为80～99％，二甲基亚砜(DMSO)的体积百分数1-5％，人血清蛋白1-10％、海藻糖1-5％、氯化镁0.5-4％、甘油0.2-7％、tris溶液Ph6.8-8.0、柠檬酸钠0.5-4％。

具体操作如下：在生物安全柜无菌环境中取4℃保存的化学限定培养基80-100份，水浴环境下升温至室温；在生物安全柜无菌环境中取二甲基亚砜1-5份；人血清蛋白1-10份、海藻糖1-5份、氯化镁0.5-4份、甘油0.2-7份、tris溶液Ph6.8-8.0 10-50份、柠檬酸钠0.5-4份，在常温、安全柜无菌环境中混合化学限定培养基和二甲基亚砜、人血清蛋白、海藻糖、氯化镁、甘油、tris溶液Ph6.8-8.0、柠檬酸钠，配置成终浓度为含80-99％化学限定培养基及1-5％二甲基亚砜、人血清蛋白1-10％、海藻糖1-5％、氯化镁0.5-4％、甘油0.2-7％、tris溶液Ph6.8-8.0、柠檬酸钠0.5-4％、的冻存液。冻存液制备成100-500ml体积放置常温或4度冰箱待用。

血小板的制备：从小鼠全血中分离血小板。C57小鼠(眶窦)采集全血放入用乙二胺四乙酸二钾处理的试管中。室温下全血100g离心20min，收集富血小板血浆(PRP)。此后，将PGE1以1μM的最终浓度添加到PRP中，并将PRP在100g下再离心20min以进一步去除红细胞。分离血小板：将PRP在800g下离心20分钟。收集沉淀并将其重新悬浮在含有1μM PGE1的台式液中。从小鼠体内采集约20-25ml血液，每次分离约1010个血小板。血小板以每100μl台式液1×108血小板的浓度在含有1μM PGE1的1ml台式液中再悬浮。对于血小板的体外活化，将血小板溶液以800g离心20分钟，然后重悬到台式缓冲液中以进行后面的活化实验。在显微镜下用血小板仪计数血小板数量。

血小板mRNA复合物的制备：在体外不活化血小板的状态下，对血小板进行mRNA的装载，在血小板与mRNA不同的MOI比值下，检测血小板装载mRNA的饱和比值，以此为依据，确定后面细胞实验、动物实验制备血小板-mRNA复合物时两者的最佳比例。通过qPCR检测装载效率，平均每个血小板可以装载6-8个mRNA；通过扫描电子显微镜下可以看出，装载mRNA后两种血小板外观无差别；通过透射电子显微镜可以看出，血小板在体外能够将mRNA吞入。

冻存液的使用：计数取血小板-mRNA复合物1-100×10¹¹个，在PRP 800g下离心20分钟。收集沉淀并将其重新悬浮在血小板-mRNA复合物冻存液100-10000ul中，每个500ul体系分装到冻存管中，

冻存管置于已处于常温状态的程序降温盒中，再将程序降温盒放置于-80℃超低温冰箱过夜，第二天转移至液氮罐冻存架中保存，备用。

复苏：将-80度或液氮中保存的血小板-mRNA复合物放至水浴锅中复苏，水浴锅调整温度20度-37度。看到溶液化开，进行下一步的实验。

试验例

一、mRNA-血小板复合物冻存前，冻存后荧光显微镜外观检测，血小板染绿色荧光标记的CD41抗体，冻存前，冻存后。使用荧光显微镜观测两者表达CD41特异性血小板抗体的情况。使用冻存液在-198度液氮中冻存一周后，复苏观察，与新鲜制备的mRNA-血小板复合物表达血小板特异性抗体CD41一致。结果见图1。

二、mRNA-血小板复合物冻存前，冻存后扫描电子显微镜图，mRNA-血小板复合物体积较小，只有2ul左右，普通光学显微镜下只能观察冻存前后轮廓，想要观察表面变化需要在放大倍数更高的扫描电镜下，无论血小板处于聚集状态或单个状态，冻存复苏后和新鲜制备的mRNA-血小板复合物，两者状态一致。结果见图2。

三、mRNA-血小板复合物冻存前，冻存后透射电子显微镜图，观察扫描电镜后，如果观察内部结构，观察经过冻存后，mRNA和血小板是否还在一起，需要做透射电镜，经过超薄切片切开mRNA-血小板复合物后，发现在冻存前和冻存后，血小板都会将mRNA包裹，箭头所指。结果见图3。

四、mRNA-血小板复合物冻存前，冻存后检测血小板表面标记物CD62表达情况。

流式细胞仪检测，在没有经过凝血酶刺激的条件下，正常血小板与装载mRNA的血小板P选择素的表达都几乎为0；经过凝血酶刺激后，正常血小板与装载mRNA的血小板P选择素的表达，在短时刺激15min时，都是10％左右，在长时刺激时，都是增加到约45％，说明装载mRNA的血小板与正常血小板一样，保持着生物学功能的完好，而且经过比较，冻存复苏后mRNA-血小板复合物和新鲜制备的表达趋势都是一致。结果见图4

五、mRNA-血小板复合物冻存前，冻存后血小板平均分布宽度图，两者一致。血小板平均分布宽度也能反应血小板异常，经过血常规检测，发现冻存前后两者一致，说明该冻存液能够在深低温下保护血小板。结果见图5。

六、mRNA-血小板复合物冻存前，冻存后还具备细胞杀伤功能图，装载了mRNA的血小板，与肿瘤细胞结合，并将表达绿色荧光的mRNA带入肿瘤细胞内，并在MOI＝5时，已经显示出对4T1细胞的杀伤活性，证明了装载有mRNA的血小板，能够将mRNA载入肿瘤细胞，引起肿瘤细胞裂解。比较冻存前后mRNA-血小板复合物杀伤活性，发现两者基本一致，说明该冻存液能够很好地保护血小板功能，又能很好的保护mRNA功能。结果见图6。

七、为mRNA-血小板复合物冻存前，冻存后动物实验降低肿瘤转移功能图。给小鼠接种4T1，一种高转移性乳腺癌细胞，对照组25天后肺部长满结节，使用现场制作和冻存后的血小板-mRNA复合物进行治疗，发现两者都能显著降低小鼠肺转移结节。结果见图7。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种mRNA-血小板复合物冻存液，其特征在于，包括以下组分：化学限定培养基、二甲基亚砜、人血清蛋白、海藻糖、氯化镁、甘油、tris溶液和柠檬酸钠。

2.根据权利要求1所述的mRNA-血小板复合物冻存液，其特征在于，所述化学限定培养基包括氨基酸、维生素、无机盐和水。

3.根据权利要求1所述的mRNA-血小板复合物冻存液，其特征在于，所述化学限定培养基、二甲基亚砜、人血清蛋白、海藻糖、氯化镁、甘油和柠檬酸钠的质量比为90-99：1-5：1-10：1-5：0.5-4：0.2-7：0.5-4。

4.根据权利要求1所述的mRNA-血小板复合物冻存液，其特征在于，所述tris溶液pH值为6.8-8.0。

5.根据权利要求2所述的mRNA-血小板复合物冻存液，其特征在于，所述氨基酸为赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、酪氨酸、甘氨酸、、脯氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸中至少一种。

6.根据权利要求2所述的mRNA-血小板复合物冻存液，其特征在于，所述无机盐为钙、磷、钾、钠、氯、镁、硫的磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、碳酸盐和盐酸盐中至少一种。

7.根据权利要求1-5任一项所述的mRNA-血小板复合物冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：在化学限定培养基中加入二甲基亚砜、人血清蛋白、海藻糖、氯化镁、甘油、tris溶液和柠檬酸钠，制得mRNA-血小板复合物冻存液。

8.权利要求1-5任一项所述的mRNA-血小板复合物冻存液在mRNA-血小板复合物保存方面的应用。