ES2536605B1

ES2536605B1 - Método de obtención de megacariocitos y plaquetas

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Publication number: ES2536605B1
Application number: ES201331568A
Authority: ES
Inventors: Pedro José REAL LUNA; Miguel GARCÍA TOSCANO; Pablo MENÉNDEZ BUJAN; Francisco MARTÍN MOLINA; Óscar NAVARRO MONTERO; Verónica AYLLÓN CASES; Verónica RAMOS MEJÍA; Clara BUENO UROZ; Marién COBO PULIDO; Tamara ROMERO ESCOBAR
Original assignee: Fundacion Publica Andaluza Progreso y Salud
Current assignee: Fundacion Publica Andaluza Progreso y Salud
Priority date: 2013-10-24
Filing date: 2013-10-24
Publication date: 2016-03-02
Anticipated expiration: 2033-10-24
Also published as: EP3061825A4; EP3061825A1; WO2015059339A1; ES2536605A1; US20160312185A1

Abstract

La presente invención se refiere al uso del gen SCL, de secuencia nucleotídica (GenBank NM_003189.2, NP_003180.1) SEQ ID NO: 1, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.

Description

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología y la medicina, y más concretamente en el ámbito de las terapias avanzadas. Específicamente, se refiere al uso de las células madre para la obtención de megacariocitos productores de plaquetas funcionales, para su empleo frente a enfermedades derivadas de anomalías hematopoyéticas. También se refiere a los megacariocitos y plaquetas obtenidos por dicho método, y a los sistemas y/o dispositivos productores de los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

Las plaquetas son fragmentos citoplasmáticos enucleados que son liberados desde megacariocitos maduros (MKs). Los MKs se originan desde células madre hematopoyéticas (HSCs) por un proceso de diferenciación conocido por megacariopoyesis. Una vez formados, los MKs sufren un proceso de maduración (trombopoyesis) de donde resultan la producción y liberación de las plaquetas

(Kaushansky, K. 2008. Blood 111(3):981-6). El trasplante de plaquetas es necesario para el tratamiento de trombocitopenias de origen fisiológico, leucemias, enfermedades genéticas o inducidas por quimioterapia agresiva. Debido a que la vida media de las plaquetas es muy baja y al número limitado de plaquetas que se obtienen de los donantes en los bancos de sangre, la generación de sistemas ex vivo alterativos para la producción de plaquetas es una opción muy prometedora (Lambert, M.P. el al., 2013. Blood 121(17):3319-24.; Slichter, S.J. 2004. Transfusion Medicine Reviews 18(3):15~7.). Uno de los retos en medicina es proporcionar a los hospitales una fuente constante de plaquetas, aunque hasta ahora ha sido imposible, ya que es totalmente dependiente de la disponibilidad y el altruismo de los donantes. Por lo tanto, la generación de un sistema donante-independiente capaz de proporcionar plaquetas para transfusión constantemente y eficientemente sería ideal para satisfacer las necesidades de las plaquetas para tratamiento de trombocitopenias en clínica (Lambert el al., M.P. 2013. Blood 121(17):3319-24.).

Durante las dos últimas décadas, varios grupos han sido capaces de generar MKs y plaquetas in vitro a partir de HSC CD34+ obtenidas desde sangre periférica, cordón umbilical, hígado fetal y médula ósea, pero la capacidad de expansión limitada de las

células HSC CD34+ restringe su uso como una fuente de plaquetas eficiente y constante (Choi, E.S. el al. 1995. B/ead 85(2):402-13; Tao, H.et al. , 1999. Exp.

Hematot. 27(2):29:>--301 ; Ma, D.C. et at. 2000. Eur. J. Haematot. 64(5):304-14; De Bruyn , C. et at. 2005. Stem Cells Dev. 14(4):415--24). Por el contrario, las células

madre embrionarias humanas (hESCs) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) se caracterizan por una capacidad de crecimiento ilimitado y la potencialidad de diferenciarse en cualquier linaje celular, convirtiéndose una alternativa muy prometedora para terapias en hematología (Thomson , J.A. el al. 1998. Science

282(5391):1145--7; Takahashi , K. et al. 2007. CeIl131(5):861-72; Krimbel, EA y Lu,

S.J. 2011. Stem Cells Int 2011 :273076.). En base a estas propiedades, varios

laboratorios en todo el mundo han optimizado diferentes estrategias para la generación de megacariocitos y plaquetas funcionales a partir de células madre

pluripotentes humanas (hPSCs) (Takayama, N. et al. 2008. Blood 111 (11 ):5298-306; Takayama, N. et al. 2010. J. Exp. Med. 207(13):2817-30; Lu, S.J. et al., 2011. Cell Res. 21(3):530-45; Piek, M. et al., 2013. PLoS One 8(2):e55530). Hasta la fecha,

estos estudios han generado megacariocitos y plaquetas que puedan ser activados in vilro por estímulos clásicos (ADP, fibrinógeno o trombina) (Takayama, N. el al. 2008.

Btood 111 (11 ):5298-306; Lu, S.J. et al., 2011. Cell Res. 21 (3):530-45) y plaquetas

funcionales que participan en la formación de coágulos in vivo (Takayama, N. el al.

2010. J. Exp. Med. 207(13):2817-30; Lu, S.J. etat. , 2011. Cetl Res. 21(3):530-45). Sin

embargo, estas células poseen la limitación de producir un número reducido de megacariocitos por cada célula madre pluripotente de partida y de plaquetas en comparación con las producciones in vivo (Tijssen, M.R y Ghevaert C.J., 2013. Thromb Haemosl 11(4):593--604). Por lo tanto, es necesario seguir trabajando en la optimización de protocolos más eficientes de megacariopoyesis y trombopoyesis

desde hPSCs.

Estas mejoras podrían basarse en el conocimiento de los mecanismos moleculares que controlan la diferenciación megacariocítica. Un gran número de factores de transcripción se han asociado a la regulación de la megacariopoyesis y trombopoyesis

(Goldfarb, A.N. 2007. Oneogene 26(47):6795--802). Entre estos mecanismos,

SCLfTAL1 ha centrado la atención no sólo en el establecimiento de la hematopoyesis en ratón (Shivdasani, RA. el al., 1995. Nalure 373(6513):432-434; Porcher, C. el al., 1996. CeI/86(1):47-57), sino también en eritroides y megacariocitos (Mikkola, H.K. el

al. , 2003. Seience 421(6922):547-51 ; Hall, MA et al., 2003. PNAS 100(3):992-7; Sehlaeger et al., 2005. Blood 105(10):3871-4).

Se ha demostrado que la sobreexpresión de SCL aumenta la diferenciación hematopoyética de hPSCs y potencia las características de los eritroides (Yung, S. el al. , 2011. Hum. Mol. Gen. 20(24):4932-46; Real, P.J. et al., 2012. Mol. Therapy 20(7):1443-53). SCL participa en el cometido de los megacariocitos, se propone que la sobreexpresión de este factor de transcripción hematopoyético aumentará la eficiencia de la megacariopoyesis y trombopoyesis de hPSCs. Esta sobreexpresión a priori no supondría ningún riesgo cuando las plaquetas son transfundidas, ya que las plaquetas son enucleadas y no llevan más copias de genes sobreexpresados ni de la proteína traducida. Esto representa un paso adelante en el camino de generación de plaquetas a gran escala para su uso en trasplantes humanos.

Por tanto, las hPSCs son una herramienta ideal para optimizar los protocolos de megacariopoyesis y trombopoyesis humana destinada a la ilimitada producción de plaquetas para su uso en clínica. Estos protocolos optimizados representarán una plataforma para el estudio de los procesos moleculares y celulares implicados en la megacariopoyesis y trombopoyesis humana, y podría ser utilizado para modelar enfermedades humanas que afectan a estos procesos de diferenciación, tales como las leucemias megacarioblásticas agudas (AMKL).

BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

Un primer aspecto de la invención se refiere al uso del gen SCL/TAL 1, de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1, de ahora en adelante secuencia nucleotídica de la invención, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de una construcción genética de ADN o ARN, de ahora en adelante construcción genética de la invención, que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias:

a.: secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, la secuencia nucleotídica de la invención, para su transcripción in vitro o in vivo, o

b.: secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende secuencia nucleotídica de la invención, operativa mente enlazado con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar,

para obtener meg8cariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre. Preferiblemente, la construcción genética es un vector, de ahora en adelante vector de la invención, y aún más preferiblemente es un vector lentiviral. En otra realización preferida, las células madre se seleccionan de la lisla que consiste en células madre hematopoyélicas, células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, fibroblastos, megacariocitos inducidos (Ono, Y. et al., 2012 B/cad 120(18):3812-21 ) o cualquiera de sus combinaciones. Aún más preferiblemente, son células madre pluripotentes (PSCs), más preferiblemente son células madre de mam ífero, y aún mucho más preferiblemente, son células humanas.

Un tercer aspecto de la invención se refiere un megacariocito productor de plaquetas funcionales, de ahora en adelante megacariocito de la invención, obtenido por un método, de ahora en adelante método de producción de plaquetas de la invención, que comprende:

a) poner en contacto la construcción genética o el vector de la invención, con una célula madre,

b) seleccionar las células madre del paso (a) que hayan sido transducidas o transformadas con la construcción genética y/o el vector, y

c) diferenciar las células madre del paso (b) a megacariocitos maduros.

En otra realización preferida, las células madre se seleccionan de la lista que consiste en células madre hematopoyéticas, células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, fibroblastos, megacariocitos inducidos (Ono, Y. et al., 2012 Blood 120(18):3812-21 ) o cualquiera de sus combinaciones. Aún más preferiblemente, son células madre pluripotentes (PSCs), más preferiblemente son células madre de mam ífero, y aún mucho más preferiblemente, son células humanas. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la diferenciación de las células madre a megacariocitos del paso (c) se lleva a cabo diferenciando las células madre a progenitores megacariocíticos mediante la adición de una composición que comprende un inhibidor de histona deacetilasa. Aún más preferiblemente, el inhibidor de histona deacetilasa es la Tricostatina A. En una realización más preferida de la invención, la diferenciación de las células madre a megacariocitos maduros del paso (c) comprende co-cultivar las células madre con células del estroma.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de plaquetas in vitro, de ahora en adelante método de producción de plaquetas de la invención, que comprende cultivar el megacariocito productor de plaquetas funcionales según se ha definido éste en el tercer aspecto de la invención en un medio de cultivo adecuado.

Un quinto aspecto de la invención se refiere a una plaqueta, de ahora en adelante plaqueta de la invención, obtenida por el método de producción de plaquetas de la invención.

Un sexto aspecto de la invención se refiere al uso de un megacariocito o de una plaqueta de la invención, en la elaboración de un medicamento.

Un séptimo aspecto de la invención se refiere al uso de un megacariocito o de una plaqueta de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento del daño vascular.

Un octavo aspecto de la invención se refiere al uso de un megacariocito o de una plaqueta de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías relacionas con las plaquetas y/o leucemias megacarioblásticas agudas.

Un noveno aspecto de la invención se refiere al uso de un inhibidor de histona deacetilasa para diferenciar una célula madre a megacariocito. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor de histona deacetilasa es la T ricostatina A.

Un décimo aspecto de la invención se refiere a un sistema o dispositivo de producción de plaquetas para la producción in vilro y/o ex vivo de las plaquetas de la invención que comprende:

a) un biorreactor para la expansión de las células madre en presencia de un primer medio de crecimiento en comunicación fluida con;

b) una cámara de maduración que comprende células estromales y/o un nicho de médula ósea artificial y un segundo medio de crecimiento, en el que la cámara de maduración está en comunicación fluida con;

c) una cámara de separación de células para la selección de megacariocitos maduros que está en comunicación fluida con;

d) un módulo de producción de plaquetas que comprende una pluralidad de cámaras de producción de plaquetas, una matriz tridimensional, un tercer medio de crecimiento, y una pluralidad de bombas para mover el tercio del medio de crecimiento a través de las cámaras de producción de plaquetas, en el que el módulo de producción de plaquetas está en comunicación fluida con ;

e) una cámara de recogida de plaquetas.

donde las células madre del paso (a) están transfectadas con el gen SCL. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el sistema o dispositivo de producción de plaquetas incorpora en uno o varios medios decrecimiento empleados en alguno de sus pasos un inhibidor de histona deacetilasa. Aún más preferiblemente, el inhibidor de histona deacetilasa es la Tricostatina A.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. La sobreexpresión de SCl incrementa la producción de megacariocitos y plaquetas en PSCs. A) Esquema de diferenciación de megacariocitos desde hPSCs. Este protocolo de diferenciación se divide en dos etapas: etapa de diferenciación EBs (del día O al 15) en presencia de citoquinas hematopoyéticas (bFGF, VEGF, BMP4, Flt3L, SCF y TPO) y con co-cultivo con OP9 en la etapa de diferenciación (del día 15 al 32) donde las hPSCs derivan del crecimiento junto a células del estroma OP9 complementados con heparina, TPO y SCF. B) Representa gráficos de citometría de flujo que muestran como las células megacariocíticas (MK) y las plaquetas se identifican y analizan durante la etapa de diferenciación ca-cultivo con OP9. Las plaquetas de sangre periférica (PB) se obtuvieron a partir de donantes de bancos de sangre para establecer la configuración del análisis de citometría de flujo. C) Cinética de aparición de los megacariocitos y plaquetas de dos líneas diferentes (AND1 y HS181 ) transducidas con el vector vacio (EV) y con el vector que expresa SCL (SCL ). En los paneles superiores se representa el número de megacariocitos (CD41 + CD42+). El numero de plaquetas (CD41 + CD42+) se muestra en los inferiores. D) Cinética acumulativa de megacariocitos y plaquetas de HS181 transducidas con el vector vacio (EV) o con el que sobreexpresa SCL, en los días 22 y 26 del desarrollo megacariocítico. Los datos representan la media ± SEM de 2-3 experimentos independientes desde la línea hPSC HS181 .

Figura 2. Caracterización morfológica, molecular y funcional de los megacariocitos y plaquetas derivadas de HPSCs. A) Tinción de Papanicolau de las células purificadas a partir de los sobrenadante de las células HS 181 EV y Sel diferenciadas de co-cultivos a 20 y 32 días. B} Análisis cuantitativo por RT-PCR de varios factores de transcripción de (FLI-1 , NFE2, GATA-1 Y SeL) y marcadores de superficie (CD41 y CD61) expresados en derivados celulares recogidos de los sobrenadantes de cultivos HS181 EV y Sel a 22 días de diferenciación de megacariocitos. La expresión relativa se muestra normalizada a las células EV. Los datos representan la media ± SEM de 2 experimentos independientes. e) Tinción de Papanicolau de megacariocitos derivados de HS181 EVo Sel activados por trombina (2 Ulml) durante 2 horas. D) Análisis por citometría de flujo del control megacariocítico

(C) o de células ADP-activadas (+ADP) al día 26 de la diferenciación megacariocítica. El anticuerpo PAC1 se usó para detectar la por la forma activada de la integrina allb¡33 después del tratamiento con ADP. los datos representan la media ± SEM de 2 experimentos independientes.

Figura 3. la sobreexpresión de SCl acelera la aparición de progenitores megacariocíticos a partir de PSC. A) Representación esquemática del análisis de progenitores megacariocíticos desde PSCs. Este protocolo de diferenciación se reduce a la etapa de diferenciación de EBs (desde el día O a 8) en presencia de citoquinas hematopoyéticas (bFGF , VEGF BMP4, Flt3L, SCF y TPO) y TPO y SCL (desde el dia 8 al 17). El análisis por cítometría de flujo se realizó en los días 10, 14 Y 17 de la diferenciación megacariocítica. B) Gráficos representativos de citometrías de flujo que muestran cómo los progenitores megacariocíticos (CD34+ y CD34+ CD41+) son identificados y analizados. C) Cinética de aparición de progenitores megacariocíticos (CD34+ y CD34+ CD41+) desde la linea celular de PSCs AND1 transducida con el vector vacío (EV) o vector Sel expresado (SCl). los datos representan la media ± SEM de 2 experimentos independientes. D) Análisis cuantitativo RT-PCR de varios factores de transcripción asociados al desarrollo megacariocítico (FU-1, NFE2, GATA-1 Y SCL) y marcadores de superficie (CD41 y CD61) expresados en EBs de cultivos AND1 EV y SCl en los días 10, 14 Y 17 de la diferenciación megacariocítica. la expresión relativa se muestra normalizada a EBs desde AND1 EV al día 10 de la diferenciación. los datos representan la media ± SEM de 2 experimentos independientes.

Figura 4. la tricostatina A acelera la aparición de progenitores megacariocíticos a partir de PSCs. A) Esquema del análisis de progenitores megacariocíticos a partir de PSCs en presencia o ausencia de tricostatina A (TSA). El análisis por citometría de flujo se desarrolló el día 14 de la diferenciación megacariocítica. B) Análisis de la aparición de progenitores meagariocíticos (CD34+ y CD34+ CD41+) a partir de AND1

PSCs silvestre a dos concentraciones diferentes (10 y 100 nM). Los datos representan la media ± SEM de 2 experimentos independientes.

DESCRIPCiÓN OHALLADA DE LA INVENCiÓN

Los autores de la presente invención han demostrado que la sobreexpresión del gen SCL, de secuencia nucleotídica SEO ID NO: 1, aumenta la producción de megacariocitos y plaquetas a partir de células madre. Además, han comprobado que este aumento se produce también a partir de PSCs, que a diferencia de la capacidad de expansión limitada de las células HSC CD34+ se caracterizan por una capacidad de crecimiento ilimitado, y pueden dar lugar a una ilimitada producción de plaquetas para su uso en clínica.

Así pues, un primer aspecto de la invención se refiere al uso del gen SCL, de secuencia nueleotidiea (Gen8ank NM_003189.2, NP_003180.1) SEO ID NO: 1, de ahora en adelante secuencia nucleotídica de la invención, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, se entiende que el gen SCL presenta una secuencia nucleotídica con una identidad de al menos un 50%, más preferiblemente un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% Y aún mucho más preferiblemente un 99% con la secuencia SEO ID NO: 1.

Puede esperarse que el grado de identidad/similaridad de las secuencias homologas a la recogida en la secuencia SEO ID NO: 1, sean, de al menos de un 50% o mayor, y más preferiblemente de al menos un 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% o un 99%. La correspondencia entre la(s) secuencia(s) nucleotídica(s) de la(s) secuencia{s) putativa(s) y la secuencia recogida en la SEO ID NO: 1 se puede determinar por métodos conocidos en la técnica. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa BLAST o BLASTN, y FASTA (Altsehul et al., J. Mol. BioL 215: 403-410 (1999)

El término "homología", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la semejanza entre dos estructuras debida a una ascendencia evolutiva común , y más concretamente, a la semejanza entre dos o más secuencias de nucleótidos o aminoácidos.

El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de nucleótidos o aminoácidos idénticos entre dos secuencias nucleotídicas o aminoacídicas que se comparan . Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et aL, Nucleic Acids Research 12: 287 (1984) Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI); BLAST, BLASTP o BLASTN, y FASTA (Allschul el al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1999).

El gen SCL o TAL1 "T-cell acute Iymphocytic leukemia 1", también denominada como TCL5; tal-1; bHLHa17, se encuentra en el cromosoma 1 (1p32). Su secuencia aminoacídica se encuentra en la SEQ ID NO: 2 , (de secuencia nucleotídica SEO ID NO: 1 con número de acceso en el GenBank (NCBI) NM_003189.2).

En el contexto de la presente invención, SCL se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótidos, que constituye la secuencia codificante de la proteína recogida en la SEO ID NO: 2, y que comprendería diversas variantes procedentes de:

a) moléculas de ácido nucleico que codifican un pOlipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEO ID NO: 2,

b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a),

c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético,

d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEO ID NO: 2, y en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de SCL.

Un segundo aspecto de la invención se refiere al uso de una construcción genética de AON o ARN, de ahora en adelante construcción genética de la invención, que comprende uno de los siguientes tipos de secuencias:

a.: secuencia de nucleótidos, que comprende, al menos, la secuencia nucleotídica de la invención, de acuerdo a cualquiera de las definiciones anteriormente mencionadas, para su transcripción in vitro o in vivo, o

b.: secuencia de nucleótidos, correspondiente a un sistema o vector de expresión génica que comprende la secuencia nucleotídica de la invención, de acuerdo a cualquiera de las definiciones anteriormente mencionadas, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia de

nucleótidos, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para la transcripción y su regulación adecuada en tiempo y lugar,

para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre. Preferiblemente, la construcción genética es un vector, de ahora en adelante un vector de la invención, y aún más preferiblemente es un vector lentiviral. En otra realización preferida, las células madre se seleccionan de la lista que consiste en células madre hematopoyéticas, células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, fibroblastos, megacariocitos inducidos (Ono, Y. et al., 2012 B/cad 120(18):3812-21 ) o cualquiera de sus combinaciones. Aún más preferiblemente, son células madre pluripotentes (PSCs), más preferiblemente son células madre de mam ífero, y aún mucho más preferiblemente, son células humanas.

Un gran número de estas construcciones, sistemas o vectores de expresión pueden ser obtenidos por métodos convencionales conocidos por los expertos en la materia y forman parte de la presente invención.

Un "vector" es un replicón , o un vector integrativo, al que se ha unido otro segmento polinucleótido, para realizar la replicación yfo expresión del segmento unido.

Un "replicón" es cualquier elemento genético que se comporta como una unidad autónoma de replicación polinucleotídica dentro de una célula; esto es, capaz de replicarse bajo su propio control.

Un vector integrativo es cualquier elemento genético que se integra y se mantiene estable en el genoma de una célula.

Un "vector lentiviral" es un vector integrativo derivado a partir de los lentivirus (retrovirus no oncogénicos capaces de infectar a todo tipo de células, tanto quiescentes como en división celular). Los vectores lentivirales pueden insertar fragmentos de ADN de tamaño intermedio y que puede alcanzar hasta las 8000 pb. El principal inconveniente de los mismos es que su integración es totalmente azarosa en el genoma de la célula hospedadora. En la actualidad la mayoría de estos vectores son derivados del Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH).

"Secuencia de control" se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión de las secuencias a las que están ligadas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo huésped; en procariotas, dichas secuencias de control generalmente incluyen un promotor, un sitio de unión ribosomal, y señales de terminación; en eucariotas, generalmente, dichas secuencias de control incluyen promotores, señales de terminación, intensificadores y, en ocasiones, silenciadores. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, como mínimo, todos los componentes cuya presencia es necesaria para la expresión, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa.

Como se usa aquí, el término "promotor" hace referencia a una región del ADN aguas arriba del punto de inicio de la transcripción, yen el particular, que es capaz de iniciar la transcripción en una célula vegetal , sea el origen del promotor una planta o no. Hay opromotores que inician la transcripción en un determinado tipo de tejidos, y se denominan como "tejido específicos". Un promotor "inducible" o "reprimible" es un promotor que se encuentra bajo el control del medio ambiente. Los promotores de tejido específico, tejido preferido, específicos de un tipo celular, o promotores inducibles son tipos constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo en la mayoría de las condiciones ambientales.

"Unidos de forma operativa" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos tienen una relación que les permite funcionar en la manera intencionada. Una secuencia de control "unida de forma operativa" a una secuencia que se transcribe a la secuencia nucleotídica de la invención, está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificadora se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de control.

Una "secuencia codificadora" o "secuencia codificante" es una secuencia de polinucleótidos que se transcribe a mRNA y/o se traduce a un polipéptido cuando está bajo control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante se determinan mediante un codón de inicio de traducción en el extremo 5' y un codón de finalización de la traducción en el extremo 3'. Una secuencia codificante puede incluir, pero no se limita a mRNA, cONA, y secuencias de polinucleótidos recombinantes.

Los términos "polinucleótido" y "ácido nucleico" se usan aquí de manera intercambiable, refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxiribonucleótidos (AON ó ONA).

Los términos "secuencia aminoacídica", "péptido", "oligopéptido", "polipéptido" y "proteína" se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados.

MEGACARIOCITOS DE LA INVENCiÓN

Un tercer aspecto de la invención se refiere un megacariocito productor de plaquetas funcionales, de ahora en adelante megacariocito de la invención, obtenido por un método que comprende:

b) seleccionar las células madre del paso (a) que han sido transducidas o transformadas con la construcción genética y/o el vector, y

e) diferenciar las células madre del paso (b) a megacariocitos maduros.

En otra realización preferida, las células madre se seleccionan de la lista que consiste en células madre hematopoyéticas, células madre pluripotentes, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, fibroblastos, megacariocitos inducidos (Ono, Y. el al., 2012 Blood 120(18):3812-21 ), células progenitoras de megacariocitos o cualquiera de sus combinaciones. Aún más preferiblemente, son células madre pluripotentes (PSCs), más preferiblemente son células madre de mamífero, y aún mucho más preferiblemente, son células humanas.

Las hESC son las células madre pluripotentes derivadas de la masa celular interna de un embrión en fase inicial y son capaces de diferenciarse en todos los derivados de las tres capas germinales primarias: ectodermo, endodermo y mesodermo. Estas células son capaces de diferenciarse en todos los tipos de células en el cuerpo humano.

Las iPS son un tipo de célula madre pluripotente derivada artificialmente a partir de una célula madura. Típicamente, las células somáticas adultas son inducidas a convertirse en pluripotentes mediante la activación de genes específiCOS de inmadurez en estas células.

Las células madre hematopoyéticas son células progenitoras que circulan en la sangre y residen en la médula ósea, y tienen el potencial para dar lugar a todas las células hematopoyéticas. Las células madre hematopoyéticas pueden ser adquiridas de la médula ósea, sangre periférica con máquinas de aféresis, o de cordón umbilical o la placenta después del nacimiento.

El término "células progenitoras de megacariocitos," tal como se utiliza en este documento, se refiere a células madre hematopoyéticas comprometidas con al menos el linaje de megacariocitos e incluye, pero no se limitan a, células de la sangre del cordón umbilical, la médula ósea y sangre periférica, así como células madre hematopoyéticas, las células madre embrionarias, incluyendo células madre embrionarias humanas, y células madre pluripotentes inducidas.

Para los propósitos de la presente descripción, los términos "células madre" y "células progenitoras de megacariocitos" son intercambiables y se refieren a pluripotentes, multipotentes o unipotente células madre o células progenitoras que son capaces de diferenciarse en megacariocitos y tienen el potencial para producir plaquetas.

Para los propósitos de la presente descripción, el término ''factores de crecimiento" se refiere a proteínas y y otros factores no proteícos que apoyan el crecimiento, el mantenimiento, la maduración y diferenciación de las células.

Para los propósitos de la presente descripción, el término "medio de crecimiento" se refiere a medio acuoso líquido o semi-sólido que incluye electrolitos, fuentes de energía, factores de crecimiento y otros materiales necesarios para el cultivo ex vivo de las células.

Los megacariocitos tienen la característica notable de duplicar sus contenidos nucleares y celulares sin división celular a través de un proceso llamado endomitosis. A través de la endomitosis, el megacariocito crece a un tamaño enorme y puede alcanzar más de 64 veces el contenido nucleares normales. El aumento de los contenidos nucleares, o poliploidía, juega un papel fundamental en la formación de plaquetas permitiendo a la célula producir las grandes cantidades de proteínas y orgánulos necesarios para la formación y función de las plaquetas. Es importante destacar que los megacariocitos maduros también tienen grandes cantidades de membrana celular extra con la que producen plaquetas. La inducción de poliploidización se puede lograr utilizando solos o en diferentes combinaciones reactivos conocidos en el estado del arte. Los autores de la presente invención han demostrado que el empleo de inhibidores de histona deacetilasa induce la maduración de los progenitores megacariocítico.

Por tanto, en otra realización preferida de este aspecto de la invención, la diferenciación de las células madre a megacariocitos del paso (c) se lleva a cabo diferenciando las células madre a progenitores megacariocíticos mediante la adición de una composición que comprende un inhibidor de histona deacetilasa. Aún más preferiblemente, el inhibidor de histona deacetilasa es la Tricostatina A. En una realización más preferida de la invención, la diferenciación de las células madre a megacariocitos maduros del paso (e) comprende ca-cultivar las células madre con células del estroma.

Las histona deacetilasas (o HOAC) son un tipo de enzimas implicadas en la eliminación de los grupos acetilo de los residuos de lisina en las histonas. Los inhibidores de histona deacetilasas (HDls) poseen una larga historia como fármacos utilizados en psiquiatría y neurología, como es el ácido valproico, por presentar una acción estabilizadora y anti-epiléptica. Más recientemente, los HDls han sido empleados como mitigadores en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. También en los últimos años, se ha llevado a cabo un esfuerzo notable en el desarrollo de HDls para terapias del cáncer, como vorinostat, que ha sido aprobado recientemente para el tratamiento dellinfoma cutáneo de células T (CTCL).

Los megacariocitos de la invención también se pueden encontrar formando parte de una población de megacariocitos. Por tanto, otro aspecto dela invención se refiere a una población celular aislada, de ahora en adelante población celular de la invención, que comprende al menos un megacariocito de la invención. En una realización preferida la población celular de la invención comprende al menos un 20%, preferiblemente un 40%, y aún más preferiblemente un 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, o un 99% de megacariocitos de la invención.

El megacariocito de la invención, preferiblemente, se encuentra aislado. El término "aislado" indica que la célula (megacariocito) o la población de megacariocitos de la invención a la que se refiere, no se encuentran en su ambiente natural. Esto es, la célula o la población celular ha sido separada de su tejido circundante. Particularmente significa que dicha célula o la población celular está sustancialmente exenta (libre) de otras células normalmente presentes en la sangre, o en un hemoderivado de la misma, de un sujeto del que se haya extraído la sangre para el aislamiento de dicha célula o la población celular. También se refiere a las células o poblaciones celulares que han sido aisladas del organismo en el que se originan. El término también incluye células que han sido aisladas de un organismo y re-introducidas en el mismo organismo, o en otro.

METODO DE OBTENCiÓN DE PLAQUETAS DE LA INVENCiÓN

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método para la producción de plaquetas in vitro, de ahora en adelante método de producción de plaquetas de la invención , que comprende cultivar el megacariocito productor de plaquetas funcionales de la invención en un medio de cultivo adecuado.

Medios de cultivo adecuados son conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo, pero sin limitarnos, los descritos en Takayama, N. el al. 2008. Bload 111 (11 ):529S--306; Takayama, N. et al. 2010. J. Exp. Med. 207(13):2817-30; Lu, S.J. etal., 2011. CeJl Res. 21(3):530-45; Ono, Y. etal., 2012 Blood 120(18):3812-21; Pick,

M. et al. , 2013. PLoS One 8(2):e55530.

USOS DE LOS MEGACARIOClTOS y PLAQUETAS DE LA INVENCiÓN

Un octavo aspecto de la invención se refiere al uso de un megacariocito o de una plaqueta de la invención, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías relacionas con las plaquetas.

Patologías relacionadas con las plaquetas son conocidas en el estado del arte, por ejemplo entre otras, pero sin limitarnos, trombocitopenias de origen fisiológico, leucemias, enfermedades genéticas o inducidas por quimioterapia agresiva, la Trombastenia de Glanzmann o el Síndrome de Bernard-Soulier, y/o leucemias megacarioblásticas agudas.

Tanto los megacariocitos como las plaquetas de la invención pueden encontrarse formando parte de una composición, de ahora en adelante primera composición de la invención. En una realización preferida, la composición es una composición farmacéutica (de ahora en adelante composición farmacéutica de la invención), y más preferiblemente, dicha composición puede incorporar otro u otros principios activos. En una realización preferida, la composición farmacéutica de la invención además

comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida, la composición farmacéutica de la invención además comprende otro principio activo.

El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" se refiere a un vehículo que debe estar aprobado por una agencia reguladora del gobierno federal o un gobierno estatal

o enumerado en la Farmacopea Estadounidense o la Farmacopea Europea, u otra farmacopea reconocida generalmente para su uso en animales, y más concretamente en humanos.

El término "vehículo" se refiere a un diluyente, coadyuvante, excipiente o portador con el que se deben administrar los megacariocitos o la población de megacariocitos de la invención o de dicha composición que comprende células madre de la invención obtenible según el procedimiento de la invención; obviamente, dicho vehículo debe ser compatible con dichas células. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dicho vehículo incluyen cualquier vehículo fisiológicamente compatible, por ejemplo, soluciones isotónicas (e.g., solución salina estéril al 0,9% NaCI, solución salina tamponada con fosfatos (PBS), solución Ringer-Iactato, etc.), opcionalmente suplementadas con suero, preferiblemente con suero autólogo; medios de cultivo celular (e.g., DMEM, etc.); o, alternativamente, un medio soporte sólido, semisólido, gelatinoso o viscoso, tal como colágeno, colagen-glicosamino-glicano, fibrina, cloruro de polivinilo, poliaminoácidos, tales como polilisina, o poliornitina, hidrogeles, agarosa, sulfato de dextrano silicona. Asimismo, si se desea, el medio de soporte puede, en realizaciones específicas, contener factores de crecimiento u otros agentes. Si el soporte es sólido, semisólido, o gelatinoso, los megacariocirtos pueden ser introducidos en una fase líquida del vehículo que es tratada posteriormente de forma tal que se convierte en una fase más sólida.

La composición farmacéutica de la invención, si se desea, puede contener también, cuando sea necesario, aditivos para aumentar, controlar o dirigir de otro modo el efecto terapéutico deseado de los megacariocitos, los cuales comprenden dicha composición farmacéutica, y/o sustancias auxiliares o sustancias farmacéuticamente aceptables, tales como agentes tamponantes, tensioactivos, codisolventes, conservantes, etc. También, para estabilizar la suspensión celular, es posible añadir quelantes de metales. La estabilidad de las células en el medio líquido de la composición farmacéutica de la invención puede mejorarse mediante la adición de sustancias adicionales, tales como, por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico, etcétera. Dichas sustancias farmacéuticamente aceptables que pueden usarse en la composición farmacéutica de la invención son conocidas, en general, por los técnicos en la materia y se usan normalmente en la elaboración de composiciones celulares. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados se describen, por ejemplo, en "Remington's Pharmaceutical Sciences", de E.W. Martín. Puede encontrarse información adicional sobre dichos vehículos en cualquier manual de tecnología farmacéutica (Farmacia Galénica).

Como se emplea aquí, el término "principio activo", "sustancia activa", "sustancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales. El término incluye aquellos componentes que promueven un cambio en la elaboración del fármaco y están presentes en el mismo de una forma modificada prevista que proporciona la actividad específica o el efecto.

El término "medicamento", tal y como se usa en esta memoria, hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades en el hombre y los animales.

La composición farmacéutica de la invención se formulará de acuerdo con la forma de administración elegida. La composición farmacéutica de la invención puede preparase en un modo de dosificación líquido o gel, por ejemplo, en forma de suspensión, para ser inyectada o perfundida al individuo. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, incluyen la formulación de la composición farmacéutica de la invención en una suspensión estéril con un excipiente farmacéuticamente aceptable, tal como una solución isotónica, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfatos (PBS), o cualquier otro vehículo farmacéuticamente aceptable apropiado, para la administración a un sujeto vía parenteral, e.9., un ser humano, preferentemente vía intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, etc., aunque también son posibles otras rutas alternativas de administración.

La administración de la composición farmacéutica de la invención al individuo se llevará a cabo por los medios convencionales. Por ejemplo, dicha composición farmacéutica se puede administrar a dicho individuo por vía intravenosa utilizando los dispositivos adecuados, tales como jeringas, catéteres (un catéter intravenoso periférico estándar, un catéter venoso central o un catéter arterial pulmonar, etc.), trocares, cánulas, etc. El flujo de las células se puede controlar por inflado y desinflado en serie de globos distales y proximales ubicados dentro de la vasculatura del paciente, creando así zonas temporales sin flujo que promueven la acción terapéutica

,.

celular. En todos los casos, la composición farmacéutica de la invención se administrará utilizando los equipos, aparatos y dispositivos adecuados a la administración de composiciones celulares y conocidos por el experto en la técnica.

Como entiende el experto en la materia, en ocasiones la administración directa de la composición farmacéutica de la invención al sitio que se pretende beneficiar puede ser ventajosa. De este modo, la administración directa de la composición farmacéutica de la invención al órgano o tejido deseado se puede lograr por administración directa

(e.g., por inyección, etc.) en la superficie externa del órgano o tejido afectado por medio de inserción de un dispositivo adecuado, e.g., una cánula apropiada, por peñusión arterial o venosa (incluyendo mecanismos de flujo retrógrado) o por otros medios mencionados en esta descripción o conocidos en la técnica.

La composición farmacéutica de la invención, si se desea, se puede almacenar hasta el momento de su aplicación mediante los procedimientos convencionales conocidos por los técnicos en la materia. Esta composición farmacéutica también se puede almacenar junto a medicamentos adicionales, útiles en el tratamiento en enfermedades, en una forma activa que comprende una terapia combinada.

COMPOSICIONES Y MEDIO DE CUL TlVO DE LA INVENCiÓN

Los autores de la presente invención también han demostrado que el uso de un inhibidor de histona deacetilasa sirve para potenciar la diferenciación de una célula madre a megacariocito. Así, dichos inhibidores se pueden utilizar para mejorar las condiciones de cultivo in vitre de los progenitores de megacariocitos y megacariocitos inmaduros. Las composiciones y el medio de cultivo de la invención, aumentan las tasas de maduración de estos , lo que puede ser usado para incrementar la producción de plaquetas.

Por tanto, un noveno aspecto de la invención se refiere al uso de un inhibidor de histona deacetilasa para diferenciar una célula madre a megacariocito. En una realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor de histona deacetilasa es la Tricostatina A. Dichos inhibidores pueden encontrarse también formando parte de una composición, de ahora en adelante segunda composición de la invención. Además,los inhibidores y/o la segunda composición de la invención puede formar parte, también, de un medio de cultivo, o de una composición farmacéutica para su uso como medicamento.

SISTEMA DE PRODUCCiÓN DE PLAQUETAS

Un décimo aspecto de la invención se refiere a un sistema o dispositivo de producción de plaquetas para la producción in vitro y/o ex vivo de las plaquetas de la invención que comprende:

a) un biorreactor para la expansión de las células madre en presencia de un primer medio de crecimiento en comunicación fluída con;

b) una cámara de maduración que comprende células estromales y/o un nicho de médula ósea artificial y un segundo medio de crecimiento, en el que la cámara de maduración está en comunicación fluída con;

e) una cámara de separación de células para la selección de megacariocitos maduros que está en comunicación fluída con;

d) un módulo de producción de plaquetas que comprende una pluralidad de cámaras de producción de plaquetas, una matriz tridimensional, un tercer medio de crecimiento, y una pluralidad de bombas para mover el tercio del medio de crecimiento a través de las cámaras de producción de plaquetas, en el que el módulo de producción de plaquetas está en comunicación fluída con ;

e) una cámara de recogida de plaquetas.

donde las células madre del paso (a) están transfectadas con el gen SCL.

En una realización preferida, el sistema o dispositivo de producción de plaquetas se utiliza para aumentar la expansión celular de las células madre y I o progenitores de megacariocitos, por tanto, incorpora en uno o varios medios decrecimiento empleados en alguno de sus pasos un inhibidor de histona deacetilasa. Aún más preferiblemente, el inhibidor de histona deacetilasa es la Tricostatina A. En otra realización preferida de la invención, las células estromales, son células estromales OP9.

Los dispositivos de producción de plaquetas o sistemas de cultivo de células son conocidos en el estado del arte y el sistema no se limita al dispositivo descrito en este documento. Así, por ejemplo pero sin limitarnos, los biorreactores, vasos, cámaras y bolsas son bolsas de recogida de células, tales como bolsas de recogida de sangre estériles conocidas por las personas con conocimiento normal en las técnicas de bancos de sangre. En otras formas de realización, los vasos, las cámaras y las bolsas son recipientes biocompatibles estériles de cualquier diseño.

EJEMPLOS DE LA INVENCiÓN

Material y métodos

Cultivo de hPSC

Las lineas hPSCs AND1 y HS181 (vector vacio (EV) o SCL (SCL)) ya se han caracterizado (Real, P.J. et al. , 2012. Mol. Therapy 20(7):1443-53). Estas lineas se mantuvieron indiferenciadas en cultivo libre de nutrientes siguiendo el protocolo descrito por Ramos-Mejía, V. el al., 2010. Mol. Therapy 18(12):2173-81 ). En resumen, las hPSCs se cultivaron sobre Matrigel (SO Bioscience, San Jase, CA) en frascos T25 en un medio nutritivo suplementado con 8ng/mL de factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) (Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania). El medio se renovó diariamente y los cultivos confluentes se separaron semanalmente mediante colagenasa IV durante 2-5 minutos (lnvitrogen, Edimburgo, Escocia). Se obtuvo la aprobación del comité nacional de ética para estudios con embriones para el trabajo con hPSCs.

Diferenciación de megacariocitos desde PSCs.

El protocolo de diferenciación de megacariocitos se adaptó del grupo del Dr. Lanza (Lu, S.J. et al., 2011. CeJl Res. 21(3):530-45). En resumen, hPSCs indiferenciadas en confluencia en dispositivosT-25 se trataron con colagenasa IV durante 2-5 minutos y se desechó el Matrigel sobrante. Con la finalidad de formar cuerpo embriodes (EB), las hPSCs se transfirieron a placas de fijación "ultra-Iow" (Corning, Lowell , MA) en medio EB (Dulbecco KO modificado con medio Eagle suplementado con 20% de suero fetal bovino no inactivado por calor, 1% de aminoácidos no esenciales 1 mmol/L de Lglutamina y 0,1 mmol/L de j3-mercaptoetanol) y sin citoquinas. Al dia siguiente se cambió el medio para eliminar los restos celulares y se refrescó el medio EB suplementado con proteína morfogenética ósea 4 (BMP4) (50 ng/mL), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (50 ng/mL) y factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) (20ng/mL). Desde el día 3 al8 se continuó con medio EB que contenía BMP4 (50 ng/mL), VEGF (50 ng/mL) y bFGF (20 ng/mL), factor célula madre (SCF) (20 ng/mL), trombopoietina (TPO) (20 ng/mL), Fms-Tirosina kinasa ligando 3 (FL T3L) (20 ng/mL), Desde el día 8 hasta el final de la fase de diferenciación (15 días) el cóctel de citoquinas suplementado con medio EB se simplificó con TPO (50 ng/mL) y SCF (20 ng/mL). Todas las citoquinas se adquirieron de PeproTech (Londres, Reino Unido).

En el día 10 de la diferenciación EB, 3x104 células por pocillo se sembraron en placas de 6 pocillos para formar el estroma celular. El día 15 de la etapa de diferenciación EB,

las EBs se disociaron en colagenasa B {Roche, Suiza) durante 2 horas a 37 oC seguido de 10 minutos de incubación con buffer de disociación celular (Invitrogen) a 37°C. Las células se lavaron con PBS, se centrifugaron a 1200rpm durante 4 minutos. La suspensión de una sola célula se obtuvo mediante pipeteo suave con 2 mi de medio de diferenciación OP9 (DM: medio basal alpha-MEM, 10% de FBS no ¡nactivado por calor, 100f.lM monotioglicerol y 50 mg/mL de ácido ascórbico que contiene TPO (100 ng/mL), SCF (50 ng/mL) y heparina (25 U/mL). Las células se cultivaron en DM durante el resto de la etapa de diferenciación de OP9 (desde el día 15-32) con refresco continuo cada 2-3 días. A partir del día 20 en adelante se añadió al cultivo celular el inhibidor de metaloproteinasas GM6001 (Merck Milipore, Bellerica, MA) (50 DM) para evitar la escisión de CD42b en plaquetas.

Para evaluar la diferenciación megacariocítica se llevó a cabo un análisis de antígenos de superficie CD41a y CD42b en el co-cultivo de de OP9 desde el día 18 hasta el final del protocolo de diferenciación cada 2 días. La mitad de los medios se recolectó, recogiendo las células en suspensión, y la misma cantidad de medio nuevo de completó para continuar el cultivo de diferenciación. Las células se centrifugaron a 800 9 durante 5 minutos, se tiñeron en PSS con FCS al 2% y 2mM de EDTA usando anticuerpos de ratón antihumanos CD41a-PE (eBiosciences , San Diego, CA) (dilución 1/100) y CD42b-APC (Siolegend, San Diego, CA) (dilución 1/50) y analizados con un citómetro de flujo FACSCantoll equipado con el software Diva FACS (Secton Dickinson , Franklin Lakes, NJ). La cuantificación del número de células y plaquetas doblemente positivas CD41 a-l-y CD42b+ se desarrollaron añadiendo una cantidad conocida de Microesferas Perfect-Count (Cytognos, Salamanca, España) a la suspensión celular antes del análisis FACS.

Integrina allbB3 con capacidad de activación vinculante a PAC-1

Los megacariocitos y las plaquetas se recogieron por centrifugación a 800 9 durante 5 minutos, se lavaron con buffer Tyrode (NaCl (150 mM), KCI (2,9 mM), NaHC03 (12 mM), glucosa (0,1%), BSA (0 ,1%), HEPES (5 mM)) con calcio y magnesio (CaCI, (1 mM) y MgCI2 (1 mM)) y se resuspendió en 100 ~L del mismo tampón. Después, las plaquetas y las células se tiñeron con el anticuerpo anti-CD42b-APC durante 20 minutos a temperatura ambiente, activado mediante la adición de 70M de 5' adenina di-fosfato (ADP) durante 10 minutos a temperatura ambiente y posteriormente se tiñeron usando el anticuerpo PAC-1-FtTC (SD biosciences) que reconoce la forma activada de la integrina allbj33. Las células y las plaquetas se incubaron durante 20 minutos adicionales a temperatura ambiente. Las células control se tiñeron con ambos

anticuerpos pero no activados por AOP. Por último, la tinción PAC-1 se analizó usando un citómetro de flujo FACSCanto 11.

Activación por fibrinógeno

El día anterior del experimento de activación, 8 pocillos de cámaras (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) se recubrieron con 100 g/mL de fibrinógeno (Sigma-Aldrich, 8t Louis, MO) preparado en PBS y se incubaron durante la noche a 4 oC. Las plaquetas y las células se recogieron, se centrifugaron a 800 9 durante 5 minutos, se re suspendieron en tampón Tyrode. Al ser activados con AOP (50 ~M) o trombina (2 U/mL) 105 megacariocitos y plaquetas se incubaron durante 2 horas a 37 oC, después se fijaron con 2% de paraformaldehido (PFA) durante 20 minutos y se lavaron con PSB.

Citoguímica

Para realizar la evaluación citológica en la suspensión celular del co-cultivo de OP9, las células se recogieron, se fijaron con paraformaldehído al 2% y se lavaron dos veces con PBS. A continuación, las células se fijaron a portaobjetos tratados con polilisina por citospina a 800 9 durante 15 minutos, se desecaron y tiñeron utilizando la tinción de Papanicolau. Alternativamente, las células y plaquetas con fibrinógeno activado se tiñeron usando el mismo protocolo. Los portaobjetos teñidos se analizaron bajo microscopia óptica y las imágenes se tomaron con un escáner 2,0 NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japón)

Análisis de precursores de megacariocitos

Se evaluó la aparición de células precursoras de megacariocíticas (CD34 ' y CD34 ' CD41a+) durante las etapas de diferenciación EB en los días 10, 14 Y 17 de diferenciación. Un tercio de las EB en crecimiento de una placa de 6 pocillos se recogieron y lavaron una vez con PBS. De la misma manera, para evaluar el efecto de la tricostatina A (TSA) en la diferenciación, las EBs se trataron con DMSO o TSA a 10 nM o 100nM durante 14 días. En ambos casos las EBs se disociaron con colagenasa B y tampón de disociación como se ha descrito anteriormente. Se obtuvo una suspensión celular homogénea después del lavado de EBs con PBS y resuspendiéndose en 300 L de PBS con 2% de FCS y 2 mM de EDTA con precaución hasta que no se observan grumos. Las células disociadas se tiñeron con los anticuerpos anti-CD34-PECy7 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania) y antiCD41a-PE y 7AAD. Las células vivas identificadas por exclusión de 7AAD se analizaron utilizando un citómetro de flujo FACSCanto 11.

Aislamiento de ARN PCR-RT y análisis gPCR

El ARN total procedente de hPSCs indiferenciadas, hEBs y suspensión celular de cocultivo OP9 se aislaron usando Trizol (Invitrogen) como se ha descrito previamente (Real, P.J. el al., 2009. Nat. Med. 15(1):50-8). El ADNc se generó con el "Super Script 5 First Strand Sythesis System" para RT-PCR (Invitrogen) y analizada mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) usando Brilliant 111 Ultra-Fast SYBR Green QPCR

Master Mix (Agilent Technotogies, La Jotla, CA) y et sistema OPCR Mx3005P (Agilent

Technologies). El gen GAPDH se utilizó para normalizar los datos y la expresión relativa se calculó utilizando el método de MCT. Las secuencias de primers se 10 enumeran en la tabla 1:

Nombre del primer: Secuencias SEQID

GAPDH Fw: GAAGGTGAAGGTCGGAGT SEO ID NO: 3

GAPDH Rv: GAAGATGGTGATGGGATTTC SEO ID NO: 4

CD41 Fw: TGAGCCGCATTTACGTGGAAA SEO ID NO: 5

CD41 Rv: CTTCACAGTAACGCTTGTCCC SEO ID NO: 6

CD61 Fw: GTGACCTGAAGGAGAATCTGC SEO ID NO: 7

CD61 Rv: TCACTCACTGGGAACTCGATG SEQ ID NO: 8

FLI-1 Fw: CCAACGAGAGGAGAGTCATCG SEO ID NO: 9

FLI-1 Rv: TTCCGTGTTGTAGAGGGTGGT SEO ID NO: 10

GATA1 Fw: TCACTCCCTGTCCCCAATAG SEO ID NO: 11

GATA1 Rv: GGAGAGTTCCACGAAGCTTG SEO ID NO: 12

NEF2 Fw: GCAGGAACAGGGTGATACAGC SEO ID NO: 13

NEF2 Rv: GAGCAGGGGCAGTAAGTTGT SEO ID NO: 14

SCL Fw: GGATGCCTTCCCTATGTTCA SEO ID NO: 15

SCL Rv: GGTGTGGGGACCATCAGTAA SEO ID NO: 16

Perfil de expresión génica y análisis de datos

A tos 14 dias, las EBs procedente de AND1 EV y AND1 SCL se rompieron y el ARN

total se aisló utilizando Trizo!. La calidad del ARN se verificó en la plataforma

15 Bioanalyzer Agilent 2100. Las muestras de ARN se etiquetaron (Agilent Low Input Quick Etiquetado kit Amp, Agilent Technologies) con Cy3 siguiendo el protocolo del fabricante. El procedimiento de hibridación se realizó utilizando el kit Agilent Gene Expression Hybridation (Agilent Technologies). Los fragmentos de ARNc etiquetados Cy3 se hibridaron con Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray 8x60K (Agilent

20 Technologies) utilizando las recomendaciones de Agilent. Dos muestras independientes por condición se etiquetaron e hibridado. La agrupación jerárquica de los genes las muestras se realizó con una correlación menos métrica. Los genes candidatos putativos con un doble cambio >2 y un valor de p<O,01 se consideraron diferencialmente expresados (EV vs SCL). Los 100 genes sobrerregulados y poco

regulados se seleccionaron y analizaron utilizando la herramienta cnline Connectivity Map (Lamb, J. el al., 2006. Science 313(5795):1929-35.) (1/IfW\N.broadin stitute. orgtema p).

Resultados

La sobreexpresión de SCL aumenta la producción de megacariocitos y plaquetas en hPSC.

En los últimos años se ha dilucidado el papel del factor de transcripción SCL en la especifiación hematopoyética de hPSCs. Los modelos celulares humanos se generaron por expresión forzada de SCL en hPSCs (Yung, S. et al., 2011 . Hum. Mol. Gen. 20(24):4932-46; Real, P.J. el al., 2012. Mol. Therapy 20(7):1443-53). Estas células conservan propiedades de pluripotencia y el aumento del potencial hematopoyético produciendo niveles altos de células progenitoras hematopoyéticas (CD34+ CD45+) y de células hematopoyéticas maduras (CD45+). También se ha visto que la sobreexpresión acelera la diferenciación eritroide. Recientemente, diferentes grupos han demostrado la participación de SCl en la diferenciación de megacariocitos a partir de ESCs (Changraoui, H. el al., 2011. Blood 118(3):723-35) y de células madre humanas hematopoyéticas CD34+ (Choi, E.S. el al., 1995. BJood 85(2):40213.; Tao, H. et al., 1999. Exp. Hematol. 27(2):293-301 ; Ma, D.C. et al., 2000. Eur. J. Haemalol. 64(5):304-14; De Bruyn, C. el al., 2005. Slem Cells Dev. 14(4):415-24). No obstante, la función de SCl durante la hematopoyesis humana en embriones o la generación in vitro de megacariocitos y plaquetas desde hPSCs es desconocida.

Para determinar el impacto de la expresión de SCl en ambos procesos, hPSCs se diferenciaron en presencia de un conjunto de citoquinas humanas como ya ha descrito el grupo del Dr. lanza (Figura 1A). Consiste en un protocolo de 2 fases. En primer lugar, las hPSCs forman cuerpo embrionario (EBs) inmediatamente en 14 días. El día 15 se desagregan y las células hPSCs derivadas se cultivan con células OP9 durante 17 días en medio de diferenciación suplementado con heparina, TPO y SCF. la cinética de aparición de megacariocitos y plaquetas se cuantificó durante la etapa de diferenciación en ca-cultivo por citometría de flujo (Figura 1 B Y C). la sobreexpresión de SCl aumentó la producción de megacariocitos y plaquetas en dos líneas celulares independientes. Como se muestra en la figura 1C, a los 18 días las hPSCs AND1 que sobreexpresaban SCL (SCL) generaron 15 veces más megacariocitos y 10 veces más plaquetas que las células control (EV). En el día 20, EV y SCl presentaron el pico de producción de megacariocitos y plaquetas, con un aumento de producción de 6 y 10 veces, respectivamente, a favor de las células que sobreexpresan SCl. A partir del día 24 en adelante, la megacariopoyesis y la trombopoyesis se redujeron drásticamente en las células AND1 acabando el proceso de diferenciación megacariocítica el día 28. En las células HS181 la cinética de aparición de megacariocitos y plaquetas es más progresiva. La producción de megacariocitos y plaquetas más elevada se observó a los 24 días con aumento de 10 Y 3 veces, respectivamente en células que sobreexpresan SCL (SCL). Este pico es seguido de un descenso pronunciado hasta el día 32, donde las células control HS181 (EV) cesan por completo la producción de plaquetas y megacariocitos, por su parte las células que sobreexpresan SCL eran todavía levemente productivas. Estos datos sugieren que SCL regula positivamente la diferenciación megacariocítica de hPSCs, aumentan el número de megacariocitos y plaquetas y mantienen su producción durante un periodo de tiempo más largo, sin tener en cuenta la línea hPSC empleada.

Por otro lado, se ha estudiado que estrategia de recolección es más eficiente en términos de producción de megacariocitos y plaquetas. En otro experimento, se recogió cada 2-4 días una fracción de sobrenadante de cultivo celular para su análisis y el volumen equivalente se repuso con medio de diferenciación. El uso de células HS181 tuvo una diferenciación de megacariocitos más progresiva, por tanto se probó en paralelo tres planes alternativos: i) una recolección el día 22; ii) una sola recolección el día 26; una primera recolección el día 22 seguida de un reemplazo del medio y una segunda recolección el día 26. La figura 10 muestra que la doble recolección es el procedimiento más eficaz para obtener una mejor producción de megacariocitos y plaquetas, en comparación con las recolecciones únicas de los días 22 y 26. Estos resultados indican que la estrategia acumulativa no es beneficiosa para incrementar la producción de megacariocitos y plaquetas, por otra parte la renovación del medio favorece la diferenciación las hPSCs a megacariocitos.

La sobreexpresión de SCL no afecta a las propiedades morfológicas moleculares y funcionales de los megacariocitos y plaquetas derivadas de hPSCs

Se desarrolló una caracterización detallada a diferentes niveles con la finalidad de evaluar el impacto de la sobreexpresión de SCL en los megacariocitos y plaquetas derivados a partir de hPSCs. En primer lugar, en HS181 se purificaron megacariocitos del sobrenadante de EV y SCL durante el ca-cultivo diferentes etapas de diferenciación, temprana (20 días) y tardía (32 días). Estas células se fijaron con formaldehido, concentradas con citospina y caracterizada utilizando una tinción con solución de Papanicolau (figura 2A). Como se muestra en la figura 2A, el sobrenadante HS181 SCL contenía una mayor concentración de megacariocitos en comparación con el conteo de EV, sin embargo no se detectaron diferencias morfológicas entre ellos. Como era de esperar, se observó un estado de diferenciación más maduro en el día 32 determinado porque se encontraron un número mayor de megacariocitos grandes y multinucleados. En segundo lugar, se realizó un análisis de la expresión génica al principio del punto de diferenciación (22 días) a partir del sobrenadante de HS181 control (EV) con sobreexpresión de SCL (SCL). Se encontraron cuatro factores de transcripción asociados a la diferenciación megacariocítica (FU-1, NFE2, GATA-1 Y SCL) y dos marcadores de superficie se analizaron por RT-PCR (figura 28). La expresión de FLI-1 y NFE2 estuvo sobreregulada en células HS181 Sel (Sel); mientras que no hubo diferencias de expresión en GATA-1 , CD41 y CD61 entre las células del control (EV) y SCl.

A continuación, se evaluó la funcionalidad de los megacariocitos derivados hPSCs. los megacariocitos derivados de cultivos control HS181 (EV) y de sobreexpresión de SCl (SCl) al día 26 se purificaron y cultivaron sobre portaobjetos recubiertos de fibronectina en presencia de trombina humana (2 U/mL) durante 2 horas (figura 2C). Después de esto, las célula no unidas se eliminaron y las células activadas se lavaron dos veces con PBS, se fijaron con formaldehido y se tiñeron utilizando el protocolo de tinción de Papanicolau. Curiosamente tanto las células megacariocíticas EV y SCL se activaron de manera similar y presentó un número similar de células unidas multinucleadas (Figura 2C). Además, a partir de una fracción de sobrenadante de HS181 control (EV) y con sobreexpresión de SCl se recogieron el día 26, se lavaron dos veces con PBS y se activa mediante la adición de 5' adenina di-fosfato (ADP) durante 10 minutos. Después de que las células y plaquetas se tiñeron utilizando el anticuerpo PAC-1 , que reconoce la forma activada de la integrina al lbj3 3, se analizaron por citometría de fluj o (figura 2D). Es importante destacar que los megacariocitos y plaquetas obtenidos a partir de células control (EV) y con sobreexpresión de SCl, son igualmente funcionales y los niveles de activación por ADP son muy cercanos. Estos resultados apoyan que la sobreexpresión de SCl no modifica la funcionalidad de los megacariocitos y las plaquetas derivadas de hPSCs.

la sobreexpresión de SCl acelera la emergencia de progenitores megacariociticos a partir de hPSCs.

En estudios anteriores, se ha propuesto que la sobreexpresión de SCl promovió la aparición de progenitores hematopoyéticos y de ertiro-megacariocitos, así como acelerar la diferenciación de eritroides. Sin embargo, el linaje de diferenciación de megacariocitos no ha sido estudiado y este es el tema principal del estudio. Para demostrar que la sobreexpresión de SCL potencia los el surgimiento de progenitores megacariocíticos a partir de hPSCs, se extendió la etapa inicial de diferenciación hasta el día 17 y se analizó la aparición de células madre CD34 y progenitores megacariocíticos (CD34+CD41 +) a diferentes tiempos (10,14 Y 17 días) por citrometría de flujo (figura 3A y 3B). Como se muestra en la figura 3C, la sobreexpresión de SCL aceleró significativamente la emergencia de ambas poblaciones. Este efecto es particularmente drástico en el caso de las poblaciones CD34+CD41 + que alcanzó del 5 al 7-8% del total de células dentro del EB durante la diferenciación de hPSCs que sobreexpresan SCL, en contraste con la baja tasa de detección (por debajo del 0,5%) en células control (EV). Además, los megacariocitos más maduros CD41 + CD42+ derivados podrían ser detectados sólo el día 17 en EBs que sobreexpresan SCl (datos no mostrados).

Con el fin de demostrar aún más el efecto de la sobreexpresión de SCl en la aceleración del surgimiento de progenitores de megacariocitos se desarrolló un análisis de la expresión génica en los mismos puntos de tiempo (10, 14 Y 17 días). los niveles de expresión de los factores de transcripción y los marcadores de superficie asociados a megacariocitos con diferenciación temprana se evaluaron con RT-PCR cuantitava usando los ESs control (EV) al dia 10 (Figure 3D). Es importante destacar que tres factores de transcripción y dos marcadores de superficie fueron significativamente sobrerregulados en EBs que sobreexpresaban SCl en los tres puntos de tiempo. la dinámica de expresión de NFE2, GATA-1, CD41 y CD61 fue muy similar con el aumento continuo de la diferenciación. Mientras que la expresión de FLI1 fue muy elevada y constante en toda la diferenciación de EBs SCl, se registró una

ligera: inducción en el control EBS (EV). Estos datos confirmaron que la

sobreexpresión: de SCl promueve y mejora la aparición de progenitores

megacariocíticos a partir de hPSCs.

la sobreexpresión de SCl imita parcialmente el efecto de los inhibidores de histona desacetilasa durante la diferenciación megacariocítica.

Una vez que se confirmó que la sobreexpresión de SCl en hPSCs aceleró la aparición de progenitores megacariociticos, se profundizó en los mecanismos moleculares y de regulación de la transcripción mediados por SCl durante el desarrollo megacariocítico a partir de hPSCs. Se desarrollaron pertiles de expresión génica con micromatrices de oligonucleótidos en células control (EV) y con sobreexpresión de SCl (SCl) a los 14 días de la etapa de diferenciación EBs, ya que fue el momento donde el EBs se desagrega y se siembran con células del estroma según el protocolo estándar (Figura

2.

1A). Este análisis mostró un desarrollo megacariocítico mas eficiente al día 14 en EBs SCL con muchos genes asociados a la diferenciación hematopoyética y la hemostasia. Entre ellos encontramos los cinco genes previamente analizados en la figura 3D. Usando el software Ingenuity (WWIN.ingenuity.com) también se construyó una red transcripcional controlada por SCL que regula muchos de los reguladores transcripcionales megacariocíticos (FLI-1, GATA1, GATA2, NEF2, RUNX1, etc) y sus genes diana (datos no mostrados).

Además, se utilizó una herramienta bioinformática pública denominada Connectivity Map, desarrollada por el Broad Institute. Este software complejo recoge una gran cantidad de perfiles de expresión génica a partir de varias líneas celulares estándares tratadas con una lista de moléculas bioactivas y compara estos perfiles con un conjunto de datos de expresión particular. Se han seleccionado los 100 genes más inducidos y repremidos en una agrupación jerárquica de EBs EV vs EBs SCL y se presentó la lista de este análisis. Se ha encontrado una correlación muy alta entre los principales genes y los perfiles de expresión de varias líneas celulares tratadas con Tricostatina A (TSA) en diferentes concentraciones (Tabla 2). El segundo compuesto que también se enriqueció fue vorinostat o suberoilanilida ácido hidroxámico. Ambas drogas están clasificadas como inhibidores de la histona desacetilasa. Para validar experimentalmente estos datos in silico se realizó un ensayo de diferenciación megacariocítica en presencia o ausencia de TSA en dos concentraciones alternativas (Figura 4A) y se analizaron los progenitores de megacariocitos a partir de hPSCs silvestres. Como se muestra en la figura 48, la adición de TSA desde el principio del proceso de diferenciación se asocia con un aumento en CD34+ CD41 + en los progenitores megacariocíticos a los 14 días de la etapa de diferenciación. Se van a realizar experimentos adicionales para optimizar el tiempo, las concentraciones y los inhibidores alternativos de la histona desacetilasa, tales como el ácido valproico o SAHA que deben ser confirmados. En conclusión, estos resultados muestran que la sobreexpresión de SCL puede controlar la actividad histona desacetilasa durante la diferenciación megacariocítica y que la caracterización de las vías moleculares inducidas por SCL puede ayudar a mejorar el proceso de desarrollo de megacariocitos a partir de hPSCs.

Claims

REIVINDICACIONES

1-. Uso de una secuencia polinucleotídica que consiste en la SEO ID No 1 o en una secuencia nucleotídica con una identidad de al menos un 80% con la secuencia SEO ID NO: 1, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre pluripotentes, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.
2.-Uso de un vector que comprende la secuencia nucleotídica definida de acuerdo con la reivindicación anterior, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre pluripotentes, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima
3.-El uso del vector de acuerdo con la reivindicación anterior, donde el vector es un vector lentiviral.
4.-Uso de una construcción genética que comprende el vector tal y como éste se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 2-3, para obtener megacariocitos productores de plaquetas funcionales a partir de células madre pluripotentes, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima
5.-El uso del vector según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, o de la construcción genética según la reivindicación 4, donde las células madre pluripotentes se seleccionan de la lista que consiste en células madre hematopoyéticas, células madre pluripotentes inducidas, células madre embrionarias, fibroblastos, megacariocitos inducidos o cualquiera de sus combinaciones con la premisa de que dichas células madre no hayan sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima
6.-El uso del vector o de la construcción genética según la reivindicación 5, donde las células madre son células madre pluripotentes inducidas.
7.-El uso del vector o de la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5-6, donde las células madre son células de un mamífero.
8.-El uso del vector o de la construcción genética según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, donde las células madre son células madre humanas no embrionarias.
9.-Un megacariocito productor de plaquetas funcionales obtenido por un método que comprende:

a) poner en contacto un vector tal y como se ha definido éste en cualquiera de las reivindicaciones 2-3, o una construcción genética según se define en la reivindicación 4, con una célula madre, donde dicha célula madre no ha sido obtenida por métodos que destruyan

o utilicen embriones humanos como materia prima;

b) seleccionar las células madre del paso (a) que han sido transducidas o transformadas con el vector y/o la construcción genética; y

e) diferenciar las células madre del paso (b) a megacariocitos maduros.
10.-El megacariocito según la reivindicación anterior, donde las células madre son células madre pluripotentes inducidas.
11.-El megacariocito según cualquiera de las reivindicaciones 9-10, donde las células madre son células de un mamífero.
12.-El megacariocito según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 , donde las células madre son células madre humanas no embrionarias.
13.-El megacariocito según cualquiera de las reivindicaciones 9-12, donde la diferenciación de las células madre a megacariocitos del paso (c) se lleva a cabo diferenciando las células madre a progenitores megacariocíticos mediante la adición de una composición que comprende un inhibidor de histona deacetilasa.
14.-El megacariocito según la reivindicación 13, donde el inhibidor de histona deacetilasa es la T ricostatina A.
15.-El megacariocito según cualquiera de las reivindicaciones 9-14, donde la diferenciación de las células madre a megacaríocilos maduros del paso (c) comprende co-cultívar las células madre con células del estroma.
16. Un método para la producción de plaquetas in vi/ro que comprende cultivar el megacariocito productor de plaquetas funcionales, tal y como se ha definido éste en cualquiera de las reivindicaciones 9-15, en un medio de cultivo adecuado.
17.-El uso de un megacariocito obtenido según cualquiera de las reivindicaciones 9-15, o de una plaqueta obtenida según el método de la reivindicación 16, en la elaboración de un medicamento o como vector dirigido a los sitios de daño vascular.
18.-El uso de un megacariocito obtenido según cualquiera de las reivindicaciones 9-15, o de una plaqueta obtenida según el método de la reivindicación 16, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de patologías relacionas con las plaquetas y/o leucemias megacarioblásticas agudas.
19.-Uso de un inhibidor de histona deacetilasa para diferenciar una célula madre a megacariocito, donde dicha célula madre no ha sido obtenida por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.
20.-Uso de una composición que comprende un inhibidor de histona deacetilasa para diferenciar una célula madre a megacariocito, donde dicha célula madre no ha sido obtenida por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como materia prima.
21.-Un sistema o dispositivo de producción de plaquetas para la producción in vitro y/o ex vivo de las plaquetas de la invención que comprende:

a) un biorreactor para la expansión de las células madre pluripotentes, donde dichas células madre no han sido obtenidas por métodos que destruyan o utilicen embriones humanos como maleria prima, en presencia de un primer medio de crecimiento en comunicación fluída con

b) una cámara de maduración que comprende células estroma les y/o un nicho de médula ósea artificial y un segundo medio de crecimiento, en el que la cámara de maduración está en comunicación fluída con

c) una cámara de separación de células para la selección de megacariocitos maduros que está en comunicación f1uída con

d) un módulo de producción de plaquetas que comprende una pluralidad de cámaras de producción de plaquetas, una matriz tridimensional, un tercer medio de crecimiento, y una pluralidad de bombas para mover el tercio del medio de crecimiento a través de las cámaras de producción de plaquetas, en el que el módulo de producción de plaquetas está en comunicación fluída con

e) una cámara de recogida de plaquetas; donde las células madre del paso (a) están transfectadas con la secuencia polinucleotídica tal y como se ha definido ésta en la reivindicación 1.