KR20210126061A - 미생물 내 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생합성 방법 - Google Patents

미생물 내 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생합성 방법 Download PDF

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엘렌 쓰꼬르넥
쎌리아 루쎌
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Abstract

본 발명은 디오스민 및 헤스페리딘을 생산할 수 있도록 변형된 재조합 미생물 및 디오스민 및/또는 헤스페리딘을 생산하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

미생물 내 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생합성 방법
본 발명은 디오스민 및 헤스페리딘의 생산 방법에 관한 것이다.
다플론은 혈관긴장 및 혈관 보호 효과를 지닌 플라보노이드의 혼합물이다. 당해 혼합물은 주로 ~85%의 디오스민, ~8%의 헤스페리딘 및 미량의 다양한 플라본 및 이의 각각의 산화된 형태로 구성된다.
의약을 생산하는 현재의 방법은, 작은 오렌지의 껍질로부터의, 헤스페리딘(94%) 및 이소나린긴(~3%), 네오폰시린(~2%) 및 헤스페레틴(<1%)을 주로 함유하는 플라보노이드의 혼합물의 산/염기 추출이다. 이후에 이러한 혼합물은 화학적 공정을 통해 제어된 산화를 겪고, 약 90%의 헤스페리딘을 디오스민, 및 이의 산화된 형태의 소량의 플라보노이드로 전환시킨다.
따라서, 다플론의 생산은 오렌지 플라보노이드의 정제된 추출물의 공급과 관련되어 있으며, 이는 기후 변화, 통화 이동의 변동 및 수개의 나라(주로, 멕시코, 지중해 분지의 국가 및 중국)의 수십개 지역으로부터의 공급 곤란성의 결과로 변할 수 있다.
따라서, 오렌지 플라보노이드의 정제된 추출물을 공급하는 날씨 변화(vagary)에 의존하지 않는 다플론의 대안적인 생산 방법이 이용가능하도록 하는 것이 가치있을 수 있다. 따라서, 디오스민 및 헤스페리딘의 생성성 공정에 대한 불만족스러운 요구가 존재한다.
발명의 요약
본 발명자는 재조합 미생물에서 디오스민 및 헤스페리딘의 생합성 방법을 개발하였다.
따라서, 본 발명은:
- 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7번 위치에서 글루코스를 첨가할 수 있는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 람노즈를 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 6번 위치내로 전달할 수 있는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- UDP-람노스를 생산할 수 있는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물에 관한 것이다.
바람직하게는, 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)는 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis), 시트러스 클레멘티나(Citrus clementina), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis) 또는 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터의 효소이다. 특히, 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)는 아라비돕시스 탈리아나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)로부터의 효소이다. 바람직하게는, 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)는 시트러스 시넨시스 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터 유래된다.
플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제는 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드로부터 선택될 수 있다. 특히, 이는 서열 번호: 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 폴리펩타이드로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다. 바람직하게는, 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제는 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호: 113로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
바람직하게는, 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT)는 바람직하게는 시트러스 속(genus Citrus) 또는 페튜니아 하이브리다(Petunia hybrida), 바람직하게는 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis), 시트러스 막시마(Citrus maxima), 또는 시트러스 클레멘티나(Citrus clementina), 보다 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나의 식물 효소이다. 바람직하게는, 6"-O-람노실트랜스퍼라제는 서열 번호: 103, 105로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다. 보다 특히 바람직하게는, 6"-O-람노실트랜스퍼라제는 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
바람직하게는, UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)는 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터 선택된 식물 효소이다. 바람직하게는, UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제는 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다. 보다 특히 바람직하게는, UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제는 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
일 구현예에서, 본 발명에 다른 미생물은 또한:
- 타이로신 암모니아 리아제(TAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및/또는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 나린게닌-찰콘 신타제(CHS)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 찰콘 이소머라제(CHI)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- O-메틸-트랜스퍼라제(OMT)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하고, 및
- 임의로, 타이로신을 L-DOPA으로 및 또한 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있는 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제를 암호화하는 이종 핵산 서열; 또는 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있는 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 미생물은:
- 서열 번호: 41 및 39로부터 선택된 서열을 포함하는 타이로신 암모니아 리아제(TAL) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 타이로신 암모니아 리아제(TAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 123, 125, 43, 45, 47 및 49로부터 선택된 서열을 포함하는 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 123, 125 및 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열, 및 특히 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 53, 51, 55 및 57로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 신타제(CHS) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 53으로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 61 및 59로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 이소머라제(CHI) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 미생물은 칼리스테푸스 키넨시스(Callistephus chinensis), 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파(Perilla frutescens var. crispa), 페투니아 엑스 하이브리다(Petunia x hybrida), 게르베라 하이브리다(Gerbera hybrida), 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 피로셀라 오피시나룸(Pilosella officinarum), 오스테오스페르뭄 하이브리드 쿨티바르(Osteospermum hybrid cultivar), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 시트러스 클레멘티나 또는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis)로부터, 특히 칼리스테푸스 키넨시스, 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페튜니아 엑스 하이브리다, 헤르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스, 아라비돕시스 탈리아나 또는 피로셀라 오피시나룸으로부터의 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H), 바람직하게는 서열 번호: 7, 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7, 11, 17 및 121을 갖는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
보다 특히 바람직하게는, 미생물은 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 (F3'H) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 미생물은 시트러스, 특히 시트러스 클레멘티나 또는 시트러스 시넨시스로부터, 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 O-메틸-트랜스퍼라제(OMT), 바람직하게는 서열 번호: 119, 117, 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 보다 특히 바람직하게는, 이는 서열 번호: 119, 117 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 119 및 117로부터 선택된 서열 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 미생물은:
- 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를, 특히 서열 번호: 63, 65 및 77, 바람직하게는 서열 번호: 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL, 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 67, 69 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H), 특히 C4H, 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
미생물은 또한 에리오딕티올로부터, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum), 제아 마이스(Zea mays), 로니세라 자포니카(Lonicera japonica), 로니세라 마크란토이데스(Lonicera macranthoides), 칼리스테푸스 키넨시스(Callistephus chinensis), 아피움 그라베올렌스(Apium graveolens), 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula), 쿠미눔 시미눔(Cuminum cyminum), 아에투사 시나피움(Aethusa cynapium), 안젤리카 아르칸젤리카(Angelica archangelica), 코니움 마쿨라툼(Conium maculatum), 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 시나라 카르둔쿨루스 바르 시콜리무스(Cynara cardunculus var scolymus), 사우쑤레아 메두사(Saussurea medusa), 플렉트란투스 바르바투스(Plectranthus barbatus), 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis), 도르코세라스 하이그로메트리쿰(Dorcoceras hygrometricum), 안티리눔 마주스(Antirrhinum majus), 페릴라 프루테스센스 바르 크리스파(Perilla frutescens var crispa), 다흘리아 핀나타(Dahlia pinnata) 또는 에리트란테 레위시이(Erythranthe lewisii)로부터 루테올린을 생산할 수 있는 플라본 신타제(FNS), 특히 플라본 신타제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다. 플라본 신타제(FNS)는 서열 번호: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택될 수 있다. 특히, FNS는 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.
더욱이, 이는 또한:
- 시토크롬 P450 리덕타제(CPR)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및/또는
- S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT)를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, CPR은 서열 번호: 25, 23, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 특히 서열 번호: 25로부터 선택된 서열 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
바람직하게는, 미생물은 효모 또는 세균, 바람직하게는 사카라마이세스 속(genus Saccharomyces), 특히 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 세균, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다.
본 발명은 또한 디오스민 및/또는 헤스페리딘을 생산하기 위한 본 문서에 기술된 바와 같은 미생물의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 문서에 기술된 바와 같은 미생물을을 배양하고, 임의로 디오스민 및/또는 헤스페리딘을 수거함을 포함하는 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생산 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 디오스민 및/또는 헤스페리딘을 생산하기 위한 본 발명에 따른 미생물의 사용 동안, 배양 배지에 공급된 나린게닌, 아피게닌, 에리도딕티올, 루테올린, 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴은 존재하지 않는다.
발명의 상세한 설명
작은 오렌지의 껍질 속에서 헤스페레틴의 생합성을 위한 경로는 불완전하게 이해되어 있다. 따라서, 본 발명자는 수개의 생합성 경로를 탐구하고 재조합 미생물 속에서 디오스민 및 헤스페리딘의 생합성을 개발하는데 성공하였다.
정의
용어 "미생물"은 단세포 유기체를 지칭한다. 바람직하게는, 미생물은 세균 또는 효모이다.
용어 "재조합 미생물"은 천연에서 발견되지 않고 하나 이상의 이종 유전자 성분의 삽입, 변형 또는 결실 후 변형된 게놈을 함유하는 미생물을 지칭한다.
용어 "재조합 핵산"은 변형되지 않고 천연 미생물 속에 존재하지 않는 핵산을 지칭한다. 예를 들면, 당해 용어는 천연 프로모터가 아닌 프로모터에 작동적으로 연결된 암호화 서열 또는 유전자를 나타낼 수 있다. 이는 또한 인트론이 엑손 및 인트론을 포함하는 유전자에 대해 결실된 암호화 서열을 나타낼 수 있다.
용어 "이종"은 유전자가 유전 가공에 의해 세포내로 도입됨을 의미한다. 이는 세포내에서 에피소옴 또는 염색체 형태로 존재할 수 있다. 유전자의 기원은 이것이 도입된 세포의 것과는 상이할 수 있다. 그러나, 유전자는 또한 이것이 도입된 세포와 동일한 종으로부터 유래될 수 있지만, 이는 이의 비천연 환경을 고려할 때 이종으로 고려된다. 예를 들면, 유전자 또는 핵산 서열은 이의 천연 프로모터 이외의 프로모터의 제어 하게 있으므로 이종이며, 이는 이것이 천연적으로 위치하는 것과는 상이한 위치에 도입된다. 숙주 세포는 이종 유전자의 도입 전에 내인성 유전자의 카피(copy)를 함유할 수 있거나 내인성 카피를 함유하지 않을 수 있다. 더욱이, 핵산 서열은 암호화 서열이 숙주 미생물내 발현에 대해 최적화되었다는 의미에서 이종일 수 있다. 바람직하게는, 본 문서에서, 이종 핵산 서열은 숙주 세포에 대해 이종인, 즉, 효모내에 천연적으로 존재하지 않는 단백질을 암호화한다.
숙주 미생물과 관련하여, 본원에 사용된 바와 같은, 용어 "천연의" 또는 "내인성"은 상기 미생물 내에 천연적으로 존재하는 유전 성분 또는 단백질을 지칭한다.
용어 "유전자"는 단백질을 암호화하는 임의의 핵산을 나타낸다. 용어 "유전자"는 DNA, 예를 들면, cDNA 또는 gDNA, 및 또한 RNA를 포함한다. 유전자는 우선 재조합적, 효소적 및/또는 화학적 기술을 통해 제조할 수 있고, 후속적으로 시험관내에서 숙주 세포 또는 시스템 내에서 복제될 수 있다. 유전자는 전형적으로 목적한 단백질을 암호화하는 개방 판독 프레임을 포함한다. 유전자는 전사 종결인자 또는 신호 펩타이드와 같은 추가의 서열을 함유할 수 있다.
유전 코드의 축퇴(degeneracy)의 결과로서, 수개의 핵산은 특수한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있다. 따라서, 주어진 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열내 코돈을 변형시켜 특수한 미생물내 최적의 발현을 예를 들면, 이러한 미생물에 대해 적합한 코돈 해독 표를 사용하여 수득할 수 있다. 핵산은 또한 특수한 효모에 대해 바람직한 GC 함량에 따라서 및/또는 반복 서열의 수를 감소시키기 위해 최적화시킬 수 있다. 특정의 구현예에서, 이종 핵산은 관련된 미생물내 발현에 대해 코돈-최적화되었다. 코돈 최적화는 당해 분야에 공지된 통상의 공정을 통해 수행될 수 있다(참고: 예를 들면, Welch, M., et al. (2011), Methods in Enzymology 498: 43-66).
용어 "작동적으로 연결된"은 제어 서열이 암호화 서열에 대하여 적합한 위치에 위치함으로써, 제어 서열이 암호화 서열의 발현을 제어함을 나타낸다.
용어 "제어 서열"은 유전자의 발현에 필요한 핵산 서열을 나타낸다. 제어 서열은 천연 또는 이종일 수 있다. 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되고 현재 사용된 제어 서열이 바람직할 것이다. 이러한 제어 서열은 리더(leader), 폴리아데닐화 서열, 프로펩타이드 서열, 프로모터, 신호 펩타이드 서열 및 전사 터미네이터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 제어 서열을 프로모터 및 전사 터미네이터를 포함한다.
용어 "발현 카세트"는 암호화 영역, 즉, 유전자, 및 조절 영역, 즉, 작동적으로 연결된, 하나 이상의 제어 서열을 포함하는 영역을 포함하는 핵산 작제물을 나타낸다. 바람직하게는, 제어 서열은 숙주 미생물에서 사용하기에 적합하다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "발현 벡터"는 발현 카세트를 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 나타낸다. 바람직하게는, 발현 벡터는 선형 또는 환형 이중 가닥 DNA 분자이다. 벡터는 또한 복제 오리진(origin of replication), 선택 마커 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해서, 2개의 핵산 서열 또는 아미노산 서열 사이의 "동일성 퍼센트"라는 용어는 가장 우수한 정렬 후 수득된, 비교될 2개의 서열 사이에 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 퍼센트를 나타내는 것으로 의도되고, 이러한 퍼센트는 순수하게 통계적이고 2개의 서열 사이의 차이는 무작위적으로 및 이의 전체 길이에 걸쳐 존재한다. 가장 우수한 정렬 또는 최적의 정렬은 하기 계산된 바와 같이, 비교될 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트가 가장 높은 정렬이다. 2개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 서열 비교는 이들이 최적으로 정렬된 후 이러한 서열을 비교함으로써 편리하게 수행되며, 상기 비교는 분절(segment) 또는 비교 윈도우(window)에 의해 수행되어 서열 유사성을 지닌 국소 영역을 확인하고 비교한다. 아미노산 서열 동일성의 퍼센트를 측정할 목적의 정렬은 당해 분야에 잘 공지된 다양한 방식으로, 예를 들면, 인터넷, 예를 들면, http: //blast.ncbi.nlm. Nih.gov/ 또는 http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/) 상에서 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용함으로써 수행할 수 있다. 당해 분야의 기술자는 비교된 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 수득하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함한, 정렬을 측정하기 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성의 퍼센트의 값은 Needleman-Wunsch 알고리즘의 수단으로 2개 서열의 최적의 정렬을 생성하는 EMBOSS Needle 쌍 서열 정렬을 사용하여 생성된 값을 지칭하며, 여기서 모든 조사 매개변수는 디폴트 표기 매트릭스(default Notation matrix) = BLOSUM62, 개방 갭(Open gap) = 10, 연장된 갭(Extended gap) = 0.5, 말단 갭 패널티(end gap penalty) = 거짓(false), 개방 말단 갭(open end gap) = 10 및 연장된 말단 갭(extended end gap) = 0.5로 정의된다. 특정의 구현예에서, 본 특허원에서 언급된 동일성의 퍼센트 모두는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 95% 동일성으로 설정될 수 있다. 특히, 효소의 서열 동일성의 퍼센트 모두가 적어도 80% 또는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성인 구현예가 기술된 바와 같이 고려된다.
일 구현예에서, 폴리펩타이드는 서열 번호에 기술된 서열과 관련하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 첨가, 치환 또는 결실을 함유할 수 있다. 특히 이러한 첨가, 치환 또는 결실은 N-말단 끝, C-말단 끝 또는 말단 둘 다에서 도입된다.
폴리펩타이드는 임의로 융합 단백질의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "과발현" 및 "증가된 발현"은 상호교환적으로 사용되고 유전자 또는 효소의 발현은 변형되지 않은 미생물, 예를 들면, 야생형 미생물 또는 본원에 기술된 유전적 변형을 포함하지 않는 미생물과 관련하여 증가됨을 의미한다. 용어 "야생형"은 천연에 존재하는 변형되지 않은 미생물을 지칭한다. 효소의 증가된 발현은 일반적으로 상기 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시킴으로써 수득된다. 유전자 또는 효소가 본 발명의 미생물 속에 천연적으로 존재하지 않는 구현예, 즉 이종 유전자 또는 효소에서, 용어 "과발현" 및 "발현"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 유전자의 발현을 증가시키기 위해, 당해 분야의 기술자는 유전자의 고 수준의 발현을 유도하는 프로모터, 즉, 강력한 프로모터를 사용함으로써, 상응하는 전령 RNA를 안정화시키는 성분 또는 리보소옴 결합 부위(RBS)를 봉쇄하는 서열 및 이를 둘어싼 서열을 사용함으로써, 임의의 공지된 기술, 예를 들면, 미생물 속의 유전자의 카피의 수를 증가시키는 것을 사용할 수 있다. 특히, 과발현은 미생물 속의 유전자의 카피 수를 증가시킴으로써 수득할 수 있따. 유전자의 하나 이상의 카피는 당해 분야의 기술자에게 공지된 재조합 공정, 예를 들면, 유전자의 교체 또는 다중-카피 통합(참고: 예를 들면, 국제 특허원 제WO 2015/092013호)을 통해 게놈내로 도입시킬 수 있다. 바람직하게는, 바람직하게는 강력한 프로모터의 제어 하에 위치하는, 유전자는 포함하는 발현 카세트는 게놈내로 통합된다. 변이체로서, 유전자는 바람직하게는 강력한 프로모터의 제어 하에 위치한, 목적한 유전자를 지닌 발현 카세트를 포함하는, 발현 벡터, 바람직하게는 플라스미드에 의해 수반될 수 있다. 발현 벡터는 복제 오리진의 특성에 따라서, 하나 이상의 카피로 미생물 속에 존재할 수 있다. 유전자의 과발현은 유전자의 고 수준의 발현을 유도하는 프로모터를 사용하여 수득할 수 있다. 예를 들면, 내인성 유전자의 프로모터는 강력한 프로모터, 즉, 보다 높은 발현 수준을 유도하는 프로모터로 대체될 수 있다. 천연의 프로모터가 아닌 프로모터의 제어하에 내인성 유전자는 이종 핵산으로 명명된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 프로모터는 당해 분야의 기술자에게 공지되어 있고 구성적 또는 유도성일 수 있고, 내인성 또는 이종일 수 있다.
용어 "포함하는"은 또한 "로 이루어진" 또는 "로 필수적으로 이루어진"을 의미한다. 용어 "로 필수적으로 이루어진"은 서열이 서열 번호로 기술된 서열과 관련하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 첨가, 치환 또는 결실을 함유할 수 있다.
재조합 미생물
본 발명에 따른 미생물은 진핵 또는 원핵세포 미생물일 수 있다.
제1 구현예에서, 미생물은 진핵세포이다. 바람직하게는, 이는 사카로마이세테탈레스(Saccharomycetales), 스포리디오볼라레스(Sporidiobolales) 및 스키조사카로마이세탈레스(SchizoSaccharomycetales) 목의 효모이다. 효모는 예를 들면, 피키아(Pichia), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 칸디다(Candida), 피로마이세스(Lipomyces), 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리디움(Rhodosporidium), 야로위아(Yarrowia), 또는 다바리오마이세스(Debaryomyces)로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 클루이베로마이세스 마륵시아누스(Kluyveromyces marxianus), 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae),사카로마이세스 카를스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로마이세스 디아스타티쿠스(Saccharomyces diastaticus), 사카로마이세스 도우글라시이(Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 클루이베리(Saccharomyces kluyveri), 사카로마이세스 노르벤시스(Saccharomyces norbensis), 사카로마이세스 오비포르미스(Saccharomyces oviformis), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis), 로도스포리디움 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica), 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii) 및 리포마이세스 스타케이이(Lipomyces starkeyi)로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 미생물은 사카로마이세스 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 효모이다. 대안적으로, 미생물은 진균, 바람직하게는 사상균(filamentous fungus)이다. 바람직하게는, 이는 아스퍼길러스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma), 뉴로스포라(Neurospora), 포도스포라(Podospora), 엔도티아(Endothia), 무코르(Mucor), 코키오볼루스(Cochiobolus) 또는 피리쿨라리아(Pyricularia)로부터 선택된다. 우선적으로, 진균은 아스퍼길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans), 아스퍼길러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼길러스 아와마리(Aspergillus awomari), 아스퍼길러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 아스퍼길러스 테레우스(Aspergillus terreus), 뉴로스포라 크라싸(Neurospora crassa), 트리코데르마 레에세이(Trichoderma reesei) 및 트리코데르마 비리데(Trichoderma viride)로부터 선택된다.
제2의 구현예에서, 미생물은 원핵 세포이다. 바람직하게는, 이는 특히 필룸 악시도박테리아(phylum Acidobacteria), 악티노박테리아(Actinobacteria), 아퀴피카에(Aquificae), 박테리오이데테스(Bacterioidetes), 클라미디아에(Chlamydiae), 클로로비(Chlorobi), 클로로플렉시(Chloroflexi), 크리시오게네테스(Chrysiogenetes), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 데페리박테레스(Deferribacteres), 데이노코쿠스-써무스(Deinococcus-Thermus), 딕티오글로미(Dictyoglomi), 피브로박테레스(Fibrobacteres), 피르미쿠테스(Firmicutes), 푸소박테리아(Fusobacteria), 겜마티모나데테스(Gemmatimonadetes), 니트로스피라에(Nitrospirae), 플란크토마이세테스(Planctomycetes), 프로테오박테리아(Proteobacteria), 스피로카에테스(Spirochaetes), 서모데설포박테리아(Thermodesulfobacteria), 서모미크로비아(Thermomicrobia), 써모토가에(Thermotogae) 또는 베루코미크로비아(Verrucomicrobia)로부터 선택된다. 바람직하게는, 세균은 아카리오클로리스(Acaryochloris), 아세토박터(Acetobacter), 악티노바실러스(Actinobacillus), 아그로박테리움(Agrobacterium), 알리사이클로바실러스(Alicyclobacillus), 아나바에나(Anabaena), 아나시스티스(Anacystis), 아나에로비오스피릴룸(Anaerobiospirillum), 아퀴펙스(Aquifex), 아르트로박터(Arthrobacter), 아르트로스피라(Arthrospira), 아조박터(Azobacter), 바실러스(Bacillus), 브레비박테리움(Brevibacterium), 브루콜데리아(Burkholderia), 클로로비움(Chlorobium), 크로마티움(Chromatium), 클로로바쿨룸(Chlorobaculum), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 시아노테세(Cyanothece), 엔테로박터(Enterobacter), 데이노코쿠스(Deinococcus), 에르위니아(Erwinia), 에스케리키아(Escherichia), 게오박터(Geobacter), 글로에박터(Gloeobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 하이드로게노박터(Hydrogenobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코쿠스(Lactococcus), 만하이미아(Mannheimia), 메소리조비움(Mesorhizobium) 메틸로박테리움(Methylobacterium), 마이크로박테리움(Microbacterium), 마이코시스티스(Microcystis), 니트로박터(Nitrobacter), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 니트로스피나(Nitrospina), 니트로스피라(Nitrospira), 노스톡(Nostoc), 포르미디움(Phormidium), 프로클로로코쿠스(Prochlorococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 랄스토니아(Ralstonia), 리조비움(Rhizobium), 로도박터(Rhodobacter), 로도코쿠스(Rhodococcus), 로돕세우도모나스(Rhodopseudomonas), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 살모넬라(Salmonella), 스케네데스문(Scenedesmun), 세라티아(Serratia), 시겔라(Shigella), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 시네콕쿠스(Synechoccus), 시네코시스티스(Synechocystis), 써모시텍초코쿠스(Thermosynechococcus), 트리초데스미움(Trichodesmium) 또는 자이모모나스(Zymomonas) 속에 속한다. 보다 바람직하게는, 세균은 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens), 아나에로비오스피릴룸 석시니시프로두센스(Anaerobiospirillum succiniciproducens), 악티노바실러스 석시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 아퀴펙스 아에올리쿠스(Aquifex aeolicus), 아퀴펙스 피로필루스(Aquifex pyrophilus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀴파시네스(Bacillus amyloliquefacines), 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 임마리오필룸(Brevibacterium immariophilum), 클로스트리디움 파스테우리아눔(Clostridium pasteurianum), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 클로스트리디움 베이게린키이(Clostridium beigerinckii), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator), 쿠프리아비두스 메탈리두란스(Cupriavidus metallidurans), 엔테로박터 사카자키이(Enterobacter sakazakii), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 클루코노박터 옥시단스(Gluconobacter oxydans), 하이드로게노박터 써모필루스(Hydrogenobacter thermophilus), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 만하이미아 석시니키프로두센스(Mannheimia succiniciproducens), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니이(Pseudomonas mevalonii), 슈도모나스 푸디카(Pseudomonas pudica), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 리조비움 에틀리이(Rhizobium etli), 로도박터 캅술라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides), 로도스피릴룸 로브룸(Rhodospirillum rubrum), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 살모넬라 파이피(Salmonella typhi), 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 시겔라 다이센테리아데(Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 손네이(Shigella sonnei), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토마이세스 코엘리콜로르(Streptomyces coelicolor), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis), 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 아르쓰로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르쓰로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 클로로비움 테피둠(Chlorobium tepidum), 클로로바쿨룸 종(Chlorobaculum sp.), 시아노테세 종(Cyanothece sp.), 글로에오박터 비올라세우스(Gloeobacter violaceus), 미크로시스티스 아에루기노사(Microcystis aeruginosa), 노스톡 푼쿠티포르메(Nostoc punctiforme), 프로클로로코쿠스 마리누스(Prochlorococcus marinus), 시네초코쿠스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus), 시네초시스티스 종(Synechocystis sp.), 써모시네초코쿠스 엘롱가투스(Thermosynechococcus elongatus), 트리초데스미움 에리쓰라에움(Trichodesmium erythraeum) 및 로돕세우도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris) 종으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세균, 예를 들면, 이. 콜라이(E. coli) BL21, 이. 콜라이 BL21(DE3), 이. 콜라이 MG1655 또는 이. 콜라이 W31 10 종 및 이의 유도체로부터 선택된다. 대안적인 구현예에서, 미생물은 스트렙토마이세스 속, 특히 스트렙토마이세스 베네주엘라에(Streptomyces venezuelae)이다.
미생물을 변형시켜 타이로신 및/또는 페닐알라닌, 바람직하게는 타이로신의 생산을 증가시킬 수 있다. 특히, 타이로신 및/또는 페닐알라닌, 바람직하게는 타이로신의 생산의 피드백 억제(feedback inhibition)에 관여하는 유전자는 불활성화될 수 있다. 대안적으로 또는 누적적으로, 타이로신 및/또는 페닐알라닌, 바람직하게는 타이로신의 생합성 경로는 타이로신 및/또는 페닐알라닌, 바람직하게는 타이로신에 경로를 향한 다른 대사 경로로부터 탄소의 유동을 재지시함으로써 최적화시킬 수 있다. 이러한 변형 및 이러한 유전자는 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다(참고: US 8,809,028; Pandey et al., 2016, Biotechnol. Adv., 34, 634-662).
따라서, 일 구현예에서, 미생물은 특히 글루코스와 같은 단순한 탄소원으로부터 다량의 타이로신 및/또는 페닐알라닌을 생산한다.
헤스페리딘 및/또는 디오스민의 생산을 가능하도록 하는 변형
본 발명에 따른 재조합 미생물을 변형시켜 헤스페리딘 및/또는 디오스민을 생산하였다. 특히, 미생물이 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴 각각으로부터 헤스페리딘 및/또는 디오스민을 생산하도록 하기 위하여, 미생물을 변형시켜 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 7번 위치에서 헤스페리틴 및/또는 디오스메틴의 글리코실화 및 6번 위치에서 람노스의 전달에 필요한 효소를 도입시켰다.
제1 구현에에서, 재조합 미생물은 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 생산할 수 있고: 특히, 이는 이러한 목적으로 변형되었다. 대안의 구현예에서, 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴은 예를 들면, 이러한 화합물을 배양 배지에 가함으로써, 미생물에 제공될 수 있다.
하나의 특수한 구현에에서, 미생물은 헤스페리딘을 생산한다. 이후에, 디오스민은 화학적 전환에 의해, 특히 산화에 의해 헤스페리딘으로부터 제조될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 미생물은 헤스페리딘 및 디오스민을 생산한다.
따라서, 재조합 미생물은:
a. 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7번 위치에서 글루코스를 가할 수 있는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
b. 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 6번 위치로 람노스를 전달할 수 있는 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
c. UDP-람노스를 생산할 수 있는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT), 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)는 미생물에 대해 이종인 효소이다.
UGT: 플라보논 7-O-베타-글루코실트랜스퍼라제
UGT는 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7번 위치로 글루코스의 전달을 수행하는 효소이다. UGT의 명칭은 UDP-글루코스: 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 또는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제이다. 다음의 명칭으로도 또한 지칭된다: 우리딘 디포스포글루코스-플라보논 7-O-글루코실트랜스퍼라제, 나린게닌 7-O-글루코실트랜스퍼라제, 및 헤스페레틴 7-O-글루코실-트랜스퍼라제. 당해 효소는 EC 2.4.1.185 부류에 속한다.
본 발명자는 기질로서 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 수용할 수 있고 이러한 화합물의 7번 위치내에 글루코스를 가할 수 있는 효소를 확인하여 선택하였다. 바람직하게는, 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7번 위치에 글리코실화에 대한 선호도를 가지도록 효소를 선택하여야 했다. 바람직한 구현예에서, 효소는 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7번 위치에 대해 특이적이다.
따라서, 미생물은 헤스페레틴 및 디오스메틴의 7번 위치내에 글루코스를 가할 수 있는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
용어 "7-O-베타-글리코실트랜스퍼라제 활성"은 플라보노이드의 7번 위치에 글루코스를 가할 수 있는 UGT 효소를 지칭한다. 7-O-베타-글리코실트랜스퍼라제 활성이 있는지를 측정하기 위하여, 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 효소를 NAD(P)H, O2, 및 플라보노이드의 존재하에, 최적의 조건(pH, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하고, UPLC-MS로 관찰하고, 7번 위치에서 추가의 글루코스를 함유하는 플라보노이드의 출현에 대해 예측된 표준과 비교하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 플라보노이드는 헤스페레틴 또는 디오스메틴이고 7번 위치에서 추가의 글루코스를 함유하는 플라보노이드는 7번 위치에서 추가의 글루코스를 지닌 이의 형태, 즉, 헤스페레틴 7-O-글루코시드 및 디오스메틴 7-O-글루코시드이다.
당해 효소는 보다 고등의 진핵세포, 특히 식물에서만 존재한다. 예를 들면, 효소는 시트러스 속, 특히 시트러스 막시마(Citrus maxima), 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis), 시트러스 클레멘티나(Citrus clementina), 시트러스 미티스(Citrus mitis) 및 시트러스 엑스 파라디시(Citrus x paradisi), 라이시움(Lysium), 특히 라이시움 바르바룸(Lysium barbarum), 페투니아(Petunia), 특히 페투니아 엑스 하이브리다(Petunia x hybrida), 아라비돕시스(Arabidopsis), 특히 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 또는 스쿠텔라리아(Scutellaria), 특히 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)로부터의 효소이다.
일 구현예에서, UGT는 아리비돕시스 탈리아나, 크쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터의 효소이다. 바람직하게는, UGT는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 효소이다.
바람직한 구현예에서, UGT는 시트러스 시넨시스, 시트러스 클레멘티나, 아라비돕시스 탈리아나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터, 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 효소이다.
특수한 구현예에서, UGT는 서열 번호: 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호: 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 특히 기질로서 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 사용하여 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, UGT는 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다. 보다 특히 바람직하게는, UGT는 서열 번호: 113, 115 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
따라서, UGT는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 NM_119576 및 NP_567995.1 하에 기술되어 있고, 보다 특히 서열 번호: 91에 기술되어 있다. 단백질은 또한 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 UGT73B1 하에 기술되어 있다.
대안적으로, UGT는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)로부터 유래된다. 제1 양태에서, 제1의 UGT 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 KU712253 및 AMK52071.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 93으로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 A0A140DPB7 하에 기술되어 있다. 제2 양태에서, 제2의 UGT 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 KU712254 및 AMK52072.1 하에 기술되어 있고, 보다 특히 서열 번호: 95로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 A0A140DPB8 하에 기술되어 있다. 제3 양태에서, 제3의 UGT 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 KU712255 및 AMK52073.1 하에 기술되어 있고, 보다 특히 서열 번호: 97로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 A0A140DPB9 하에 기술되어 있다.
더욱이, UGT는 호모 사피엔스로부터 유래될 수 있다. 제1 양태에서, UGT는 UGT1A6(UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 계열 1 구성원 A6)이다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 P19224 하에 기술되어 있다. 컨센서스(consensus) 암호화 서열은 NCBI에 번호 CCDS2507.1 하에 기술되어 있다. 당해 효소의 서열은 서열 번호: 99로 기술되어 있다. 제2 양태에서, UGT는 UGT1A7(UDP 글루쿠로노실트랜스퍼라제 계열 1 구성원 A7)이다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q9HAW7 하에 기술되어 있다. 컨센서스 암호화 서열은 NCBI에 번호 CCDS2506.1 하에 기술되어 있다. 당해 효소의 서열은 서열 번호: 101에 기술되어 있다.
UGT는 또한 시트러스, 특히 시트러스, 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나로부터 유래될 수 있다. 특히, 시트러스 시넨시스로부터의 UGT는 서열 번호: 113에 기술되어 있다. 당해 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호: 114에 기술되어 있다. 시트러스 클레민티나로부터의 UGT는 서열 번호: 115에 기술되어 있다. 당해 효소를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열 번호: 116에 기술되어 있다.
바람직한 구현예에서, UGT는 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호: 113으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 당해 효소와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
RhaT: 6-O-람노실트랜스퍼라제
RhaT는 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 6번 위치내로 람노스의 전달을 수행하는 효소이다. RhaT는 6-O-람노실트랜스퍼라제이다. 당해 효소는 EC 2.4.1.B53 부류에 속한다.
본 발명자는 기질로서 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드를 허용할 수 있고 이러한 화합물의 글루코스의 6번 위치에서 람노스를 첨가할 수 있는 효소를 확인하고 선택하여야 한다.
따라서, 미생물은 람노스를 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 6번 위치로 전달할 수 있는 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 이러한 효소는 보다 고등 진핵세포, 특히 식물에만 존재한다.
용어 "6-O-람노실트랜스퍼라제 활성"은 효소 RhaT에 의한 글루코스의 6번 위치에서 람노스의 첨가를 의미한다. 6-O-람노실트랜스퍼라제 활성이 존재하는지를 시험하기 위하여, 6-O-람노실트랜스퍼라제 효소를 NAD(P)H, O2, 및 플라보노이드의 존재 하에, 최적의 조건(pH, 이온 등)에서 시험관내(in vitro) 항온처리하고, UPLC-MS로 관찰하고 람노스가 글루코스의 6번 위치에 가해진 플라보노이드의 출현에 대해 예측된 표준과 비교하는 것으로 이루어진, 효소 시험을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 플라보노이드는 헤스페레틴 7-O-글루코시드 또는 디오스메틴 7-O-글루코시드 및 람노스가 헤스페리딘 및 디오스민의 글루코스의 6번 위치에 가해진 플라보노이드이다.
바람직하게는, 당해 효소는 시트러스 속 또는 페투니아 하이브리다, 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 시트러스 막시마, 또는 시트러스 클레멘티나 종의 식물에 의해 생산된 효소이다. 바람직하게는, 효소는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나로부터 유래되는 효소이다.
특수한 구현예에서, 6-O-람노실트랜스퍼라제는 서열 번호: 103, 105로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
따라서, RhaT는 시트러스 클레멘티나로부터 유래될 수 있다. 이는 핵산 서열의 경우 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 번호 XM_006420965 및 단백질 서열의 경우 번호 XP_006421028 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 103에 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 V4RJL6 하에 기술되어 있다.
RhaT는 또한 시트러스 시넨시스로부터 유래될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 번호 DQ119035 하에 및 단백질 서열의 경우 번호 ABA18631.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 105로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 A7ISD3 하에 기술되어 있다.
특수한 구현예에서, RhaT는 시트러스 시넨시스로부터 유래되고 서열 번호: 105의 서열 또는 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 효소로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, RhaT는 서열 번호: 103로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
RHM: UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제
RHM은 삼기능성 효소 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제이다.이러한 효소는 UDP-글루코스로부터 UDP-람노스를 생산할 수 있다. 이러한 효소는 EC 4.2.1.76 부류에 속한다. UDP-람노스는 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 활성에 필수적이다.
따라서, 미생물은 UDP-람노즈를 생산할 수 있는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 이러한 효소는 보다 고등 진핵세포, 특히 식물에서만 존재한다.
용어 "UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성"은 UDP-람노스로 UDP-글루코스의 형질전환을 의미한다. UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성이 존재하는지를 측정하기 위하여, UDP-글루코스 효소, NAD(P)H 및 O2를 최적의 조건(pH, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하고, UPLC-MS로 관찰하고 UDP-람노스의 출현에 대해 예측된 표준과 비교하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다.
바람직하게는, 이러한 효소는 시트러스 속의 식물, 특히 시트러스 시넨시스, 또는 아라비돕시스 탈리아나에 의해 생산된 효소이다.
특수한 구현예에서, UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제는 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
RHM은 시트러스 시넨시스로부터 유래될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 번호 XM_006477756 및 단백질 서열의 경우 번호 XP_006477819.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 107로 기술되어 있다.
RHM은 또한 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래될 수 있다. 제1 양태에서, 단백질은 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 번호 AY081471 하에 및 단백질 서열의 경우 번호 AAM10033.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 109로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q9SYM5 하에 기술되어 있다. 제2 양태에서, 단백질은 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 번호 AJ565874 하에 및 단백질 서열의 경우 번호 CAD92667.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 111에 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q9LPG6 하에 기술되어 있다.
특수한 구현예에서, RHM은 서열 번호: 107 및 109로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, RHM은 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
효소의 조합
특수한 구현예에서, 재조합 미생물은:
- 아라비돕시스 탈리아나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT), 바람직하게는 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 특히 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 113, 115 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 시트러스 속 또는 페투니아 하이브리다, 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 시트러스 막시마, 또는 시트러스 클레멘티나, 심지어 보다 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나의 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT), 바람직하게는 서열 번호: 103 및 105로부터 선택된 서열을 포함하는 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 RhaT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 시트러스 시넨시스로부터 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 (RHM), 바람직하게는 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 107 및 109로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 재조합 미생물은 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 선행 구현예에서 정의된 바와 같은 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 아라비돕시스 탈리아나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터, 바람직하게는 아라비옵시스 탈리아나 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)를 암호화하는 이종 핵산 서열, 바람직하게는 서열 번호: 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 특히 서열 번호: 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 미생물은:
- 서열 번호: 113, 115 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된, 바람직하게는 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 113로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 103로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 6"-O-람노실트랜스퍼라제를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. 특수한 구현예에서, 상기 기술된 효소는 보다 높은 진핵 세포, 바람직하게는 식물 세포로부터의 효소이다. 특수한 구현예에서, 효소는 동일한 속, 예를 들면, 동일한 종의 식물로부터 유래된다.
헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 생산을 가능하도록 하는 변형
앞서 나타낸 바와 같이, 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴은 미생물에 적용되거나, 미생물은 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 생산할 수 있다. 특히, 미생물은 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 생산할 수 있거나 생산할 수 있도록 변형되었다. 따라서, 본 발명자는 또한 미생물이 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 생산하도록 하는 생합성 경로를 개발하였다.
나린게닌/아피게닌으로부터 헤스페레틴/디오스메틴까지
헤스페레틴 및/또는 디오스메틴은 나린게닌 및 아피게닌으로부터 수득될 수 있다.
수개의 생합성 전략이 가능하였다. 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 제조하기 위하여, 2개의 변형: 4' 위치에서 하이드록실의 메틸화 및 3' 위치에서 하이드록실화를 만드는데 필수적이다. 따라서, 4' 위치에서 하이드록실의 메틸화의 특이성을 증가시키기 위하여, 이는 3' 위치에서 제2의 하이드록실 그룹을 가하기 전에 이미 존재하는 하이드록실 그룹의 메틸화를 우선 수행하는 것이 타당한 것으로 여겨진다. 대조적으로, 본 발명자는 제2의 하이드록실의 도입으로 인하여 메틸화 특이성 문제의 위험성에도 불구하고, 우선 하이드록실화에 이어 메틸화를 수행하는 것이 필수적이라는 결론에 도달하였다.
F3'H: 플라보노이드 3'-모노옥시게나제
플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)는 나린게닌 및/또는 아피게닌의 3' 위치에서 하이드록실 그룹의 첨가를 수행하는 효소이다. 당해 효소는 EC 1.14.14.82 부류에 속한다. 이는 또한 플라본 3'-하이드록실라제로서 공지되어 있다.
본 발명자는 기질로서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 수용할 수 있고 이러한 화합물의 3' 위치에서 하이드록실 그룹을 가할 수 있는 효소를 확인하고 선택하였다. 바람직하게는, 효소는 나린게닌 및/또는 아피게닌의 3' 위치에서 하이드록실화에 대한 선호도를 가지도록 선택된다. 바람직한 구현예에서, 효소는 나린게닌 및/또는 아피게닌의 3' 위치에 대해, 특히 5' 위치와 관련하여 특이적이어서 3' 및 5' 위치에서 이중 하이드록실화를 피하고, 바람직하게는 또한 5' 위치에서 하이드록실화를 피한다.
플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)는 나린게닌 및/또는 아피게닌의 3' 위치에서 하이드록실 그룹의 첨가를 수행하는 효소이다. 이러한 효소는 EC 1.14.14.82 부류에 속한다. 이는 또한 플라보노이드 3'-하이드록실라제로 공지되어 있다.
용어 "플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성"은 CPR-의존성 F3'H 효소에 의한 3'-하이드록실화된 플라보노이드로 플라보노이드의 형질전환을 의미한다. 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성이 존재하는지를 측정하기 위해, 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 효소를 NAD(P)H, O2, 및 플라보노이드의 존재하에, 최적 조건(pH, 이온 등) 하에 시험관내 항온처리하고, UPLC-MS로 관찰하고 3'-하이드록실화된 플라보노이드의 출현에 대해 예측된 표준물과 비교하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 플라보노이드는 나린게닌 또는 아피게닌이고 3'-하이드록실화된 플라보노이드는 이의 3'-하이드록실화된 형태, 즉, 에리오딕티올 또는 루테올린이다.
따라서, 미생물은 나린게닌 및/또는 아피게닌의 3' 위치에서 하이드록실을 가할 수 있는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)를 암호화하는 를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, F3'H는 알리움(Allium), 아라비돕시스, 브라씨카(Brassica), 칼리스테푸스(Callistephus), 콜룸네아(Columnea), 시트러스, 디안투스(Dianthus), 겐티아나(Gentiana), 게르베라(Gerbera), 글리시네(Glycine), 프라가리아(Fragaria), 이포모에아(Ipomoea), 말루스(Malus), 마티올라(Matthiola), 오스테오스페르뭄(Osteospermum), 오리자(Oryza), 파네로차에테(Phanerochaete), 페릴라(Perilla), 페트로셀리눔(Petroselinum), 펠라르고니움(Pelargonium), 피로셀라(Pilosella), 페투니아(Petunia), 신닌기아(Sinningia), 소르굼(Sorghum), 토레니아(Torenia), 비티스(Vitis) 또는 제아(Zea), 예를 들면 알리움 세파(Allium cepa), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 브라씨카 나푸스(Brassica napus), 콜룸네아 하이브리다(Columnea hybrida), 칼리스테푸스 키넨시스(Callistephus chinensis), 시트러스 신넨시스(Citrus sinensis), 시트러스 클레멘티나(Citrus clementina), 디안투스 카리오필루스(Dianthus caryophyllus), 프라가리아 베스카(Fragaria vesca), 프라가리아 엑스 아나나싸(Fragaria x ananassa), 게르베라 하이브리다(Gerbera hybrida), 글리신 막스(Glycine max), 겐티아나 트리플로라(Gentiana triflora), 이포모에아 닐(Ipomoea nil), 이포모에아 푸르푸레아(Ipomoea purpurea), 이포모에아 트리콜로르(Ipomoea tricolor), 마티올라 인카나(Matthiola incana), 말루스 도메스티카(Malus domestica), 오스테오스페르뭄 하이브리드 쿨티바르( Osteospermum hybrid cultivar), 오리자 사티바(Oryza sativa), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 피로셀라 오피시날룸(Pilosella officinarum), 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum), 펠라르고니움 엑스 호르토룸(Pelargonium x hortorum), 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파(Perilla frutescens var. crispa), 페투니아 엑스 하이브리다(Petunia x hybrida), 신닌기아 카르디날리스(Sinningia cardinalis), 소르굼 비콜로르(Sorghum bicolor), 토레니아 종(Torenia sp), 토레니아 하이브리드 쿨티바르(Torenia hybrid cultivar), 비티스 비니페라(Vitis vinifera) 또는 제아 마이스(Zea mays) 속의 식물로부터의 식물 효소이다. 보다 특이적인 구현예에서, F3'H는 알리움, 브라씨카, 칼리스테푸스, 콜룸네아, 시트러스, 디안투스, 겐티아나, 게르베라, 글리시네, 프라가리아, 이포모에아, 말루스, 마티올라, 오스테오스페르뭄, 오리자, 파네로차에테, 페릴라, 페트로셀리눔, 펠라르고니움, 피로셀라, 페투니아, 신닌기아, 소르굼, 토레니아, 비티스 또는 제아, 예를 들면 알리움 세파, 브라씨카 나푸스, 콜룸네아 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 시트러스 신넨시스, 시트러스 클레멘티나, 디안투스 카리오필루스, 프라가리아 베스카, 프라가리아 엑스 아나나싸, 게르베라 하이브리다, 글리신 막스, 겐티아나 트리플로라, 이포모에아 닐, 이포모에아 푸르푸레아, 이포모에아 트리콜로르, 마티올라 인카나, 말루스 도메스티카, 오스테오스페르뭄 하이브리드 쿨티바르, 오리자 사티바, 파네로차에테 크리소스포리움, 피로셀라 오피시날룸, 페트로셀리눔 크리스품, 펠라르고니움 엑스 호르토룸, 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 신닌기아 카르디날리스, 소르굼 비콜로르, 토레니아 종, 토레니아 하이브리드 쿨티바르, 비티스 비니페라 또는 제아 마이스 속의 식물로부터의 효소이다.
바람직하게는, F3'H는 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 게르베라 하이브리다, 시트러스 클레멘티나, 오스테오스페르뭄 하이브리드 쿨티바르, 파네로차에테 크리소스포리움, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스, 시트러스 시넨시스, 아라비돕시스 탈리아나 또는 피로셀라 오피시나룸으로부터의 효소이다. 특히, F3'H는 페릴라 푸루테스센스 바르.(var.) 크리스파, 페투니아 엑스(x) 하이브리다, 칼리스테푸스 치넨시스, 게르베라 하이브리다, 시트루스 시넨시스 및 필로셀라 오피시아눔으로부터의 효소일 수 있다.
특수한 구현예에서, F3'H는 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 121로부터, 특히 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호: 1, 5, 7, 11, 17, 19 및 121로부터, 특히 서열 번호: 1, 5, 7, 11, 17 및 19선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 특히 기질로서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 사용하여 및 3' 위치에서 하이드록실화와 함께 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는, 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다. 특수한 구현예에서, F3'H는 서열 번호: 5, 7 및 17로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
바람직한 구현예에서, F3'H는 서열 번호: 7, 11, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. 가장 특히 바람직하게는, F3'H는 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 75, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.
따라서, F3'H는 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 AB045593.1 및 BAB59005.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 2 및 1로 기술되어 있다.
F3'H는 파네로차에테 크리소스포리움으로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 AB597870.1 및 BAL05157.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 4 및 3에 기술되어 있다.
F3'H는 페투니아 엑스 하이브리다로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 AF155332.1 및 AAD56282.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 6 및 5로 기술되어 있다.
F3'H는 칼리스테푸스 키넨시스로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 AF313488.1 및 AAG49298.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 8 및 7로 기술되어 있다. 다른 구현예에서, 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 AF313489.1 및 AAG49299.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 10 및 9로 기술되어 있다.
F3'H는 게르베라 하이브리다로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 DQ218417.1 및 ABA64468.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 12 및 11로 기술되어 있다.
F3'H는 오스테오스페르뭄 하이브리드 쿨티바르로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 DQ250711.1 및 ABB29899.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 14 및 13로 기술되어 있다.
F3'H는 시트러스 클레멘티나로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 XM_006440673.1 및 XP_006440736.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 16 및 15로 기술되어 있다.
F3'H는 시트러스 시넨시스로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 XM_006477592.2 및 XP_006477655.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 18 및 17로 기술되어 있다.
F3'H는 피로셀라 오피시날룸로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 DQ319866.2 및 ABC47161.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 20 및 19로 기술되어 있다.
F3'H는 스트렙토마이세스 아베르미틸리스로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 SAV_4539 및 WP_010985964.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 22 및 21로 기술되어 있다.
F3'H는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 NM_120881.2 및 NP_196416.1 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 122 및 121로 기술되어 있다.
바람직하게는, F3'H는 서열 번호: 7, 11, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. 가장 특히 바람직하게는, F3'H는 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
바람직한 구현예에 따라서, F3'H는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
다른 특수한 구현예에 따라서, F3'H는 서열 번호: 17로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
다른 특수한 구현예에 따라서, F3'H는 서열 번호: 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
다른 특수한 구현예에 따라서, F3'H는 서열 번호: 11로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
CPR: 시토크롬 P450 리덕타제
플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)는 하이드록실 그룹의 첨가를 수행할 NADPH의 존재를 필요로 한다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 미생물은 시토크롬 P450 리덕타제, NADPH-시토크롬 P450 리덕타제를 암호화하는 이종 핵산을 포함한다. 이러한 효소는 EC 1.6.2.4 부류에 속한다.
시토크롬 P450 리덕타제는 진핵세포로부터, 특히 효모로부터, 예를 들면, 사카로마이세테탈레스 속으로부터, 또는 아라비돕시스, 암미(Ammi), 아비센니아(Avicennia), 카멜리아(Camellia), 캄프토테카(Camptotheca), 카타란투스(Catharanthus), 시트러스(Citrus), 글리신(Glycine), 헬리안투스(Helianthus), 로투스(Lotus), 메셈브리안테뭄(Mesembryanthemum), 파세올루스(Phaseolus), 피스코미트렐라(Physcomitrella), 피누스(Pinus), 포풀루스(Populus), 루타(Ruta), 사카룸(Saccharum), 솔라눔(Solanum), 비그나(Vigna), 비티스(Vitis) 또는 제아(Zea) 속으로부터 유래된다.
바람직한 구현예에서, 시토크롬 P450 리덕타제는 진핵세포로부터, 예를 들면, 효모로부터, 특히 사카로마세스 세레비지아에로부터, 또는 식물, 예를 들면, 칸타란투스 로세우스(Catharanthus roseus) 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된다.
특수한 구현예에서, 시토크롬 P450 리덕타제는 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택될 수 있다. 매우 특수한 구현예에서, 시토크롬 P450 리덕타제는 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택될 수 있다.
예를 들면, 시토크롬 P450 리덕타제는 카타란투스 로세우스로부터 유래될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 번호 X69791.1 하에 및 단백질 서열의 경우 번호 CAA49446.1 하에, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 24 및 23으로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q05001 하에 기술되어 있다.
시토크롬 P450 리덕타제는 사카로마이세스 세레비지아에로부터 유래될 수 있는 이는 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵선 서열의 경우 번호 NM_001179172.1 하에 및 단백질 서열의 경우 번호 NP_011908.1 하에, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 26 및 25로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 P16603 하에 기술되어 있다.
시토크롬 P450 리덕타제는 키메라일 수 있다. 이는 아이그라인(Aigrain) 등의 문헌(2009, EMBO Reports, 10, 742-747)에 기술되어 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열는 각각 서열 번호: 28 및 27에 기술되어 있다.
더욱이, 시토크롬 P450 리덕타제는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래될 수 있다. 시토크롬 P450이 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된 경우, 이는 ATR로 명명될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 NM_118585.4 및 단백질 서열의 경우 번호 NP_194183.1 하에, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 30 및 29로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q9SB48 하에 기술되어 있다.
또한, 시토크롬 P450 리덕타제는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래될 수 있고, NCBI로부터의 GenBank에 핵산 서열의 경우 NM_179141.2 및 단백질 서열의 경우 번호 NP_849472.2 하에, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 32 및 31로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q9SUM3 하에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 상술한 바와 같은 CRP을 암호화하는 서열의 신규 카피는 효모내로 도입된다. 다른 구현예에서, 효모가 사카로마이세스 세레비지아에이고 CPR이 동일한 효모로부터 유래된 경우, CPR을 암호화하는 내인성 유전자는 강력한 프로모터로 대체된다. 따라서, CPR의 발현은 야생형 효모와 관련하여 증가되며; 따라서 CPR은 변형된 효모내에서 과발현된다.
하나의 특수한 구현예에서, F3'H 및 CPR은 동일한 기원, 동일한 종으로부터 유래된다.
OMT: O-메틸트랜스퍼라제
O-메틸트랜스퍼라제(OMT)는 정의하기에 어려운 표적을 갖는 효소의 매우 큰 게열이다. 본 발명자는 4' 위치(파라 위치)에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제를 확인하고 선택하여야 한다.
바람직하게는, 효소는 에리오딕티올 및/또는 푸테올린의 4' 위치에서 메틸화에 대한 선호도를 갖도록 선택되었다. 바람직한 구현예에서, 효소는 에리오딕티올 및/또는 루테올린의 4' 위치에 대해 특이적이다. 용어 "특이적인"은 효소에 의해 에리오딕티올 및/또는 루테올린 상에 도입된 메틸 그룹이 경우들의 60%, 바람직하게는 경우의 70%, 및 심지어 보다 바람직하게는 경우의 80%는 4' 위치에서 발견되고, 나머지가 3' 위치내로 도입됨을 의미한다.
용어 "4'-O-메틸트랜스퍼라제 활성"은 4'-O-메틸트랜스퍼라제 효소에 의한 4'-하이드록시플라보노이드의 4'-메톡시플라보노이드로의 전환을 의미한다. 4'-O-메틸트랜스퍼라제 활성의 존재하는지의 여부를 측정하기 위하여, 4'-O-메틸트랜스퍼라제 효소, 4'-하이드록시플라보노이드 및 S-아데노실-L-메티오닌으로 구성된 혼합물을 최적의 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 4'-메톡시플라보노이드의 출현을 예측된 표준과 비교하여 UPLC-MS에서 관찰한다.
본 경우에, 4'-하이드록시플라보노이드는 에리오딕티올 또는 루테올린이며, 이는 각각 이의 4'-메톡시플라보노이드 형태, 즉, 헤스페레틴 또는 디오스메틴으로 전환된다.
따라서, 미생물은 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다.
효소는 보다 고등 원핵세포, 특히 식물에만 존재한다.
일 구현예에서, O-메틸트랜스퍼라제(OMT)는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 효소이다. 다른 구현예에서, O-메틸트랜스퍼라제(OMT)는 보다 고등 진핵세포, 바람직하게는 포유동물로부터 기원한다. 특히, O-메틸트랜스퍼라제(OMT)는 사람 기원(호모 사피엔스)이다.
특수한 구현예에서, OMT는 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화된, 서열 번호: 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
일 구현예에서, OMT는 서열 번호: 89 로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
다른 구현예에서, OMT는 서열 번호: 87로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
따라서, OMT는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 NM_118755.4 및 NP_567739.1로 기술되어 있다. 단백질은 또한 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q9C5D7 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 87로 기술되어 있다.
대안적으로, OMT는 호모 사피엔스로부터 유래된다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 NM_007310.2 및 NP_009294.1로 기술되어 있다. 단백질은 또한 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 P21964 하에, 및 보다 특히 서열 번호: 89로 기술되어 있다.
호모 사피엔스로부터의 OMT는 메틸화용 기질로서 에리오딕티올 및 루테올린을 수용하는 장점을 갖는 반면, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 OMT는 에리오딕티올에 대해 강한 선호도를 갖는다. 역으로, 헤스페레틴의 합성이 디오스메틴의 것과 비교하여 선호되어야 하는 경우, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 OMT가 장점을 가질 수 있다.
바람직한 구현예에서, OMT는 시트러스, 특히 시트러스 클레멘티나 또는 시트러스 시넨시스로부터의 OMT이다. 특히 바람직한 구현예에서, OMT는 서열 번호 117 및 119로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
바람직하게는, OMT는 서열 번호: 117로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
대안적으로, OMT는 서열 번호: 119로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
상술한 시트러스로부터 및 아라비돕시스 탈리아나로부터의 OMT는 4' 위치에서 에리오딕티올을 특이적으로 메틸화하는 장점을 갖는다.
미생물의 설계 동안에, 본 발명자는 이러한 메틸화 단계가 제한된 단계 중 하나로 구성됨을 관찰하였다. 놀랍게도, 미생물, 특히 효소에서 보조인자 S-아데노실-L-메티오닌의 존재에도 불구하고, 이러한 보조인자의 합성을 증가시키는 효소의 첨가는 당해 단계의 제한 양태를 없애는 것을 가능하도록 한다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 미생물은 또한 S-아데노실-L-메티오닌을 합성하는 효소, S-아데노실메티오닌 신타제(SAMT)를 암호화하는 이종 또는 내인성 서열을 포함한다. 이러한 효소는 EC 2.5.1.6 부류에 속한다.
일 구현예에서, 미생물은 특히 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 암호화할 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT)를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, SAMT는 가장 특히 미생물이 효소인 경우, 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지아에로부터 유래된다.
특수한 구현예에서, S-아데노실메티오닌 신테타제는 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신테타제 활성을 갖는 폴리펩타이드이다.
예를 들면, S-아데노실메티오닌 신타제는 사카로마이세스 세레비지아에로부터 유래될 수 있다. 이는 핵산 서열의 경우 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 NM_001180810.3 및 단백질 서열의 경우 번호 NP_010790.3에 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 P19358로 기술되어 있다.
일 구현예에서, 상기 정의된 바와 같은 SMAT를 암호화하는 서열의 신규 카피가 미생물내로 도입된다. 다른 구현예에서, 미생물이 사카로마이세스 세레비지아에인 경우, SMAT를 암호화하는 내인성 유전자의 프로모터는 강한 프로모터로 대체된다. 따라서, SAMT의 발현은 야생형 미생물과 비교하여 증가되며; 따라서 SAMT는 변형된 미생물에서 과발현된다.
따라서, 바람직한 구현예에서, 미생물은 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화할 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 S-아데노실-L-메티오닌을 생산할 수 있는 S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT)를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열을 포함한다.
FNS: 플라본 신타제
디오스메틴은 루테올린으로부터 생산될 수 있다. 이는 또한 이를 루테올린 내로 형질전환시킨 다음 루테올린으로부터 디오스메틴을 제조하거나, 이를 헤스페레틴내로 형질전환시킨 다음 헤스페레틴으로부터 디오스메틴을 제조함으로써, 에리오딕티올로부터 수득할 수 있다. 에리오딕티올을 루테올린으로 및/또는 헤스페레틴을 디오스메틴으로 전환시킬 수 있는 효소는 플라본 신타제(FNS)이다. 특수한 구현예에서, 플라본 신타제는 또한 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있다.
따라서, 미생물은 서열 플라본 신타제, 특히 에리오딕티올로부터 루테올린 및/또는 헤스페레틴으로부터 디오스메틴을 생산할 수 있는 플라본 신타제를 암호화하는 이종 핵산을 포함할 수 있다.
용어 "플라본 신타제 활성"은 FNSI 효소(CPR-독립적인) 또는 FNSII 효소(CPR-의존적인)에 의해 플라보논을 플라본으로 전환시킴을 의미한다.
플라본 신타제 활성이 존재하는지를 측정하기 위해, 플라본 신타제 효소(FNSI), 플라보논, 2-옥소글루타레이트 및 O2로 구성된 혼합물의 FNSI의 경우에 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 및 효소 FNSII, 플라보논, NAD(P)H 및 O2로 구성된 혼합물의 FNSII의 경우에 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 플라보논에 상응하는 플라본의 출현은 예측된 표준과 비교하여 UPLC-MS에서 관찰된다. 바람직하게는, 플라보논은 에리오딕티올 또는 헤스페레틴이고, 이는 각각 이의 플라본 형태, 즉, 루테올린 또는 디오스메틴으로 전환될 것이다.
따라서, 특수한 구현예에서, 미생물은 특히 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 에리오딕티올으로부터 루테올린 및/또는 헤스페레틴으로부터 디오스메틴을 생산할 수 있는 플라본 신타제, 특히 플라본 신타제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 플라본 신타제는 식물, 예를 들면, 아에투사(Aethusa), 안젤리카(Angelica), 안티리눔(Antirrhinum), 아피움(Apium), 아라비돕시스(Arabidopsis), 칼리스테푸스(Callistephus), 카멜리아(Camellia), 코니움(Conium), 쿠미눔(Cuminum), 시나라(Cynara), 다흘리아(Dahlia), 도르코세라스(Dorcoceras), 에리트란테(Erythranthe), 로이세라(Lonicera), 메디카고(Medicago), 오리자(Oryza), 페릴라(Perilla), 페트로셀리눔(Petroselinum), 플렉트란투스(Plectranthus), 포풀루스(Populus), 사우쑤레아(Saussurea), 스쿠텔라리아(Scutellaria) 또는 제아(Zea) 속, 특히 아라비돕시스, 로니세라, 메디카고(Medicago), 오리자, 페트로셀리눔, 포풀루스 또는 제아의 속, 특히 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 칼리스테푸스 키넨시스, 아피움 그라베올렌스, 쿠미눔 시미눔, 아에투사 시나피움, 안젤리카 아르칸젤리카, 코니움 마쿨라툼, 카멜리아 시넨시스, 시나라 카르둔쿨루스 바르 시콜리무스, 사우쑤레아 메두사, 플렉트란투스 바르바투스, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 도르코세라스 하이그로메트리쿰, 안티리눔 마주스, 페릴라 프루테스센스 바르 크리스파, 다흘리아 핀나타 또는 에리트란테 레위시이, 특히, 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트룬카툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스 또는 제아 마이스로부터 유래된 효소이다.
특수한 구현예에서, 플라본 신타제(FNS)는 서열 번호: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택될 수 있다. 특히, 플라본 신타제(FNS)는 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다. 바람직하게는 FNS는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
플라본 신타제(FNS)의 2개 유형: 플라본 신타제 1(FNSI) 및 플라본 신타제 2(FNSII)가 존재한다. 플라보논 및 2-옥소글루타레이트로부터 출발하여, FNSI는 상응하는 플라본을 생산할 수 있다. 효소 FNSI는 EC 1.14.11.22 부류에 속한다. FNSII는 P450 그룹에 속하고 시토크롬 P450 리덕타제의 존재를 필요로 한다. 효소 FNSII는 EC 1.14.13 부류에 속한다.
일 구현예에서, FNS는 제I형 플라본 신타제이다. 다른 구현예에서, FNS는 제II형 플라본 신타제이다. 추가의 구현예에서, 미생물은 제I형 플라본 신타제 및 제II형 플라본 신타제를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 미생물은 제I형 플라본 신타제(FNSI)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다. FNSI의 장점은 이것이 시토크롬 P450 리덕타제의 부재하에 기능한다는 것이다.
FNSI는 식물, 예를 들면, 페트로셀리눔 크리스품, 오리자 사티바, 포풀루스 델토이데스, 메디카고 트룬카툴라, 아피움 그라베올렌스, 쿠미눔 시미눔, 아에투사 시나피움, 안젤리카 아르칸젤리카, 또는 코니움 마쿨라툼으로부터, 특히 페트로셀리눔 크리스품, 오리자 사티바, 포풀루스 델토이데스 또는 메디카고 트룬카툴라로부터, 바람직하게는 페트로셀리눔 크리스품으로부터의 플라본 신타제일 수 있다.
FNSI는 서열 번호: 37, 127, 137, 141, 143 및 145로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다. 특수한 양태에서, FNSI는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 폴리펩타이드일 수 있다.
예를 들면, FNSI는 페트로셀리눔 크리스품으로부터 유래될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 AY817680.1 및 단백질 서열의 경우 번호 AAX21541.1 하게 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q7XZQ8 하에 기술되어 있다. 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호: 37 및 38로 기술되어 있다.
FNSI는 또한 안젤리카 아르칸젤리카로부터 유래될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 DQ683352.1 및 단백질 서열의 경우 번호 ABG78793.1로 기술되어 있다. 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호: 127 및 128로 기술되어 있다.
FNSI는 또한 아피움 그라베올렌스로부터 유래될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 AY817676.1 및 단백질 서열의 경우 번호 AAX21537.1로 기술되어 있다. 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호: 137 및 138로 기술되어 있다.
FNSI는 또한 쿠미눔 시미눔으로부터 유래될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 DQ683349.1 및 단백질 서열의 경우 번호 ABG78790.1로 기술되어 있다. 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호: 141 및 142로 기술되어 있다.
FNSI는 또한 아에투사 시나피움으로부터 유래될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 DQ683350.1 및 단백질 서열의 경우 번호 DQ683350.1로 기술되어 있다. 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호: 143 및 144로 기술되어 있다.
FNSI는 또한 코니움 마쿨라툼으로부터 유래될 수 있다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 DQ683354.1 및 단백질 서열의 경우 번호 ABG78795.1로 기술되어 있다. 아미노산 및 핵산 서열은 각각 서열 번호: 145 및 146로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 미생물은 제II형 플라본 신타제(FNSII)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
FNSII는 식물, 예를 들면, 아라비돕시스 탈리아나, 제아 마이스, 예를 들면, 로니세라 속의 식물, 예를 들면, 로니세라 자포니카 및 로니세라 마크란토이데스, 칼리스테푸스 키넨시스, 메디카고 트루카툴라, 카멜리아 시넨시스, 시나라 카르둔쿨루스 바르 스콜리무스, 사우쑤레아 메두사, 플렉트란투스 바르바투스, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 도르코세라스 하이드로메트리쿰, 안티리눔 마주스, 페릴라 플루테스센스 바르 크리스파, 다흘리아 핀나타 또는 에리트란테 레위시이로부터의 플라본 신타제, 특히 아라비돕시스 탈리아나, 제아 마이스 또는 로니세라 속, 예를 들면, 로니세라 자포니카 및 로니세라 마크란토이데스로부터의 플라본 신타제일 수 있다.
특수한 구현예에서, 플라본 신타제(FNSII)는 서열 번호: 33, 35, 129, 131, 133, 135, 139, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 33 및 35로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 로니세라 자포니카로부터 유래된 FNSII 이다. 당해 구현예에서, 효소는 NCBI로부터의 GenBank에 핵산 서열의 경우 번호 KU127576.1 및 단백질 서열의 경우 번호 AMQ91109.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 34 및 33로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 로니세라 마크란토이데스로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 KU127580.1 및 AMQ91113.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 36 및 35로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 시나라 세르둔쿨루스 바르 스콜리무스로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 JN825735.1 및 AFG31000.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 130 및 129로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 페릴라 프루테스센스 바르 크리스파로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 AB045592.1 및 BAB59004.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 132 및 131로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 다흘리아 핀나타로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 AB769842.1 및 BAM72335.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 134 및 133으로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 칼리스테푸스 키넨시스로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 AF188612.1 및 AAF04115.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 136 및 135로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 메디카고 트루카툴라로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 DQ354373.1 및 ABC86159.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 140 및 139로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 카멜리아 시넨시스로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 FJ169499.1 및 ACH99109.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 148 및 147로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 사우싸레아 메두사로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 KF170286.1 및 AGV40781.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 150 및 149로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 플렉트란투스 바르바투스로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 KF606861.1 및 AHJ89438.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 152 및 151로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 스쿠텔라리아 바이텔라리아 바이칼렌시스로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 KT963454.1 및 AMW91729.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 154 및 153으로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 도르코세라스 하이그로메트리쿰으로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 KV013332.1 및 KZV23934.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 156 및 155로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 안티리눔 마주스로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 AB028151.1 및 BAA84071.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 158 및 157로 기술되어 있다.
다른 구현예에서, 플라본 신타제 FNS는 에리트란테 레위시이로부터 유래된 FNSII이다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 KX710102.1 및 AOR81894.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 160 및 159로 기술되어 있다.
특수한 구현예에서, 미생물은 제II형 플라본 신타제(FNSII) 및 제I형 플라본 신타제를 암호화하는 이종 핵산 서열, 예를 들면 서열 번호: 33, 35, 129, 131, 133, 135, 139, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 서열 번호: 37, 127, 137, 141, 143 및 145로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 33 및 35로부터 선택된 서열 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
제II형 FNS, FNSII는 시토크롬 P450 리덕타제(CPR)의 존재를 필요로 한다. 미생물이 시토크롬 P450 리덕타제를 포함하지 않는 경우, 이는 따라서 이종 시토크롬 P450 리덕타제를 필수적으로 도입할 것이다. 미생물이 이를 이미 포함하는 경우, 내인성 시토크롬 P450 리덕타제의 과발현(예를 들면, 프로모터를 강한 프로모터로 대체하거나 암호화 서열의 하나 이상의 카피를 가함으로써) 또는 이종 시토크롬 P450 리덕타제를 도입하는 것을 계상하는 것이 가능하다.
특수한 구현예에서, 제II형 FNS 및 CPR는 동일한 기원, 동일한 종으로부터 유래된다.
효소의 조합
따라서, 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴 각각으로부터 헤스페리딘 및/또는 디오스민의 생합성에 필요한 효소 외에, 미생물은 바람직하게는 나린게닌 및/또는 아피게닌으로부터 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 생산하기 위한 효소를 포함한다.
제1의 특수한 구현예에서, 재조합 미생물은:
- 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7 위치에서 글루코스를 가할 수 있는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 시트러스 시넨시스, 시트러스 클레멘티나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터, 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT); 바람직하게는 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 특히 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 (UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 람노스를 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 6 위치내로 전달할 수 있는 를 암호화하는 이종 핵산 서열 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT); 바람직하게는 시트러스 또는 페투니아 하이브리다 속, 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 시트러스 막시마, 또는 시트러스 클레멘티나, 심지어 보다 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나의 RhaT, 바람직하게는 서열 번호: 103 및 105로부터 선택된 서열을 포함하는 6-O-람노실트랜스퍼라제 (RhaT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
- UDP-람노스를 생산할 수 있는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM); 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 RHM, 바람직하게는 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 107 및 109로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화할 수 있고; 특히 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화할 수 있고; 바람직하게는 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 게르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스, 시트러스 클레멘티나, 오스테오스페르뭄 하이브리드 쿨티바르, 파네로카에테 크리소스포리움, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 또는 피로셀라 오피시나룸으로부터 유래된 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H), 바람직하게는 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 1, 5, 7, 11, 17, 19 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 7, 11, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 임의로, 시토크롬 P450 리덕타제(CPR); 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 CPR, 또는 식물, 예를 들면 카타렌투스 로세우스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 CPR; 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 호모 사피엔스로부터의 OMT, 바람직하게는 특히 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화된, 서열 번호: 117, 119, 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 117, 119 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 임의로, 플라보논으로부터 플라본을 생산할 수 있고, 특히 나린게닌을 아피게닌으로, 및/또는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있는 플라본 신타제(FNS); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트룬카툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스, 제아 마이스, 칼리스테푸스 키넨시스, 아피움 그라베올렌스, 쿠미눔 시미눔, 아에투사 시나피움, 안젤리카 아르칸젤리카, 코니움 마쿨라툼, 카멜리아 시넨시스, 시나라 카르둔쿨루스 바르 시콜리무스, 사우쑤레아 메두사, 플렉트란투스 바르바투스, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 도르코세라스 하이그로메트리쿰, 안티리눔 마주스, 페릴라 프루테스센스 바르 크리스파, 다흘리아 핀나타 또는 에리트란테 레위시이로부터, 특히 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트루칸툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스 또는 제아 마이스로부터, 바람직하게는 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스 및 페트로셀리눔 크리스품으로부터의 FNS; 바람직하게는 서열 번호: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 재조합 미생물은:
- 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7 위치에서 글루코스를 가할 수 있는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT); 바람직하게는 서열 번호: 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 특히 서열 번호: 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 람노스를 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 6 위치로 전달할 수 있는 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT); 바람직하게는 시트러스 또는 페투니아 하이브리다 속, 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 시트러스 막시마, 또는 시트러스 클레멘티나, 심지어 보다 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나의 RhaT, 바람직하게는 서열 번호: 103 및 105로부터 선택된 서열을 포함하는 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- UDP-람노스를 생산할 수 있는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM); 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 RHM, 바람직하게는 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 107 및 109로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 ㄱ자는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화할 수 있고; 특히 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화할 수 있고; 바람직하게는 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 게르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스 및 피로셀라 오피시나룸으로부터의 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H), 바람직하게는 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖고, 바람직하게는 서열 번호: 1, 5, 7, 11, 17 및 19로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 5, 7 및 17로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 임의로, 시토크롬 P450 리덕타제(CPR); 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에로부터, 또는 식물로부터, 예를 들면, 카타란투스 로세우스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 CPR; 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 호모 사피엔스로부터의 OMT, 바람직하게는 특히 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화된, 서열 번호: 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 서열 번호: 89를 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 OMT를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 임의로, 플라보논으로부터 플라본을 생산할 수 있고, 특히 나린게닌을 아피게닌으로, 및/또는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있는 플라본 신타제(FNS); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트룬마툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스 또는 제아 마이스로부터, 바람직하게는 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스 및 페트로셀리눔 크리스품으로부터의 FNS; 바람직하게는 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 미생물은:
- 효소 서열 번호: 113, 115 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 113으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 6"-O-람노실트랜스퍼라제를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 7, 11, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H), 바람직하게는 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 당해 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 임의로, 서열 번호: 23, 25, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 시토크롬 P450 리덕타제(CPR) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있고, 서열 번호: 117, 119 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖고, 특히 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화된 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 117 및 119로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 OMT를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 임의로, 플라보논으로부터 플라본을 생산할 수 있고, 특히 나린게닌을 아피게닌으로, 및/또는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있고, 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 미생물은 각각의 이러한 이종 핵산 서열을 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 재조합 미생물은:
- 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7 위치에서 글루코스를 가할 수 있는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 6 위치로 람노스를 전달할 수 있는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- UDP-람노스를 생산할 수 있는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화할 수 있는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 시토크롬 P450 리덕타제를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화할 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 플라보논으로부터 플라본을 생산할 수 있고, 특히 나린게닌을 아피게닌으로, 에리오딕티올을 루테올린으로 및/또는 헤스페레틴을 디오스메틴으로 전달할 수 있고, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전달할 수 있는 플라본 신타제(FNS)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 재조합 미생물은 또한 특히 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT), 예를 들면, 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 SAMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신테타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열을 포함한다.
각각의 효소는 상술한 효소로부터 선택될 수 있다.
나린게닌 및 아피게닌까지
특히 글루코스, 타이로신 또는 페닐알라닌로부터 나린게닌 및 아피게닌의 생합성을 위한 다양한 경로는 식물에서 알려져 있다. 미생물, 특히, 이. 콜라이 및 사카로마이세스 세레비지아에는 변형되어 나린게닌 및/또는 아피게닌을 생산하여 왔다(Hwang EI, et al. 2003. Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69(5): 2699-2706; Jiang H1, et al. 2005. Appl. Environ. Microbiol. 2005, 71(6): 2962-9; Pandey et al., 2016, Biotechnol. Adv., 34, 634-662).
예를 들면, 나린게닌 및 아피게닌의 생합성을 위한 경로는 도 1에 기술된 것일 수 있다.
제1 구현예에서, 미생물은 타이로신으로부터 나린게닌 및/또는 아피게닌의 합성에 필요한 효소를 포함한다.
제2 구현예에서, 미생물은 페닐알라닌으로부터 나린게닌 및/또는 아피게닌의 합성에 필요한 효소를 포함한다.
제3 구현예에서, 미생물은 타이로신 및 페닐알라닌으로부터 나린게닌 및/또는 아피게닌의 합성에 필요한 효소를 포함한다.
TAL: 타이로신 암모니아 리아제
TAL은 타이로신 암모니아 리아제이다. 이러한 효소는 타이로신으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있다. 당해 효소는 EC 4.3.1.23 부류에 속한다.
용어 "페닐알라닌 암모니아 리아제 활성"은 효소 페닐알라닌 암모니아 리아제의 수단에 의하 트랜스-신남산으로 페닐알라닌의 전환을 의미한다. 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성이 있는지의 여부를 측정하기 위해, 페닐알라닌 암모니아 리아제 효소 및 페닐알라닌으로 구성된 혼합물을 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 트랜스-신남산의 출현이 예측된 표준과 비교하여 UPLC-MS에서 관찰된다.
타이로신 암모니아 리아제(TAL)는 또한 상기 정의된 바와 같은 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 활성 및/또는 디하이드록시페닐알라닌 암모니아-리아제 (DAL) 활성을 가질 수 있다.
따라서, 미생물은 타이로신 암모니아 리아제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 이러한 효소는 로도박터(Rhodobacter) 속의 세균 또는 플라보박테리아세아에(Flavobacteriaceae) 속의 세균에 의해 생산된 효소이다. 특수한 구현예에서, 이러한 효소는 로도박터 캅술라투스(Rhodobacter capsulatus) 또는 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides) 세균으로부터 생산된다. 다른 특수한 구현예에서, 이러한 효소는 플리보박테리움 존소니아에(Flavobacterium johnsoniae) 세균에 의해 생산된다. 다른 구현예에서, 이러한 효소는 효모, 특히 로도토룰라(Rhodotorula) 속의 효소, 예를 들면, 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis)에 의해 생산된 효소이다. 다른 유기체, 예를 들면, 카멜리아 시넨시스, 프라가리아 엑스 아나나싸, 랄스토니아 메탈리두란스 또는 제아 마이스 또한 이러한 효소를 생산한다.
특수한 구현예에서, 타이로신 암모니아 리아제는 서열 번호: 39 및 41로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
일 구현예에서, TAL은 플라보박테리움 존소니아에로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 KR095306.1 및 단백질 서열의 경우 번호 AKE50827.1로, 및 보다 특히 서열 번호: 40 및 39로 기술되어 있다.
특히 바람직한 구현예에서, TAL은 로도토룰라 글루티니스로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 KF765779.1 및 단백질 서열의 경우 번호 AGZ04575.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 42 및 41로 기술되어 있다.
특히 바람직한 구현예에서, 타이로신 암모니아 리아제는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
4CL: 4-쿠마레이트-CoA 리가제
4CL은 4-쿠마레이트-CoA 리가제이다. 이러한 효소는 p-쿠마르산 및 조효소 A로부터 4-쿠마로일-CoA 및 카페산 및 조효소 A로부터 카페오일-CoA를 생산할 수 있다. 이러한 효소는 EC 6.2.1.12 부류에 속한다.
용어 "4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성"는 효소 4-쿠마레이트 CoA 리가제에 의해 p-쿠마르산을 p-쿠마로일-CoA로 또는 카페산을 카페오일-CoA로의 전환시킴을 의미한다. 4-쿠마레이트 CoA 리가제 활성이 있는지를 측정하기 위해, 4-쿠마레이트 CoA 리가제 효소, p-쿠마르산 또는 카페산, ATP 및 CoA로 구성된 혼합물을 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온 시간 후, p-쿠마로일-CoA 또는 카페오일-CoA의 출현을 UV 분광광도계로 각각 333 nm 및 346 nm의 파장에서 예측된 표준과 비교하여, 관찰한다.
따라서, 미생물은 4-쿠마레이트-CoA 리가제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 이러한 효소는 식물, 예를 들면, 아비에스(Abies), 아라비돕시스, 아가스타케(Agastache), 아모르파(Amorpha), 브라씨카(Brassica), 시트러스, 카타야(Cathaya), 세드루스(Cedrus), 크로쿠스(Crocus), 라릭스(Larix), 페스투카(Festuca), 글리신(Glycine), 주글란스(Juglans), 케텔레에리아(Keteleeria), 리토스페르뭄(Lithospermum), 롤리움(Lolium), 로투스(Lotus), 라이코페르시콘(Lycopersicon), 말루스(Malus), 메디카고(Medicago), 메심브리안테뭄(Mesembryanthemum), 니코티아나(Nicotiana), 노토트수가(Nothotsuga), 오리자(Oryza), 파세올루스(Phaseolus), 펠라르고니움(Pelargonium), 페트로셀리눔(Petroselinum), 피스코미트렐라(Physcomitrella), 피세아(Picea), 프루누스(Prunus), 슈도라릭스(Pseudolarix), 슈도트수가(Pseudotsuga), 로사(Rosa), 로부스(Rubus), 리자(Ryza), 사카룸(Saccharum), 수아에다(Suaeda), 피누스(Pinus), 포풀루스(Populus), 솔라눔(Solanum), 텔룬기엘라(Thellungiella), 트리티쿰(Triticum), 쓰가(Tsuga), 비티스(Vitis) 또는 제아(Zea)로부터 생산된 효소이다. 대안적으로, 이러한 효소는 미생물, 예를 들면, 아스퍼길러스(Aspergillus), 마이코스파에렐라(Mycosphaerella), 마이코박테리움(Mycobacterium), 나이쎄리아(Neisseria), 뉴로스포라(Neurospora), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 로도박터(Rhodobacter) 또는 야로위아(Yarrowia)에 의해 생산된 효소이다.
바람직한 구현예에서, 이러한 효소는 식물, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 시트러스 클레멘티나 또는 페트로셀리눔 크리스품, 특히 아라비돕시스 탈리아나 또는 페트로셀리눔 크리스품에 의해, 또는 바람직하게는 스트렙토마이세스 속의 세균, 특히 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)에 의해 생산된 효소이다.
특수한 구현예에서, 4-쿠마레이트-CoA 리가제는 서열 번호: 43, 45, 47, 49, 123 및 125로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
다른 특수한 구현예에서, 4-쿠마레이트-CoA 리가제는 서열 번호: 43, 45, 47 및 49, 바람직하게는 서열 번호: 45 및 49로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
제1의 특수한 구현예에서, 4CL은 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 핵산 서열의 경우 GenBank 데이타베이스에 AY099747.1 및 단백질 서열의 경우 번호 AAM20598.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 44 및 43으로 기술되어 있다.
제2의 특수한 구현예에서, 4CL은 페트로셀리눔 크리스품으로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 X13324.1 또는 X13325.1 및 단백질 서열의 경우 각각 번호 CAA31696.1 또는 CAA31697.1로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 핵산 서열의 경우 참고 번호 P14912 및 P14913로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 46 및 45, 48 및 47로 기술되어 있다. 바람직하게는, 4CL은 페트로셀리눔 크리스품으로부터 유래되고 NCBI로부터의 GenBank에 핵산 서열의 경우 번호 X13324.1 및 단백질 서열의 경우 번호 CAA31696.1로, 및 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 P14912, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 46 및 45로 기술되어 있다.
제3의 특수한 구현예에서, 4CL은 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 CP016559.1 및 단백질 서열의 경우 번호 ANW18832.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 50 및 49로 기술되어 있다.
제4의 특수한 구현예에서, 4CL은 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된다. 이러한 효소의 뉴클레오타이드 서열 및 단백질 서열은 각각 서열 번호: 124 및 123으로 기술되어 있다.
제5의 특수한 구현예에서, 4CL은 시트러스 클레멘티나로부터 유래되고 이러한 효소의 뉴클레오타이드 서열 및 단백질 서열은 각각 서열 번호: 126 및 125에 기술되어 있다.
바람직한 구현예에서, 4CL은 서열 번호: 45, 123 및 125, 바람직하게는 서열 번호: 123 및 45로부터 선택된 서열을 포함하는 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. 가장 특히 바람직하게는, 4CL은 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
CHS: 찰콘 신타제
CHS는 찰콘 신타제이다. 이러한 효소는 4-쿠마로일-CoA 및 말로닐-CoA로부터 나린게닌-찰콘을 및 카페오일-CoA로부터 및 말로닐-CoA로부터 에리오딕티올-찰콘을 생산할 수 있다. 이러한 효소는 EC 2.3.1.74 부류에 속한다.
용어 "찰콘 신타제 활성"은 찰콘 신타제 효소의 수단에 의한 p-쿠마로일-CoA 및 말로닐-CoA의 나린게닌 찰콘으로의 또는 카페오일-CoA 및 말로닐-CoA의 에리오딕티올 찰콘으로의 전환을 의미한다. 찰콘 신타제 활성이 있는지를 시험하기 위하여, 찰콘 신타제 효소, 쿠마로일-CoA 또는 카페오일-CoA 및 말로닐-CoA로 구성된 혼합물을, 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 나린게닌 찰콘 또는 에리오딕티올 찰콘 각각의 출현은 HPLC-MS에서 예측된 표준과 비교하여 관찰한다.
미생물은 따라서 찰콘 신타제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
이러한 효소는 식물, 특히 아라비돕시스, 아베나(Avena), 코스모스(Cosmos), 시트러스, 다우쿠스(Daucus), 파고피룸(Fagopyrum), 프레에시아(Freesia), 글리신(Glycine), 글리시리자(Glycyrrhiza), 후물루스(Humulus), 하이페리쿰(Hypericum), 호르데움(Hordeum), 주글란스(Juglans), 메디카고(Medicago), 파세올루스(Phaseolus), 피스코미트렐라(Physcomitrella), 플라기오차스마(Plagiochasma), 페트로셀리눔(Petroselinum), 푸에라리아(Pueraria), 루부스(Rubus), 세칼레(Secale), 스쿠텔라리아(Scutellaria), 실레네(Silene), 시나피스(Sinapis), 스피나시아(Spinacia), 스텔라리아(Stellaria), 트리티쿰(Triticum), 툴리파(Tulipa), 베르베나(Verbena), 비티스(Vitis) 또는 크산티스마(Xanthisma) 속, 예를 들면, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 아베나 사티바(Avena sativa), 코스모스 술푸레우스(Cosmos sulphureus), 시트러스 시넨시스, 다우쿠스 카로타(Daucus carota), 파고피룸 에스쿨렌툼(Fagopyrum esculentum), 프레레시아 하이브리드 쿨티바르(Freesia hybrid cultivar), 글리신 막스(Glycine max), 글리시리자 에키나타(Glycyrrhiza echinata), 후물루스 루풀루스(Humulus lupulus), 하이페리쿰 안드로사에뭄(Hypericum androsaemum), 호르데움 불가레(Hordeum vulgare), 주글란스 종(Juglans sp.), 메디카고 사티바(Medicago sativa), 파세올루스 불가리스(Phaseolus vulgaris), 피스코미트렐라 파텐스(Physcomitrella patens), 플라기오차스마 압펜디쿨라툼(Plagiochasma appendiculatum), 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum), 푸에라리아 몬타나 바르. 로바타(Pueraria montana var. lobata), 루부스 이다에우스(Rubus idaeus), 세칼레 세레알레(Secale cereale), 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis), 실레네 종(Silene sp.), 시나피스 알바(Sinapis alba), 스피나시아 올레라세아(Spinacia oleracea), 스텔라리아 론기페스(Stellaria longipes), 트리티쿰 아에스티붐(Triticum aestivum), 툴리파 하이브리드 쿨티바르(Tulipa hybrid cultivar), 베르베나 종(Verbena sp.), 비티스 비니페라(Vitis vinifera) 또는 크산티스마 그라실레(Xanthisma gracile)에 의해 생산된 효소일 수 있다.
바람직하게는, 이러한 효소는 식물, 예를 들면 시트러스 속, 특히 시트러스 시넨시스, 또는 호르데움 불가레에 의해 또는 세균, 바람직하게는 스트렙토마이세스 속, 특히 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)에 의해 생산된 효소이다.
특수한 구현예에서, 찰콘 신타제는 서열 번호: 51, 53, 55 및 57로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터, 바람직하게는 서열 번호: 53 및 55로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
특히 바람직한 구현예에서, 찰콘 신타제는 서열 번호: 53으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
제1의 특수한 구현예에서, CHS는 호르데움 불가레로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 Y09233.1 및 단백질 서열의 경우 번호 CAA70435.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 52 및 51로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q96562로 기술되어 있다.
제2의 특수한 구현예에서, CHS는 시트러스 시넨시스로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 AB009351.1 및 단백질 서열의 경우 번호 BAA81664.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 54 및 53로 기술되어 있다.
제3의 특수한 구현예에서, CHS는 시트러스 시넨시스로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 XM_006489733.1 및 단백질 서열의 경우 번호 XP_006489796.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 56 및 55로 기술되어 있다.
제4의 특수한 구현예에서, CHS는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 CP016559.1 및 단백질 서열의 경우 번호 ANW16917.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 58 및 57로 기술되어 있다.
찰콘 신타제에 의해 촉매된 반응은 말로닐-CoA의 존재를 필요로 하므로, 미생물을 변형시켜 말로닐-CoA의 합성을 증가시킬 수 있다.
CHI: 찰콘 이소머라제
CHI는 찰콘 이소머라제이다. 이는 나린게닌 찰콘으로부터 나린게닌을 및 에리오딕티올 찰콘으로부터 에리오딕티올을 생산할 수 있다. 이러한 효소는 EC 5.5.1.6 부류에 속한다.
용어 "찰콘 이소머라제 활성"은 찰콘 이소머라제 효소에 의한 나린게닌 찰콘 또는 에리오딕티올 찰콘의 나린게닌 또는 에리오딕티올로의 전환을 의미한다. 찰콘 이소머라제 활성이 있는지를 측정하기 위하여, 찰콘 이소머라제 효소, 나린게닌 찰콘 또는 에리오딕티올 찰콘으로 구성된 혼합물을 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 나린게닌 또는 에리오딕티올 각각의 출현을 HPLC-MS에서 예측된 표준과 비교하여 관찰한다.
미생물은 따라서 찰콘 이소머라제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
이러한 효소는 식물, 특히 아라비돕시스, 진코(Ginkgo), 온시디움(Oncidium), 페릴라(Perilla), 시트러스(Citrus) 또는 트리고넬라(Trigonella), 예를 들면, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 진코 빌로바(Ginkgo biloba), 온시디움 고워 람세이(Oncidium Gower Ramsey), 페릴라 프루테스센스(Perilla frutescens), 시트러스 시넨시스 또는 트리고넬라 포에눔-그라에쿰(Trigonella foenum-graecum)으로부터 기원한다.
바람직하게는, 이러한 효소는 식물, 예를 들면, 아라비돕시스 탈리아나에 의해 또는 세균, 바람직하게는 스트렙토마이세스 속, 특히 스트렙토마이세스 클라불리게루스에 의해 생산된 효소이다.
특수한 구현예에서, 찰콘 이소머라제는 서열 번호: 59 및 61로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 찰콘 이소머라제는 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
제1의 특수한 구현예에서, CHI는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 CP016559.1 및 단백질 서열의 경우 번호 ANW16918.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 60 및 59로 기술되어 있다.
제2의 특수한 구현예에서, CHI는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 핵산 서열의 경우 NM_115370.4 및 단백질 서열의 경우 번호 NP_191072.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 62 및 61로 기술되어 있다.
FNS: 플라본 신타제
아피게닌은 나린게닌으로부터 플라본 신타제(FNS)를 사용하여 제조될 수 있다. 이는 나릴게닌으로부터 아피게닌을 생산할 수 있다.
미생물은 따라서 나린게닌으로부터 아피게닌을 생산할 수 있는 플라본 신타제를 암호화하는 이종 핵산 서열 및/또는 에리오딕티올로부터 루테올린을 생산할 수 있는 플라본 신타제를 암호화하는 이종 핵산 서열, 및/또는 헤스페리딘으로부터 디오스메틴을 생산할 수 있는 플라본 신타제를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
FNS는 앞서 기술한 것으로부터 선택될 수 있다.
페닐알라닌으로 출발
대안적으로 또는 추가로, 미생물은 또한 페닐알라닌으로부터 -쿠마르산의 합성에 필요한 효소를 포함할 수 있다.
이와 관련하여, 미생물은 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다.
PAL은 EC 4.3.1.24 부류에 속한다. 이는 페닐알라닌으로부터 신남산을 생산할 수 있다.
용어 "페닐알라닌 암모니아 리아제 활성"은 효소 페닐알라닌 암모니아 리아제의 수단에 의한 페닐알라닌의 트랜스-신남산으로의 전환을 의미한다. 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성이 있는지를 측정하기 위하여, 페닐알라닌 암모니아 리아제 효소 및 페닐알라닌으로 구성된 혼합물을, 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 트랜스-신남산의 출현이 UPLC-MS에서 예측된 표준과 비교하여 관찰된다.
수개의 효소가 이미 선행 분야에 기술되어 왔다. 바람직하게는, 효소는 식물, 예를 들면, 아라비돕시스, 아가스타체(Agastache), 아나나스(Ananas), 아스파라거스(Asparagus), 브라씨카(Brassica), 브롬헤아디아(Bromheadia), 밤부사(Bambusa), 베타(Beta), 베툴라(Betula), 시트러스(Citrus), 쿠쿠미스(Cucumis), 카멜리아(Camellia), 캅시쿰(Capsicum), 카씨아(Cassia), 카타란투스(Catharanthus), 시서(Cicer), 시트룰루스(Citrullus), 코페아(Coffea), 쿠쿠르비타(Cucurbita), 시노돈(Cynodon), 다우쿠스(Daucus), 덴드로비움(Dendrobium), 디안투스(Dianthus), 디기탈리스(Digitalis), 디오스코레아(Dioscorea), 에우칼립투스(Eucalyptus), 칼루스(Gallus), 진코, 글리신(Glycine), 호르데움(Hordeum), 헬리안투스(Helianthus), 이포모에아(Ipomoea), 락투카(Lactuca), 리토스페르뭄(Lithospermum), 로투스(Lotus), 라이코페르시콘(Lycopersicon), 메디카고(Medicago), 마루스(Malus), 마니호트(Manihot), 메디카고(Medicago), 메셈브리안테뭄(Mesembryanthemum), 니코티아나(Nicotiana), 올레아(Olea), 오리자(Oryza), 파세올루스(Phaseolus), 피누스(Pinus), 포풀루스(Populus), 피숨(Pisum), 페르세아(Persea), 페트로셀리눔(Petroselinum), 팔라에놉시스(Phalaenopsis), 필로스타키스(Phyllostachys), 피스코미트렐라(Physcomitrella), 피세아(Picea), 파이루스(Pyrus), 프루누스(Prunus), 쿼르쿠스(Quercus), 라파누스(Raphanus), 레흐만니아(Rehmannia), 루부스(Rubus), 솔라눔(Solanum), 소르굼(Sorghum), 스페노스틸리스(Sphenostylis), 스텔라리아(Stellaria), 스틸로산테스(Stylosanthes), 트리티쿰(Triticum), 트리폴리움(Trifolium), 박시니움(Vaccinium), 비그나(Vigna), 비티스(Vitis), 제아(Zea) 또는 진니아(Zinnia) 속으로부터 유래된다. 예를 들면, 아라비돕시스 탈리아나 또는 페트로셀리눔 크리스품으로부터의 것이 언급될 수 있다. 바람직한 구현예에서, PAL은 시트러스 시넨시스로부터 유래된다.
또한, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)는 또한 하기 정의된 바와 같은 타이로신 암모니아 리아제(TAL) 활성 및/또는 디하이드록시페닐알라닌 암모니아-리아제(DAL) 활성을 가질 수 있다.
특수한 구현예에서, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)는 서열 번호: 63, 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드ㄹ부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, PAL은 서열 번호: 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다. 가장 특히 바람직하게는, PAL은 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
특수한 구현예에서, 시트러스 시넨시스로부터의 PAL은 NCBI로부터의 GenBank에 핵산 서열의 경우 번호 XM_006481431.2 하에 및 단백질 서열의 경우 번호 XP_006481494.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 64 및 63에 기술되어 있다.
다른 특수한 구현예에서, 시트러스 시넨시스로부터의 PAL은 NCBI로부터의 GenBank에 핵산 서열의 경우 번호 XM_006488000.2로 및 단백질 서열의 경우 번호 XP_006488063.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 66 및 65로 기술되어 있다.
다른 특수한 구현예에서, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 PAL은 NCBI로부터의 GenBank에 핵산 서열의 경우 번호 NM_115186.4 및 단백질 서열의 경우 번호 NP_190894.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 78 및 77로 기술되어 있다.
임의로, 타이로신 및 페닐알라닌으로부터 출발하는 생합성이 고려되며, PAL 및 TAL은 페닐알라닌/타이로신 암모니아 리아제(PTAL)로 대체되거나 보충된다. PTAL은 EC 4.3.1.25 부류에 속한다.
C4H는 EC 1.14.13.11 부류에 속한다. 이는 신남산으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있다.
용어 "트랜스-신나메이트 4-모노옥시게나제 활성"은 트랜스-신나메이트 4-모노옥시게나제 효소(CPR-의존성)에 의한 트랜스-신남산의 p-쿠마르산으로의 전환을 의미한다. 트랜스-신나메이트 4-모노옥시게나제 활성이 존재하는지를 측정하기 위하여, 트랜스-신나메이트 4-모노옥시게나제 효소, 신남산, NADPH, H+ 및 O2로 구성된 혼합물을 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 4-하이드록시신나메이트(p-쿠마르산)의 출현은 UPLC-MS에서 예측된 표준과 비교하여 관찰한다.
수개의 효소가 당해 분야에 이미 기술되어 왔다. 바람직하게는, 효소는 식물, 예를 들면 아라비돕시스, 암미(Ammi), 아비센니아(Avicennia), 카멜리아(Camellia), 캄프토테카(Camptotheca), 카타란투스(Catharanthus), 시트러스, 글리신, 헬리안투스, 로투스, 메셈브리안테뭄, 피스코미트레일라(Physcomitreila), 파세올루스, 피누스(Pinus), 포풀루스, 루타(Ruta), 사카룸(Saccharum), 솔라눔, 비티스, 비그나 또는 제아 속의 식물로부터 유래된다. 바람직한 구현예에서, 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H)는 시트러스 시넨시스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래된다.
특수한 구현예에서, 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H)는 서열 번호: 67, 69 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, C4H는 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
특수한 구현예에서, 시트러스 시넨시스로부터의 C4H는 NCBI로부터의 GenBank에 핵산 서열의 경우 번호 NM_001288840.1 및 단백질 서열의 경우 번호 NP_001275769.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 68 및 67로 기술되어 있다.
다른 특수한 구현예에서, 시트러스 시넨시스로부터의 C4H는 NCBI로부터의 GenBank에 핵산 서열의 경우 번호 NM_001288895.1 및 단백질 서열의 경우 번호 NP_001275824.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 70 및 69로 기술되어 있다.
다른 특수한 구현예에서, 아라비돕시스 탈리아나로부터의 C4H는 NCBI로부터의 GenBank에 핵산 서열의 경우 번호 NM_128601.3 및 단백질 서열의 경우 번호 NP_180607.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 80 및 79로 기술되어 있다.
카페산을 통한 진행
추가의 구현예에서, 에리오딕티올의 생합성은 또한 타이로신으로부터 L-DOPA (3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌) 및 이후 L-DOPA (3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌)으로부터 카페산의 합성을 포함할 수 있다. 이를 수행하기 위해, 다음의 효소가 필수적이다. 타이로신을 L-DOPA (3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌)으로 전환시키기 위해, 2개의 서브단위, HpaB 및 HpaC가 필수적이다.
HpaB는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 소단위(HpaB)이다.
바람직하게는, 이러한 효소는 세균, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이에 의해 생산된다.
특수한 구현예에서, 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제(HpaB)는 서열 번호: 83로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
특수한 구현예에서, HpaB는 에스케리키아 콜라이로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 단백질 서열의 경우 CAQ34705.1로, 및 보다 특히 서열 번호: 83으로 기술되어 있다. 이러한 효소를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 84에 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 A0A140NG21로 기술되어 있다.
HpaC는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 소단위이다. 미생물은 따라서 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 소단위(HpaC)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다.
용어 "p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성"은 HpaB (4-하이드록시페닐아세테이트 3-하이드록실라제 옥시다제) 및 HpaC (4-하이드록시페닐아세테이트 3-하이드록실라제 리덕타제)로 구성된 효소 복합체를 사용한 p-쿠마르산의 카페산으로 및/또는 L-타이로신의 L-DOPA로의 전환을 의미한다. p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성이 있는지를 측정하기 위해, 효소 HpaB, HpaC, p-쿠마르산 또는 L-타이로신, FAD 및 NADH로 구성된 혼합물을 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에서 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 카페산 또는 L-DOPA의 출현을 HPLC-MS에서 예측된 표준과 비교하여 관찰된다.
바람직하게는, 이러한 효소는 세균, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이에 의해 생산된 효소이다.
특수한 구현예에서, 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제(HpaC)는 서열 번호: 85로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
특수한 구현예에서, HpaC는 에스케리키아 콜라이로부터 유래된다. 이는 NCBI로부터의 GenBank 데이타베이스에 단백질 서열의 경우 CAQ34704.1로, 및 보다 특히 서열 번호: 85로 기술되어 있다. 이러한 효소를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호: 86에 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 A0A140NG67 하에 기술되어 있다.
이와 함께, HpaB 및 HpaC는 타이로신으로부터 L-DOPA (3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌)을 생산할 수 있다.
따라서, 미생물은 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 (HpaB)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제(HpaC)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다.
더욱이, 이러한 경로는 또한 L-DOPA (3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌), 디하이드록시페닐알라닌 암모니아-리아제(DAL)로부터 카페산을 합성할 수 있는 효소의 존재를 필요로 한다. 이러한 효소는 EC 4.3.1.11 부류에 속한다.
용어 "디하이드록시페닐알라닌 암모니아 리아제 활성"은 디하이드록시페닐알라닌 암모니아 리아제 효소에 의해 L-DOPA의 트랜스-카페산의 전환을 의미한다. 디하이드록시페닐알라닌 암모니아 리아제 활성이 있는지를 측정하기 위하여, 디하이드록시페닐알라닌 암모니아 리아제 효소 및 L-DOPA(레보도파)로 구성된 혼합물을 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 트랜스-카페산의 출현이 UPLC-MS에서 예측된 표준과 비교하여 관찰된다.
또한, 디하이드록시페닐알라닌 암모니아 리아제(DAL)는 또한 타이로신 암모니아 리아제(TAL) 활성 및/또는 페닐알라닌 암모니아-리아제(PAL) 활성을 가질 수 있다.
미생물은 따라서 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 소단위(HpaB)를 암호화하는 이종 핵산 서열, 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 소단위(HpaC)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 디하이드록시페닐알라닌 암모니아-리아제(DAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다.
HpaB 및 HpaC의 사용에 대한 대안으로서 또는 이와 함께, 타이로신을 L-DOPA로 전환시키는 효소 및 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시키는 효소를 사용하는 것이 가능하다.
이는 각각, L-타이로신 하이드록실라제 활성을 갖고, EC 1.14.99.15 부류에 속하는 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제, 및 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성을 갖고, EC 1.14.13 부류에 속하는 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제이다.
이러한 다양한 효소 둘 다는 시토크롬 P450(CYP) 계열의 부분을 형성한다.
용어 "L-타이로신 하이드록실라제 활성"은 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 효소(CPR-의존성)를 사용한 p-쿠마르산의 카페산으로 및/또는 L-타이로신의 L-DOPA로의 전환을 의미한다. L-타이로신 하이드록실라제 활성이 있는지를 측정하기 위하여, p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 효소, p-쿠마르산 또는 L-타이로신 및 필수적인 보조인자로 구성된 혼합물을, 최적 조건(pH, 온도, 이온 등) 하에 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 카페산 또는 L-DOPA의 출현이 HPLC-MS에서 예측된 표준과 비교하여 관찰된다.
용어 "p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성"은 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 효소(CPR-의존성)를 사용한 p-쿠마르산의 카페산으로 및/또는 L-타이로신의 L-DOPA로의 전환을 의미한다. p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성이 있는지를 측정하기 위하여, p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 효소, p-쿠마르산 또는 L-타이로신으로 구성된 혼합물을 최적 조건(pH, 온도, 이온 등)하에 시험관내 항온처리하는 것으로 이루어진 효소 시험을 수행할 수 있다. 특정의 항온처리 시간 후, 카페산 또는 L-DOPA의 출현이 HPLC-MS에서 예측된 표준과 비교하여 관찰된다.
따라서, 재조합 미생물은 타이로신을 L-DOPA로 및 또한 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있는 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제(CYP)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제는 특히 로돕세우도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 세균 효소, 특히 베타 불가리스로부터의 식물 효소, 특히 오릭톨라구스 쿠니쿨루스(Oryctolagus cuniculus)로부터의 포유동물 효소 또는 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis)로부터의 진균 효소이다. 특수한 구현예에서, 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제는 로돕세우도모나스 팔루스트리스, 사카로트릭스 에스파나엔시스(Saccharothrix espanaensis) 또는 베타 불가리스로부터의 효소이다.
특수한 구현예에서, 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제는 서열 번호: 73 및 75로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 L-타이로신 하이드롤라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제는 또한 베타 불가리스로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소를 암호화하는 핵산 서열 및 단백질 서열은 각각 서열 번호: 74 및 73에 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 P0DKI2로 기술되어 있다.
또한, 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제는 사카로트릭스 에스파나엔시스(Saccharothrix espanaensis)로부터 유래될 수 있다. 이러한 효소 및 단백질 서열을 암호화하는 핵산 서열은 NCBI에 각각 참고 번호 NC_005296.1 및 WP_011157377.1로, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 76 및 75로 기술되어 있다. 단백질은 UniProtKB/Swiss Prot에 참고 번호 Q6N8N2 하에 기술되어 있다.
일 구현예에서, 미생물은 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 디하이드록시페닐알라닌 암모니아-리아제(DAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 재조합 미생물은 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있는 쿠마레이트 3-하이드록실라제(Coum3H)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 쿠마레이트 3-하이드록실라제는 특히 사카로트릭스로부터의 세균 효소이다.
특수한 구현예에서, 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제는 서열 번호: 71로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된다.
이러한 효소 및 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 서열 NCBI에 각각 참고 번호 DQ357071.1 및 ABC88666.1 하에, 및 보다 특히 각각 서열 번호: 72 및 71로 기술되어 있다.
일 구현예에서, 미생물은 쿠마레이트 3-하이드록실라제를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 디하이드록시페닐알라닌 암모니아-리아제(DAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함할 수 있다.
효소의 추가의 조합
따라서, 앞서 기술한 바와 같이 나린게닌 및/또는 아피게닌으로부터 헤스페리딘 및/또는 디오스민의 생합성에 필요한 효소 외에, 미생물은 바람직하게는 타이로신 및/또는 페닐알라닌으로부터, 바람직하게는 타이로신으로부터 나린게닌 및/또는 아피게닌을 생산하기 위한 효소를 포함한다.
따라서, 특수한 구현예에 따라서, 미생물은
- 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7 위치에서 글루코스를 가할 수 있는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)를 암호화하는 이종 핵산 서열,
- 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 6 위치내로 람노스를 전달할 수 있는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT)를 암호화하는 이종 핵산 서열,
- UDP-람노스를 생산할 수 있는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)를 암호화하는 이종 핵산 서열,
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT)를 암호화하는 이종 핵산 서열,
- F3'H 효소를 암호화하는 이종 핵산 서열,
- 및 임의로 FNS 효소를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 CPR 효소를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하고,
또한
- 타이로신 암모니아 리아제(TAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열, 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL)를 암호화하는 이종 핵산 서열, 찰콘 신타제(CHS)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 찰콘 이소머라제(CHI)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
일 구현예에서, 미생물은:
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 암호화하는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT); 바람직하게는 시트러스 클레멘티나, 시트러스 시넨시스, 아라비돕시스 탈리아나 또는 호모 사피엔스로부터의 OMT, 바람직하게는 서열 번호: 117, 119, 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 특히 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화를 지닌, 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 117 및 119로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 117로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화할 수 있고 서열 번호: 7, 11, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 임의로, 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 시토크롬 P450 리덕타제(CPR) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 특히 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 임의로, 서열 번호: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) 또는 플라보박테리움 존소니아에(Flavobacterium johnsoniae)로부터의 타이로신 암모니아 리아제(TAL), 특히 서열 번호: 41 및 39로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 아라비돕시스 탈리아나, 시트러스 클레멘티나, 페트로셀리눔 크리스품 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)로부터의 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL), 특히 서열 번호: 123, 125, 45, 43, 47 및 49로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 123, 125 및 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열 및
- 시트러스 시넨시스, 호르데움 불가레 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)로부터의 찰콘 신타제(CHS) 특히 서열 번호: 53, 51, 55 및 57로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 53로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 아라비돕시스 탈리아나 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터의 찰콘 이소머라제(CHI), 특히 서열 번호: 61 및 59로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 본 문서에서, 미생물은 상술한 효소 UGT, RhaT 및 RHM의 조합 중 하나, 특히
- 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된, 바람직하게는 서열 번호: 113으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제;
- 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 6"-O-람노실트랜스퍼라제; 및
- 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제를 포함한다.
바람직하게는, 이러한 구현예에서, 미생물은 또한:
- 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL), 특히 서열 번호: 63, 65 및 77, 바람직하게는 서열 번호: 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H), 특히 서열 번호: 67, 69 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
다른 구현예에서, 미생물은:
- 서열 번호: 117 및 119로부터 선택된 서열을 포함하는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 117로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화할 수 있고 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 임의로, 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열을 포함하는 시토크롬 P450 리덕타제(CPR) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열 및
- 임의로, 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 타이로신 암모니아 리아제(TAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 123, 125 및 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 53로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 신타제(CHS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 이소머라제(CHI) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 이러한 구현예에서, 미생물은 상술한 효소 UGT, RhaT 및 RHM의 조합 중 하나, 특히
- 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된, 바람직하게는 서열 번호: 113로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제; 및
- 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 6"-O-람노실트랜스퍼라제; 및
- 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제를 포함한다.
바람직하게는, 이러한 구현예에서, 미생물은 또한 선행 구현예에 기술된 바와 같은 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
임의로, 이러한 다양한 구현예에서, 미생물은 또한 특히 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 S-아데노실메티오닌 신타제(SAMT)를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열, 예를 들면, 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 SAMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 미생물은:
- 아라비돕시스 탈리아나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT), 바람직하게는 서열 번호: 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT); 특히 서열 번호: 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 113로부터 선택된 서열을 포함하는 UGT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 시트러스 속 또는 페투니아 하이브리다, 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 시트러스 막시마, 또는 시트러스 클레멘티나, 심지어 보다 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나로부터의 6"-O-람노실트랜스퍼라제 (RhaT), 바람직하게는 서열 번호: 103 및 105로부터 선택된 서열을 포함하는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 103로부터 선택된 서열을 포함하는 RhaT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 시트러스 시넨시스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM), 바람직하게는 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 107 및 109로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화시킬 수 있는; 바람직하게는페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스(Callistephus chinensis), 게르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스, 시트러스 클레멘티나, 오스테로스페르뭄 하이브리드 쿨티바르, 파네로차에테 크리소스포리움, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 또는 피로셀라 오피시나룸으로부터, 특히 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 게르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스 또는 필로셀라 오피시날룸으로부터의 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H), 바람직하게는 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 1, 5, 7, 11, 17 및 19로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 5, 7 및 17로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 임의로, 시토크롬 P450 리덕타제(CPR); 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에로부터, 또는 식물로부터, 예를 들면, 카테란투스 로세우스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터 선택된 CPR; 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 특히 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 호모 사피엔스로부터의 OMT, 바람직하게는 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화된, 서열 번호: 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 89로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 임의로, 특히 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT), 예를 들면, 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 SAMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신테타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열; 및
- 임의로, 나린게닌을 아피게닌으로, 에리오딕티올을 루테올린으로, 및/또는 헤스페레틴을 디오스메틴으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있는 플라본 신타제(FNS); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula), 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스, 제아 마이스, 칼리스테푸스 키넨시스, 아피움 그라베올렌스, 메디카고 트루카툴라, 쿠미눔 시미눔, 아에투사 시나피움, 안젤리카 아르칸겔리카, 코니움 마쿨라툼, 카멜리아 시넨시스, 시나라 카르둔쿨루스 바르 시콜리무스, 사우쑤레아 메두사, 플렉트란투스 바르바투스, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 도르코세라스 하이그로메트리쿰, 안티리눔 마주스, 페릴라 프루테스센스 바르 크리스파, 다흘리아 핀나타 또는 에리트란테 레위시이로부터, 특히 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트룬카툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스 또는 제아 마이로부터, 바람직하게는 로이세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스 및 페트로셀리눔 크리스품으로부터의 FNS; 바람직하게는 서열 번호: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 타이로신으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있는 타이로신 암모니아 리아제(TAL); 특히 로도토룰라 글루티니스 또는 플라보박테리움 존소니아에로부터 유래된 TAL; 특히 서열 번호: 39 및 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- p-쿠마르산 및 조효소 A로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있는 4-쿠마레이트-CoA 리가제(4CL); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 페트로셀눔 크리스품 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 4CL; 서열 번호: 43, 45, 47 및 49로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4-쿠마로일-CoA 및 말로닐-CoA로부터 나린게닌-찰콘을 생산할 수 있는 찰콘 신타제(CHS), 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 호르데움 불가레 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 CHS; 특히 서열 번호: 51, 53, 55 및 57로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 53 및 55로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 53로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 나린게닌 찰콘으로부터 나린게닌을 생산할 수 있는 찰콘 이소머라제(CHI); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 CHI; 특히 서열 번호: 59 및 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산을 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 미생물은 선행 구현예에 기술된 바와 같이, 효소 UGT, RhaT, RHM, F3'H, OMT, 4CL, CHS 및 CHI, 및 임의로 효소 CPR, FNS 및 SAMT를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하고 또한:
- 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL), 특히 서열 번호: 63, 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H), 특히 페닐알라닌으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있는, 서열 번호: 67, 69 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
제3의 특수한 구현예에서, 미생물은 앞서의 구현예에서 기술된 바와 같은 효소 UGT, RhaT, RHM, F3'H, OMT, 4CL, CHS 및 CHI, 및 임의로 효소 CPR, FNS 및 SAMT를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하고 또한:
- L-DOPA로부터 카페산을 생산할 수 있는, (3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 바람직하게는 서열 번호: 83로부터 선택된 서열을 포함하는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 소단위(HpaB) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열, 및 바람직하게는 서열 번호: 85로부터 선택된 서열을 포함하는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 소단위(HpaC) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 또는 타이로신을 L-DOPA로 및 또한 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 73 및 75로부터 선택된 서열을 포함하는 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 L-타이로신 하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 또는 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 71로부터 선택된 서열을 포함하는 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 미생물은 앞서의 구현예에서 기술한 바와 같은, 효소 UGT, RhaT, RHM, F3'H, OMT, 4CL, CHS 및 CHI, 및 임의로 효소 CPR, FNS 및 SAMT를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하고 또한:
- 타이로신으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있고; 바람직하게는 로도토룰라 글루티니스 또는 플라보박테리움 존소니아에로부터 유래된, 타이로신 암모니아 리아제(TAL); 특히 서열 번호: 39 및 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 각조 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 임의로, 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL), 특히 서열 번호: 63, 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H), 특히 페닐알라닌으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있는, 서열 번호: 67, 69 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 임의로, 바람직하게는 서열 번호: 83로부터 선택된 서열을 포함하는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 소단위(HpaB) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열, 및 바람직하게는 서열 번호: 85로부터 선택된 서열을 포함하는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 소단위(HpaC) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 또는 타이로신을 L-DOPA로 및/또한 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 73 및 75로부터 선택된 서열을 포함하는 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 L-타이로신 하이드롤라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 또는 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 71로부터 선택된 서열을 포함하는 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 임의로, L-DOPA(3,4-디하이드록시-L-페닐알라닌)로부터 카페산을 생산할 수 있는 디하이드록시페닐알라닌 암모니아-리아제(DAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
다른 특수한 구현예에서, 미생물은:
- 서열 번호: 113으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 타이로신 암모니아 리아제 (TAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 45 또는 123으로부터 선택된 서열을 포함하는 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 45로부터 선택된 서열 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 53으로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 신타제(CHS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 이소머라제(CHI) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 서열 번호: 7 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 시토크롬 P450 리덕타제(CPR) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있고 서열 번호: 117 및 119로부터 선택된 서열을 포함하는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 117로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
바람직하게는, 미생물은 또한 S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT), 특히 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 SAMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신테타제활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열을 포함한다.
효소 또는 효소의 세트의 기원은 이러한 기원이 동일하거나 유사하도록 선택할 수 있다. 예를 들면, 효소 또는 효소의 세트는 세균, 예를 들면 동일한 속 또는 동일한 종의 세균으로부터 수득될 수 있다. 다른 예에서, 효소 또는 효소의 세트는 식물로부터, 예를 들면, 동일한 속 또는 동일한 종의 식물로부터 수득될 수 있다. 이에 대한 이유는 이러한 일반적인 기원이 효소가 최적으로 함께 기능하도록 할 수 있다는 것이다.
일 구현예에서, 미생물은 타이로신의 생합성을 위한 대사 경로를 포함한다. 특히, 미생물은 야생형 균주에 대해 타이로신의 생산이 증가되도록 변형되었다. 특히, 미생물은 탄소 유동이 타이로신 생합성에 대해 재시디되도록 변형될 수 있다. 또한, 미생물은 타이로신 생합성 피드백 억제를 감소시키거나 억제하도록 변형될 수 있다.
다른 구현예에서, 미생물은 페닐알라닌의 생합성을 위한 대사 경로를 포함한다. 특히, 미생물은 야생형 균주에 대해 페닐알라닌의 생산이 증가되도록 변형될 수 있다. 특히, 미생물은 탄소 유동이 페닐알라닌 생합성에 대해 재지시되도록 변형될 수 있다. 또한, 미생물은 페닐알라닌 생합성 피드백 억제를 감소시키거나 억제하도록 변형될 수 있다.
다른 구현예에서, 미생물은 페닐알라닌 및 타이로신의 생합성을 위한 대사 경로를 포함한다. 특히, 미생물은 야생형 균주에 대해 페닐알라닌 및 타이로신의 생산이 증가되도록 변형될 수 있다. 특히, 미생물은 탄소 유동이 페닐알라닌 및 타이로신 생합성에 대해 재지시되도록 변형될 수 있다. 또한, 미생물은 페닐알라닌 및 타이로신 생합성 피드백 억제를 감소시키거나 억제하도록 변형될 수 있다.
재조합 핵산 및 발현 카세트
앞서 기술된 바와 같은 효소를 암호화하는 각각의 핵산 서열이 발현 카세트내에 포함된다. 바람직하게는, 암호화 핵산 서열은 숙주 미생물내에서 발현을 위해 최적화된다. 암호화 핵산 서열은 유전자의 발현, 특히 전사 및 해독에 필요한 성분에 작동적으로 연결된다. 이러한 성분은 숙주 재조합 미생물에서 기능하도록 선택된다. 이러한 성분은, 예를 들면, 전사 프로모터, 전사 활성인자, 터미네이터 서열 및 종결 코돈을 포함할 수 있다. 발현이 요구되는 숙주 세포의 기능으로서 이러한 성분을 선택하는 방법은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
바람직하게는, 프로모터는 강한 프로모터이다. 프로모터는 임의로 유도성일 수 있다.
예를 들면, 미생물이 원핵세포인 경우, 프로모터는 다음의 프로모터로부터 선택될 수 있다: Lacl, LacZ, pLacT, ptac, pARA, pBAD, 박테리오파아지 T3 또는 T7의 RNA 폴리머라제 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 람다 파아지의 PR 또는 PL 프로모터. 하나의 특수한 구현예에서, 프로모터는 pLac이다. 미생물이 진핵세포 및 특히 효모인 경우, 프로모터는 다음의 프로모터로부터 선택될 수 있다: 프로모터 pTDH3, 프로모터 pTEF1, 프로모터 pTEF2, 프로모터 pCCW12, 프로모터 pHHF2, 프로모터 pHTB2 및 프로모터 pRPL18B. 효모에 사용될 수 있는 유도성 프로모터의 예는 프로모터 tetO-2, GAL10, GAL10-CYC1 및 PHO5이다.
기술된 바와 같은 또는 이중 일부의 조합을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트 중 모두 또는 부분은 일반적인 발현 벡터 또는 상이한 발현 벡터내에 포함될 수 있다.
따라서, 본 발명은 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 (UGT)를 암호화하는 이종 핵산 서열, 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT)를 암호화하는 이종 핵산 서열 및 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)를 암호화하는 이종 핵산 서열로부터 선택된 2개의 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이고; 바람직하게는, 벡터는 이러한 3개의 서열을 포함한다.
특히, 본 발명은 다음으로부터 선택된 2개의 핵산 서열을 포함하는 벡터에 관한 것이다:
(i) 아라비돕시스 탈리아나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나로부터 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT), 바람직하게는 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 특히 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95 및 97로부터 또는 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 113으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
(ii) 시트러스 속 또는 페투니아 하이브리다, 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 시트러스 막시마 또는 시트러스 클레멘티나, 심지어 보다 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나로부터의 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT), 바람직하게는 서열 번호: 103 및 105로부터 선택된 서열을 포함하는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 RhaT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
(iii) 시트러스 시넨시스로부터 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM), 바람직하게는 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 107 및 109로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열.
특히, 벡터는 다음으로부터 선택된 2개의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
(i) 아라비돕시스 탈리아나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나로부터 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT), 바람직하게는 서열 번호: 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소인 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 특히 서열 번호: 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
(ii) 시트러스 속 또는 페투니아 하이브리다, 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 시트러스 막시마 또는 시트러스 클레멘티나, 심지어 보다 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나로부터의 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT), 바람직하게는 서열 번호: 103 및 105로부터 선택된 서열을 포함하는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
(iii) 시트러스 시넨시스로부터 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM), 바람직하게는 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 107 및 109로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열.
바람직하게는, 벡터는 다음으로부터 선택된 2개의 핵산 서열을 포함한다:
(i) 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 113으로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
(ii) 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
(iii) 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열.
바람직한 구현예에서, 미생물은 3개 모두를 포함한다.
암호화 핵산 서열 및 효소 서열은 상기 기술된 바와 같다. 용어 "핵산 서열을 포함하는"은 또한 핵산 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함함을 의미한다.
임의로, 벡터는 또한 다음으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다: 각각 상기 정의된 바와 같은, O-메틸트랜스퍼라제(OMT)를 암호화하는 핵산 서열, F3'H를 암호화하는 핵산 서열, CPR를 암호화하는 핵산 서열, FNS를 암호화하는 핵산 서열, SAMT를 암호화하는 핵산 서열, TAL를 암호화하는 핵산 서열, 4CL을 암호화하는 핵산 서열, CHS를 암호화하는 핵산 서열, CHI를 암호화하는 핵산 서열, PAL를 암호화하는 핵산 서열, C4H를 암호화하는 핵산 서열, HpaB를 암호화하는 핵산 서열, 및 DAL를 암호화하는 핵산 서열, 및 또한 이의 조합.
바람직하게는, 벡터는 또한 OMT를 암호화하는 핵산 서열, F3'H를 암호화하는 핵산 서열, CPR를 암호화하는 핵산 서열, FNS를 암호화하는 핵산 서열, TAL을 암호화하는 핵산 서열, 4CL을 암호화하는 핵산 서열, CHS를 암호화하는 핵산 서열, CHI를 암호화하는 핵산 서열, PAL을 암호화하는 핵산 서열 및 C4H를 암호화하는 핵산 서열로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함한다.
특히, 벡터는 또한 다음으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
- 바람직하게는 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 게르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스, 아라비돕시스 탈리아나, 시트러스 클레멘티나, 오스테오스페르뭄 하이브리드 쿨티바르, 파네로차에테 크리소스포리움, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 또는 피로셀라 오피시나룸으로부터, 특히 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 케르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스 또는 피로셀라 오피시나룸으로부터 유래된, 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화하고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H), 바람직하게는 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 1, 5, 7, 11, 17, 19 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 5, 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 시토크롬 P450 리덕타제 (CPR); 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에로부터, 또는 식물로부터, 예를 들면 카타란투스 로세우스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 CPR; 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화할 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 호모 사피엔스로부터의 OMT, 바람직하게는 특히 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화된, 서열 번호: 117, 119, 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 117, 119 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 OMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 나린게닌을 아피게닌으로, 에리오딕티올을 루테올린으로, 및/또는 헤스페레틴을 디오스메틴으로 전환시킬 수 있는, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있는 플라본 신타제(FNS); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트룬카툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스, 제아 마이스, 칼리스테푸스 키넨시스, 아피움 그라베올렌스, 메티카고 트룬카툴라, 쿠미눔 시미눔, 아에투사 시나피움, 안젤리카 아르칸젤리카, 코니움 마쿨라툼, 카멜리아 시넨시스, 시나라 카르둔쿨루스 바르 시콜리무스, 사우쑤레아 메두사, 플렉트란투스 바르바투스, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 도르코세라스 하이그로메트리쿰, 안티리눔 마주스, 페릴라 프루테스센스 바르 크리스파, 다흘리아 핀나타 또는 에리트란테 레위시이로부터, 특히 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트루칸툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스 또는 제아 마이스로부터, 바람직하게는 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스 및 페트로셀리눔 크리스품으로부터의 FNS; 바람직하게는 서열 번호: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 특히 사카로마이세스 세레비니자에로부터의 S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT), 예를 들면 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 SAMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신테타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열;
- 타이로신으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있고; 바람직하게는 로도토룰라 글루티니스 또는 플라보박테리움 존소니아에로부터 유래된 타이로신 암모니아 리아제(TAL); 특히 서열 번호: 39 및 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 페트로셀눔 크리스품 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터, p-쿠마르산 및 조효소 A로부터 쿠마릴-CoA를 생산할 수 있는 4-쿠마레이트-CoA 리가제(4CL); 서열 번호: 43, 45, 47, 49, 123 및 125로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 123, 125 및 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4-쿠마로일-CoA 및 말로닐-CoA로부터 나린게닌-찰콘을 생산할 수 있는 찰콘 신타제(CHS), 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 호르데움 불가레 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 CHS; 특히 서열 번호: 51, 53, 55 및 57로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 53 및 55로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 CHS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 53로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 나린게닌 찰콘으로부터 나린게닌을 생산할 수 있는 찰콘 이소머라제(CHI); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 CHI; 특히 서열 번호: 59 및 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 바람직하게는 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL), 특히 서열 번호: 63, 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 페닐알라닌으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있는, 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H), 특히 서열 번호: 67, 69 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 폴리펩타이드; 및 바람직하게는 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 바람직하게는 서열 번호: 83으로부터 선택된 서열을 포함하는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 소단위(HpaB) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 및 바람직하게는 서열 번호: 85로부터 선택된 서열을 포함하는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 소단위(HpaC) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 또는 타이로신을 L-DOPA로 및 또한 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 73 및 75로부터 선택된 서열을 포함하는 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 L-타이로신 하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 또는 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 71로부터 선택된 서열을 포함하는 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
특히, 벡터는 또한 다음으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
- 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화할 수 있고; 바람직하게는 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 게르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스 및 피로셀라 오피시나룸으로부터 유래된 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H), 바람직하게는 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 1, 5, 7, 11, 17 및 19로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 7, 11 및 17로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 시토크롬 P450 리덕타제(CPR); 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 CPR, 또는 식물, 예를 들면 카타렌투스 로세우스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 CPR; 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 호모 사피엔스로부터의 OMT, 바람직하게는 특히 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화된, 서열 번호: 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 89로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 나린게닌을 아피게닌으로, 에리오딕티올을 루테올린으로 및/또는 헤스페레틴을 디오스메틴으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있는 플라본 신타제(FNS); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트룬카툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스 또는 제아 마이스로부터, 바람직하게는 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스 및 페트로셀리눔 크리스품으로부터의 FNS; 바람직하게는 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 특히 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT), 예를 들면, 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 SAMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신테타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열;
- 타이로신으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있고; 바람직하게는 로도토룰라 글루티니스 또는 플라보박테리움 존소니아에로부터 유래된, 타이로신 암모니아 리아제(TAL), 특히 서열 번호: 39 및 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- p-쿠마르산 및 조효소 A로부터 쿠마릴-CoA를 생산할 수 있는 4-쿠마레이트-CoA 리가제(4CL); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 페트로셀리눔 크리스품 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 4CL; 특히 서열 번호: 43, 45, 47 및 49로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4-쿠마로일-CoA 및 말로닐-CoA로부터 나린게닌-찰콘을 생한할 수 있고; 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 호르데움 불가레 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 찰콘 신타제(CHS), 특히 서열 번호: 51, 53, 55 및 57로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 53 및 55로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 나린게닌 찰콘으로부터 나린게닌을 생산할 수 있고; 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 찰콘 이소머라제(CHI), 특히 서열 번호: 59 및 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드;
- 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL), 특히 서열 번호: 63, 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 페닐알라닌으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있는, 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H), 특히 서열 번호: 67, 69 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H, 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 바람직하게는 서열 번호: 83으로부터 선택된 서열을 포함하는, 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 소단위(HpaB) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 및 바람직하게는 서열 번호: 85로부터 선택된 서열을 포함하는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 소단위(HpaC) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드을 암호화하는 핵산 서열; 또는 타이로신을 L-DOPA로 및 또한 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 73 및 75로부터 선택된 서열을 포함하는 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 L-타이로신 하이드롤라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 또는 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 서열 번호: 71을 포함하는 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열, 및
- 디하이드록시페닐알라닌 암모니아-리아제(DAL)를 암호화하는 핵산 서열.
바람직하게는, 벡터는 또한 다음으로부터 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있다:
- 서열 번호: 7, 11, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 가진 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된 F3'H, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 시토크롬 P450 리덕타제(CPR) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화된, 5' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화할 수 있고 서열 번호: 117 및 119로부터 선택된 서열을 포함하는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 117로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 OMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신테타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열;
- 타이로신으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있고 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 타이로신 암모니아 리아제(TAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- p-쿠마르산 및 조효소 A로부터 쿠마릴-CoA를 생산할 수 있고 서열 번호: 123, 125 및 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4-쿠마레이트-CoA 리가제(4CL) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4-쿠마로일-CoA 및 말로닐-CoA로부터 나린게닌-찰콘을 생산할 수 있고 서열 번호: 53로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 신타제(CHS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 나린게닌 찰콘으로부터 나린게닌을 생산할 수 있고 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 이소머라제(CHI) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 서열 번호: 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 페닐알라닌으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있는, 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열.
특수한 구현예에서, 벡터는:
- 특히 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 핵산 서열, 및 나린게닌 및/또는 아피게닌의 3' 위치에서 하이드록실을 가할 수 있는, 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 또는
- 특히 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화할 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT)를 암호화하는 핵산 서열; 나린게닌 및/또는 아피게닌의 3' 위치에서 하이드록실을 가할 수 있는, 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및 시토크롬 P450 리덕타제를 암호화하는 이종 핵산 서열; 또는
- 특히 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화할 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및 나린게닌을 아피게닌으로, 에리오딕티올을 루테올린으로 및/또는 헤스페레틴을 디오스메틴으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있는 플라본 신타제(FNS)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 또는
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화할 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제를 암호화하는 이종 핵산 서열; 나린게닌 및/또는 아피게닌의 3' 위치에서 하이드록실화할 수 있는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 시토크롬 P450 리덕타제를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및 나린게닌을 아피게닌으로, 에리오딕티올을 루테올린으로 및/또는 헤스페레틴을 디오스메틴으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있는 플라본 신타제(FNS)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함한다.
따라서, 벡터는 이로부터 선택된 수개의 핵산 서열, 특히 이로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 핵산 서열을 포함할 수 있다.
벡터는 특히 상술한 바와 같은 특수한 암호화 서열의 조합을 포함할 수 있다.
벡터는 암호화 서열이 숙주 미생물에 대해 최적화될 수 있고/있거나, 이종 프로모터의 제어 하에 있을 수 있고/있거나 동일한 기원의 미생물로부터 유래되지 않고/않거나 동일한 정렬로 존재하지 않는 암호화 서열과 조합될 수 있는 한 이종인 암호화 서열을 포함한다.
벡터는 임의의 DNA 서열일 수 있고 여기서 이는 외부 핵산, 즉, 숙주 미생물내로 외부 DNA를 도입시킬 수 있도록 하는 벡터를 삽입시키는 것이 가능하다. 예를 들면, 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 특히, YAC, 또는 BAC일 수 있다.
발현 벡터는 선택 마커를 암호화하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 선택 마커는 하나 이상의 항생제 또는 영양요구성 유전자에 대한 내성을 위한 유전자일 수 있다. 영양요구성 유전자는, 예를 들면, URA3, LEU2, HIS3 또는 TRP1일 수 있다. 항생제-내성 유전자는 바람직하게는, 예를 들면, 암피실린, 가나마이신, 하이그로마이신, 게네티신 및/또는 뉴로세트리신에 대한 내성을 위한 유전자일 수 있다.
숙주 미생물 내로의 벡터의 도입은 당해 분야의 기술자에게 널리 알려진 공정이다. 몇가지 방법이 특히 문헌: "Current Protocols in Molecular Biology", 13.7.1-13.7.10; 또는 in Ellis T. et al., Integrative Biology, 2011, 3(2), 109-118에 기술되어 있다.
숙주 미생물은 일시적으로 또는 안정하게 형질전환/형질감염될 수 있고 핵산, 카세트 또는 벡터가 에피소옴 형태 또는 숙주 미생물의 게놈내로 혼입된 형태로 내부에 함유될 수 있다.
발현 벡터는 또한 벡터, 발현 카세트 또는 핵산의 숙주 미생물 게놈내로의 표적화된 삽입을 허용하는 하나 이상의 서열을 포함할 수 있다.
상기 기술된 바와 같은 효소를 암호화하는 핵산 서열 또는 이들 중 일부의 조합을 포함하는 발현 카세트 모두 또는 부분은 재조합 미생물의 염색체내로 삽입될 수 있다.
역으로, 기술된 바와 같은 효소를 암호화하는 핵산 서열 또는 이들 중 일부의 조합을 포함하는 발현 카세트의 모두 또는 부분은 에피소옴 형태, 특히 플라스미드 형태로 보존될 수 있다.
임의로, 미생물은 앞서 기술한 바와 같은 효소를 암호화하는 핵산 서열의 수개의 카피를 포함할 수 있다. 특히, 이는 앞서 기술한 바와 같은 효소를 암호화하는 핵산 서열의 2 내지 10개의 카피, 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 카피를 포함할 수 있다.
본 발명은 특히 헤스페리틴 및 디오스페틴의 7 위치에서 글루코스를 가할 수 있는, 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT), 특히 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 6 위치에서 람노스를 전환시킬 수 있는 6"-O-람노실트랜스퍼라제 (RhaT); 및 특히 미생물에서 UDP-람노스를 생산할 수 있는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)를 암호화하는 핵산 서열을 미생물내로 도입시키는 단계; 및 이러한 핵산 서열을 포함하는 미생물을 선택하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 미생물의 제조 방법에 관한 것이다.
이러한 방법은 또한 다음 중에서 선택된 하나 이상의 핵산 서열을 도입시키는 단계를 포함할 수 있다:
- 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화시킬 수 있고; 바람직하게는 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 게르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스, 시트러스 클레멘티나, 오스테오스페르뭄 하이브리드 쿨티바르, 파네로차에테 크리소스포리움, 스트렙토마이세스 아베르미틸리스 또는 피로셀라 오피시나룸으로부터, 특히 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파, 페투니아 엑스 하이브리다, 칼리스테푸스 키넨시스, 게르베라 하이브리다, 시트러스 시넨시스 또는 피로셀라 오피시날룸으로부터의 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H), 바람직하게는 서열 번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 1, 5, 7, 11, 17 및 19로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 F3'H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 5, 7 및 17로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 시토크롬 P450 리덕타제(CPR); 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지아에로부터, 또는 식물로부터, 예를 들면 카타란투스 로세우스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 CPR; 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 특히 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화시킬 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 호모사피엔스로부터의 OMT, 바람직하게는 특히 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4'에서 메틸화된, 서열 번호: 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85 eHSMS 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 89로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 OMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 나린게닌을 아피게닌으로, 에리오딕티올을 루테올린으로, 및/또는 헤스페레틴을 디오스메틴으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 에리오딕티올을 루테올린으로 전환시킬 수 있는 플라본 신타제(FNS); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트룬카툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스, 제아 마이스, 칼리스테푸스 키넨시스, 아피움 그라베올렌스, 메디카고 트루카툴라, 쿠미눔 시미눔, 아에투사 시나피움, 안젤리카 아르칸겔리카, 코니움 마쿨라툼, 카멜리아 시넨시스, 시나라 카르둔쿨루스 바르 시콜리무스, 사우쑤레아 메두사, 플렉트란투스 바르바투스, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스, 도르코세라스 하이그로메트리쿰, 안티리눔 마주스, 페릴라 프루테스센스 바르 크리스파, 다흘리아 핀나타 또는 에리트란테 레위시이로부터, 특히 아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스, 메디카고 트룬카툴라, 오리자 사티바, 페트로셀리눔 크리스품, 포풀루스 델토이데스 또는 제아 마이로부터, 바람직하게는 로이세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스 및 페트로셀리눔 크리스품으로부터의 FNS; 바람직하게는 서열 번호: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 특히 사카로마이세스 세레비지아에로부터의 S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT), 예를 들면, 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 SAMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신테타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열;
- 타이로신으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있는 타이로신 암모니아 리아제 (TAL); 바람직하게는 로도토룰라 글루티니스 또는 플라보박테리움 존소니아에로부터 유래된 TAL; 특히 서열 번호: 39 및 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- p-쿠마르산 및 조효소 A로부터 쿠마릴-CoA를 생산할 수 있는 4-쿠마레이트-CoA 리가제(4CL); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나, 페트로셀눔 크리스품 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 4CL; 서열 번호: 43, 45, 47 및 49로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 4-쿠마로일-CoA 및 말로닐-CoA로부터 나린게닌-찰콘을 생산할 수 있는 찰콘 신타제(CHS), 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 호르데움 불가레 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 CHS, 특히 서열 번호: 51, 53, 55 및 57로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 53 및 55로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 CHS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 53로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 나린게닌 찰콘으로부터 나린게닌을 생산할 수 있는 찰콘 이소머라제(CHI); 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터 유래된 CHI, 특히 서열 번호: 59 및 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL), 특히 서열 번호: 63, 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H), 특히 페닐알라닌으로부터 p-쿠마르산을 생산할 수 있는, 서열 번호: 67, 69 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 특히 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 바람직하게는 서열 번호: 83으로부터 선택된 서열을 포함하는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 소단위(HpaB) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 및 바람직하게는 서열 번호: 85로부터 선택된 서열을 포함하는 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 소단위(HpaC) 및 이와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-하이드록시페닐아세테이트 3-모노옥시게나제 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 또는 타이로신을 L-DOPA로 및 또한 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 73 및 75로부터 선택된 서열을 포함하는 4-메톡시벤조에이트 O-데메틸라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 L-타이로신 하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 또는 p-쿠마르산을 카페산으로 전환시킬 수 있고, 바람직하게는 서열 번호: 71로부터 선택된 서열을 포함하는 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 p-쿠마레이트 3-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열, 및
- 디하이드록시페닐알라닌 암모니아-리아제(DAL)를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에 따라서, 방법은:
(i) 아라비돕시스 탈리아나, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스 또는 호모 사피엔스로부터, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT), 바람직하게는 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터 선택된 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 특히 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
(ii) 시트러스 속 또는 페투니아 하이브리다, 바람직하게는 시트러스 시넨시스, 시트러스 막시마, 또는 시트러스 클레멘티나, 심지어 보다 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나의 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT), 바람직하게는 서열 번호: 103 및 105로부터 선택된 서열을 포함하는 6-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
(iii) 시트러스 시넨시스로부터 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM), 바람직하게는 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 특히 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 RHM 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
다음으로부터 선택된 적어도 하나의 핵산 서열의 도입 단계를 포함한다:
- 4' 위치에서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 메틸화할 수 있는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT); 바람직하게는 시트러스 클레멘티나, 시트러스 시넨시스, 아라비돕시스 탈리아나 또는 호모 사피엔스로부터의 OMT, 바람직하게는 서열 번호: 117, 119, 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 특히 기질로서 에리오딕티올 및/또는 루테올린을 사용하고 4' 위치에서 메틸화된, 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 117 및 119로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 117로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 3' 위치에서 나린게닌 및/또는 아피게닌을 하이드록실화할 수 있고 서열 번호: 7, 11, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 23, 25, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 시토크롬 P450 리덕타제(CPR) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 특히 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 서열 번호: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT); 특히 사카로마이세스 세레비니자에로부터의 SAMT, 예를 들면 서열 번호: 81로부터 선택된 서열을 포함하는 SAMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 S-아데노실메티오닌 신테타제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열; 및
- 로도토룰라 글루티니스 또는 플라보박테리움 존소니아에로부터 유래된 타이로신 암모니아 리아제(TAL); 특히 서열 번호: 41 및 39로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 아라비돕시스 탈리아나, 시트러스 크레멘티나, 페트로셀눔 크리스품 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터의 4-쿠마레이트-CoA 리가제(4CL); 특히 서열 번호: 123, 125, 45, 43, 47 및 49로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 123, 125 및 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 가장 특히 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 시트러스 시넨시스, 호르데움 불가레 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터의 찰콘 신타제(CHS); 특히 서열 번호: 53, 51, 55 및 57로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 53으로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
- 아라비돕시스 탈리아나 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스로부터의 찰콘 이소머라제(CHI); 특히 서열 번호: 61 및 59로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드; 바람직하게는 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열.
바람직하게는, 방법은 이러한 서열 모두의 도입 단계를 포함한다.
바람직하게는, 방법은 또한:
- 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL), 특히 서열 번호: 63, 65 및 77, 바람직하게는 서열 번호: 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 및 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
- 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H), 특히 서열 번호: 67, 69 및 79 및 서열을 포함하는 C4H 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 폴리펩타이드, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열의 도입 단계를 포함한다.
바람직하게는, 방법은 상술한 바와 같은 특수한 암호화 서열의 조합의 도입 단계를 포함한다.
디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생산
본 발명은 디오스민 및/또는 헤스페리딘을 생산하기 위한 본 발명에 따른 미생물의 용도에 관한 것이다. 제1의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 디오스민을 생산하기 위한 본 발명에 따른 미생물의 용도에 관한 것이다. 제2의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 헤스페리딘을 생산하기 위한, 본 발명에 따른 미생물의 용도에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 디오스민 및 헤스페리딘을 생산하기 위한 본 발명에 따른 미생물의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 특히 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생산을 허용하거나 이에 대해 유리한 조건 하에서, 본 발명에 따른 미생물의 배양 단계 및 임의로 생산된 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 회수 및/또는 정제 단계를 포함하는 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미생물의 배양 조건은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 통상의 기술에 따라 채택할 수 있다.
미생물은 적합한 배양 배지 속에서 배양된다. 용어 "적합한 배양 배지"는 일반적으로 상기 미생물의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 유리한 영양물, 예를 들면, 탄소원; 질소원, 예를 들면, 황산암모늄; 인원(phosphorus source), 예를 들면, 일염기성 인산칼륨; 미량 성분, 예를 들면, 구리, 요오드, 철, 마그네슘, 아연 또는 몰리브데이트 염; 비타민 및 다른 성장 인자, 예를 들면, 아미노산 또는 다른 성장 프로모터를 제공하는 배양 배지를 나타낸다. 소포제를 필요한 경우 가할 수 있다. 본 발명에 따라서, 이러한 적합한 배양 배지는 화학적으로 정의되거나 복잡할 수 있다. 따라서 배양 배지는 문헌: Verduyn et al., (Yeast. 1992. 8: 501-17)에 정의되거나, 비써(Visser) 등의 문헌(Biotechnology and Bioengineering. 2002. 79: 674-81)에 의해 채택된 합성 배지, 또는 상업적으로 이용가능한, 예를 들면, YNB 배지(Yeast Nitrogen Base, MP Biomedicals 또는 Sigma-Aldrich)와 동일하거나 유사할 수 있다. 특히, 배양 배지는 단순 탄소원, 예를 들면, 글루코스, 프럭토스, 크실로스, 에탄올, 글리세롤, 갈락토스, 슈크로스, 셀룰로스, 셀로비오스, 전분, 글루코스 중합체, 몰라세스, 또는 이러한 당의 부산물을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 미생물에 의한 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생산은 나린게닌, 아피게닌, 에리오딕티올, 루테올린, 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 배지에 공급하지 않고, 바람직하게는 나린게닌, 아피게닌, 에리오딕티올, 루테올린, 헤스페레틴 및 디오스메틴을 배양 배지에 공급하지 않고 수득된다.
본 발명에 따라서, 목적한 분자의 산업 규모 생산을 위한 임의의 배양 방법이 고려될 수 있다. 유리하게는, 배양은 생물반응기, 특히, 배치(batch), 공급-배치(fed-batch), 케모스타트(chemostat) 및/또는 연속 배양 방식으로 수행된다. 공정 동안 비타민의 제어된 공급은 또한 생산성에 유리할 수 있다(Alfenore et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. 60: 67-72).
배양은 일반적으로 생물반응기 속에서 적합한 배양 배지가 들어있는 에를렌마이어 플라스크(Erlenmeyer flask) 속에서 가능한 고체 및/또는 액체 예비배양 단계로 수행한다.
일반적으로, 본 발명에 따른 미생물의 배양 조건은 미생물의 기능으로서, 당해 분야의 기술자에 의해 용이하게 채택가능하다. 예를 들면, 배양 온도는 특히 효모의 경우 20℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28 내지 35℃, 및 보다 특히 에스. 세레비지아에의 경우 약 30℃이다.
본 발명에 따른 미생물은 1 내지 30일, 및 바람직하게는 1 내지 10일 동안 배양될 수 있다.
본 발명에 따른 미생물은 디오스민 및/또는 헤스페리딘을 1 mg/l의 배양 배지, 바람직하게는 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mg/l의 배양 배지, 임의로 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 mg/l의 배양 배지의 최소량으로 생산할 수 있다.
도 1: 헤스페리딘 및 디오스민을 생산하기 위한 대사 경로의 설명.
도 2: 균주 FL_405 (F3'H4 + CPR2)에 의한 나린게닌으로부터 에리오딕티올의 생산. 대조군 균주: CF235. 균주 fl-405에서 나린게닌 피크의 사라짐 및 에리오딕티올 피크의 출현의 관찰.
도 3: 균주 FL_405 (F3'H4 + CPR2)에 의한 아피게닌으로부터 루테올린의 생산. 대조군 균주: CF235. 균주 FL-405에서 아피게닌 피크의 사라짐 및 루테올린 피크의 출현의 관찰.
도 4: 균주 SC744 (FNSII1 + CPR2)에 의한 나린게닌으로부터 아피게닌의 생산. 대조군 균주: CF234. 균주에서 나린게닌 피크의 사라짐 및 아피게닌 피크의 출현의 관찰.
도 5: 에리오딕티올 SC744(FNSII1 + CPR2)로부터 루테올린의 생산. 대조군 균주: CF234. 균주에서 에리오딕티올 피크의 사라짐 및 루테올린 피크의 출현의 관찰.
도 6: 균주 SC1500에 의한 에리오딕티올 및 루테올린의 생산. 대조군 균주: CF237. 에리오딕티올 및 루테올린 피크의 관찰.
도 7: 균주 SC 1612(MET + SAM) 및 SC 1614(MET + SAM)에 의한 에리오딕티올로부터 헤스페레틴의 생산. 대조군 균주: CF235. 균주에서 에리오딕티올 피크의 사라짐 및 헤스페레틴 피크의 출현의 관찰.
도 8: 균주 SC 1612(MET + SAM) 및 SC 1614(MET + SAM)에 의한 루테올린으로부터 디오스메틴의 생산. 대조군 균주: CF235. 균주에서 루테올린 피크의 사라짐 및 디오스메틴 피크의 출현의 관찰.
도 9: 균주 SC744(FNSII + CPR)에 의한 헤스페레틴으로부터 디오스메틴의 생산. 대조군 균주: CF234. 균주에서 헤스페레틴 피크의 사라짐 및 디오스메틴 피크의 출현의 관찰.
도 10: 이. 콜라이 EC26(MET + SAM)에 의한 에리오딕티올로부터 헤스페레틴의 생산. 대조군 균주: 이. 콜라이 MH1. 균주에서 에리오딕티올 피크의 사라짐 및 헤스페레틴 피크의 출현의 관찰.
도 11: 이. 콜라이 EC26(MET + SAM)에 의한 루테올린으로부터 디오스메틴의 생산. 대조군 균주: 이. 콜라이 MH1. 균주에서 루테올린 피크의 사라짐 및 디오스메틴 피크의 출현의 관찰.
도 12: 이. 콜라이 EC30(FNSII)에 의한 헤스페레틴으로부터 디오스메틴의 생산. 대조군 균주: 이. 콜라이 MH1. 균주에서 헤스페레틴 피크의 사라짐 및 디오스메틴 피크의 출현의 관찰.
도 13: 균주 SC1508에 의한 헤스페레틴 및 디오스메틴의 생산. 대조군 균주: CF237. 헤스페레틴 및 디오스메틴 피크의 관찰.
도 14: 균주 FL 547(GT + RHM + RHAT)에 의한 헤스페레틴으로부터 헤스페리딘의 생산. 대조군 균주: CF 233. 헤스페레틴 피크의 사라짐 및 헤스페리딘 피크의 출현의 관찰.
도 15: 균주 FL 547(GT + RHM + RHAT)에 의한 디오스메틴으로부터 디오스민의 생산. 대조군 균주: CF 233. 디오스메틴 피크의 사라짐 및 디오스민 피크의 출현의 관찰.
도 16: 이. 콜라이 EC38, EC45 및 EC47(GT + RHM + RHAT)에 의한 헤스페레틴으로부터 헤스페리딘의 생산. 대조군 균주: 이. 콜라이 MH1. 헤스페레틴 피크의 사라짐 및 헤스페리딘 피크의 출현의 관찰.
도 17: 이. 콜라이 EC38, EC45 및 EC47(GT + RHM + RHAT)에 의한 디오스메틴으로부터 디오스민의 생산. 대조군 균주: 이. 콜라이 MH1. 디오스메틴 피크의 사라짐 및 디오스민 피크의 출현의 관찰.
도 18: 균주 SC1509, SC1530, SC1529, SC1568 및 SC2410에 의한 헤스페리딘 및 디오스민의 생산. 대조군 균주: CF237. 헤스페리딘 및 디오스민 피크의 관찰.
도 19: 균주 SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC2428 및 SC1500에 의한 에리오딕티올 및 루테올린의 생산. 대조군 균주: CF237.
도 20: 균주 SC2147, SC2151, SC1612 및 SC1614에 의한 헤스페레틴 및 호모에리오딕티올의 생산. 대조군 균주: CF235.
도 21: 균주 SC2147, SC2151, SC1612 및 SC1614에 의한 디오스메틴 및 크리소에리올의 생산. 대조군 균주: CF235.
도 22: 이. 콜라이 EC41(MET + SAM)에 의한 에리오딕티올로부터 헤스페레틴의 생산. 대조군 균주: 이. 콜라이 MH1. 균주에서 에리오딕티올 피크의 사라짐 및 헤스페레틴 피크의 출현의 관찰.
도 23: 이. 콜라이 EC43(MET + SAM)에 의한 에리오딕티올로부터 헤스페레틴의 생산. 대조군 균주: 이. 콜라이 MH1. 균주에서 에리오딕티올 피크의 사라짐 및 헤스페레틴 피크의 출현의 관찰.
도 24: 이. 콜라이 EC43(MET + SAM)에 의한 루테올린으로부터 디오스메틴의 생산. 대조군 균주: 이. 콜라이 MH1. 균주에서 루테올린 피크의 사라짐 및 디오스메틴 피크의 출현의 관찰.
도 25: 균주 SC2408에 의한 헤스페레틴 및 디오스메틴의 생산. 대조군 균주: CF237. 헤스페레틴 및 디오스메틴 피크의 관찰.
도 26: 균주 SC2409에 의한 헤스페레틴 및 디오스메틴의 생산. 대조군 균주: CF237. 헤스페레틴 및 디오스메틴 피크의 관찰.
도 27: 균주 SC2408, SC2409 및 SC1508에 의한 헤스페레틴 및 디오스메틴의 생산. 대조군 균주: CF237.
도 28: 균주 SC1579, SC1584, SC1621 및 SC1626에 의한 헤스페리딘 및 디오스민의 생산.
도 29: 균주 SC2429 내지 SC2434, SC2436 내지 SC2444, SC2446 내지 SC2454, SC2456 내지 SC2464 및 SC2466에 의한 나린게닌으로부터 디오스메틴의 생산.
[표 1]
Figure pct00001

Figure pct00002

Figure pct00003

Figure pct00004

Figure pct00005

Figure pct00006
실시예
물질 및 방법
균주
실시예에 사용된 효모는 사카로마이세스 세레비지아에 FY1679-28A(Tettelin et al., 1995 https://doi.org/10.1016/S1067-2389(06)80008-7)로부터 수득하였다. 당해 효모는 우라실, 트립토판, 히스티딘 및 루이신에 대해 4배 영양요구성이었다. 실시예에 사용된 세균 균주는 에스케리키아 콜라이 MH1으로부터 수득하였다.
표준
표준은 프랑스 소재의 공급업자 Extrasynthese(나린게닌, 아피게닌, 에리오딕티올, 루테올린, 헤스페레틴, 헤스페리딘, 디오스메틴 및 디오스민)로부터 입수하였다.
유전자 클로닝
효모에서 발현하도록 최적화된 유전자는 독일 에베르스버그 소재의 Eurofins Genomics 또는 캐나다 캠프릿지 소재의 Biomatik 또는 미국 샌프란시스코주 소재의 Twist Biosciences 또는 영국 던디 소재의 DC Biosciences에 의해 합성되었다. PCR로, 에스. 세레비지아에로부터의 유전자 cpr2(서열 번호: 26)를 게놈 DNA로부터 증폭시켰다.
합성 또는 PCR에 의해 수득한 유전자는 5' 및 3' 말단에서 BbsI(GAAGAC) 또는 BsaI(GGTCTC) 제한 부위를 포함한다.
모든 유전자, 프로모터 및 터미네이터를 효모 또는 벡터내에서 발현의 경우 벡터 pSBK내에서 또는 이. 콜라이내에서 발현의 경우 벡터 pSB1K3 내에서 제한-클로닝하였다. 프로모터 및 터미네이터(Wargner et al., 2015 DOI: 10.1016/j.fgb.2015.12.001)는 PCR에 의해 효모 에스. 세리비지아에 또는 이. 콜라이의 게놈 DNA로부터 회수하였다.
벡터 pSBK는 효모의 경우 URA 또는 LEU 또는 TRP 또는 HIS 선택 마커를 포함하고 벡터 pSB1K3은 가나마이신-내성 마커를 포함한다.
배양 조건
균주를 효모의 경우 글루코스가 20 g/l에서 보충된 1 ml의 최소 질소 기본 배지(Dutscher, 프랑스 브루마쓰 소재) 및 이. 콜라이의 경우 글루코스가 4 g.l-1에서 보충된 1 ml의 M9 속에 배양하였다. 특정의 경우에, 나린게닌 또는 아피게닌을 100 mg.l-1이 농도에서 가하여 F3'Hs의 활성을 측정하고, 나린게닌 또는 에리오딕티올을 100 mg.l-1의 농도에서 가하여 FNSIIs의 활성을 측정하고, 에리오딕티올 또는 루테올린을 100 mg.l-1의 농도로 가하여 MET의 활성을 측정하고, 헤스페레틴 또는 디오스메틴을 100 mg.l-1의 농도에서 가하여 GT의 활성을 측정하고, 헤스페레틴 7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴 7-O-글루코시드를 가하야 RHM 및 RHAT의 활성을 측정하였다.
각각의 균주를 0.2의 OD에서 동일한 조건 하에 배양한 24-시간 예비 배양물을 사용하여 접종하였다.
분석 방법
샘플의 제조: 1 mL의 배양물을 -80℃에서 동결시키고 12시간 동안 0.10 mbar에서 동결건조시켰다. 이후에, 샘플을 1 mL의 디메틸설폭사이드(DMSO)에 넣고, 30초 동안 1000 rpm에서 교반한 다음 5분 동안 3000 rpm에서 실온에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 공지된 용적의 상층액을 메탄올 속에 용해된 공지된 용적의 내부 표준의 혼합물에 가한다.
내부 표준의 최종 농도는 다음과 같다:
* 디오스민 C13 0.5 mg/L
* 디오스메틴 C13 0.015 mg/L
UHPLC-TQ에 의한 분석: 샘플을 Quantis triple-quadrupole MS(Thermo)에 커플링된 Vanquish-H UHPLC machine(Thermo)을 사용하여 분석하였다. 컬럼은 HSST3 1.8 μm 2.1 X 5 mm 예비컬럼과 결합된 Waters Acquity UPLC@ USST3 컬럼(8 μm 2.1 X 100 mm)이다.
이동상 A는 LC/MS-등급 수 중 포름산의 0.1% 용액이고 이동상 B는 순수한 LC/MS-등급 아세토니트릴 중 포름산의 0.1% 용액이다. 컬럼 온도는 50℃이고 샘플 교환기의 온도는 10℃이다.
2개의 크로마토그래피 조건을 목적한 플라보노이드를 검출하는데 사용하였다:
Figure pct00007
Figure pct00008
모니터링된 이온 및 목적한 분자에 대한 단편화 조건은 다음과 같다:
Figure pct00009
Figure pct00010
F3'H
각각의 F3'H에 대한 작제물을 URA 선택 마커를 지닌 벡터 내에서 제조하였다(표 6). 각각의 SAM2 및 다양한 CPR 중 하나 만을 포함하는 작제물을 LEU 선택 마커를 지닌 벡터내에서 생성시켰다(표 7). URA 또는 LEU 선택 마커 만을 포함하는 2개의 벡터를 또한 대조군으로서 생성시켰다. 마커 유전자는 혼입된 목적한 유전자를 갖는 세포를 검출 및 선택하는 것을 가능하도록 한다.
Figure pct00011
Figure pct00012
수개의 균주를 각각 표 6에 나타낸 모든 F3'H을 사용하여 생성시킴으로써 이들이 표 7의 작제물로 각각 시험될 수 있도록 하였다.
이러한 다양한 조립은 F3'H의 효소 활성을 점검하는 것을 가능하게 하고 또한 가장 효율적인 F3'H-CPR 쌍을 측정할 수 있도록 한다.
예를 들면, 균주 FL 405는 작제물 FL 26 및 FL 401을 함유한다.
작제물 TT URA 및 TT LEU를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF235로 불린다.
FNSII
다음의 FNSII 각각의 경우, TRP 벡터에서 작제물을 제조하였다(표 8). 각각 SAM2 및 상이한 CPR를 함유하는 LEU 선택 마커를 지닌 동일한 벡터를 사용하여 FNSII를 시험하였다(표 9).
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
수개의 균주를 표 8에서 나타낸 FNSII의 작제물 각각 및 표 9의 CPR의 작제물 각각을 사용하여 생성시켰다.
이러한 다양한 조립체는 FNSII의 효소 활성을 점검할 수 있도록 하고 또한 가장 효율적인 FNSII를 측정할 수 있도록 한다.
예를 들면, 균주 SC 744는 작제물 FL 620 및 FL 401을 함유한다.
작제물 TT TRP 및 TT LEU를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF234로 불린다.
유사한 작제물을 제조하여 서열 번호: 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159의 FNSII를 시험하였다.
에리오딕티올/루테올린까지의 효모
에리오딕티올 및 루테올린까지의 경로를 포함하는 균주를 또한 사용하였다:
- FL 26, FL 602, FL 808 및 FL 822를 포함하는 균주 SC1500 작제물;
- 작제물 FL 1031 + FL 602 + FL 822 + TT HIS를 포함하는 균주 SC2424;
- 작제물 FL 26 + FL 602 + FL 822 + TT HIS를 포함하는 균주 SC2425;
- 작제물 FL 31 + FL 602 + FL 822 + TT HIS를 포함하는 균주 SC2426;
- 작제물 FL 1031, FL 602, FL 808 및 FL 822를 포함하는 균주 SC2427; 및
- 작제물 FL 31 + FL 602 + FL 808 + FL 822를 포함하는 균주 SC2428.
Figure pct00016
작제물 TT URA, TT TRP, TT HIS 및 TT LEU를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF237로 불린다.
MET:
각각의 MET를 시험하기 위하여, 작제물을 제조하고 표 11에 나타낸다. 마커 유전자는 혼입된 목적한 유전자를 갖는 세포를 검출 및 선택할 수 있도록 한다.
Figure pct00017
에리오딕티올의 헤스페레틴으로부터 전환에 대해 SC1612의 경우 FL 121 및 FL 266, SC1614의 경우 FL 121 및 FL 268, SC2147 및 FL 469의 경우 FL 475 및 FL 121 및 SC2151의 경우 FL 121을 사용하여 4개의 균주 SC1612, SC1614, SC2147 및 SC2151을 생성시킴으로써 어느 MET가 가장 효율적인지를 측정하였다.
작제물 TT LEU 및 TT URA를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF235로 불린다.
F3'H, MET, FNS, CPR: 나린게닌으로부터 디오스메틴의 생산
Figure pct00018
Figure pct00019
다음의 균주를 작제하였다:
SC2429: FL 1111 + FL 1031 + FL 121
SC2430: FL 1112 + FL 1031 + FL 121
SC2431: FL 1113 + FL 1031 + FL 121
SC2432: FL 1114 + FL 1031 + FL 121
SC2433: FL 1115 + FL 1031 + FL 121
SC2439: FL 1111 + FL 1031 + TT LEU
SC2440: FL 1112 + FL 1031 + TT LEU
SC2441: FL 1113 + FL 1031 + TT LEU
SC2442: FL 1114 + FL 1031 + TT LEU
SC2443: FL 1115 + FL 1031 + TT LEU
SC2434: FL 1116 + FL 1031 + FL 121
SC2436: FL 1118 + FL 1031 + FL 121
SC2437: FL 1119 + FL 1031 + FL 121
SC2438: FL 1120+ FL 1031 + FL 121
SC2444: FL 1116 + FL 1031 + TT LEU
SC2446: FL 1118 + FL 1031 + TT LEU
SC2447: FL 1119 + FL 1031 + TT LEU
SC2448: FL 1120 + FL 1031 + TT LEU
SC2449: FL 1111 + FL 26 + FL 121
SC2450: FL 1112 + FL 26 + FL 121
SC2451: FL 1113 + FL 26 + FL 121
SC2452: FL 1114 + FL 26 + FL 121
SC2453: FL 1115 + FL 26 + FL 121
SC2459: FL 1111 + FL 26 + TT LEU
SC2460: FL 1112 + FL 26 + TT LEU
SC2461: FL 1113 + FL 26 + TT LEU
SC2462: FL 1114 + FL 26 + TT LEU
SC2463: FL 1115 + FL 26 + TT LEU
SC2454: FL 1116 + FL 26 + FL 121
SC2456: FL 1118 + FL 26 + FL 121
SC2457: FL 1119 + FL 26 + FL 121
SC2458: FL 1120+ FL 26 + FL 121
SC2464: FL 1116 + FL 26 + TT LEU
SC2466: FL 1118 + FL 26 + TT LEU
SC2467: FL 1119 + FL 26 + TT LEU
SC2468: FL 1120 + FL 26 + TT LEU
작제물 TT URA, TT TRP, TT HIS 및 TT LEU를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF237로 불린다.
헤스페레틴/디오스메틴까지의 이. 콜라이
Figure pct00020
헤스페레틴/디오스메틴까지의 효모
헤스페레틴/디오스메틴까지의 경로를 포함하는 3개의 균주를 또한 시험하였다. 균주 SC1508은 표 14의 작제물 FL 121 + FL 268 + FL 602 + FL 808을 포함한다. 균주 SC2408은 표 14의 작제물 FL 121 + FL 469 + FL 602 + FL 808을 포함한다. 균주 SC2409는 표 14의 작제물 FL 121 + FL 475 + FL 602 + FL 808을 포함한다.
Figure pct00021
Figure pct00022
작제물 TT LEU, TT URA, TT TRP 및 TT HIS를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF237로 불린다.
GT
각각의 GT를 시험하기 위하여, 작제물을 제조하고 표 15에 나타낸다. 마커 유전자는 혼입된 목적한 유전자를 갖는 세포를 검출 및 선택할 수 있도록 한다.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
다양한 GT를 지닌 다양한 작제물은 GT의 효소 활성을 점검하는 것을 가능하도록 하고 또한 가장 효율적인 GT를 측정하는 것을 가능하도록 한다.
작제물 TT URA를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF233으로 불린다.
RHM
각각의 RHM을 시험하기 위하여, 작제물을 제조하고 표 16에 나타낸다.
Figure pct00026
다양한 RHM을 지닌 다양한 작제물은 RHM의 효소 활성을 점검하는 것을 가능하도록 하고 또한 가장 효율적인 RHM을 측정하는 것을 가능하도록 한다.
작제물 TT URA를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF233으로 불린다.
RHAT
각각의 RHAT를 시험하기 위하여, 작제물을 제조하고 표 17에 나타낸다.
Figure pct00027
다양한 RHAT를 사용하여 제조된 다양한 조립체는 RHAT의 효소 활성을 점검하는 것을 가능하도록 하고 또한 가장 효율적인 RHAT를 측정하는 것을 가능하도록 한다.
작제물 TT URA를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF233으로 불린다.
헤스페리딘/디오스민까지의 이. 콜라이
Figure pct00028
헤스페리딘/디오스민까지의 효모
전체 경로를 포함하는 9개의 균주를 또한 생성시켰다.
균주 SC1509는 작제물 FL 121 + FL 511 + FL 602 + FL 808을 포함한다.
균주 SC1530은 작제물 FL 121 + FL 603 + FL 602 + FL 808을 포함한다.
균주 SC1529는 작제물 FL 121 + FL 554 + FL 602 + FL 808을 포함한다.
균주 SC1568은 작제물 FL 121 + FL 556 + FL 602 + FL 808을 포함한다.
균주 SC2410은 작제물 FL 121 + FL 1100 + FL 602 + FL 808을 포함한다.
균주 SC1579는 작제물 FL 401 + FL 547 + FL 602 + FL 828을 포함한다.
균주 SC1584는 작제물 FL 401 + FL 554 + FL 602 + FL 828을 포함한다.
균주 SC1621은 작제물 FL 401 + FL 556 + FL 602 + FL 828을 포함한다.
균주 SC1626은 작제물 FL 401 + FL 603 + FL 602 + FL 828을 포함한다.
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
작제물 TT LEU, TT URA, TT TRP 및 TT HIS를 함유하는 대조군 균주(유전자 부재)는 CF237로 불린다.
결과
F3'H
하기 표 20 및 21은 표 6에 나타낸 F3'H 및 표 7의 작제물을 포함하는 균주를 나린게닌 및 아피게닌 각각의 존재하에 배양함으로써 수득된 에리오딕티올(표 20) 및 루테올린(표 21)의 생산을 나타낸다.
Figure pct00033
다양한 균주가 또한 사용된 F3'H 및 CPR에 따라 상이한 농도에서, 나린게닌으로부터 에리오딕티올을 생산할 수 있다.
Figure pct00034
다양한 균주가 또한 사용된 F3'H 및 CPR에 따라 상이한 농도에서, 아피게닌으로부터 루테올린을 생산할 수 있다(참고: 도 3).
FNS
하기 표 22 및 23운 표 8에 나타낸 FNSII 및 표 9의 작제물을 포함하는 균주를 나린게닌 및 에리오딕티올 각각의 존재하에서 배양함으로써 수득된 아피게닌(표 22) 및 루테올린(표 23)의 생산을 나타낸다.
Figure pct00035
Figure pct00036
다양한 균주가 또한 사용된 FNS에 따라 상이한 농도에서, 나린게닌 및 에리오딕티올로부터 아피게닌 및 루테올린을 생산할 수 있다(참고: 도 4 및 도 5).
유사한 결과가 서열 번호: 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159의 FNSII를 사용하여 수득되었다.
F3'H, MET, FNS, CPR: 나린게닌으로부터 디오스메틴의 생산
균주 SC2429 내지 SC2434, SC2436 내지 SC2444, SC2446 내지 SC2454, SC2456 내지 SC2464 및 SC2466 내지 SC2468에 의한 나린게닌으로부터 디오스메틴의 생산 결과를 도 29에 나타낸다.
모든 균주는 나린게닌으로부터 디오스메틴을 생산할 수 있다. 디오스메틴의 생산은 CPR를 첨가함에 의해 크게 증가된다.
에리오딕티올/루테올린까지의 효모
균주 SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC1500 및 SC2428은 에리오딕티올 및 루테올린까지의 경로의 모든 효소를 함유하고 글루코스로부터 루테올린 및 에리오딕티올을 생산할 수 있다.
균주 SC1500에 대한 결과는 도 6에 상응하며, 여기서 에리오딕티올 및 루테올린 피크가 관찰된다. 유사한 결과가 균주 SC2424, SC2425, SC2426, SC2427 및 SC2428에 대해 관찰된다. 각각의 균주 SC2424, SC2425, SC2426, SC2427, SC1500 및 SC2428에 대한 에리오딕티올 및 루테올린의 생산은 도 19에 나타낸다.
생합성 경로에 효소 PAL 및 C4H의 첨가는 현저히 보다 높은 에리오딕티올 및 루테올린 농도를 수득하는 것을 가능하도록 함을 주목해야한다. 이러한 농도는 PAL 및 C4H를 제외한 동일한 효소를 함유하는 균주를 사용하여 수득된 농도보다 6배까지 더 높을 수 있다(참고: 도 19, 예를 들면 PAL/C4H가 없는 균주 SC2425 및 PAL/C4H를 지닌 균주 SC1500 또는 PAL/C4H이 없는 균주 SC2426 및 PAL/C4H를 지닌 균주 SC2428를 비교함으로써).
MET
균주 SC1612, SC1614, SC2147 및 SC2151에 의한 에리오딕티올 및 루테올린으로부터 헤스페레틴 및 디오스메틴의 생산을 각각 도 7, 8, 20 및 21에 나타낸다.
효모 균주 SC1612, SC1614, SC2147 및 SC2151은 실제로 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 생산할 수 있다.
에리오딕티올로 출발하여, 균주 SC2147, SC2151 및 SC1612는 헤스페레틴을 에리오딕티올의 4' 위치에서 하이드록실을 특이적으로 메틸화시킬 수 있다(도 20). 균주 SC1614는 이의 일부의 경우 헤스페레틴 및 호모에리오딕티올의 혼합물을 생산한다.
주목할만한 방식으로, 균주 SC2151은 또한 약 40 mg/L의 헤스페레틴을 생산할 수 있다(도 20). 이의 부분에 대해 균주 SC2147, SC1612 및 SC1614는 루테올린으로부터 디오스메틴을 생산할 수 있다(도 21).
FNSII
균주 SC744에 의한 헤스페레틴으로부터 디오스메틴의 생산 결과를 도 9에 나타낸다.
효모 균주 SC744는 또한 헤스페레틴으로부터 디오스메틴을 생산할 수 있다.
헤스페레틴/디오스메틴까지의 이. 콜라이
균주 EC26, EC41 및 EC43에 의한 에리오딕티올로부터 헤스페레틴의 생산 결과는 도 10, 22 및 23에 나타내고 균주 EC26 및 EC43에 의한 루테올린으로부터 디오스메틴의 생산은 도 11 및 24에 나타낸다.
이. 콜라이 균주 EC26, EC41 및 EC43은 실제로 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 생산할 수 있다.
균주 EC30에 의한 헤스페레틴으로부터 디오스메틴의 생산 결과는 도 12에 나타낸다.
이. 콜라이 균주 EC30은 실제로 헤스페레틴으로부터 디오스메틴을 생산할 수 있다.
헤스페레틴/디오스메틴까지의 효모
균주 SC1508, SC2408 및 SC2409에 의한 글루코스로부터 헤스페레틴 및 디오스메틴의 생산 결과는 도 13, 25 및 26에 나타낸다.
헤스페레틴 및 디오스메틴까지의 경로의 모든 효소를 함유하는 효모 균주 SC1508, SC2408 및 SC2409는 글루코스로부터 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴을 생산할 수 있다(도 27). 주목할만한 방식으로, 균주 SC2408은 약 25 mg/L의 헤스페레틴 및 약 5 mg/L의 디오스메틴을 생산한다.
GT
Figure pct00037
Figure pct00038
다양한 균주가 실제로 헤스페레틴 및 디오스메틴으로부터 헤스페리딘 및/또는 디오스민을 사용된 GT에 따라 상이한 농도로 생산할 수 있다.
RHM
Figure pct00039
Figure pct00040
다양한 균주가 또한 헤스페레틴 및 디오스메틴으로부터 헤스페리딘 및 디오스민을 사용된 RHM에 따라 상이한 농도로 생산할 수 있다.
RHAT
Figure pct00041
Figure pct00042
다양한 균주가 실제로 헤스페레틴 및 디오스메틴으로부터 헤스페리딘 및 디오스민을 사용된 GT, RHM 및 RHAT에 따라 상이한 농도에서 생산할 수 있다.
균주 FL 547에 의한 헤스페레틴 및 디오스메틴으로부터 헤스페리딘 및 디오스민의 생산 결과는 도 14 및 15에 각각 나타낸다.
다양한 작제물로 시험된 효모가 실제로 헤스페리딘 및 디오스민을 생산할 수 있다.
헤스페리딘/디오스민까지의 이. 콜라이
균주 EC38, EC45 및 EC47에 의한 헤스페레틴으로부터 헤스페리딘의 생산 결과는 도 16에 나타낸다.
이러한 균주는 실제로 헤스페레틴으로부터 헤스페리딘을 생산할 수 있다.
균주 EC38, EC45 및 EC47에 의한 디오스메틴으로부터 디오스민의 생산 결과는 도 17에 나타낸다.
이러한 균주는 실제로 디오스메틴으로부터 디오스민을 생산할 수 있다.
헤스페리딘/디오스민까지의 효모
균주 SC1509, SC1530, SC1529, SC1568 및 SC2410에 의한 글루코스로부터 헤스페리딘 및 디오스민의 생산 결과는 도 18에 나타내다. 균주 SC1579, SC1584, SC1621 및 SC1626에 의한 디오스민으로부터 헤스페리딘의 생산 결과는 도 28에 나타낸다.
경로의 효소 모두를 함유하는 모든 균주는 헤스페리딘 및/또는 디오스민을 생산할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> LES LABORATOIRES SERVIER <120> METHOD FOR THE BIOSYNTHESIS OF DIOSMIN AND/OR HESPERIDIN IN A MICROORGANISM <130> IP20214028/FR <160> 160 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 524 <212> PRT <213> Perilla frutescens <400> 1 Met Ser Ile Ser Ala Ala Val Ser Leu Ile Ile Cys Thr Ser Ile Leu 1 5 10 15 Gly Val Leu Val Tyr Phe Leu Phe Leu Arg Arg Gly Gly Gly Ser Asn 20 25 30 Gly Arg Pro Leu Pro Pro Gly Pro Arg Pro Trp Pro Ile Val Gly Asn 35 40 45 Leu Pro Gln Leu Gly Pro Lys Pro His Gln Ser Met Ala Ala Leu Ala 50 55 60 Arg Val His Gly Pro Leu Met His Leu Lys Met Gly Phe Val His Val 65 70 75 80 Val Val Ala Ala Ser Ala Thr Val Ala Glu Lys Phe Leu Lys Val His 85 90 95 Asp Thr Asn Phe Leu Ser Arg Pro Pro Asn Ser Gly Ala Glu His Ile 100 105 110 Ala Tyr Asn Tyr Asn Asp Leu Val Phe Ala Pro His Gly Pro Arg Trp 115 120 125 Arg Leu Leu Arg Lys Ile Cys Ala Leu His Leu Phe Ser Ser Lys Ala 130 135 140 Leu Asp Asp Phe Arg His Val Arg Glu Glu Glu Val Gly Ile Leu Ile 145 150 155 160 Arg Asn Leu Ala Ser Val Gly Glu Met Pro Ala Ser Ile Gly Gln Met 165 170 175 Met Tyr Val Cys Ala Thr Asn Ala Ile Ser Arg Val Met Leu Gly Arg 180 185 190 His Val Leu Gly Asp Glu His Arg Gly Ala Ala Gly Gly Gly Asp Thr 195 200 205 Thr Ala Glu Glu Phe Lys Ala Met Val Val Glu Leu Met Ala Leu Ala 210 215 220 Gly Val Phe Asn Val Gly Asp Phe Ile Pro Pro Leu Lys Gly Leu Asp 225 230 235 240 Leu Gln Gly Val Val Ala Lys Met Lys Lys Leu His Gln Arg Phe Asp 245 250 255 Ala Phe Phe Ser Gly Ile Leu His Asp His Lys Ile Asn Gly Ser Asn 260 265 270 Ala Ala Glu Gly His Val Asp Leu Leu Thr Thr Leu Ile Ser Leu Lys 275 280 285 Asp Val Asp Asn Asn Gly Glu Gly Gly Lys Leu Thr Asp Thr Glu Ile 290 295 300 Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ser 305 310 315 320 Ser Thr Val Glu Trp Ala Ile Thr Glu Leu Ile Arg Asn Pro Asn Ile 325 330 335 Leu Ala Arg Val Arg Lys Glu Leu Asp Leu Ile Val Gly Lys Asp Lys 340 345 350 Leu Val Lys Glu Ser Asp Leu Gly Gln Leu Thr Tyr Leu Gln Ala Val 355 360 365 Ile Lys Glu Asn Phe Arg Leu His Pro Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro 370 375 380 Arg Val Ala Gln Glu Ser Cys Glu Ile Asn Gly Tyr Tyr Ile Pro Lys 385 390 395 400 Asp Ser Thr Leu Leu Val Asn Val Trp Ala Ile Gly Arg Asp Pro Asn 405 410 415 Val Trp Pro Asp Pro Leu Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe Leu Met Gly 420 425 430 Gly Glu Lys Pro Asn Val Asp Val Arg Gly Asn Asp Phe Glu Leu Ile 435 440 445 Pro Phe Gly Ser Gly Arg Arg Ile Cys Ala Gly Met Asn Leu Gly Ile 450 455 460 Arg Met Val Gln Leu Leu Ile Ala Thr Met Val His Ala Phe Asp Phe 465 470 475 480 Glu Leu Ala Asn Gly Gln Leu Ala Lys Asp Leu Asn Met Glu Glu Ala 485 490 495 Tyr Gly Ile Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Leu Val Val His Pro Arg 500 505 510 Pro Arg Leu Ala Arg His Val Tyr Gln Ala Gln Val 515 520 <210> 2 <211> 1575 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> coding sequence for SEQ ID NO: 1 <400> 2 atgtccatct ctgccgccgt ttctttgatc atctgtactt ccattttggg tgttttggtt 60 tacttcttgt tcttgagaag aggtggtggt tctaacggta gaccattgcc accaggtcca 120 agaccatggc caattgtcgg taacttgcca caattgggtc caaagccaca ccaatctatg 180 gctgccttgg ccagagttca cggtccattg atgcacttga agatgggttt cgttcacgtt 240 gttgttgccg cctccgccac cgttgctgaa aagttcttga aggttcacga caccaacttc 300 ttgtctagac caccaaactc cggtgccgaa cacattgctt acaactacaa cgacttggtt 360 ttcgctccac acggtccaag atggagattg ttgagaaaga tttgtgcctt gcacttgttc 420 tcctccaagg ccttggatga cttcagacac gttagagaag aagaagttgg tatcttgatt 480 agaaacttgg cttctgttgg tgaaatgcca gcttctatcg gtcaaatgat gtacgtttgt 540 gccactaacg ctatctctag agtcatgttg ggtagacacg ttttgggtga cgaacacaga 600 ggtgccgccg gtggtggtga taccactgct gaagaattca aggctatggt tgttgaattg 660 atggctttgg ccggtgtttt caacgttggt gatttcattc caccattgaa gggtttggac 720 ttgcaaggtg ttgttgctaa gatgaagaag ttgcaccaaa gattcgacgc tttcttctct 780 ggtatcttgc acgatcacaa gatcaacggt tctaacgccg ctgaaggtca cgttgacttg 840 ttgactactt tgatttcttt gaaggacgtt gacaacaacg gtgaaggtgg taagttgacc 900 gatactgaaa ttaaggcttt gttgttgaac ttgttcactg ctggtactga cactacttct 960 tctactgttg aatgggccat cactgaattg atcagaaacc caaacatttt ggctagagtt 1020 agaaaggaat tggacttgat cgttggtaag gataagttgg ttaaggaatc cgatttgggt 1080 caattgacct acttgcaagc cgttatcaag gaaaacttca gattgcaccc atctactcca 1140 ttgtctttgc caagagtcgc tcaagaatct tgtgaaatca acggttacta catcccaaag 1200 gattctacct tgttggtcaa cgtttgggcc atcggtagag atccaaacgt ttggccagat 1260 ccattggaat tcagaccaga aagattcttg atgggtggtg aaaagccaaa cgttgatgtt 1320 agaggtaacg atttcgaatt gattccattc ggttctggta gaagaatttg tgctggtatg 1380 aacttgggta ttagaatggt tcaattgttg attgctacta tggttcacgc tttcgatttc 1440 gaattggcta acggtcaatt ggccaaggac ttgaacatgg aagaagctta cggtattact 1500 ttgcaaagag ccgacccatt ggttgtccac ccaagaccaa gattggccag acacgtttac 1560 caagctcaag tttaa 1575 <210> 3 <211> 627 <212> PRT <213> Phanerochaete chrysosporium <400> 3 Met Ser Pro Leu Leu Ser Ala Val Pro Ala Ala Ala Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Ala Ala Ala Met Tyr Val Leu Trp Thr Phe Leu Ala Leu Leu Val Arg 20 25 30 Gln Ala Arg Ser Pro Leu Arg His Leu Arg Gly Pro Pro Ser Pro Ser 35 40 45 Phe Leu Val Gly Asn Leu Arg Glu Met His Asp Gln Glu Asn Thr Ala 50 55 60 Leu Phe Ala Arg Trp Glu His Arg Tyr Gly Ser Thr Phe Val Tyr His 65 70 75 80 Gly Phe Leu Gly Gly Ala Arg Leu Leu Thr Thr Asp Pro Val Ala Val 85 90 95 Ala His Ile Leu Ala His Gly Tyr Asp Phe Pro Lys Pro Glu Phe Ile 100 105 110 Arg Asp Ala Leu Ala Ser Met Ala Ala Gly His Glu Gly Leu Leu Val 115 120 125 Val Glu Gly Asp Gly His Arg Arg Gln Arg Lys Ile Leu Ser Pro Ala 130 135 140 Phe Ala Thr Pro His Ile Lys Ser Leu Ser Pro Ile Ile Trp Ser Lys 145 150 155 160 Ala Thr Gln Leu Arg Asp Val Trp Ile Asp Leu Ala Ser Ser Pro Ser 165 170 175 Leu Thr Pro Ala Ala Thr Pro Ser Asp Pro Leu Ala His Ala Glu Glu 180 185 190 Gln Pro Ala Arg Ala Ser Gly Phe Leu Pro Asn Pro Phe Ser Ser Phe 195 200 205 Leu Ser Ser Lys Ala His Pro Arg Ser Ala Leu Pro Arg Ala Glu Ala 210 215 220 His Pro Glu Asp Arg Met Ser Ser Pro Gly Thr Lys Val Asp Val Leu 225 230 235 240 Ala Trp Leu Ala Arg Ala Thr Leu Asp Val Ile Gly Glu Ala Gly Phe 245 250 255 Gly Tyr Ala Phe Asn Ser Val Arg Ala Ala Ala Cys Pro Gly Asp Ala 260 265 270 Ala Glu Asp Glu Leu Ala Arg Ala Phe Ala Val Ile Phe Ser Thr Ala 275 280 285 Arg Lys Phe Arg Leu Ile Thr Val Leu Gln Val Trp Phe Pro Phe Leu 290 295 300 Arg Arg Phe Arg Arg Asn Ser Ala Ala Glu Asp His Ala Arg Ala Thr 305 310 315 320 Met Arg Arg Ile Gly Leu Ala Leu Ile Ala Glu Arg Arg Gln Glu Val 325 330 335 Leu Asp Asp Lys Ala His Ala Ser Gln Glu Ala Met Asp Gly Lys Asp 340 345 350 Leu Leu Thr Val Met Ile Lys Ser Ser Leu Ser Ser Asp Pro Ser Gln 355 360 365 Gln Leu Ser Thr Asn Glu Met Leu Cys Gln Ile Ala Thr Phe Leu Ala 370 375 380 Ala Gly His Glu Thr Ser Ala Ser Ala Leu Ser Trp Ala Leu Tyr Ala 385 390 395 400 Leu Ala Arg Ala Pro Ala Cys Gln His Thr Leu Arg Arg Glu Leu Arg 405 410 415 Ala Leu Thr Leu Pro Ala Asp Pro Ser Ala Ala Asp Leu Gln Ala Val 420 425 430 Leu Ala Leu Pro Tyr Leu Asp Ala Val Val Arg Glu Thr Leu Arg Val 435 440 445 His Ala Pro Val Thr Ser Thr Met Arg Val Ala Ala His Asp Ala Ala 450 455 460 Val Pro Val Gly Thr Pro Phe Arg Asp Ala His Gly Ala Gln His Ala 465 470 475 480 Ala Ile Arg Leu Arg Ala Gly Asp Val Val Thr Leu Pro Leu Gln Ala 485 490 495 Met Asn Lys Ala Arg Ala Leu Trp Gly Ala Asp Ala Ala Cys Phe Arg 500 505 510 Pro Glu Arg Trp Leu Ala His Gly Asp Ala Pro Arg Glu Pro Arg Gly 515 520 525 Leu Trp Gly Gly Val Met Thr Phe Gly Thr Gly Val Val Ala Asn Gly 530 535 540 Asn Arg Ser Cys Ile Gly Tyr Arg Phe Ala Val Asn Glu Ile Lys Leu 545 550 555 560 Phe Leu Tyr Ala Leu Val Arg Asp Ile Glu Phe Thr Ile Asp Pro Trp 565 570 575 Ile Glu Ile Glu Lys Arg Val Asn Val Val Thr Arg Pro Cys Val Lys 580 585 590 Ser Glu Pro His Leu Gly Asn Gln Met Pro Leu Arg Leu Arg Arg Val 595 600 605 Ala Val Glu Glu Thr Val Gly Asp Ser Ser Gly Asp Gly Ala Pro Arg 610 615 620 Thr Val Ser 625 <210> 4 <211> 1884 <212> DNA <213> artificial <220> <223> coding sequence for SEQ ID NO: 3 <400> 4 atgtccccat tgttgtctgc cgttccagcc gccgctttgc cattgttggc cgccgctatg 60 tacgttttgt ggactttctt ggctttgttg gttagacaag ccagatcccc attgagacac 120 ttgagaggtc caccatctcc atctttcttg gtcggtaact tgagagaaat gcacgaccaa 180 gaaaacaccg ctttgttcgc tagatgggaa cacagatacg gttctacctt cgtctaccac 240 ggtttcttgg gtggtgccag attgttgacc accgacccag tcgccgtcgc ccacatcttg 300 gcccacggtt acgacttccc aaagccagaa ttcatcagag atgccttggc ttctatggcc 360 gccggtcacg aaggtttgtt ggtcgtcgaa ggtgacggtc acaggagaca aagaaagatc 420 ttgtccccag ctttcgccac tccacacatc aagtctttgt ctccaatcat ctggtctaag 480 gctactcaat tgagagatgt ttggattgac ttggcctctt ctccatcctt gactccagct 540 gctaccccat ccgacccatt ggctcacgct gaagaacaac cagctagagc ttctggtttc 600 ttgccaaacc cattctcttc tttcttgtca tctaaggctc acccaagatc cgctttgcca 660 agagctgaag ctcacccaga agatagaatg tcctctccag gtaccaaggt cgacgttttg 720 gcttggttgg ctagagccac tttggacgtc atcggtgaag ccggtttcgg ttacgctttc 780 aactctgtca gagccgctgc ttgtccaggt gacgccgctg aagatgaatt ggctagagct 840 ttcgctgtca tcttctctac tgctagaaag ttcagattga tcactgtctt gcaagtttgg 900 ttcccattct tgagaagatt cagaagaaac tctgctgctg aagatcacgc tagagctact 960 atgagaagaa tcggtttggc tttgatcgct gaaaggagac aagaagtctt ggacgacaag 1020 gctcacgcct ctcaagaagc tatggatggt aaggacttgt tgactgtcat gatcaagtca 1080 tctttgtcat ccgatccatc tcaacaattg tctactaacg aaatgttgtg tcaaatcgct 1140 actttcttgg ctgctggtca cgaaacctct gcttctgctt tgtcttgggc cttgtacgcc 1200 ttggctagag ctccagcttg tcaacacact ttgagaagag aattgagagc tttgactttg 1260 ccagctgacc catctgccgc tgacttgcaa gctgttttgg ctttgccata cttggacgcc 1320 gtcgttagag aaactttgag agttcacgct ccagttactt ctactatgag agtcgctgct 1380 cacgacgccg ctgttccagt cggtactcca ttcagagatg ctcacggtgc tcaacacgcc 1440 gctatcagat tgagagctgg tgacgtcgtc actttgccat tgcaagctat gaacaaggcc 1500 agagctttgt ggggtgccga cgccgcttgt ttcagaccag aaagatggtt ggctcacggt 1560 gacgccccaa gagaaccaag aggtttgtgg ggtggtgtca tgactttcgg taccggtgtc 1620 gtcgctaacg gtaacagatc ttgtattggt tacagattcg ctgttaacga aatcaagttg 1680 ttcttgtacg ccttggttag agacatcgaa ttcactatcg acccatggat cgaaatcgaa 1740 aagagagtta acgtcgtcac cagaccatgt gtcaagtccg aaccacactt gggtaaccaa 1800 atgccattga gattgagaag agtcgctgtt gaagaaactg ttggtgattc ttctggtgac 1860 ggtgctccaa gaactgtttc ttaa 1884 <210> 5 <211> 513 <212> PRT <213> Petunia x hybrida <400> 5 Met Ser Glu Ile Leu Ser Leu Ile Leu Tyr Thr Val Ile Phe Ser Phe 1 5 10 15 Leu Leu Gln Phe Ile Leu Arg Ser Phe Phe Arg Lys Arg Tyr Pro Leu 20 25 30 Pro Leu Pro Pro Gly Pro Lys Pro Trp Pro Ile Ile Gly Asn Leu Val 35 40 45 His Leu Gly Pro Lys Pro His Gln Ser Thr Ala Ala Met Ala Gln Thr 50 55 60 Tyr Gly Pro Leu Met Tyr Leu Lys Met Gly Phe Val Asp Val Val Val 65 70 75 80 Ala Ala Ser Ala Ser Val Ala Ala Gln Phe Leu Lys Thr His Asp Ala 85 90 95 Asn Phe Ser Ser Arg Pro Pro Asn Ser Gly Ala Glu His Met Ala Tyr 100 105 110 Asn Tyr Gln Asp Leu Val Phe Ala Pro Tyr Gly Pro Arg Trp Arg Met 115 120 125 Leu Arg Lys Ile Cys Ser Val His Leu Phe Ser Thr Lys Ala Leu Asp 130 135 140 Asp Phe Arg His Val Arg Gln Asp Glu Val Lys Thr Leu Thr Arg Ala 145 150 155 160 Leu Ala Ser Ala Gly Gln Lys Pro Val Lys Leu Gly Gln Leu Leu Asn 165 170 175 Val Cys Thr Thr Asn Ala Leu Ala Arg Val Met Leu Gly Lys Arg Val 180 185 190 Phe Ala Asp Gly Ser Gly Asp Val Asp Pro Gln Ala Ala Glu Phe Lys 195 200 205 Ser Met Val Val Glu Met Met Val Val Ala Gly Val Phe Asn Ile Gly 210 215 220 Asp Phe Ile Pro Gln Leu Asn Trp Leu Asp Ile Gln Gly Val Ala Ala 225 230 235 240 Lys Met Lys Lys Leu His Ala Arg Phe Asp Ala Phe Leu Thr Asp Ile 245 250 255 Leu Glu Glu His Lys Gly Lys Ile Phe Gly Glu Met Lys Asp Leu Leu 260 265 270 Ser Thr Leu Ile Ser Leu Lys Asn Asp Asp Ala Asp Asn Asp Gly Gly 275 280 285 Lys Leu Thr Asp Thr Glu Ile Lys Ala Leu Leu Leu Asn Leu Phe Val 290 295 300 Ala Gly Thr Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Glu Trp Ala Ile Ala Glu 305 310 315 320 Leu Ile Arg Asn Pro Lys Ile Leu Ala Gln Ala Gln Gln Glu Ile Asp 325 330 335 Lys Val Val Gly Arg Asp Arg Leu Val Gly Glu Leu Asp Leu Ala Gln 340 345 350 Leu Thr Tyr Leu Glu Ala Ile Val Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro 355 360 365 Ser Thr Pro Leu Ser Leu Pro Arg Ile Ala Ser Glu Ser Cys Glu Ile 370 375 380 Asn Gly Tyr Phe 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ttctggtaac taa 1533 <210> 157 <211> 507 <212> PRT <213> Antirrhinum majus <400> 157 Met Ser Ser Thr Leu Val Tyr Ser Thr Leu Phe Ile Leu Ser Thr Leu 1 5 10 15 Leu Leu Thr Leu Leu Thr Arg Thr Arg Arg Lys Thr Arg Pro Pro Gly 20 25 30 Pro Leu Ala Leu Pro Leu Ile Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Lys 35 40 45 Leu His His Thr Phe His Gln Phe Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Ile 50 55 60 Gln Leu Tyr Leu Gly Ser Val Pro Cys Val Val Ala Ser Thr Pro Glu 65 70 75 80 Leu Ala Arg Glu Phe Leu Lys Thr His Glu Leu Asp Phe Ser Ser Arg 85 90 95 Lys His Ser Thr Ala Ile Asp Ile Val Thr Tyr Asp Ser Ser Phe Ala 100 105 110 Phe Ala Pro Tyr Gly Pro Tyr Trp Lys Phe Ile Lys Lys Leu Cys Thr 115 120 125 Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg Asn Leu Ser His Phe Gln Pro Ile Arg 130 135 140 Ala Leu Glu Val Asn Ser Phe Leu Arg Ile Leu Tyr Glu Lys Thr Glu 145 150 155 160 Gln Lys Gln Ser Val Asn Val Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser 165 170 175 Asn Val Ile Ser Asn Met Met Leu Gly Ile Arg Cys Ser Gly Thr Glu 180 185 190 Gly Glu Ala Glu Val Ala Arg Thr Val Ile Arg Glu Val Thr Gln Ile 195 200 205 Phe Gly Glu Phe Asp Val Ser Glu Ile Val Trp Phe Cys Lys Asn Leu 210 215 220 Asp Leu Gln Gly Ile Arg Lys Arg Ser Glu Asp Ile Arg Arg Arg Tyr 225 230 235 240 Asp Ala Leu Leu Glu Lys Ile Ile Ser Asp Arg Glu Arg Leu Arg Leu 245 250 255 Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Val Lys Asp Phe Leu Asp 260 265 270 Met Leu Leu Asp Val Met Glu Ser Glu Lys Ser Glu Val Glu Phe Thr 275 280 285 Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe Thr Ala Gly Thr 290 295 300 Asp Thr Thr Ala Ile Thr Thr Glu Trp Ala Ile Ala Glu Leu Ile Ser 305 310 315 320 Asn Pro Asn Val Leu Lys Lys Ala Gln Glu Glu Met Asp Lys Val Ile 325 330 335 Gly Ser Gln Arg Leu Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro Asn Leu Pro Tyr 340 345 350 Leu Asn Ala Ile Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His Pro Pro Ile Pro 355 360 365 Met Leu Thr Arg Lys Ser Ile Ser Asp Val Val Val Asn Gly Tyr Thr 370 375 380 Ile Pro Ala Lys Thr Leu Leu Phe Val Asn Leu Trp Ser Met Gly Arg 385 390 395 400 Asn Pro Asn Tyr Trp Glu Asn Pro Met Glu Phe Arg Pro Glu Arg Phe 405 410 415 Leu Glu Lys Gly Thr Gly Ser Ile Asp Val Lys Gly Gln His Phe Glu 420 425 430 Leu Leu Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro Gly Met Leu Leu 435 440 445 Gly Met Gln Glu Leu Phe Ser Ile Ile Gly Ala Met Val Gln Cys Phe 450 455 460 Asp Trp Lys Leu Pro Asp Gly Val Lys Ser Val Asp Met Thr Glu Arg 465 470 475 480 Pro Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Asn Asp Leu Val Cys Gln Leu Val 485 490 495 Pro Arg Ile Asp Pro Val Val Val Ser Gly Pro 500 505 <210> 158 <211> 1524 <212> DNA <213> artificial <220> <223> coding sequence for SEQ ID NO: 157 <400> 158 atgtcctcta ctttggttta ctctactttg ttcatcttgt ctactttgtt gttgactttg 60 ttgactagaa ctagaagaaa gactagacca ccaggtccat tggctttgcc attgatcggt 120 cacttgcact tgttgggtcc aaagttgcac cacactttcc accaattctc tcaaagatac 180 ggtccattga tccaattgta cttgggttct gttccatgtg ttgttgcttc tactccagaa 240 ttggctagag aattcttgaa aactcacgaa ttggacttct cttctagaaa gcactctact 300 gctatcgaca tcgttactta cgactcttct ttcgctttcg ctccatacgg tccatactgg 360 aagttcatca agaagttgtg tacttacgaa ttgttgggtg ctagaaactt gtctcacttc 420 caaccaatca gagctttgga agttaactct ttcttgagaa tcttgtacga aaagactgaa 480 caaaagcaat ctgttaacgt tactgaagaa ttggttaagt tgacttctaa cgttatctct 540 aacatgatgt tgggtatcag atgttctggt actgaaggtg aagctgaagt tgctagaact 600 gttatcagag aagttactca aatcttcggt gaattcgacg tttctgaaat cgtttggttc 660 tgtaagaact tggacttgca aggtatcaga aagagatctg aagatatcag aagaagatac 720 gacgctttgt tggaaaagat catctctgac agagaaagat tgagattgag aggtggtggt 780 ggtggtggtg gtggtgaagt taaggacttc ttggacatgt tgttggacgt tatggaatct 840 gaaaagtctg aagttgaatt cactagagaa cacttgaagg ctttgatctt ggacttcttc 900 actgctggta ctgacactac tgctatcact actgaatggg ctatcgctga attgatctct 960 aacccaaacg ttttgaagaa ggctcaagaa gaaatggaca aggttatcgg ttctcaaaga 1020 ttgttgcaag aatctgacgc tccaaacttg ccatacttga acgctatcat caaggaaact 1080 ttcagattgc acccaccaat cccaatgttg actagaaagt ctatctctga cgttgttgtt 1140 aacggttaca ctatcccagc taagactttg ttgttcgtta acttgtggtc tatgggtaga 1200 aacccaaact actgggaaaa cccaatggaa ttcagaccag aaagattctt ggaaaagggt 1260 actggttcta tcgacgttaa gggtcaacac ttcgaattgt tgccattcgg tactggtaga 1320 agaggttgtc caggtatgtt gttgggtatg caagaattgt tctctatcat cggtgctatg 1380 gttcaatgtt tcgactggaa gttgccagac ggtgttaagt ctgttgacat gactgaaaga 1440 ccaggtttga ctgctccaag agctaacgac ttggtttgtc aattggttcc aagaatcgac 1500 ccagttgttg tttctggtcc ataa 1524 <210> 159 <211> 511 <212> PRT <213> Erythranthe lewisii <400> 159 Met Ser Asn Gln Thr Met Asp Leu Pro Glu Ile Cys Leu Tyr Ala Val 1 5 10 15 Ile Leu Phe Val Ser Thr Leu Leu Ile Leu Gly Ile Tyr Lys Arg Lys 20 25 30 Arg Ser His Ile Pro Ser Pro Pro Gly Pro Phe Ala Leu Pro Val Ile 35 40 45 Gly His Leu His Leu Leu Gly Pro Arg Ile His His Thr Phe His Asp 50 55 60 Leu Ser Gln Arg Tyr Gly Pro Leu Phe Gln Leu Ser Leu Gly Ser Val 65 70 75 80 Arg Cys Val Val Val Ser Thr Pro Glu Leu Ala Arg Glu Phe Leu Lys 85 90 95 Thr His Glu Leu Val Phe Ser Ser Arg Lys His Thr Thr Ala Ile Asp 100 105 110 Ile Val Thr Tyr Glu Ser Ser Phe Ala Phe Ser Pro Tyr Gly Pro Tyr 115 120 125 Trp Lys Tyr Ile Lys Lys Leu Cys Thr Tyr Glu Leu Leu Gly Ala Arg 130 135 140 Asn Leu Ala Asn Phe Glu Pro Val Arg Asn Val Glu Ile Lys Asp Phe 145 150 155 160 Leu Lys Val Met Ser Asn Lys Ala Asn Thr Gly Glu Ile Val Asn Val 165 170 175 Thr Glu Glu Leu Val Lys Leu Thr Ser Asn Val Ile Ser His Met Met 180 185 190 Leu Gly Ile Arg Cys Ser Gly Thr Glu Gly Glu Ala Glu Ala Ala Arg 195 200 205 Asn Val Ile Arg Asp Val Thr Gln Ile Phe Gly Glu Phe Asp Val Ser 210 215 220 Asp Ile Ile Trp Phe Cys Lys Asn Phe Asp Leu Gln Gly Ile Arg Arg 225 230 235 240 Arg Ser Glu Asp Ile Gln Lys Arg Tyr Asp Gly Leu Leu Glu Lys Ile 245 250 255 Ile Thr Asp Arg Glu Lys Thr Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Val Lys 260 265 270 Asp Phe Leu Asp Met Leu Leu Asp Val Met Asp Ser Lys Asn Ser Asp 275 280 285 Val Lys Phe Thr Arg Glu His Leu Lys Ala Leu Ile Leu Asp Phe Phe 290 295 300 Thr Ala Gly Thr Asp Thr Thr Ala Ile Ala Val Glu Trp Ser Ile Ala 305 310 315 320 Glu Leu Leu Arg Asn Pro Lys Val Ile Lys Lys Ala Gln Gln Glu Ile 325 330 335 Asp Asn Val Val Gly Ser Gln Arg Leu Leu Gln Glu Ser Asp Ala Pro 340 345 350 Lys Leu Pro Tyr Ile Met Ala Ile Ile Lys Glu Thr Phe Arg Leu His 355 360 365 Pro Pro Ile Pro Met Ile Ser Arg Lys Ser Val Ser Asp Cys Ala Ile 370 375 380 Asn Gly Cys Met Ile Arg Ala Asn Thr Leu Leu Phe Val Asn Ile Trp 385 390 395 400 Ser Ile Gly Arg Asn Pro Met Tyr Trp Glu Arg Pro Met Glu Phe Arg 405 410 415 Pro Glu Arg Phe Leu Asp Pro Gly Cys Gly Ser Ile Asp Val Lys Gly 420 425 430 Gln Asn Phe Glu Leu Met Pro Phe Gly Thr Gly Arg Arg Gly Cys Pro 435 440 445 Gly Met Leu Leu Ala Met Gln Glu Leu Val Ala Ile Ile Gly Ala Met 450 455 460 Val Gln Cys Phe Glu Trp Gln Leu Pro Asp Asp Ser Gln Asp Val Asp 465 470 475 480 Met Thr Glu Arg Pro Gly Leu Thr Ala Pro Arg Ala Asn Asp Leu Phe 485 490 495 Cys Arg Val Val Pro Arg Val Asp Val Ala Val Val Ser Gly Asn 500 505 510 <210> 160 <211> 1536 <212> DNA <213> artificial <220> <223> coding sequence for SEQ ID NO: 159 <400> 160 atgtccaacc aaactatgga cttgccagaa atctgtttgt acgctgttat cttgttcgtt 60 tctactttgt tgatcttggg tatctacaag agaaagagat ctcacatccc atctccacca 120 ggtccattcg ctttgccagt tatcggtcac ttgcacttgt tgggtccaag aatccaccac 180 actttccacg acttgtctca aagatacggt ccattgttcc aattgtcttt gggttctgtt 240 agatgtgttg ttgtttctac tccagaattg gctagagaat tcttgaaaac tcacgaattg 300 gttttctctt ctagaaagca cactactgct atcgacatcg ttacttacga atcttctttc 360 gctttctctc catacggtcc atactggaag tacatcaaga agttgtgtac ttacgaattg 420 ttgggtgcta gaaacttggc taacttcgaa ccagttagaa acgttgaaat caaggacttc 480 ttgaaggtta tgtctaacaa ggctaacact ggtgaaatcg ttaacgttac tgaagaattg 540 gttaagttga cttctaacgt tatctctcac atgatgttgg gtatcagatg ttctggtact 600 gaaggtgaag ctgaagctgc tagaaacgtt atcagagatg ttactcaaat cttcggtgaa 660 ttcgacgttt ctgacatcat ctggttctgt aagaacttcg acttgcaagg tatcagaaga 720 agatctgaag atatccaaaa gagatacgac ggtttgttgg aaaagatcat cactgacaga 780 gaaaagacta gaggtggtgg tggtggtggt gttaaggact tcttggacat gttgttggac 840 gttatggact ctaagaactc tgacgttaag ttcactagag aacacttgaa ggctttgatc 900 ttggacttct tcactgctgg tactgacact actgctatcg ctgttgaatg gtctatcgct 960 gaattgttga gaaacccaaa ggttatcaag aaggctcaac aagaaatcga caacgttgtt 1020 ggttctcaaa gattgttgca agaatctgac gctccaaagt tgccatacat catggctatc 1080 atcaaggaaa ctttcagatt gcacccacca atcccaatga tctctagaaa gtctgtttct 1140 gactgtgcta tcaacggttg tatgatcaga gctaacactt tgttgttcgt taacatctgg 1200 tctatcggta gaaacccaat gtactgggaa agaccaatgg aattcagacc agaaagattc 1260 ttggacccag gttgtggttc tatcgacgtt aagggtcaaa acttcgaatt gatgccattc 1320 ggtactggta gaagaggttg tccaggtatg ttgttggcta tgcaagaatt ggttgctatc 1380 atcggtgcta tggttcaatg tttcgaatgg caattgccag acgactctca agacgttgac 1440 atgactgaaa gaccaggttt gactgctcca agagctaacg acttgttctg tagagttgtt 1500 ccaagagttg acgttgctgt tgtttctggt aactaa 1536

Claims (32)

  1. - 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴의 7 위치에서 글루코스를 가할 수 있는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제(UGT)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 람노스를 헤스페레틴-7-O-글루코시드 및/또는 디오스메틴-7-O-글루코시드의 글루코스의 6 위치 내로 전달할 수 있는 6"-O-람노실트랜스퍼라제(RhaT)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - UDP-람노스를 생산할 수 있는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제(RHM)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함하는 재조합 미생물.
  2. 제1항에 있어서,
    플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제가 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis)로부터, 시트러스 클레멘티나(Citrus clementina)로부터, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터, 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis)로부터 또는 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터, 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 스쿠텔라리아 바이칼렌시스로부터의 효소인, 재조합 미생물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제가 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95, 97, 99 및 101로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되는, 바람직하게는 서열 번호: 113, 115, 91, 93, 95 및 97로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되는, 재조합 미생물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제가 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되는, 바람직하게는 서열 번호: 113으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되는, 재조합 미생물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    6"-O-람노실트랜스퍼라제가 시트러스 속(genus Citrus) 또는 페투니아 하이브리다(Petunia hybrida), 바람직하게는 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis), 시트러스 막시마(Citrus maxima) 또는 시트러스 클레멘티나(Citrus clementina), 보다 바람직하게는 시트러스 시넨시스 또는 시트러스 클레멘티나의 효소인, 재조합 미생물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    6"-O-람노실트랜스퍼라제가 서열 번호: 103 및 105로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고; 바람직하게는, 6"-O-람노실트랜스퍼라제가 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되는, 재조합 미생물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제가 시트러스 시넨시스 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래되는, 재조합 미생물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제가 서열 번호: 107, 109 및 111로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고; 바람직하게는, UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제가 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된, 재조합 미생물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제가 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호: 113으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고;
    - 6"-O-람노실트랜스퍼라제가 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택되고;
    - UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제가 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드로부터 선택된, 재조합 미생물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이,
    - 타이로신 암모니아 리아제(TAL)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 4-쿠마린-CoA 리가제(4CL)를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 나린게닌-찰콘 신타제(CHS)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 찰콘 이소머라제(CHI)를 암호화하는 이종 핵산 서열;을 또한 포함하는, 재조합 미생물.
  11. 제10항에 있어서,
    - 로도토룰라 글루티니스(Rhodotorula glutinis) 또는 플라보박테리움 존소니아에(Flavobacterium johnsoniae)로부터의 타이로신 암모니아 리아제(TAL)를, 특히 서열 번호: 41 및 39로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를; 바람직하게는 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 TAL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 이종 핵산 서열;
    - 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 시트러스 클레멘티나(Citrus clementina), 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum) 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)로부터의 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL)를; 바람직하게는 서열 번호: 123, 125, 43, 45, 47 및 49로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를; 특히 서열 번호: 123, 125 및 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를, 및 바람직하게는 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4CL 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는, 이종 핵산 서열;
    - 시트러스 시넨시스, 호르데눔 불가레(Hordeum vulgare) 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)로부터의 찰콘 신타제(CHS)를, 특히 서열 번호: 53, 51, 55 및 57로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를, 바람직하게는 서열 번호: 53으로부터 선택된 서열을 포함하는 CHS 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 또는 스트렙토마이세스 클라부리게루스로부터의 찰콘 이소머라제(CHI)를, 특히 서열 번호: 61 및 59로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를, 바람직하게는 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 CHI 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    - 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 타이로신 암모니아 리아제(TAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호: 123, 125 및 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호: 53으로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 신타제(CHS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 이소머라제(CHI) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 타이로신 암모니아 리아제(TAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호: 45로부터 선택된 서열을 포함하는 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 서열 번호: 53으로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 신타제(CHS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 이소머라제(CHI) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 또한 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  15. 제14항에 있어서,
    미생물이 칼리스테푸스 키넨시스(Callistephus chinensis), 페릴라 프루테스센스 바르. 크리스파(Perilla frutescens var. crispa), 페투니아 엑스 하이브리다(Petunia x hybrida), 게르베라 하이브리다(Gerbera hybrida), 시트러스 시넨시스(Citrus sinensis), 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana), 시트러스 클레멘티나, 오스테오스페르뭄 하이브리드 쿨티바르(Osteospermum hybrid cultivar), 파네로차에테 크리소스포리움(Phanerochaete chrysosporium), 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) 또는 피로셀라 오피시나룸(Pilosella officinarum)으로부터의 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H), 바람직하게는 서열 번호: 7, 1, 3, 5, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7, 11, 17 및 121을 갖는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드로부터 선택되는 효소를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    미생물이 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열을 포함하는 F3'H 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    O-메틸트랜스퍼라제(OMT)를 암호화하는 이종 핵산 서열을 또한 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  18. 제17항에 있어서,
    미생물이 시트러스, 특히 시트러스 클레멘티나 또는 시트러스 시넨시스로부터, 호모 사피엔스(Homo sapiens)로부터 또는 아라비돕시스 탈리아나로부터의 O-메틸-트랜스퍼라제(OMT), 바람직하게는 서열 번호: 119, 117, 87 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    서열 번호: 119, 117 및 89로부터 선택된 서열을 포함하는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 119 및 117로부터 선택된 서열 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL)를, 특히 서열 번호: 63, 65 및 77, 바람직하게는 서열 번호: 65 및 77로부터 선택된 서열을 포함하는 PAL, 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를, 및 보다 특히 바람직하게는 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H)를, 특히 서열 번호: 67, 69 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는 C4H, 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 폴리펩타이드를, 및 가장 특히 바람직하게는 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 또한 포함하는, 재조합 미생물.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라본 신타제(FNS)를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열을 또한 포함하는, 재조합 미생물.
  22. 제21항에 있어서,
    아라비돕시스 탈리아나, 로니세라 자포니카(Lonicera japonica), 로니세라 마크란토이데스(Lonicera macranthoides), 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula), 오리자 사티바(Oryza sativa), 페트로셀리눔 크리스품(Petroselinum crispum), 포풀루스 델토이데스(Populus deltoides), 제아 마이스(Zea mays), 칼리스테푸스 키넨시스(Callistephus chinensis), 아피움 그라베올렌스(Apium graveolens), 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula), 쿠미눔 시미눔(Cuminum cyminum), 아에투사 시나피움(Aethusa cynapium), 안젤리카 아르칸젤리카(Angelica archangelica), 코니움 마쿨라툼(Conium maculatum), 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis), 시나라 카르둔쿨루스 바르 시콜리무스(Cynara cardunculus var scolymus), 사우쑤레아 메두사(Saussurea medusa), 플렉트란투스 바르바투스(Plectranthus barbatus), 스쿠텔라리아 바이칼렌시스(Scutellaria baicalensis), 도르코세라스 하이그로메트리쿰(Dorcoceras hygrometricum), 안티리눔 마주스(Antirrhinum majus), 페릴라 프루테스센스 바르 크리스파(Perilla frutescens var crispa), 다흘리아 핀나타(Dahlia pinnata) 또는 에리트란테 레위시이(Erythranthe lewisii), 바람직하게는 로니세라 자포니카, 로니세라 마크란토이데스 및 페트로셀리눔 크리스품으로부터의 플라본 신타제(FNS)를, 바람직하게는 서열 번호: 33, 35, 37, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157 및 159로부터 선택된 서열을 포함하는 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를, 바람직하게는 서열 번호: 33, 35 및 37로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 FNS 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를, 바람직하게는 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 시토크롬 P450 리덕타제(CPR)를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및/또는
    - S-아데노실메티오닌 신테타제(SAMT)를 암호화하는 이종 또는 내인성 핵산 서열;을 또한 포함하는, 재조합 미생물.
  24. 제23항에 있어서,
    미생물이 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)로부터, 또는 식물, 예를 들면, 카타란투스 로세우스(Catharanthus roseus) 또는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)로부터의 시토크롬 P450 리덕타제(CPR)를; 바람직하게는, 서열 번호: 25, 23, 27, 29 및 31로부터 선택된 서열을 포함하는 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를, 바람직하게는 서열 번호: 23, 25 및 29로부터 선택된 서열을 포함하는 효소로부터의 CPR 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를, 및 특히 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 효소 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이:
    - 서열 번호: 65로부터 선택된 서열을 포함하는 페닐알라닌 암모니아 리아제(PAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 페닐알라닌 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 서열 번호: 79로부터 선택된 서열을 포함하는 신나메이트 4-하이드록실라제(C4H) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 신나메이트 4-하이드록실라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 서열 번호: 41로부터 선택된 서열을 포함하는 타이로신 암모니아 리아제(TAL) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 타이로신 암모니아 리아제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 서열 번호: 45 또는 123으로부터 선택된 서열을 포함하는 4-쿠마로일-CoA 리가제(4CL) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 4-쿠마레이트-CoA 리가제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 서열 번호: 53으로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 신타제(CHS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 서열 번호: 61로부터 선택된 서열을 포함하는 찰콘 이소머라제(CHI) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 찰콘 이소머라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 서열 번호: 7, 17 및 121로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보노이드 3'-모노옥시게나제(F3'H) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 7로부터 선택된 서열 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보노이드 3'-모노옥시게나제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;
    - 서열 번호: 37로부터 선택된 서열을 포함하는 플라본 신타제(FNS) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라본 신타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호: 25로부터 선택된 서열을 포함하는 시토크롬 P450 리덕타제(CPR) 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 시토크롬 P450 리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호 117 및 119로부터 선택된 서열을 포함하는 O-메틸트랜스퍼라제(OMT) 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 117로부터 선택된 서열을 포함하는 OMT 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 동일성을 갖고 O-메틸트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호: 113 및 95로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 및 이러한 서열 중 하나와 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 서열 번호: 113으로부터 선택된 서열을 포함하는 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 플라보논 7-O-베타-D-글루코실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호: 103으로부터 선택된 서열을 포함하는 6"-O-람노실트랜스퍼라제 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 6"-O-람노실트랜스퍼라제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열; 및
    - 서열 번호: 107로부터 선택된 서열을 포함하는 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 및 이러한 서열과 적어도 60, 70, 80, 85, 90 또는 95% 서열 동일성을 갖고 UDP-글루코스 4,6-데하이드라타제/UDP-4-케토-6-데옥시-D-글루코스 3,5-에피머라제/UDP-4-케토-L-람노스-리덕타제 활성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 이종 핵산 서열;을 포함함을 특징으로 하는, 재조합 미생물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물이 효모 또는 세균, 바람직하게는 사카로마이세스 속의 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지아에, 또는 세균, 예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 재조합 미생물.
  27. 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생산을 위한, 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물의 용도.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 재조합 미생물을 배양하는 단계 및 디오스민 및/또는 헤스페리딘을 수거(harvesting)하는 단계를 포함하는, 디오스민 및/또는 헤스페리딘의 생산 방법.
  29. 헤스페리딘의 생산을 위한, 제27항에 따른 용도 또는 제28항에 따른 방법.
  30. 디오스민의 생산을 위한 제27항에 따른 용도 또는 제28항에 따른 방법.
  31. 헤스페리딘 및 디오스민의 생산을 위한, 제27항에 따른 용도 또는 제28항에 따른 방법.
  32. 나린게닌, 아피게닌, 에리오딕티올, 루테올린, 헤스페레틴 및/또는 디오스메틴이 배양 배지에 보충되지 않음을 특징으로 하는, 제27항, 제29항, 제30항 및 제31항 중 어느 한 항에 따른 용도 또는 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 방법.
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