KR20210121408A - 아스퍼질러스 나이거 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법 - Google Patents

아스퍼질러스 나이거 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.

Description

아스퍼질러스 나이거 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법{COMPOSITION AND METHOD FOR PRODUCING GINSENOSIDE COMPOUND K USING ENZYME LIQUID OF ASPERGILLUS NIGER}
본 발명은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.
인삼은 전통적으로 한방약에서 강심제나 이뇨제로 사용되어왔고, 그 중 인삼 내에 존재하는 사포닌을 일컫는 진세노사이드는 인삼의 여러 가지 유효성분 중에서 약리 작용을 하는 물질로 알려져 있다.
그 중 진세노사이드 컴파운드 케이는 인삼 내에 다량으로 존재하는 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd로부터 글루코스, 아라비노스와 같은 당이 가수분해되어 체내에서 훨씬 흡수가 잘되는 형태가 되고, 항암, 항염증, 항알러지, 면역증강, UV에 의한 피부손상 회복 및 피부 노화 방지, 주름억제 등의 많은 효능에 대한 실험이 여러 논문으로 나타나있다.
현재까지 진세노사이드 컴파운드 케이의 고효율 생산기술로는 칼디셀룰로시럽터 베시(Caldicellulosiruptor bescii) 유래 재조합 유전자를 대장균에 삽입시켜 얻은 효소로 고효율의 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산할 수 있는 생산 방법이 알려져 있으나, 유전자 조작으로 얻은 효소로 반응하여 생산하는 방법이기 때문에 식품에 이용하기에는 한계가 있고, 장내 세균과 같은 유산균을 이용하여 여러 진세노사이드가 함유되어 있는 복합체를 기질로 하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산하는 경우 전환율이 낮은 문제점이 있기에, 식품에 이용할 수 있고 유산균보다 높은 수율로 진세노사이드 컴파운드 케이를 생산하는 곰팡이 효소를 사용하였다.
기존 곰팡이 효소를 이용한 방법으로는 트리코데르마 또는 페니실리움속에서 분리한 셀룰라제 또는 아스퍼질러스속에서 분리한 베타-갈락토시다제를 이용하여 프로토파낙사다이올(protopanaxadiol, PPD)계 사포닌이 주로 함유된 인삼근에서 분리한 조사포닌 분획과 인삼 추출엑스를 기질로 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하는 방법들이 보고 되어왔으나, 수율에 있어 한계가 있고 특히 기존 보고에 따르면 진세노사이드 Rb2를 기질로 하였을 때 생성되는 컴파운드 와이(compound Y)에서 오랜시간 반응을 진행하여야 컴파운드 케이로 전환할 수 있다는 단점이 있었다.
본 발명은 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조하기 위한 것으로, (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주(KACC 46495)일 수 있다.
상기 (a) 단계에서 발현 배지 내 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)의 농도는 3 g/L 내지 20 g/L일 수 있다.
상기 (a) 단계에서 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 발현 배지는 KH2PO4, MgSO4 .7H2O, CaCl2, FeSO4 .7H2O, ZnSO4 .7H2O, MnSO4 . H2O 및 CoCl2 .6H2O 를 추가로 포함할 수 있다.
상기 (a) 단계에서 효소액은 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 세포 외 효소액일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌; 또는 인삼 추출물을 포함할 수 있다.
상기 (b) 단계에서 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 처리는 pH 4.0~6.5 및 40~65℃ 조건에서 2 시간 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물을 제공한다.
상기 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는바, 비용이 저렴한 탄소원을 이용하되, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 가수분해를 통해 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.
특히, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 식품에 이용가능한 안전한 곰팡이인바, 상기와 같은 방법으로 제조된 진세노사이드 컴파운드 케이는 식품용으로 유용하게 활용될 수 있는 이점을 가진다.
도 1(a)~(c)는 발현 배지의 탄소원을 다양하게 하여 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서, (a) 진세노사이드 Rb1, (b) 진세노사이드 Rb2 및 (c) 진세노사이드 Rc 에 각각 처리한 경우, 그 상대적인 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 발현 배지의 탄소원 농도를 다양하게 하여 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서, 진세노사이드 Rb2에 처리한 경우, 그 상대적인 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 3(a) 및 (b)는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 (a) 온도, (b) pH의 변화에 따른 상대적인 활성도 및 안정성을 나타낸 그래프로서, 이때, 상대적인 활성도는 진세노사이드 Rb1이 감소되는 정도에 따라 나타내었다.
도 4(a)~(c)는 최적화된 발현 배지를 통해 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서, 기질로서, (a) 진세노사이드 Rb1, (b) 진세노사이드 Rb2 및 (c) 진세노사이드 Rc 에 각각 처리한 경우, 그 전환 정도를 시간별로 나타낸 그래프이다.
도 5는 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2 및 진세노사이드 Rc가 어떠한 중간 물질을 거쳐 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환되는지를 보여주는 그림이다.
도 6(a)는 최적화된 발현 배지를 통해 세포 외 효소액을 배양한 다음, 기질로서, 기질로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 혼합물을 포함하는 고려 인삼 뿌리 추출물에 처리한 경우, 그 전환 정도를 시간별로 나타낸 그래프이고, 도 6(b)는 반응 전후의 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC) 측정 결과를 나타낸 그림이다.
본 발명자들은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함에 있어서, 이의 생산성 및 수율을 높이기 위한 방법을 연구하던 중, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액으로, 탄소원이 최적화된 발현 배지를 통해 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 배양하고, 이의 세포 외 효소액의 우수한 활성도를 확인한 다음, 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 기질에 처리하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 명세서 내 "진세노사이드 컴파운드 케이(C-K)"라 함은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 의미하는 것으로, 종래부터 다양한 생리 활성이 보고된 바 있다:
[화학식 1]
Figure pat00001
진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법
본 발명은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder) 를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법을 제공한다.
먼저, 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.
상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 식품에 이용가능한 상업용 곰팡이로서, 자낭균류 누룩곰팡이속에 속한다. 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주(KACC 46495)인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명자들은 농촌진흥청 국립농원과학원(KACC)으로부터 약 50종의 식품에 이용가능한 균주인 아스퍼질러스 오라이제(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 투빈젠시스(Aspergillus tubingensis), 페니실리움 크라이소제눔(Penicillium chrysogenum)등을 분양받았다. 이러한 곰팡이 균주를 배양하여 얻은 세포 외 효소 반응물과 진세노사이드 Rb1, Rb2 또는 Rc를 반응시킨 결과, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) KACC 46495 균주가 가장 활성이 우수한 균주로 나타나 위 균주를 선택하였다.
상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주로부터 배양액을 수득하기 위해서는, 상기 균주를 평판배양하여 포자를 수득하는 단계; 상기 포자를 성장 배지에서 배양하여 균사를 활성화시키는 단계; 및 상기 성장 배지를 제거한 후, 상기 활성화된 균사를 발현 배지로 옮겨 배양하여 배양액을 수득하는 단계를 포함한다.
추가적으로, 상기 배양액으로부터 세포 외 효소액을 수득하기 위해서는, 상기 배양액을 여과하는 단계; 상기 여과액을 회수하여 황산암모늄을 첨가 및 혼합하여 효소 침전액을 수득하는 단계; 상기 효소 침전액을 투석막에 넣어 투석하는 단계; 및 센트리콘을 이용하여 남은 염을 추가 제거 및 농축하는 단계를 포함한다.
즉, 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액은 발현 배지를 통해 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 배양함으로써 수득될 수 있는데, 본 발명에서는 상기 발현 배지를 최적화시킨 것을 특징으로 한다.
상기 발현 배지는 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 것을 특징으로 하고, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)를 포함하는 것이 바람직한바, 진세노사이드 Rb1, Rb2 또는 Rc를 진세노사이드 컴파운드 케이로 효과적으로 전환할 수 있다.
이때, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)는 셀룰로스의 수산기를 카복시메틸화시킨 것으로, 화학적으로 대단히 안정하고 특히 인체에 무해, 무독하여 식품산업 및 화장품산업에 등에 이용하기에 적합한 합성물로써 여러 산업분야에서 다양하고 폭넓게 사용되고 있다.
또한, 인삼 파우더(ginseng powder)는 Panax ginseng 유래인 것으로, HP-20로 정제된 Panax ginseng 추출물 파우더일 수 있고, 상기 인삼 파우더(ginseng powder)는 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd를 포함하는 프로토파낙사다이올계 사포닌을 총 120 mg/g 내지 140 mg/g의 농도로, 진세노사이드 Rg1, Rh1, Re, Rg2, Rf1 및 F1을 포함하는 프로토파낙사트리올계 사포닌을 총 40 mg/g 내지 60 mg/g의 농도로 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에서 사용한 Panax ginseng(4년근) 유래 인삼 파우더(ginseng powder)의 세부 함량 및 농도는 하기 표 1과 같다.
진세노사이드 인삼 파우더(ginseng powder)
함량((w/w)%) 농도(mg/g)
프로토파낙사다이올계 사포닌 Rb1 21.4 38.0
Rb2 18.8 33.4
Rc 17.5 31.1
Rd 14.3 25.4
프로토파낙사트리올계 사포닌 Rg1 2.6 4.6
Rh1 0.0 0.0
Re 9.7 17.3
Rg2 1.3 2.3
Rf1 0.6 1.2
F1 13.6 24.2
총 100.0 177.5
상기 발현 배지 내 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)의 농도는 3 g/L 내지 20 g/L일 수 있고, 10 g/L 내지 15 g/L인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
반면, 탄소원으로서, 셀룰로오스 (cellulose), 락토오스(lactose, 젖당) 또는 감귤류에서 추출한 펙틴(pectin from citrus)를 사용한 경우에는 진세노사이드 Rb1, Rb2 또는 Rc를 효과적으로 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환하지 못한다.
또한, 상기 발현 배지는 질소원으로는 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 마찬가지로, 진세노사이드 Rb1, Rb2 또는 Rc를 진세노사이드 컴파운드 케이로 효과적으로 전환할 수 있다. 이때, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)은 옥수수 전분을 제좌는 과정 중 침지 공정에서 배출되는 부산물로서, 비용이 저렴한 이점을 가질 뿐 만 아니라, 가용성 단백, 젖산, 당류, 비타민, 무기물 등을 함유하고 있어 영양가가 아주 높아 사료에 첨가하거나 미생물 배지의 질소원으로 적합하다.
상기 발현 배지 내 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)의 농도는 5 g/L 내지 20 g/L일 수 있고, 10 g/L 내지 15 g/L인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
그밖에, 상기 발현 배지는 KH2PO4, MgSO47H2O, CaCl2, FeSO4·7H2O, ZnSO4·7H2O, MnSO4·H2O 및 CoCl2·6H2O 를 추가로 포함할 수 있는데, 구체적으로, KH2PO4 1~3 g/L, MgSO47H2O 0.1~1.0 g/L, CaCl2 0.1~1.0 g/L, FeSO4.7H2O 1.0~10.0 mg/L, ZnSO4.7H2O 0.5~5.0 mg/L, MnSO4·H2O 0.5~5.0 mg/L 및 CoCl2·6H2O 1.0~10.0 mg/L 를 추가로 포함할 수 있다.
한편, 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액은 전술한 바와 같이, 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 세포 외 효소액일 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.
상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 기질은 고려 인삼 추출물일 수 있고, 상기 고려 인삼 추출물은 인삼의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.
상기 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml일 수 있고, 0.4 mg/ml 내지 7.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 처리는 pH 4.0~6.5 및 40~65℃ 조건에서 2 시간 내지 24 시간 동안 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 처리를 위한 pH 조건은 pH 4.5~5.0인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, pH가 5.0을 초과하는 경우, 세포 외 효소액의 안정성이 크게 저하되는 양상을 보일 수 있다. 따라서, 이러한 pH 조건을 유지하기 위해서 반응용매로 완충용액을 사용할 수 있다. 또한, 상기 처리를 위한 온도 조건은 55~60℃인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 온도가 50℃인 경우, 상대적 활성이 약 60% 이하로 감소할 수 있고, 온도가 65℃인 경우, 세포 외 효소액의 안정성이 크게 저하되는 양상을 보일 수 있다. 즉, 이러한 pH 및 온도 조건을 유지함으로써, 세포 외 효소액의 활성도가 높으면서도, 오랜 시간 반응에도 세포 외 효소액의 안정성을 유지할 수 있다. 따라서, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 가수분해를 통해 최종적으로 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.
한편, 상기 처리를 통한 경우, 진세노사이드 컴파운드 케이(compound K) 외에, 부산물로서 진세노사이드 컴파운드 와이(compound Y) 또는 진세노사이드 에프투(F2)를 제조할 수 있다.
진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물
본 발명은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는데, 상기 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함할 수 있다.
상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주, 상기 발현 배지 및 상기 효소액에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.
상기 조성물 내 효소액의 농도는 0.5 mg/ml 내지 10.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 기질에 처리하기 위한 것일 수 있다.
상기 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌을 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 상기 기질은 고려 인삼 추출물일 수 있고, 상기 고려 인삼 추출물은 인삼의 뿌리, 열매, 줄기 또는 잎을 용매 추출한 것일 수 있다. 이때, 용매 추출은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 수행될 수 있고, 상기 저급 알코올은 에탄올 또는 메탄올일 수 있다.
상기 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml일 수 있고, 0.4 mg/ml 내지 7.0 mg/ml인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는바, 비용이 저렴한 탄소원을 이용하되, 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 최적 가수분해를 통해 진세노사이드 컴파운드 케이를 높은 생산성 및 수율로 제조할 수 있다.
특히, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 식품에 이용가능한 안전한 곰팡이인바, 상기와 같은 방법으로 제조된 진세노사이드 컴파운드 케이는 식품용으로 유용하게 활용될 수 있는 이점을 가진다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 발현 배지 내 탄소원 및 이의 농도에 따른 진세노사이드 컴파운드 케이로의 전환 비교
본 발명에서는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 효소액을 이용하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조함에 있어서, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 발현 배지를 최적화하였다.
구체적으로, 농촌진흥청 국립농원과학원(KACC)으로부터 분양받은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주(KACC 46495)를 감자한천배지(Potato dextrose agar medium, PDA)에서 26℃에서 7일간 평판배양하였다. 평판배양된 접시(plate)내의 포자를 거즈에 걸러 회수하고 4 ㎖의 액상 감자배지(Potato dextrose medium, PDB)에 포자 농도가 1.0 X 106 spores/mL 농도로 희석한 포자액을 1 ㎖ 접종하고, 26℃ 및 150 rpm으로 24시간 동안 성장배양하였다. 성장배양으로 만들어진 성장배양액 내의 균사를 탄소원 및 질소원이 제외된 발현 배지로 세척하여 균사만 100㎖의 발현 배지에 옮긴 후, 26℃ 및 150 rpm으로 6일간 배양하였다.
이때, 발현 배지의 조성은 탄소원 20 g/L, 질소원 10 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO47H2O 0.3 g/L, CaCl2 0.3 g/L, FeSO4.7H2O 5.0 mg/L, ZnSO4.7H2O 1.4 mg/L, MnSO4·H2O 1.3 mg/L 및 CoCl2·6H2O 3.7 mg/L 이다. 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스 (carboxymethyl cellulose)(시그마 알드리치 사), 셀룰로오스 (cellulose)(대정화금㈜), Panax ginseng(4년근) 유래 인삼 파우더(ginseng powder)(중국 에이스셈 바이올로지 사), 락토오스(lactose)(대정화금㈜), 감귤류에서 추출한 펙틴(pectin from citrus)(대정화금㈜) 및 밀기울(wheat bran)(심즈펫)로 총 6가지를 사용하였고, 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)(시그마 알드리치 사)를 사용하였다.
그 다음, 배양액을 와트만 여과지를 사용하여 여과한 후, 여과액을 회수하여 황산암모늄을 30 ~ 80% 포화가 되도록 첨가하고 24시간 동안 혼합하여 효소 침전액을 수득하였다. 효소 침전액 내의 황산암모늄을 제거하기 위해 셀룰로오스 투석막을 이용하여 200 mM의 맥킬바인(Mcilvaine) 완충용액으로 24 시간 동안 투석하고, 센트리콘을 이용하여 남은 황산암모늄 추가 제거 및 농축을 진행하여 세포 외 효소액을 수득하였다.
그 다음, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 기질로서, 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc 0.4 mg/ml가 각각 함유된 완충용액을 50℃ 및 pH 5.5에서 6 시간 동안 반응시켜, 세포 외 효소액의 활성도를 측정하였다.
그 결과, 도 1(a) 내지 도 1(c)에 나타난 바와 같이, 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder) (특히, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose))를 사용하면서, 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 사용한 경우, 세포 외 효소액의 활성도가 높은 것으로 확인된다. 다만, 탄소원으로서, 셀룰로오스 (cellulose), 락토오스(lactose), 감귤류에서 추출한 펙틴(pectin from citrus) 및 밀기울(wheat bran)을 사용한 경우에는, 세포외 효소액의 활성도가 크게 저하되는 것으로 확인된다.
한편, 기질로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 중 가장 전환이 잘 되지 않았던 진세노사이드 Rb2를 이용하여, 발현 배지 내 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)의 최적 농도를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 발현 배지 내 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose)가 10 g/L 내지 15 g/L (특히, 10 g/L)인 경우, 세포 외 효소액의 활성도가 크게 높은 것으로 확인된다.
따라서, 최적화된 발현 배지의 조성은 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 10 g/L, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid) 10 g/L, KH2PO4 2 g/L, MgSO47H2O 0.3 g/L, CaCl2 0.3 g/L, FeSO4.7H2O 5.0 mg/L, ZnSO4.7H2O 1.4 mg/L, MnSO4·H2O 1.3 mg/L 및 CoCl2·6H2O 3.7 mg/L 이다.
실시예 2: 세포 외 효소액의 온도 및 pH 변화에 따른 활성도 및 안정성 확인
본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액의 온도 및 pH 변화에 따른 활성도 및 안정성을 확인하였다.
(1) 세포 외 효소액에 대한 온도 효과 확인
세포 외 효소액에 대한 온도 효과를 확인하기 위해서, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 0.4 mg/mL 진세노사이드 Rb1이 함유된 완충용액(pH 5.5)을 40℃ 내지 65℃의 범위에서 10분 동안 반응시켰다. 반응액의 경우, 부탄올과 1.0 mg/mL의 내부 표준 물질(internal standard)인 다이고신을 같이 첨가하여 반응을 종결시키고 부탄올 층을 모아 진공압으로 용매를 증발 한 뒤, 메탄올을 넣어주어 측정 시료를 준비하였다. 측정 시료의 경우 HPLC (High performance liquid chromatography; 고성능 액체 크로마토그래피)를 이용하여 203nm의 흡광도에서 측정하였고, 각 진세노사이드 표준 물질을 측정하여 구한 표준 곡선에 따른 정량법으로 전환 정도를 확인하였다.
한편, 세포 외 효소액을 40℃ 내지 65℃의 범위에서 24시간 동안 방치한 후, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 0.4 mg/mL 진세노사이드 Rb1이 함유된 완충용액(pH 5.5)을 55℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그 다음, 이전에 언급한 것과 같은 방법으로 반응을 종결시키고 측정하여 세포 외 효소액의 온도에 따른 안정성(글리코시다아제 활성)를 확인하였다.
그 결과, 도 3(a)에 나타난 바와 같이, 세포 외 효소액의 활성도가 높은 온도는 55~65℃(특히, 55℃)인 것으로 확인되나, 세포 외 효소액의 안정성이 60℃를 초과하는 경우, 60℃ 이하인 경우에 비해, 세포 외 효소액의 안정성이 크게 저하되는 문제점이 있는 것으로 확인된다. 따라서, 세포 외 효소액의 활성도가 높으면서도, 오랜 시간 반응에도 세포 외 효소액의 안정성을 유지하는 온도인 55~60℃가 최적 온도인 것으로 확인된다.
(2) 세포 외 효소액에 대한 pH 효과 확인
세포 외 효소액에 대한 pH 효과를 확인하기 위하여, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 0.4 mg/mL 진세노사이드 Rb1이 함유된 완충용액을 55℃에서 pH 4.0 내지 6.5의 범위로 10분 동안 반응시킨 다음, 반응을 종결시키고 HPLC를 이용하여 203 nm의 흡광도에서 측정하였고, 세포 외 효소액의 활성도(글리코시다아제 활성)를 확인하였다.
한편, 세포 외 효소액을 pH 4.0 내지 6.5의 범위로 24시간 동안 방치한 후, 센트리콘을 이용하여 pH를 5.0으로 바꾼 다음, 세포 외 효소액 1.0 mg/ml 및 0.4 mg/mL 진세노사이드 Rb1이 함유된 완충용액(pH 5.0)을 55℃에서 10분 동안 반응시켰다. 그 다음, 반응을 종결시키고 HPLC를 이용하여 203 nm의 흡광도에서 측정하였고, 세포 외 효소액의 안정성(글리코시다아제 활성)를 확인하였다.
그 결과, 도 3(b)에 나타난 바와 같이, 세포 외 효소액의 활성도 및 안정성이 모두 높은 pH는 모두 4.5~5.0인 것으로 확인된다. pH가 5.0을 초과하는 경우, 세포 외 효소액의 활성도가 크게 저하되는 양상을 보였고, 오랜 시간 반응에 있어 세포 외 효소액의 안정성 역시 저하되는 양상을 보였다.
실시예 3: 세포 외 효소액을 이용한 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조
본 발명에서는 최적화된 발현 배지를 통해 배양된 세포 외 효소액을 이용하여 진세노사이드 컴파운드 케이를 제조하였다.
먼저, 세포 외 효소액 2.5 mg/ml를 기질로서, 진세노사이드 Rb1, Rb2 및 Rc 1.0 mg/ml이 함유된 시약을 55℃ 및 pH 5.0에서 2 시간 또는 24시간 동안 반응시켰다.
그 결과, 도 4(a) 및 (c)에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rb1 또는 Rc가 2 시간 만에 모두 진세노사이드 C-K로 완전히 전환되었고, 도 4(b)에 나타난 바와 같이, 진세노사이드 Rb2가 24 시간 만에 약 94 몰%의 수율로 진세노사이드 C-K 전환됨을 확인하였다. 이를 통해 도 5와 같은 전환 경로를 따라 각 프로토파낙사다이올계 사포닌이 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환될 수 있다는 것을 제시할 수 있었다.
한편, 세포 외 효소액 8.0 mg/ml를 기질로서, 프로토파낙사다이올계 사포닌 6.0 mg/ml을 포함하는 고려 인삼 뿌리 추출물에 처리함에 있어, 55℃ 및 pH 5.0에서 18 시간 동안 반응시켰다.
그 결과, 도 6(a)에 나타난 바와 같이, 반응 전에 존재하던 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd의 경우 반응 초기에 모두 중간 물질들로 전환되고, 6 시간 이후부터 전환 정도가 낮아지는 양상을 나타내고, 18 시간 초과 반응에서는 더 이상 진세노사이드 컴파운드 케이로의 전환을 나타내지 않았다. 특히, 9 시간 동안 반응 결과 생성된 진세노사이드 컴파운드 케이의 전환 수율은 80 몰%이었고, 그 양은 2.8 mg/mL(4.5 mM)이었으며, 그 생산성은 313.0 mg/L/h(502.4 μM/h)인 것으로 확인된다.
즉, 도 6(b)에 나타난 바와 같이, 프로토파낙사다이올계 사포닌인 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc 및 Rd가 세포 외 효소액에 의해 짧은 반응 시간 동안 높은 수율로 많은 진세노사이드 컴파운드 케이로 전환됨을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (11)

  1. (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양하여 효소액을 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득한 효소액을 기질에 처리하는 단계를 포함하는
    진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주(KACC 46495)인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 발현 배지 내 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)의 농도는 3 g/L 내지 20 g/L인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 발현 배지는 KH2PO4, MgSO4 .7H2O, CaCl2, FeSO4 .7H2O, ZnSO4 .7H2O, MnSO4 . H2O 및 CoCl2 .6H2O 를 추가로 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계에서 효소액은 상기 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주의 세포 외 효소액인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 기질은 진세노사이드 Rb1, 진세노사이드 Rb2, 진세노사이드 Rc 및 진세노사이드 Rd 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로토파낙사다이올계 사포닌; 또는 인삼 추출물을 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 기질 내 프로토파낙사다이올계 사포닌의 농도는 0.1 mg/ml 내지 10 mg/ml인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 처리는 pH 4.0~6.5 및 40~65℃ 조건에서 2 시간 내지 24 시간 동안 수행되는 것인, 진세노사이드 컴파운드 케이의 제조방법.
  10. 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 균주를 탄소원으로서, 카복시메틸 셀룰로오스(carboxymethyl cellulose) 또는 인삼 파우더(ginseng powder)를 포함하는 발현 배지에서 배양시킨 효소액을 포함하는 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 발현 배지는 질소원으로서, 옥수수 침지액 고형물(corn steep solid)을 포함하는, 진세노사이드 컴파운드 케이 제조용 조성물.
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