KR20210115279A - 신규한 트리테르펜 사포닌 유도체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벌개미취(Aster koraiensis Nakai, Korean starwort) 추출물로부터 분리 동정한 신규 트리테르펜 사포닌 유도체인 아스터사포닌 I 및 이의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

Description

신규한 트리테르펜 사포닌 유도체 및 이의 용도{Novel triterpene saponin derivative and use thereof}

본 발명은 벌개미취(Aster koraiensis Nakai, Korean starwort) 추출물로부터 분리 동정한 신규 트리테르펜 사포닌 유도체인 아스터사포닌 I 및 이의 신경퇴행성 질환 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.

최근 노인 인구 비율이 점차 높아져 가는 고령화 현상이 사회적 문제로 대두됨에 따라, 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disorders)에 대한 관심이 높아지고 있다. 신경퇴행성 질환이란 다양한 원인에 의해 퇴행성으로 변한 신경 때문에 운동 작용, 기억, 인지 작용 등에 장애가 발생하는 질환이며, 그 중에서 파킨슨병(Parkinson's disease)은 알츠하이머 질환 다음으로 가장 발병률이 높은 대표적인 신경퇴행성 질환이다. 파킨슨병은 1817년 영국 의학자인 James Parkinson이 "흔들림성 마비"를 처음으로 기술하였으며, 그로부터 60여년 후에 J.Charout에 의해 파킨슨병이라는 용어가 사용되었고, 1912년 Kinner wilson에 의해 파킨슨병이 척수의 중추 경로 중 추체계(pyramidal system)가 아닌 추체외로계(extrapyramidal system) 관련 질환임이 확인되었다.

상기 파킨슨병의 발병 원인의 규명을 위한 연구가 수십 년에 걸쳐 진행되어 왔으나, 그 기전에 대해 정확하게 밝혀진 바가 없다. 그로 인해 파킨슨병은 유효적이고 효과적인 장기 치료방법이 없는 점진적인 신경 장애 난치병으로 분류된다. 다만 파킨슨병 환자에게 발생되는 다양한 병리학적인 요인에 의해서 파킨슨병이 발병되는 것으로 추측되고 있다. 그 요인으로서, 중뇌의 흑색질(substantia nigra par compacta)이 파괴되거나 손상되면서 중뇌의 흑색질에 분포하는 신경전달물질 중 도파민을 분비하는 신경세포의 비정상적인 사멸이 가장 대표적이다. 도파민 신경세포의 비정상적인 사멸은 일련의 과정을 통해 일어나는데, 먼저 환경, 유전, 노화와 같은 다양한 요인에 의해 손상을 입은 미토콘드리아가 단백질 분해 시스템의 기능 장애를 야기시키게 되고, 그로 인해 비정상적인 단백질과 세포소기관들이 분해되지 못하고 축적됨으로써 발생하게 된다. 이러한 원인들로 인해 파킨슨병의 치료 및 예방에 있어서, 단백질 분해 시스템의 중요성이 대두되고 있다.

현재까지 임상에서 파킨슨병 환자에게 가장 높은 비율로 처방되는 약제는 L-dopa 제제이며, 이는 도파민 신경세포의 전구체인 Levodopa를 직접 주입하여 혈중 도파민 농도를 증가시켜주는 치료법이다. 직접적인 Levodopa의 주입은 파킨슨병 환자들에게 실질적인 증상 완화를 가져오지만, 장기간 사용하였을 경우 용량의 증가가 필수적이며, 용량의 증가에 따라 예측하지 못했던 다양한 부작용을 초래하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 도파민 혈중 농도를 높여주는 L-dopa를 직접 투여하는 치료법 보다는, 도파민 분비를 원활하게 해 주는 신경세포의 보호 및 사멸을 억제할 수 있는 좀 더 근본적인 치료법 및 약제의 개발이 시급하다고 할 수 있다. 이러한 시도 중 하나로 단백질 분해 시스템 중 하나인 자가포식을 표적으로 한 치료제 개발 연구가 최근 주목을 받고 있다.

자가포식(autophagy)은 자아, 자신이라는 뜻의 "self"와 먹는다는 의미의 "eating"을 칭하는 그리스어에서 파생된 단어로, 세포의 신진대사 균형을 유지할 뿐만 아니라 세포의 운명에 중요한 역할을 하는 자기 희생의 메커니즘으로 알려져 있다. 이러한 자가포식 작용은 자가포식소체(autophagosome)의 전구체이자 독립된 이중막인 파고폴(phagophore)의 가장자리가 점점 연장되어 세포 내 불필요한 단백질을 완전히 에워싸, 소포체인 자가포식소체를 형성할 수 있는 형태학적으로 특징적인 구조를 가지고 있다. 또한 자가포식소체는 미세소관을 따라 이동하여 세포 내 리소좀(lysosome)과 융합하게 되며 자가포식용해소체(autolysosome)를 형성하게 되며 이때, 리소좀 내부에서 분비되는 단백질분해효소에 의해 단백질을 분해시키는 것으로 보고되었다. 자가포식은 에너지원의 균형(balance of energy sources) 및 영양 스트레스의 적응(adaption of nutrient stress)을 조절함은 물론, 세포에 독성을 나타내기 전에, 손상된 세포질 성분 또는 세포소기관(organelles)의 분해를 촉진한다. 자가포식은 신경퇴행성 질환을 포함한 다양한 질환의 치료에 매우 중요하다. 자가포식의 감소는 세포질에서 독성 성분을 축적시키며, 결과적으로 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)과 같은 신경퇴행성 질환을 유발한다. 자가포식 과정 동안, 미세소관-연관 단백질(microtubule-associated protein) 경쇄(light chain) 3(LC3)은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine)에 결합하여 LC3-II를 형성하며, 이는 자가포식소체의 막 상에서 나타난다. LC3-II의 형성은 자가포식소체의 양을 반영하므로, LC3은 자가포식 유도를 모니터하기 위한 중요한 마커로 간주되고 있다.

한편, 벌개미취(Aster koraiensis Nakai, Korean starwort)는 국화과(family Asteraceae)에 속하는 식물로서, 한국에서 유래한 다년생의 허브이며, 한반도의 온난한 지역 및 제주도에 주로 분포한다. 이는 오랫동안 장식, 식재료(food ingredients), 또는 전통 약재(traditional medicines)로 이용되어 오고 있다. 이의 어린 잎과 줄기는 식용이며, 뿌리는 만성 기관지염(chronic bronchitis), 백일해(pertussis), 및 폐렴(pneumonia)의 치료에 사용되고 있다. 기존의 식물 화학물질 연구(phytochemical studies)는, 세포독성 및 면역 질환과 같은 몇몇 생물학적 활성에 관여하는, 폴리에세틸렌, 벤조퓨란 및 세스퀴테르페노이드(sesquiterpenoids)를 함유함을 밝혔다. 또한, 벌개미취 추출물의 창상 치료 또는 피부 재생 유도 효과(한국공개특허 제10-2019-0132076호), 피부 미백 효과(한국공개특허 제10-2019-0129556호), 항당뇨 활성(한국공개특허 제10-2019-0007163호), 안구 건조증 개선 효과(한국등록특허 제10-1928026호), 콜라겐 관련 피부 항노화 효과(한국공개특허 제10-2017-0084845호), 망막질환 개선 효과(한국등록특허 제10-1391308호), 간 보호 효과(한국등록특허 제10-1187032호), 비만과 고지혈증 개선 효과(한국공개특허 제10-2011-0121849호), 통증 치료 효과(한국공개특허 제10-2011-0038375호), 암 예방 효과(한국등록특허 제10-0998573호) 및 당뇨합병증 개선 효과(한국등록특허 제10-0845469호) 등의 다양한 용도가 알려져 있다. 본 발명자들은 선행연구를 통해, 상기 벌개미취의 추출물이 파킨슨병 등의 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있음을 확인하였으나, 상기 효과를 나타내는 구체적인 유효성분에 대해서는 확인된 바 없다(특허출원 제10-2018-0052009호).

아스터사포닌(Astersaponin)은 주로 개미취(Aster tataricus L.)에서 분리 보고되었으며, 올레아난 트리테르펜 모핵에 3번 탄소 및 2번 또는 16번 탄소에 결합된 수산화기들과, 아라비노피라노스, 글루코피라노스, 아피오푸라노스, 자일로피라노스 또는 람노피라노스 등의 당들이 3번 탄소의 수산화기와 28번 위치의 카복실산에 치환된 구조적 특징을 가진다. 현재까지 아스터사포닌 A, A₂, B, C, C₂, E, F, G, G₂, H, H_b 등 11종의 아스터사포닌이 보고되었으며, 세포내 산화질소(NO) 생성 억제작용, 암세포에 대한 세포독성 작용(Wang, Bing & Zheng, Yiduan, Zhongcaoyao, 32, 244-245) 및 항염증 작용이 보고된 바 있다. 아스터사포닌은 수산화기의 치환 위치와 결합한 당의 종류와 위치에 따라 다른 양상의 생리활성을 나타낼 수 있는데, 일례로써 16번 탄소에 수산화기를 가지고 28번 카복실산에 결합된 당 그룹에서 아피오퓨라노스와 자일로피라노스가 말단에 위치한 구조를 특징으로 하는 아스터사포닌 B가 다른 아스터사포닌에 비하여 현저한 항염증 작용을 나타낸다는 연구결과가 보고된 바 있다(Su, Xiang-Dong et al. Journal of Natural Products, 2019, 82, 1139-1148). 그러나, 아스터사포닌들의 자가포식(Autophagy) 유도 작용 및 신경보호활성은 알려진 바 없다. 특히, 본 발명의 아스터사포닌 I은 현재까지 보고된 바 없는 신규 화합물로써, 아스터사포닌 I와 같이 아글리콘(Aglycon) 모핵의 3번 탄소 위치에 결합한 이당류 중 말단의 당이 자일로피라노스(Xylopyranose)이며 28번 카복실기에 결합한 5개 당 중 첫번째 당이 아라비노피라노스이면서 말단의 당이 자일로피라노스와 람노피라노스 두 개인 아스터사포닌은 보고된 바 없다. 또한, 28번 카복실기에 결합된 5개 당의 조성이 아라비노피라노스 한 개, 자이로피라노스 두 개 및 람노피라노스 두 개로 이루어진 아스터사포닌은 본 발명의 아스터사포닌 I가 처음이다. 아스터사포닌 I와 가장 유사한 물질은 학명이 Conyza blini인 식물로부터 분리 보고된 코니자사포닌 K(conyzasaponin K)이다. 그러나, 코니자사포닌 K는 아글리콘 모핵의 3번 탄소에 결합된 2개의 당의 조성과 결합순서는 아스터사포닌 I와 동일하나, 28번 카복실기에 결합된 5개의 당에서 말단의 당 중 하나가 아피오퓨라노스인 반면, 아스터사포닌은 자일로피라노스이므로 상이한 구조를 가진다.

본 발명자들은 벌개미취(Aster koraiensis) 추출물로부터 신경퇴행성 질환의 치료에 있어서 중요한 역할을 하는 자가포식 유도 활성을 나타내는 생물활성 화합물의 발굴하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 벌개미취의 에탄올 추출물로부터 신규한 트리테르펜 사포닌인, 아스터사포닌 I(astersaponin I, 이하, 화합물 1)을 분리하여 동정하고, 상기 화합물이 SH-SY5Y 세포에서 미세소관-연관 단백질(microtubule-associated protein) 경쇄(light chain) 3B (LC3-II)의 발현을 현저하게 증가시킴으로써 자가포식 유도 효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하는 것이다:

[화학식 1]

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본 발명의 다른 목적은 상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:

[화학식 1]

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예컨대, 상기 화합물은 벌개미취(Aster koraiensis)의 추출물로부터 분리된 화합물일 수 있다. 구체적으로, 상기 화합물은 벌개미취의 에탄올 추출물로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 나아가, 상기 화합물은 벌개미취 추출물의 부탄올 분획물로부터 분리될 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 화합물은 벌개미취 에탄올 추출물의 부탄올 분획물로부터 분리될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벌개미취 추출물은 상기 식물의 지상부, 예컨대, 줄기, 잎 등을 추출하여 수득한 것일 수 있으나, 상기 화합물을 함유하는 한 이에 제한되지 않는다. 상기 벌개미취는 상업적으로 판매되는 것을 구입하거나, 자연에서 채취 또는 재배된 것을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, "추출물"은 벌개미취를 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

상기 벌개미취 추출물을 제조하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행할 수 있다. 상기 추출 방법의 비 제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 벌개미취 추출물 제조에 사용되는 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 용매의 비제한적인 예는 물, C1 내지 C4의 알코올 및 이들의 혼합 용매 등일 수 있으며, 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 바람직하게는 95% 에탄올이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어, "분획물"은 여러 다양한 구성 성분들을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 성분 그룹을 분리하기 위하여 분획을 수행하여 얻어진 결과물을 의미한다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 분획 방법의 비제한적인 예로는, 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다. 구체적으로, 본 발명의 벌개미취를 추출하여 얻은 추출물에 소정의 용매를 처리하여 상기 추출물로부터 분획물을 얻는 방법을 들 수 있다.

본 발명에서 상기 분획물을 얻는 데 사용되는 분획 용매의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 분획 용매의 비제한적인 예로는 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 등의 극성 용매; 헥산(hexan), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 클로로포름(chloroform), 디클로로메탄(dichloromethane) 등의 비극성 용매; 또는 이들의 혼합용매 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 구체적으로, 헥산, 에틸 아세테이트, 부탄올(butanol) 또는 물이 단독으로 사용되거나 1종 이상 혼합하여 사용되거나, 보다 구체적으로 n-부탄올이 사용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 세포 예컨대, 뇌세포에서 자가포식 유도 활성을 나타내는 것이 특징이다.

한편, 상기 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 상기 화합물의 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 활성을 보유하고 있고, 원하지 않는 독물학적 효과는 최소한으로 나타내는 모든 염을 의미한다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알콜(예, 글리콜 모노메틸 에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다. 이때, 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 히드로브롬산, 인산, 질산, 황산, 주석산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 메탄 술폰산, p-톨루엔 술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 히드로아이오딕산 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

상기 화학식 1의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 상기 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 거의 포함한다. 예를 들어 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄술포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔술포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며 당업계에서 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

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또한, 본 발명은 상기 약학 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

구체적으로, 상기 본 발명의 화학식 1의 화합물에 의한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료는 자가포식 유도 신경세포보호작용에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 용어 "신경퇴행성 질환"이란 신경세포가 퇴화하고, 기능을 잃고, 그리고 사멸하는 경우 나타나는 증상들과 관련된 질환을 의미한다. 주로 진행성이어서 그 결과는 매우 파괴적이고, 상기 질환을 가진 환자들은 인지 또는 운동 능력에 있어서 극심한 퇴화를 겪을 수 있다. 상기 신경퇴행성 질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 자가포식 유도 신경세포보호작용이 유효하게 작용할 수 있는 질환인, 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)(Moors, Tim E. et al., Molecular Neurodegeneration, 2017, 12: 11; Rubinsztein, David C. et al., Autophagy, 2005, 1: 11), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD)(Nixon, Ralph A., Journal of Cell Science, 2007, 120: 4081), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)(Chen, Sheng et al., Brain Pathology, 2012, 22: 110; Barmada, Sami J et al., Nature Chemical Biology, 2014, 10: 677), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD)(Martin, Dale D. O. et al., Trends in Neurosciences, 2015, 38: 26), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia)(Winslow, Ashley R. & Rubinsztein, David C., Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease, 2008, 1782: 723), 피질-기저핵 퇴행증(Corticobasal Degeneration)(Piras, Antonio et al., Acta Neuropathologica Communications, 2016, 4: 22), 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)(Piras, Antonio et al., Acta Neuropathologica Communications, 2016, 4: 22)를 포함한다. 구체적으로, 본 발명의 약학 조성물을 투여하여 예방 또는 치료할 수 있는 신경퇴행성 질환은 파킨슨병일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 용어, "예방"은 상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 투여에 의해 신경퇴행성 질환의 진행을 억제시키거나 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 화학식 1의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물의 투여에 의해 신경퇴행성 질환이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어 "개체"란 신경퇴행성 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 신경퇴행성 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나, 기존의 신경퇴행성 질환 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

본 발명의 용어 "투여"란 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 조성물 이외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스, 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 그러나 경구 투여시, 천연물로부터 유래된 상기 팥꽃나무 추출물의 활성성분은 소화로 인하여 손실될 수 있으므로, 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화하는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내 주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제(예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란 의학적 예방 또는 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 예방 또는 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 고형분을 기준으로 1일 0.0001 내지 500 mg/체중 kg으로, 더욱 구체적으로 0.01 내지 500 mg/체중kg으로 투여할 수 있다. 투여는 상기 권장 투여량을 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

예컨대, 본 발명의 약학 조성물에 의한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료는 자가포식 유도 작용을 통한 뇌세포 사멸 억제에 의해 달성될 수 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

.

이때, 상기 신경퇴행성 질환 및 예방의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어, "식품학적으로 허용 가능한 염"은 상기 "약학적으로 허용 가능한 염"에 정의된 바와 같다.

본 발명의 용어, "개선"은 본 발명의 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "식품"은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강 기능 식품 및 건강 식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품 조성물은 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 높은 파킨슨병 개선 효과를 기대할 수 있으므로, 건강 증진 목적으로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 식품의 제형은 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 천연물을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나므로, 본 발명의 식품은 파킨슨병 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

상기 건강 식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강보조식품의 용어는 혼용된다.

구체적으로, 상기 건강 기능 식품은 본 발명의 추출물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품 소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용이 없는 장점이 있다.

상기 식품 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄; 및 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 글루타민산나트륨 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다. 아울러, 본 발명의 식품 조성물에 함유되는 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 상기 약학적 조성물의 제조에서 언급된 추출방법과 동일 또는 유사한 방법으로 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.

캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 가루가 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다. 과립 형태의 건강기능식품은 12호(1680 μm), 14호(1410 μm) 및 45호(350 μm) 체를 이용하여, 다음 입도시험을 수행할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것이 전체량의 5.0% 이하이고, 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0% 이하일 수 있다.

상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함할 수 있다(대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).

또 다른 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다:

[화학식 1]

.

이때, 상기 식품학적으로 허용 가능한 염, 신경퇴행성 질환, 예방 및 개선의 정의는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 명세서에 사용된 용어 "사료"는 동물이 섭취하는 먹이를 의미하며, 구체적으로 동물의 생명을 유지하거나 또는 고기, 젖 등을 생산하는 데에 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 의미할 수 있다. 상기 사료는 사료 첨가제를 포함할 수 있으며, 당업계의 공지된 다양한 형태로 제조 가능하다.

본 발명의 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 조성물은 가축, 또는 반려동물과 같이 인간 이외의 개체의 파킨슨병 발병 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있으며, 기능성 사료첨가제, 또는 사료용 조성물로 활용할 수 있다.

본 발명에 따른 사료 조성물 내 화학식 1의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염의 함량은 적용 가축의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 1 내지 99 중량%, 바람직하게는 10 내지 90 중량%, 더욱 바람직하게는 20 내지 80 중량%로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

또는, 상기 본 발명의 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염은 사료 조성물에 첨가되는 사료 첨가제로 사용될 수 있다. 상기 사료 첨가제는 대상 동물의 생산성 향상이나 건강을 증진시키기 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 사료 첨가제는 사료 관리법 상의 보조사료에 해당할 수 있다.

본 출원의 사료 첨가제는, 추가로 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 등의 유기산이나 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 필요에 따라 액상, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

상기 사료 또는 사료 첨가제는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 나타내는 물질을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화, 항곰팡이, 미생물 제제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.

본 출원의 사료 및 사료 첨가제는 포유류, 가금류를 포함하는 다수의 동물에 급이될 수 있다. 예컨대, 미관을 유지 또는 개선하기 위하여, 소, 염소 등의 가축; 개, 고양이 등의 애완동물에 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 신규한 트리테르펜 사포닌 유도체, 아스터사포닌 I(화합물 1)은 뇌세포에서 자가포식소체의 막 단백질인 LC3 단백질의 발현을 증가을 증가시키므로, 자가포식 유도 작용을 통한 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 분리 동정한 화합물, 아스터사포닌 I(astersaponin I, 화합물 1)의 IR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 UV 스펙트럼을 나타낸 도이다(CH₃OD).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 HR-MS 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다(500 MHz, CD₃OD).
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다(125 MHz, CD₃OD).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 주요 (A) HMBC 및 (B) ROSEY 상관관계를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼을 나타낸 도이다(500 MHz, CD₃OD).
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 HSQC 스펙트럼을 나타낸 도이다(500 MHz, CD₃OD).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 HMBC 스펙트럼을 나타낸 도이다(500 MHz, CD₃OD).
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 2D ROESY 스펙트럼을 나타낸 도이다(500 MHz, CD₃OD).
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 측정된 ECD 스펙트럼 및 이론적 ECD 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 2D TOCSY 스펙트럼을 나타낸 도이다(600 MHz, CD₃OD).
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 TOCSY-HSQC 스펙트럼을 나타낸 도이다(850 MHz, CD₃OD).
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 당 결정(sugar determination)을 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물 1의 화학적 구조를 나타낸 도이다.
도 16은 (A) 벌개미취의 에탄올 추출물(12.5, 25 및 50 μg/mL), 이의 n-헥산 분획물(12.5 μg/mL), 에틸아세테이트 분획물(12.5, 25 및 50 μg/mL) 및 n-부탄올 분획물(12.5, 25 및 50 μg/mL)로 처리하여 용량 의존적으로 증가된 LC3-II 발현, (B) 아스터사포닌 I로 처리하여 용량 의존적으로 상향조절된(up-regulated) LC3-II 발현, 및 (C) 상기 벌개미취의 에탄올 추출물, 이의 분획물(n-헥산, 에틸아세테이트 및 n-부탄올) 및 화합물 1로 처리된 SH-SY5Y 세포에서 단백질 마커 LC3의 대표적인 웨스턴 블롯 밴드를 나타낸 도이다. 데이터는 평균±SEM(n=3)으로 표기하였다. **p＜0.01, ***p＜0.001 대조군으로부터의 유의한 차이.
도 17은 mTOR 의존적 자가포식 신호에 대한 AKNS의 효과를 나타낸 도이다. AKNS 시료로 처리한 후 24시간에, SH-SY5Y 세포에서 자가포식 유도에 관련된 주요 마커들을 웨스턴 블롯법으로 측정하였다. (A), (B) 및 (C)는 각각 AKNS 추출물, AKNS n-BuOH 분획물 및 단일 화합물 AKNS-2로 처리한 SH-SY5Y 세포에서 자가포식 관련 단백질 마커의 발현을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 3)로 표현하였다. ^* p<0.05, ^** p<0.01, ^*** p<0.001 대조군으로부터 유의적 차이.
도 18은 SH-SY5Y 세포에서 AKNS-2 유도 자가포식에 대한 자가포식 억제제의 저해효과를 나타낸 도이다. (A)는 AKNS-2 상향조절된(up-regulated) LC3-II 발현이 3-MA(5 mM)에 의해 감소되었음을 나타내며, (B)는 3-MA가 AKNS-2에 의해 감소된 p62 발현을 향상시켰음을 나타낸다. (C)의 mRFP-GFP-LC3 탠덤 형광 단백질 소광 어세이(Tandem Fluorescent Protein Quenching Assay)는 AKNS-2 유도된 자가포식이 보르트만닌(Wart, 50 nM) 및 바필로마이신 A₁(Baf, 100 nM)에 의해 저해되었음을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 3)로 표현하였다. ^*** p<0.001 대조군으로부터 유의적 차이, ^# p<0.05, ^## p<0.01 AKNS-2 처리군으로부터 유의적 차이.
도 19는 자가포식 억제제 3-MA에 의한 MPP^{+ -}유도된 독성으로부터 SH-SY5Y 세포에 대한 AKNS-2의 보호 효과의 저해를 나타낸 도이다. (A), (B), 및 (C)는 다양한 농도에서 각각 AKNS-2 단독, MPP⁺ 단독, 및 AKNS-2와 MPP⁺ 병용 처리된 SH-SY5Y 세포의 세포 생존율을 나타낸다. (D), (E), 및 (F)는 3-MA의 부재 또는 존재 하에 AKNS-2 및 MPP⁺ 처리된 SH-SY5Y 세포에서 각각 LC3, p62, 및 TH의 단백질 발현을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(MTT 어세이에 대해 n = 5, 및 웨스턴 블롯 분석에 대해 n = 3)로 표현하였다. ^** p< 0.01, ^*** p<0.001001 대조군으로부터 유의적 차이, ^# p<0.05, ^## p<0.01, ^### p<0.001 MPP⁺ 처리군으로부터 유의적 차이. ^&p<0.05 AKNS-2 및 MPP⁺ 처리군으로부터 유의적 차이.
도 20은 MPP⁺ 유도된 독성으로부터 SH-SY5Y 세포에 대한 Erk 신호 경로 활성화에 의한 AKNS-2의 보호 효과를 나타낸 도이다. SH-SY5Y 세포를 10 μM U0126의 존재 또는 부재 하에 AKNS-2(5 및 10 μM)로 처리하였으며, (A), (B), (C), 및 (D)는 각각 LC3, Erk, ULK, 및 mTOR의 단백질 발현을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 3)로 표현하였다. ^* p< 0.05, ^** p< 0.01, ^*** p<0.001 대조군으로부터 유의적 차이, ^# p<0.05, ^## p<0.01, ^### p<0.001 AKNS-2 처리군으로부터 유의적 차이. SH-SY5Y 세포를 10 μM U0126의 존재 또는 부재 하에 AKNS-2 및 MPP⁺(2mM)로 처리하였으며, (E)는 U0126가 세포 생존율에 대한 AKNS-2의 보호 효과를 철폐하였음을 나타내고; (F), (G), 및 (H)는 각각 LC3, TH 및 α-시누클레인(α-synuclein)의 발현을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(MTT 어세이에 대해 n = 5, 및 웨스턴 블롯 분석에 대해 n = 3)로 표현하였다. ^*** p<0.001 대조군으로부터 유의적 차이, ^# p<0.05, ^## p<0.01, ^### p<0.001 MPP⁺ 처리군으로부터 유의적 차이(AKNS-2 처리군으로부터 LC3 차이에 대한). ^&p<0.05, ^{& &}p<0.01 AKNS-2 및 MPP⁺ 처리군으로부터 유의적 차이.
도 21은 MPP ⁺ 유도 독성으로부터 SH-SY5Y 세포에 대한 AMPK 신호 경로 활성화에 의한 AKNS-2의 보호 효과를 발휘한다. (A) 내지 (D)는 각각 AMPK siRNA(50 nM) 존재 또는 부재 하에 AKNS-2(5 및 10 μM)로 처리된 SH-SY5Y 세포의 LC3, AMPK, ULK, 및 mTOR 단백질 발현을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 3)로 표현하였다. ^* p< 0.05, ^** p< 0.01, ^*** p<0.001 대조군으로부터 유의적 차이, ^# p<0.05, ^## p<0.01 AKNS-2단독 처리 군으로부터 유의적 차이. SH-SY5Y 세포를 AMPK siRNA 존재 또는 부재 하에 AKNS-2 및 MPP⁺(2mM)로 처리하였다. (E)는 AKNS-2의 보호 효과가 철폐된 MPP⁺, 및 AMPK siRNA에 의해 감소된 세포 생존률을 AKNS-2가 증가시켰음을 나타낸다; (F), (G), 및 (H)는 LC3, TH, α-시누클레인 및 상대적인 밀도의 전형적인 단백질 밴드를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(MTT 어세이에 대해 n = 5, 및 웨스턴 블롯 분석에 대해 n = 3)로 표현하였다. ^*** p<0.001 대조군으로부터 유의적 차이, ^# p<0.05, ^## p<0.01, ^### p<0.001 MPP⁺ 처리군으로부터 유의적 차이 (AKNS-2 처리군으로부터 LC3 차이에 대한). ^&p<0.05 AKNS-2 및 MPP⁺ 처리군으로부터 유의적 차이.
도 22는 MPTP 손상된 동물 거동 수행능에 대한 AKNS-2의 보호 효과를 나타낸 도이다. (A)는 아만성(sub-chronic) MPTP 투여-유도된 in vivo PD 모델에 대한 개략도를 나타낸다. 마우스를 회전 막대, 장대 및 선에 3일 동안 매달아 선훈련하였다. 마직막 MPTP 주입 후, 다른 시점에서 마우스 거동 수행능을 기록하였다. (B), (C) 및 (D)는 MPTP 투여 전과 후 상이한 시점에서 회전 막대, 장대 및 선 매달림 테스트에 대한 마우스의 거동 수행능을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 5)로 표현하였다. ^** p< 0.01, ^*** p<0.001 대조군으로부터 유의적 차이, ^# p<0.05, ^## p<0.01, ^### p<0.001 MPTP 처리군으로부터 유의적 차이.
도 23은 MPTP-유도된 아만성 in vivo PD 모델에 대한 AKNS-2의 보호 효과를 나타낸 도이다. MPTP 주입 후 수일차에, 생화학적 분석을 위하여 흑색질(substantia nigra; SN) 및 선조체(striatum; ST)의 마우스 뇌 조직을 적출하였다. (A)는 각 군으로부터 ST의 도파민 수준을 나타낸다. (B) 및 (C)는 각각 ST 및 SN의 MAO-B 활성을 나타낸다. (D)는 각각 ST 및 SN에서 TH 및 α-시누클레인의 전형적인 단백질 밴드를 나타낸다. (E) 및 (F)는 ST 및 SN으로부터 TH의 상대적인 밀도를 나타내며, (G) 및 (H)는 ST 및 SN으로부터 α-시누클레인의 상대적인 밀도를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM (n = 5)로 표현하였다. ^** p< 0.01, ^*** p<0.001 대조군으로부터 유의적 차이, ^# p<0.05, ^## p<0.01, ^### p<0.001 MPTP 처리군으로부터 유의적 차이.
도 24는 in vivo 실험에서 AKNS-2의 자가포식 유도를 나타낸 도이다. (A)는 선조체에서 LC3, p62, AMPK, Erk, ULK 및 mTOR을 포함하는 자가포식 관련 단백질 마커들의 전형적인 단백질 밴드 및 상대적인 밀도를 나타낸다. (B)는 흑색질에서 LC3, p62, AMPK, Erk, ULK 및 mTOR을 포함하는 자가포식 관련 단백질 마커들의 전형적인 단백질 밴드 및 상대적인 밀도를 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM(n = 5)로 표현하였다. ^* p< 0.05, ^** p< 0.01, ^*** p<0.001 대조군으로부터 유의적 차이, ^# p<0.05, ^## p<0.01, ^## p<0.01 MPTP 처리군으로부터 유의적 차이.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

광학 회전(optical rotations)을 Perkin-Elmer(Waltham, MA, USA) 343 편광계(polarimeter)로 획득하였다. UV 및 IR 스펙트럼은 각각 Perkin-Elmer Lambda 35 분광광도계(spectrophotometer) 및 Thermo(Waltham, MA, USA) iS50 분광계(spectrometer)로 획득하였다. 전자 원평광 이색성(electron circular dichroism, ECD) 스펙트럼은 Applied Photophysics(Leatherhead, England) Chirascan V100 분광계로 획득하였다. NMR 스펙트럼은 Varian(Palo Alto, CA, USA) 500 MHz, Joel(Tokyo, Japan) 600 MHz, 및 Bruker(Billerica, MA, USA) 850 MHz NMR 분광계 상에 기록하였다. 고해상도 질량 분광법(high resolution mass spectrometry, HRMS) 데이터는 Thermo Q-Exactive 질량 분광기 상에 수집하였다. 분취(preparative) HPLC 시스템은 Phenomenex Luna C₁₈ 컬럼(10 μm, 250×21.2 mm)을 구비한 YMC(Kyoto, Japan) LC-Forte/R 및 ELS 검출기를 이용하였다. 컬럼 크로마토그래피는 GE Healthcare(Chicago, IL, USA) Sephadex LH-20 겔을 이용하여 수행하였다.

<식물 원료 물질>

아스터 코라이엔시스(Aster koraiensis, 벌개미취) 전초는 평창 야생 종묘 영농 조합(Wild Plant Nursery and Farming Corporation, Pyeongchang, Republic of Korea)에서 재배 후 2016년 10월에 수집하였다. 확증 표본(voucher specimen, No. BS0083A1)을 한국과학기술연구원 강릉분원(Korea Institute of Science and Technology Gangneung Institute)에 기탁하였다.

<물질>

DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 100 units/ml 페니실린(penicillin) 및 100 mg/ml 스트렙토마이신(streptomycin)을 Gibco(Thermo Fisher Scientific)로부터 구입하였다. 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(1-Methyl-4-pheynl-1,2,3,6-tetrahydropyridine; MPTP) 염산염, 1-메틸-4-페닐피리디늄(1-Methyl-4-phenylpyridinium; MPP⁺) 아이오다이드, 3-메틸아데닌(3-methyladenine; 3-MA) 및 로피니롤(ropinirole)은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 보르트만닌(wortmannin; Wart)과 바필로마이신 A1(bafilomycin A1; Baf)은 Abcam(MA, USA)으로부터 구입하였다. 항-글리세르알데히드-3-포스페이트 탈수소화효소(anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GAPDH), 항-AMPK, 항-인산화된(phosphorylated) AMPK(p-AMPK), 항-ULK, 항-인산화된 ULK555(p-ULK555), 항-Erk, 항-인산화된 Erk(p-Erk), 항-mTOR, 항-인산화된 mTOR(p-mTOR), 항-LC3B, 항-타이로신 수소화효소(anti-tyrosine hydroxylase; TH), 래빗 유래의 항-α-시누클레인 일차항체, 항-래빗 호스래디쉬 과산화효소-결합된 IgG(anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated IgG) 이차항체, Erk 억제제 U0126, AMPK siRNA, 및 AMPK siRNA 콘트롤은 Cell signaling Technology(Boston, MA, USA)로부터 구입하였다. 자가포식 탠덤 센서 RFP-GFP-LC3B 키트는 Thermo Fisher Scientific(MA, USA)으로부터 구입하였다. MTT 어세이 키트 Z-Cytox는 대일랩서비스(DAEILLAB Co, Ltd, Seoul, Republic of Korea)로부터 구입하였다. 도파민(dopamine) ELISA 키트는 Abnova(Taipei City, Taiwan)로부터 구입하였으며, MAO-B 어세이 키트는 Promega(Woods Hollow Road Madison, USA)에 의해 공급되었다. 모든 다른 시약은 최상등급의 것을 사용하였으며, 상업적 제품으로부터 선택하였다.

제조예 1: 세포 배양

인간 신경아세포종 세포(human neuroblastoma cells) SH-SY5Y를 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)로부터 입수하여, 10% 열-비활성화된(heat-inactivated) FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 보충한 DMEM에 배양하였다. SH-SY5Y 세포는 37°C 조건 하에 5% CO₂ 함유 습윤 분위기에서 배양하였다. 먼저 세포를 6-웰 플레이트에 80 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 2 mL 배지와 함께 분주하고, 24 시간 후 원하는 농도의 시료(AKNS EtOH 추출물, AKNS n-BuOH 분획물 또는 AKNS-2)로 처리하였다. 3-MA, Wart, Baf 또는 U0126 존재 조건 하에서, 세포를 시료 처리 전 30분 동안 이들 시약으로 처리하였다. AMPK siRNA 감염된(transfected) SH-SY5Y 세포에 대해, siRNA 감염 후 36시간에 AKNS-2를 투여하였다. MPP⁺ 처리가 필요할 때, 상기 시료 처리 후 1시간에 세포를 MPP⁺로 처리하였다. 시료 처리 24시간 후, SH-SY5Y 세포를 회수하여 이후 분석에 사용하였다.

실험예 1: 세포 생존율 측정을 위한MTT 어세이

MTT 어세이 키트Z-Cytox를 사용하여 세포 생존율을 검출하였다. 간략하게, SH-SY5Y 세포를 96-웰 플레이트에 2×10⁴ 세포/웰 밀도로 100 μL배지와 분주하였다. 24시간 후, AKNS-2 및 MPP⁺의 세포독성을 확인하기 위하여, SH-SY5Y 세포를 원하는 농도의 AKNS-2 및/또는 MPP⁺ 로 처리하였다. 24시간 후, 10 μL의 MTT 시약을 96-웰 플레이트의 세포를 포함하는 각 웰에 첨가하였다. 마이크로플레이트 분광광도계(BioTek, VT, USA)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. MPP⁺ 유도 세포독성에 대한 AKNS-2의 보호효과를 입증하기 위하여, AKNS-2 처리 후 1시간에 2 mM MPP⁺를 세포에 처리하였다. 다음 날, MTT 시약을 첨가하고 1시간 후에 흡광도를 측정하였다. AKNS-2가 자가포식 유도를 통해 MPP⁺-유도 세포독성에 대한 보호효과를 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, SH-SY5Y 세포를 U0126 또는 AMPK siRNA로 처리하고, 각각 30분 및 36시간 후 AKNS-2 (5 및 10 μM) 를 첨가하고, AKNS 처리 후 1시간에 세포에 2 mM MPP⁺를 첨가하였다.

실험예 2: 형광분광법에 의한 RFP-GFP-LC3의 측정

SH-SY5Y 세포를 24-웰 플레이트 내에서 8×10⁴ 세포/웰의 밀도로 유리 커버슬립 상에 배양하였다. 자가포식 탠덤 센서 RFP-GFP-LC3B 키트의 지시에 따라 감염 과정을 수행하였다. 24시간 동안 배양한 후, 세포에 LC3B 시약을 처리하였다. 감염된 세포를 24시간 동안 인큐베이션한 후, 50 nM Wart 또는 100 nM Baf를 투여하고 AKNS-2(10 μM)를 첨가하였다. 상기 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하고 with 0.1% Triton X100으로 침투화(permeabilized) 하였다. 핵을 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(4,6-diamidino-2-phenylindole; DAPI, 25 μg/mL)로 염색하였다. 공초점 현미경(confocal microscope, Leica, Solms, Germany)을 이용하여 형광 신호를 검출하였다.

제조예 2: 세포 용해물의 준비

약물 처리 후 24시간에, 6-웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 세포를 차가운 염수로 한번 부드럽게 세척하였다. 다음으로, 1 mL의 차가운 염수를 각 웰에 첨가하고, 바닥에 부착된 세포를 1 mL 피펫으로 바닥을 문질러 부유시켰다. 현탁액을 1.5 mL 튜브에 회수하고 4℃에서 13000×g로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거한 후, 세포 펠렛에, 프로테아제 억제제 칵테일(protease inhibitor cocktail, Roche, Mannheim, Germany)을 함유하는, cell signaling(Danvers, MA, USA)으로부터 구입한 RIPA 용해 완충액(lysis buffer) 50 μL를 첨가하였다. 4℃에서 30분 동안 흔들어 준 후, 획득한 세포 시료를 4℃에서 13000×g로 20분 동안 원심분리하였다. 상층액을 회수하여, BSA를 이용하여 구축한 표준 곡선으로 브래드포드법(Bradford method)에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 이후, 상층액을 로딩 완충액으로 희석한 후, 99℃에서 5분 동안 가열하였다. 결과로 얻은 세포 시료를 이후 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다.

제조예 3: 동물실험

본 연구에서 모든 동물 관리 및 실험적 프로토콜은 한국과학기술연구원 동물실험윤리위원회의 지침을 준수하였다. 40마리 마우스(C57BL/6j, 수컷, 8주령)를 일본 SLC Inc.(Shizuoka, Japan)로부터 주문하였다. 도착 후, 4마리씩 각 케이지(30 cm × 18.5 cm × 13 cm)에 넣고 음식과 물을 무제한 공급하였다. 모든 마우스는 다음의 일정한 조건 하에 수용되었다: 6:00로부터 18:00까지 점등, 온도 23 ± 1℃, 및 습도 50 ± 10%. 7일의 습관화기간(habituation period) 후, 표준 프로토콜에 따라 마우스를 일련의 실험에 사용하였다.

제조예 4: 동물 분류 및 시료 처리

40마리 마우스를 각 군에 8마리를 포함하도록 임의의 5개 군으로 나누었다. 습관화기간 후, 모든 마우스에 매일 약물을 단회분으로 경구투여하였다. 제1군 및 제2군의 마우스에는 염수를 투여(p.o.)하는 한편, 제3군, 제4군 및 제5군의 마우스에는 각각 5 mg/kg 로피니롤(ropinirole)(p.o.), 5 mg/kg AKNS-2(p.o.), 및 15 mg/kg AKNS-2(p.o.)를 투여하였다. 5일차로부터, 제1군 마우스에 염수 위관영양(gavage) 후 1시간에 염수를 복강내 주입하였으며, 제2, 제3, 제4 및 제5군 마우스에는 각각 염수, 로피니롤, AKNS-2 5 mg/kg 및 AKNS-2 15 mg/kg 위관영양 후 1시간에 30 mg/kg MPTP(i.p.)를 투여하였다. 각 마우스에는 단회 용량의 염수/MPTP 주사를 8일 동안 주어졌다. 마지막 MPTP 주사 후 7일에, 모든 마우스를 경추탈구(cervical dislocation)로 치사시키고, 이후 생화학적 분석을 위해 전체 뇌, SNpc 및 선조체(striatum; ST)를 적출하였다. 도 22A는 동물실험의 개략도를 나타낸다.

실험예 3: 회전막대(rotarod) 테스트

최소한의 수정으로 공지된 방법에 따라 회전막대 테스트를 수행하였다(Borlongan C. V. et al., Pharmacology Biochemistry and Behavior. 1995, 52: 225; Hu X. et al., Neuropharmacology, 2017, 117: 352). 간략하게, 상기 테스트는 선훈련 섹션(pretraining section)과 테스트 섹션으로 구성하였다. 선훈련 섹션은 연속 4일에 걸쳐 수행하였다. 모든 마우스를 꼬리가 오퍼레이터를 향하도록 회전막대 장치의 원통 상에 위치시키고, 300초 기간에 걸쳐 16 rpm의 일정한 속도로 훈련을 시작하였다. 상기 300초 동안, 바닥으로 떨어지는 마우스를 오퍼레이터가 다시 원통 상에 위치시켰다. 모든 마우스는 MPTP 투여 전 매일 30분 이내의 간격으로 총 3회 시도를 수행하였다. 마지막 거동 훈련일 다음 날의 시작에, 마우스에 연속 8일 동안 AKNS-2(5 and 15 mg/kg) 투여 후 1시간에 단회 용량의 30 mg/kg MPTP로 처리하였다. 각 마우스에 대해 바닥으로 떨어지는 잠재기(latency)를 기록하였다. 테스트 섹션에서는, MPTP의 마지막 투여 후 2시간, 24시간 및 48시간의 3개 시점에서 선훈련 섹션 동안 사용된 프로토콜에 따라 회전막대 상의 모든 마우스의 수행능(performance)을 테스트하였다. 각 마우스가 바닥으로 떨어지는 잠복기를 기록하였다. 선훈련 섹션에서 60초 이상 원통 상에 머무른 마우스만을 통계적 분석에 사용하였다. 균형, 악력(grip strength) 및 운동협응(motor coordination)을 평가하기 위하여 3회 시도의 평균 시간을 계산하였다.

실험예 4: 장대(pole) 테스트

최소한의 수정으로 공지된 방법에 따라 장대 테스트를 수행하였다(Choi D. Y. et al., Neurobiology of disease, 2013, 49: 159). 간략하게, MPTP 투여 전날에, 거친 표면의 나무 장대(길이 50 cm, 직경 1 cm)를 방음실에 설치하였다. 마우스를 머리가 하늘을 향하도록 장대 꼭대기에 위치시키고, 마우스가 돌아서 장대를 내려오는데 걸린 시간을 스톱워치로 최대 120초까지 기록하였다. 동일한 훈련 작업을 30분 이내의 간격으로 3회 수행하였다. MPTP 주입 후, 막대 상의 모든 마우스의 수행능을 MPTP의 마지막 투여 후 2시간, 24시간 및 48시간의 3개 시점에서 선훈련에서와 동일한 프로토콜을 사용하여 테스트하였다. 운동기능(motor function)을 평가하기 위하여 3회 시도의 평균 시간을 분석하였다.

실험예 5: 선 매달리기(wire hanging) 테스트

최소한의 수정으로 공지된 방법에 따라 선 매달리기 테스트를 수행하였다(Zhu W. et al., Brain, Behavior, and Immunity, 2018, 69: 568). 간략하게, 수평선(horizontal wire, 직경 1.5 mm, 길이 50 cm 및 하상 재료(bedding material) 위로 30 cm)을 2개 장대 사이에 고정하였다. 푹신한 침구를 선 아래에 두었다. 마우스는 꼬리로 다루고, 앞발로 선의 중심점을 잡도록 하였다. 마우스가 적절히 부유된 후 즉시 타이머를 시작하였다. 최대 300초 기간까지 마우스가 선으로부터 떨어질 때까지의 시간을 기록하였다. MPTP 주입 전날에, 각 마우스에 대해 3회 시도를 수행하고, 균형, 근기능 및 조정력(coordination)을 평가하기 위한 지수(index)로서 3회 시도의 평균 매달림 시간을 분석하였다. MPTP 주입 후 2시간, 24시간 및 48시간 후에, 선 매달림 과제에서 마우스의 수행능을 테스트하였다. 각 마우스가 하상 재료로 떨어지는 평균 잠재기를 계산하였다.

제조예 5: 마우스 뇌 조직의 준비

MPTP의 마지막 주입 후 7일차에, 마우스의 SNpc 및 ST를 조심스럽게 적출하고 사용 전까지 -80℃에 보관하였다. 이후, SNpc 및 ST의 뇌 조직을 인산화효소 억제제 칵테일(Phosphatase Inhibitor Cocktail) Set I(Sigma-Aldrich, MO, USA)을 포함하는 PRO-PREPTM용해 완충액(iNtRON, Gyeonggi, Korea)에 균질화하였다. 4℃에서 30분 동안 흔들어준 후, 균질액(homogenates)을 4℃에서 13000×g로 20분 동안 원심분리하고, 수득한 상층액을 회수하여 새로운 1.5 mL 튜브에 회수하였다. 상층액 중의 단백질 농도를 브래드포드법으로 측정하였다. 상층액 일부를 같은 부피의 로딩 완충액과 혼합하고, 웨스턴블롯 분석을 위해 99℃ 히터에서 5분 동안 변성시켰다. 남은 상층액은 이후 MAO-B 활성 및 ELISA키트에 의한 DA 수준의 분석을 위해 -80℃에 보관하였다.

실험예 6: DA 수준 측정

제조업자의 지시에 따라 경쟁(competitive) ELISA 키트(Abnova, Taipei City, Taiwan)를 이용하여 ST 중의 DA 수준을 측정하였다. 간략하게, ST를 EDTA 및 소디움 메타바이설파이트(sodium metabisulfite) 존재 하에 0.01 N HCl에 균질화하였다. 균질액을 13000×g에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 회수하여 DA 수준 측정에 사용하였다. 상층액 중의 단백질 농도 결정 후, ELISA 키트를 이용하여 각 뇌 시료 중의 DA 수준을 2회 반복하여 검출하였다. 마이크로리더(BioTek, VT, USA)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 그 세기는 DA 수준에 반비례하였다. DA 수준은 ng/mg 단백질로 표현하였다.

실험예 7: MAO-B 활성 결정

Promega로부터의 MAO-B 어세이 키트(Woods Hollow Road Madison, USA)를 이용하여 제조업자의 지시에 따라 ST 및 SN의 MAO-B 활성을 결정하였다. MAO 활성을 검출하기 위하여 상기 키트는 균일발광법(homogeneous luminescent method)을 적용하였다. 상기 어세이는 2 단계를 포함한다. 먼저, MAO-B 기질을 MAO-B 효소-함유 물질(ST 및 SN 시료)에 첨가하여 메틸 에스테르 루시페린(methyl ester luciferin)을 생성하였다. 다음으로, 생성된 메틸 에스테르 루시페린을 에스테라아제(esterase) 및 루시페라아제(luciferase)와 반응시켜 빛을 생성하였다. MAO-B 활성은 발달된 빛(developed light)의 양에 직접 비례하였다. 발광 신호를 Infinite M1000 다중모드 마이크로플레이트 리더(TECAN, M

nnedorf, Switzerland)로 측정하였다. MAO-B 활성은 상대적 빛의 단위(relative light units; RLU)/mg 단백질로 표현하였다.

실험예 8: 웨스턴 블롯 분석

SH-SHY5Y 세포로부터의 용해물 및 마우스 브레인 조직(SNpc and ST)에서의 단백질 마커를 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. 간략하게, 농도를 결정한 후, 8%, 10% 또는 15% 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 젤 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)에 의해 단백질 시료(20 μg)를 분리하였다. 이후, 젤 상에서 분리된 단백질을 Trans-Blot Turbo 트랜스퍼 시스템(Bio-Rad, USA)을 이용하여 45분 동안 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene fluoride; PVDF) 막 상에 옮겼다. 0.1% Tween 20 함유 트리스-완충된 염수(Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20, TBST)에서 5분 동안 세척한 후, TBST 완충액에 용해시킨 5% 스킴밀크로 상기 막을 차단하였다. 상기 막을 래빗으로부터 유래한 단클론 일차 항체(anti-GAPDH, anti-AMPK, anti-p-AMPK, anti-ULK, anti-p-ULK555, anti-Erk, anti-p-Erk, anti-mTOR, anti-p-mTOR, anti-LC3B, anti-TH 및 anti-α-synuclein antibodies를 포함)와 추가로 인큐베이션하였다. 일차 항체는 차단 완충액에서 1:1000 비율로 희석하여 4℃에서 밤새도록 인큐베이션하였다. 둘째날, 막을 TBST로 3회 세척하고(각 10분), 실온에서 incubated in horseradish peroxidase-결합된 goat anti-rabbit IgG 이차 항체(차단 완충액에 1:2000의 비율로 희석)에 인큐베이션하였다. 1시간 동안 이차 항체에서 인큐베이션 후, 30분 동안 막을 세척하였다. 막 상의 단백질 블롯을 ECL 검출 키트로 현상하고, LAS-4000 미니 시스템(Fujifilm, Japan)을 사용하여 가시화하였다. 단백질 블롯의 세기는 다중 게이지 소프트웨어(Multi Gauge software, Fujifilm, Japan)로 정량하였다.

실험예 9: 통계학적 분석

본 발명에서 모든 데이터는 GraphPad Prism 7 소프트웨어(GraphPad Software, CA, USA)로 분석하여 평균 ± SEM로 나타내었다. 통계적 분석은 일원변량분석(one-way analysis of variance; ANOVA) 또는 스튜던트 티 테스트(Student's t-test)를 사용하여 수행하였다. P < 0.05의 값은 통계적 유의성을 고려하였다.

실시예 1: 추출, 분리 및 동정

건조 벌개미취(A. koraiensis, 15 kg)를 분쇄하여 95% 에탄올로 65℃에서 3시간 동안 추출하였다. 추출된 용액을 진공건조하여 분말화된 추출물(1.7 kg, 수율 11.3%)을 수득하였다. 이어서, n-헥산, 에틸아세테이트, 및 n-부탄올로 분획하여 3종의 분획물(각각 149 g, 175 g, 및 190 g)을 획득하였다. 생물학적 평가에 따라, n-부탄올 분획(1.4 g)을 등용매 조건(isocratic condition, CH₃CN/H₂O, 7:18, 유속 10.0 mL/min) 하에 분취 HPLC로 크로마토그래피하여 생리활성 분획(bioactive fraction, t _R=33.0분)을 획득하였다. 획득한 분획을 Sephadex LH-20 컬럼(2.8 cm x 100 cm, CH₃OH, 유속 0.25 mL/min)으로 분리하여 아스터사포닌 I (화합물 1, 34.6 mg, t _R=800분)을 수득하였다.

흰색 분말;

[α]²⁰ _D -18.0 (c 0.01, CH₃OH);

IR υ_max (ATR) 3392, 2916, 2850, 1637, 1571, 1416, 1088 cm^-1;

ECD (c 0.1 mM, CH₃CN) Δε +3.1 (203);

¹H 및 ¹³C NMR, 하기 표 1 참조;

HRESIMS m/z 1487.68823 [M + H]⁺ (calcd for C₆₈H₁₁₁O₃₅, 1487.69004).

아스터사포닌 I은 백색의 무정형 분말로 분리되었다. IR 데이터는, 각각 히드록시기 및 카보닐기를 나타내는, 3368 및 1657 cm^-1에서 흡수 밴드를 나타내었다(도 1). UV 데이터는 공액(conjugation)이 거의 없는 테르펜에 기인하는 205 nm에서의 말단 흡수만을 나타내었다(도 2). 분자식은 HR-MS 데이터에 기초하여 C₆₈H₁₁₀O₃₅로 추론되었으며, 분절 패턴(fragmentation patterns, m/z 1487, 1355, 1209, 1077, 945, 799, 667, 및 505)은 트리테르펜 아글리콘(triterpene aglycone)이 7개 당 단위와 함께 존재함을 나타내었다(도 3). ¹H 및 ¹³C NMR 데이터는 아글리콘(aglycone) 및 당 단위에 대한 특징적인 신호를 나타내었다(상기 표 1, 도 4 및 도 5 참조). 올레아난 타입(oleanane-type) 트리테르페노이드(triterpenoid)를 가리키는 ¹³C NMR 스펙트럼에서 3개의 공명(δ_C 180.1, 144.7, 및 123.7)과 더불어(도 4), 6개의 구별되는 메틸 단일선들(singlets, δ_H 1.38, 1.31, 1.27, 0.98, 0.95, 0.89, 및 0.80) 및 올레핀성 메틴(olefinic methine) 신호(δ_H 5.38)가 ¹H NMR 스펙트럼에서 관찰되었다(et al.,). Furthermore, 2개의 옥시메틴(oxymethine) 신호(δ_H 4.49 및 4.33) 및 하나의 옥시메틸렌(oxymethylene) 신호(δ_H 3.63 및 3.24)가 관찰되었으며, HSQC, COSY, 및 HMBC 상관관계는 2개 옥시메틴 그룹이 C-2 및 C-16에 위치하는 한편, 옥시메틸렌 그룹이 C-23에 존재함을 나타내었다(도 6 내지 9). 결과적으로, 아글리콘은 폴리갈락산(polygalacic acid)으로 결정되었다. ROESY 상관관계 및 이전에 공지된 NMR 데이터와의 비교에 의해 아글리콘의 상대적인 배열(relative configuration)을 추론하였다(도 6 및 도 10).

ECD 계산을 이용하여 절대 배열(absolute configuration)을 결정하였다. 화합물 1에 대해 측정된 CD 스펙트럼은 203 nm에서 양의 코튼효과(cotton effect; CE)를 나타내었다(Δε= +3.1). 상기 코튼 효과는 2β,3β,16β,23-테트라히드록시-올레안-12-엔-28-오익 애시드 메틸-에스테르(2β,3β,16β,23-tetrahydroxy-olean-12-en-28-oic acid methyl-ester; 메틸-폴리갈라케이트)에 대한 값과 유사하였다(Δε= +1.84 at 209 nm). 화합물 1에 대해 측정된 CD(circular dichroism) 스펙트럼은 이론적 ECD 스펙트럼과 잘 맞았다(도 11). 이 외에, 7개 당의 아노머 탄소(δ_C 93.8, 102.8, 101.3, 105.1, 106.2, 106.3, and 105.3)와 연관된, 당의 아노머 양성자(anomeric proton)에 대한 7개 특징적인 피크가 4.40 ppm과 5.70 ppm 사이의 범위에서 관찰되었다[δ_H 5.63 (br d, J = 3.0 Hz), 5.14 (br d, J = 1.5 Hz), 5.00 (br d, J = 1.5 Hz), 4.74 (br d, J = 8.0 Hz), 4.51 (br d, J = 7.5 Hz), 4.50 (br d, J = 7.5 Hz), and 4.49 (br d, J = 7.5 Hz)]. 이들 커플링 상수 및 화학적 이동(chemical shift)은 7개 당 단위가 하나의 α-아라비노스(α-arabinose, Ara), 2개의 α-람노스(α-rhamnose, Rha I 및 Rha II), 3개의 β-자일로스(β-xylose, Xyl I, Xyl II, 및 Xyl III), 및 하나의 β-글루코스(β-glucose, Glc)임을 나타내었다. TOCSY 및 HSQC-TOCSY 상관관계 각 당 단위의 ¹H 및 ¹³C NMR 신호의 분류(grouping) 및 전체적인 지정(overall assignment)을 가능하게 하였다(도 12 및 13). HR-MS/MS(고해상도 질량/질샹 분석기) 데이터에 의해 당의 적절한 결합 순서를 추론하였다(도 3). ¹H NMR 스펙트럼에서 아랫장(downfield shift)으로의 이동 및 아노머 양성자로부터 관련된 탄소로의 HMBC 상관관계로 당 단위의 정확한 위치와 순서를 확인하였다(도 6A). 이전에 보고된 바에 따르면, 화합물 1의 구조는, β-자일로스(β-xylose)에 의한 β-아피오스(β-apiose)의 치환을 제외하고는, 코니자사포닌 K(conyzasaponin K)의 구조와 유사하였다. 산성 가수분해(acid hydrolysis) 및 HPLC를 이용한 표준 시료와의 비교 연구는 이들 당 유닛이 L-아라비노스(L-arabinose), L-람노스(L-rhamnose), D-자일로스(D-xylose), 및 D-글루코스(D-glucose)임을 나타내었다(도 14). 따라서, 그 구조는 3-O-β-D-자일로피라노실-(1→3)-β-D-글루코피라노실폴리갈락산 28-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-β-D-자일로피라노실-(1→4)-[β-D-자일로피라노실-(1→3)]-α-L-람노피라노실-(1→2)-α-L-아라비노피라노실 에스테르(3-O-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-glucopyranosylpolygalacic acid 28-O-α-L-rhamnopyranosyl- (1→3)-β-D-xylopyranosyl-(1→4)-[β-D-xylopyranosyl-(1→3)]-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl ester)로서 결정되었으며, 이를 아스터사포닌 I(astersaponin I)로 명명하였다(도 15).

실시예 3: ECD 계산

구조적 분포(conformational distribution), 최적화(optimization) 및 에너지 계산을 포함한 모든 계산적 방법(computational methods)은 기존에 공지된 방법에 따라 실시하였다(J. Nat. Prod., 2016, 79(6): 1689-1693). 구체적으로, MMFF 분자동력학장(molecular mechanics force field) 하에 스파르탄'14 소프트웨어(Spartan'14 software)에서 시행되는 절차를 이용하여 구조적 검색(searches)을 수행하고, 기하학 최적화(geometry optimizations)를 위한 이형태체(conformers)를 선택하였다. 기하학 최적화는 가우시안 09 패키지(Gaussian 09 package)를 이용하여 B3LYP/6-31+G(d,p) 수준에서 DFT 계산으로 수행되었다. MeCN에서의 CPCM 용매 모델을 가지고 CAM-B3LYP/SVP 수준에서 최적화된 이형태체에 대한 TDDFT ECD 계산을 수행하였다. 계산된 ECD 스펙트럼을 0.3 eV의 반높이띠너비(half bandwidth)로 시뮬레이션하고, SpecDis 1.64 소프트웨어로 ECD 곡선을 생성하였다. ECD 스펙트럼은 UV 보정 후 볼츠만 분포에 의해 가중되었다.

실시예 4: 자가포식 유도 어세이 ( Autophagy Induction Assay)

벌개미취(A. koraiensis)의 자가포식 유도 효과를 확인하기 위하여, 인간 신경아세포종(neuroblastoma, SH-SY5Y) 세포를 5% CO₂ 함유 습윤 대기 하에 37℃에서 8×10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 2 mL의 DMEM 배지(Gibco)로 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, 세포를, 실시예 1에 따라 준비한, 벌개미취의 에탄올 추출물(12.5, 25 및 50 μg/mL), 이의 n-BuOH 분획물(12.5, 25 and 50 μg/mL), 및 상기 분획물로부터 분리한 화합물 1(5, 10 및 20 μM)로 각각 처리하였다. 24시간 더 배양한 후, 세포를 회수하고 RIPA 용해 완충액(RIPA lysis buffer, Cell signaling)으로 용해시켰다. 세포 용해물 중의 LC3-II의 단백질 발현을 웨스턴 블롯 분석을 이용하여 측정하였다. 래빗 항-LC3B 일차 항체 및 고트 항 래빗 호스래디쉬 퍼록시다제-결합된 IgG 이차 항체(모두 Cell signaling)를 이용하여 LC3 발현을 검출하였다. 면역-블롯을 ECL 검출 키트로 가시화하고 LAS-4000 미니 시스템(Fujifilm)으로 분석하였다.

SH-SY5Y 세포에서 LC3-II/LC3-I 비율을 분석하여 자가포식에 대한 상기 추출물, 분획물 및 아스터사포닌 I(1)의 향상 효과를 확인하였다. LC3-I으로부터 LC3-II으로의 전환은 자가포식소체(autophagosome) 형성에 불가피한 과정이므로 LC3-II/LC3-I 비율은 자가포식 활성화에 대한 표지자로 널리 사용되고 있다. 도 16에 나타난 바와 같이, 에탄올 추출물 및 n-BuOH 분획물의 처리는 LC3-II/LC3-I 비율을 량 의존적으로 현저하게 증가시킨 반면, n-헥산 및 에틸아세테이트 분획물은 LC3 발현에 대해 효과를 나타내지 않았다(도 16A). 흥미롭게도, 화합물 1의 처리는 LC3-II/LC3-I 비율에서 용량 의존적인 증가를 유도하였으며(도 16B), 이는 자가포식소체 형성 및 자가포식 활성화의 정도를 나타낸다. 종래 연구는 진세노사이드를 포함한 몇몇 트리테르펜 사포닌이, 주로 암과 관련된, 수종 세포주에서 자가포식을 향상시킬 수 있다고 보고하였다. 그러나, 자가포식은 파킨슨병(Parkinson's disease, PD)과 같은 다양한 신경퇴행성 질환의 조절에서도 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 화합물 1이 자가포식 유도를 통해 PD에 대한 보호 효과를 나타내는지 확인하기 위하여 추가적인 기계적 연구가 요구된다.

기존의 아스터사포닌들의 생물활성으로는 항암(antitumor), 거담(expectorant) 및 진해(antitussive) 활성이 알려진 반면, 종양세포 또는 신경세포에서 아스터사포닌 및 코니자사포닌의 자기포식 유도 효과는 알려진 바 없다. 또한, 벌개미취로부터 분리된 아스터사포닌에 대해 보고한 문헌은 없었다. 아스터사포닌들은 주로 아스터 타타리쿠스(Aster tataricus, 개미취)에 존재하는 것으로 보고되었다(J. Nat. Prod., 2016, 79: 1689-1693). 아스터사포닌 I은 벌개미취로부터 보고된 최초의 사포닌이며, 벌개미취의 자가포식 유도 성분 역시 본 발명에서 최초로 보고되는 것이다.

실시예 5: mTOR-의존적 자가포식 신호전달 경로에 대한 AKNS 시료의 효과

AKNS 시료의 자가포식-유도 효과(autophagy-inducing effects)를 연구하기 위하여, SH-SY5Y 세포를 다양한 농도의 AKNS 시료로 처리하였다(AKNS 추출물: 12.5, 25, 또는 50 μg/mL; AKNS n-BuOH 분획물: 12.5, 25, 또는 50 μg/mL; AKNS-2: 5, 10, or 20 μM; AKNS-2의 화학적 구조는 도 15에 개시). 24시간 동안 처리 후, 자가포식-관련 단백질 마커의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. 도 17A에 나타난 바와 같이, AKNS 추출물은 12.5, 25 및 50 μg/mL 농도에서 LC3-II 수준을 현저히 증가시켰으며, 대조군 조건과 비교하여, 25 및 50 μg/mL 농도의 AKNS 추출물로 처리시 p-AMPK는 눈에 띄게 향상되었고 p-mTOR 발현은 현저히 감소하였다. 추가적으로, p-Erk 및 p-ULK에서의 현저한 증가가 고용량(high dose, 50 μg/mL) AKNS 추출물 처리군에서 확인되었다.

유사하게, 도 17B에 나타난 바와 같이, 대조군 조건과 비교하여, 12.5, 25, 또는 50 μg/mL 농도의 AKNS n-BuOH 분획물은 용량 의존적으로 LC3-II 발현을 현저히 증가시켰다. p-Erk 및 p-ULK 발현에서의 현저한 증가가 50 μg/mL의 고농도에서 확인되었다. 또한, 대조군 조건과 비교하여, 25 및 50 μg/mL AKNS n-BuOH 분획물은 p-AMPK의 발현을 현저히 향상시키는 반면, p-mTOR 발현을 눈에 띄게 저해하였다.

다음으로, 단일 화합물(AKNS-2)의 자가포식-유도 효과를 확인하였다. 도 17C에 나타난 바와 같이, AKNS-2 처리는 SH-SY5Y 세포에서 용량 의존적 방식으로 주요한 자가포식 지시제인 LC3-II의 발현을 유도하였다. 또한, 10 및 20 μM 농도의 AKNS-2 처리는 p-Erk 발현을 현저히 증가시키는 한편, 5, 10, 및 20 μM AKNS-2의 처리는 p-AMPK 및 p-ULK 발현에서 현저한 증가를 유도하였다. p-mTOR 발현은 10 및 20 μM AKNS-2에 의해 저해되었다. 이러한 결과는 AKNS 시료가 AMPK/mTOR 경로 및/또는 Erk/mTOR 경로를 활성화함으로써 자가포식을 상향조절 할 수 있음을 나타낸다.

실시예 6: 자가포식 억제제에 의한 SH-SY5Y 세포에서 AKNS-2-활성화된 자가포식 차단효과

3-메틸아데닌(3-Methyladenine; 3-MA)은 자가포식소체(autophagosome)의 형성을 저해한다. AKNS-2에 의해 유도되는 자가포식 활성화를 확인하기 위하여, 3-MA(5 mM)를 이용하여 SH-SY5Y 세포를 10 μM AKNS-2로 처리하기 전 30분 동안 자가포식소체 축적을 방해하였다. 그 결과 10 μM AKNS-2는 LC3-II 발현을 현저히 증가시켰으나(도 18A에 나타난 바와 같이), 이러한 향상은 3-MA에 의해 눈에 띄게 저해되었다; p62 역시 자가포식에서 중요한 역할을 하며, 이는 LC3-상호작용 영역(LC3-interacting region; LIR)이라 불리는 영역을 통해 LC3에 결합하고 자가포식이 활성화될 때 분해될 수 있다. 흥미롭게도, AKNS-2 또한 p62 발현에서 현저한 감소를 유도하였고(도 18B), 3-MA 처리는 p62 수준에 대한 AKNS-2의 저해 효과를 눈에 띄게 차단하였다. 탠덤 형광 단백질 소광(quenching) 어세이에서, GFP-RFP-LC3-II 반점(puncta)의 축적(도 18C)을 Thermo Fisher Scientific(MA, USA)으로부터의 자가포식 센서로 평가하였다. 대조군 세포에 비해 AKNS-2단독으로 처리한 감염된 세포에서 녹색 형광 및 빨간색 형광으로 염색된 보다 많은 세포질체(cytoplastic) 반점이 관찰되었다. AKNS-2가 자가포식을 향상시키는 것을 확인하기 위하여, 감염된 세포를 AKNS-2와 보르트만닌(wortmannin; Wart; 50 nM) 또는 바필로마이신 A₁(bafilomycin) A₁; Baf; 100 nM)을 함께 처리하였다. 녹색 및 빨간색 LC3-II 반점의 AKNS-2-향상된 축적은 Wart에 의해 감소되는 반면, Baf는 녹색 형광은 증가시키고 빨간색 형광은 감소시켰다. 이는 AKNS-2이 자가포식을 활성화함을 나타내는 것이다.

실시예 7: AKNS-2에 의한 자가포식 활성화를 통한 MPP ⁺ -유도 신경독성으로부터의 SH-SY5Y 세포 보호 효과

MPP⁺-유도된 in vitro PD 모델에 대한 AKNS-2의 보호 효과를 확인하고자 하였다. 도 19A는 MTT 어세이에 의해 AKNS-2가 40 μM의 높은 농도까지 세포 독성에 현저한 영향을 미치지 않았음을 나타낸다. MPP⁺ 및 AKNS-2의 작업 농도 역시 MTT 어세이로 결정하였다. 도 19B는 SH-SY5Y 세포를 다양한 농도의 MPP⁺ 로 처리했을 때, 2 mM 농도의MPP⁺ 는 세포 생존율을 현저히 감소시킴을 나타낸다. 이에 따라, in vitro PD 모델을 유도하기 위하여 2 mM의 MPP⁺를 사용하였다. 다음으로, MPP⁺ 유도된 신경 독성에 대한AKNS-2의 보호 효과를 테스트하였다. 간략하게, SH-SH5Y 세포를 다양한 농도의 AKNS-2로 처리하고, 1시간 후, 2 mM MPP⁺를 상기 세포에 첨가하였다. 처리 후 24시간에 세포 생존율을 검출하였다. 그 결과(도 19C), 5 및 10 μM AKNS-2가 2 mM MPP⁺에 의해 손상된 세포 생존율을 현저하게 향상시킴을 확인하였다.

AKNS-2가 자가포식을 활성화함으로써 MPP⁺-손상된 SH-SY5Y 세포에 대해 보호 효과를 발휘하는지 여부를 확인하기 위하여, 자가포식 억제제, 3-MA를 사용하여 AKNS-2에 의해 활성화된 자가포식을 차단하였다. AKNS-2 및 MPP⁺ 공처리군과가 비교하여, 3-MA-처리된 군은 LC3-II 발현을 현저히 저해(도 19D)하는 반면, p62는 MPP⁺에 의해 유도되는 저해(도 19E)를 나타내고, AKNS-2는 3-MA에 의해 회복되었다. 이에 따라, AKNS-2에 의해 활성화된 자가포식은 3-MA에 의해 차단되었다. 효소 타이로신 하이드록실라아제(tyrosine hydroxylase; TH)는 중추신경계(central nervous system)를 통해 발현된다. TH는 타이로신을, DA로 진행될 수 있는, L-3,4-디하이드록시페닐알라닌(L-3,4-dihydroxyphenylalanine; L-DOPA)으로 전환한다. TH는 DA 합성의 속도제한효소(rate-limiting enzyme)이다. 흥미롭게도, 자가포식을 저해하는 것뿐만 아니라, TH 발현에서의 MPP⁺-유도된 감소는 AKNS-2 처리에 의해 반전(도 19F)되었으며, AKNS-2의 이로운 효과는 3-MA 처리에 의해 폐지되었다.

실시예 8: AKNS-2에 의한 Erk/mTOR 경로 활성화를 통한 SH-SY5Y 세포에서의 자가포식 상향조절 및 MPP ⁺ 세포독성으로부터 보호 효과

Erk의 결핍이 자가포식을 부분적으로 저해할 수 있고, Erk의 활성화가 TSC에의 결합 및 이를 활성화함으로써 mTORC1을 저해하므로 자가포식을 상향조절한다는 것이 보고된 바 있다[19]. U0126은 키나아제 MEK1/2의 저해제이다. U0126은 Erk1/2의 활성화를 방지하며, 자가포식 유도에서 Erk의 역할을 연구하는데 사용될 수 있다. AKNS-2가 Erk/mTOR 신호 경로를 조절함으로써 자가포식을 활성화하는지 여부를 확인하기 위하여, SH-SY5Y 세포를 U0126(10 μM) 부재 또는 존재 하에 AKNS-2(5 및 10 μM)로 처리하였다. 24시간 동안 배양 후, 웨스턴 블롯 분석으로 자가포식의 유도 및 Erk-조절된 자가포식 경로에 관여하는 단백질의 발현을 평가하였다. 그 결과를 도 20 나타내었다. LC3-II 발현은 대조군 조건에 비해 AKNS-2(5 and 10 μM) 처리에 의해 현저히 증가되었다. AKNS-2 처리 30분 전에10 μM U0126을 첨가하였을 때, LC3-II 발현에서의 현저한 감소(도 20A)가 5 및 10 μM AKNS-2처리군 모두에서 관찰되었으며, 이는 AKNS-2-유도 자가포식이 U0126에 의해 저해되었음을 나타낸다. p-Erk에서의 현저히 증가된 발현(도 20B)이 대조군에 비해 5 및 10 μM AKNS-2 처리군 모두에서 관찰된 한편, 10 μM AKNS-2 처리된 세포에서 p-Erk의 증가된 발현은 10 μM U0126 투여에 의해 상당히 폐지되었다. 이후, p-mTOR 발현(도 20D)을 측정하였다. 대조군 조건과 비교하여, AKNS-2(10 μM)는 p-mTOR 발현을 현저히 저해하였으며, AKNS-2 처리 30분 전에 10 μM U0126 투여하였을 때, AKNS-2(5 및 10 μM)에 의해 유도되는 p-mTOR 발현의 억제는 상당히 회복되었다. AKNS-2(5 및 10 μM)는, 도 20C에 나타난 바와 같이, p-ULK555 발현을 현저히 향상시킨 반면, 10 μM U0126은 p-ULK에 대한 10 μM AKNS-2의 향상 효과를 폐지하였다. 이는 AKNS-2가 Erk/mTOR 경로를 활성화 함으로써 SH-SY5Y 세포에서 자가포식을 상향조절함을 나타낸다.

TH는 DA의 속도 제한 효소이다. α-시누클레인은 PD의 병리학적(pathologic) 특징의 하나인, LB의 주된 구성성분(primary constituent)이다. 본 발명은 SH-SY5Y 세포에서 MPP⁺-유도 신경독성에 대한 AKNS-2의 보호 효과를 연구하는 것을 목적으로 하였다. 세포 생존율을 MTT 어세이로 확인하였다. 도 20E의 결과는 5 및 10 μM의 AKNS-2가 2 mM MPP⁺에 의해 유도된 감소된 세포 생존율을 현저히 향상시키나, 이러한 향상은 U0126처리에 의해 폐지되었음을 나타낸다. 다음으로, LC3의 발현을 확인하였다(도 20F). 상기 결과는 U0126이 LC3-II 발현에 대한 AKNS-2(5 및 10 μM)의 향상 효과를 차단하였음을 나타낸다. 유사하게, AKNS-2 및 MPP⁺ 공처리에 의한 LC3-II 발현에서의 증가 또한 U0126 투여에 의해 폐지되었다. 이러한 결과는 AKNS-2가 세포 생존율을 향상시키고, AKNS-2가 Erk 신호전달을 조절함으로써 자가포식 및 세포 생존율을 향상시킴을 확인하였다. 또한, TH 발현(도 20G)은 2 mM MPP⁺에 의해 현저히 감소되는 한편, TH 감소는 5 및 10 μM 의 AKNS-2에 의해 회복될 수 있었다. AKNS-2 및 MPP⁺ 처리에 앞서 U0126를 투여하였을 때, TH 발현에 대한 AKNS-2의 향상 효과는 저해되었다. α-시누클레인 발현과 관련하여, 2 mM MPP⁺는 SH-SY5Y 세포에서 α-시누클레인 발현을 현저히 증가시켰고(도 20H), AKNS-2 처리는 MPP⁺의 영향을 상쇄시키고 α-시누클레인 발현을 저해하였다. 흥미롭게도, 상기 보호 효과는 U0126의 존재에 의해 차단되었다. AKNS-2 TH 및 α-시누클레인의 변화된 발현을 반전시키고 SH-SY5Y 세포에서 MPP⁺ 처리에 의해 감소된 세포 생존율을 향상시켰다. 그러나, 이러한 보호 효과는 Erk 신호전달 경로를 차단함으로써 자가포식을 교란하여 저해될 수 있었다. 이는 AKNS-2가 Erk 신호를 조절하여 자가포식을 활성화함으로써 MPP⁺ 유도 세포독성에 대해 보호 효과를 발휘함을 나타내는 것이다.

실시예 9: AKNS-2에 의한 AMPK/mTOR 경로 활성화를 통한 SH-SY5Y 세포에서의 자가포식 상향조절 및 MPP ⁺ 세포독성으로부터의 보호 효과

AMPK 활성화는 TSC1/2의 활성화를 유도하고, 그에 따라, 궁극적으로 ULK1및 자가포식을 활성화하는, TOR 활성제(activator) Rheb의 불활성화를 통해 mTOR 활성을 저해한다. 몇몇 세포에서, ULK1의 녹아웃은 자가포식 유도를 차단하며, 이는 ULK1이 자가포식 진행(progression)에 원인이 됨을 나타낸다. AKNS-2가 AMPK/mTOR 경로를 조절함으로써 자가포식을 상향조절하는지 여부를 확인하기 위하여, AMPK siRNA(50 nM)를 이용하여 SH-SY5Y 세포에서 AMPK 신호전달을 교란하고, 이후 SH-SY5Y 세포를 AKNS-2(5 및 10 μM)로 처리하였다. AKNS-2 처리 24시간 후, LC3, AMPK, mTOR 및 ULK를 포함하는, 자가포식을 조절하는 AMPK/mTOR 신호전달 경로에 관여하는 대표적인 단백질 마커를 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. 대조군에 비해 AKNS-2 처리군에서 LC3-II(도 21A), p-AMPK(도 21B) 및 p-ULK555(도 21C)에서의 현저한 증가가 관찰되었다. LC3-II, p-AMPK 및 p-ULK555의 AKNS-2-향상된 발현은 정상 AKNS-2-처리 SH-SY5Y 세포에 비해 AMPK siRNA-감염된 SH-SY5Y 세포에서 크게 감소하였다. 또한, AKNS-2는 p-mTOR 발현을 현저히 저해하였으나(도 21D), 상기 저해는 AMPK 신호전달의 교란에 대응하여 폐지되었다.

다음으로, AKNS-2가 MPP⁺-유도 세포독성으로부터 SH-SY5Y 세포를 보호하는지 여부를 확인하고, 상기 보호에 있어서 AMPK-매개 자가포식의 역할을 규명하고자 하였다. SH-SY5Y 세포를 50 nM AMPK siRNA로 감염시킨 후, 상기 세포를 2 mM MPP⁺ 부재 또는 존재 하에 AKNS-2(5 및 10 μM)로 처리하였다. MTT 어세이에 의해 세포 생존율을 테스트하고, 그 결과를 도 21E에 나타내었다. 그 결과, 대조군과 비교하여 MPP⁺ 처리에 따라 현저히 감소된 세포 생존율이 관찰되었으며, AKNS-2(5 및 10 μM)는 세포 생존율에 대한 MPP⁺의 효과를 반전시켰다. AMPK siRNA-감염된 SH-SY5Y 세포의 생존율은 ANKS-2 및 MPP⁺ 존재 하의 정상 SY-SY5Y 세포에 비해 현저히 더 낮았다. 단백질 마터의 발현과 관련하여, 정상 SH-SY5Y 세포에서 LC3-II 발현(도 21F)은 AKNS-2(5 및 10 μM)에 의해 눈에 띄게 향상되었으나, AMPK siRNA-감염된 세포에서 LC3-II 수준은 AKNS-2존재 하의 정상 SH-SY5Y 세포에 비해 현저히 더 낮았다. 유사하게, LC3-II 발현은 정상 세포에 비해 AKNS-2 및 MPP⁺ 공처리 후의 siRNA-감염된 세포에서 현저히 감소하였다. 나아가, TH 발현(도 21G)은 MPP⁺ 투여에 의해 현저히 감소하였으며, AKNS-2 처리가 MPP⁺의 독성을 상쇄시키고 TH 발현을 반전시켰다. 흥미롭게도, TH 발현에서의 AKNS-2-매개된 개선은 AMPK siRNA에 의해 폐지되었다. MPP⁺는 α-시누클레인 발현을 현저히 증가시켰으며(도 21H), α-시누클레인 수준의 증가는 정상세포에서 AKNS-2에 의해 억제되었다. 그러나, AMPK siRNA-감염된 세포에서, AKNS-2에 의한 α-시누클레인의 억제는 폐지되었다. 이는 AKNS-2가 AMPK 신호전달을 조절함으로써 자가포식을 상향조절하며, 활성화된 자가포식이 MPP⁺-유도된 독성으로부터 SH-SY5Y 세포를 보호함을 나타내는 것이다.

실시예 10: AKNS-2에 의한 MPTP-유도된 in vivo PD 모델의 행동성과(behavioral performance) 개선 효과

본 발명자들은 또한 MPTP-유도된 in vivo PD 모델에 대한 AKNS-2의 보호 효과를 테스트하였다(도 22A 내의 개략도). 먼저, 회전막대 테스트, 장대 테스트 및 매달리기 테스트를 이용하여 MPTP-손상된 행동 수행능(behavioral performance)에 대한 AKNS-2의 효과를 테스트하였다. 훈련 후, 8일 연속 매일 MPTP를 마우스에 투여하였다. 마지막 MPTP 투여 후 2시간, 24시간 및 48시간 후에 회전막대 테스트, 장대 테스트 및 선 매달리기 테스트에서 행동 수행능을 테스트하였다. 회전막대 테스트에서 마우스 행동 수행능은 투여 후 2시간 및 24시간 후의 정상군과 비교하여 MPTP-처리군에서 상당히 손상되었으나, 이러한 손상은 2시간 및 24시간에 5 mg/kg 로피니롤(ropinirole) 및 15 mg/kg AKNS-2 투여에 의해 반전되었다. 5 mg/kg AKNS-2로의 처리는 24시간에서의 회전막대 테스트에서 MPTP-손상된 수행능을 현저히 향상시켰다. 48시간에는, 모든 마우스의 수행능이 정상 수준으로 회복되었다(도 22B). MPTP 처리는 주입 후 2시간에서의 장대 테스트에서 수행능을 상당히 손상시켰다. 그러나, 상기 손상된 수행능은 2시간에 로피니롤 및 AKNS-2 투여(5 및 15 mg/kg)에 의해 상당히 개선되었다. MPTP 주입 후 24시간 및 48시간에 모든 군에서 현저한 차이는 나타나지 않았다(도 22C). 선 매달리기 테스트에 대해, 대조군 조건과 비교하여, MPTP 주입은 2시간 및 24시간에서 낙하 잠재기(latency)를 현저히 감소시켰다. 48시간에서, 잠재기에서 MPTP-유도된 감소는 선훈련에서의 수준까지 회복되었다. 양성대조군 로피니롤(5 mg/kg)은 2시간에 MPTP에 의해 손상된 잠재기를 상당히 향상시킨 한편, 선 매달리기 테스트에서 손상된 수행능은 2시간 및 24시간에서 15 mg/kg AKNS-2에 의해 현저히 향상되었다(도 22 D).

실시예 11: MPTP 투여에 의해 손상된 마우스에 대한 AKNS-2의 보호 효과

DA는 뇌에서 다른 신경세포로 신호를 전달하는 신경전달물질(neurotransmitter)이다. 나아가, 도파민작동성 신경 손상(dopaminergic neuron damage)은 DA의 손실을 유도하여, PD의 운동 증상(motor symptoms)을 유발한다. ELISA 키트(Abnova, Taipei City, Taiwan)를 이용하여 ST에서 DA 수준을 측정하였다. 그 결과(도 23A)는 ST에서 DA 수준이 30 mg/kg MPTP 투여에 의해 현저히 감소됨을 나타내었다. 흥미롭게도, DA에서의 MPTP-유도된 감소는 로피니롤(5 mg/kg) 및 AKNS-2(15 mg/kg)에 의해 회복되었다. 이는 AKNS-2가 MPTP에 의해 유도되는 손상으로부터 도파민작동성 신경을 보호함을 나타내는 것이다.

MPTP는 신경교세포(glial cells)에서 MAO-B에 의해 MPP⁺로 전환될 수 있고, MPP⁺는 도파민작동성 신경을 손상시키는 실질적 독소(actual toxin)이다. MAO-B 억제제는 MAO-B의 작동을 차단함으로써 MPTP의 MPP⁺로의 대사(metabolism)를 방지한다. 본 발명은 MAO-B 활성을 억제함으로써 MPTP의 독성으로부터 도파민작동성 신경을 보호할 수 있는지 여부를 규명하고자 하였다. SN 및 ST에서 MAO-B 활성을 MAO-B 어세이 키트(Promega, Woods Hollow Road Madison, USA)로 검출하였다. 그 결과는 MPTP(30 mg/kg)가 ST(도 23B) 및 SN(도 23C) 모두에서 MAO-B 활성을 현저히 향상시키는 것으로 나타났다. 그러나, AKNS-2(5 및 15 mg/kg)는 ST 및 SN 모두에서 MPTP-향상된 MAO-B 활성을 감소시키지 못하였다. 이는 AKNS-2가 효율적인 MAO-B 억제제가 아니며, MPTP-손상된 마우스에 대한 AKNS-2의 보호 효과는 MAO-B 억제에 의한 것이 아님을 나타낸다.

MPTP-유도된 PD 모델은 도파민작동성 신경에서 TH가 감소하는 것을 특징으로 한다. LBs는 PD의 병리학적 특성 중 하나이며, α-시누클레인은 LBs의 주요 구성성분이다. 본 발명에서는 웨스턴 블롯 분석에 의해 MPTP-손상된 마우스의 ST 및 SN에서 TH 및 α-시누클레인의 발현을 측정하였다. 도 23D는 ST 및 SN에서 TH 및 α-시누클레인의 대표적인 면역블롯(immunoblots)을 나타낸다. TH 수준은 ST(도 23E) 및 SN(도 23F) 모두에서 정상 대조군에 비해 MPTP-처리된 군(30 mg/kg)에서 현저히 감소되었다. 흥미롭게도, ST 및 SN에서 TH 수준의 감소는 양성 대조군 로피니롤(5 mg/kg) 및 5 및 15 mg/kg AKNS-2의 투여에 의해 상당히 반전되었다. 도 23G 및 도 23H에 나타난 바와 같이, α-시누클레인 수준은 ST 및 SN 모두에서 MPTP 투여에 의해 현저히 증가하였으며, α-시누클레인 수준의 현저한 감소는MPTP와 비교하여 5 mg/kg의 양성대조군 로피니롤과 관찰되었다. 또한, α-시누클레인 수준에서 눈에 띄는 감소가 MPTP-처리된 마우스와 비교하여 AKNS-2-처리된 마우스(5 and 15 mg/kg)의 ST 및 SN 에서도 확인되었다.

실시예 12: MPTP-유도된 in vivo PD 모델에서 AKNS-2에 의한 자가포식 유도

AKNS-2는 SH-SY5Y 세포에서 자가포식을 유도하며, 이는 자가포식 활성화를 통해 MPP⁺-유도된 세포독성으로부터 세포를 보호한다. 본 발명의 MPTP-유도된 in vivo PD 모델에서, 자가포식 조절에 대한 AKNS-2의 효과를 확인하고자 하였다. AKNS-2 및 MPTP로 처리 후 7일차에, ST 및 SN에서 자가포식-관련된 단백질 마크들을 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. 도 23A 및 도 23B는 각각 ST 및 SN에서 단백질 마커들의 대표적인 면역블롯 및 상대적인 세기를 나타낸다. 이는 MPTP가 어느 정도까지 LC3-II 발현을 향상시키나, ST 및 SN에서 눈에 띄는 차이는 관찰되지 않음을 나타낸다. MPTP 처리와 비교하여, 15 mg/kg AKNS-2 처리는 ST에서 LC3-II 발현의 현저한 증가를 유도하였다. 눈에 띄는 차이는 관찰되지 않았음에도 불구하고, 향상된 LC3-II 발현이 15 mg/kg AKNS-2-처리군의 SN에서 관찰되었다. 정상군과 비교하여, MPTP-처리군은 ST에서 p62 발현의 현저한 감소를 나타내었고, 현저히 감소된 p62 수준은 MPTP-처리군과 비교하여 5 및 15 mg/kg AKNS-2-처리군의 ST 및 SN 모두에서 관찰되었다. 추가적으로, MPTP는 ST 및 SN 둘 모두에서 p-AMPK 발현 수준을 증가시켰다. MPTP처리와 비교하여, 로피니롤 및 AKNS-2로의 처리는 ST 및 SN 모두에서 p-AMPK의 현저한 증가를 유도하였다. 나아가, ST 및 SN에서 p-Erk 발현은 대조군 조건과 비교하여 30 mg/kg MPTP 처리에 의해 감소되었으며, MPTP 처리와 비교하여 15 mg/kg AKNS-2 처리에 의해 현저히 향상되었다. p-Erk 발현과 유사하게, ST 및 SN에서 p-ULK 수준은 MPTP 투여에 의해 눈에 띄게 감소하였으며, 로피니롤 및 AKNS-2(5 및 15 mg/kg) 처리는 MPTP의 효과를 상쇄시키고 ST 및 SN에서 p-ULK 발현을 현저하게 향상시켰다. 또한 본 발명자들은 마우스에서 p-mTOR 발현을 측정하였으며, ST 또는 SN에서 정상 및 MPTP-처리군 간의 어떠한 유의한 차이도 나타나지 않았다. 로피니롤 및 AKNS-2은, 어떠한 눈에 띄는 감소가 관찰되지 않았음에도 불구하고, ST에서 p-mTOR 발현을 감소시키는 경향을 명확히 나타내었다. SN에서, p-mTOR의 현저한 감소가 로피니롤 및 AKNS-2-처리군에서 확인되었다.

Claims (12)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
   [화학식 1]
   

   

   .
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 벌개미취(Aster koraiensis)의 추출물로부터 분리된 것인, 화합물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 벌개미취의 에탄올 추출물로부터 분리된 것인, 화합물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 벌개미취 추출물의 부탄올 분획물로부터 분리된 것인, 화합물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 화합물은 세포에서 자가포식 유도 활성을 나타내는 것인, 화합물.
   
6. 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
   [화학식 1]
   

   

   .
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병(Parkinson's disease; PD), 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 헌팅턴병(Huntington's disease; HD), 전측두엽 치매(Fronto-Temporal Dementia), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico Basal Degeneration), 및 진행성 핵상마비(progressive supranuclear palsy; PSP)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학 조성물.
   
8. 제6항에 있어서,
   상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병인 것인, 약학 조성물.
   
9. 제6항에 있어서,
   상기 신경퇴행성 질환의 예방 또는 치료는 자가포식 유도 작용을 통한 뇌세포 사멸 억제에 의해 달성되는 것인, 약학 조성물.
   
10. 제6항에 있어서,
    약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것인 약학적 조성물.
    
11. 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물:
    [화학식 1]
    

    

    .
    
12. 하기 화학식 1의 화합물, 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 신경퇴행성 질환의 예방 또는 개선용 사료 조성물:
    [화학식 1]
    

    

    .
    

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