KR20210109967A - 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물 - Google Patents
꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물 및 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물에 관한 것으로, 어류에서 높은 폐사를 유발하는 병원성 세균에 대하여 우수한 항균 활성이 있으며, 특히 항생제 내성 어병세균에 대해서도 우수한 항균활성을 보유하고 있다.
Description
본 발명은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물 및 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물에 관한 것이다.
수산양식업에 있어 전 세계적으로 문제가 되고 있는 수산양식생물 질병의 국내 발생 현황을 살펴보면, 1990년대 전반의 발병률이 5% 미만에 불과하던 것이 1990년대 후반부터는 15% 내외로 증가하고 있으며, 고수온기에 주로 발생하던 질병들이 연중 발생하는 추세에 있다. 그 중에서도 세균성 전염병의 발생 증가에 의한 양식 어류의 피해가 증대되고 있으며, 약제 오남용에 의한 내성균의 출현 증가로 치료 효과가 저하되고 있는 실정이다. 특히, 최근에 들어서는 국외로부터의 양식용 종묘의 수입량 증가로 인하여 신종 외래 전염병의 유입 위험성이 증대되고 있으며, 감염 종묘의 이동에 의한 질병의 확산이 우려되고 있다.
특히, 국내 산업적으로 중요한 넙치 및 조피볼락 등의 감염성 질병의 경우, 치어와 성어기에 주로 발병하는 감염성 질병에는 차이가 있는데, 100g 미만의 치어시기에는 스쿠티카증 (Scuticociliatosis), 아가미흡충증 (Gill flukes) 또는 활주세균증 (Flavobacteriosis)과 같은 감염성 질병이 흔하며, 주로 기생충성 질병으로 인한 피해가 심하다.
그러나, 300g 이상이 되는 성어의 경우 에드워드증 (Edwardsiellosis), 비브리오증 (Vibriosis), 연쇄상구균증 (Streptococcosis)와 같은 세균성 질병으로 인한 피해가 심하다.
이러한 세균성 질병을 제어하기 위해 현재 상용화되어 있는 백신이 존재하나, 주로 치어시기에 접종이 이루어져, 성어에 세균성 질병이 발생할 경우 항생제 외에는 특별한 치료법이 존재하지 않는 실정이다.
따라서, 이러한 세균성 질병을 치료하기 위해 양식장에서는 다량의 항생제를 사용하고 있으며, 경우에 따라서는 여러 항생제를 병용하여 사용하는 경우도 있다. 이러한 항생제의 빈용으로 어병세균에서의 항생제 내성 발현에 관한 보고들이 이어지고 있다.
특히, 양식넙치의 연쇄상구균에 대한 항생제 내성경향을 살펴보면 옥시테트라사이클린 (oxytetracycline)과 테트라사이클린 (tetracycline)에 대한 내성은 1999년도부터 2016년도까지 약 60% 정도의 꾸준한 항생제 내성을 나타내고 있다. 페니실린계 항생제에 대해서는 2004 내지 2005년도에는 70%의 내성률을 나타내어, 최근 5 내지 6년 사이에 항생제 내성률이 매우 높아짐을 알 수 있다.
즉, 지속적인 항생제 사용은 결국 내성을 유발하게 되고, 이는 광범위 신규 항생제로의 사용 확대로 이어질 수 밖에 없는 현실이며, 이는 수산양식의 지속가능성과 양식어의 식품안전성에 가장 큰 위협이 되고 있다. 따라서 수산양식분야에서 안전하고 효과적인 항생제 대체제의 개발이 시급한 실정이다.
천연소재를 이용한 항생제 대체제의 경우 기존 항생제 대비 생산 비용 증가가 약점으로 작용하기 때문에 저비용 생산 과정이 필요하며, 따라서 효능성분이 최대한 함유될 수 있는 최적의 추출물을 도출하는 것이 중요하다 할 수 있다. 이러한 공정을 개선하기 위해 본 발명에서는 실험계획법 (Design Of Experiment; DOE)의 일종인 반응 표면 분석법 (Response Surface Methodology; RSM)을 이용하여 소재의 타겟 활성을 극대화 시킨 추출조건을 도출하여 비용 대비 효율적인 추출물의 도출이 가능하도록 추출물의 제조 방법을 설계하였다.
꾸지뽕나무 (Cudrania tricuspidata Bureau)는 뽕나무과 (Moraceae)에 속하며, 한국, 일본, 중국 등 동아시아 전역에 널리 분포되어있는 낙엽 소교목 또는 관목이다. 꾸지뽕나무 잎과 열매는 식품원료로써 사용되며, 잎, 열매를 포함한 줄기 등 다른 부위는 약용으로도 사용되고 있다. 꾸지뽕나무 추출물은 항염증, 항고혈압, 항당뇨, 항산화, 항미생물활성 등이 알려져 있지만, 현재까지 어류 병원성 세균에 대한 항균활성은 보고된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물이 어류에서 높은 폐사를 유발하는 병원성 세균에 대하여 우수한 항균 활성이 있으며, 특히 항생제 내성 어병세균에 대해서도 우수한 항균활성을 보유하고 있음을 확인하였다. 또한, 반응표면분석법을 이용하여 꾸지뽕 열매로부터 항균활성이 최적화된 추출조건을 획득, 이로부터 최적화된 추출물을 확보하다.
이에, 본 발명의 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균 활성을 갖는 어류 사료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균 활성을 갖는 어류 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 이용한 어류 세균성 질병의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물의 어류 세균성 질병의 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물 및 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물에 관한 것이다.
꾸지뽕의 수피는 갈색 또는 회갈색으로 세로로 얕게 갈라지며, 가지에 껍질눈이 발달한다. 잎 겨드랑이에 잔가지가 변한 굵고 날카로운 가시가 있다. 어긋나게 달리는 잎은 난형으로 가장자리가 밋밋하며, 2 내지 3 갈래로 갈라지기도 한다. 양면에 털이 있으며, 잎자루에도 털이 있다. 암수딴그루로 5 내지 6월에 잎 겨드랑이에 연한 노란색의 꽃이 모여 달린다. 수꽃이삭은 둥글며 연한 털이 덮이고 수꽃에는 3 내지 5개의 화피조각과 수술이 4개가 있다. 암꽃이삭은 타원형으로 암꽃에는 암술대 2개가 실처럼 갈라진다. 열매는 취과로 단단하고 초록색이었다가 9 내지 10월에 약간 물렁해지면서 붉은색으로 익는다. 잎을 자르면 흰 액이 나오고 열매는 단맛이 난다. 우리나라 중부 이남의 산지 양지 바른 곳에서 자라는 낙엽활엽소교목 또는 관목이다.
본 발명에 있어서 용어 "꾸지뽕"은 꾸지뽕나무를 의미하는 것으로 "꾸지뽕"과 "꾸지뽕나무"는 동일한 의미인 것으로 해석한다.
본 발명에 있어서 꾸지뽕은 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 열매 또는 잎인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 꾸지뽕 열매는 미숙과 또는 성숙과인 것일 수 있으며, 예를 들어, 성숙과인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 용어 '미숙과'는 일반적으로 9월경에 채취하는 것으로, 색차계로 측정 시 redness(a*) -5 전후인 것을 의미한다.
본 발명에 있어서 용어 '성숙과'는 일반적으로 10월경에 채취하는 것으로 색차계로 측정 시 redness(a*) 25 전후인 것을 의미한다.
본 발명의 꾸지뽕 추출물을 꾸지뽕에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서 추출용매는 극성 용매 또는 비극성 용매인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 극성 용매는 물, 알코올, 아세트산, 디메틸 포름아미드 (dimethyl formamide; DMFO) 및 디메틸술폭시드 (dimethyl sulfoxide; DMSO)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 알코올은 탄소수 1 내지 5개의 직쇄 또는 분지형 알코올인 것일 수 있으며, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 추출용매로 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 10 내지 90%(v/v), 20 내지 90%(v/v), 30 내지 90%(v/v), 40 내지 90%(v/v), 50 내지 90%(v/v), 10 내지 80%(v/v), 20 내지 80%(v/v), 30 내지 80%(v/v), 40 내지 80%(v/v), 50 내지 80%(v/v)의 알코올 수용액인 것일 수 있으며, 예를 들어, 50%(v/v)의 탄소수 1 내지 5개의 직쇄 또는 분지형 알코올 수용액인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 비극성 용매는 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매 및/또는 분획용매는 탄소수 1 내지 5의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 물, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 꾸지뽕 추출물은 에탄올 수용액을 추출용매로하여 수득한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 '추출물'은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물 (crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다.
따라서, 본 발명의 꾸지뽕 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들어, 꾸지뽕 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 꾸지뽕 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명의 꾸지뽕 추출물은 감압 증류, 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 꾸지뽕 추출물은 상기한 추출용매뿐만 아니라, 다른 추출용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 본 발명의 추출물이 얻어질 수 다는 것은 당업자에게 자명한 것이다.
본 발명의 꾸지뽕 추출물은 추출용매와 함께 초음파 처리를 하여 추출물을 수득한 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 하기의 꾸지뽕 추출물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물에 포함된 꾸지뽕 추출물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 꾸지뽕 추출물은 용매 조추출물을 추가의 용매로 분획한 용매 분획물일 수 있으며, 예를 들어, 꾸지뽕 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 부탄올 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물일 수 있며, 예를 들어, 디클로로메탄을 용매로 사용한 용매 분획물인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 어류는 양식어류 또는 관상어인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 양식어류는 넙치, 우럭, 돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 가자미, 복어, 고등어, 노래미, 다랑어, 민어, 방어, 전갱이, 잉어, 숭어, 향어, 뱀장어, 메기, 미꾸라지 및 붕어로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 넙치 (Paralichthys olivaceus)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 관상어는 잉어류, 메기류, 금붕어류, 카라신류, 송사리류, 씨클리드류, 아나반티스류 및 난두스기수어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 세균은 그람 양성균 또는 그람 음성균인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 그람 양성균은 Streprococcus iniae, S. parauberis, Lactococcus garvieae, Staphylococcus epidermidis, Renibacterium salmoninarum, Nocardia seriolae 및 N. asteriodes로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, Streprococcus iniae, S. parauberis 및/또는 Lactococcus garvieae인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 그람 음성균은 Aeromonas hydrophila, A. salmonicida, Edwardsiella tarda, E. ictaluri, Flavofacterium columnare, Photobacterium damselae (or subsp. piscicida), Piscirickettsia salmonis, Pseudomonas anguilliseptica, P. fluorescens, Flexibacter maritimus, Vibrio alginolyticus, V. anguillarum, V. cholerae, V. harveyi, V. ichthyoenteri, V. ordalii, V. salmonicida, V. vulnificus 및 Yersinia ruckeri로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 어류 세균성 질병은 연쇄상구균증, 포도상구균증, 세균성신장병, 노카르디아병, 절창병, 에로모나스병, 에드워드병, 활주세균병, 류결절증, 적점병, 슈도모나스병 및 리케챠병, 비브리오병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 연쇄상구균증인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물은 플라보노이드계 (flavonoids) 또는 잔톤계 (xanthones)화합물, 또는 이의 유도체인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물은 하기의 화학식 1 내지 화학식 17로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 유도체인 것일 수 있다.
본 발명에 일 구체예에 있어서, 본 발명의 조성물은 하기의 화학식 1 내지 화학식 17로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 유도체를 포함하는 것일 수 있다:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 -H 또는 -OH이고,
R2는 -OH 또는 -OCH3이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H, 
또는 
이다.
[화학식 2]
상기 화학식 2에서,
R1은 -H 또는 -OH이고,
R2는 -OH 또는 -OCH3이고,
R3은 -H 또는 
이다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서,
R1은 -H 또는 -OH이고,
R2는 -OH이고,
R3은 -H 또는 
이다.
[화학식 4]
상기 화학식 4에서,
R1은 -H 또는 -OH이고,
R2는 -OH 또는 -OCH3이고,
R3은 -H 또는 -OCH3이고,
R4는-H 또는 
이다.
[화학식 5]
[화학식 6]
상기 화학식 6에서, R은 -H 또는 -OH이다.
[화학식 7]
[화학식 8]
[화학식 9]
[화학식 10]
[화학식 11]
[화학식 12]
[화학식 13]
[화학식 14]
[화학식 15]
[화학식 16]
[화학식 17]
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R1은 -OH이고, R2는 -OH이고, R3 및 R4는 -H인, 오로볼 (orobol)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R1은 -H이고, R2는 -OCH3이고, R3은 
이고, R4는 -H인, 잔카오닌 A (Gancaonin A)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R1은 -H이고, R2는 -OH이고, R3 및 R4는 
인, 6,8-디프레닐제니스테인 (6,8-Diprenylgenistein)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R1은 -OH이고, R2는 -OH이고, R3 및 R4는 
인, 6,8-디프레닐오로볼 (6,8-Diprenylorobol)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R1은 -H이고, R2는 -OCH3이고, R3은 
이고, R4는 -H인, 5,7-Dihydroxy-6-(2'피-hydroxy-3피-methylbut-3피-enyl)-4
-methoxylisoflavone인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R1은 -H이고, R2는 -OH이고, R3은 
이고, R4는 
인, Isoerysenegalensein E인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R1은 -H이고, R2는 -OH이고, R3은 
이고, R4는 -H인, Wighteone인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R1은 -H이고, R2는 -OH이고, R3은 
이고, R4는 
인, Erysenegalensein E인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 1에서 R1은 -OH이고, R2는 -OH이고, R3은 
이고, R4는 
인, Millewanin H인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 2에서 R1은 -H이고, R2는 -OCH3이고, R3은 -H인, 4'-O-Methylalpinumisoflavone인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 2에서 R1은 -OH이고, R2는 -OH이고, R3은 -H인, 5,3',4'-Trihydroxy-6'',6''-dimethylpyrano-[2'',3'';7,6]isoflavone인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 2에서 R1은 -OH이고, R2는 -OCH3이고, R3은 -H인, 3'-Hydroxy-4'-O-methylalpinumisoflavone인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 2에서 R1은 -H이고, R2는 -OH이고, R3은 
인, Euchrenone b8인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 3에서 R1은 -H이고, R2는 -OH이고, R3은 -H인, Derrone인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 3에서 R1은-OH이고, R2는 -OH이고, R3은 
인, 5, 3',4', 2'''-Tetrahydroxy-2'', 2''-dimethylpyrano-(5''6'':7,8)-6-(3'''-methyl-3'''-butenyl)isoflavone인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 4에서 R1은 -H이고, R2는-OCH3이고, R3은 -H이고, R4는-H인, 4'-O-Methylerythrinin C인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 4에서 R1은 -H이고, R2는 -OH이고, R3은 -OCH3이고, R4는-H인, (±)-1"-O-Methylerythrinin F인 것일 수 인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 4에서 R1은 -H이고, R2는 -OH이고, R3은 -H이고, R4는 
인, Euchrenone b10인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 4에서 R1은 -OH이고, R2는 -OH이고, R3은 -H이고, R4는 
인, Furowanin A인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 화학식 5의 화합물은 4'-O-Methyl-2''-hydroxydihydroalpinumisoflavone인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 6에서 R은 -H인, Senegalensin인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물은 상기 화학식 6에서 R은 -OH인, Furowanin B인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 7은 Macluraxanthone B인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 8은 Cudratricusxanthone A인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 9는 Gerontoxanthone I인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 10은 Macluraxanthone C인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 11은 Cudracuspixanthone E인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 12는 Alvaxanthone인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 13은 Cudraxanthone L인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 14는 Cudraxanthone M인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 15는 Aromadendrin인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 16은 8-prenylnaringenin인 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 화합물 17은 Cudraflavanone A인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 약제학적으로 허용되는 담체는 조제 시 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물의 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 예를 들어, 경구 투여로 투여하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 동물의 수령, 체중, 성, 병적 상태, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 예를 들면, 생체 1 ㎏ 당 본 발명의 조성물을 유효성분 함량 1 내지 300 ㎎이 되도록 하여 1 내지 10일에 1 내지 5회씩 복강주사 또는 경구 투여하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균 활성을 갖는 어류 사료용 조성물 또는 어류 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 어류 사료 또는 어류 사료 첨가용 조성물은 통상적으로 이용되는 다양한 성분과 함께 제조될 수 있다. 예를 들어, 해양 단백질 (예를 들어, 어분 또는 크릴밀), 식물성 단백질 (예를 들어, 콩분말, 밀 글루텐, 옥수수 글루텐, 루핀 분말, 완두콩 분말 또는 해바라기씨 분말), 혈분 및 골분을 포함하는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질원을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 어류 사료 또는 어류 사료 첨가용 조성물은 어류 기름 (예를 들어, 오징어간유) 또는 식물성 기름 (예를 들어, 평지씨 기름, 콩기름, 대두유)를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 에너지원, 비타민 혼합물 및 무기질 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물, 사료용 조성물 및 어류 사료 첨가용 조성물은 상기 항균 조성물을 포함하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에 또 다른 일 양태는 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제조 방법을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다:
꾸지뽕을 준비 하는 꾸지뽕 준비 단계; 및
꾸지뽕에 추출용매를 가하여 추출하는 용매추출 단계.
본 발명에 있어서 꾸지뽕은 뿌리, 줄기, 잎 및 열매를 모두 사용할 수 있으며, 예를 들어, 열매 또는 잎인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다
본 발명에 있어서 꾸지뽕 열매는 미숙과 또는 성숙과인 것일 수 있으며, 예를 들어, 성숙과인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 준비 단계는 꾸지뽕을 절단하는 단계, 세척하는 단계 및 건조하는 단계로 이루어진 군에서 선택된 1개 이상의 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 추출용매는 꾸지뽕 중량에 대하여 10 내지 50 부피배, 15 내지 50 부피배, 20 내지 50 부피배, 25 내지 50 부피배, 10 내지 45 부피배, 15 내지 45 부피배, 20 내지 45 부피배, 25 내지 45 부피배, 10 내지 40 부피배, 15 내지 40 부피배, 20 내지 40 부피배, 25 내지 40 부피배, 10 내지 35 부피배, 15 내지 35 부피배, 20 내지 35 부피배, 25 내지 35 부피배, 예를 들어, 30 부피배의 추출용매로 추출하는 것일 수 있다.
본 발명의 꾸지뽕 추출물은 꾸지뽕에 추출용매를 처리하여 수득하는 경우에는, 다양한 추출용매가 이용될 수 있다.
본 발명에 있어서 추출용매는 극성 용매 또는 비극성 용매인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 극성 용매는 물, 알코올, 아세트산, DMFO (dimethyl-formamide) 및 DMSO (dimethyl sulfoxide)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 비극성 용매는 메틸렌 클로라이드, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 추출용매 및/또는 분획용매는 탄소수 1 내지 5의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 등), 물, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 알코올은 탄소수 1 내지 5개의 직쇄 또는 분지형 알코올인 것일 수 있으며, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 및 에틸렌글리콜로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으며, 예를 들어, 에탄올인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 추출용매로 물과 알코올의 혼합물을 사용하는 경우에는 10%이상 내지 100%(v/v)미만, 20%이상 내지 100%(v/v)미만, 30%이상 내지 100%(v/v)미만, 40%이상 내지 100%(v/v)미만, 50%이상 내지 100%(v/v)미만, 10 내지 90%(v/v), 20 내지 90%(v/v), 30 내지 90%(v/v), 40 내지 90%(v/v), 50 내지 90%(v/v), 10 내지 80%(v/v), 20 내지 80%(v/v), 30 내지 80%(v/v), 40 내지 80%(v/v), 50 내지 80%(v/v)의 알코올 수용액인 것일 수 있으며, 예를 들어, 50%(v/v)의 알코올 수용액 (예를 들어, 에탄올 수용액)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 용매추출은 통상적으로 사용되는 모든 방법일 수 있으며, 예를 들어, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 또는 환류 냉각 추출법일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 용매추출 단계의 수행 온도는 20 내지 100℃, 20 내지 95℃, 20 내지 90℃, 20 내지 85℃, 20 내지 80℃, 25 내지 100℃, 25 내지 95℃, 25 내지 90℃, 25 내지 85℃, 25 내지 80℃, 30 내지 100℃, 30 내지 95℃, 30 내지 90℃, 30 내지 85℃, 30 내지 80℃, 35 내지 100℃, 35 내지 95℃, 35 내지 90℃, 35 내지 85℃, 35 내지 80℃, 40 내지 100℃, 40 내지 95℃, 40 내지 90℃, 40 내지 85℃, 40 내지 80℃, 45 내지 100℃, 45 내지 95℃, 45 내지 90℃, 45 내지 85℃, 45 내지 80℃, 50 내지 100℃, 50 내지 95℃, 50 내지 90℃, 50 내지 85℃, 50 내지 80℃, 55 내지 100℃, 55 내지 95℃, 55 내지 90℃, 55 내지 85℃, 55 내지 80℃, 60 내지 100℃, 60 내지 95℃, 60 내지 90℃, 60 내지 85℃, 60 내지 80℃, 65 내지 100℃, 65 내지 95℃, 65 내지 90℃, 65 내지 85℃, 65 내지 80℃, 70 내지 100℃, 70 내지 95℃, 70 내지 90℃, 70 내지 85℃, 70 내지 80℃, 75 내지 100℃, 75 내지 95℃, 75 내지 90℃, 75 내지 85℃, 75 내지 80℃, 예를 들어, 80℃인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 용매추출 단계의 수행 시간은 5 내지 10 시간, 6 내지 10 시간, 7 내지 10 시간, 5 내지 9 시간, 6 내지 8 시간, 7 내지 10 시간, 5 내지 9 시간, 6 내지 8 시간, 7 내지 8 시간, 예를 들어, 7.5 시간인 것일 수 있다.
추출공정은 1회 또는 수회 반복할 수 있으며, 본 발명의 한 바람직한 예에서는 1차 추출 후 다시 재추출하는 방법을 채택할 수 있는데, 이는 생약추출물을 대량 생산하는 경우 효과적으로 여과를 한다 하더라도 생약 자체의 수분 함량이 높기 때문에 손실이 발생하게 되어 1차 추출만으로는 추출효율이 떨어지므로 이를 방지하기 위함이다. 또한, 각 단계별 추출효율을 검증한 결과 2차 추출에 의해 전체 추출량의 80 내지 90% 정도가 추출되는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 일 예에서, 추출 단계를 2회 반복하는 경우, 상기 얻어진 잔사에 다시 추출용매 10 내지 50 부피배, 15 내지 50 부피배, 20 내지 50 부피배, 25 내지 50 부피배, 10 내지 45 부피배, 15 내지 45 부피배, 20 내지 45 부피배, 25 내지 45 부피배, 10 내지 40 부피배, 15 내지 40 부피배, 20 내지 40 부피배, 25 내지 40 부피배, 10 내지 35 부피배, 15 내지 35 부피배, 20 내지 35 부피배, 25 내지 35 부피배, 예를 들어, 30 부피배로 환류 추출하는 것일 수 있다.
본 발명에 일 예에서, 추출 후 여과하고 이전에 얻어진 여과액과 합쳐서 감압농축을 하여 꾸지뽕 추출물을 제조한다. 이와 같이 2차에 걸친 추출 및 각각의 추출 후 얻어진 여과액을 혼합함으로써 추출 효율을 높일 수 있으나, 본 발명의 추출물이 추출 회수에 한정되는 것은 아니다.
이와 같이 얻어진 여과된 추출물은 원료로 사용하기에 적합하도록 잔존하는 저급 알코올의 함량을 조절하기 위하여 농축물 총량의 약 10 내지 30배, 바람직하게는 15 내지 25배, 보다 바람직하게는 약 20 중량배의 물로 1 내지 5회, 바람직하게는 2 내지 3회 공비 농축하고 재차 동량의 물을 가하여 균질 하게 현탁시킨 후 동결 건조하여 분말상태의 꾸지뽕 추출물로서 제조될 수 있다.
본 발명은 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물 및 꾸지뽕으로부터 유래된 화합물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물에 관한 것으로, 어류에서 높은 폐사를 유발하는 병원성 세균에 대하여 우수한 항균 활성이 있으며, 특히 항생제 내성 어병세균에 대해서도 우수한 항균활성을 보유하고 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 꾸지뽕나무 잎의 추출 및 용매 분획을 보여주는 그림이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 꾸지뽕나무 미숙과 열매의 추출 및 용매 분획을 보여주는 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 꾸지뽕나무 성숙과 열매의 추출 및 용매 분획을 보여주는 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 구조별 항균활성상관관계를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 구조별 항균활성상관관계를 보여주는 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 구조별 항균활성상관관계를 보여주는 그림이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 꾸지뽕나무 뿌리에서 분리된 화합물의 구조를 보여주는 그림이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 꾸지뽕나무에서 분리된 화합물의 구조에 따른 항균 활성 모식도이다.
도 9a 내지 도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따른 주효과도 및 곡률효과를 보여주는 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 축소된 모델의 잔차그림 (항균활성)이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 축소된 모델의 잔차그림 (세포독성)이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 독립변수에 대한 항균활성의 반응표면도면 및 항균활성과 세포독성의 다중반응표면분석으로 도출된 최적추출조건을 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 최적화된 추출물을 투여한 넙치에 어병세균을 인위 감염시킨 후의 누적 폐사율을 관찰한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 꾸지뽕나무 미숙과 열매의 추출 및 용매 분획을 보여주는 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 꾸지뽕나무 성숙과 열매의 추출 및 용매 분획을 보여주는 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 구조별 항균활성상관관계를 보여주는 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 구조별 항균활성상관관계를 보여주는 그림이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 구조별 항균활성상관관계를 보여주는 그림이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 꾸지뽕나무 뿌리에서 분리된 화합물의 구조를 보여주는 그림이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 꾸지뽕나무에서 분리된 화합물의 구조에 따른 항균 활성 모식도이다.
도 9a 내지 도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따른 주효과도 및 곡률효과를 보여주는 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 축소된 모델의 잔차그림 (항균활성)이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 축소된 모델의 잔차그림 (세포독성)이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 독립변수에 대한 항균활성의 반응표면도면 및 항균활성과 세포독성의 다중반응표면분석으로 도출된 최적추출조건을 나타낸 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 최적화된 추출물을 투여한 넙치에 어병세균을 인위 감염시킨 후의 누적 폐사율을 관찰한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 꾸지뽕나무 부위별 추출물의 제조
건조된 꾸지뽕나무 (Cudrania tricuspidata Bureau)의 뿌리 (CTR), 잎 (CTL), 줄기 (CTS), 성숙열매 (CTF) 및 미숙열매 (CTU)를 각각 분쇄하여, 각 1 g을 취해 실온에서 100% 메탄올 10 mL로 추출하였다. 그 다음, 회전 감압 농축기로 농축하여, 각 부위별 추출물을 수득하였다.
제조예 2. 꾸지뽕나무 부위별 분획물의 제조
2-1. 꾸지뽕나무 잎
2-1-1. 추출 및 용매 분획
건조된 꾸지뽕나무 잎 0.8 kg을 실온에서 100% 메탄올로 2회 반복 추출하였다. 그 다음, 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기로 농축하여 100% 메탄올 추출물 102.4 g을 수득하였다. 이를 증류수에 현탁 한 후 n-헥산, CH2Cl2, 에틸 아세테이트, n-부탄올 순서로 분획하여, n-헥산 분획물 12.2 g, CH2Cl2 분획물 15.2g, 에틸 아세테이트 분획물 4.7g 및 n-부탄올 분획물 17.7 g을 수득하였다. (도 1)
2-1-2. 성분 분리
CH2Cl2분획층을 실리카겔 C.C. (CH2Cl2:MeOH=100:1~1:1, step gradient)를 시행하여 총 10개의 분획 (CTL-M-1 내지 CTL-M-10)으로 구분하였다. CTL-M-4 분획은 세파덱스 LH-20 (CH2Cl2:MeOH = 1:1)를 수행하여 총 5개의 소분획 (CTL-M-4-1 내지 CTL-M-4-5)을 얻었다. 이 중 CTL-M-4-2분획을 세파덱스 LH-20 (n-hexane:CH2Cl2:MeOH = 10:10:1)를 수행하여 총 8개의 소분획 (CTL-M-4-2-1 내지 CTL-M-4-2-8)을 얻었다. 이 중 CTL-M-4-2-3분획을 반-분취 (semi-preparative) HPLC (MeCN:H2O=45:55)를 사용하여 화합물 CTL-37을 얻었고, CTL-M-4-2-6분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=60:40)를 사용하여 화합물 CTL-45를 얻었다.
CTL-M-4-4분획은 세파덱스 LH-20 (n-hexane:CH2Cl2:MeOH = 10:10:1)를 수행하여 총 12개의 소분획 (CTL-M-4-4-1 내지 CTL-M-4-4-12)을 얻었다. 이 중 CTL-M-4-4-2분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O = 60:40)를 사용하여 화합물 CTL-19를 얻었고, CTL-M-4-4-4분획을 반-분취 HPLC (MeCN : H2O=60:40)를 사용하여 화합물 CTL-53 및 54를 얻었다.
CTL-M-4-4-9분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O = 60:40)를 사용하여 화합물 CTL-40을 얻었고, CTL-M-4-4-10분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O = 55:45)를 사용하여 화합물 CTL-28, 55, 56을 얻었고, CTL-M-4-4-11분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O = 55:45)를 사용하여 화합물 CTL-32를 얻었다.
2-2. 꾸지뽕나무 미숙과 열매
2-2-1. 추출 및 용매분획
신선한 꾸지뽕나무 미숙과 열매 2.8 kg을 실온에서 75% 에탄올로 2회 반복 추출하였다. 그 다음, 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기로 농축하여 75% 에탄올 추출물 508.2 g을 얻었으며, 이를 증류수에 현탁 한 후 n-헥산, CH2Cl2, 에틸 아세테이트, n-부탄올 순서로 분획하여 n-헥산 (30.1 g), CH2Cl2 (44.6 g), 에틸 아세테이트 (7.5 g), n-부탄올 (35.8 g)을 얻었다. (도 2)
2-2-2. 성분 분리
CH2Cl2 분획층을 실리카겔 C.C. (n-hexane:EtOAc = 50:1 내지 0:100, step gradient)를 시행하여 총 11개의 분획 (CTU-M-1 내지 CTU-M-11)으로 구분하였다. CTU-M-1분획을 defating (CH2Cl2:MeOH=1:1 add 0.1% H2O)를 수행하여 총 2개의 소분획(CTU-M-1MC, CTU-M-1M)을 얻었다. 이 중 CTU-M-1M분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=90:10)를 사용하여 화합물 CTU-33을 얻었다. CTU-M-6분획을 MPLC (CH2Cl2:MeOH=50:1 내지 0:100, step gradient)를 수행하여 총 11개의 소분획(CTU-M-6-1 내지 CTU-M-6-11)을 얻었다. 이 중 CTU-M-6-4분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=57:43)를 사용하여 화합물 CTU-37을 얻었다.
CTU-M-7분획은 재결정과 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 4개의 소분획 (CTU-M-7-1 내지 CTU-M-7-4)을 얻었다. 이 중 CTU-M-7-3분획은 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=55:45)를 사용하여 CTU-M-7-3-1 소분획과 화합물 CTU-18, 43을 얻었다. CTU-M-8분획은 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 4개의 소분획 (CTU-M-8-1 내지 CTU-M-8-4)을 얻었다. 이 중 CTU-M-8-3분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=55:45)를 사용하여 화합물 CTU-34를 얻었다.
CTU-M-9분획은 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 4개의 소분획 (CTU-M-9-1 내지 CTU-M-9-4)을 얻었다. 이 중 CTU-M-9-2분획을 세파덱스 LH-20 (CH2Cl2:MeOH=1:1)를 수행하여 총 2개의 소분획(CTU-M-9-2-1 내지 CTU-M-9-2-2)을 얻었다. 이 중 CTU-M-9-2-2분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=57:43)를 사용하여 화합물 CTU-21을 얻었다. CTU-M-9-4분획은 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=45:55)를 사용하여 화합물 CTU-36, 46을 얻었다.
2-3. 꾸지뽕나무 성숙과 열매
2-3-1. 추출 및 용매분획
신선한 꾸지뽕나무 성숙과 열매 1.2 kg을 실온에서 100% MeOH로 2회 반복 추출하였다. 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기로 농축하여 100% MeOH 추출물 486.5 g을 얻었으며, 이를 증류수에 현탁 한 후 n-헥산, CH2Cl2, 에틸 아세테이트, n-부탄올 순서로 분획하여 n-헥산 (8.8 g), CH2Cl2 (14.4 g), 에틸 아세테이트 (4.3 g), n-부탄올 (19.5 g)을 얻었다. (도 3)
2-3-2. 성분 분리
CH2Cl2 분획층을 실리카겔 C.C. (n-hexane:EtOAc=20:1 내지 0:100 내지 EtOAc:MeOH=100:0 내지 0:100, step gradient)를 시행하여 총 11개의 분획(CTF-M-1 내지 CTF-M-11)으로 구분하였다. CTF-M-7분획과 CTF-M-8분획은 각각 재결정을 통해서 화합물 CTF-11, 10을 얻었다. CTF-M-10분획은 세파덱스 LH-20(CH2Cl2:MeOH=1:1)을 수행하여 총 5개의 소분획 (CTF-M-10-1 내지 CTF-M-10-5)을 얻었다. 이 중 CTF-M-10-4분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=80:20)를 사용하여 화합물 CTF-12를 얻었다.
에틸 아세테이트 분획층을 RP-MPLC (MeOH:H2O=50:50 내지 100:0, step gradient)를 수행하여 총 5개의 분획(CTF-E-1 내지 CTF-E-5)으로 구분하였다. CTF-E-1분획을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)를 수행하여 총 5개의 소분획(CTF-E-1-1 내지 CTF-E-1-5)을 얻었다. 이 중 CTF-E-1-5분획은 재결정을 통해서 화합물 CTF-2를 얻었다.
2-4. 꾸지뽕나무 뿌리
2-4-1. 추출 및 용매분획
건조된 꾸지뽕나무 뿌리 7.5 kg을 실온에서 80% 메탄올로 2회 반복 추출하였다. 추출액을 여과한 후에 여액을 회전 감압 농축기로 농축하여 80% 메탄올 추출물 461.4 g을 얻었으며, 이를 증류수에 현탁 한 후 n-헥산, CH2Cl2, 에틸 아세테이트, n-부탄올 순서로 분획하여 n-헥산 (1.2 g), CH2Cl2 (66.9 g), 에틸 아세테이트 (69.4 g), n-부탄올 (130.1 g)을 얻었다.
2-4-2. 성분 분리
CH2Cl2 분획층을 실리카겔 C.C. (n-hexane > CH2Cl2 > MeOH gradient)를 시행하여 총 17개의 분획 (C-1 내지 C-17)으로 구분하였다. 이 중 C-15 분획을 MPLC (n-hexane:CH2Cl2, gradient)를 수행하여 총 5개의 소분획 (C15A 내지 C15E)을 얻었으며, C15B 분획을 RP-MPLC (MeOH:H2O = 45:55, MeOH gradient)를 수행하여 총 14개의 소분획 (C15B1 내지 C15B14)을 얻었다.
소분획 중 C15B9를 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 5개의 소분획 (C15B9A 내지 C15B9E)을 얻었다. 이 중 C15B9D를 반-분취 HPLC (MeCN:0.1% 아세트산 수용액 = 65:35)를 사용하여 화합물 CTR-X13, F36을 얻었다.
소분획 중 C15B10 분획을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 5개의 소분획(C15B10A 내지 C15B10E)을 얻었으며, C15B10E 분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O with 0.1% acetic acid=60:40)을 사용하여 화합물 CTR-X14, 15, 17, 19를 얻었다.
소분획 중 C15B12 분획을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 4개의 소분획(C15B12A 내지 C15B12D)을 얻었으며, C15B12B 분획을 MPLC (CH2Cl2:MeOH)를 수행하여 총 3개의 소분획 (C15B12B1 내지 C15B12B3)을 얻었다. 이 중 C15B12B2 분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O with 0.1% acetic acid=60:40)를 사용하여 화합물 CTR-X16을 얻었다.
C-16 분획을 MPLC (CH2Cl2:MeOH=90:1, gradient)를 수행하여 총 5개의 소분획(C16A 내지 C16E)을 얻었으며, 이 중 C16B 분획을 RP-MPLC (MeOH:H2O=1:1)를 수행하여 총 18개의 소분획(C16B1 내지 C16B18)을 얻었다.
소분획 중 C16B12을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 9개 소분획 (C16B12A 내지 C16B12I)을 얻었으며, C16B12F 분획을 반-분취 HPLC (MeCN:H2O=45:55)를 사용하여 화합물 CTR-F38을 얻었다.
소분획 중 C16B17을 세파덱스 LH-20 (MeOH=100)을 수행하여 총 5개의 소분획(C16B12A 내지 C16B12E)을 얻었으며, C16B12E 분획을 세파덱스 LH-20 (CH2Cl2:MeOH = 1:1)을 수행하여 총 2개의 소분획 (C16B12E1 내지 C16B12E2)으로 나누었다. C16B12E2 분획을 semi-preparetive HPLC (MeCN:H2O = 80:20)를 사용하여 화합물 CTR-X11. 23을 얻었다.
에틸 아세테이트 분획층을 실리카겔 C.C. (CH2Cl2:MeOH=90:1, gradient)를 시행하여 총 7개의 분획 (E1 내지 E7)을 얻었으며, 이 중 E4 분획을 RP-MPLC (MeOH:H2O =20:80)를 수행하여 7개의 소분획 (E4A 내지 E4G)을 얻었다. 소분획 중 E4C를 재결정을 통해서 화합물 CTR-F40을 얻었다.
실험예 1. 항균 활성 측정
꾸지뽕나무 각 부위별 추출물과 분리한 화합물에 대한 항균활성은 microdilution assay로 실시하였다. Streptococcus iniae KCTC3657, S. iniae DSJ19, S. iniae BS9, S. parauberis KCTC3651, Lactococcus garvieae KCTC3772, Edwardsiella tarda KCTC12267, Vibrio anguillarum KCTC2711, Aeromonas salmonicida KCCM40239를 BHIB (brain heart infusion broth) 10 ml에 접종 후, 25℃에서 24시간 동안 0.5 Mcfarland standard에 준하게 배양한 뒤 최종 세균수를 1 X 106 CFU/ml로 맞춰 주었다. 추출물 및 화합물을 DMSO에 잘 녹인 뒤 BHIB를 첨가하여 최종 DMSO 농도를 10%가 되게 조정하였으며, 2배씩 희석하여 준비하였다. 그 후, 96웰 플레이트에 시료 희색액과 세균액을 동량 넣어 최종 부피를 200 ul가 되도록 하였으며, 25℃배양기에서 24시간동안 배양하였다. 최소 살균농도 (minimum bactericidal concentration, MBC)를 확인하기 위해 24시간 배양된 플레이트를 육안으로 관찰하여, 세균이 자라지 않는 부분부터 상위 농도에 해당하는 구간에서 20 ul를 취한 뒤, 100 ul BHIB가 분주된 96웰 플레이트에 접종하여, 25℃ 배양기에서 24시간동안 배양하였다. 최종 최소 억제 농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 및 최소 살균 농도(MBC) 결정은 0.2 mg/ml 농도의 p-INT를 웰당 30 ul 주입 하여 암조건에서 2시간동안 반응 시킨 후, 염색되지 않는 구간을 MIC 및 MBC로 결정하였다. 양성대조구로 옥시테트라사이클린과 아목시실린을 사용하였다.
그람양성 3균주 그람음성 3균주에 대한 꾸지뽕나무 부위별 추출물의 MIC를 결정하여, 그 결과를 표 1에 나타내었으며, 그람양성균주 (표준균주 및 임상분리균주) 5종과 그람음성균주 1종에 대하여 각 추출물에서 분리된 화합물들에 대한 MIC와 MBC를 결정하여, 그 결과를 표 2에 나타내었다.
| Sample | S. iniae KCTC3657 | S. parauberis KCTC3651 |
L. garvieae KCTC3772 | E. tarda KCTC12267 |
V. anguillarum KCTC2711 | A. salmonicida KCCM40239 |
| ug/ml | ug/ml | ug/ml | ug/ml | ug/ml | ug/ml | |
| CTR | 31.25 | 125 | 62.5 | 1000 | >250 | 500 |
| CTL | 250 | 1000 | 1000 | 2000 | NT | 1000 |
| CTS | 1000 | >2000 | >500 | >2000 | NT | 1000 |
| CTF | 62.5 | 250 | 125 | >2000 | >2000 | 2000 |
| CTU | >2000 | >2000 | >1000 | >2000 | NT | 2000 |
| OTC | 0.25 | 0.5 | 1 | 0.5 | <0.125 | 0.125 |
| DMSO vehicle | 10% | >10% | 5% | 10% | 10% | 10% |
| Cell No. (CFU/ml) | 11.6*105 | 11.9*105 | 5.2*105 | 6.5*105 | 6.3*105 | 7.7*105 |
OTC, oxytetracycline; DMSO, dimethyl sulfoxide; NT, not tested
표 1에서 확인할 수 있듯이, 꾸지뽕 뿌리, 잎, 줄기, 성숙과 및 미성숙과의 추출물은 전반적으로 주요한 그람 양성 및 그람 음성 어병세균에 대한 항균활성을 나타내었으며, 특히, 그람 음성균에 비해 그람 양성균에 대하여 상대적으로 우수한 항균활성을 보여주었다. 특히, 뿌리와 성숙과의 항균활성이 두드러지는 것으로 확인되었다.
| Sample | S. iniae KCTC3657 | S. iniae DSJ19 | S. iniae BS9 | L. garvieae KCTC3772 | S. parauberis KCTC3651 | V. anguillarum KCTC2711 |
| ㎍/ml | ㎍/ml | ㎍/ml | ㎍/ml | ㎍/ml | ㎍/ml | |
| Genistein | >500 | >500 | NT | NT | NT | NT |
| CTF-2 | 500 | NT | NT | >250 | NT | NT |
| CTF-10 | 62.5a(500b) | NT | NT | >250 | NT | NT |
| CTF-11 | 3.91(7.81) | 1.95 | 1.95 | 3.91 | 3.91(15.63) | >250 |
| CTF-12 | 7.81(31.25) | 7.81 | 3.91 | 31.25 | 31.25(250) | >250 |
| CTU-18 | 31.25(125) | NT | NT | 250 | NT | NT |
| CTU-21 | 1.95(3.91) | 1.95 | 1.95 | NT | 1.95(15.63) | >250 |
| CTL-19 | 7.81(15.63) | 3.91 | 3.91 | 7.81 | 15.63(62.5) | >250 |
| CTL-28 | 7.81(15.63) | 3.91 | 3.91 | 7.81 | 15.63(125) | >250 |
| CTL-32 | 15.63(62.5) | NT | NT | 15.63 | NT | NT |
| CTU-33 | 250(>500) | NT | NT | >250 | NT | NT |
| CTU-36 | 31.25(250) | NT | NT | >250 | NT | NT |
| CTU-37 | 250(500) | NT | NT | 250 | NT | NT |
| CTU-43 | 62.5(250) | NT | NT | 250 | NT | NT |
| CTU-34 | >500 | NT | NT | >250 | NT | NT |
| CTU-46 | 62.5(250) | NT | NT | >250 | NT | NT |
| CTL-37 | 125(500) | NT | NT | 250 | NT | NT |
| CTL-40 | 250(>500) | NT | NT | 250 | NT | NT |
| CTL-53 | 7.81(15.63) | 7.81 | 7.81 | 15.6 | 125(>250) | >250 |
| CTL-55 | 62.5(250) | NT | NT | 125 | NT | NT |
| CTL-45 | 125(500) | NT | NT | >250 | NT | NT |
| CTL-54 | 7.81(31.25) | 3.91 | 3.91 | 31.25 | 62.5(250) | >250 |
| CTL-56 | 31.25(125) | NT | NT | 62.5 | NT | NT |
| CTR-X11 | 125(>500) | NT | NT | >125 | 250(>250) | >250 |
| CTR-X13 | 1.95(7.81) | NT | NT | 15.6 | 7.81(62.5) | >250 |
| CTR-X14 | 7.81(31.25) | NT | NT | >125 | 31.25(250) | >250 |
| CTR-X15 | 7.81(15.63) | NT | NT | >125 | 31.25(250) | >250 |
| CTR-X16 | 7.81(15.63) | NT | NT | >125 | 15.63(250) | >250 |
| CTR-X17 | 7.81(31.25) | NT | NT | >125 | 31.25(250) | >250 |
| CTR-X19 | 7.81(31.25) | NT | NT | >125 | 62.5(250) | >250 |
| CTR-X23 | 3.91(15.625) | NT | NT | >125 | 31.25(250) | >250 |
| CTR-F36 | 500(>500) | NT | NT | >125 | >250 | 250 |
| CTR-F38 | 15.63(31.25) | NT | NT | 62.5 | 31.25(250) | >250 |
| CTR-F40 | 1.95(7.81) | NT | NT | 31.25 | 3.91(62.5) | >250 |
| OTC | 0.25(1) | 0.5 | 0.25 | 1 | 0.5(1) | 0.25 |
| AMX | 0.0078 | 0.0156 | 0.0156 | 1 | NT | NT |
| DMSO vehicle | 10% | 10% | 10% | 5% | >10% | 10% |
| Cell No. (CFU/ml) | 7.2*105 | 18.4*105 | 18.8*105 | 5.5*105 | 1.16*105 | 2.08*105 |
a, MIC; b, MBC; NT, not tested; OTC, oxytetracycline; AMX, amoxicillin sodium, DMSO, dimethyl sulfoxide
표 2에서 확인할 수 있듯이, 총 34종의 화합물에 대한 항균활성을 확인하였으며, 각 부위에서 분리된 화합물들은 그람 양성균에 대해 우수한 항균활성을 나타내었다. 추출물의 MIC의 결과와 유사하게 뿌리와 성숙열매에서 분리된 화합물들의 항균활성이 우수한 것을 알 수 있으며, 뿌리와 성숙열매에서 분리된 화합물 중 활성이 우수한 화합물들의 MIC 범위는 1.95-7.81㎍/ml로 OTC의 MIC인 0.25-0.5㎍/ml와 비슷한 활성을 나타냄을 확인하였다.
이를 구조별로 살펴보면 도 4에서 확인할 수 있듯이, 기본구조인 genistein의 MIC는 >500 ㎍/ml을 나타낸 반면 F11 F12 U21 L19, 28, 32와 같이 기본 구조에서 R3,4자리에 prenylation 되면 1.95 내지 7.81㎍/ml으로 MIC값이 낮아지는 것으로 확인되었다. F11, 12 및 L28, 32와 비교에서 R1 위치에 H 대신 OH가 치환되면 MIC값이 2배 높아져, 구조의 극성이 낮아질수록 활성이 증가하는 것으로 확인되었다.
고리화를 이루는 구조에서도 구조활성상관관계가 존재하였으며 도 5에서 확인할 수 있듯이, 7번 자리의 OH와 6번 자리의 페닐이 고리화를 이루는 경우 항균활성이 4 내지 8배 낮아지나 (CTU-33 (250㎍/ml)과 CTF-10 (62.5㎍/ml)/ CTU-43 (62.5㎍/ml)와 CTL-28 (7.81㎍/ml)의 비교) 마찬가지로 페닐화된 구조 (U43, U46)의 활성이 증가하였다.
마찬가지로 도 6에서 확인할 수 있듯이, 마찬가지로 고리화되면 항균활성이 2-4배 낮아지나(CTL-53(7.81㎍/ml)과 CTU-21 (1.95㎍/ml)/CTL-45 (125㎍/ml)와 CTU-18 (31.25㎍/ml)/CTL-56 (31.25㎍/ml)과 CTL-32 (15.63㎍/ml) 비교) 마찬가지로 prenylation된 구조의 활성이 올라가는 것으로 보이고(L53, 55, 54, 56), H가 OH로 치환됨에 따라 활성이 낮아는 것으로 보아, 구조의 극성이 낮아질수록 활성이 증가하였다.
실험예 2. 항생제 내성 어병세균에 대한 항균 활성 측정
앞선 항균활성 실험에서 활성을 나타낸 꾸지뽕나무 부위별 추출물과 분리한 화합물에 대해서 아목시실린 내성 어류병원성 세균인 Streptococcus parauberis KSP44에 대한 항균활성을 검토하였다.
| Streptococcus parauberis KSP44 (J14) | ||
| MIC (ug/ml) | MBC (ug/ml) | |
| CTF | 62.5 | 125 |
| CTR | 62.5 | 250 |
| CTL | 500 | 1000 |
| Genistein | 250 | >250 |
| CTF-11 | 1.95 | 1.95 |
| CTF-12 | 31.25 | 125 |
| CTU-21 | 1.95 | 1.95 |
| CTL-19 | 15.625 | 31.25 |
| CTL-28 | 7.81 | 125 |
| CTL-53 | 7.81 | 125 |
| CTL-54 | 15.625 | 62.5 |
| Amoxicillin | 0.5 | 4 |
| Cell No. (CFU/ml) | 5.6*105 | |
MIC, minimum inhibitory concentration MBC, minimum bactericical concentration
표 6에서 확인할 수 있듯이, CTF. CTR은 62.5 ug/ml의 MIC를 보여주었으며, CTF에서 분리된 화합물 (CTF-11)의 MIC가 1.95ug/ml로 확인되었다. 특히, MBC 결과를 보면, CTF-11 및 CTU-21의 경우 살균제로 작용하는 것을 알 수 있으며, 아목시실린의 MBC (4ug/ml)보다 약 2배 이상 낮은 값을 나타내어, 항생제 내성균에서도 우수한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.
실험예 3. 꾸지뽕나무 성숙과에 대한 항균활성 추출최적화
3-1. 주효과도 및 곡률효과 분석
각 요인들의 주효과도 및 그들의 상호작용을 파악하기 위해 23 full factorial design (center point: 3)을 수행하였다. 각 실험점 마다 2g의 시료를 시료대 용배비 30배수를 적용하여 추출을 진행하였으며, 추출물은 감압농축 후 50ml vial에 옮겨 동결 건조한 뒤 항균활성을 검토하였다. 항균활성결과와 추출수율을 토대로 실험설계를 위한 독립변수들의 수준을 정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
| No. | 용매조성 (에탄올 %) | 추출온도 (℃) | 추출시간 (h) |
| 1 | 0 | 90 | 10 |
| 2 | 50 | 65 | 7.5 |
| 3 | 0 | 90 | 5 |
| 4 | 0 | 40 | 5 |
| 5 | 0 | 40 | 10 |
| 6 | 50 | 65 | 7.5 |
| 7 | 100 | 90 | 5 |
| 8 | 100 | 40 | 5 |
| 9 | 100 | 90 | 10 |
| 10 | 50 | 65 | 7.5 |
| 11 | 100 | 40 | 10 |
| 에탄올함량(%) | 추출온도( |
추출시간(h) | 항균활성 MIC (ug/㎖) |
추출수율(%) |
| 0 | 90 | 10 | >1000 | 54.1 |
| 50 | 65 | 7.5 | 62.5 | 57.2 |
| 0 | 90 | 5 | >1000 | 54.8 |
| 0 | 40 | 5 | >1000 | 50.8 |
| 0 | 40 | 10 | >1000 | 51.4 |
| 50 | 65 | 7.5 | 62.5 | 57.3 |
| 100 | 90 | 5 | 125 | 56 |
| 100 | 40 | 5 | 62.5 | 43 |
| 100 | 90 | 10 | 125 | 57 |
| 50 | 65 | 7.5 | 62.5 | 56.4 |
| 100 | 40 | 10 | 62.5 | 47.4 |
| OTC | - | - | 0.5 | - |
| DMSO | - | - | 10% | - |
| Cell No. (CFU/㎖) |
- | - | 1.5*106 | - |
MIC, minimum inhibitory concentration; OTC, oxytetracycline; DMSO, dimethyl sulfoxide
도 9에서 확인할 수 있듯이, 항균활성에 대한 주효과도 분석에서 에탄올 함량이 항균활성에 영향을 주는 것으로 보이나, 통계적인 유의성은 없는 것으로 확인되었다. 하지만, 모든 인자에서 중심점의 항균활성이 가장 높은 것으로 나타나 곡률효과가 존재하는 것으로 판단되었다. 추출수율에 대한 주효과도 분석에서는 추출온도가 유의한 인자로 확인되었으며 에탄올 함량은 유의한 인자는 아니지만 온도인자와 교호작용이 있는 것으로 확인되었다. 추출 수율에서도 마찬가지로 중심점에서 수율이 가장 높아 곡률효과가 존재하는 것으로 판단되었다.
따라서, 위 실험을 통해 추출물의 성격을 결정하는 세 가지 인자들을 확인하였고 반응에 곡면이 존재함을 확인하여 반응표면분석을 진행하였다. 반응표면분석의 종속변수는 항균활성과 세포독성으로 결정하였으며, 세포독성의 경우 in vivo 항균활성실험에서 추출물의 장기간 복용에 따른 추출물의 독성유발에 관련된 주요한 항목으로 판단하여 최종종속변수로 선정하였다. 하지만, 추출수율의 경우 위 실험에서 각 조건별로 큰 차이가 보이지 않았기 때문에 종속변수에서 제외하였다.
3-2. Box-Behnken Design (BBD)를 이용한 꾸지뽕나무 성숙과의 항균활성 및 세포독성 추출최적화
꾸지뽕나무 성숙과 시료의 S. iniae에 대한 항균활성과 세포독성에 대한 최적조건을 분석하기 위해 response surface methodology (RSM)중 BBD를 사용하였다. 추출조건의 독립변수는 주효과도 및 곡률효과 분석을 통해 에탄올 함량(X1), 추출온도(X2) 및 추출시간(X3)으로 추출 요인을 선택하고, 코드화된 -1, 0, 1의 3수준으로 실험을 설계하였다. 설계된 15개의 실험조건대로 추출하여 항균활성 및 세포독성실험을 수행하였다. 항균활성이 최대화 되면서 세포독성은 낮춘 최적의 추출조건을 예측하기 위해 MINITAB® release 14 (Minitab INC., Pennsylvania, USA) 프로그램을 이용하여 분석하여, 그 결과를 표 6에 나타내었다.
| 실험순서 | 독립변수 | 종속변수 | |||||
| 에탄올 함량 % (X1) | 추출온도 (X2) | 추출시간 (X3) |
항균활성(MIC) (ug/ml, Y1) |
세포독성(CC50) (ug/ml, Y2) |
|||
| 실측값 | 예측값a | 실측값 | 예측값a | ||||
| 1 | 80 (+1) | 60 (0) | 5 (-1) | 62.5 | 86.0 | 114.5 | 120.5 |
| 2 | 80 (+1) | 80 (+1) | 7.5 (0) | 62.5 | 31.3 | 140.2 | 123.8 |
| 3 | 20 (-1) | 80 (+1) | 7.5 (0) | 2000 | 1984.4 | 200.0 | 203.7 |
| 4 | 50 (0) | 80 (+1) | 5 (-1) | 62.5 | 70.3 | 129.6 | 140.0 |
| 5 | 20 (-1) | 60 (0) | 10 (+1) | 2000 | 1976.6 | 200.0 | 194.0 |
| 6 | 50 (0) | 40 (-1) | 10 (+1) | 125 | 117.2 | 151.6 | 141.2 |
| 7 | 80 (+1) | 40 (-1) | 7.5 (0) | 125 | 140.7 | 135.0 | 131.3 |
| 8 | 50 (0) | 60 (0) | 7.5 (0) | 62.5 | 62.5 | 133.9 | 141.2 |
| 9 | 20 (-1) | 60 (0) | 5 (-1) | 2000 | 2007.8 | 200.0 | 185.9 |
| 10 | 50 (0) | 80 (+1) | 10 (+1) | 62.5 | 101.6 | 130.2 | 132.5 |
| 11 | 50 (0) | 60 (0) | 7.5 (0) | 62.5 | 62.5 | 146.0 | 141.2 |
| 12 | 50 (0) | 40 (-1) | 5 (-1) | 250 | 211.0 | 154.0 | 151.7 |
| 13 | 80 (+1) | 60 (0) | 10 (+1) | 62.5 | 54.7 | 80.4 | 94.5 |
| 14 | 20 (-1) | 40 (-1) | 7.5 (0) | 2000 | 2031.3 | 200.0 | 216.4 |
| 15 | 50 (0) | 60 (0) | 7.5 (0) | 62.5 | 62.5 | 143.7 | 141.2 |
MIC, minimum inhibitory concentration; CC50, 50% cytotoxic concentrationa, 예측값은 독립변수의 종속변수에 대한 2차 회귀식으로부터 도출
3-2-1. 향균활성 모델 확립
모델 방정식의 통계적 유의성은 T-검정으로 평가 되었으며, 표 10에서 확인할 수 있듯이, P < 0.05인 항이 유의적이므로 이 모델에서 X1, X2및 (X1)2항은 유의한 인자로 확인되었다.
| 항 | 계수 | 계수의 표준오차 | T | P |
| 상수 | 62.500 | 21.35 | 2.928 | 0.033* |
| 선형항 | ||||
| X1 | -960.938 | 13.07 | -73.507 | 0.000* |
| X2 | -39.063 | 13.07 | -2.988 | 0.031* |
| X3 | -15.625 | 13.07 | -1.195 | 0.286 |
| 제곱항 | ||||
| (X1)2 | 945.313 | 19.24 | 49.126 | 0.000* |
| (X2)2 | 39.062 | 19.24 | 2.030 | 0.098 |
| (X3)2 | 23.437 | 19.24 | 1.218 | 0.278 |
| 교호작용항 | ||||
| X1X2 | -15.625 | 18.49 | -0.845 | 0.437 |
| X1X3 | -0.000 | 18.49 | -0.000 | 1.000 |
| X2X3 | 31.250 | 18.49 | 1.690 | 0.152 |
R2=99.9% R2(adj)=99.8%*: P < 0.05
최종 적합 모델을 확인하기 위해, 고차항부터 유의하지 않은 항을 차례로 제거하여 모형을 축소하였다. 단, 유의한 고차항에 포함된 주효과는 P 값이 0.05이상이어도 계층적 모형을 유지하기 위해 최종 모델에 포함시켰다.
도 10의 잔차그림을 통해 축소된 모형의 정규분포, 모든 적합치에서 분산의 동일성, 시간에 따른 랜덤성이 적합함을 확인하였으며, 분산분석에서 축소된 모델의 모든 항이 유의적임을 나타내었다.
| 항목 | DF | MS | F | P |
| 회귀식 | 3 | 3568048 | 1881.83 | 0.000 |
| 선형항 | 2 | 3699707 | 1951.27 | 0.000 |
| 제곱항 | 1 | 3304729 | 1742.95 | 0.000 |
| 잔차오차 | 11 | 1896 | ||
| 적합성결여 | 5 | 2609 | 2.00 | 0.211 |
| 순수오차 | 6 | 1302 | ||
| 총합 | 14 |
R2=99.8% R2(adj)=99.8%DF: 자유도; MS: 제곱합/DF
표 8에서 확인할 수 있듯이, 모형의 적합성을 나타내는 lack-of-fit (적합성결여) 값은 P > 0.05 임으로 축소된 모형이 적합함을 나타내었으며, 회귀모형의 반응변수에 대한 변동을 설명해주는 R2 (adj)값은 99.8%로 확인되었다. 축소된 최종적인 모형 (1)은 다음과 같다.
[축소된 최종 모형 (1)]
Y = 4430.43 - 136.57X1 - 1.95X2 + 1.05(X1)2
3-2-2. 세포독성 모델 확립
| 항 | 계수 | 계수의 표준오차 | T | P |
| 상수 | 141.197 | 9.456 | 14.932 | 0.000* |
| 선형항 | ||||
| X1 | -41.236 | 5.791 | -7.121 | 0.001* |
| X2 | -5.075 | 5.791 | -0.876 | 0.421 |
| X3 | -4.499 | 5.791 | -0.777 | 0.472 |
| 제곱항 | ||||
| (X1)2 | 17.484 | 8.524 | 2.051 | 0.095 |
| (X2)2 | 10.117 | 8.524 | 1.187 | 0.289 |
| (X3)2 | -9.951 | 8.524 | -1.167 | 0.296 |
| 교호작용항 | ||||
| X1X2 | 1.293 | 8.189 | 0.158 | 0.881 |
| X1X3 | -8.525 | 8.189 | -1.041 | 0.346 |
| X2X3 | 0.752 | 8.189 | 0.092 | 0.930 |
R2=92.4% R2(adj)=78.6%*: P < 0.05
표 9에서 확인할 수 있듯이, 모델 방정식의 통계적 유의성은 T-검정으로 평가되었으며, P < 0.05인 항이 유의적이므로 이 모델에서 X1만이 유의한 인자로 확인되었다. 최종 적합 모델을 확인하기 위해 고차항부터 유의하지 않은 항을 차례로 제거하여 모형을 축소하였다. 단, 유의한 고차항에 포함된 주효과는 P 값이 0.05이상이어도 계층적 모형을 유지하기 위해 최종 모델에 포함시켰다.
| 항목 | DF | MS | F | P |
| 회귀식 | 2 | 7371.6 | 31.43 | 0.000 |
| 선형항 | 1 | 13603.4 | 58.00 | 0.000 |
| 제곱항 | 1 | 1139.7 | 4.86 | 0.048 |
| 잔차오차 | 12 | 234.5 | ||
| 순수오차 | 12 | |||
| 총합 | 14 |
R2=84.0% R2(adj)=81.3%DF: 자유도; MS: 제곱합/DF
도 11의 잔차그림을 통해 축소된 모형의 정규분포, 모든 적합치에서 분산의 동일성과 시간에 따른 랜덤성이 적합함을 확인하였으며, 표 13에서 확인할 수 있듯이, 회귀모형의 반응변수에 대한 변동을 설명해주는 R2 (adj)값은 81.3 %로 확인되었다. 축소된 최종적인 모형은 다음과 같다(2)
[축소된 최종 모형 (2)]
Y = 258.553 - 3.31591X1 + 0.0194137(X1)2
3-2-3. 다중 반응 최적화
꾸지뽕나무 성숙과 추출물의 항균활성 및 세포독성의 최종 모델을 통해 항균활성은 40 ug/ml 이하와 세포독성은 140 ug/ml 이상의 두 가지 반응변수에 대하여 다중반응표면분석을 진행하였으며, 이로부터 최적화된 반응조건은 에탄올 함량 50.9884%, 추출온도 79.9598℃로 도출되었다.
도 12에서 확인할 수 있듯이, 이에 따른 종속변수의 반응 예측치는 항균활성이 28.5919 ug/ml, 세포독성은 139.9518 ug/ml로 예측되었으며 이때의 종합만족도(D)는 0.63207이었다. 항균활성 및 세포독성 모두 추출시간은 유의한 인자가 아니기 때문에 최적화에서는 제외되었으나, 최종 추출조건에서는 가장 활성이 우수했던 중간값인 7.5시간으로 결정하였다. 에탄올 함량과 추출온도는 향후 추출물의 대량생산의 편의를 위해 각각 50% 와 80℃로 조정하였다. 따라서, 추출물 제조를 위해 최종 선정된 추출조건은 에탄올 함량 50%, 추출온도 80℃, 추출시간 7.5시간이며, 시료 대 용매비는 30배수로 고정하여 추출하였다 (50.80.7.5 추출물).
| 반응 | 개별최적추출조건 | 종합만족도 (D) | 실측값 (ug/ml) |
예측값a (ug/ml) |
예측용량 (%) |
||
| 에탄올 함량 % (X1) |
추출 시간 (X2) |
추출 온도(X3) |
|||||
| 세포독성 (CC50, ug/ml) |
50 | P >0.05 | P >0.05 | 1.0000 | NTb | 141.29 | - |
| 항균활성 (MIC, ug/ml) | 51 | 63 | P >0.05 | 1.0000 | NT | 61.37 | - |
| 다중반응최적화 | 0.7365 | ||||||
| 세포독성 (CC50, ug/ml) |
51 | 80 | 7.5 | 0.3995 | 153.18±2.93 | 139.95 | 109.45% |
| 항균활성 (MIC, ug/ml) |
1.0000 | 40.00±0.00 | 28.59 | 71.48% | |||
a, 예측값은 독립변수의 종속변수에 대한 2차 회귀식으로부터 도출; b, Not tested
표 11에서 확인할 수 있듯이, 최적화된 추출물에 대한 검증 실험을 진행한 결과, 항균활성은 40 ug/ml, 세포독성은 153.18±2.93 ug/ml로 확인되었다. 이의 예측용량은 항균활성이 71.5%, 세포독성은 109.5%로 최종회귀모형이 반응변수에 대한 변동을 설명해주고 있음을 확인하였으며, 마찬가지로 모델에 대한 신뢰도가 높은 것으로 확인되었다.
실험예 4. 꾸지뽕나무 성숙과 최적화 추출물을 투여한 넙치에서의
in vivo
효과
최적화된 추출물을 투여하기 위해 5개의 (각 구당 10마리) 지수식 수조(30L)에 순치하여, 추출물을 흡착한 사료를 10 내지 50 mg/kg b.w.로 1일 1회 어체중당 0.5%를 5주간 경구투여 하였다. 대조약물로 넙치 연쇄상구균증 치료제인 아목시실린 (amoxicillin)을 사용하였으며 40 mg/kg b.w.로 1일 1회 어체중당 0.5%로 5일간 투여하였다. 이때 대조구는 일반사료 (참넙치마루 2호, 천하제일사료)를 투여하였다. 흡착사료 투여기간 동안 수온은 20±0.1℃를 유지하였으며, 일일 환수량은 수조용량의 100%로 하였다. 예비실험을 통해 S. iniae DSJ19의 감염농도를 2 X 102 CFU/fish와 1 X 103 CFU/fish로 결정하였다. 그 결과를 도 13 및 표 12에 나타내었다.
| 감염농도 (CFU/fish) |
그룹 | 투여농도 (mg/kg b.w./day) |
누적폐사율 (%) |
상대생존율 (%) |
P value | Asterisk |
| - | NC | - | 0 | - | - | - |
| 2 X 102 | BC | 0 | 80 | - | - | - |
| RC | 40 | 10 | 87.5 | 0.0008 | *** | |
| OE | 10 | 90 | -12.5 | 0.9391 | - | |
| 25 | 50 | 37.5 | 0.0362 | * | ||
| 50 | 30 | 62.5 | 0.0133 | * | ||
| 1 X 103 | BC | 0 | 70 | - | - | - |
| RC | 40 | 0 | 100.0 | 0.0016 | ** | |
| OE | 10 | 80 | -14.3 | 0.6464 | - | |
| 25 | 50 | 28.6 | 0.2225 | - | ||
| 50 | 10 | 85.7 | 0.0054 | ** |
도 13 및 표 12에서 확인할 수 있듯이, 최적화된 추출물을 10, 25 및 50 mg/kg으로 투여한 구는 감염대조구에 비해 상대생존율이 2 X 102 CFU/fish 감염구에서 각각 -12.5, 37.5 및 62.5%를 나타내었으며, 25과 50 mg/kg 투여구에서 감염대조구 대비 유의적인 생존율을 나타내었다 (P < 0.05). 또한, 1 X 103 CFU/fish 감염구의 상대생존율은 각각 -14.3, 28.6 및 85.7로 나타났으며, 50 mg/kg 투여구에서 감염대조구 대비 유의적인 생존율을 나타내었다 (P < 0.01). 특히, 50 mg/kg 투여구는 대조약물로 사용된 아목시실린의 상대생존율 (87.5 및 100%)과 비슷한 결과를 나타내어 항생제만큼의 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
제조예 4. 꾸지뽕 성숙과 최적화 추출물의 대량제조
건조 후 조말한 꾸지뽕나무 성숙과 시료 20g을 상기 최적화된 추출조건에 따라 추출하였으며, 추출 시 매 2.5 시간 마다 교반하였다. 추출물은 Whatman No.4 여과지로 여과 후 감압 농축하여 남은 잔사를 48시간 동결건조하였다. 동결건조 후 추출수율은 62.4%로 확인되었으며, 사용 전까지 -20℃ 냉동고에 보관하였다.
Claims (20)
- 꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata Bureau) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 꾸지뽕 추출물은 뿌리, 줄기, 잎 및 열매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출물인 것인, 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 열매는 미숙과 또는 성숙과인 것인, 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 탄소수 1 내지 5의 무수 또는 함수 저급 알코올, 물, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출된 것인, 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 분획물은 꾸지뽕 용매 조추출물에 에틸에테르, 아세트산에틸, 부탄올 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 용매를 사용한 용매 분획물인 것인, 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 어류는 양식어류 또는 관상어인 것인, 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 양식어류는 넙치, 우럭, 돔, 능성어, 숭어, 농어, 전어, 가자미, 복어, 고등어, 노래미, 다랑어, 민어, 방어, 전갱이, 잉어, 숭어, 향어, 뱀장어, 메기, 미꾸라지 및 붕어로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 세균은 그람 양성균 또는 그람 음성균인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 어류 세균성 질병은 연쇄상구균증, 포도상구균증, 세균성신장병, 노카르디아병, 절창병, 에로모나스병, 에드워드병, 활주세균병, 류결절증, 적점병, 슈도모나스병 및 리케챠병, 비브리오병으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 하기의 화학식 1 내지 17로 이루어진 군에 선택된 1종 이상의 화합물 또는 이의 유도체를 포함하는 것인, 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물:
[화학식 1]
상기 화학식 1에서,
R1은 -H 또는 -OH이고,
R2는 -OH 또는 -OCH3이고,
R3 및 R4는 각각 독립적으로 -H,또는
이다;
[화학식 2]
상기 화학식 2에서,
R1은 -H 또는 -OH이고,
R2는 -OH 또는 -OCH3이고,
R3은 -H 또는이다;
[화학식 3]
상기 화학식 3에서,
R1은 -H 또는 -OH이고,
R2는 -OH이고,
R3은 -H 또는이다;
[화학식 4]
상기 화학식 4에서,
R1은 -H 또는 -OH이고,
R2는 -OH 또는 -OCH3이고,
R3은 -H 또는 -OCH3이고,
R4는-H 또는이다;
[화학식 5]
;
[화학식 6]
상기 화학식 6에서, R은 -H 또는 -OH이다;
[화학식 7]
;
[화학식 8]
;
[화학식 9]
;
[화학식 10]
;
[화학식 11]
;
[화학식 12]
;
[화학식 13]
;
[화학식 14]
;
[화학식 15]
;
[화학식 16]
; 및
[화학식 17]
.
- 꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata Bureau) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
- 꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata Bureau) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균 활성을 갖는 어류 사료용 조성물
- 꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata Bureau) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균 활성을 갖는 어류 사료 첨가용 조성물
- 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 이용한 어류 세균성 질병의 예방 또는 치료방법.
- 꾸지뽕 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함하는 어류 세균성 질병에 대한 항균 조성물 제조 방법:
꾸지뽕을 준비 하는 꾸지뽕 준비 단계; 및
꾸지뽕에 추출용매를 가하여 추출하는 용매추출 단계. - 제15항에 있어서, 상기 꾸지뽕은 뿌리, 줄기, 잎 및 열매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 제조 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 열매는 미숙과 또는 성숙과인 것인, 제조 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 추출용매는 탄소수 1 내지 5의 무수 또는 함수 저급 알코올, 물, 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌글리콜, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 제조 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 용매추출 단계는 20 내지 100 ℃에서 수행하는 것인, 제조 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 용매추출 단계는 5 내지 10 시간 동안 수행하는 것인, 제조 방법.
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| KR20120105776A (ko) | 2011-03-16 | 2012-09-26 | 주식회사 아라심수 | 해양심층수를 이용한 피부 염증 개선용 화장료 조성물 |
| KR20130019352A (ko) | 2011-08-16 | 2013-02-26 | 한양대학교 산학협력단 | 꾸지뽕나무 줄기 추출물을 함유하는 아토피 질환 치료용 조성물 |
| KR20140129492A (ko) | 2013-04-30 | 2014-11-07 | 수원대학교산학협력단 | 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2020
- 2020-02-28 KR KR1020200025286A patent/KR102364472B1/ko active IP Right Grant
-
2022
- 2022-01-27 KR KR1020220012730A patent/KR102594356B1/ko active IP Right Grant
-
2023
- 2023-10-20 KR KR1020230141414A patent/KR102647200B1/ko active IP Right Grant
-
2024
- 2024-02-08 KR KR1020240019558A patent/KR20240023573A/ko active Application Filing
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120105776A (ko) | 2011-03-16 | 2012-09-26 | 주식회사 아라심수 | 해양심층수를 이용한 피부 염증 개선용 화장료 조성물 |
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| KR20140129492A (ko) | 2013-04-30 | 2014-11-07 | 수원대학교산학협력단 | 꾸지뽕나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 관절염의 예방 또는 치료용 조성물 |
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|---|
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Also Published As
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|---|---|
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