KR20210096967A

KR20210096967A - 알츠하이머병의 진단과 유사 퇴행성 뇌질환과의 감별진단 향상을 위한 알파-시누클레인의 활용

Info

Publication number: KR20210096967A
Application number: KR1020200010688A
Authority: KR
Inventors: 안성수; 심규환; 김상윤; 윤영철
Original assignee: 가천대학교 산학협력단; 중앙대학교 산학협력단; 서울대학교병원
Priority date: 2020-01-29
Filing date: 2020-01-29
Publication date: 2021-08-06
Also published as: KR102296346B1

Abstract

본 발명은 알파-시누클레인을 이용한 알츠하이머병의 진단 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 다양한 바이오마커 조합에 따른 알츠하이머병의 진단 가능성을 실험적으로 확인하였는바, 알츠하이머병 환자의 진단 정확도를 높이고, 질병 초기 단계에서도 더 높은 민감도로 진단이 가능하다. 특히, 특정 바이오마커 조합(알파-시누클레인 및 타우)을 통해 병리생리학적으로 비-알츠하이머병으로 의심되는(Suspected-non Alzheimer's disease pathophysiology; SNAP) 환자에서 알츠하이머병으로의 진단이 가능하며, 알파-시누클레인이 관여하는 루이소체치매, 파킨슨병, 파킨슨 치매 등과의 구별된 결과를 제공할 수 있다.

Description

알츠하이머병의 진단과 유사 퇴행성 뇌질환과의 감별진단 향상을 위한 알파-시누클레인의 활용{Application of α-synuclein for Diagnosing of Alzheimer's Disease and Improving Diagnosis of Alzheimer's Disease and Differential Diagnosis to Similar Degenerative Brain Diseases}

본 발명은 알파-시누클레인을 이용한 알츠하이머병의 진단 및 유사 퇴행성 뇌질환과의 감별진단 향상 방법에 관한 것이다.

알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD)은 주로 아밀로이드 베타 단백질 응집체(Aβ Protein Plaque) 또는 타우 응집체(Tau Tangle)와 같은 질병인자를 감지하여 진단하고 있는데, 알츠하이머병을 발생시키는 많은 단백질의 복잡한 기전 및 아밀로이드 베타를 표적으로 하는 신약의 실패 등으로 인해, 최근 아밀로이드 베타(Aβ) 및 타우(tau) 이외의 대체 단백질이 주목 받고 있다.

일반적으로, 알츠하이머병의 바이오마커로 뇌척수액의 Aβ42, 총 tau(total tau), 인산화 타우(phosphorylated tau) 등이 사용될 수 있으나, 알츠하이머를 정확히 진단하는 데 한계를 가지고 있으며, 또한 루이소체치매, 전두측두치매 및 파킨슨병(Parkinson's disease, PD) 등과 같은 다른 신경 퇴행성 질환의 공존으로 인해 이로부터 알츠하이머를 구별하여 적절히 치료하는 데 한계가 있다.

한편, 알파-시누클레인(α-syn)은 신피질, 해마, 치아이랑, 후각망울, 선조체, 시상 및 소뇌에서 광범위하게 발현되는 140개의 아미노산 단백질이다. α-syn은 또한 B-세포, T-세포, 및 NK 세포를 포함하는 조혈 세포뿐만 아니라, 단핵구 및 혈소판에서 고도로 발현된다.

이러한 α-syn은 파킨슨병, 파킨슨병 치매 등의 주요 병리학적 단백질로 최근에는 알츠하이머병과의 연관성이 제시되면서 이 질병에 대한 진단 가능성 및 진단 정확도의 향상이 필요한 상황이다.

국내공개특허 제10-2019-0015947호

본 발명자들은 알파-시누클레인을 이용한 알츠하이머병의 진단 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 인간으로부터 채취한 뇌척수액에 존재하는 전체 α-syn의 양 및 전체 tau 양 및 인산화 tau, 또는 이들의 비 값을 측정하는 것으로 알츠하이머병의 진단 및 예후 판정이 가능함을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명자들은 알파-시누클레인을 이용한 알츠하이머병의 진단 방법을 개발하고자 하였다. 그 결과, 인간으로부터 채취한 뇌척수액에 존재하는 전체 α-syn의 양 및 전체 tau 양 및 인산화 tau, 또는 이들의 비 값을 측정하는 것으로 알츠하이머병의 진단 및 예후 판정이 가능함을 규명하였다.

본 발명은 알츠하이머병의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 알츠하이머병의 진단 또는 예후 분석용 키트에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 다음을 포함하는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

(a) 인간으로부터 분리된 생시료(bio sample)를 얻는 단계; 및

(b) 전체 α-시누클레인(total α-synuclein)의 양을 측정하는 단계.

본 명세서에서, "진단 또는 예후"는 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 알츠하이머병의 단계 결정 또는 치료에 대한 회복 가능성 예측)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

(a) 단계

본 단계에서는 인간으로부터 채취된 분석대상 생시료(bio sample)를 얻는다.

본 단계에서 상기 생시료는 뇌척수액(Cerebrospinal fluid; CSF), 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 또는 체액일 수 있다.

상기 분석대상 생시료는 알츠하이머병 의심 환자로부터 뇌척수액을 채취하는 과정을 통하여 얻을 수 있다. 또는, 뇌척수액을 포함하는 시료를 제3자로부터 구입 또는 입수함으로써 얻을 수 있다.

본 단계의 일 실시예에 따르면, 본 단계는 상기 뇌척수액을 포함하는 시료에 있는 뇌척수액을 분석대상 시료로 이용한다. 뇌척수액을 8-12시 사이에 L3/L4나 L4/L5 사이에서 요추 천자(lumbar puncture)로 채취할 수 있는데, 채취한 뒤 4시간 이내에 2000xg로 10분 동안 원심분리하여 상층액은 1 mL씩 폴리프로필렌(polypropylene) 용기 등에 옮겨 -80℃에서 보관하여 사용할 수 있다.

본 명세서에서, "전체 α-시누클레인(total α-synuclein), 전체 α-syn 또는 α-syn"은 천연형 모노머 α-syn과 이의 이형태(isoform) 모두를 포괄하는 의미이며, 140개의 아미노산으로 이루어진 천연형의 α-syn, 얼터너티브 스플라이싱(alternative splicing)에 의하여 생성된 126개의 아미노산으로 이루어진 α-syn과 112개의 아미노산으로 이루어진 α-syn, 이들의 모노머형의 α-syn, 이들의 올리고머형의 α-syn, 및 이들의 인산화된 형태의 α-syn을 포함한다. 인간 α-syn의 아미노산 서열은 문헌 및 관련 데이터베이스로부터 검색될 수 있다.

(b) 단계

본 단계에서는 시료에 있는 전체 α-syn의 양을 측정한다. 본 명세서에서 α-syn의 양을 측정하는 것에는 α-syn의 존재여부에 대한 확인도 포함된다.

본 단계의 일 실시예에 따르면, 측정된 전체 α-syn의 양을 정상 대조군 시료의 값과 비교하여 높을 경우 알츠하이머병으로 판단한다.

상기 전체 α-syn의 양은 뇌척수액에 존재하는 전체 α-syn의 양이다.

상기 전체 α-syn 양의 측정은, α-syn의 전체 서열 또는 일부 서열을 에피토프로 인식하는 항체를 이용하여 실시된다. α-syn의 전체 서열이 규명되었으므로, 이를 이용하여 α-syn의 전체 서열 또는 일부 서열을 에피토프로 인식하는 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서는 2종 이상의 항체를 조합하여 사용할 수도 있다.

상기 다클론 항체는 상기한 마커 단백질을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

상기 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method) 또는 파지 항체 라이브러리 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 방법을 항체를 이용하여 실시하는 경우, 본 발명은 통상적인 면역분석 방법에 따라 실시하여 알츠하이머병을 진단하는데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 정량적 또는 정성적 면역분석 방법에 따라 실시하여 알츠하이머병을 진단하는데 이용될 수 있다. 상기 면역분석 포맷은 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 캡처-엘라이자, 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명의 방법이 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 변형예에 따르면, 항체 대신에 α-syn에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 앱타머는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자, 바람직하게는 펩타이드 분자일 수 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 알츠하이머병을 진단할 수 있다. 즉, 시료에서 본 발명의 마커에 대한 시그널이 정상 시료 보다 강하게 나오는 경우에는 알츠하이머병으로 진단된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 방법은 다음의 단계를 더 포함할 수 있다.

(c-1) 전체 타우(total Tau) 또는 인산화 타우(phosphorylated Tau)의 양을 측정하는 단계;

(c-2) 전체 α-시누클레인의 양에 대한 전체 타우 또는 인산화 타우의 양의 비(전체 타우/전체 α-시누클레인 비 또는 인산화 타우/전체 α-시누클레인 비)를 구하는 단계.

(c-1) 단계

본 단계에서는 시료에 있는 전체 타우(T-tau) 또는 인산화 타우(P-tau)의 양을 측정한다. 본 명세서에서 T-tau 또는 P-tau의 양을 측정하는 것에는 T-tau 또는 P-tau의 존재여부에 대한 확인도 포함된다.

상기 전체 타우 또는 인산화 타우의 양은 뇌척수액에 존재하는 전체 타우 또는 인산화 타우의 양이다.

본 명세서에서, "전체 타우(T-tau)"는 천연형 모노머 타우와 이의 이형태(isoform) 모두를 포괄하는 의미이며, 441개의 아미노산으로 이루어진 천연형의 타우, 얼터너티브 스플라이싱(alternative splicing)에 의하여 생성된 412개의 아미노산으로 이루어진 타우, 410개의 아미노산으로 이루어진 타우, 383개의 아미노산으로 이루어진 타우, 381개의 아미노산으로 이루어진 타우과 352개의 아미노산으로 이루어진 타우, 이들의 모노머형의 타우, 이들의 올리고머형의 타우, 및 이들의 인산화된 형태의 α-타우를 포함한다. 인간 T-tau의 아미노산 서열은 문헌 및 관련 데이터베이스로부터 검색될 수 있다.

본 명세서에서, "인산화 타우(P-tau)"는 441개의 아미노산으로 이루어진 천연형의 인산화 타우, 얼터너티브 스플라이싱(alternative splicing)에 의하여 생성된 412개의 아미노산으로 이루어진 인산화 타우, 410개의 아미노산으로 이루어진 인산화 타우, 383개의 아미노산으로 이루어진 인산화 타우, 381개의 아미노산으로 이루어진 인산화 타우과 352개의 아미노산으로 이루어진 인산화 타우, 이들의 모노머형의 인산화 타우, 이들의 올리고머형의 인산화 타우를 포함한다.

상기 인산화 타우의 인산화 아미노산은 Y18, S46, S68, S69, T71, S113, T123, T153, T175, T181, S184, S185, S195, S197, S198, S199, S202, T205, S208, S210, T212, S214, T217, T231, S235, S237, S238, S258, S262, S289, S356, S394, S396, S400, S403, S404, S409, S412, S413, T414, S415, S416, S418, S422, S427, S433, S435가 포함된다.

상기 전체 타우 또는 인산화 타우의 양의 측정은, tau의 전체 서열 또는 일부 서열을 에피토프로 인식하는 항체, 또는 P-tau의 전체 서열 또는 일부 서열을 에피토프로 인식하는 항체를 이용하여 실시된다. tau의 전체 서열이 규명되었으므로, 이를 이용하여 tau의 전체 서열 또는 일부 서열을 에피토프로 인식하는 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

상기 전체 타우 또는 인산화 타우의 양의 측정, 및 상술한 본 발명의 α-syn의 양의 측정 방법 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

(c-2) 단계

본 단계에서는 전체 α-시누클레인의 양에 대한 전체 타우 또는 인산화 타우의 양의 비(전체 타우/전체 α-시누클레인 비 또는 인산화 타우/전체 α-시누클레인 비)를 구한다.

상기 측정된 전체 타우/전체 α-시누클레인 비 또는 인산화 타우/전체 α-시누클레인 비 값이 정상 대조군 시료의 값과 비교하여 높을 경우 알츠하이머병으로 판단한다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 상기 방법은 다음의 단계를 더 포함할 수 있다.

(d-1) 전체 아밀로이드베타(total amyloid beta)의 양을 측정하는 단계;

(d-2) 인산화 타우의 양에 대한 전체 아밀로이드베타의 양의 비(전체 아밀로이드베타/인산화 타우 비)를 구하는 단계.

(d-1) 단계

본 단계에서는 시료에 있는 전체 아밀로이드베타(Aβ)의 양을 측정한다. 본 명세서에서 Aβ의 양을 측정하는 것에는 Aβ의 존재여부에 대한 확인도 포함된다.

상기 전체 아밀로이드베타의 양은 뇌척수액에 존재하는 전체 아밀로이드베타의 양이다.

본 명세서에서, "전체 아밀로이드베타(Aβ)"는 구체적으로 아밀로이드베타 1-42(Aβ₄₂), 즉 천연형 모노머 Aβ₄₂와 이의 이형태(isoform) 모두를 포괄하는 의미이며, 42개의 아미노산으로 이루어진 천연형의 Aβ₄₂ 및 이들의 올리고머형의 Aβ₄₂를 포함한다. 인간 Aβ의 아미노산 서열은 문헌 및 관련 데이터베이스로부터 검색될 수 있다.

상기 전체 아밀로이드베타의 양의 측정은, 아밀로이드베타의 전체 서열 또는 일부 서열을 에피토프로 인식하는 항체를 이용하여 실시된다. Aβ의 전체 서열이 규명되었으므로, 이를 이용하여 Aβ의 전체 서열 또는 일부 서열을 에피토프로 인식하는 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

상기 전체 아밀로이드베타의 양의 측정, 및 상술한 본 발명의 α-syn의 양의 측정 방법 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

(d-2) 단계

본 단계에서는 인산화 타우의 양에 대한 전체 아밀로이드베타의 양의 비(전체 아밀로이드베타/인산화 타우 비)를 구한다.

상기 측정된 전체 아밀로이드베타/인산화 타우 비 값에 상기 전체 타우/전체 α-시누클레인 비 값을 나눈 값이 정상 대조군 시료의 값과 비교하여 낮을 경우 알츠하이머병으로 판단한다.

또한, 정상 대조군 시료의 값에 비해 상기 측정된 전체 아밀로이드베타의 양이 적고 전체 타우와 인산화 타우의 양이 많은 경우에 대하여, 전체 타우/전체 α-시누클레인 비 값이 정상 대조군 시료의 값과 비교하여 높을 경우 알츠하이머병으로 판단한다.

본 명세서에서, "바이오마커"란 알츠하이머병을 진단할 수 있는 물질로, 정상인에 비하여 알츠하이머병이 발병한 개체에서 증가/감소 양상을 보이는 단백질과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 알츠하이머병 진단 마커는 "전체 α-syn", "전체 Aβ", "전체 tau", "인산화 tau", "Aβ/인산화 tau", "전체 tau/α-syn", "인산화 tau/α-syn", 및/또는 "전체 Aβ/인산화 tau 및 전체 tau/α-syn" 일 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 다음을 포함하는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 진단 또는 예후 분석용 키트에 관한 것이다.

α-시누클레인의 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제, 또는 올리고머형의 α-시누클레인에 결합하는 결합제;

타우 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제, 또는 인산화 타우 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제; 및

아밀로이드베타의 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제, 또는 올리고머형의 아밀로이드베타에 결합하는 결합제;

상기 결합제는 항체 또는 앱타머이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 본 발명의 진단 또는 예후 분석에 필요한 정보를 제공하는 방법에 사용된다.

본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 바람직하게는 상기 면역분석용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이고, 보다 바람직하게는 ELISA 키트이다.

본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 항체는 마커 단백질 항원에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 복합 마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스 키트는 마커 단백질 항원에 대한 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명의 키트는 상기한 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

상기 알츠하이머병의 진단 또는 예후 분석용 키트와 알츠하이머병의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

도 1a 및 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 α-시누클레인, 전체 타우(total tau) 및 인산화 타우(phosphorylated tau) 수치(도 1a), 및 α-시누클레인에 대한 전체 타우 및 인산화 타우의 비(도 1b)를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 알츠하이머병 그룹(EOAD 및 LOAD) 및 비-알츠하이머병 그룹(PD 및 HC) 별 각 바이오마커 간의 진단 일치도를 평가한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 FBB-PET 양성 및 음성 그룹 별 각 바이오마커 간의 진단 일치도를 평가한 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 ATN(T/S) 그룹에서의 T-tau 및 α-syn의 분포를 나타낸 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

1-1. 알츠하이머병(AD)의 진단

발병-초기 알츠하이머병(EOAD), 발병-후기 알츠하이머병(LOAD), 가벼운 인지 장애(MCI), 주관적 인지 감소(SCD), 파킨슨병(PD) 환자 및 건강한 대조군(HC)을 대상으로 알츠하이머병(AD)을 진단하였으며, 그 기준은 하기와 같다:

(1) NIA-AA(National Institute on Aging-Alzheimer's Association workgroups, 2011)에서 제안한 AD 기준 참고,

(2) 경험 있는 신경과 전문의에 의하여 6 개월 이상 추적,

(3) 50 세 내지 80 세의 남성 또는 여성 환자,

(4) 6 년 이상의 교육 기간.

한편, 알츠하이머병은 65 세의 나이를 기준으로 EOAD 및 LOAD로 분류되었으며, MCI는 하나 이상의 인지 영역에서 손상이 존재하지만, 기능적 능력은 보존되고 NIA-AA 기준에 의해 규정된 AD로 인한 치매 기준을 충족시키지 못하였다. 또한, SCD는 상세한 신경 심리학적 시험에 따라 정상 수준에서 주관적 인지 감소의 존재에 따라 진단되었다. PD는 영국 파킨슨병 협회의 뇌 은행 기준에 따라 모집되었으며, AD, 뇌졸중 및 섬망 이외의 인지 장애는 제외되었다.

이 연구는 모든 참여 기관의 윤리위원회의 승인을 받았으며, 모든 참가자로부터 연구 목적의 임상 데이터 사용에 대해 사전 동의를 받았다.

1-2. 뇌척수액(CSF)에서 바이오마커 수준 측정

먼저, 뇌척수액에서 Aβ42, T-tau 및 P-tau₁₈₁의 수준은 제조업체의 지침에 따라 상용 ELISA 키트(INNOTEST β-AMYLOID (1-42), INNOTEST hTAU-Ag 및 INNOTEST PHOSPHO-TAU (181P), Fujirebio, 벨기에)로 측정하였다.

다음으로, 뇌척수액에서 α-syn 수준을 측정하기 위하여, 96-웰 Polysorp NUNC 마이크로플레이트(Thermo Fischer Scientific, USA)를 코팅 완충액 중의 포획 항체(4B12, BioLegend)로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 그 다음, 플레이트를 0.05% 트윈-20(PBST)을 포함하는 인산염-완충 식염수로 3회 세척하고, 37℃에서 1시간 동안 300 uL/웰의 차단 완충제와 함께 배양하였다. PBST로 3회 세척한 후, 연속 희석된 재조합 α-syn 및 해동된 뇌척수액(샘플 희석 완충액으로 3:1로 희석)을 각 웰에 투입하고 실온(RT)에서 2-5시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 플레이트를 5회 세척하고 반응 용액에서 실온으로 1시간 동안 biotinylated 검출 항체(4D6, BioLegend)와 함께 배양하였다. 세척 후, 플레이트를 반응 용액에서 37℃로 0.5시간 동안 streptavidin poly-HRP(Thermo Fischer Scientific, USA)와 함께 배양하였다. 끝으로, 플레이트를 5회 세척하고 어두운 곳에서 실온으로 0.5시간 동안 TMB 기질(Thermo Fischer Scientific, USA)과 반응시켰다. 정지 용액을 첨가한 후 광학 밀도(Optical density)를 측정하였다. 허위 신호를 제거하기 위하여 이염색성(Heterophilic) 항체 간섭을 모든 분석에 포함시켰다.

최종적인 참가자의 통계학적 특성, 임상 특성 및 CSF 바이오마커 수준에 대한 결과는 하기 표 1에 나타내었다.

	EOAD	LOAD	MCI	SCD	PD	HC	P
N	71	34	11	17	45	32
성별 (남/여)	25/46	17/17	6/5	4/13	18/27	12/20	0.412^a
나이*	58.0 (54.0-62.0)	77.0 (73.0-80.0)	68.0 (59.0-75.0)	67.0 (61.0-73.0)	68.0 (60.0-74.5)	66.5 (62.0-68.0)	0.000^c
MMSE^??	16.0 (13.0-20.0)	19.0 (16.0-21.0)	25.0 (24.0-26.0)	29.0 (25.5-29.0)	-	28.0 (27.0-30.0)	0.000^c
CDR 0/0.5/1/2/3^??	0/20/33/15/3	0/13/15/6/0	0/10/1/0/0	2/15/0/0/0	-	15/17/0/0/0	0.000^b
CSF Aβ₄₂(pg/mL)	326.8 (258.6-488.2)	401.3 (239.6-587.3)	737.5 (445.9-806.9)	990.3 (904.3-1043.5)	774.4 (595.2-967.2)	1078.0 (982.4-1297.3)	0.000^c
CSF T-tau(pg/mL)	534.3 (386.2-732.9)	442.6 (326.3-598.2)	283.6 (203.7-490.8)	321.9 (252.1-335.9)	159.4 (116.9-215.8)	203.3 (147.1-295.9)	0.000^c
CSF P-tau₁₈₁(pg/mL)	77.2 (53.9-106.0)	69.9 (44.1-89.7)	54.6 (40.1-83.3)	51.5 (41.1-60.4)	34.8 (25.5-43.6)	40.3 (32.1-54.6)	0.000^c
CSF α-syn(pg/mL)	754.2 (526.7-1163.9)	834.8 (586.5-1330.3)	889.5 (628.7-1079.5)	880.4 (689.5-1154.8)	590.9 (420.0-842.3)	669.8 (506.8-973.3)	0.007^c
FBB-PET (+/)^??	50/1	18/10	1/4	1/12	-	1/21	0.000^a

EOAD(early-onset Alzheimer's disease): 발병-초기 알츠하이머병

LOAD(late-onset Alzheimer's disease): 발병-후기 알츠하이머병

MCI(mild cognitive impairment): 가벼운 인지 장애

SCD(subjective cognitive decline): 주관적 인지 감소

PD(Parkinson's disease): 파킨슨병

HC(healthy control): 건강한 대조군

MMSE(Mini Mental State Examination): 간이 정신 상태 검사

CDR(Clinical Dementia Rating): 임상 치매 등급

CSF(cerebrospinal fluid): 뇌척수액

Aβ42(amyloid-β 1-42): 아밀로이드 베타 1-42

T-tau(total tau): 총 타우

P-tau₁₈₁(phosphorylated tau₁₈₁): 인산화 타우 181

α-syn(α-synuclein): α-시누클레인

FBB-PET(¹⁸F-florbetaben positron emission tomography): ¹⁸F-플로베타벤 양전자 방출 단층 촬영

실험예 1: α-시누클레인(α-synuclein)에 대한 전체 타우(total tau) 및 인산화 타우(phosphorylated tau) 비의 측정

상기 실시예 결과를 바탕으로, α-시누클레인(α-synuclein)에 대한 전체 타우(total tau) 및 인산화 타우(phosphorylated tau) 비의 측정하였다.

도 1에서 확인할 수 있듯이, α-syn은 각각 T-tau 및 P-tau₁₈₁와 유의한 양의 상관 관계를 보였으며, 각각 0.619 및 0.737의 상관 계수를 나타내었다(도 1a 참조). 또한, T-tau/α-syn 및 P-tau₁₈₁/α-syn은 비-알츠하이머병 그룹(MCI, SCD, PD 또는 HC)에 비하여 알츠하이머병 그룹(EOAD 또는 LOAD)에서 매우 높게 나타났으며, EOAD 및 LOAD 사이에서도 유의한 통계적 차이를 나타내었다. 특히, T-tau/α-syn의 경우 P-tau₁₈₁/α-syn에 비하여 알츠하이머병(EOAD 또는 LOAD) 및 건강한 대조군(HC) 값이 크게 분리되었다(도 1b 참조).

실험예 2: α-시누클레인과의 조합에 따른 각 바이오마커별 진단 정확도 및 진단 일치도 평가

2-1. ROC(receiver operator characteristic) 커브 분석

알츠하이머병의 진단 정확도를 얻기 위한 ROC 커브 분석을 실시하였다. EOAD 및 LOAD는 알츠하이머병(AD) 그룹으로 분류되었고, PD 및 HC는 비-알츠하이머병(비-AD) 그룹으로 분류되었다. 결과는 하기 표 2에 나타내었다.

CSF 바이오마커	Cutoff	AUC	민감도 (Sensitivity)	특이도 (Specificity)
Aβ₄₂	555.4 pg/mL	0.899	89.6 %	81.0 %
T-tau	318.9 pg/mL	0.908	81.0 %	90.9 %
P-tau₁₈₁	57.6 pg/mL	0.860	66.7 %	89.6 %
Aβ₄₂/P-tau₁₈₁	10.6	0.948	92.2 %	89.5 %
T-tau/α-syn	0.412	0.930	88.6 %	94.8 %
P-tau₁₈₁/α-syn	0.071	0.869	80.0 %	81.8 %
Aβ₄₂/P-tau₁₈₁, T-tau/α-syn	21.5	0.956	96.1 %	86.7 %

AUC(area under the curve): 곡선 아래 면적

상기 표 2에서 확인할 수 있듯이, Aβ₄₂의 경우 PD 그룹의 Aβ₄₂의 농도가 낮아 컷오프 및 AUC는 각각 555.4pg/mL 및 0.899로 낮아졌다. T-tau 및 P-tau₁₈₁의 AUC는 각각 0.908 및 0.860이었다. 한편, 현재 가장 대표적으로 사용되고 있는 바이오마커인 Aβ₄₂/P-tau₁₈₁의 경우 AUC가 0.948로 나타났으며, T-tau/α-syn은 0.930로 Aβ₄₂없이도 높은 수준으로 AD 진단이 가능함을 알 수 있었다. 특히, T-tau/α-syn을 Aβ₄₂/P-tau₁₈₁와 복합 사용한 경우(Aβ₄₂/P-tau₁₈₁ 및 T-tau/α-syn) AUC는 0.956으로 분석한 모든 바이오마커 중 가장 높은 수준으로 AD 진단이 가능함을 알 수 있었다(민감도=96.1%, 특이도=86.7%).

종합해 보면, T-tau/α-syn만으로도 AD의 바이오마커로써의 충분한 진단 효과를 나타냈으며, 이를 기존 Aβ₄₂/P-tau₁₈₁와 복합 사용 시 AD 진단 정확도를 향상시킬 수 있음을 알 수 있었다.

2-2. 알츠하이머병 그룹(EOAD 및 LOAD) 및 비-알츠하이머병 그룹(PD 및 HC) 별 각 바이오마커 간의 진단 일치도 평가

상기 실험예 2-1의 결과를 바탕으로, CSF 바이오마커 간의 일치 정도를 결정하기 위하여, OPA(overall percentage agreement), PPA(positive percent agreement) 및 NPA(negative percent agreement)를 계산하고 각 바이오마커의 수준을 산점도로 표시하였다.

도 2에서 확인할 수 있듯이, Aβ₄₂/P-tau₁₈₁ 및 T-tau/α-syn을 비교했을 때, 진단 일치율이 가장 높은 값을 나타냈다(OPA=91.8%, PPA=92.4%, NPA=91.0%). 한편, 뇌척수액에서 T-tau의 농도 변화는 상대적으로 Aβ₄₂보다 느리게 진행되어, Aβ₄₂ 및 T-tau의 일치도는 낮은 수준으로 머물렀다.

그러나, 임상적으로 AD로 진단되었고 바이오마커 상으로도 Aβ₄₂가 낮게 나와 AD에 속했지만, T-tau가 낮게 나와 진단이 불일치했던 환자들에서 T-tau/α-syn은 AD에 속하는 것으로 나타나 진단의 일치를 보였다.

이러한 결과는, 뇌척수액에서의 T-tau/α-syn의 변화는 T-tau보다 먼저 일어남을 의미하며, T-tau/α-syn에 의한 AD의 조기진단 가능성을 시사한다. 또한, Aβ₄₂/P-tau₁₈₁ 및 T-tau/α-syn의 높은 진단 일치율은 T-tau/α-syn의 바이오마커로써의 효용성을 충분히 입증한다.

2-3. FBB-PET 양성 및 음성 그룹 별 각 바이오마커 간의 진단 일치도 평가

상기 실험예 2-1의 결과를 바탕으로, FBB-PET 양성 및 음성 그룹에서 CSF 바이오마커의 일치 정도를 결정하기 위하여, OPA, PPA 및 NPA를 계산하고 각 바이오마커의 수준을 산점도로 표시하였다.

도 3에서 확인할 수 있듯이, Aβ₄₂/P-tau₁₈₁ 및 T-tau/α-syn을 비교했을 때, FBB-PET 분류와 거의 유사하게 구별되었다(OPA=91.6%, PPA=93.2%, NPA=89.1%).

또한, 상기 실험예 2-2의 결과를 뒷받침하는 결과로 FBB-PET과 Aβ₄₂가 모두 AD에 속하지만 T-tau는 낮게 나와 진단이 불일치했던 환자들이 T-tau/α-syn은 높게 나와 진단의 일치를 보였다.

이러한 결과는, 뇌척수액에서의 T-tau/α-syn의 변화는 FBB-PET나 Aβ₄₂와 유사한 시점에서 시작하는 것을 의미한다.

실험예 3: ATN 프로파일링

바이오마커 그룹을 아밀로이드 베타(A), 인산화 타우(T) 및 전체 타우(N)의 세 그룹으로 나누고, 이를 ATN을 기반으로 하는 T-tau/α-syn(T/S) 그룹과 비교하였다(2018년 NIA-AA research framework 참조). 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

ATN 프로파일			EOAD	LOAD	MCI	SCD	PD	HC	T/S+(%)
Normal	A-T-N-	T/S-	1	4	5	8	34	27	4.8%
Normal	A-T-N-	T/S+	-	-	-	3	-	1	4.8%
Pre-AD	A+T-N-	T/S-	3	1	1	-	4	-	59.1%
Pre-AD	A+T-N-	T/S+	8	3	-	-	2	-	59.1%
AD	A+T+N-	T/S-	1	-	-	-	-	-	0.0%
	A+T+N-	T/S+	-	-	-	-	-	-	0.0%
	A+T+N+	T/S-	2	1	-	1	-	1	92.4%
	A+T+N+	T/S+	41	17	2	-	1	-	92.4%
AD with SNAP	A+T-N+	T/S-	-	-	-	-	-	-	100.0%
AD with SNAP	A+T-N+	T/S+	10	5	-	1	-	-	100.0%
SNAP	A-T-N+	T/S-	-	1	-	1	1	-	0.0%
	A-T-N+	T/S+	-	-	-	-	-	-	0.0%
	A-T+N-	T/S-	-	-	1	1	1	1	0.0%
	A-T+N-	T/S+	-	-	-	-	-	-	0.0%
	A-T+N+	T/S-	-	1	2	2	2	2	40.0%
	A-T+N+	T/S+	5	1	-	-	-	-	40.0%
T/S+ (%)			90.1%	76.5%	18.2%	23.5%	6.7%	3.1%

AD: 알츠하이머병

Pre-AD: 전임상 알츠하이머병

SNAP(suspected non-Alzheimer's disease pathophysiology): 병리생리학적으로 비-알츠하이머병으로 의심되는

상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, T/S+ 백분율은 EOAD 및 LOAD에서 가장 높았으며, MCI, SCD, PD 및 HC에서 백분율이 점차 감소하는 것으로 나타났다. 이는 T/S가 알츠하이머병의 기본 병리를 구체적으로 반영함을 시사한다. 또한, 도 4에서 확인할 수 있듯이, T-tau 및 α-syn에 따른 산점도에서 대부분의 그룹은 겹치지 않고 분산된 형태를 나타내었다.

각 그룹들의 독립된 집단화(clustering)는 각 그룹이 독특한 병태생리(pathophysiology)를 가지고 있음을 의미하며, α-syn이 AD 바이오마커 패널(panel)로 추가되어야 하는 중요성을 시사한다. 한편, T/S+ 프로파일링을 통해 무증상 상태에서 AD 예측이 가능하였으며, PD와 같이 시누클레인병증(synucleinophies)의 수반되는(concomitant) 병증을 감별할 수 있었다. 또한, SNAP(suspected non-Alzheimer's disease pathophysiology)에서는 T/S+인 환자들이 AD(T/S+)로 재통합되었으며, 두 그룹은 통계적으로 차이를 보이지 않아 동일한 집단으로 나타났다.

한편, A-T+N+ 그룹 중에서 T와 N이 모두 AD로 나왔지만 A의 거짓 결과(false result)로 인해서 SNAP으로 진단된 환자들이 T/S+를 통한 프로파일링에 의해 AD로 재진단되었다.

Claims

다음을 포함하는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하는 방법:
(a) 인간으로부터 분리된 생시료(bio sample)를 얻는 단계; 및
(b) 전체 α-시누클레인(total α-synuclein)의 양을 측정하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 측정된 전체 α-시누클레인의 양이 정상 대조군 시료의 것보다 높을 경우 알츠하이머병으로 판단하는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 전체 α-시누클레인은 모노머형의 α-시누클레인, 올리고머형의 α-시누클레인 및 인산화된 α-시누클레인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 다음의 단계를 더 포함하는 것인, 방법:
(c-1) 전체 타우(total Tau) 또는 인산화 타우(phosphorylated Tau)의 양을 측정하는 단계;
(c-2) 전체 α-시누클레인의 양에 대한 전체 타우 또는 인산화 타우의 양의 비(전체 타우/전체 α-시누클레인 비 또는 인산화 타우/전체 α-시누클레인 비)를 구하는 단계.
제 4 항에 있어서, 상기 전체 타우/전체 α-시누클레인 비 또는 인산화 타우/전체 α-시누클레인 비 값이 정상 대조군 시료의 것보다 높을 경우 알츠하이머병으로 판단하는 것인, 방법.
제 4 항에 있어서, 다음의 단계를 더 포함하는 것인, 방법:
(d-1) 전체 아밀로이드베타(total amyloid beta)의 양을 측정하는 단계;
(d-2) 인산화 타우의 양에 대한 전체 아밀로이드베타의 양의 비(전체 아밀로이드베타/인산화 타우 비)를 구하는 단계.
제 6 항에 있어서, 상기 전체 아밀로이드베타/인산화 타우 비 값에 상기 전체 타우/전체 α-시누클레인 비 값을 나눈 값이 정상 대조군 시료의 값과 비교하여 낮을 경우 알츠하이머병으로 판단하는 것인, 방법.
제 6 항에 있어서, 정상 대조군 시료의 값에 비해 상기 측정된 전체 아밀로이드베타의 양이 적고 전체 타우와 인산화 타우의 양이 많은 경우에 대하여, 전체 타우/전체 α-시누클레인 비 값이 정상 대조군 시료의 값과 비교하여 높을 경우 알츠하이머병으로 판단하는 것인, 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 생시료는 뇌척수액(CSF), 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포, 조직, 및 기타 다른 조직 또는 체액인, 방법.
다음을 포함하는 알츠하이머병(Alzheimer's disease)의 진단 또는 예후 분석용 키트:
α-시누클레인의 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제, 또는 올리고머형의 α-시누클레인에 결합하는 결합제;
타우 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제, 또는 인산화 타우 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제; 및
아밀로이드베타의 전체 또는 일부 아미노산 서열에 결합하는 결합제, 또는 올리고머형의 아밀로이드베타에 결합하는 결합제;
상기 결합제는 항체 또는 앱타머이다.
제 10 항에 있어서, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것인, 키트.