KR20190015947A - 아밀로이드 베타 검출용 펩타이드 프로브 - Google Patents

Abstract

본 발명은 아밀로이드 베타 검출용 펩타이드 프로브에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 알츠하이머 진단을 위한 아밀로이드 베타에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 선형 펩타이드는 항체를 대체할 수 있는 새로운 기술로서, 기존에 보고된 바 있는 다른 펩타이드 진단제 보다 극미량으로도 아밀로이드 베타 진단에 효과적이며, 3차원적 구조로 인하여 높은 물리 화학적 안정성을 갖는 저분자 물질이다. 이에, 본 발명에 따른 펩타이드를 신규한 진단 탐침자로 이용하여 알츠하이머 메인 바이오마커로 알려진 아밀로이드 물질을 진단함으로써 기존 치료보다 더 효율적인 알츠하이머 질환 진단에 응용될 것이라고 기대된다.

Description

아밀로이드 베타 검출용 펩타이드 프로브{Peptide probe for detecting amyloid beta}

본 발명은 아밀로이드 베타 검출용 펩타이드 프로브에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 알츠하이머 진단을 위한 아밀로이드 베타에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

알츠하이머병은 두뇌의 신경 세포가 줄어들면서 인지능력 감퇴, 비가역적 기억손실, 방향감각 상실 및 언어능력 손상 장애를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 질병이다. 현재까지 알려진 알츠하이머병의 가장 대표적인 증상 또는 예후는 아밀로이드베타(Aβ)의 집적에 의한 응집이 있다. 이러한 증상으로 인해 환자의 뇌에서는 플라그(plaques)가 나타난다.

아밀로이드베타(Aβ)는 뇌세포 내 아밀로이드 전구체 단백질(APP, amyloid precursor protein)인 당단백질이 분해효소에 의하여 절단되어 42개 혹은 40개의 아미노산으로 형성된 물질로서, 아밀로이드베타 40(Aβ40)은 병독성이 거의 없는데 반해, 아밀로이드베타 42(Aβ42)는 일반인의 경우 뇌세포에서 생성되어 뇌척수액(CSF, cerebro spinal fluid)을 통해 순환되며, 최종적으로 뇌세포에서 자연적으로 분해된다. 그러나 이러한 기능이 제대로 작동되지 않아 뇌 세포 내에 침적이 되며, 결국 신경 전달을 방해함으로 질병을 유발한다.

현재 알츠하이머병을 진단하는 방법으로는 신체검사, 신경학적 검사, 정신상태 검사, 일상생활 기능수준 검사, 혈액 검사, 뇌영상학 검사 등 다양한 방법이 있다. 비록 다양한 진단법이 있음에도 불구하고, 이 모든 진단법은 조기 알츠하이머 질환을 진단하지 못하는 단점을 가지고 있다. 이미 환자 질병 단계가 어느 정도 진행된 상태에서 나타나는 증상을 가지고 진단하기 때문이다. 현재 알츠하이머 질환을 가장 정확하게 진단하는 방법은 CSF 내 존재하는 Aβ42 혹은 다른 바이오 마커인 타우 단백질을 항체를 이용하여 농도를 비교분석하는 효소면역측정법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)이 있으며, 뇌영상검사로 PET/SPECT 혹은 MRI 진단법이 있다.

하지만, ELISA 경우 환자의 CSF를 취한 후, 검사가 진행되는 침습적 방법으로 환자에게 극심한 고통을 제공하며, 단순히 항체를 이용한 진단법으로서 검출한계로 인한 정확한 진단을 하기에 다소 문제가 있으며, 뇌영상 검사의 경우 비록 정확한 편이지만 영상이미지를 얻기 위해 방사성 동위원소, 금속 혹은 다양한 화합물을 처리하여 진단이 진행됨에 따라 환자에게 부작용을 나타내는 문제가 수반된다.

따라서, 알츠하이머 질환의 조기 진단을 위하여 위와 같은 단점을 극복할 수 있는 새로운 진단제 개발이 시급한 실정이며, 진단탐침의 개발에 소용되는 비용, 시간뿐만 아니라 진단의 민감도 및 소요시간에 관련된 다양한 제한적인 요건을 극복하기 위하여 보다 안정하고 민감도가 높은 진단 탐침을 개발하고자 하는 시도가 이루어지고 있으나(JP 2016-539911 A 등 참조), 아직 미미한 수준이다.

본 발명자들은 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질환의 대표적인 바이오 마커인 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 펩타이드 프로브를 발굴하기 위하여 파지 디스플레이(Phage display) 기술을 이용하여 연구노력한 결과, 랜덤 파지(Phage) 라이브러리로부터 아밀로이드 베타 단백질에 높은 특이성 및 친화력을 갖는 선형 펩타이드를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 아밀로이드 베타 단백질 표적용 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 이용한 아밀로이드 베타 단백질 검출 방법, 상기 펩타이드를 포함하는 아밀로이드 베타 단백질 이미징용 프로브, 상기 프로브를 포함하는 아밀로이드 베타 단백질 검출용 조성물 또는 알츠하이머 진단용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 아밀로이드 베타 단백질 표적용 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는, 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는, 아밀로이드 베타 단백질 이미징용 프로브를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는, 아밀로이드 베타 단백질 검출용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프로브를 포함하는, 알츠하이머 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 아밀로이드베타 검출 방법을 제공한다:

(a) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함될 수 있는 아밀로이드베타의 결합 여부를 확인하는 단계.

본 발명의 일 구현예로, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지될 수 있다.

본 발명에 따른 선형 펩타이드는 항체를 대체할 수 있는 새로운 기술로서, 기존에 보고된 바 있는 다른 펩타이드 진단제 보다 극미량으로도 아밀로이드 베타 진단에 효과적이며, 3차원적 구조로 인하여 높은 물리 화학적 안정성을 갖는 저분자 물질이다. 이에, 본 발명에 따른 펩타이드를 신규한 진단 탐침자로 이용하여 알츠하이머 메인 바이오마커로 알려진 아밀로이드 물질을 진단함으로써 기존 치료보다 더 효율적인 알츠하이머 질환 진단에 응용될 것이라고 기대된다.

도 1은 Aβ42 유전자 클로닝 및 단백질 정제를 위한 각각의 과정을 도시한 도면으로서, 도 1a는 Aβ42 DNA와 아미노산 서열과 PCR 증폭을 이용한 Aβ42 DNA를 확보한 결과, 도 1b는 pET-28a 발현 벡터에 ligation을 통한 Aβ42 DNA 삽입 후, 클로닝 서열을 확인한 결과, 도 1c는 E. coli에서 발현 후, affinity chromatography를 통한 Aβ42 단백질 정제 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 Aβ42 단백질과 결합하는 펩타이드 발현 파지 스크리닝을 위한 M13 파지 펩타이드 스크리닝에 대한 개략적인 계획도를 나타낸 것이다.
도 3은 바이오 패닝에 따른 Aβ42 결합 펩타이드를 코딩한 파지의 검출빈도 및 서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4a는 Aβ42 단백질에 결합하는 각 파지에 대한 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4b는 선별된 5개의 파지 중 BSA에 대하여 특이성을 갖는 파지의 결합력을 추가로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 펩타이드를 표지한 후, Aβ42 단백질에 대한 결합력을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 펩타이드(SPHLHTSSPWER)와 기존 Aβ42를 진단하는 항체 간의 Aβ42 단백질에 대한 결합 여부를 면역조직염색법을 이용하여 확인한 결과로서, 도 6a는 TG mouse (6 month), 도 6b는 TG mouse (12 month)의 뇌조직을 이용한 결과이다.
도 7은 lABP4(RVAPDFSCAYPY)와 기존 Aβ42를 진단하는 항체 간의 Aβ42 단백질에 대한 결합 여부를 면역조직염색법을 이용하여 확인한 결과로서, 도 7a는 TG mouse (6 month), 도 7b는 TG mouse (12 month)의 뇌조직을 이용한 결과이다.

아밀로이드 베타, 보다 구체적으로 아밀로이드베타 42(Aβ42)는 치매를 일으키는 가장 흔한 퇴행성 뇌질환인 알츠하이머 질환의 대표적 바이오 마커이다. 본 발명자들은 재조합 Aβ42 단백질에 대하여 랜덤 파지로부터 특이적으로 높은 친화도를 보이는 파지를 파지 디스플레이 과정을 이용하여 선별하고, 선별된 파지들의 염기서열 및 특성 분석, 파지에 발현에 펩타이드를 합성하여 결합력을 측정하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 아밀로이드 베타 단백질 표적용 펩타이드를 제공한다.

본 발명에 따른 펩타이드는 12개의 아미노산으로 구성된 선형 펩타이드(linear peptide)로서, 그 크기가 작아서 3차원적으로 안정화되어 있어 높은 물리 화학적 안정성을 갖는 저분자 펩타이드이다. 또한 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 대량 생산이 항체에 비해 상대적으로 간단하고, 독성이 거의 없는 장점이 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 저분자 펩타이드는 표적 물질인 아밀로이드 베타 단백질에 대한 결합력이 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다.

본 발명에 따른 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있다. 우선, 통상적인 방법에 따라 상기 펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제작된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 이 기술분야에서 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 펩타이드가 숙주로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 펩타이드는 N-말단의 아미노 말단의 반응성 제거를 위한 공지된 변성이 가능하고, 예를 들어 아세틸화(Acetylation)가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 펩타이드 범위에 포함될 수 있는 생물학적 기능 균등물은 본 발명에 따른 펩타이드와 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이에 한정될 것이라는 것은 당업자에게 명확하다.

이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.

변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스 (hydropathic idex)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신 (+4.5); 발린 (+4.2); 루이신 (+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글라이신 (-0.4); 쓰레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).

펩타이드의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드를 초래한다는 것도 잘 알려져 있으며, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트 (+3.0± 1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글라이신 (0); 쓰레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5 ± 1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 루이신 (-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).

친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.

분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 펩타이드에서의 아미노산 교환도 당해 분야에 공지되어 있으며, 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에 따른 펩타이드는 서열번호 1에 기재된 서열과 실질적인 동일성 (substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%의 상동성, 가장 바람직하게는 96%, 97%, 98%, 99%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

본 발명의 실시예에서는 파지 디스플레이(Phage Display)를 통해 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 선별하고, 이에 대한 진단 탐침자로서의 성능을 검출한 결과, 본원발명에 따른 선형 펩타이드에 의한 형광신호가 기존 항체의 형광신호와 같은 위치에서 신호를 내는 것을 직접적으로 확인하였다.

따라서, 본원발명에 따른 선형 펩타이드는 아밀로이드 베타에 특이적으로 강한 결합력을 나타내는바, 아밀로이드 베타 단백질을 검출하는 탐침자로서 알츠하이머를 진단하는데 유용하게 이용할 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 펩타이드를 포함하는 아밀로이드 베타 단백질 이미징용 프로브, 상기 프로브를 포함하는 아밀로이드 베타 단백질 검출용 조성물 또는 알츠하이머 진단용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 아밀로이드베타 검출 방법을 제공한다:

(a) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함될 수 있는 아밀로이드베타의 결합 여부를 확인하는 단계.

본 발명에서, 본 발명에 따른 펩타이드가 아밀로이드 베타 단백질에 결합하였는지를 용이하게 확인, 검출 및 정량하기 위하여, 본 발명에 따른 펩타이드는 표지된 상태로 제공될 수 있다. 즉, 검출 가능한 표지에 링크(예: 공유 결합 또는 가교)되어 제공될 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 발색효소(퍼옥시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 등), 형광물질(FITC, RITC, 로다민 (rhodamine), 텍사스레드(Texas Red), 플로레신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 퀀텀닷(quantum dots)), 크로모포어(chromophore) 및 방사성 동위원소(¹²⁴I, ¹²⁵I, ¹¹¹In, ^99mTc, ³²P, ³⁵S 등)로 구성된 군에서 선택되는 적어도 어느 하나일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. Aβ42 유전자 클로닝 및 단백질 정제

Aβ42 단백질을 E. coli 상에서 발현시키고 대량생산 및 분리를 위하여 Aβ42 유전자를 PCR을 통하여 증폭하였다(도 1a). 증폭한 Aβ42 유전자는 단백질로 발현하기 위하여 발현벡터인 pET-28a에 삽입한 뒤, 발현 벡터를 발현 숙주인 단백질 발현용 대장균 BL21(DE3)에 형질전환(transformation)을 시키고, 0.5 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside), 37℃ 조건하에서 4시간 동안 Aβ42 단백질 생산을 유도하였다. E. coli에서 발현 후, affinity chromatography를 통하여 Aβ42 단백질을 정제하였다 (도 1b 및 도 1c).

실시예 2. Aβ42 결합 프로브 스크리닝 - 파지 디스플레이(Phage Display)

Aβ42 단백질과 결합하는 펩타이드 발현 파지 스크리닝을 위한 M13 파지 펩타이드 스크리닝에 대한 개략적인 계획도는 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, Histidine이 tagging되어 있는 단백질을 Nickel 이온이 충전된 NTA-resin(Ni Sepharose 6 Fast Flow)에 배위 결합을 통해 결합하였다. 이러한 파지 선별 과정은 기존에 주로 사용된 방법인 단백질과 플레이트 표면 사이의 소수성 상호작용(Hydrophobic interaction)에 의하여 단백질을 고정시킨 후 파지를 선별하는 방법과 비교하여, 단백질 구조 변성이 없어 좀더 자연적인 단백질 구조를 나타내어 보다 높은 특이도를 갖는 파지 디스플레이를 가능하게 한다. 이렇게 고정된 단백질에 랜덤 파지 펩타이드 라이브러리(M13 파지 gp3 minor coat 단백질에 융합된 선형 12개의 아미노산으로 구성된 무작위 배열을 통하여 27억 개의 다양한 아미노산 서열을 가지도록 제작된 파지 펩타이드 라이브러리-Ph.D^TM(Phage Display Peptide Library Kit, New England Biolabs를 구입하여 사용함))를 이용한 스크리닝 과정에서 보다 높은 특이성 및 결합력 분석이 가능하도록 디자인하였다. Aβ42 단백질과 결합하는 파지 펩타이드를 스크리닝 하기 위하여, Aβ42 단백질이 고정된 레진(resin)에 M13 파지 라이브러리를 넣어 Aβ42 단백질과 결합시킨 후, 다양한 결합 시간 및 세척조건을 통하여 높은 친화력으로 결합하는 펩타이드 발현 파지를 선별하였다.

보다 구체적으로, 상기와 같이 얻어진 파지를 대장균(E. coli ER2738)에 감염시켜 증폭시키고, 증폭된 파지를 다시 Aβ42 단백질과 결합시킨 후, 세척 조건의 강도와 반응 시간을 조절하면서 보다 강한 결합력을 갖는 파지를 찾는 과정을 반복하였다. 이러한 일련의 과정을 바이오패닝(Biopanning)이라 하며, 구체적인 바이오패닝 실험 조건은 하기 표 1에 나타내었다.

[표 1]

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 단계마다 강한 세척조건, 짧은 반응 시간으로 반응 조건을 다양하게 변화시켰으며, 바이오 패닝을 실시하여 Aβ42 단백질에 결합하는 펩타이드를 가진 파지를 확보하였다. 상기에 의하여 얻어진 파지를 숙주세포인 대장균 E. coli ER2738 세포에 감염시켜서 LB 배지에서 증폭시킨 후, 60여 개의 파지 플라그를 선별 및 M13 파지 게놈성 DNA(Single Strand DNA)를 분리 정제하여 각각의 유전자 염기서열을 확인하게 되고, 파지 표면 단백질(gp3 minor coat 단백질)에 발현되어 Aβ42 단백질과 결합하도록 제작된 펩타이드 부분의 아미노산 염기서열을 규명하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Aβ42 결합 펩타이드를 코딩한 5종의 파지를 스크리닝하였다.

실시예 3: Aβ42 결합 파지에 대한 펩타이드 서열 및 결합력 분석

상기 실시예 2를 통해 스크리닝된 파지 5종의 결합력 분석을 진행하기 위하여 먼저 각각의 펩타이드가 발현된 파지를 증폭한 뒤 타이터링(Titering)을 통하여 파지 용액의 농도를 결정하였다. 이후, Aβ42가 결합된 플레이트에 파지를 농도별로 넣어주어 결합한 파지의 양을 측정함으로써 각각의 펩타이드 발현 파지의 결합력을 산출하였다.

보다 구체적으로, Aβ42가 결합된 플레이트에 파지를 넣어준 뒤 세척하여 파지 표면 단백질을 인식하는 항체(Anti-M13 Monoclonal Antibody)를 이용한 효소면역측정법(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)를 수행하였다. 해당 농도에 따르는 ELISA 신호를 표시하여 이를 포화곡선에 맞추어 외견상 Kd 값을 결정하였다.

실험 과정은 Aβ42 단백질(5μg/ml)을 Ni-NTA-plate에 고정, BSA를 이용하여 blocking시킨 후 증폭된 파지를 넣어준 뒤 2 시간 고정시키고, 1 X TBST 세척용액으로 5번 세척을 한 후, 항-M13 항체를 1시간 결합시켰다. 다음으로 항체가 붙은 단백질을 동일 세척용액으로 10번 세척한 다음, 2차 항체(HRP-conjugated Polyclonal Antibody)를 1시간 결합시키고, TMB(3,3' 5,5'-tetramethylbenzidine) 기질 용액을 15분 반응을 한 후, 1M 황산을 넣어 반응을 종결시켰다. Kd 값은 450 nm에서 측정하여 얻어진 값으로 결정하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이, 파지 1은 13.07 ± 5.88 pM, 파지 2는 1548.22 ± 835.51 pM, 파지 3은 637.02 ± 815.98 pM, 파지 4는 217.97 ± 27.01 pM, 파지 5는 1282.66 ± 269.73 pM로, 5개 펩타이드 발현 파지가 모두 피코몰 농도(pM) 범위의 결합력을 나타냄을 확인확인할 수 있었다.

한편, 5개의 파지 중 BSA에 대하여 특이성을 갖는 파지의 결합력을 추가로 분석하였고, 그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, 파지 4가 BSA에 대하여 특이성을 가짐을 확인하였고, 이외의 파지는 낮은 결합력 및 낮은 특이도를 갖는 것으로 확인하였다.

실시예 4: Aβ42 결합 펩타이드 변형 및 합성을 통한 결합력 분석

상기 실시예 3을 통해 선별된 펩타이드 발현 파지 4에서 Aβ42 단백질을 특이적으로 인지하는 높은 결합력을 가진 1개의 선형 펩타이드(linear Aβ42 binding Binding Peptide, lABP) 서열에 대하여 신호를 나타내기 위해 Biotin을 결합하여 합성하였고, 구체적인 서열은 다음과 같다:

Nickel resin-ABP #4 : (Biotin)-SPHLHTSSPWER-NH₂ (서열번호 1)

표기된 아미노산 서열은 아미노 말단(N-말단)부터 나타낸다. N-말단에는 신호를 나타낼 수 있는 스트렙타비딘(Streptavidin)과 강한 결합이 가능한 비오틴(Biotin)을 연결하였으며, C-말단에는 아미노산 반응성 제거를 위하여 아미드화(Amidation) 시켰다. 펩타이드의 Aβ42 단백질에 대한 결합력 분석을 위하여 펩타이드를 Aβ42 단백질이 고정된 플레이트에 농도별로 희석하여 결합시켰다. 플레이트의 각 웰의 Aβ42 단백질에 결합한 펩타이드는 HRP와 TMB 용액의 발색반응을 이용하여 450 nm에서 펩타이드 농도에 대한 흡광도를 측정하였다. 펩타이드의 농도에 따른 흡광신호를 표지하여 포화곡선에 맞추어 Kd 값을 결정하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 펩타이드와 Aβ42 사이 결합력이 1.93±0.11μM로 나타났는바, Aβ42에 대하여 높은 결합력을 가짐을 확인할 수 있었다.

실시예 5: TG mouse를 이용한 선형 펩타이드의 Aβ42 검출능력 검증

5-1. TG mouse brain의 면역 조직 화학 염색법을 위한 뇌조직 고정 및 박절

면역 조직 화학 염색법을 위해 각각 생후 6달, 12달된 TG mouse를 사용하였다. 쥐를 희생시킨 후 0.9% saline으로 관류하여 체내의 피를 제거하였다. 체내의 모든 피를 제거한 후 4% paraformaldehyde로 24 시간 동안 고정하였다. 고정 후 뇌를 적출하였고 적출된 뇌는 30% sucrose에 2~3일 동안 뇌가 튜브에 바닥에 가라앉을 때까지 보관하였다. 마지막으로 -20℃에서 optimal cutting temperature (OCT) compound를 사용하여 고정한 후 20μm 간격으로 coronal section하였다.

5-2. 진단 탐침자로서의 선형 펩타이드 성능 검증

발굴된 펩타이드 프로브의 Aβ42에 대한 진단 능력 검증을 위하여 human Aβ42를 과발현하는 TG mouse의 뇌조직을 이용하여 펩타이드 프로브를 통한 면역 조직 화학 염색법을 통해 진단 탐침자로서의 검출 능력을 분석하였다. 기존 Aβ42를 진단하는 항체를 이용한 염색법과 비교하여 새롭게 개발된 선형 펩타이드의 프로브로써의 성능을 검증하였다. 보다 구체적으로, 뇌조직 절편을 슬라이드 글라스에 올려놓은 후 오염을 막기 위해 super pap pen을 이용하였다. 고정된 뇌 조직은 0.01M PBS에 섞인 50% 에탄올에 30분 동안 반응시켜 pereabilization 과정을 거쳤다. Endogenous peroxidase의 활성을 막기 위해 0.3% 과산화수소에 10분 동안 반응 시킨 후 10% normal serum에 1시간 배양하였다. 준비된 뇌 조직은 아밀로이드 베타를 인지하는 1차 항체(D54D2)를 1:100, biotin이 라벨되어있는 펩타이드(Nickel resin-ABP4 및 lABP4)를 2μM로 희석시킨 0.5% serum에 O/N으로 배양하였다. 이후 anti-rabbit tetramethylrhodamine과 Streptavidin Alexa Flour 488을 각 제품의 protocol에 맞게 희석시킨 0.5% serum에 120분 배양하였다. 염색된 뇌 조직은 PBS로 충분히 세척한 후, DAPI를 포함하고 있는 mounting용액을 이용하여 글라스슬라이드에 mounting한 후 형광 현미경을 이용하여 염색결과를 분석하였다.

도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, Nickel resin-ABP4를 사용하여 TG mouse (6 month 및 12 month)의 뇌조직을 염색한 결과, 본원발명에 따른 선형 펩타이드에 의한 형광신호가 항체의 형광신호와 같은 위치에서 신호를 내는 것을 확인할 수 있었다.

반면, 도 7a 및 도 7b에 나타낸 바와 같이, lABP4(RVAPDFSCAYPY)를 사용하여 TG mouse (6 month 및 12 month)의 뇌조직을 염색한 결과, 펩타이드의 형광신호가 항체의 형광신호와 같은 위치에서 검출되지 못하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터, 본원발명에 따른 선형 펩타이드는 아밀로이드 베타에 특이적으로 강한 결합력을 나타내어 진단 탐침자로서 유용하게 이용가능함을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Hanyang University <120> Peptide probe for detecting amyloid beta <130> PD17-085 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide probe for amyloid beta <400> 1 Ser Pro His Leu His Thr Ser Ser Pro Trp Glu Arg 1 5 10

Claims (8)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 아밀로이드 베타 단백질 표적용 펩타이드.
   
2. 제1항의 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는, 핵산 분자.
   
3. 제1항의 펩타이드를 포함하는, 아밀로이드 베타 단백질 이미징용 프로브.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는, 프로브.
   
5. 제3항의 프로브를 포함하는, 아밀로이드 베타 단백질 검출용 조성물.
   
6. 제3항의 프로브를 포함하는, 알츠하이머 진단용 조성물.
   
7. 하기 단계를 포함하는 아밀로이드베타 검출 방법:
   (a) 제1항의 따른 펩타이드와 검출 대상 시료를 접촉시키는 단계; 및
   (b) 상기 펩타이드와 검출 대상 시료에 포함될 수 있는 아밀로이드베타의 결합 여부를 확인하는 단계.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 펩타이드는 발색효소, 방사성 동위원소, 크로모포어(chromopore), 발광물질 및 형광물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나로 표지된 것을 특징으로 하는, 검출방법.

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