KR20210091170A - 인터류킨 10 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20210091170A
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unnatural amino
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KR1020217014864A
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Inventor
카롤리나 이. 카파로
제로드 프타신
마르코스 밀라
Original Assignee
신톡스, 인크.
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Abstract

인터류킨 10 접합체 및 하나 이상의 적응증의 치료에서의 용도가 본원에 개시된다. 하나 이상의 IL-10 접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 키트가 또한 본원에 기재된다.

Description

인터류킨 10 접합체 및 이의 용도
상호 참조
본 출원은 2018년 11월 8일 출원된 미국 가출원 제62/757,690호 및 2019년 10월 4일 출원된 미국 가출원 제62/911,036호의 이익을 주장하며, 이들 전문은 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 2019년 11월 4일에 생성된 상기 ASCII 사본은 명칭이 46085-727_851_SL.txt이고 용량이 4,157 바이트이다.
서로 다른 T세포 집단은 면역 항상성과 관용을 유지하도록 면역계를 조절한다. 예를 들어, 조절 T(Treg) 세포는 병리학적 자가-반응성을 방지함으로써 면역계에 의한 부적절한 반응을 방지하는 반면, 세포독성 T세포는 감염된 세포 및/또는 암세포를 표적화하고 파괴한다. 일부 예에서, 상이한 T세포 집단의 조절은 질환 또는 적응증의 치료에 대한 옵션을 제공한다.
특정 구현예에서, 인터류킨 10(IL-10) 접합체 및 하나 이상의 적응증의 치료에서의 이의 용도가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 암의 치료를 위한 IL-10 접합체가 본원에 개시된다. 추가의 경우, 본원에 기재된 IL-10 접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 키트가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 접합 모이어티에 결합된 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하되, 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 33 내지 158과 99.0% 동일한, 변형된 인터류킨 10(IL-10) 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 1 내지 160과 적어도 95.0% 동일하다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 1 내지 160과 적어도 97.0% 동일하다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 1 내지 160과 적어도 98.0% 동일하다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 13개의 리신 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 서열번호 1 내의 E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, 또는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 및 82에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Q70, E74, N82, K88, N126, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 70, 74, 82, 88, 126, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 a) 리신 유사체이거나; b) 방향족 측쇄를 포함하거나; c) 아지도기를 포함하거나; d) 알킨기를 포함하거나; e) 알데하이드 또는 케톤기를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 방향족 측쇄를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), BCN-L-리신, 노보넨 리신, TCO-리신, 메틸테트라진 리신, 알릴옥시카보닐리신, 2-아미노-8-옥소노난산, 2-아미노-8-옥소옥탄산, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF), p-요오도-L-페닐알라닌, m-아세틸페닐알라닌, 2-아미노-8-옥소노난산, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, O-알릴티로신, O-메틸-L-티로신, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 포스포노티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-포스포세린, 포스포노세린, L-3-(2-나프틸)알라닌, 2-아미노-3-((2-((3-(벤질옥시)-3-옥소프로필)아미노)에틸)셀라닐)프로판산, 2-아미노-3-(페닐셀라닐)프로판산, 또는 셀레노시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍에 의해, 변형된 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍의 직교성 tRNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 제2 변형된 IL-10 폴리펩티드와 이량체화되어, 2개의 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 이량체를 생성한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드의 비천연 아미노산은 제2 변형된 IL-10 폴리펩티드의 비천연 아미노산과 다른 잔기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 두 비천연 아미노산은 모두 각각의 IL-10 폴리펩티드의 동일한 잔기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 포함하지 않는 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 야생형 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 접합 모이어티는 수용성 중합체, 지질, 단백질, 또는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 PEG 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 선형 PEG이다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 분지형 PEG이다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알루론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린, 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산은 약 6개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 18개의 탄소 원자, 약 20개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 약 12개 내지 약 18개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산은 포화 지방산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 알부민, 트랜스페린, 또는 트랜스티레틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 항체의 Fc 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 XTEN 펩티드, 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP), PAS 폴리펩티드, 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELP), CTP 펩티드, 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 변형된 IL-10의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 링커는 동종이작용성 링커, 이종이작용성 링커, 제로-길이 링커, 절단 가능한 또는 절단 불가능한 디펩티드 링커, 말레이미드기, 스페이서, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 a) 전장 IL-10 폴리펩티드의 기능적 활성 단편; b) 재조합 IL-10 폴리펩티드; 또는 c) 재조합 인간 IL-10 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 N-말단 결실, C-말단 결실, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 결실은 N-말단으로부터의 처음 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 25개, 또는 30개 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 구현예에서, C-말단 결실은 C-말단으로부터의 마지막 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 또는 그 이상의 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체는 IL-10R에 결합하여 IL-10/IL-10R 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 30일, 또는 그 이상 더 길다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 약 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 폴리펩티드의 이량체화를 실질적으로 방해하지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 이량체와 IL-10R의 결합을 크게 방해하지는 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하보다 적게 손상시킨다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 세포의 Stat3 인산화 및/또는 IL-10R 신호전달 활성화 능력에 의해 정의되는 IL-10R의 신호전달을 크게 손상시키지는 않는다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 단리되고 정제된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 제형으로 제형화될 수 있다. 일부 구현예에서, 약학적 제형은 전신 전달용으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 청구항 1의 변형된 IL-10 폴리펩티드 2개를 포함하는 변형된 IL-10 동종이량체가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, IL-10 수용체(IL-10R)에 결합된 본 발명의 변형된 동종이량체의 복합체를 포함하는 조성물이 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 증식성 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본 발명의 변형된 IL-10 폴리펩티드의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 증식성 질환 또는 병태는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 구현예에서, 고형 종양 암은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 안암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 또는 전립선암이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 변형된 IL-10 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자가 본원에 개시된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터가 본원에 개시된다.
특정 구현예에서, IL-10 수용체와의 상호작용을 크게 변경하지 않으면서 혈장 반감기를 향상시키는 폴리펩티드 상의 위치에 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리되고 변형된 인터류킨 10(IL-10) 폴리펩티드가 본원에 개시되고, 여기서 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 단백질의 혈장 반감기와 비교된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E의 표면 노출된 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, 또는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 및 82에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Q70, E74, N82, K88, N126, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 70, 74, 82, 88, 126, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 33 내지 158과 적어도 또는 약 99.0% 동일하다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 또는 13개의 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157 중 하나 이상에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157 중 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 a) 리신 유사체이거나; b) 방향족 측쇄를 포함하거나; c) 아지도기를 포함하거나; d) 알킨기를 포함하거나; e) 알데하이드 또는 케톤기를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 방향족 측쇄를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), BCN-L-리신, 노보넨 리신, TCO-리신, 메틸테트라진 리신, 알릴옥시카보닐리신, 2-아미노-8-옥소노난산, 2-아미노-8-옥소옥탄산, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF), p-요오도-L-페닐알라닌, m-아세틸페닐알라닌, 2-아미노-8-옥소노난산, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, O-알릴티로신, O-메틸-L-티로신, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 포스포노티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-포스포세린, 포스포노세린, L-3-(2-나프틸)알라닌, 2-아미노-3-((2-((3-(벤질옥시)-3-옥소프로필)아미노)에틸)셀라닐)프로판산, 2-아미노-3-(페닐셀라닐)프로판산, 또는 셀레노시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍에 의해, 변형된 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍의 직교성 tRNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 제2 변형된 IL-10 폴리펩티드와 이량체화되어, 2개의 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 이량체를 생성한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드의 비천연 아미노산은 제2 변형된 IL-10 폴리펩티드의 비천연 아미노산과 다른 잔기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 두 비천연 아미노산은 모두 각각의 IL-10 폴리펩티드의 동일한 잔기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 포함하지 않는 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 야생형 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 접합 모이어티에 공유 부착된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 수용성 중합체, 지질, 단백질, 또는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 PEG 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 선형 PEG이다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 분지형 PEG이다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알루론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린, 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산은 약 6개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 18개의 탄소 원자, 약 20개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 약 12개 내지 약 18개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산은 포화 지방산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 알부민, 트랜스페린, 또는 트랜스티레틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 항체의 Fc 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 XTEN 펩티드, 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP), PAS 폴리펩티드, 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELP), CTP 펩티드, 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 변형된 IL-10의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 링커는 동종이작용성 링커, 이종이작용성 링커, 제로-길이 링커, 절단 가능한 또는 절단 불가능한 디펩티드 링커, 말레이미드기, 스페이서, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 a) 전장 IL-10 폴리펩티드의 기능적 활성 단편; b) 재조합 IL-10 폴리펩티드; 또는 c) 재조합 인간 IL-10 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 N-말단 결실, C-말단 결실, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 결실은 N-말단으로부터의 처음 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 25개, 또는 30개 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 구현예에서, C-말단 결실은 C-말단으로부터의 마지막 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 또는 그 이상의 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체는 IL-10R에 결합하여 IL-10/IL-10R 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 30일, 또는 그 이상 더 길다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 약 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 폴리펩티드의 이량체화를 실질적으로 방해하지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 이량체와 IL-10R의 결합을 크게 방해하지는 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하보다 적게 손상시킨다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 세포의 Stat3 인산화 및/또는 IL-10R 신호전달 활성화 능력에 의해 정의되는 IL-10R의 신호전달을 크게 손상시키지는 않는다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, K88, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 88, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82 또는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82 및 129에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 129에 상응한다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, K88, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 88, 129, 130, 및 132에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 130, 및 132에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 130, 및 132에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 132에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82 또는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82 및 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 132에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 132에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 132에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 132에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82, N129, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82, 129, 132에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82 또는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82 및 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82 또는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82 및 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82 또는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82 및 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82 또는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82 및 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82 또는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82 및 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 82에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N129로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 129에 상응하고, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 접합 모이어티에 공유 부착된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 수용성 중합체, 지질, 단백질, 또는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 PEG 분자에 공유 부착된다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 선형 PEG이다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 분지형 PEG이다. 일부 구현예에서, PEG의 중량 평균 분자량은 약 100 달톤 내지 약 150,000 달톤이다. 예시적인 범위는 예를 들어 5,000 달톤 초과 내지 약 100,000 달톤의 범위, 약 6,000 달톤 내지 약 90,000 달톤의 범위, 약 10,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 10,000 달톤 초과 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 20,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 53,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 25,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 약 29,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 약 35,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 및 약 40,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위의 중량 평균 분자량을 포함한다. PEG에 대한 예시적인 중량 평균 분자량은 약 100 달톤, 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 1,500 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 4,500 달톤, 약 5,000 달톤, 약 5,500 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 45,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 55,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 65,000 달톤, 약 70,000 달톤, 및 약 75,000 달톤을 포함한다. 상기 임의의 총 분자량을 갖는 PEG의 분지형 형태(예를 들어, 2개의 20,000 달톤 중합체로 이루어진 분지형 40,000 달톤 PEG)가 또한 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 5,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 7,500 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 8,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 9,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 10,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 11,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 12,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 13,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 14,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 15,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 16,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 17,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 18,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 19,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 20,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 21,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 22,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 23,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 25,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 30,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 40,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 50,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 60,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 70,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 80,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 90,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 100,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 120,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 130,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 140,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 150,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 175,000 달톤이다. 일부 구현예에서, PEG의 분자량은 약 200,000 달톤이다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 모노사카라이드 또는 폴리사카라이드에 공유 부착된다. 특정 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 모노사카라이드에 공유 부착된다. 특정 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 폴리사카라이드에 공유 부착된다. 특정 구현예에서, 모노사카라이드 또는 폴리사카라이드는 폴리펩티드의 시스테인 또는 아스파라긴 잔기를 통해 링커에 의해 IL-10 폴리펩티드에 결합된다. 특정 구현예에서, 모노사카라이드 또는 폴리사카라이드는 폴리펩티드의 시스테인 잔기를 통해 링커에 의해 IL-10 폴리펩티드에 결합된다. 특정 구현예에서, 모노사카라이드 또는 폴리사카라이드는 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기를 통해 링커에 의해 IL-10 폴리펩티드에 결합된다.
본원에 개시된 특정 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 PEG 분자에 공유 부착되고, 폴리펩티드의 다른 아미노산을 통해 모노사카라이드 또는 폴리사카라이드에 공유 부착된다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 선형 PEG이다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 분지형 PEG이다. 특정 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 PEG 분자에 공유 부착되고, 폴리펩티드의 다른 아미노산을 통해 모노사카라이드에 공유 부착된다. 특정 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 PEG 분자에 공유 부착되고, 폴리펩티드의 다른 아미노산을 통해 폴리사카라이드에 공유 부착된다. 특정 구현예에서, 모노사카라이드 또는 폴리사카라이드는 폴리펩티드의 시스테인 또는 아스파라긴 잔기를 통해 링커에 의해 IL-10 폴리펩티드에 결합된다. 특정 구현예에서, 모노사카라이드 또는 폴리사카라이드는 폴리펩티드의 시스테인 잔기를 통해 링커에 의해 IL-10 폴리펩티드에 결합된다. 특정 구현예에서, 모노사카라이드 또는 폴리사카라이드는 폴리펩티드의 아스파라긴 잔기를 통해 링커에 의해 IL-10 폴리펩티드에 결합된다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리되고 변형된 인터류킨 10(IL-10) 폴리펩티드가 본원에 개시되고, 여기서 단리되고 변형된 IL-10 폴리펩티드는 IL-10 수용체(IL-10R)에 결합하여 IL-10/IL-10R 복합체를 형성하는 생물학적 활성 IL-10 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 생물학적 활성 IL-10 폴리펩티드는 야생형 IL-10 단백질의 혈장 반감기에 비해 실질적으로 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E의 표면 노출된 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, 또는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 및 82에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Q70, E74, N82, K88, N126, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 70, 74, 82, 88, 126, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 33 내지 158과 적어도 또는 약 99.0% 동일하다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 또는 13개의 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157 중 하나 이상에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157 중 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 a) 리신 유사체이거나; b) 방향족 측쇄를 포함하거나; c) 아지도기를 포함하거나; d) 알킨기를 포함하거나; e) 알데하이드 또는 케톤기를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 방향족 측쇄를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), BCN-L-리신, 노보넨 리신, TCO-리신, 메틸테트라진 리신, 알릴옥시카보닐리신, 2-아미노-8-옥소노난산, 2-아미노-8-옥소옥탄산, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF), p-요오도-L-페닐알라닌, m-아세틸페닐알라닌, 2-아미노-8-옥소노난산, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, O-알릴티로신, O-메틸-L-티로신, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 포스포노티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-포스포세린, 포스포노세린, L-3-(2-나프틸)알라닌, 2-아미노-3-((2-((3-(벤질옥시)-3-옥소프로필)아미노)에틸)셀라닐)프로판산, 2-아미노-3-(페닐셀라닐)프로판산, 또는 셀레노시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍에 의해, 변형된 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍의 직교성 tRNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 제2 변형된 IL-10 폴리펩티드와 이량체화되어, 2개의 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 이량체를 생성한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드의 비천연 아미노산은 제2 변형된 IL-10 폴리펩티드의 비천연 아미노산과 다른 잔기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 두 비천연 아미노산은 모두 각각의 IL-10 폴리펩티드의 동일한 잔기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 포함하지 않는 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 야생형 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 접합 모이어티에 공유 부착된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 수용성 중합체, 지질, 단백질, 또는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 PEG 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 선형 PEG이다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 분지형 PEG이다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알루론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린, 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산은 약 6개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 18개의 탄소 원자, 약 20개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 약 12개 내지 약 18개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산은 포화 지방산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 알부민, 트랜스페린, 또는 트랜스티레틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 항체의 Fc 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 XTEN 펩티드, 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP), PAS 폴리펩티드, 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELP), CTP 펩티드, 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 변형된 IL-10의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 링커는 동종이작용성 링커, 이종이작용성 링커, 제로-길이 링커, 절단 가능한 또는 절단 불가능한 디펩티드 링커, 말레이미드기, 스페이서, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 a) 전장 IL-10 폴리펩티드의 기능적 활성 단편; b) 재조합 IL-10 폴리펩티드; 또는 c) 재조합 인간 IL-10 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 N-말단 결실, C-말단 결실, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 결실은 N-말단으로부터의 처음 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 25개, 또는 30개 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 구현예에서, C-말단 결실은 C-말단으로부터의 마지막 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 또는 그 이상의 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체는 IL-10R에 결합하여 IL-10/IL-10R 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 30일, 또는 그 이상 더 길다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 약 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 폴리펩티드의 이량체화를 실질적으로 방해하지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 이량체와 IL-10R의 결합을 크게 방해하지는 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하보다 적게 손상시킨다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 크게 손상시키지는 않는다.
특정 구현예에서, 종양 침윤 면역세포에 대한 복수의 종양세포의 노출을 강화하는 폴리펩티드 상의 위치에 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리되고 변형된 인터류킨 10(IL-10) 폴리펩티드가 본원에 개시되고, 여기서 복수의 종양세포의 강화된 노출은 야생형 IL-10 단백질 존재하에서의 복수의 종양세포의 노출과 비교된다. 일부 구현예에서, 종양 침윤 면역세포의 세포독성 및/또는 클론 확장을 강화 및/또는 유지하는 폴리펩티드 상의 위치에 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리되고 변형된 인터류킨 10(IL-10) 폴리펩티드가 또한 본원에 기재되고, 여기서 강화된 세포독성 및 클론 확장은 동일한 용량의 야생형 IL-10 단백질로 인한 종양 침윤 면역세포의 노출과 비교된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E의 표면 노출된 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, 또는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 및 82에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Q70, E74, N82, K88, N126, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 70, 74, 82, 88, 126, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 33 내지 158과 적어도 또는 약 99.0% 동일하다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 또는 13개의 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157 중 하나 이상에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157 중 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 a) 리신 유사체이거나; b) 방향족 측쇄를 포함하거나; c) 아지도기를 포함하거나; d) 알킨기를 포함하거나; e) 알데하이드 또는 케톤기를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 방향족 측쇄를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), BCN-L-리신, 노보넨 리신, TCO-리신, 메틸테트라진 리신, 알릴옥시카보닐리신, 2-아미노-8-옥소노난산, 2-아미노-8-옥소옥탄산, p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF), p-요오도-L-페닐알라닌, m-아세틸페닐알라닌, 2-아미노-8-옥소노난산, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L- 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, O-알릴티로신, O-메틸-L-티로신, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 포스포노티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-포스포세린, 포스포노세린, L-3-(2-나프틸)알라닌, 2-아미노-3-((2-((3-(벤질옥시)-3-옥소프로필)아미노)에틸)셀라닐)프로판산, 2-아미노-3-(페닐셀라닐)프로판산, 또는 셀레노시스테인을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍에 의해, 변형된 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍의 직교성 tRNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 제2 변형된 IL-10 폴리펩티드와 이량체화되어, 2개의 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 이량체를 생성한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드의 비천연 아미노산은 제2 변형된 IL-10 폴리펩티드의 비천연 아미노산과 다른 잔기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 두 비천연 아미노산은 모두 각각의 IL-10 폴리펩티드의 동일한 잔기 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 포함하지 않는 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 야생형 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 통해 접합 모이어티에 공유 부착된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 수용성 중합체, 지질, 단백질, 또는 펩티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜)(PPG), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린(POZ), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 PEG 분자를 포함한다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 선형 PEG이다. 일부 구현예에서, PEG 분자는 분지형 PEG이다. 일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리사카라이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알루론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린, 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 지방산을 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산은 약 6개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 18개의 탄소 원자, 약 20개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 약 12개 내지 약 18개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구현예에서, 지방산은 포화 지방산이다. 일부 구현예에서, 단백질은 알부민, 트랜스페린, 또는 트랜스티레틴을 포함한다. 일부 구현예에서, 단백질은 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 항체의 Fc 부분을 포함한다. 일부 구현예에서, 펩티드는 XTEN 펩티드, 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP), PAS 폴리펩티드, 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELP), CTP 펩티드, 또는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 변형된 IL-10의 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 링커는 동종이작용성 링커, 이종이작용성 링커, 제로-길이 링커, 절단 가능한 또는 절단 불가능한 디펩티드 링커, 말레이미드기, 스페이서, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 a) 전장 IL-10 폴리펩티드의 기능적 활성 단편; b) 재조합 IL-10 폴리펩티드; 또는 c) 재조합 인간 IL-10 폴리펩티드이다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 N-말단 결실, C-말단 결실, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, N-말단 결실은 N-말단으로부터의 처음 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 25개, 또는 30개 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 구현예에서, C-말단 결실은 C-말단으로부터의 마지막 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 또는 그 이상의 잔기의 결실을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체는 IL-10R에 결합하여 IL-10/IL-10R 복합체를 형성한다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 30일, 또는 그 이상 더 길다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 약 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일이다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 폴리펩티드의 이량체화를 실질적으로 방해하지 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 이량체와 IL-10R의 결합을 크게 방해하지는 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하보다 적게 손상시킨다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 크게 손상시키지는 않는다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Stat3의 인산화 및/또는 IL-10R 신호전달의 활성화에 의해 측정되는 IL-10R의 신호전달을 손상시키지는 않는다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 IL-10 폴리펩티드를 암호화하는 폴리핵산 중합체가 본원에 개시된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 폴리핵산 중합체를 포함하는 벡터가 본원에 개시된다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 폴리펩티드, 및 적어도 하나의 비천연 아미노산에 결합된 접합 모이어티를 포함하는 인터류킨 10(IL-10) 접합체가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 적어도 하나의 비천연 아미노산에 직접 결합된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 링커를 통해 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E의 표면 노출된 위치에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, 또는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 및 82에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Q70, E74, N82, K88, N126, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 70, 74, 82, 88, 126, 130, 및 132에 상응한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 33 내지 158과 적어도 또는 약 99.0% 동일하다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 또는 13개의 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157 중 하나 이상에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157 중 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 또는 12개에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 아미노산 서열은 K34, K40, K49, K57, K88, K99, K117, K119, K125, K130, K134, K138, 및 K157에서 야생형 리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단에 근접하게 위치한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 2개 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 제2 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 포함하지 않는 제2 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 야생형 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체는 2개 이상의 접합 모이어티를 포함하고, 2개 이상의 접합 모이어티 각각은 각각의 IL-10 단량체 내의 동일한 잔기 위치에 위치한 비천연 아미노산에 결합된다. 일부 구현예에서, IL-10 이량체는 2개 이상의 접합 모이어티를 포함하고, 2개 이상의 접합 모이어티 각각은 IL-10 이량체 내의 상이한 잔기 위치에 위치한 비천연 아미노산에 결합된다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 향상된 혈장 반감기를 포함하고, 여기서 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 단백질의 혈장 반감기와 비교된다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는, IL-10 수용체(IL-10R)에 결합하여 IL-10/IL-10R 복합체를 형성하고 IL-10R 신호전달 경로를 활성화하는 생물학적 활성 IL-10 폴리펩티드이다.
특정 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 변형된 IL-10 이량체 및 IL-10R을 포함하는 IL-10/IL-10R 복합체가 본원에 개시되고, 여기서 변형된 IL-10 이량체는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기에 비해 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 구현예에서, 변형된 IL-10 이량체는 적어도 하나의 비천연 아미노산에 공유 부착된 접합 모이어티를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 단리되고 변형된 IL-10 폴리펩티드 또는 본원에 기재된 IL-10 접합체; 및 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 조성물이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 전신 전달용으로 제형화된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 비경구 투여용으로 제형화된다.
특정 구현예에서, 증식성 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 단리되고 변형된 IL-10 폴리펩티드, 본원에 기재된 IL-10 접합체; 또는 본원에 기재된 약학적 조성물의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 증식성 질환 또는 병태는 암이다. 일부 구현예에서, 암은 고형 종양 암이다. 일부 구현예에서, 고형 종양 암은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 안암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 또는 전립선암이다. 일부 구현예에서, 암은 혈액 악성종양이다. 일부 구현예에서, 혈액 악성종양은 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소형 림프구성 림프종(SLL), 소포성 림프종(FL), 확산성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 맨틀세포 림프종(MCL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 결절외 변연부 B세포 림프종, 결절 변연부 B세포 림프종, 버킷 림프종, 비버킷 고등급 B세포 림프종, 원발성 종격 B세포 림프종(PMBL), 면역모구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, B세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 형질세포 골수종, 형질세포종, 종격(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 또는 림프종모양 육아종증이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 추가 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 단리되고 변형된 IL-10 폴리펩티드, 본원에 기재된 IL-10 접합체; 또는 본원에 기재된 약학적 조성물 및 추가 치료제는 동시에 투여되거나 공동 제형화된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 단리되고 변형된 IL-10 폴리펩티드, 본원에 기재된 IL-10 접합체; 또는 본원에 기재된 약학적 조성물 및 추가 치료제는 순차적으로 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 단리되고 변형된 IL-10 폴리펩티드, 본원에 기재된 IL-10 접합체; 또는 본원에 기재된 약학적 조성물은 추가 치료제 이전에 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 단리되고 변형된 IL-10 폴리펩티드, 본원에 기재된 IL-10 접합체; 또는 본원에 기재된 약학적 조성물은 추가 치료제의 투여 후에 투여된다.
특정 구현예에서, 본원에 기재된 단리되고 변형된 IL-10 폴리펩티드, 본원에 기재된 IL-10 접합체; 또는 본원에 기재된 약학적 조성물을 포함하는 키트가 본원에 개시된다.
본 발명의 다양한 양태는 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시되어 있다. 본 발명의 특징 및 장점은 본 발명의 원리가 이용되는 예시적인 구현예를 설명하는 다음의 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이다.
도 1은 예시적인 비천연 아미노산을 보여준다. 이 도면은 문헌[Young et al., "Beyond the canonical 20 amino acids: expanding the genetic lexicon," J. of Biological Chemistry 285(15): 11039-11044 (2010)]의 도 2에서 발췌된 것이다.
도 2a 및 도 2b는 예시적인 비천연 아미노산을 나타낸다. 도 2a는 예시적인 리신 유도체를 나타낸다. 도 2b는 예시적인 페닐알라닌 유도체를 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d는 예시적인 비천연 아미노산을 나타낸다. 이들 비천연 아미노산(UAA)은 단백질에서 유전자 암호화되었다(도 3a - UAA #1~42; 도 3b - UAA #43~89; 도 3c - UAA #90~128; 도 3d - UAA #129~167). 도 3a 내지 도 3d는 문헌[Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69]의 표 1에서 발췌된 것이다.
사이토카인은 선천성 및 적응성 면역세포 항상성에서 역할을 하는 케모카인, 인터페론, 인터류킨, 림포카인, 종양 괴사 인자, 및 기타 성장 인자와 같은 세포 신호전달 단백질의 군을 구성한다. 사이토카인은 대식세포, B 림프구, T 림프구 및 비만세포, 내피세포, 섬유아세포, 및 다른 기질세포와 같은 면역세포에 의해 생성된다. 일부 경우에, 사이토카인은 체액성 면역 반응과 세포계 면역 반응 사이의 균형을 조절한다.
인터류킨은 T 및 B 림프구, 단핵구 계통의 세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 거핵구, 및 조혈세포의 발달과 분화를 조절하는 신호전달 단백질이다. 인터류킨은 헬퍼 CD4 T 및 B 림프구, 단핵구, 대식세포, 내피세포, 및 기타 조직 상주 세포에 의해 생성된다. 일부 경우에, 약 15개의 인터류킨, 인터류킨 1-13, 인터류킨 15, 및 인터류킨 17이 있다.
IL-10은 종양 침윤 CD8+ T세포의 활성화, CD8+ T세포의 세포 증식, 종양세포에서 MHC 클래스 I을 증가시키고 대식세포에서 MHC 클래스 II를 증가시키는 IFN-γ의 유도, 및 표적세포 용해를 매개하는 세포독성 단백질의 유도에 의해 종양 면역을 생성한다. CD8+ T세포에서의 증가된 T세포 수용체 자극은 항세포자멸 및 증식 신호를 제공한다. 종양 미세환경(TME)에서의 IL-10에 대한 예기치 않은 역할은 항종양 이펙터 세포 반응의 억제로 이어지는 종양 관련 염증을 담당하는 전염증성 Th17 세포 및 사이토카인의 억제이다. 전임상 연구 결과, IL-10 결핍은 종양 발생률을 높이고 면역 감시를 감소시키는 것으로 나타났다. 또한, 페길화된 IL-10을 사용한 Her2 유전자이식 마우스의 치료는 종양 거부를 일으켰지만, 종양에서 CD8a/b+ T세포의 유의한 증가와 함께 IFN-γ 및 그랜자임-발현 CD8+ T세포의 발현을 필요로 한다.
IL-10은 체내에서 비교적 짧은 혈청 반감기를 갖는다. 실제로, 시험관내 생물검정 또는 폐혈성 쇼크 모델 시스템의 효능[Smith et al., Cellular Immunology 173:207-214 (1996) 참조]에 의해 측정된 마우스에서의 반감기는 약 2시간 내지 6시간이다.
특정 구현예에서, 향상된 혈장 반감기를 갖는 변형된 IL-10 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 일부 구현예에서, 이량체화시 종양 침윤 면역세포에 대한 복수의 종양세포의 노출을 강화하는 변형된 IL-10 폴리펩티드가 또한 본원에 기재된다. 다른 구현예에서, 생물학적 활성 IL-10 이량체를 형성하는 변형된 IL-10 폴리펩티드가 또한 본원에 기재된다.
추가로 기재된 것은 IL-10 폴리펩티드 접합체, 하나 이상의 변형된 IL-10 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물, 및 질환 또는 적응증을 치료하는 방법을 포함한다.
변형된 IL-10 폴리펩티드
일부 구현예에서, 아미노산 위치에서 변형된 IL-10 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 일부 경우에, 변형은 천연 아미노산에 대한 것이다. 일부 경우에, 변형은 비천연 아미노산에 대한 것이다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 단리되고 변형된 IL-10 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 단리되고 정제된 포유류 IL-10, 예를 들어 설치류 IL-10 단백질, 또는 인간 IL-10 단백질이다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 인간 IL-10 단백질이다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 서열번호 1에 대해 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 서열번호 1의 서열로 이루어진다. 추가의 경우에, IL-10 폴리펩티드는 서열번호 2에 대해 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 서열 동일성을 포함한다. 추가의 경우에, IL-10 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열을 포함한다. 추가의 경우에, IL-10 폴리펩티드는 서열번호 2의 서열로 이루어진다.
일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 절단된 변이체이다. 일부 경우에, 절단은 N-말단 결실이다. 다른 경우에, 절단은 C-말단 결실이다. 추가의 경우에, 절단은 N-말단 결실 및 C-말단 결실 모두를 포함한다. 예를 들어, 절단은 N-말단 또는 C-말단, 또는 두 말단 모두로부터의 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 또는 그 이상의 잔기의 결실일 수 있다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 20개, 또는 그 이상의 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 2개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 3개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 4개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 5개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 6개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 7개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 8개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 9개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 적어도 또는 약 10개 잔기의 N-말단 결실을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 기능적 활성 단편이다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 5-160, 10-160, 15-160, 20-160, 1-155, 5-155, 10-155, 15-155, 20-155, 1-150, 5-150, 10-150, 15-150, 또는 20-150을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 5-160을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 10-160을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 15-160을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 20-160을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 1-155를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 5-155를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 10-155를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 15-155를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 20-155를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 1-150을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 5-150을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 10-150을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 15-150을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 기능적 활성 단편은 IL-10 영역 20-150을 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 폴리펩티드가 본원에 기재된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E에 위치한다. 일부 경우에, 나선 C는 잔기 L60-N82를 포함하고, 여기서 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 나선 D는 잔기 I87-C108을 포함하고, 여기서 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 나선 E는 잔기 S118-L131을 포함하고, 여기서 위치는 서열번호 1에서의 위치를 참조한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 나선 C, D, 또는 E의 표면 노출 위치에 위치한다.
일부 구현예에서, E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되는 위치에 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 폴리펩티드가 본원에 기재되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67, Q70, E74, E75, Q79, 또는 N82로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 및 82에 상응한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Q70, E74, N82, K88, N126, K130, 또는 Q132로부터 선택되고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 70, 74, 82, 88, 126, 130, 및 132에 상응한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E67로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Q70으로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E74로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 E75로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Q79로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N82로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K88로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K125로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N126으로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 N129로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 K130으로부터 선택된다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 Q132로부터 선택된다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단에 근접하게 위치한다. 본원에 사용된 바와 같이, 근접은 N-말단 잔기로부터 적어도 1개의 잔기만큼 떨어지고 N-말단 잔기로부터 최대 약 50개의 잔기만큼 떨어져 위치한 잔기를 의미한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 10개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 20개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 30개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 40개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기로부터 처음 50개 잔기 내에 위치한다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단 잔기이다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단에 근접하게 위치한다. 본원에 사용된 바와 같이, 근접은 C-말단 잔기로부터 적어도 1개의 잔기만큼 떨어지고 C-말단 잔기로부터 최대 약 50개의 잔기만큼 떨어져 위치한 잔기를 의미한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 10개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 20개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 30개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 40개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기로부터 처음 50개 잔기 내에 위치한다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단 잔기이다.
일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는, IL-10R에 결합할 수 있고 신호전달 경로를 활성화하는 기능적 활성 단량체이다. 일부 경우에, 기능적 활성 IL-10 단량체는 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기와 비교된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 단백질의 혈장 반감기보다 적어도 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 30일, 또는 그 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 단백질의 혈장 반감기에 비해 약 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일이다.
일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 IL-10 이량체, 예를 들어 생물학적 활성 이량체를 형성한다. 일부 경우에, IL-10 이량체(예를 들어, 생물학적 활성 IL-10 이량체)는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함한다. 다른 경우에, IL-10 이량체(예를 들어, 생물학적 활성 IL-10 이량체)는 적어도 2개 이상의 비천연 아미노산을 포함한다. 추가의 경우에, IL-10 이량체(예를 들어, 생물학적 활성 IL-10 이량체)는 적어도 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 또는 그 이상의 비천연 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-10 이량체(예를 들어, 생물학적 활성 IL-10 이량체)는 2개의 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 두 비천연 아미노산은 모두 동일한 IL-10 폴리펩티드에 위치한다. 다른 경우에, 각각의 IL-10 폴리펩티드는 하나의 비천연 아미노산을 포함한다. 이러한 경우에, 각각의 비천연 아미노산은 IL-10 폴리펩티드의 상이한 잔기 위치에 위치한다(즉, 비천연 아미노산 중 하나는 IL-10 폴리펩티드 중 하나의 제1 잔기 위치에 위치하고, 두 번째 비천연 아미노산은 다른 IL-10 폴리펩티드의 제2 잔기 위치에 위치하며, 제2 잔기 위치는 제1 잔기 위치와 다르다). 추가의 경우에, 각각의 비천연 아미노산은 각각의 IL-10 폴리펩티드의 동일한 잔기 위치에 위치한다.
일부 구현예에서, IL-10 이량체(예를 들어, 생물학적 활성 IL-10 이량체)는 하나의 비천연 아미노산을 포함한다. 이러한 경우에, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 포함하지 않는 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다. 일부 경우에, 비천연 아미노산을 포함하지 않는 IL-10 폴리펩티드는 천연 아미노산을 갖는 돌연변이를 포함한다. 다른 경우에, 비천연 아미노산을 포함하지 않는 IL-10 폴리펩티드는 IL-10 변이체, 예를 들어 절단된 IL-10 단백질이다. 일부 경우에, 변형된 IL-10 폴리펩티드는 야생형 IL-10 폴리펩티드와 이량체화된다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 폴리펩티드의 이량체화를 실질적으로 방해하지 않는다.
일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10 이량체와 IL-10R의 결합을 더 이상 크게 방해하지는 않는다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하보다 적게 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 80% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 70% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 60% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 50% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 40% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 30% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 20% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 10% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 5% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 2% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 1% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 크게 손상시키지는 않는다. 추가의 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산의 위치는 IL-10R의 신호전달을 손상시키지 않는다.
일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기와 비교된다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 30일, 또는 그 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 90분 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 2시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 3시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 4시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 5시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 6시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 10시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 12시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 18시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 24시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 36시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 48시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 3일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 4일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 5일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 6일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 7일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 10일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 12일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 14일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 21일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 28일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 이량체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기보다 적어도 30일 이상 더 길다.
일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 또는 30일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 90분의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 2시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 3시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 4시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 5시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 6시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 7시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 8시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 9시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 10시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 11시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 12시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 18시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 24시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 36시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 48시간의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 3일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 4일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 5일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 6일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 7일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 10일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 12일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 14일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 21일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 28일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 생물학적 활성 IL-10 이량체는 약 30일의 향상된 혈장 반감기를 갖는다.
IL-10 접합체
특정 구현예에서, IL-10 접합체가 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, IL-10 접합체는 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 폴리펩티드 및 적어도 하나의 비천연 아미노산에 결합된 접합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 적어도 하나의 비천연 아미노산에 직접 결합된다. 다른 경우에, 접합 모이어티는 하기 기재된 링커를 통해 적어도 하나의 비천연 아미노산에 간접적으로 결합된다.
전술한 바와 같이, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 선택적으로 나선 C, D, 또는 E, 예를 들어 표면 접근 가능 잔기에 위치한다. 일부 경우에, 잔기는 E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 경우에, 잔기는 E67, Q70, E74, E75, Q79, 또는 N82를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 67, 70, 74, 75, 79, 및 82에 상응한다. 일부 경우에, 잔기는 K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 88, 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 경우에, 잔기는 K125, N126, N129, K130, 또는 Q132를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 125, 126, 129, 130, 및 132에 상응한다. 일부 경우에, 잔기는 Q70, E74, N82, K88, N126, K130, 또는 Q132를 포함하고, 여기서 잔기 위치는 서열번호 1에 제시된 위치 70, 74, 82, 88, 126, 130, 및 132에 상응한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단에 근접하게(예를 들어, N-말단 잔기에 근접하게) 위치한다. 예를 들어, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 선택적으로 N-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N-말단에 위치한다(즉, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 IL-10 폴리펩티드의 N-말단 잔기이다).
다른 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단에 근접하게(예를 들어, C-말단 잔기에 근접하게) 위치한다. 예를 들어, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 선택적으로 C-말단으로부터 처음 10개, 20개, 30개, 40개, 또는 50개 잔기 내에 위치한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 C-말단에 위치한다(즉, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 IL-10 폴리펩티드의 C-말단 잔기이다).
일부 경우에, IL-10 접합체는 비천연 아미노산에 결합된 하나의 접합 모이어티를 포함한다.
일부 경우에, IL-10 접합체는 IL-10R 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 IL-10 단량체를 포함한다. 다른 경우에, IL-10 접합체는 기능적으로 활성인 IL-10 이량체를 포함한다.
일부 경우에, IL-10 접합체는 2개 이상의 접합 모이어티를 포함하고, 2개 이상의 접합 모이어티 각각은 상이한 비천연 아미노산에 결합된다. 일부 경우에, 2개 이상의 접합 모이어티는 (예를 들어, 기능적 활성 IL-10 단량체 또는 기능적 활성 IL-10 이량체에서) 동일한 IL-10 폴리펩티드에 접합된다. 다른 경우에, 2개 이상의 접합 모이어티는 각각 IL-10 이량체 내에서 상이한 IL-10 폴리펩티드에 접합된다. 추가의 경우에, IL-10 접합체는 3개, 4개, 5개, 6개, 또는 그 이상의 접합 모이어티를 포함하고, 각각의 접합 모이어티는 상이한 비천연 아미노산에 결합된다. 이러한 경우에, 이량체 내의 2개의 IL-10 폴리펩티드는 불균등한 분포의 접합 모이어티를 갖는다. 예를 들어, 하나의 IL-10 폴리펩티드는 하나의 접합 모이어티를 갖는 반면 다른 하나의 IL-10 폴리펩티드는 2개 이상의 접합 모이어티를 갖는다.
일부 경우에, IL-10 접합체는 2개 이상의 접합 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 2개 이상의 접합 모이어티 각각은 각각의 IL-10 단량체 내의 동일한 잔기 위치에서 비천연 아미노산에 결합된다. 다른 경우에, 2개 이상의 접합 모이어티 각각은 IL-10 이량체 내의 상이한 잔기 위치에 위치한 비천연 아미노산에 결합된다.
일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10 폴리펩티드의 이량체화를 실질적으로 방해하지 않는다.
일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10 이량체와 IL-10R의 결합을 더 이상 크게 방해하지는 않는다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하보다 적게 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 80% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 70% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 60% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 50% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 40% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 30% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 20% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 10% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 5% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 2% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 1% 미만만큼 손상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 크게 손상시키지는 않는다. 추가의 경우에, 접합 모이어티의 위치는 IL-10R의 신호전달을 손상시키지 않는다.
일부 경우에, IL-10 접합체는 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기와 비교된다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 14일, 21일, 28일, 30일, 또는 그 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 90분 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 2시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 3시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 4시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 5시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 6시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 10시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 12시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 18시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 24시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 36시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 48시간 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 3일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 4일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 5일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 6일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 7일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 10일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 12일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 14일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 21일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 28일 이상 더 길다. 일부 경우에, IL-10 접합체의 향상된 혈장 반감기는 야생형 IL-10 접합체의 혈장 반감기보다 적어도 30일 이상 더 길다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 변형된 IL-10 이량체 및 IL-10R을 포함하는 IL-10/IL-10R 복합체가 본원에 또한 기재되고, 여기서 변형된 IL-10 이량체는 야생형 IL-10 이량체의 혈장 반감기에 비해 향상된 혈장 반감기를 갖는다. 일부 경우에, 변형된 IL-10 이량체는 적어도 하나의 비천연 아미노산에 공유 부착된 접합 모이어티를 추가로 포함한다.
IL-10 접합체 전구체
하나 이상의 아미노산이 야생형 아미노산으로부터 돌연변이된, 변형된 IL-10 폴리펩티드를 포함하는 IL-10 접합체 전구체가 본원에 기재된다. 이러한 전구체는 흔히 질환 또는 병태의 치료를 위한 본원에 기재된 방법과 함께 사용된다. 일부 구현예에서, IL-10 전구체는 접합되지 않는다. 이러한 돌연변이는 다양하게 부가, 결실, 또는 치환을 포함한다.
천연 아미노산 및 비천연 아미노산
일부 구현예에서, (예를 들어, IL-10 폴리펩티드 내의) 본원에 기재된 아미노산 잔기는 접합 모이어티에 결합하기 전에(또는 이와 반응하기 전에) 리신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 티로신으로 돌연변이된다. 예를 들어, 리신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 또는 티로신의 측쇄는 본원에 기재된 접합 모이어티에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 시스테인, 리신, 또는 히스티딘으로 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 시스테인으로 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 리신으로 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 히스티딘으로 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 티로신으로 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 트립토판으로 돌연변이된다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 N-말단 또는 C-말단에 근접하게, N-말단 또는 C-말단에, 또는 내부 잔기 위치에 위치한다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 N-말단 또는 C-말단 잔기이고, 돌연변이는 시스테인 또는 리신에 대한 것이다. 일부 경우에, 아미노산 잔기는 N-말단 또는 C-말단 잔기에 근접하게(예를 들어, N-말단 또는 C-말단 잔기로부터 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 10개 잔기 내에) 위치하고, 돌연변이는 시스테인 또는 리신에 대한 것이다.
일부 경우에, 아미노산 잔기는 N-말단 또는 C-말단 잔기에 부가된다. 즉 IL-10 폴리펩티드는 N-말단 또는 C-말단에 추가의 아미노산 잔기를 포함하고, 추가의 아미노산 잔기는 시스테인 또는 리신이다. 일부 경우에, 추가의 아미노산 잔기는 시스테인이다. 일부 경우에, 추가의 아미노산은 접합 모이어티에 접합된다.
일부 구현예에서, (예를 들어, IL-10 폴리펩티드 내의) 본원에 기재된 아미노산 잔기는 비천연 아미노산으로 돌연변이된다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 접합 모이어티와 접합되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드는 비천연 아미노산을 포함하고, Il-10은 단백질에 접합되고, 여기서 부착점은 비천연 아미노산이 아니다.
일부 구현예에서, (예를 들어, IL-10 폴리펩티드 내의) 본원에 기재된 아미노산 잔기는 접합 모이어티에 결합하기 전에 비천연 아미노산으로 돌연변이된다. 일부 경우에, 비천연 아미노산으로의 돌연변이는 면역계의 자가-항원 반응을 방지하거나 최소화한다. 본원에 사용된 용어 "비천연 아미노산"은 단백질에서 자연 발생하는 20개 아미노산 이외의 아미노산을 지칭한다. 비천연 아미노산의 비제한적인 예는 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-요오도-L-페닐알라닌, p-메톡시페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, p-보로노페닐알라닌, O-프로파길티로신, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, 셀레노시스테인, p-아미노-L-페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), 티로신 아미노산의 비천연 유사체; 글루타민 아미노산의 비천연 유사체; 페닐알라닌 아미노산의 비천연 유사체; 세린 아미노산의 비천연 유사체; 트레오닌 아미노산의 비천연 유사체; 알킬, 아릴, 아실, 아지도, 시아노, 할로, 하이드라진, 하이드라지드, 하이드록실, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 설포닐, 셀레노, 에스테르, 티오산, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데하이드, 하이드록실아민, 케토, 또는 아미노 치환된 아미노산, 또는 이들의 조합; 광활성화 가교제를 갖는 아미노산; 스핀 표지된 아미노산; 형광 아미노산; 금속 결합 아미노산; 금속 함유 아미노산; 방사성 아미노산; 포토케이징된 아미노산 및/또는 광이성체화 아미노산; 비오틴 또는 비오틴-유사체 함유 아미노산; 케토 함유 아미노산; 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산; 중원자 치환된 아미노산; 화학절단성 또는 광절단성 아미노산; 긴 측쇄를 갖는 아미노산; 독성기를 함유하는 아미노산; 당 치환된 아미노산; 탄소 연결된 당 함유 아미노산; 산화환원 활성 아미노산; a-하이드록시 함유 산; 아미노 티오산; α,α-이치환 아미노산; β-아미노산; 프롤린 또는 히스티딘 이외의 환형 아미노산, 및 페닐알라닌, 티로신, 또는 트립토판 이외의 방향족 아미노산을 포함한다.
비천연 아미노산의 다른 예는 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 및 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 선택적 반응기, 또는 표적 폴리펩티드의 부위 선택적 표지를 위한 반응기를 포함한다. 일부 경우에, 화학은 쌍직교성 반응(예를 들어, 생체적합성 및 선택적 반응)이다. 일부 경우에, 화학은 Cu(I)-촉매 또는 "구리 비함유" 알킨-아지드 트리아졸 형성 반응, Staudinger 결찰, 역전자 요구 Diels-Alder(IEDDA) 반응, "포토-클릭" 화학, 또는 금속 매개 공정, 예컨대 올레핀 복분해, 및 Suzuki-Miyaura 또는 Sonogashira 교차-커플링이다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 예를 들어 UV 조사시 가교하는 광반응기를 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 포토케이징된 아미노산을 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 파라-치환, 메타-치환, 또는 오르토-치환 아미노산 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 p-아세틸-L-페닐알라닌, p-아지도메틸-L-페닐알라닌(pAMF), p-요오도-L-페닐알라닌, O-메틸-L-티로신, p-메톡시페닐알라닌, p-프로파길옥시페닐알라닌, p-프로파길-페닐알라닌, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAcp-세린, L-도파, 플루오르화 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, p-아실-L-페닐알라닌, p-벤조일-L-페닐알라닌, L-포스포세린, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 또는 이소프로필-L-페닐알라닌을 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 3-아미노티로신, 3-니트로티로신, 3,4-디하이드록시-페닐알라닌, 또는 3-요오도티로신이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 페닐셀레노시스테인이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 벤조페논, 케톤, 요오다이드, 메톡시, 아세틸, 벤조일, 또는 아지드 함유 페닐알라닌 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 벤조페논, 케톤, 요오다이드, 메톡시, 아세틸, 벤조일, 또는 아지드 함유 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 방향족 측쇄를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 방향족 측쇄를 포함하지 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 아지도기를 포함한다.
일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 마이클(Michael)-억셉터 기를 포함한다. 일부 경우에, 마이클-억셉터 기는 1,2-부가 반응을 통해 공유 결합을 형성할 수 있는 불포화 모이어티를 포함한다. 일부 경우에, 마이클-억셉터 기는 전자 결핍 알켄 또는 알킨을 포함한다. 일부 경우에, 마이클-억셉터 기는 알파, 베타 불포화: 케톤, 알데하이드, 설폭사이드, 설폰, 니트릴, 이민, 또는 방향족을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 데하이드로알라닌이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 알데하이드 또는 케톤기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 알데하이드 또는 케톤기를 포함하는 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 베타, 감마, 또는 델타 위치에 하나 이상의 O, N, Se, 또는 S 원자를 포함하는 리신 유도체이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 감마 위치에 O, N, Se, 또는 S 원자를 포함하는 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 엡실론 N 원자가 산소 원자로 대체된 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 번역 후 변형된 자연 발생 리신이 아닌 리신 유도체이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 알파 위치로부터 여섯 번째 원자가 카보닐기를 포함하는, 측쇄를 포함하는 아미노산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 알파 위치로부터 여섯 번째 원자가 카보닐기를 포함하고 알파 위치로부터의 다섯 번째 원자가 질소인, 측쇄를 포함하는 아미노산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 알파 위치로부터 일곱 번째 원자가 산소 원자인, 측쇄를 포함하는 아미노산이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 셀레늄을 포함하는 세린 유도체이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 셀레노세린(2-아미노-3-하이드로셀레노프로판산)이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-3-((2-((3-(벤질옥시)-3-옥소프로필)아미노)에틸)셀라닐)프로판산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-3-(페닐셀라닐)프로판산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 셀레늄을 포함하고, 셀레늄의 산화는 알켄을 포함하는 비천연 아미노산을 형성시킨다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 시클로옥티닐기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 트랜스시클로옥테닐기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 노보네닐기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 시클로프로페닐기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 디아지린기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 테트라진기를 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 측쇄 질소가 카바밀화된 리신 유도체이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 측쇄 질소가 아실화된 리신 유도체이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(tert-부톡시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(tert-부톡시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-Boc-N6-메틸리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-아세틸리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 피롤리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-트리플루오로아세틸리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(벤질옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(p-요오도벤질옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(p-니트로벤질옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-프롤릴리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(시클로펜틸옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(시클로펜탄카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(테트라하이드로퓨란-2-카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(3-에티닐테트라하이드로퓨란-2-카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((프로프-2-인-1-일옥시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(2-아지도시클로펜틸옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(2-니트로벤질옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-{[(2-시클로옥티닐옥시)카보닐]아미노}헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(2-아미노부트-3-이노일)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-6-((2-아미노부트-3-이노일)옥시)헥산산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(알릴옥시카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(부테닐-4-옥시카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(펜테닐-5-옥시카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((부트-3-인-1-일옥시)카보닐)-리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((펜트-4-인-1-일옥시)카보닐)-리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(티아졸리딘-4-카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-8-옥소노난산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-8-옥소옥탄산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(2-옥소아세틸)리신이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-프로피오닐리신이다. 일부 경우에. 비천연 아미노산은 N6-부티릴리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(부트-2-에노일)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((바이시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일옥시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((스피로[2.3]헥스-1-엔-5-일메톡시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-(((4-(1-(트리플루오로메틸)시클로프로프-2-엔-1-일)벤질)옥시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((바이시클로[2.2.1]헵트-5-엔-2-일메톡시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 시스테이닐리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((1-(6-니트로벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)에톡시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((2-(3-메틸-3H-디아지린-3-일)에톡시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((3-(3-메틸-3H-디아지린-3-일)프로폭시)카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((메타 니트로베닐옥시)N6-메틸카보닐)리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((바이시클로[6.1.0]논-4-인-9-일메톡시)카보닐)-리신이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 N6-((시클로헵트-3-엔-1-일옥시)카보닐)-L-리신이다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 2-아미노-3-(((((벤질옥시)카보닐)아미노)메틸)셀라닐)프로판산이다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 용도 변경된 앰버, 오팔, 또는 오커 종결 코돈에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 4-염기 코돈에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 용도 변경된 희귀 센스 코돈에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 비천연 핵산을 포함하는 합성 코돈에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 직교성 변형된 합성효소/tRNA 쌍에 의해 IL-10에 통합된다. 이러한 직교성 쌍은, a) 비천연 tRNA에 다른 내인성 아미노산이 하전되는 것 및 b) 다른 내인성 tRNA에 비천연 아미노산이 하전되는 것을 최소화하면서 비천연 tRNA를 비천연 아미노산으로 하전시킬 수 있는 비천연 합성효소를 포함한다. 이러한 직교성 쌍은, 내인성 합성효소에 의해 다른 내인성 아미노산으로 하전되는 것을 방지하면서 비천연 합성효소에 의해 하전될 수 있는 tRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 쌍은 다양한 유기체, 예컨대 박테리아, 효모, 고세균, 또는 인간 원천으로부터 확인된다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍은 단일 유기체로부터의 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍은 2개의 상이한 유기체로부터의 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소/tRNA 쌍은 변형 전에 2개의 상이한 아미노산의 번역을 촉진하는 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 알라닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 아르기닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 아스파라긴 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 아스파르트산 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 시스테인 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 글루타민 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 글루탐산 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 알라닌 글리신이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 히스티딘 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 류신 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 이소류신 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 리신 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 메티오닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 페닐알라닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 프롤린 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 세린 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 트레오닌 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 트립토판 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 티로신 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 발린 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 합성효소는 변형된 포스포세린 합성효소이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 알라닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 아르기닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 아스파라긴 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 아스파르트산 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 시스테인 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 글루타민 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 글루탐산 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 알라닌 글리신이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 히스티딘 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 류신 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 이소류신 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 리신 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 메티오닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 페닐알라닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 프롤린 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 세린 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 트레오닌 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 트립토판 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 티로신 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 발린 tRNA이다. 일부 구현예에서, 직교성 tRNA는 변형된 포스포세린 tRNA이다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 아미노아실(aaRS 또는 RS)-tRNA 합성효소-tRNA 쌍에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. 예시적인 aaRS-tRNA 쌍은 Methanococcus jannaschii(Mj-Tyr) aaRS/tRNA 쌍, E. coli TyrRS(Ec-Tyr)/B. stearothermophilus tRNACUA 쌍, E. coli LeuRS(Ec-Leu)/B. stearothermophilus tRNACUA 쌍, 및 피롤리실-tRNA 쌍을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 Mj-TyrRS/tRNA 쌍에 의해 사이토카인(예를 들어, IL 폴리펩티드)에 통합된다. Mj-TyrRS/tRNA 쌍에 의해 통합될 수 있는 예시적인 UAA는 파라-치환 페닐알라닌 유도체, 예컨대 p-아미노페닐알라닌 및 p-메톡시페닐알라닌; 메타-치환 티로신 유도체, 예컨대 3-아미노티로신, 3-니트로티로신, 3,4-디하이드록시페닐알라닌, 및 3-요오도티로신; 페닐셀레노시스테인; p-보로노페닐알라닌; 및 o-니트로벤질티로신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 Ec-Tyr/tRNACUA 또는 Ec-Leu/tRNACUA 쌍에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. Ec-Tyr/tRNACUA 또는 Ec-Leu/tRNACUA 쌍에 의해 통합될 수 있는 예시적인 UAA는 벤조페논, 케톤, 요오다이드, 또는 아지드 치환기를 함유하는 페닐알라닌 유도체; O-프로파길티로신; α-아미노카프릴산, O-메틸 티로신, O-니트로벤질 시스테인; 및 3-(나프탈렌-2-일아미노)-2-아미노-프로판산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 피롤리실-tRNA 쌍에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. 일부 경우에, PylRS는 고세균, 예를 들어 메탄생성 고세균으로부터 얻어진다. 일부 경우에, PylRS는 Methanosarcina barkeri, Methanosarcina mazei, 또는 Methanosarcina acetivorans로부터 얻어진다. 피롤리실-tRNA 쌍에 의해 통합될 수 있는 예시적인 UAA는 아미드 및 카바메이트 치환된 리신, 예컨대 2-아미노-6-((R)-테트라하이드로퓨란-2-카복사미도)헥산산, N-ε-D-프롤릴-L-리신, 및 N-ε-시클로펜틸옥시카보닐-L-리신; N-ε-아크릴로일-L-리신; N-ε-[(1-(6-니트로벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)에톡시)카보닐]-L-리신; 및 N-ε-(1-메틸시클로프로-2-엔카복사미도)리신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 접합체는 M. barkeri 피롤리실-tRNA 합성효소(Mb PylRS)에 의해 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK)과 같은 비천연 아미노산으로 선택적으로 하전되는 M. mazei tRNA를 사용하여 제조될 수 있다. 문헌[Zhang et al., Nature 2017, 551(7682): 644-647]에 개시된 것과 같은 다른 방법들은 당업자에게 알려져 있다. 사용될 수 있는 비천연 아미노산의 다른 예는 N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 US 9,988,619 및 US 9,938,516에 개시된 합성효소에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. 이러한 합성효소에 의해 통합될 수 있는 예시적인 UAA는 파라-메틸아지도-L-페닐알라닌, 아랄킬, 헤테로시클릴, 헤테로아랄킬 비천연 아미노산 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 UAA는 피리딜, 피라지닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티오페닐, 또는 다른 복소환을 포함한다. 일부 구현예에서 이러한 아미노산은 아지드, 테트라진, 또는 수용성 모이어티와 같은 커플링 파트너에 접합될 수 있는 다른 화학기를 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 합성효소는 발현되어 UAA를 생체내 사이토카인에 통합하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 이러한 합성효소는 무세포 번역 시스템을 사용하여 UAA를 사이토카인에 통합하는 데 사용된다.
본원에 개시된 작제물 또는 벡터가 도입되는 숙주 세포는 관심 tRNA, tRNA 합성효소, 및 단백질이 생산되도록 적합한 배지에서 배양되거나 유지된다. 배지는 또한, 관심 단백질이 비천연 아미노산(들)을 통합하도록 비천연 아미노산(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 박테리아, 식물, 또는 조류의 뉴클레오시드 트리포스페이트 수송체(NTT)가 숙주 세포에 또한 존재한다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 접합체는 NTT를 발현하는 숙주 세포를 사용하여 제조된다. 일부 구현예에서, 숙주 세포에 사용되는 뉴클레오티드 뉴클레오시드 트리포스페이트 수송체는 TpNTT1, TpNTT2, TpNTT3, TpNTT4, TpNTT5, TpNTT6, TpNTT7, TpNTT8(T. pseudonana), PtNTT1, PtNTT2, PtNTT3, PtNTT4, PtNTT5, PtNTT6(P. tricornutum), GsNTT(Galdieria sulphuraria), AtNTT1, AtNTT2(Arabidopsis thaliana), CtNTT1, CtNTT2(Chlamydia trachomatis), PamNTT1, PamNTT2(Protochlamydia amoebophila), CcNTT(Caedibacter caryophilus), RpNTT1(Rickettsia prowazekii)로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT1, PtNTT2, PtNTT3, PtNTT4, PtNTT5, 및 PtNTT6으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT1이다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT2이다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT3이다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT4이다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT5이다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT6이다. 사용될 수 있는 다른 NTT는 문헌[Zhang et al., Nature 2017, 551(7682): 644-647; Malyshev et al. Nature 2014 509(7500), 385-388; 및 Zhang et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114:1317-1322]에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, NTT 및 tRNA 합성효소를 발현하는 세포 시스템에서 본원에 개시된 IL-10 접합체를 제조하는 방법이 제공된다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT1, PtNTT2, PtNTT3, PtNTT4, PtNTT5, 및 PtNTT6으로부터 선택되고, tRNA 합성효소는 Methanococcus jannaschii, E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus, 및 M. mazei로부터 선택된다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT1이고, tRNA 합성효소는 Methanococcus jannaschii, E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus, 또는 M. mazei로부터 유래된다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT2이고, tRNA 합성효소는 Methanococcus jannaschii, E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus, 또는 M. mazei로부터 유래된다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT3이고, tRNA 합성효소는 Methanococcus jannaschii, E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus, 또는 M. mazei로부터 유래된다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT3이고, tRNA 합성효소는 Methanococcus jannaschii, E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus, 또는 M. mazei로부터 유래된다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT4이고, tRNA 합성효소는 Methanococcus jannaschii, E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus, 또는 M. mazei로부터 유래된다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT5이고, tRNA 합성효소는 Methanococcus jannaschii, E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus, 또는 M. mazei로부터 유래된다. 일부 구현예에서, NTT는 PtNTT6이고, tRNA 합성효소는 Methanococcus jannaschii, E. coli TyrRS (Ec-Tyr)/B. stearothermophilus, 또는 M. mazei로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 접합체는 (a) 뉴클레오티드 트리포스페이트 수송체 PtNTT2(전장 단백질의 처음 65개 아미노산 잔기가 결실된 절단된 변이체 포함), (b) 원하는 아미노산 서열을 갖는 IL-10 변이체를 암호화하고, N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신과 같은 비천연 아미노산이 통합될 원하는 위치에 코돈을 제공하기 위해 제1 비천연 뉴클레오티드 및 제2 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 비천연 염기쌍을 함유하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, (c) M. mazei로부터 유래된 tRNA를 암호화하고, 천연 서열 대신 (IL-10 변이체의 코돈에) 인식된 안티코돈을 제공하기 위해 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드, 및 (d) tRNA를 암호화하는 동일한 플라스미드 또는 상이한 플라스미드일 수 있는, M. barkeri 유래 피롤리실-tRNA 합성효소(Mb PylRS)를 암호화하는 플라스미드를 포함하는, 대장균(E. coli)과 같은 세포에서 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 비천연 염기를 포함하는 데옥시리보 트리포스페이트로 추가로 보충된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 비천연 염기를 포함하는 리보 트리포스페이트로 추가로 보충된다. 일부 구현예에서, 세포는 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK), N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신과 같은 하나 이상의 비천연 아미노산으로 추가로 보충된다. 일부 구현예에서, 원하는 IL-10 변이체의 아미노산 서열을 암호화하는 이중가닥 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 서열번호 1을 갖는 단백질을 암호화하는 서열의 위치 67, 70, 74, 75, 79, 82, 88, 125, 126, 129, 130, 또는 132에 코돈 AXC를 함유하고, 여기서 X는 본원에 개시된 것, 예컨대 NaM과 같은 비천연 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 세포는 천연 서열 대신 AXC-매칭 안티코돈 GYT를 포함하는 M. mazei로부터의 직교성 tRNA를 암호화하는, 단백질 발현 플라스미드 또는 다른 플라스미드일 수 있는 플라스미드를 추가로 포함하고, 여기서 Y는 코돈의 비천연 뉴클레오티드와 동일하거나 상이할 수 있고 상보적인, TPT3와 같은 본원에 개시된 비천연 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 코돈의 비천연 뉴클레오티드는 안티코돈의 비천연 뉴클레오티드와 상이하고 상보적이다. 일부 구현예에서, 코돈의 비천연 뉴클레오티드는 안티코돈의 비천연 뉴클레오티드와 동일하다. 일부 구현예에서, 이중가닥 올리고뉴클레오티드에 비천연 염기쌍을 포함하는 제1 및 제2 비천연 뉴클레오티드는
Figure pct00001
,
Figure pct00002
, 및
Figure pct00003
로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 이중가닥 올리고뉴클레오티드에 비천연 염기쌍을 포함하는 제1 및 제2 비천연 뉴클레오티드는
Figure pct00004
및
Figure pct00005
로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비천연 뉴클레오티드의 트리포스페이트는
Figure pct00006
,
Figure pct00007
, 및
Figure pct00008
, 또는 이들의 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 비천연 뉴클레오티드의 트리포스페이트는
Figure pct00009
및
Figure pct00010
, 또는 이들의 염을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 비천연 뉴클레오티드 및 제2 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA 유래 이중가닥 올리고뉴클레오티드는
Figure pct00011
,
Figure pct00012
, 및
Figure pct00013
로부터 유래된 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 코돈을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, M. mazei tRNA는 mRNA의 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 코돈을 인식하는 비천연 뉴클레오티드를 포함하는 안티코돈을 포함할 수 있다. M. mazei tRNA의 안티코돈은
Figure pct00014
,
Figure pct00015
, 및
Figure pct00016
로부터 유래된 비천연 뉴클레오티드를 포함할 수 이다. 일부 구현예에서, mRNA는
Figure pct00017
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는
Figure pct00018
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는
Figure pct00019
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, tRNA는
Figure pct00020
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, tRNA는
Figure pct00021
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, tRNA는
Figure pct00022
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는
Figure pct00023
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함하고, tRNA는
Figure pct00024
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는
Figure pct00025
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함하고, tRNA는
Figure pct00026
로부터 유도된 비천연 뉴클레오티드를 포함한다. 숙주 세포는 적절한 영양소가 포함된 배지에서 배양되며, (a) 코돈을 포함하는 사이토카인 유전자를 암호화하는 플라스미드(들)의 복제에 필요한 하나 이상의 비천연 염기를 포함하는 데옥시리보 뉴클레오시드의 트리포스페이트, (b) (i) 하나 이상의 비천연 염기를 포함하는 코돈을 포함하고 사이토카인의 코딩 서열에 상응하는 mRNA, 및 (ii) 하나 이상의 비천연 염기를 포함하는 안티코돈을 포함하는 tRNA의 전사에 필요한 하나 이상의 비천연 염기를 포함하는 리보 뉴클레오시드의 트리포스페이트, 및 (c) 관심 사이토카인의 폴리펩티드 서열에 통합될 비천연 아미노산(들)으로 보충된다. 이어서, 숙주 세포는 관심 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 유지된다.
예를 들어 발현된, 하나 이상의 비천연 아미노산, AzK, N6-(프로파길에톡시)-L-리신(PraK), N6-(((2-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, N6-(((3-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신, 또는 N6-(((4-아지도벤질)옥시)카보닐)-L-리신을 포함하는 생성 단백질은 당업자에게 알려진 방법에 의해 정제될 수 있고, 이어서, 당업자에게 알려진 조건하에서, 본원에 개시된 바와 같은 원하는 평균 분자량을 갖는 PEG 사슬을 포함하는 DBCO와 같은 알킨과 반응하도록 하여 본원에 개시된 IL-10 접합체를 제공할 수 있다. 문헌[Zhang et al., Nature 2017, 551(7682): 644-647; WO 2015157555; WO 2015021432; WO 2016115168; WO 2017106767; WO 2017223528; WO 2019014262; WO 2019014267; WO 2019028419; 및 WO2019/028425]에 개시된 것과 같은 다른 방법은 당업자에게 알려져 있다.
대안적으로, 비천연 아미노산(들)을 포함하는 사이토카인(예를 들어, IL-10) 폴리펩티드는, tRNA 및 아미노아실 tRNA 합성효소를 포함하고 하나 이상의 인-프레임 직교성 (종결) 코돈과 함께 관심 핵산 서열을 포함하는 본원에 기재된 핵산 작제물을 숙주 세포에 도입함으로써 제조된다. 숙주 세포는 적절한 영양소가 포함된 배지에서 배양되며, (a) 새로운 코돈 및 안티코돈을 포함하는 사이토카인 유전자를 암호화하는 플라스미드(들)의 복제에 필요한 하나 이상의 비천연 염기를 포함하는 데옥시리보 뉴클레오시드의 트리포스페이트, (b) (i) 코돈을 포함하는 사이토카인 서열, 및 (ii) 안티코돈을 포함하는 직교성 tRNA에 상응하는 mRNA의 전사에 필요한 리보 뉴클레오시드의 트리포스페이트, 및 (c) 비천연 아미노산(들)으로 보충된다. 이어서, 숙주 세포는 관심 단백질의 발현을 허용하는 조건하에서 유지된다. 비천연 아미노산(들)은 비천연 코돈에 반응하여 폴리펩티드 사슬에 통합된다. 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산이 사이토카인(예를 들어, IL-10) 폴리펩티드에 통합된다. 대안적으로, 2개 이상의 비천연 아미노산이 단백질의 2개 이상의 부위에서 사이토카인(예를 들어, IL-10) 폴리펩티드에 통합될 수 있다.
비천연 아미노산(들)을 포함하는 사이토카인(예를 들어, IL-10) 폴리펩티드가 숙주 세포에서 생성되면, 효소적, 화학적, 및/또는 삼투적 용해 및 물리적 파괴를 포함하여 당업계에 알려진 다양한 기법에 의해 숙주 세포로부터 추출될 수 있다. 사이토카인(예를 들어, IL-10) 폴리펩티드는 당업계에 알려진 표준 기법, 예컨대 분취 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 또는 당업자에게 알려진 임의의 다른 적합한 기법에 의해 정제될 수 있다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 자연 발생 합성효소에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 하나 이상의 아미노산에 영양요구성인 유기체에 의해 사이토카인에 통합된다. 일부 구현예에서, 영양요구성 아미노산에 상응하는 합성효소는 상응하는 tRNA를 비천연 아미노산으로 하전시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 셀레노시스테인 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 셀레노메티오닌 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 방향족 아미노산이고, 방향족 아미노산은 아릴 할라이드, 예컨대 요오다이드를 포함한다. 구현예에서, 비천연 아미노산은 영양요구성 아미노산과 구조적으로 유사하다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 도 1에 예시된 비천연 아미노산을 포함한다.
일부 경우에, 비천연 아미노산은 리신 또는 페닐알라닌 유도체 또는 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 리신 유도체 또는 리신 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 피롤리신(Pyl)을 포함한다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 페닐알라닌 유도체 또는 페닐알라닌 유사체를 포함한다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 문헌[Wan, et al., "Pyrrolysyl-tRNA synthetase: an ordinary enzyme but an outstanding genetic code expansion tool," Biochim Biophys Acta 1844(6): 1059-4070 (2014)]에 기재된 비천연 아미노산이다. 일부 경우에, 비천연 아미노산은 도 2(예를 들어, 도 2a 및 도 2b)에 예시된 비천연 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 (문헌[Dumas et al., Chemical Science 2015, 6, 50-69]의 표 1에서 발췌된) 도 3a 내지 도 3d에 예시된 비천연 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드에 통합되는 비천연 아미노산은 US 9,840,493; US 9,682,934; US 2017/0260137; US 9,938,516; 또는 US 2018/0086734에 개시되어 있다. 이러한 합성효소에 의해 통합될 수 있는 예시적인 UAA는 파라-메틸아지도-L-페닐알라닌, 아랄킬, 헤테로시클릴, 헤테로아랄킬, 및 리신 유도체 비천연 아미노산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이러한 UAA는 피리딜, 피라지닐, 피라졸릴, 트리아졸릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 티오페닐, 또는 다른 복소환을 포함한다. 일부 구현예에서 이러한 아미노산은 아지드, 테트라진, 또는 수용성 모이어티와 같은 커플링 파트너에 접합될 수 있는 다른 화학기를 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 링커를 통해 방향족 모이어티에 부착된 아지드를 포함한다. 일부 구현예에서, 알킬 링커는 C1-C10 링커이다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 링커를 통해 방향족 모이어티에 부착된 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 아미노기를 통해 방향족 모이어티에 부착된 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬아미노기를 통해 방향족 모이어티에 부착된 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 사슬을 통해 아미노산 측쇄의 말단 질소(예를 들어, 리신 유도체의 N6, 또는 더 짧은 알킬 측쇄를 포함하는 유도체의 N5, N4, 또는 N3)에 부착된 아지드를 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 사슬을 통해 아미노산 측쇄의 말단 질소에 부착된 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 알킬 링커를 통해 아미드에 부착된 아지드 또는 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, UAA는 3-아미노알라닌, 세린, 리신, 또는 이의 유도체의 아지드 또는 테트라진 함유 카바메이트 또는 아미드이다. 일부 구현예에서, 이러한 UAA는 생체내 사이토카인에 통합된다. 일부 구현예에서, 이러한 UAA는 무세포 시스템에서 사이토카인에 통합된다.
접합 모이어티
특정 구현예에서, 상기 기재된 IL-10 폴리펩티드에 결합되는 접합 모이어티가 본원에 개시된다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 IL-10과 이의 수용체의 상호작용을 교란하는 분자이다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 IL-10에 결합시 IL-10 접합체가 면역 반응을 조절할 수 있게 하는 임의의 분자이다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 공유 결합을 통해 IL-10에 결합된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10은 트리아졸기로 접합 모이어티에 부착된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10은 디하이드로피리다진 또는 피리다진기로 접합 모이어티에 부착된다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 수용성 중합체를 포함한다. 다른 경우에, 접합 모이어티는 단백질 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 펩티드를 포함한다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 핵산을 포함한다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 소분자를 포함한다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 생체접합체(예를 들어, TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, 또는 TLR9 작용제와 같은 TLR 작용제; 또는 Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, 폴리 I:C, 폴리 A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA, 또는 플라젤린과 같은 합성 리간드)를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 혈청 반감기를 증가시키고/시키거나, 안정성을 향상시킨다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 하나 이상의 사이토카인 수용체 도메인 또는 아단위와의 사이토카인 상호작용을 감소시킨다. 추가의 경우에, 접합 모이어티는 하나 이상의 IL-10 도메인 또는 아단위와 이의 동족 수용체(들)와의 IL-10 상호작용을 차단한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-10 접합체는 다수의 접합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-10 폴리펩티드의 비천연 또는 천연 아미노산에 부착된다. 일부 구현예에서, IL-10 접합체는 천연 아미노산에 부착된 접합 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-10 접합체는 사이토카인 펩티드의 비천연 아미노산에 부착된다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-10 폴리펩티드의 N 또는 C 말단 아미노산에 부착된다. 다양한 조합 부위가 본원에 개시되고, 예를 들어 제1 접합 모이어티는 IL-10 폴리펩티드의 비천연 또는 천연 아미노산에 부착되고, 제2 접합 모이어티는 IL-10 폴리펩티드의 N 또는 C 말단 아미노산에 부착된다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드의 다수의 잔기에 단일 접합 모이어티가 부착된다(예를 들어, 스테이플). 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 IL-10 폴리펩티드의 N 말단 아미노산 및 C 말단 아미노산 모두에 부착된다.
수용성 중합체
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 모이어티는 수용성 중합체이다. 일부 경우에, 수용성 중합체는 비펩티드성이고, 비독성이고, 생체적합성이다. 본원에 사용된 바와 같이, 생체 조직과 관련하여(예를 들어, 환자에 대한 투여) 물질을 단독으로 또는 다른 물질(예를 들어, IL-10 모이어티와 같은 활성제)과 함께 사용하는 것과 관련된 유리한 효과가 임상의, 예를 들어 의사, 독성학자, 또는 임상 개발 전문가가 평가할 때 임의의 해로운 효과보다 더 큰 경우, 그 물질은 생체적합성인 것으로 간주된다. 일부 경우에, 수용성 중합체는 추가로 비면역원성이다. 일부 경우에, 물질의 생체내 의도된 사용이 원치 않는 면역 반응(예를 들어, 항체의 형성)을 생성하지 않는 경우, 또는 면역 반응이 생성되고, 이러한 반응이 임상의, 예를 들어 의사, 독성학자, 또는 임상 개발 전문가가 평가할 때 임상적으로 유의하거나 중요하다고 여겨지지 않는 경우, 그 물질은 비면역원성인 것으로 간주된다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 약 2개 내지 약 300개의 말단을 갖는 것을 특징으로 한다. 예시적인 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜("PEG"), 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체 등, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리아크릴아미드(PAAm), 폴리(N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드)(PHPMA), 폴리디메틸아크릴아미드(PDAAm), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린("POZ")(WO 2008/106186에 기재된 것), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 및 이들의 임의의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 특정 구조로 제한되지는 않는다. 일부 경우에, 수용성 중합체는 선형(예를 들어, 말단 캡핑된, 예컨대 알콕시 PEG 또는 이작용성 PEG), 분지형 또는 다중 아암형(예를 들어, 포크형 PEG 또는 폴리올 코어에 부착된 PEG), 수지상(또는 별) 구조이고, 각각에는 하나 이상의 분해 가능한 연결이 있거나 없다. 또한, 수용성 중합체의 내부 구조는 다양한 반복 패턴으로 구성될 수 있고, 동종중합체, 교번 공중합체, 랜덤 공중합체, 블록 공중합체, 교번 삼원중합체, 랜덤 삼원중합체, 및 블록 삼원중합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, IL-10 접합체에서의 수용성 중합체의 중량 평균 분자량은 약 100 달톤 내지 약 150,000 달톤이다. 예시적인 범위는 예를 들어 5,000 달톤 초과 내지 약 100,000 달톤의 범위, 약 6,000 달톤 내지 약 90,000 달톤의 범위, 약 10,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 10,000 달톤 초과 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 20,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 53,000 달톤 내지 약 85,000 달톤의 범위, 약 25,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 약 29,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 약 35,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위, 및 약 40,000 달톤 내지 약 120,000 달톤의 범위의 중량 평균 분자량을 포함한다.
수용성 중합체에 대한 예시적인 중량 평균 분자량은 약 100 달톤, 약 200 달톤, 약 300 달톤, 약 400 달톤, 약 500 달톤, 약 600 달톤, 약 700 달톤, 약 750 달톤, 약 800 달톤, 약 900 달톤, 약 1,000 달톤, 약 1,500 달톤, 약 2,000 달톤, 약 2,200 달톤, 약 2,500 달톤, 약 3,000 달톤, 약 4,000 달톤, 약 4,400 달톤, 약 4,500 달톤, 약 5,000 달톤, 약 5,500 달톤, 약 6,000 달톤, 약 7,000 달톤, 약 7,500 달톤, 약 8,000 달톤, 약 9,000 달톤, 약 10,000 달톤, 약 11,000 달톤, 약 12,000 달톤, 약 13,000 달톤, 약 14,000 달톤, 약 15,000 달톤, 약 20,000 달톤, 약 22,500 달톤, 약 25,000 달톤, 약 30,000 달톤, 약 35,000 달톤, 약 40,000 달톤, 약 45,000 달톤, 약 50,000 달톤, 약 55,000 달톤, 약 60,000 달톤, 약 65,000 달톤, 약 70,000 달톤, 및 약 75,000 달톤을 포함한다. 상기 임의의 총 분자량을 갖는 수용성 중합체의 분지형 형태(예를 들어, 2개의 20,000 달톤 중합체로 이루어진 분지형 40,000 달톤 수용성 중합체)가 또한 사용될 수 있다. 하나 이상의 구현예에서, 접합체는 약 6,000 달톤 미만의 중량 평균 분자량을 갖는 PEG와 직접 또는 간접적으로 부착된 어떠한 PEG 모이어티도 갖지 않을 것이다.
PEG는 일반적으로 다수의 (OCH2CH2) 단량체[또는 PEG의 정의 방법에 따라 (CH2CH2O) 단량체]를 포함할 것이다. 본원에 사용된 바와 같이, 반복 단위의 수는 "(OCH2CH2)n"에서 아래 첨자 "n"에 의해 식별된다. 따라서, (n)의 값은 일반적으로 다음 범위 중 하나 이상에 속한다: 2 내지 약 3400, 약 100 내지 약 2300, 약 100 내지 약 2270, 약 136 내지 약 2050, 약 225 내지 약 1930, 약 450 내지 약 1930, 약 1200 내지 약 1930, 약 568 내지 약 2727, 약 660 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 795 내지 약 2730, 약 909 내지 약 2730, 및 약 1,200 내지 약 1,900. 분자량이 알려진 임의의 소정 중합체에 대해, 중합체의 총 중량 평균 분자량을 반복 단량체의 분자량으로 나누어 반복 단위의 수(즉, "n")를 결정할 수 있다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 말단 캡핑된 중합체, 즉 저급 C1-6 알콕시기 또는 하이드록실기와 같은 비교적 불활성인 기로 캡핑된 적어도 하나의 말단을 갖는 중합체이다. 중합체가 PEG인 경우, 메톡시-PEG(일반적으로 mPEG라고 함)가 사용될 수 있으며, 이는 PEG의 선형 형태로서, 중합체의 하나의 말단은 메톡시(-OCH3) 기이고, 다른 말단은 하이드록실기 또는 필요에 따라 화학적으로 변형될 수 있는 다른 작용기이다.
일부 구현예에서, 예시적인 수용성 중합체는 Quanta Biodesign, Ltd의 선형 또는 분지형 이산 PEG(dPEG); Nektar Therapeutics의 선형, 분지형, 또는 포크형 PEG; JenKem Technology의 선형, 분지형, 또는 Y형 PEG 유도체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드는 폴리(알킬렌 글리콜), 예컨대 폴리에틸렌 글리콜("PEG"), 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG"), 에틸렌 글리콜과 프로필렌 글리콜의 공중합체 등, 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(사카라이드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리아크릴아미드(PAAm), 폴리디메틸아크릴아미드(PDAAm), 폴리(N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드)(PHPMA), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린("POZ"), 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 및 이들의 조합으로부터 선택되는 수용성 중합체에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 PEG에 접합(예를 들어, PEG화)된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 PPG에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 POZ에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 PVP에 접합된다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 폴리글리세롤(PG)을 포함한다. 일부 경우에, 폴리글리세롤은 (예를 들어, 문헌[Imran, et al. "Influence of architecture of high molecular weight linear and branched polyglycerols on their biocompatibility and biodistribution," Biomaterials 33:9135-9147 (2012))]에 기재된 것과 같은) 과분지형 PG(HPG)이다. 다른 경우에, 폴리글리세롤은 선형 PG(LPG)이다. 추가의 경우에, 폴리글리세롤은 중간작용성 PG, (예를 들어, 문헌[Wurm et. Al., "Squaric acid mediated synthesis and biological activity of a library of linear and hyperbranched poly(glycerol)-protein conjugates," Biomacromolecules 13:1161-1171 (2012))]에 기재된 것과 같은) 선형-블록-과분지형 PG, 또는 (예를 들어, 문헌[Li, et. al., "Synthesis of linear polyether polyol derivatives as new materials for bioconjugation," Bioconjugate Chem. 20:780-789 (2009)]에 기재된 것과 같은) 측쇄 작용성 PG이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드는 PG, 예를 들어 HPG, LPG, 중간작용성 PG, 선형-블록-과분지형 PG, 또는 측쇄 작용성 PG에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 분해 가능한 합성 PEG 대안이다. 예시적인 분해 가능한 합성 PEG 대안은 폴리[올리고(에틸렌 글리콜)메틸 메타크릴레이트](POEGMA); 텔레켈릭 또는 디-말단-작용기화 PEG계 마크로단량체의 중합에 의해 생성된 골격 변형된 PEG 유도체; 분해 가능한 연결을 포함하는 공단량체를 포함하는 PEG 유도체, 예컨대 폴리[(에틸렌 옥사이드)-코-(메틸렌 에틸렌 옥사이드)][P(EO-co-MEO)], OEGMA와 공중합된 5,6-벤조-2-메틸렌-1,3-디옥세판(BMDO), 2-메틸렌-1,3-디옥세판(MDO), 및 2-메틸렌-4-페닐-1,3-디옥솔란(MPDL)과 같은 환형 케텐 아세탈; 또는 폴리-(ε-카프로락톤)-그래프트-폴리(에틸렌 옥사이드)(PCL-g-PEO)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드는, 예를 들어 POEGM; 텔레켈릭 또는 디-말단-작용기화 PEG계 마크로단량체의 중합에 의해 생성된 골격 변형된 PEG 유도체; P(EO-co-MEO); OEGMA와 공중합된 BMDO, MDO, 및 MPDL과 같은 환형 케텐 아세탈; 또는 PCL-g-PEO와 같은, 분해 가능한 합성 PEG 대안에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리(양쪽성 이온)을 포함한다. 예시적인 폴리(양쪽성 이온)은 폴리(설포베타인 메타크릴레이트)(PSBMA), 폴리(카복시베타인 메타크릴레이트)(PCBMA), 및 폴리(2-메틸아크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린)(PMPC)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 PSBMA, PCBMA, 또는 PMPC와 같은 폴리(양쪽성 이온)에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리카보네이트를 포함한다. 예시적인 폴리카보네이트는 펜타플루오로페닐 5-메틸-2-옥소-1,3-디옥산-5-카복실레이트(MTC-OC6F5)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드는 MTC-OC6F5와 같은 폴리카보네이트에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는, 예를 들어 폴리카보네이트/PEG 중합체 하이브리드, 펩티드/단백질-중합체 접합체, 또는 하이드록실 함유 및/또는 양쪽 이온성 유도체화 중합체(예를 들어, 하이드록실 함유 및/또는 양쪽 이온성 유도체화 PEG 중합체)와 같은, 중합체 하이브리드를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드는 폴리카보네이트/PEG 중합체 하이브리드, 펩티드/단백질-중합체 접합체, 또는 하이드록실 함유 및/또는 양쪽 이온성 유도체화 중합체(예를 들어, 하이드록실 함유 및/또는 양쪽 이온성 유도체화 PEG 중합체)와 같은 중합체 하이브리드에 접합된다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 폴리사카라이드를 포함한다. 예시적인 폴리사카라이드는 덱스트란, 폴리시알산(PSA), 히알루론산(HA), 아밀로스, 헤파린, 황산헤파란(HS), 덱스트린, 또는 하이드록시에틸-스타치(HES)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 폴리사카라이드에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 덱스트란에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 PSA에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 HA에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 아밀로스에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 헤파린에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 HS에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 덱스트린에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 HES에 접합된다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 글리칸을 포함한다. 예시적인 글리칸 부류는 N-연결 글리칸, O-연결 글리칸, 당지질, O-GlcNAc, 및 글리코사미노글리칸을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 글리칸에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 N-연결 글리칸에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 O-연결 글리칸에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 당지질에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 O-GlcNAc에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 글리코사미노글리칸에 접합된다.
일부 구현예에서, 수용성 중합체는 폴리옥사졸린 중합체를 포함한다. 폴리옥사졸린 중합체는 선형 합성 중합체이고, PEG와 유사하고, 낮은 다분산도를 포함한다. 일부 경우에, 폴리옥사졸린 중합체는 평균 분자량을 특징으로 하는 다분산 폴리옥사졸린 중합체이다. 일부 경우에, 폴리옥사졸린 중합체의 평균 분자량은 예를 들어 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000, 100,000, 200,000, 300,000, 400,000, 또는 500,000 Da를 포함한다. 일부 경우에, 폴리옥사졸린 중합체는 폴리(2-메틸 2-옥사졸린)(PMOZ), 폴리(2-에틸 2-옥사졸린)(PEOZ), 또는 폴리(2-프로필 2-옥사졸린)(PPOZ)을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 폴리옥사졸린 중합체에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 PMOZ에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 PEOZ에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 PPOZ에 접합된다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 폴리아크릴산 중합체를 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 폴리아크릴산 중합체에 접합된다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 폴리아민을 포함한다. 폴리아민은 2개 이상의 1차 아미노기를 포함하는 유기 중합체이다. 일부 구현예에서, 폴리아민은 분지형 폴리아민, 선형 폴리아민, 또는 환형 폴리아민을 포함한다. 일부 경우에, 폴리아민은 저분자량 선형 폴리아민이다. 예시적인 폴리아민은 푸트레신, 카다베린, 스퍼미딘, 스퍼민, 에틸렌 디아민, 1,3-디아미노프로판, 헥사메틸렌디아민, 테트라에틸메틸렌디아민, 및 피페라진을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 폴리아민에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 푸트레신, 카다베린, 스퍼미딘, 스퍼민, 에틸렌 디아민, 1,3-디아미노프로판, 헥사메틸렌디아민, 테트라에틸메틸렌디아민, 또는 피페라진에 접합된다.
일부 경우에, 수용성 중합체는 미국 특허 7,744,861호, 8,273,833호, 및 7,803,777호에 기재되어 있다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 미국 특허 7,744,861호, 8,273,833호, 또는 7,803,777호에 기재된 링커에 접합된다.
지질
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 모이어티는 지질이다. 일부 경우에, 지질은 지방산이다. 일부 경우에, 지방산은 포화 지방산이다. 다른 경우에, 지방산은 불포화 지방산이다. 예시적인 지방산은 약 6개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 18개의 탄소 원자, 약 20개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 약 12개 내지 약 18개의 탄소 원자를 포함하는 지방산을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 지질은 하나 이상의 혈청 단백질에 결합하여 혈청 안정성 및/또는 혈청 반감기를 증가시킨다.
일부 구현예에서, 지질은 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드에 접합된다. 일부 경우에, 지질은 지방산, 예를 들어 포화 지방산 또는 불포화 지방산이다. 일부 경우에, 지방산은 약 6개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 20개의 탄소 원자, 약 6개 내지 약 18개의 탄소 원자, 약 20개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 26개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 24개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 22개의 탄소 원자, 약 12개 내지 약 20개의 탄소 원자, 또는 약 12개 내지 약 18개의 탄소 원자이다. 일부 경우에, 지방산은 약 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 또는 26개의 탄소 원자 길이를 포함한다. 일부 경우에, 지방산은 카프로산(헥산산), 에난트산(헵탄산), 카프릴산(옥탄산), 펠라르곤산(노난산), 카프르산(데칸산), 운데실산(운데칸산), 라우르산(도데칸산), 트리데실산(트리데칸산), 미리스트산(테트라데칸산), 펜타데실산(펜타데칸산), 팔미트산(헥사데칸산), 마르가르산(헵타데칸산), 스테아르산(옥타데칸산), 노나데실산(노나데칸산), 아라키드산(에이코산산), 헤네이코실산(헤네이코산산), 베헨산(도코산산), 트리코실산(트리코산산), 리그노세르산(테트라코산산), 펜타코실산(펜타코산산), 또는 세로트산(헥사코산산)을 포함한다.
일부 구현예에서, IL-10 지질 접합체는 혈청 안정성 및/또는 혈청 반감기를 향상시킨다.
단백질
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 모이어티는 단백질 또는 이의 결합 단편이다. 예시적인 단백질은 알부민, 트랜스페린, 또는 트랜스티레틴을 포함한다. 일부 경우에, 단백질 또는 이의 결합 단편은 항체 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 단백질 또는 이의 결합 단편을 포함한다. 일부 경우에, 단백질 또는 이의 결합 단편을 포함하는 IL-10 접합체는 증가된 혈청 반감기 및/또는 안정성을 갖는다. 일부 경우에, 단백질 또는 이의 결합 단편을 포함하는 IL-10 접합체는 하나 이상의 IL-10R 아단위와의 감소된 IL-10 상호작용을 갖는다. 추가의 경우에, 단백질 또는 이의 결합 단편은 하나 이상의 IL-10R 아단위와의 IL-10 상호작용을 차단한다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 알부민이다. 알부민은 수용성 구상 단백질 계열이다. 이것은 모든 혈장 단백질의 약 55~60%를 포함하는 혈장에서 흔히 발견된다. 인간 혈청 알부민(HSA)은 3차 구조가 도메인 I(아미노산 잔기 1~195), 도메인 II(아미노산 잔기 196~383), 및 도메인 III(아미노산 잔기 384~585)의 3개의 도메인으로 분할된 585개 아미노산의 폴리펩티드이다. 각각의 도메인은 장쇄 및 중쇄 지방산, 빌리루빈, 또는 헤민과 같은 내인성 리간드, 또는 헤테로시클릭 또는 방향족 화합물과 같은 외인성 화합물과 가역적으로 또는 비가역적으로 상호작용할 수 있는 결합 부위를 추가로 포함한다.
일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 알부민에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 인간 혈청 알부민(HSA)에 접합된다. 추가의 경우에, IL-10 폴리펩티드는 알부민의 기능적 단편에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 트랜스페린이다. 트랜스페린은 2개의 Fe3+ 결합 부위를(하나는 N-말단 도메인에, 다른 하나는 C-말단 도메인에) 포함하는 크기가 약 80 kDa인 679개 아미노산의 폴리펩티드이다. 일부 경우에, 인간 트랜스페린은 약 7~12일의 반감기를 갖는다.
일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 트랜스페린에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 인간 트랜스페린에 접합된다. 추가의 경우에, IL-10 폴리펩티드는 트랜스페린의 기능적 단편에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 트랜스티레틴(TTR)이다. 트랜스티레틴은 갑상선 호르몬 티록신(T4) 및 레티놀에 결합된 레티놀-결합 단백질을 운반하는 혈청 및 뇌척수액에 있는 운반 단백질이다.
일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 (말단 중 하나를 통해 또는 내부 힌지 영역을 통해) 트랜스티레틴에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 트랜스티레틴의 기능적 단편에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 결합 단편, 쥣과 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 단일클론 항체 또는 이의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 휴마바디, 디설파이드-안정화 Fv 단백질(dsFv), 단일-도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타 항체 또는 이의 결합 단편, 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 이들의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다.
일부 경우에, 접합 모이어티는 scFv, 비스-scFv, (scFv)2, dsFv, 또는 sdAb를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 scFv를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 비스-scFv를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 (scFv)2를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 dsFv를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 sdAb를 포함한다.
일부 경우에, 접합 모이어티는 항체, 예를 들어 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD의 Fc 부분을 포함한다. 일부 경우에, 모이어티는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 부분을 포함한다.
일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 항체 또는 이의 결합 단편에 접합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 인간화 항체 또는 이의 결합 단편, 쥣과 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 단일클론 항체 또는 이의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 휴마바디, 디설파이드-안정화 Fv 단백질(dsFv), 단일-도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타 항체 또는 이의 결합 단편, 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 이들의 화학적으로 변형된 유도체에 접합된다. 추가의 경우에, IL-10 폴리펩티드는 항체의 Fc 부분에 접합된다. 추가의 경우에, IL-10 폴리펩티드는 IgG(예를 들어, IgG1, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 부분에 접합된다.
일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 및 항체 또는 이의 결합 단편에 접합된다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 인간화 항체 또는 이의 결합 단편, 쥣과 항체 또는 이의 결합 단편, 키메라 항체 또는 이의 결합 단편, 단일클론 항체 또는 이의 결합 단편, 1가 Fab', 2가 Fab2, F(ab)'3 단편, 단쇄 가변 단편(scFv), 비스-scFv, (scFv)2, 디아바디, 미니바디, 나노바디, 트리아바디, 테트라바디, 휴마바디, 디설파이드-안정화 Fv 단백질(dsFv), 단일-도메인 항체(sdAb), Ig NAR, 낙타 항체 또는 이의 결합 단편, 이중특이적 항체 또는 이의 결합 단편, 또는 이들의 화학적으로 변형된 유도체를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 scFv, 비스-scFv, (scFv)2, dsFv, 또는 sdAb를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 scFv를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 이의 결합 단편은 IL-10 접합체를 관심 표적세포로 가이드하고, 수용성 중합체는 안정성 및/또는 혈청 반감기를 향상시킨다.
일부 경우에, 하나 이상의 IL-10 폴리펩티드 - 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 접합체는 항체 또는 이의 결합 단편에 추가로 결합된다. 일부 경우에, IL-10 접합체 대 항체의 비는 약 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 11:1, 또는 12:1이다. 일부 경우에, IL-10 접합체 대 항체의 비는 약 1:1이다. 다른 경우에, IL-10 접합체 대 항체의 비는 약 2:1, 3:1, 또는 4:1이다. 추가의 경우에, IL-10 접합체 대 항체의 비는 약 6:1 이상이다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 IL-10 폴리펩티드 - 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 접합체는 항체 또는 이의 결합 단편에 직접 결합된다. 다른 경우에, IL-10 접합체는 링커를 통해 항체 또는 이의 결합 단편에 간접적으로 결합된다. 예시적인 링커는 동종이작용성 링커, 이종이작용성 링커, 말레이미드계 링커, 제로-트레이스 링커, 자가-희생 링커, 스페이서 등을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 IL-10 폴리펩티드 - 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 접합체의 IL-10 폴리펩티드 부분에 직접 또는 간접적으로 결합된다. 이러한 경우에, IL-10 폴리펩티드에 대한 항체의 접합 부위는 IL-10 폴리펩티드와 IL-10R의 결합을 방해하지 않는 부위에 있다. 추가의 경우에, IL-10 폴리펩티드에 대한 항체의 접합 부위는 IL-10 폴리펩티드와 IL-10R의 결합을 부분적으로 차단하는 부위에 있다. 다른 구현예에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 IL-10 폴리펩티드 - 수용성 중합체(예를 들어, PEG) 접합체의 수용성 중합체 부분에 직접 또는 간접적으로 결합된다.
펩티드
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 모이어티는 펩티드이다. 일부 경우에, 펩티드는 비구조화된 펩티드이다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 펩티드에 접합된다. 일부 경우에, 펩티드를 포함하는 IL-10 접합체는 혈청 증가된 반감기 및/또는 안정성을 갖는다. 일부 경우에, 펩티드를 포함하는 IL-10 접합체는 하나 이상의 IL-10R 아단위와의 감소된 IL-10 상호작용을 갖는다. 추가의 경우에, 펩티드는 하나 이상의 IL-10R 아단위와의 IL-10 상호작용을 차단한다.
일부 경우에, 접합 모이어티는 XTEN™ 펩티드(Amunix Operating Inc.)이고, 변형은 XTEN화로 지칭된다. XTEN화는 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 상이한 비율의 6개 아미노산 Ala, Glu, Gly, Ser, 및 Thr을 포함하는 긴 비구조화된 친수성 펩티드인 XTEN™ 펩티드(Amunix Operating Inc.)를 암호화하는 핵산의 유전자 융합이다. 일부 경우에, XTEN™ 펩티드는 관심 폴리펩티드와 조합하여 발현, 유전자 안정성, 용해도, 응집 저항, 향상된 반감기, 증가된 효능, 및/또는 증가된 시험관내 활성과 같은 특성에 기초하여 선택된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 XTEN 펩티드에 접합된다.
일부 경우에, 접합 모이어티는 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP)이고, 변형은 HAP화로 지칭된다. HAP화는 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 글리신-농후 호모아미노산 중합체(HAP)를 암호화하는 핵산의 유전자 융합이다. 일부 경우에, HAP 중합체는 (Gly4Ser)n 반복 모티프(서열번호 3)를 포함하고, 때로는 약 50개, 100개, 150개, 200개, 250개, 300개, 또는 그 이상의 잔기 길이이다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 HAP에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 PAS 폴리펩티드이고, 변형은 PAS화로 지칭된다. PAS화는 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 PAS 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 유전자 융합이다. PAS 폴리펩티드는 Pro, Ala, 및 Ser 잔기로 이루어진 친수성 비하전 폴리펩티드이다. 일부 경우에, PAS 폴리펩티드의 길이는 적어도 약 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 또는 600개의 아미노산이다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 PAS 폴리펩티드에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELP)이고, 변형은 ELP화로 지칭된다. ELP화는 관심 폴리펩티드를 암호화하는 핵산과 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELP)를 암호화하는 핵산의 유전자 융합이다. ELP는 VPGxG 반복 모티프(서열번호 4)를 포함하고, 여기서 x는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 ELP에 접합된다.
일부 구현예에서, 접합 모이어티는 CTP 펩티드이다. CTP 펩티드는 31개 아미노산 잔기 펩티드 FQSSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ(서열번호 5)를 포함하고, 여기서 S*는 O-글리코실화 부위(OPKO)를 나타낸다. 일부 경우에, CTP 펩티드는 IL-10 폴리펩티드에 유전자 융합된다. 일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 CTP 펩티드에 접합된다.
일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 글루타밀화에 의해 변형된다. 글루타밀화(또는 폴리글루타밀화)는 글루타메이트의 γ-카복시기가 유리 글루타메이트의 아미노기와 펩티드-유사 결합을 형성하고, α-카복시기가 폴리글루타메이트 사슬로 확장되는, 글루타메이트의 가역적인 번역후 변형이다.
일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 젤라틴-유사 단백질(GLK) 중합체에 의해 변형된다. 일부 경우에, GLK 중합체는 Gly-Xaa-Yaa의 다중 반복을 포함하고, 여기서 Xaa 및 Yaa는 각각 프롤린 및 4-하이드록시프롤린을 주로 포함한다. 일부 경우에, GLK 중합체는 아미노산 잔기 Pro, Gly, Glu, Gln, Asn, Ser, 및 Lys를 추가로 포함한다. 일부 경우에, GLK 중합체의 길이는 약 20개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 110개, 120개, 150개 잔기 이상이다.
추가의 접합 모이어티
일부 경우에, 접합 모이어티는 세포외 바이오마커를 포함한다. 일부 경우에, 세포외 바이오마커는 종양 항원이다. 일부 경우에, 예시적인 세포외 바이오마커는 CD19, PSMA, B7-H3, B7-H6, CD70, CEA, CSPG4, EGFRvIII, EphA3, EpCAM, EGFR, ErbB2 (HER2), FAP, FRα, GD2, GD3, 루이스-Y, 메소텔린, Muc1, Muc 16, ROR1, TAG72, VEGFR2, CD11, Gr-1, CD204, CD16, CD49b, CD3, CD4, CD8, 및 B220을 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 IL-10에 결합되거나 접합된다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 예를 들어 IL-10의 N-말단 또는 C-말단에서 유전자 융합된다.
일부 경우에, 접합 모이어티는 번역후 변형으로부터의 분자를 포함한다. 일부 경우에, 번역후 변형의 예는 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화(또는 프레닐화)(예를 들어, 파르네실화 또는 게라닐게라닐화), 글리피화, 아실화(예를 들어, O-아실화, N-아실화, S-아실화), 알킬화(예를 들어, 메틸기 또는 에틸기와 같은 알킬기의 첨가), 아미드화, 글리코실화, 하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오티드 첨가, 산화, 인산화, 석신일화, 황화, 당화, 카바밀화, 글루타밀화, 또는 탈아미드화를 포함한다. 일부 경우에, IL-10은 미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화(또는 프레닐화)(예를 들어, 파르네실화 또는 게라닐게라닐화), 글리피화, 아실화(예를 들어, O-아실화, N-아실화, S-아실화), 알킬화(예를 들어, 메틸기 또는 에틸기와 같은 알킬기의 첨가), 아미드화, 글리코실화, 하이드록실화, 요오드화, 뉴클레오티드 첨가, 산화, 인산화, 석신일화, 황화, 당화, 카바밀화, 글루타밀화, 또는 탈아미드화와 같은 번역후 변형에 의해 변형된다.
접합
링커
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드에 접합 모이어티를 접합하거나 결합시키는 데 유용한 작용성 반응기는, 예를 들어 0차 또는 고차의 링커를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 인터류킨에 통합되는 비천연 아미노산은 작용성 반응기를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 본원에 기재된 인터류킨에 통합된 비천연 아미노산과 반응하는 작용성 반응기를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 본원에 기재된 인터류킨에 통합된 비천연 아미노산과 반응하는 작용성 반응기를 포함한다. 일부 경우에, 접합 모이어티는 본원에 기재된 링커(선택적으로 사이토카인 펩티드에 미리 부착됨)와 반응하는 작용성 반응기를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드의 천연 아미노산과 반응하는 반응기를 포함한다. 일부 경우에, 고차 링커는 동종이작용성 링커 또는 이종이작용성 링커와 같은 이작용성 링커를 포함한다. 예시적인 동종이작용성 링커는 Lomant 시약 디티오비스(석신이미딜프로피오네이트) DSP, 3'3'-디티오비스(설포석신이미딜 프로피오네이트)(DTSSP), 디석신이미딜 수베레이트(DSS), 비스(설포석신이미딜)수베레이트(BS), 디석신이미딜 타르트레이트(DST), 디설포석신이미딜 타르트레이트(설포 DST), 에틸렌 글리코비스(석신이미딜석시네이트)(EGS), 디석신이미딜 글루타레이트(DSG), N,N'-디석신이미딜 카보네이트(DSC), 디메틸 아디피미데이트(DMA), 디메틸 피멜리미데이트(DMP), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3,3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 1,4-디-(3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미도)부탄(DPDPB), 비스말레이미도헥산(BMH), 예를 들어 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 또는 1,3-디플루오로-4,6-디니트로벤젠과 같은 아릴 할라이드 함유 화합물(DFDNB), 4,4'-디플루오로-3,3'-디니트로페닐설폰(DFDNPS), 비스-[β-(4-아지도살리실아미도)에틸]디설파이드(BASED), 포름알데하이드, 글루타르알데하이드, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르, 아디프산 디하이드라지드, 카보하이드라지드, o-톨루이딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 벤지딘, α,α'-p-디아미노디페닐, 디요오도-p-자일렌 설폰산, N,N'-에틸렌-비스(요오도아세트아미드), 또는 N,N'-헥사메틸렌-비스(요오도아세트아미드)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 이작용성 링커는 이종이작용성 링커를 포함한다. 예시적인 이종이작용성 링커는 아민 반응성 및 설프하이드릴 가교제, 예컨대 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(sPDP), 장쇄 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(LC-sPDP), 수용성-장쇄 N-석신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(설포-LC-sPDP), 석신이미딜옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루엔(sMPT), 설포석신이미딜-6-[α-메틸-α-(2-피리딜디티오)톨루아미도]헥사노에이트(설포-LC-sMPT), 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(sMCC), 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(설포-sMCC), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스테르(MB), m-말레이미도벤조일-N-하이드록시설포석신이미드 에스테르(설포-MB), N-석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(sIAB), 설포석신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트(설포-sIAB), 석신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(sMPB), 설포석신이미딜-4-(p-말레이미도페닐)부티레이트(설포-sMPB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)석신이미드 에스테르(GMB), N-(γ-말레이미도부티릴옥시)설포석신이미드 에스테르(설포-GMB), 석신이미딜 6-((요오도아세틸)아미노)헥사노에이트(sIAX), 석신이미딜 6-[6-(((요오도아세틸)아미노)헥사노일)아미노]헥사노에이트(sIAXX), 석신이미딜 4-(((요오도아세틸)아미노)메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(sIAC), 석신이미딜 6-((((4-요오도아세틸)아미노)메틸)시클로헥산-1-카보닐)아미노)헥사노에이트(sIACX), p-니트로페닐 요오도아세테이트(NPIA), 카보닐 반응성 및 설프하이드릴 반응성 가교제, 예컨대 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 하이드라지드(MPBH), 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실-하이드라지드-8(M2C2H), 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 하이드라지드(PDPH), 아민 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대 N-하이드록시석신이미딜-4-아지도살리실산(NHs-AsA), N-하이드록시설포석신이미딜-4-아지도살리실산(설포-NHs-AsA), 설포석신이미딜-(4-아지도살리실아미도)헥사노에이트(설포-NHs-LC-AsA), 설포석신이미딜-2-(ρ-아지도살리실아미도)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAsD), N-하이드록시석신이미딜-4-아지도벤조에이트(HsAB), N-하이드록시설포석신이미딜-4-아지도벤조에이트(설포-HsAB), N-석신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(sANPAH), 설포석신이미딜-6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노)헥사노에이트(설포-sANPAH), N-5-아지도-2-니트로벤조일옥시석신이미드(ANB-NO), 설포석신이미딜-2-(m-아지도-o-니트로벤즈아미도)-에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAND), N-석신이미딜-4(4-아지도페닐)1,3'-디티오프로피오네이트(sADP), N-설포석신이미딜(4-아지도페닐)-1,3'-디티오프로피오네이트(설포-sADP), 설포석신이미딜 4-(ρ-아지도페닐)부티레이트(설포-sAPB), 설포석신이미딜 2-(7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세트아미드)에틸-1,3'-디티오프로피오네이트(sAED), 설포석신이미딜 7-아지도-4-메틸쿠마린-3-아세테이트(설포-sAMCA), ρ-니트로페닐 디아조피루베이트(ρNPDP), ρ-니트로페닐-2-디아조-3,3,3-트리플루오로프로피오네이트(PNP-DTP), 설프하이드릴 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대 1-(ρ-아지도살리실아미도)-4-(요오도아세트아미도)부탄(AsIB), N-[4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸]-3'-(2'-피리딜디티오)프로피온아미드(APDP), 벤조페논-4-요오도아세트아미드, 벤조페논-4-말레이미드 카보닐 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대 ρ-아지도벤조일 하이드라지드(ABH), 카복실레이트 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대 4-(ρ-아지도살리실아미도)부틸아민(AsBA), 및 아르기닌 반응성 및 광반응성 가교제, 예컨대 ρ-아지도페닐 글리옥살(APG)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 반응성 작용기는 결합 모이어티(예를 들어, 접합 모이어티 또는 IL-10)에 존재하는 친전자기에 반응성인 친핵기를 포함한다. 예시적인 친전자기는 카보닐기, 예컨대 알데하이드, 케톤, 카복실산, 에스테르, 아미드, 에논, 아실 할라이드, 또는 산 무수물을 포함한다. 일부 구현예에서, 반응성 작용기는 알데하이드이다. 예시적인 친핵기는 하이드라지드, 옥심, 아미노, 하이드라진, 티오세미카바존, 하이드라진 카복실레이트, 및 아릴하이드라지드를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 인터류킨에 통합되는 비천연 아미노산은 친전자기를 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 절단 가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 디펩티드 링커이다. 일부 구현예에서, 디펩티드 링커는 발린-시트룰린(Val-Cit), 페닐알라닌-리신(Phe-Lys), 발린-알라닌(Val-Ala), 및 발린-리신(Val-Lys)이다. 일부 구현예에서, 디펩티드 링커는 발린-시트룰린이다.
일부 구현예에서, 링커는 예를 들어 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 링커이다. 일부 경우에, 펩티드 링커는 최대 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 또는 그 이하의 아미노산을 포함한다. 추가의 경우에, 펩티드 링커는 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 또는 50개의 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 링커는 자가-희생 링커 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-희생 링커 모이어티는 p-아미노벤질 알코올(PAB), p-아미노벤지옥시카보닐(PABC), 또는 이의 유도체 또는 유사체를 포함한다. 일부 구현예에서, 링커는 디펩티드 링커 모이어티 및 자가-희생 링커 모이어티를 포함한다. 일부 구현예에서, 자가-희생 링커 모이어티는 미국 특허 9089614호 및 WIPO 출원 WO2015038426호에 기재된 것과 같다.
일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 글루쿠로나이드이다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 산-절단 가능한 링커이다. 일부 구현예에서, 산-절단 가능한 링커는 하이드라진이다. 일부 구현예에서, 절단 가능한 링커는 환원성 링커이다.
일부 구현예에서, 링커는 말레이미드기를 포함한다. 일부 경우에, 말레이미드기는 말레이미드 스페이서로 지칭되기도 한다. 일부 경우에, 말레이미드기는 카프로산을 추가로 포함하여, 말레이미도카프로일(mc)을 형성한다. 일부 경우에, 링커는 말레이미도카프로일(mc)을 포함한다. 일부 경우에, 링커는 말레이미도카프로일(mc)이다. 다른 경우에, 말레이미드기는 상기 기재된 석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(sMCC) 또는 설포석신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카복실레이트(설포-sMCC)와 같은 말레이미도메틸기를 포함한다.
일부 구현예에서, 말레이미드기는 자기-안정화 말레이미드이다. 일부 경우에, 자기-안정화 말레이미드는 말레이미드에 인접한 염기성 아미노기를 통합하기 위해 디아미노프로피온산(DPR)을 사용하여 티오석신이미드 고리 가수분해의 분자내 촉매작용을 제공함으로써, 레트로-마이클(retro-Michael) 반응을 통해 제거 반응을 겪는 말레이미드를 제거한다. 일부 경우에, 자기-안정화 말레이미드는 문헌[Lyon, et al., "Self-hydrolyzing maleimides improve the stability and pharmacological properties of antibody-drug conjugates," Nat. Biotechnol. 32(10):1059-1062 (2014)]에 기재된 말레이미드기이다. 일부 경우에, 링커는 자기-안정화 말레이미드를 포함한다. 일부 경우에, 링커는 자기-안정화 말레이미드이다.
접합 화학
다양한 접합 반응을 사용하여 링커, 접합 모이어티, 및 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드에 통합된 비천연 아미노산을 접합한다. 이러한 접합 반응은 대개 "생체직교" 반응과 같은 수성 조건에 적합하다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 촉매와 같은 화학 시약; 광; 또는 링커, 접합 모이어티, 또는 비천연 아미노산에서 발견되는 반응성 화학기에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 효소에 의해 매개된다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 접합 반응은 문헌[Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 접합 반응은 문헌[Chen, X.; Wu. Y-W. Org. Biomol. Chem. 2016, 14, 5417]에 기재되어 있다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 접합 반응은 케톤 또는 알데하이드와 친핵체의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 옥심을 형성하기 위한 케톤과 아미녹시기의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 이민을 형성하기 위한 케톤과 아릴 또는 헤테로아릴 아민기의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 이민을 형성하기 위한 알데하이드와 아릴 또는 헤테로아릴 아민기의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 옥심을 통해 부착된 링커 또는 접합 모이어티를 포함하는 IL-10 폴리펩티드를 생성한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 알데하이드 또는 케톤과 트립타민 친핵체의 Pictet-Spengler 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 하이드라지노-Pictet-Spengler 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 Pictet-Spengler 결찰을 포함한다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아지드와 포스핀의 반응(Staudinger 결찰)을 포함한다. 일부 구현예에서, 포스핀은 아릴 포스핀이다. 일부 구현예에서, 아릴 포스핀은 오르토 에스테르기를 포함한다. 일부 구현예에서, 포스핀은 구조 메틸 2-(디페닐포스판일)벤조에이트를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아릴아미드를 통해 부착된 링커 또는 접합 모이어티를 포함하는 IL-10 폴리펩티드를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아미드를 통해 부착된 링커 또는 접합 모이어티를 포함하는 IL-10 폴리펩티드를 생성한다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 1,3-쌍극 고리화첨가 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 1,3-쌍극 고리화첨가 반응은 아지드와 포스핀의 반응("클릭" 반응)을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 구리에 의해 촉매된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 트리아졸을 통해 부착된 링커 또는 접합 모이어티를 포함하는 IL-10 폴리펩티드를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아지드와 변형된 올레핀의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아지드와 변형된 알킨의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아지드와 시클로알킨, 예를 들어 OCT, DIFO, DIFBO, DIBO, BARAC, TMTH, 또는 기타 변형된 시클로알킨의 반응을 포함하며, 이들의 구조는 문헌[Gong, Y., Pan, L. Tett. Lett. 2015, 56, 2123]에 기재되어 있다. 일부 구현예에서, 1,3-쌍극 고리화첨가 반응은 광에 의해 촉매된다("포토클릭"). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 말단 알릴기와 테트라졸 및 광의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 말단 알키닐기와 테트라졸 및 광의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 O-알릴 아미노산과 테트라진 및 광의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 O-알릴 티로신과 테트라진 및 광의 반응을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아지드와 시클로알킨, 예를 들어 DBCO의 반응을 포함한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 하기 반응을 포함하고,
Figure pct00027
여기서 X는 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 접합체에서의 위치이다. 일부 구현예에서, 접합 모이어티는 수용성 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 반응기는 알킨 또는 아지드를 포함한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 하기 반응을 포함하고,
Figure pct00028
여기서 X는 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 접합체에서의 위치이다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 하기 반응을 포함하고,
Figure pct00029
여기서 X는 비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 접합체에서의 위치이다.
본원에 기재된 클릭 반응과 같은 접합 반응은 단일 위치이성체, 위치이성체의 혼합물을 생성할 수 있다. 일부 경우에, 위치이성체의 비는 약 1:1이다. 일부 경우에, 위치이성체의 비는 약 2:1이다. 일부 경우에, 위치이성체의 비는 약 1.5:1이다. 일부 경우에, 위치이성체의 비는 약 1.2:1이다. 일부 경우에, 위치이성체의 비는 약 1.1:1이다. 일부 경우에, 위치이성체의 비는 1:1보다 크다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 디엔 및 친디엔체를 포함하는 역전자 요구 고리화첨가 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 디엔은 테트라진을 포함한다. 일부 구현예에서, 친디엔체는 알켄을 포함한다. 일부 구현예에서, 친디엔체는 알킨을 포함한다. 일부 구현예에서, 알킨은 변형된 알킨이다. 일부 구현예에서, 알켄은 변형된 디엔이다. 일부 구현예에서, 알킨은 트랜스-시클로옥틴이다. 일부 구현예에서, 알킨은 시클로옥텐이다. 일부 구현예에서, 알켄은 시클로프로펜이다. 일부 구현예에서, 알켄은 플루오로시클로프로펜이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 고리에 2개의 질소 원자를 포함하는 6원 고리 복소환을 통해 링커 또는 접합 모이어티에 부착된 IL-10 폴리펩티드를 형성시킨다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 올레핀 복분해 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 알켄 및 알킨과 루테늄 촉매의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 2개의 알켄과 루테늄 촉매의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 2개의 알킨과 루테늄 촉매의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 알켄 또는 알킨과 루테늄 촉매 및 알릴기를 포함하는 아미노산의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 알켄 또는 알킨과 루테늄 촉매 및 알릴 설파이드 또는 셀레나이드를 포함하는 아미노산의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 루테늄 촉매는 Hoveda-Grubbs 2세대 촉매이다. 일부 구현예에서, 올레핀 복분해 반응은 하나 이상의 변형된 알켄 또는 알킨의 반응을 포함한다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 교차-커플링 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 교차-커플링 반응은 전이 금속 촉매, 예컨대 이리듐, 금, 루테늄, 로듐, 팔라듐, 니켈, 백금, 또는 기타 전이 금속 촉매 및 하나 이상의 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속 촉매는 수용성이다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 Suzuki-Miyaura 교차-커플링 반응을 포함한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아릴 할라이드(또는 트리플레이트 또는 토실레이트), 아릴 또는 알케닐 보론산, 및 팔라듐 촉매의 반응을 포함한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 Sonogashira 교차-커플링 반응을 포함한다. 본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아릴 할라이드(또는 트리플레이트 또는 토실레이트), 알킨, 및 팔라듐 촉매의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 교차-커플링 반응은 탄소-탄소 결합을 통해 IL-10 폴리펩티드에 링커 또는 접합 모이어티를 부착시킨다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 접합 전에 반응기의 탈보호 또는 "언케이징(uncaging)" 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 광에 의한 반응기의 언케이징에 이은 접합 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 반응기는 하나 이상의 니트로기를 포함하는 아랄킬 모이어티로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응기의 언케이징은 유리 아민, 설파이드, 또는 다른 반응기를 생성한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 전이 금속 촉매에 의한 반응기의 언케이징에 이은 접합 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 전이 금속 촉매는 팔라듐 및 하나 이상의 리간드를 포함한다. 일부 구현예에서, 반응기는 알릴 모이어티로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응기는 알릴 카바메이트로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응기는 프로파길 모이어티로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응기는 프로파길 카바메이트로 보호된다. 일부 구현예에서, 반응기는 친디엔체로 보호되고, 여기서 디엔(예컨대, 테트라진)에 대한 노출은 반응기를 탈보호시킨다.
본원에 기재된 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 리간드(필요에 따라 반응기에 부착됨)가 반응기와 IL-10 폴리펩티드 간의 접합 부위를 촉진하는 리간드-유도 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 리간드는 IL-10 폴리펩티드와 반응기의 반응 중에 또는 후에 절단된다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드의 접합 부위는 천연 아미노산이다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드의 접합 부위는 리신, 시스테인, 또는 세린이다. 일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드의 접합 부위는 본원에 기재된 비천연 아미노산이다. 일부 구현예에서, 반응기는 전자-부족 아릴 또는 헤테로아릴기와 같은 이탈기를 포함한다. 일부 구현예에서, 반응기는 IL-10 폴리펩티드에 의해 대체되는 전자-부족 알킬기와 같은 이탈기를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 라디칼 포획제와 라디칼 종의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 산화성 라디칼 첨가 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 라디칼 포획제는 아릴아민이다. 일부 구현예에서, 라디칼 종은 티로실 라디칼이다. 일부 구현예에서, 라디칼 종은 루테늄 촉매(예컨대, [Ru(bpy)3]) 및 광에 의해 생성된다.
효소 반응은 본원에 기재된 접합 반응에 선택적으로 사용된다. 예시적인 효소 접합은 SortA 매개 접합, TG 매개 접합, 또는 FGE 매개 접합을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 접합 반응은 아미드 결합을 형성하기 위한 말단 1-아미노-2-티오기와 티오에스테르의 천연 단백질 결찰(NPL)을 포함한다.
링커 또는 접합 모이어티를 IL-10 폴리펩티드와 반응시키기 위한 다양한 접합 반응이 본원에 기재되고, 여기서 반응은 IL-10 폴리펩티드의 천연("정규") 아미노산과 일어난다. 일부 구현예에서, 접합 위치에서 발견되는 천연 아미노산은 야생형 서열에서 발견되거나, 대안적으로 위치가 돌연변이되었다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 IL-10 잔기에서의 이황화 결합의 형성을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 시스테인 또는 리신의 1,4 마이클 첨가 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 IL-10의 시아노벤조티아졸 결찰을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 1,3-디클로로-2-프로피오논과 같은 아세톤 모이어티와의 가교를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 시스테인과 O-메시틸렌설포닐하이드록실아민의 반응에 의해 형성된 데하이드로알라닌에 대한 1,4 마이클 첨가를 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 티로신과 트리아졸린디온(TAD) 또는 TAD 유도체의 반응을 포함한다. 일부 구현예에서, 접합 반응은 트립토판과 로듐 카르베노이드의 반응을 포함한다.
사용 방법
증식성 질환 또는 병태
일부 구현예에서, 증식성 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 IL-10 접합체의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 구현예에서, 증식성 질환 또는 병태는 암이다. 일부 경우에, 암은 고형 종양이다. 예시적인 고형 종양은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 안암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 또는 전립선암을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 고형 종양은 전이성 암이다. 일부 경우에, 고형 종양은 이전 치료로 인한 재발성 또는 난치성 암이다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 접합체는 고형 종양의 치료를 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 이러한 경우에, 대상체는 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 안암, 두경부암, 신장암(또는 신장세포 암종), 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 또는 전립선암이 있다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 방광암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 유방암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 대장암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 식도암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 두경부암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 신장암(또는 신장세포 암종 또는 RCC)의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 폐암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 흑색종의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 난소암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 췌장암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 전립선암의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 암은 전이성 암이다. 다른 경우에, 암은 재발성 암이다. 추가의 경우에, 암은 난치성 암이다.
일부 구현예에서, 암은 치료 경험이 없는 암이다. 이러한 경우에, 치료 경험이 없는 암은 치료를 받은 적이 없는 암이다. 일부 경우에, 치료 경험이 없는 암은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 안암, 두경부암, 신장암(또는 RCC), 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 또는 전립선암과 같은 고형 종양이다. 일부 구현예에서, 치료 경험이 없는 고형 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 본원에 기재된 IL-10 접합체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법이 본원에 기재된다.
일부 구현예에서, 암은 혈액 악성종양이다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 접합체는 혈액 악성종양의 치료를 위해 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 혈액 악성종양은 백혈병, 림프종, 또는 골수종을 포함한다. 일부 경우에, 혈액 악성종양은 T세포 악성종양이다. 다른 경우에, 혈액 악성종양은 B세포 악성종양이다. 일부 경우에, 혈액 악성종양은 전이성 혈액 악성종양이다. 다른 경우에, 혈액 악성종양은 재발성 혈액 악성종양이다. 추가의 경우에, 혈액 악성종양은 난치성 혈액 악성종양이다. 일부 경우에, 대상체는 T세포 악성종양이 있다. 일부 경우에, 대상체는 B세포 악성종양이 있다. 일부 경우에, 대상체는 만성 림프구성 백혈병(CLL), 소형 림프구성 림프종(SLL), 소포성 림프종(FL), 확산성 거대 B세포 림프종(DLBCL), 맨틀세포 림프종(MCL), 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 다발성 골수종, 결절외 변연부 B세포 림프종, 결절 변연부 B세포 림프종, 버킷 림프종, 비버킷 고등급 B세포 림프종, 원발성 종격 B세포 림프종(PMBL), 면역모구성 대세포 림프종, 전구체 B-림프모구성 림프종, B세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포 림프종, 비장 변연부 림프종, 형질세포 골수종, 형질세포종, 종격(흉선) 거대 B세포 림프종, 혈관내 거대 B세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 또는 림프종모양 육아종증이 있다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 CLL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 SLL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 FL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 DLBCL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 MCL의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 발덴스트롬 마크로글로불린혈증의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 다발성 골수종의 치료를 위해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 버킷 림프종의 치료를 위해 대상체에게 투여된다.
추가 치료제
일부 구현예에서, 대상체에게 추가 치료제가 추가로 투여된다. 일부 경우에, 추가 치료제는 IL-10 접합체와 동시에 투여되고/되거나 공동 제형화된다. 다른 경우에, 추가 치료제와 IL-10 접합체는 순차적으로 투여되고, 예를 들어 추가 치료제 전에 IL-10 접합체가 투여되거나, 추가 치료제의 투여 후에 IL-10 접합체가 투여된다.
일부 경우에, 추가 치료제는 화학치료제, 면역치료제, 표적 치료, 방사선 치료, 또는 이들의 조합을 포함한다. 예시적인 추가 치료제는 알트레타민, 부설판, 카보플라틴, 카무스틴, 클로르암부실, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 다카바진, 로무스틴, 멜팔란, 옥살라플라틴, 테모졸로마이드, 또는 티오테파와 같은 알킬화제; 5-플루오로우라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈, 시타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 또는 페메트렉시드와 같은 항대사물질; 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 또는 이다루비신과 같은 안트라사이클린; 토포테칸 또는 이리노테칸(CPT-11)과 같은 토포이소머라제 I 억제제; 에토포시드(VP-16), 테니포시드, 또는 미톡산트론과 같은 토포이소머라제 II 억제제; 도세탁셀, 에스트라무스틴, 익사베필론, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 또는 비노렐빈과 같은 유사분열 억제제; 또는 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 또는 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 추가 치료제는 제1선 치료를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "제1선 치료"는 암이 있는 대상체에 대한 1차 치료를 포함한다. 일부 경우에, 암은 원발성 또는 국소 암이다. 다른 경우에, 암은 전이성 또는 재발성 암이다. 일부 경우에, 제1선 치료는 화학치료를 포함한다. 다른 경우에, 제1선 치료는 면역치료, 표적 치료, 또는 방사선 치료를 포함한다. 당업자는 상이한 제1선 치료가 상이한 유형의 암에 적용될 수 있음을 쉽게 이해할 것이다.
일부 경우에, IL-10 접합체는 알트레타민, 부설판, 카보플라틴, 카무스틴, 클로르암부실, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 다카바진, 로무스틴, 멜팔란, 옥살라플라틴, 테모졸로마이드, 또는 티오테파와 같은 알킬화제; 5-플루오로우라실(5-FU), 6-머캅토퓨린(6-MP), 카페시타빈, 시타라빈, 플록수리딘, 플루다라빈, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 또는 페메트렉시드와 같은 항대사물질; 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 또는 이다루비신과 같은 안트라사이클린; 토포테칸 또는 이리노테칸(CPT-11)과 같은 토포이소머라제 I 억제제; 에토포시드(VP-16), 테니포시드, 또는 미톡산트론과 같은 토포이소머라제 II 억제제; 도세탁셀, 에스트라무스틴, 익사베필론, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 또는 비노렐빈과 같은 유사분열 억제제; 또는 프레드니손, 메틸프레드니솔론, 또는 덱사메타손과 같은 코르티코스테로이드로부터 선택되는 추가 치료제와 함께 투여된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 접합체는 효소 폴리 ADP 리보스 중합효소(PARP)의 억제제와 함께 투여된다. 예시적인 PARP 억제제는 올라파립(AZD-2281, Lynparza®, Astra Zeneca에서 제공), 루카파립(PF-01367338, Rubraca®, Clovis Oncology에서 제공), 니라파립(MK-4827, Zejula®, Tesaro에서 제공), 탈라조파립(BMN-673, BioMarin Pharmaceutical Inc.에서 제공), 벨리파립(ABT-888, AbbVie에서 제공), CK-102(이전 명칭 CEP 9722, Teva Pharmaceutical Industries Ltd.에서 제공), E7016(Eisai에서 제공), 이니파립(BSI 201, Sanofi에서 제공), 및 파미파립(BGB-290, BeiGene에서 제공)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 올라파립, 루카파립, 니라파립, 탈라조파립, 벨리파립, CK-102, E7016, 이니파립, 또는 파미파립과 같은 PARP 억제제와 함께 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 IL-10 접합체는 티로신 키나제 억제제(TKI)와 함께 투여된다. 예시적인 TKI는 아파티닙, 알렉티닙, 악시티닙, 보수티닙, 카보잔티닙, 세리티닙, 코비메티닙, 크리조티닙, 다브라페닙, 다사티닙, 에를로티닙, 게피티닙, 이브루티닙, 이마티닙, 라파티닙, 렌바티닙, 닐로티닙, 닌테다닙, 오시머티닙, 파조파닙, 포나티닙, 레고라페닙, 룩솔리티닙, 소라페닙, 수니티닙, 토파시티닙, 및 반데타닙을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 접합체는 면역 관문 억제제와 함께 투여된다. 예시적인 관문 억제제는 다음을 포함한다:
PD-L1 억제제, 예컨대 AstraZeneca의 더발루맙(Imfinzi), Genentech의 아테졸리주맙(MPDL3280A), EMD Serono/Pfizer의 아벨루맙, CytomX Therapeutics의 CX-072, Novartis Pharmaceuticals의 FAZ053, 3D Medicine/Alphamab의 KN035, Eli Lilly의 LY3300054, 또는 EMD Serono의 M7824(항-PD-L1/TGF베타 트랩);
PD-L2 억제제, 예컨대 GlaxoSmithKline의 AMP-224(Amplimmune), 및 rHIgM12B7;
PD-1 억제제, 예컨대 Bristol-Myers Squibb의 니볼루맙(Opdivo), Merck의 펨브롤리주맙(Keytruda), Agenus의 AGEN 2034, BeiGene의 BGB-A317, Boehringer-Ingelheim Pharmaceuticals의 Bl-754091, CBT Pharmaceuticals의 CBT-501(게놀림주맙), Incyte의 INCSHR1210, Janssen Research & Development의 JNJ-63723283, MedImmune의 MEDI0680, MacroGenics의 MGA 012, Novartis Pharmaceuticals의 PDR001, Pfizer의 PF-06801591, Regeneron Pharmaceuticals/Sanofi의 REGN2810(SAR439684), 또는 TESARO의 TSR-042;
CTLA-4 억제제, 예컨대 Bristol Meyers Squibb의 이필리무맙(Yervoy®, MDX-010, BMS-734016, 및 MDX-101로도 알려짐), Pfizer의 트레멜리무맙(CP-675,206, 티실리무맙), 또는 Agenus의 AGEN 1884;
LAG3 억제제, 예컨대 Bristol-Myers Squibb의 BMS-986016, Novartis Pharmaceuticals의 IMP701, Novartis Pharmaceuticals의 LAG525, 또는 Regeneron Pharmaceuticals의 REGN3767;
B7-H3 억제제, 예컨대 MacroGenics의 에노블리투주맙(MGA271);
KIR 억제제, 예컨대 Innate Pharma의 리릴루맙(IPH2101; BMS-986015);
CD137 억제제, 예컨대 우렐루맙(BMS-663513, Bristol-Myers Squibb), PF-05082566(항-4-1BB, PF-2566, Pfizer), 또는 XmAb-5592(Xencor);
PS 억제제, 예컨대 바비툭시맙;
및 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 단일클론 항체, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체), RNAi 분자, 또는 TIM3, CD52, CD30, CD20, CD33, CD27, OX40, GITR, ICOS, BTLA (CD272), CD160, 2B4, LAIR1, TIGHT, LIGHT, DR3, CD226, CD2, 또는 SLAM에 대한 소분자와 같은 억제제.
일부 경우에, IL-10 접합체는 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 트레멜리무맙, 또는 이필리무맙과 함께 투여된다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 접합체는 알렘투주맙, 트라스투주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 브렌툭시맙 베도틴, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 또는 블리나투모맙과 같은 항체와 함께 투여된다.
일부 경우에, IL-10 접합체는 추가의 사이토카인으로부터 선택되는 추가 치료제와 함께 투여된다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 T 이펙터 세포 확장 및/또는 증식을 향상 및/또는 상승작용시킨다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 IL-1β, IL-2, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, 또는 TNFα를 포함한다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 IL-7이다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 IL-15이다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 IL-21이다. 일부 경우에, 추가의 사이토카인은 TNFα이다.
일부 경우에, IL-10 접합체는 수용체 작용제로부터 선택되는 추가 치료제와 함께 투여된다. 일부 경우에, 수용체 작용제는 톨-유사 수용체(TLR) 리간드를 포함한다. 일부 경우에, TLR 리간드는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, 또는 TLR9를 포함한다. 일부 경우에, TLR 리간드는 예를 들어 Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, 폴리 I:C, 폴리 A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA, 또는 플라젤린과 같은 합성 리간드를 포함한다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, 및 TLR9로부터 선택되는 하나 이상의 TLR 작용제와 함께 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 Pam3Cys, CFA, MALP2, Pam2Cys, FSL-1, Hib-OMPC, 폴리 I:C, 폴리 A:U, AGP, MPL A, RC-529, MDF2β, CFA, 및 플라젤린으로부터 선택되는 하나 이상의 TLR 작용제와 함께 투여된다.
일부 구현예에서, IL-10 접합체는 입양 T세포 전달(ACT) 치료와 함께 사용된다. 일 구현예에서, ACT는 예를 들어 항종양 활성을 갖는 대상체에서 자가유래 T 림프구를 확인하는 단계, 시험관 내에서 자가유래 T 림프구를 확장시키는 단계, 및 확장된 T 림프구를 대상체에 후속 재주입하는 단계를 포함한다. 다른 구현예에서, ACT는 예를 들어 항종양 활성을 갖는 동종이계 T 림프구를 사용하는 단계, 시험관 내에서 T 림프구를 확장시키는 단계, 및 확장된 동종이계 T 림프구를 이를 필요로 하는 대상체에 후속 주입하는 단계를 포함한다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 접합체는 ACT 치료의 일부로서 자가유래 T 림프구와 함께 사용된다. 다른 경우에, 본원에 기재된 IL-10 접합체는 ACT 치료의 일부로서 동종이계 T 림프구와 함께 사용된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 치료를 필요로 하는 대상체에게 ACT 치료와 동시에 투여된다. 다른 경우에, IL-10 접합체는 치료를 필요로 하는 대상체에게 ACT 치료와 함께 순차적으로 투여된다.
일부 구현예에서, IL-10 접합체는 자가유래 및/또는 동종이계 T세포 전달의 생체외 활성화 및/또는 확장에 사용된다. 이러한 경우에, IL-10 접합체는 자가유래 및/또는 동종이계 T세포를 포함하는 샘플을 활성화하고/하거나 확장하는 데 사용되고, IL-10 접합체는 이를 필요로 하는 대상체에게 샘플을 투여하기 전에 샘플로부터 필요에 따라 제거된다.
일부 구현예에서, IL-10 접합체는 백신과 함께 투여된다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 종양세포붕괴성 바이러스(oncolytic virus)와 함께 사용된다. 이러한 경우에, IL-10 접합체는 면역 반응을 조절하는 자극제로서 작용한다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 아쥬반트 치료의 일부로서 종양세포붕괴성 바이러스와 함께 사용된다. 예시적인 종양세포붕괴성 바이러스는 T-Vec(Amgen), G47Δ(Todo et al.), JX-594(Sillajen), CG0070(Cold Genesys), 및 Reolysin(Oncolytics Biotech)을 포함한다. 일부 경우에, IL-10 접합체는 T-Vec, G47Δ, JX-594, CG0070, 또는 Reolysin과 같은 종양세포붕괴성 바이러스와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, IL-10 접합체는 방사선 치료와 함께 투여된다.
IL-10 폴리펩티드 생산
일부 경우에, 천연 아미노산 돌연변이 또는 비천연 아미노산 돌연변이를 포함하는 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드는 재조합으로 생성되거나 화학적으로 합성된다. 일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드는, 예를 들어 숙주 세포 시스템에 의해 또는 무세포 시스템에서, 재조합으로 생성된다.
일부 경우에, IL-10 폴리펩티드는 숙주 세포 시스템을 통해 재조합으로 생성된다. 일부 경우에, 숙주 세포는 진핵 세포(예를 들어, 포유류 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 또는 식물 세포), 원핵 세포(예를 들어, 그램 양성 박테리아 또는 그램 음성 박테리아), 또는 고세균 세포이다. 일부 경우에, 진핵 숙주 세포는 포유류 숙주 세포이다. 일부 경우에, 포유류 숙주 세포는 안정한 세포주이거나, 관심 유전 물질을 자신의 게놈에 통합하고 여러 세대의 세포 분열 후 유전 물질의 산물을 발현하는 능력을 가진 세포주이다. 다른 경우에, 포유류 숙주 세포는 일시적 세포주이거나, 관심 유전 물질을 자신의 게놈에 통합하지 않고 여러 세대의 세포 분열 후 유전 물질의 산물을 발현하는 능력이 없는 세포주이다.
예시적인 포유류 숙주 세포는 293T 세포주, 293A 세포주, 293FT 세포주, 293F 세포, 293 H 세포, A549 세포, MDCK 세포, CHO DG44 세포, CHO-S 세포, CHO-K1 세포, Expi293F™ 세포, Flp-In™ T-REx™ 293 세포주, Flp-In™-293 세포주, Flp-In™-3T3 세포주, Flp-In™-BHK 세포주, Flp-In™-CHO 세포주, Flp-In™-CV-1 세포주, Flp-In™-Jurkat 세포주, FreeStyle™ 293-F 세포, FreeStyle™ CHO-S 세포, GripTite™ 293 MSR 세포주, GS-CHO 세포주, HepaRG™ 세포, T-REx™ Jurkat 세포주, Per.C6 세포, T-REx™-293 세포주, T-REx™-CHO 세포주, 및 T-REx™-HeLa 세포주를 포함한다.
일부 구현예에서, 진핵 숙주 세포는 곤충 숙주 세포이다. 예시적인 곤충 숙주 세포는 Drosophila S2 세포, Sf9 세포, Sf21 세포, High Five™ 세포, 및 expresSF+® 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 진핵 숙주 세포는 효모 숙주 세포이다. 예시적인 효모 숙주 세포는 GS115, KM71H, SMD1168, SMD1168H, 및 X-33과 같은 Pichia pastoris 효모 균주, 및 INVSc1과 같은 Saccharomyces cerevisiae 효모 균주를 포함한다.
일부 구현예에서, 진핵 숙주 세포는 식물 숙주 세포이다. 일부 경우에, 식물 세포는 조류의 세포를 포함한다. 예시적인 식물 세포주는 Chlamydomonas reinhardtii 137c, 또는 Synechococcus elongatus PPC 7942의 균주를 포함한다.
일부 구현예에서, 숙주 세포는 원핵 숙주 세포이다. 예시적인 원핵 숙주 세포는 BL21, Mach1™, DH10B™, TOP10, DH5α, DH10Bac™, OmniMax™, MegaX™, DH12S™, INV110, TOP10F', INVαF, TOP10/P3, ccdB Survival, PIR1, PIR2, Stbl2™, Stbl3™, 또는 Stbl4™를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드의 생산에 적합한 폴리핵산 분자 또는 벡터는 진핵생물 또는 원핵생물 원천으로부터 유래된 임의의 적합한 벡터를 포함한다. 예시적인 폴리핵산 분자 또는 벡터는 박테리아(예를 들어, E. coli), 곤충, 효모(예를 들어, Pichia pastoris), 조류, 또는 포유류 원천으로부터의 벡터를 포함한다. 박테리아 벡터는, 예를 들어 pACYC177, pASK75, pBAD 벡터 시리즈, pBADM 벡터 시리즈, pET 벡터 시리즈, pETM 벡터 시리즈, pGEX 벡터 시리즈, pHAT, pHAT2, pMal-c2, pMal-p2, pQE 벡터 시리즈, pRSET A, pRSET B, pRSET C, pTrcHis2 시리즈, pZA31-Luc, pZE21-MCS-1, pFLAG ATS, pFLAG CTS, pFLAG MAC, pFLAG Shift-12c, pTAC-MAT-1, pFLAG CTC, 또는 pTAC-MAT-2를 포함한다.
곤충 벡터는, 예를 들어 pFastBac1, pFastBac DUAL, pFastBac ET, pFastBac HTa, pFastBac HTb, pFastBac HTc, pFastBac M30a, pFastBact M30b, pFastBac, M30c, pVL1392, pVL1393, pVL1393 M10, pVL1393 M11, pVL1393 M12, FLAG 벡터, 예컨대 pPolh-FLAG1 또는 pPolh-MAT 2, 또는 MAT 벡터, 예컨대 pPolh-MAT1, 또는 pPolh-MAT2를 포함한다.
효모 벡터는 예를 들어 Gateway® pDEST™ 14 벡터, Gateway® pDEST™ 15 벡터, Gateway® pDEST™ 17 벡터, Gateway® pDEST™ 24 벡터, Gateway® pYES-DEST52 벡터, pBAD-DEST49 Gateway® 목표 벡터, pAO815 Pichia 벡터, pFLD1 Pichi pastoris 벡터, pGAPZA, B, & C Pichia pastoris 벡터, pPIC3.5K Pichia 벡터, pPIC6 A, B, & C Pichia 벡터, pPIC9K Pichia 벡터, pTEF1/Zeo, pYES2 효모 벡터, pYES2/CT 효모 벡터, pYES2/NT A, B, & C 효모 벡터, 또는 pYES3/CT 효모 벡터를 포함한다.
조류 벡터는 예를 들어 pChlamy-4 벡터 또는 MCS 벡터를 포함한다.
포유류 벡터는, 예를 들어 일시적 발현 벡터 또는 안정한 발현 벡터를 포함한다. 예시적인 포유류 일시적 발현 벡터는 p3xFLAG-CMV 8, pFLAG-Myc-CMV 19, pFLAG-Myc-CMV 23, pFLAG-CMV 2, pFLAG-CMV 6a,b,c, pFLAG-CMV 5.1, pFLAG-CMV 5a,b,c, p3xFLAG-CMV 7.1, pFLAG-CMV 20, p3xFLAG-Myc-CMV 24, pCMV-FLAG-MAT1, pCMV-FLAG-MAT2, pBICEP-CMV 3, 또는 pBICEP-CMV 4를 포함한다. 예시적인 포유류의 안정한 발현 벡터는 pFLAG-CMV 3, p3xFLAG-CMV 9, p3xFLAG-CMV 13, pFLAG-Myc-CMV 21, p3xFLAG-Myc-CMV 25, pFLAG-CMV 4, p3xFLAG-CMV 10, p3xFLAG-CMV 14, pFLAG-Myc-CMV 22, p3xFLAG-Myc-CMV 26, pBICEP-CMV 1, 또는 pBICEP-CMV 2를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 IL-10 폴리펩티드의 생산을 위해 무세포 시스템이 사용된다. 일부 경우에, 무세포 시스템은 세포로부터의 세포질 및/또는 핵 성분의 혼합물을 포함하고(예를 들어, 완전히 정제된 재조합 성분 또는 부분적으로 정제된 성분으로 이루어짐), 시험관내 핵산 합성에 적합하다. 일부 경우에, 무세포 시스템은 원핵 세포 성분을 사용한다. 다른 경우에, 무세포 시스템은 진핵 세포 성분을 사용한다. 핵산 합성은 예를 들어 초파리 세포, 제노프스 알, 고세균, 또는 HeLa 세포에 기초한 무세포 시스템에서 얻어진다. 예시적인 무세포 시스템은 E. coli S30 추출 시스템, E. coli T7 S30 시스템, 또는 PURExpress®, XpressCF, 및 XpressCF+를 포함한다.
무세포 번역 시스템은 플라스미드, mRNA, DNA, tRNAs, 합성효소, 방출 인자, 리보솜, 샤페론 단백질, 번역 개시 및 신장 인자, 천연 및/또는 비천연 아미노산과 같은 성분, 및/또는 단백질 발현에 사용되는 기타 성분을 다양하게 포함한다. 이러한 성분은 수율 향상, 합성 속도 증가, 단백질 산물 신뢰도 증가, 또는 비천연 아미노산 통합을 위해 필요에 따라 변형된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 사이토카인은 US 8,778,631; US 2017/0283469; US 2018/0051065; US 2014/0315245; 또는 US 8,778,631에 기재된 무세포 번역 시스템을 사용하여 합성된다. 일부 구현예에서, 무세포 번역 시스템은 변형된 방출 인자, 또는 심지어 시스템으로부터의 하나 이상의 방출 인자의 제거를 포함한다. 일부 구현예에서, 무세포 번역 시스템은 감소된 프로테아제 농도를 포함한다. 일부 구현예에서, 무세포 번역 시스템은 비천연 아미노산을 코딩하는 데 사용되는 재할당된 코돈을 갖는 변형된 tRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 비천연 아미노산의 통합을 위한 본원에 기재된 합성효소는 무세포 번역 시스템에 사용된다. 일부 구현예에서, tRNA는 무세포 번역 시스템에 첨가되기 전에 효소적 또는 화학적 방법을 사용하여 비천연 아미노산으로 예비로딩된다. 일부 구현예에서, 무세포 번역 시스템을 위한 성분은 변형된 유기체, 예컨대 변형된 박테리아, 효모, 또는 기타 유기체로부터 얻어진다.
일부 구현예에서, IL-10 폴리펩티드는 발현 숙주 시스템을 통해 또는 무세포 시스템을 통해 원형으로 재배치된 형태로 생성된다.
비천연 아미노산을 포함하는 IL-10 폴리펩티드의 생산
직교성 또는 확장된 유전 코드가 본 발명에 사용될 수 있으며, 여기서 IL-10 폴리펩티드의 핵산 서열에 존재하는 하나 이상의 특정 코돈은 비천연 아미노산을 암호화하도록 할당되어 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍을 사용하여 IL-10에 유전적으로 통합될 수 있다. 직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍은 tRNA를 비천연 아미노산으로 하전시킬 수 있고, 코돈에 반응하여 비천연 아미노산을 폴리펩티드 사슬에 통합시킬 수 있다.
일부 경우에, 코돈은 코돈 앰버, 오커, 오팔, 또는 쿼드러플렛 코돈이다. 일부 경우에, 코돈은 비천연 아미노산을 운반하는 데 사용될 직교성 tRNA에 해당한다. 일부 경우에, 코돈은 앰버이다. 다른 경우에, 코돈은 직교성 코돈이다.
일부 경우에, 코돈은 직교성 리보솜 리보-Q1에 의해 디코딩될 수 있는 쿼드러플렛 코돈이다. 일부 경우에, 쿼드러플렛 코돈은 문헌[Neumann, et al., "Encoding multiple unnatural amino acids via evolution of a quadruplet-decoding ribosome," Nature, 464(7287): 441-444 (2010)]에 예시되어 있다.
일부 경우에, 본 발명에 사용되는 코돈은 재코딩된 코돈, 예를 들어 대체 코돈으로 대체된 동의 코돈 또는 희귀 코돈이다. 일부 경우에, 재코딩된 코돈은 문헌[Napolitano, et al., "Emergent rules for codon choice elucidated by editing rare arginine codons in Escherichia coli," PNAS, 113(38): E5588-5597 (2016)]에 기재되어 있다. 일부 경우에, 재코딩된 코돈은 문헌[Ostrov et al., "Design, synthesis, and testing toward a 57-codon genome," Science 353(6301): 819-822 (2016)]에 기재되어 있다.
일부 경우에, 비천연 핵산이 사용되어 하나 이상의 비천연 아미노산이 IL-10에 통합된다. 예시적인 비천연 핵산은 우라실-5-일, 하이포잔틴-9-일(I), 2-아미노아데닌-9-일, 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 구체적으로 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 비천연 핵산, 예컨대 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2 치환된 퓨린, N-6 치환된 퓨린, O-6 치환된 퓨린, 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실, 5-프로피닐시토신, 5-메틸시토신, 듀플렉스 형성의 안정성을 증가시키는 것, 보편적 핵산, 소수성 핵산, 무차별 핵산, 크기 확대된 핵산, 플루오르화 핵산, 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린, 예를 들어 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신. 5-메틸시토신(5-me-C), 5-하이드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸, 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실, 5-할로시토신, 5-프로피닐(-C≡C-CH3) 우라실, 5-프로피닐 시토신, 피리미딘 핵산의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 6-아조 시토신, 6-아조 티민, 5-우라실(슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-하이드록실 및 기타 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 구체적으로 5-브로모, 5-트리플루오로메틸, 기타 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌, 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌, 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌, 7-데아자아데닌, 3-데아자구아닌, 3-데아자아데닌, 삼환 피리미딘, 페녹사진 사이티딘([5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 페노티아진 사이티딘(1H-피리미도[5,4-b][l,4]벤조티아진-2(3H)-온), G-클램프, 페녹사진 사이티딘(예를 들어, 9-(2-아미노에톡시)-H-피리미도[5,4-b][l,4]벤족사진-2(3H)-온), 카바졸 사이티딘(2H-피리미도[4,5-b]인돌-2-온), 피리도인돌 사이티딘(H-피리도[3',2':4,5]피롤로[2,3-d]피리미딘-2-온), 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 복소환으로 대체된 것, 7-데아자-아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘, 2-피리돈, 아자시토신, 5-브로모시토신, 브로모우라실, 5-클로로시토신, 염화 시토신, 시클로시토신, 시토신 아라비노시드, 5-플루오로시토신, 플루오로피리미딘, 플루오로우라실, 5,6-디하이드로시토신, 5-요오도시토신, 하이드록시우레아, 요오도우라실, 5-니트로시토신, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 및 5-요오도우라실, 2-아미노-아데닌, 6-티오-구아닌, 2-티오-티민, 4-티오-티민, 5-프로피닐-우라실, 4-티오-우라실, N4-에틸시토신, 7-데아자구아닌, 7-데아자-8-아자구아닌, 5-하이드록시시토신, 2'-데옥시우리딘, 2-아미노-2'-데옥시아데노신, 및 문헌[미국 특허 3,687,808호; 4,845,205호; 4,910,300호; 4,948,882호; 5,093,232호; 5,130,302호; 5,134,066호; 5,175,273호; 5,367,066호; 5,432,272호; 5,457,187호; 5,459,255호; 5,484,908호; 5,502,177호; 5,525,711호; 5,552,540호; 5,587,469호; 5,594,121호; 5,596,091호; 5,614,617호; 5,645,985호; 5,681,941호; 5,750,692호; 5,763,588호; 5,830,653호 및 6,005,096호; WO 99/62923; Kandimalla et al., (2001) Bioorg. Med. Chem. 9:807-813; The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, Kroschwitz, J.I., Ed., John Wiley & Sons, 1990, 858- 859; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; 및 Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, Crookeand Lebleu Eds., CRC Press, 1993, 273-288]에 기재된 것. 추가의 염기 변형은, 예를 들어 문헌[미국 특허 3,687,808호; Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613; 및 Sanghvi, Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke and Lebleu ed., CRC Press, 1993]에서 확인할 수 있다.
다양한 헤테로시클릭 염기 및 다양한 당 모이어티(및 당 유사체)를 포함하는 비천연 핵산은 당업계에서 이용 가능하고, 일부 경우에 핵산은 자연 발생 핵산의 주요 5가지 염기 성분 이외의 하나 또는 여러 헤테로시클릭 염기를 포함한다. 예를 들어, 일부 경우에 헤테로시클릭 염기는 우라실-5-일, 시토신-5-일, 아데닌-7-일, 아데닌-8-일, 구아닌-7-일, 구아닌-8-일, 4-아미노피롤로 [2.3-d] 피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로 [2,3-d] 피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로 [2.3-d] 피리미딘-3-일 기를 포함하고, 여기서 퓨린은 9-위치를 통해, 피리미딘은 1-위치를 통해, 피롤로피리미딘은 7-위치를 통해, 그리고 피라졸로피리미딘은 1-위치를 통해 핵산의 당 모이어티에 부착된다.
일부 구현예에서, 뉴클레오티드 유사체가 또한 포스페이트 모이어티에서 변형된다. 변형된 포스페이트 모이어티는 2개의 뉴클레오티드 사이의 연결에서 변형을 갖는 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 기타 알킬 포스포네이트(3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트 포함), 포스피네이트, 포스포라미데이트(3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트 포함), 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 보라노포스페이트를 함유한다. 2개의 뉴클레오티드 사이의 이러한 포스페이트 또는 변형된 포스페이트 연결은 3'-5' 연결 또는 2'-5' 연결을 통한 것이며, 연결은 3'-5'에서 5'-3', 또는 2'-5'에서 5'-2'와 같은 반전 극성을 포함하는 것으로 이해된다. 다양한 염, 혼합염 및 유리산 형태가 또한 포함된다. 다수의 미국 특허는 변형된 포스페이트를 함유하는 뉴클레오티드의 제조 및 사용 방법을 교시하며, 3,687,808호; 4,469,863호; 4,476,301호; 5,023,243호; 5,177,196호; 5,188,897호; 5,264,423호; 5,276,019호; 5,278,302호; 5,286,717호; 5,321,131호; 5,399,676호; 5,405,939호; 5,453,496호; 5,455,233호; 5,466,677호; 5,476,925호; 5,519,126호; 5,536,821호; 5,541,306호; 5,550,111호; 5,563,253호; 5,571,799호; 5,587,361호; 및 5,625,050호를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 비천연 핵산은 2',3'-디데옥시-2',3'-디데하이드로-뉴클레오시드(PCT/US2002/006460), 5'-치환된 DNA 및 RNA 유도체(PCT/US2011/033961; Saha et al., J. Org Chem., 1995, 60, 788-789; Wang et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 1999, 9, 885-890; 및 Mikhailov et al., Nucleosides & Nucleotides, 1991, 10(1-3), 339-343; Leonid et al., 1995, 14(3-5), 901-905; 및 Eppacher et al., Helvetica Chimica Acta, 2004, 87, 3004-3020; PCT/JP2000/004720; PCT/JP2003/002342; PCT/JP2004/013216; PCT/JP2005/020435; PCT/JP2006/315479; PCT/JP2006/324484; PCT/JP2009/056718; PCT/JP2010/067560), 또는 변형된 염기를 갖는 모노포스페이트로서 제조된 5'-치환된 단량체(Wang et al., Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids, 2004, 23 (1 & 2), 317-337)를 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 핵산은 당 고리의 5'-위치 및 2'-위치에서의 변형(PCT/US94/02993), 예컨대 5'-CH2-치환 2'-O-보호 뉴클레오시드(Wu et al., Helvetica Chimica Acta, 2000, 83, 1127-1143 및 Wu et al., Bioconjugate Chem. 1999, 10, 921-924)를 포함한다. 일부 경우에, 비천연 핵산은 올리고뉴클레오티드에 통합시키기 위해 제조된 아미드 연결된 뉴클레오시드 이량체를 포함하고, 여기서 이량체의 3' 연결된 뉴클레오시드(5'→3')는 2'-OCH3 및 5'-(S)-CH3을 포함한다(Mesmaeker et al., Synlett, 1997, 1287-1290). 비천연 핵산은 2'-치환 5'-CH2(또는 O) 변형된 뉴클레오시드를 포함할 수 있다(PCT/US92/01020). 비천연 핵산은 5'-메틸렌포스포네이트 DNA 및 RNA 단량체 및 이량체를 포함할 수 있다(Bohringer et al., Tet. Lett., 1993, 34, 2723-2726; Collingwood et al., Synlett, 1995, 7, 703-705; 및 Hutter et al., Helvetica Chimica Acta, 2002, 85, 2777-2806). 비천연 핵산은 2'-치환을 갖는 5'-포스포네이트 단량체(US2006/0074035) 및 기타 변형된 5'-포스포네이트 단량체(WO1997/35869)를 포함할 수 있다. 비천연 핵산은 5'-변형된 메틸렌포스포네이트 단량체를 포함할 수 있다(EP614907 및 EP629633). 비천연 핵산은 5' 및/또는 6'-위치에 하이드록실기를 포함하는 5' 또는 6'-포스포네이트 리보뉴클레오시드의 유사체를 포함할 수 있다(Chen et al., Phosphorus, Sulfur and Silicon, 2002, 777, 1783-1786; Jung et al., Bioorg. Med. Chem., 2000, 8, 2501-2509; Gallier et al., Eur. J. Org. Chem., 2007, 925-933; 및 Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19(8), 1029-1033). 비천연 핵산은 5'-포스페이트기를 갖는 5'-포스포네이트 데옥시리보뉴클레오시드 단량체 및 이량체를 포함할 수 있다(Nawrot et al., Oligonucleotides, 2006, 16(1), 68-82). 비천연 핵산은 6'-포스포네이트기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있으며, 여기서 5' 및/또는 6'-위치는 치환되지 않거나 티오-tert-부틸기(SC(CH3)3) (및 이의 유사체); 메틸렌아미노기(CH2NH2) (및 이의 유사체) 또는 시아노기(CN) (및 이의 유사체)로 치환된다(Fairhurst et al., Synlett, 2001, 4, 467-472; Kappler et al., J. Med. Chem., 1986, 29, 1030-1038; Kappler et al., J. Med. Chem., 1982, 25, 1179-1184; Vrudhula et al., J. Med. Chem., 1987, 30, 888-894; Hampton et al., J. Med. Chem., 1976, 19, 1371-1377; Geze et al., J. Am. Chem. Soc, 1983, 105(26), 7638-7640; 및 Hampton et al., J. Am. Chem. Soc, 1973, 95(13), 4404-4414).
일부 구현예에서, 비천연 핵산은 또한 당 모이어티의 변형을 포함한다. 일부 경우에, 핵산은 당 기가 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드를 포함한다. 이러한 당 변형된 뉴클레오시드는 향상된 뉴클레아제 안정성, 증가된 결합 친화성, 또는 일부 다른 유익한 생물학적 특성을 부여할 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산은 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리의 예는 치환기(5' 및/또는 2' 치환기 포함)의 부가; 이환 핵산(BNA)을 형성하기 위한 2개의 고리 원자의 가교; S, N(R), 또는 C(R1)(R2) (R = H, C1-C12 알킬 또는 보호기)에 의한 리보실 고리 산소 원자의 대체; 및 이들의 조합을 제한 없이 포함한다. 화학적으로 변형된 당의 예는 WO2008/101157, US2005/0130923, 및 WO2007/134181에서 확인할 수 있다.
일부 경우에, 변형된 핵산은 변형된 당 또는 당 유사체를 포함한다. 따라서, 리보스 및 데옥시리보스 이외에, 당 모이어티는 펜토스, 데옥시펜토스, 헥소스, 데옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 자일로스, 릭소스, 또는 당 "유사체" 시클로펜틸기일 수 있다. 당은 피라노실 또는 푸라노실 형태일 수 있다. 당 모이어티는 리보스, 데옥시리보스, 아라비노스 또는 2'-O-알킬리보스의 푸라노시드일 수 있고, 당은 [알파] 또는 [베타] 아노머 입체배치로 각각의 헤테로시클릭 염기에 부착될 수 있다. 당 변형은 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA, 및 2'-알콕시- 또는 아미노-RNA/DNA 키메라를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 당 변형은 2'-O-메틸-우리딘 또는 2'-O-메틸-시티딘을 포함할 수 있다. 당 변형은 2'-O-알킬-치환 데옥시리보뉴클레오시드 및 2'-O-에틸렌글리콜 유사 리보뉴클레오시드를 포함한다. 이러한 당 또는 당 유사체, 및 이러한 당 또는 유사체가 헤테로시클릭 염기(핵산 염기)에 부착된 각각의 "뉴클레오시드"의 제조는 알려져 있다. 당 변형이 또한 이루어지고 다른 변형과 조합될 수 있다.
당 모이어티에 대한 변형은 리보스 및 데옥시리보스의 천연 변형, 및 비천연 변형을 포함한다. 당 변형은 2' 위치에서의 다음과 같은 변형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다 OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S-, 또는 N-알키닐; 또는 O-알킬-O-알킬(알킬, 알케닐, 및 알키닐은 치환 또는 비치환 C1 내지 C10 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐일 수 있음). 2' 당 변형은 또한 -O[(CH2)nO]m CH3, -O(CH2)nOCH3, -O(CH2)nNH2, -O(CH2)nCH3, -O(CH2)nONH2, 및 -O(CH2)nON[(CH2)n CH3)]2를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(n 및 m은 1 내지 약 10임).
2' 위치에서의 다른 변형은 C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알카릴, 아랄킬, O-알카릴, O-아랄킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2 CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알카릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 인터컬레이터, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선하기 위한 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선하기 위한 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당의 다른 위치, 구체적으로 3' 말단 뉴클레오티드 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드에서의 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 유사한 변형이 이루어질 수도 있다. 변형된 당은 또한 CH2 및 S와 같은 가교 고리 산소에서의 변형을 포함하는 것들을 포함한다. 뉴클레오티드 당 유사체는 또한, 펜토푸라노실 당 대신 시클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다. 이러한 변형된 당 구조의 제조를 교시하며 일련의 염기 변형을 열거하고 설명하는 미국 특허 4,981,957호; 5,118,800호; 5,319,080호; 5,359,044호; 5,393,878호; 5,446,137호; 5,466,786호; 5,514,785호; 5,519,134호; 5,567,811호; 5,576,427호; 5,591,722호; 5,597,909호; 5,610,300호; 5,627,053호; 5,639,873호; 5,646,265호; 5,658,873호; 5,670,633호; 4,845,205호; 5,130,302호; 5,134,066호; 5,175,273호; 5,367,066호; 5,432,272호; 5,457,187호; 5,459,255호; 5,484,908호; 5,502,177호; 5,525,711호; 5,552,540호; 5,587,469호; 5,594,121호; 5,596,091호; 5,614,617호; 5,681,941호; 및 5,700,920호와 같은 다수의 미국 특허가 있으며, 이들 각각의 전문은 본원에 참조로 포함된다.
변형된 당 모이어티를 갖는 핵산의 예는 5'-비닐, 5'-메틸(R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3, 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기를 포함하는 핵산을 제한 없이 포함한다. 2' 위치에서의 치환기는 또한 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-(C1-C10 알킬), OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn)으로부터 선택될 수 있다(각각의 Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환 C1-C10 알킬임).
특정 구현예에서, 본원에 기재된 핵산은 하나 이상의 이환 핵산을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 이환 핵산은 4' 및 2' 리보실 고리 원자 사이의 가교체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 핵산은 하나 이상의 이환 핵산을 포함하며, 가교체는 4'→2' 이환 핵산을 포함한다. 이러한 4'→2' 이환 핵산의 예는 화학식 4'-(CH2)-O-2'(LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)2-O-2'(ENA); 4'-CH(CH3)-O-2' 및 4'-CH(CH2OCH3)-O-2', 및 이들의 유사체(미국 특허 7,399,845호 참조); 4'-C(CH3)(CH3)-O-2' 및 이의 유사체(WO2009/006478, WO2008/150729, US2004/0171570, 미국 특허 7,427,672호, Chattopadhyaya et al., J. Org. Chem., 209, 74, 118-134, 및 WO2008/154401 참조) 중 하나를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 예를 들어 Singh et al., Chem. Commun., 1998, 4, 455-456; Koshkin et al., Tetrahedron, 1998, 54, 3607-3630; Wahlestedt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2000, 97, 5633-5638; Kumar et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1998, 8, 2219-2222; Singh et al., J. Org. Chem., 1998, 63, 10035-10039; Srivastava et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(26) 8362-8379; Elayadi et al., Curr. Opinion Invens. Drugs, 2001, 2, 558-561; Braasch et al., Chem. Biol, 2001, 8, 1-7; Oram et al., Curr. Opinion Mol. Ther., 2001, 3, 239-243; 미국 특허 4,849,513호; 5,015,733호; 5,118,800호; 5,118,802호; 7,053,207호; 6,268,490호; 6,770,748호; 6,794,499호; 7,034,133호; 6,525,191호; 6,670,461호; 및 7,399,845호; 국제 공보 WO2004/106356호, WO1994/14226호, WO2005/021570호, WO2007/090071호, 및 WO2007/134181호; 미국 특허 공보 US2004/0171570호, US2007/0287831호, 및 US2008/0039618호; 미국 가출원 60/989,574호, 61/026,995호, 61/026,998호, 61/056,564호, 61/086,231호, 61/097,787호, 및 61/099,844호; 및 국제 출원 PCT/US2008/064591호, PCT US2008/066154호, PCT US2008/068922호, 및 PCT/DK98/00393호 참조.
특정 구현예에서, 핵산은 연결된 핵산을 포함한다. 핵산은 임의의 핵산간 연결을 사용하여 서로 연결될 수 있다. 핵산간 연결기의 두 가지 주요 부류는 인 원자의 존재 또는 부재에 의해 정의된다. 대표적인 인 함유 핵산간 연결은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포라미데이트, 및 포스포로티오에이트(P=S)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 대표적인 인 비함유 핵산간 연결기는 메틸렌메틸이미노(-CH2-N(CH3)-O-CH2-), 티오디에스테르(-O-C(O)-S-), 티오노카바메이트(-O-C(O)(NH)-S-); 실록산(-O-Si(H)2-O-); 및 N,N*-디메틸하이드라진(-CH2-N(CH3)-N(CH3))을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 특정 구현예에서, 키랄 원자를 갖는 핵산간 연결은 라세미 혼합물, 별개의 거울상이성체, 예를 들어, 알킬포스포네이트 및 포스포로티오에이트로서 제조될 수 있다. 비천연 핵산은 단일 변형을 포함할 수 있다. 비천연 핵산은 모이어티 중 하나 내에 또는 서로 다른 모이어티 사이에 다수의 변형을 포함할 수 있다.
핵산에 대한 골격 포스페이트 변형은 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포라미데이트(가교 또는 비가교), 포스포트리에스테르, 포스포로디티오에이트, 포스포디티오에이트, 및 보라노포스페이트를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 임의의 조합으로 사용될 수 있다. 다른 비포스페이트 연결도 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 골격 변형(예를 들어, 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로아미데이트, 및 포스포로디티오에이트 뉴클레오티드간 연결)은 변형된 핵산에 면역조절 활성을 부여하고/하거나 이의 생체내 안정성을 향상시킬 수 있다.
일부 경우에, 인 유도체(또는 변형된 포스페이트기)는 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착되며, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포라미데이트 등일 수 있다. 변형된 포스페이트 연결 또는 비포스페이트 연결을 포함하는 예시적인 폴리뉴클레오티드는 문헌[Peyrottes et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24:2318-2323; 및 Schultz et al., (1996) Nucleic Acids Res. 24:2966-2973; Matteucci, 1997, "Oligonucleotide Analogs: an Overview" in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (Chadwick and Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY; Zon, 1993, "Oligonucleoside Phosphorothioates" in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Humana Press, pp. 165-190; Miller et al., 1971, JACS 93:6657-6665; Jager et al., 1988, Biochem. 27:7247-7246; Nelson et al., 1997, JOC 62:7278-7287; U.S. Patent No. 5,453,496; 및 Micklefield, 2001, Curr. Med. Chem. 8: 1157-1179]에서 확인할 수 있다.
일부 경우에, 골격 변형은 음이온성, 중성, 또는 양이온성 기와 같은 대체 모이어티에 의한 포스포디에스테르 연결의 대체를 포함한다. 이러한 변형의 예는 음이온성 뉴클레오시드간 연결; N3'→P5' 포스포라미데이트 변형; 보라노포스페이트 DNA; 프로올리고뉴클레오티드; 중성 뉴클레오시드간 연결, 예컨대 메틸포스포네이트; 아미드 연결된 DNA; 메틸렌(메틸이미노) 연결; 포름아세탈 및 티오포름아세탈 연결; 설포닐기를 함유하는 골격; 모르폴리노 올리고; 펩티드 핵산(PNA); 및 양전하를 띤 데옥시리보핵산 구아니딘(DNG) 올리고(Micklefield, 2001, Current Medicinal Chemistry 8: 1157-1179)를 포함한다. 변형된 핵산은 하나 이상의 변형, 예를 들어 포스포디에스테르 연결과 포스포로티오에이트 연결의 조합과 같은 포스페이트 연결의 조합을 포함하는 키메라 또는 혼합 골격을 포함할 수 있다.
포스페이트의 치환기는, 예를 들어 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 이들은 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성된) 모르폴리노 연결을 갖는 것; 실록산 골격; 설파이드, 설폭사이드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 함유 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌하이드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 및 혼합된 N, O, S, 및 CH2 성분 부분을 갖는 그 외의 것들을 포함한다. 다수의 미국 특허는 이러한 유형의 포스페이트 대체물의 제조 및 사용 방법을 개시하며, 미국 특허 5,034,506호; 5,166,315호; 5,185,444호; 5,214,134호; 5,216,141호; 5,235,033호; 5,264,562호; 5,264,564호; 5,405,938호; 5,434,257호; 5,466,677호; 5,470,967호; 5,489,677호; 5,541,307호; 5,561,225호; 5,596,086호; 5,602,240호; 5,610,289호; 5,602,240호; 5,608,046호; 5,610,289호; 5,618,704호; 5,623,070호; 5,663,312호; 5,633,360호; 5,677,437호; 및 5,677,439호를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 뉴클레오티드 치환에서 뉴클레오티드의 당 및 포스페이트 모이어티 모두가, 예를 들어 아미드 유형 연결(아미노에틸글리신)(PNA)에 의해 대체될 수 있다는 것이 이해된다. 미국 특허 5,539,082호; 5,714,331호; 및 5,719,262호는 PNA 분자의 제조 및 사용 방법을 교시하며, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다. 또한 문헌[Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500] 참조. 예를 들어 세포 흡수를 향상시키기 위해 다른 유형의 분자(접합체)를 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 연결할 수도 있다. 접합체는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체에 화학적으로 연결될 수 있다. 이러한 접합체는 지질 모이어티, 예컨대 콜레스테롤 모이어티(Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜산(Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), 티오에테르, 예를 들어 헥실-S-트리틸티올(Manoharan et al., Ann. KY. Acad. Sci., 1992, 660, 306-309; Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), 티오콜레스테롤(Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기(Saison-Behmoaras et al., EM5OJ, 1991, 10, 1111-1118; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327-330; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 l-디-O-헥사데실-rac-글리세로-S-H-포스포네이트(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬(Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산(Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 모이어티(Mishra et al., Biochem. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카보닐-옥시콜레스테롤 모이어티(Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다수의 미국 특허는 이러한 접합체의 제조를 교시하며, 미국 특허 4,828,979호; 4,948,882호; 5,218,105호; 5,525,465호; 5,541,313호; 5,545,730호; 5,552,538호; 5,578,717호; 5,580,731호; 5,580,731호; 5,591,584호; 5,109,124호; 5,118,802호; 5,138,045호; 5,414,077호; 5,486,603호; 5,512,439호; 5,578,718호; 5,608,046호; 4,587,044호; 4,605,735호; 4,667,025호; 4,762,779호; 4,789,737호; 4,824,941호; 4,835,263호; 4,876,335호; 4,904,582호; 4,958,013호; 5,082,830호; 5,112,963호; 5,214,136호; 5,082,830호; 5,112,963호; 5,214,136호; 5,245,022호; 5,254,469호; 5,258,506호; 5,262,536호; 5,272,250호; 5,292,873호; 5,317,098호; 5,371,241호; 5,391,723호; 5,416,203호; 5,451,463호; 5,510,475호; 5,512,667호; 5,514,785호; 5,565,552호; 5,567,810호; 5,574,142호; 5,585,481호; 5,587,371호; 5,595,726호; 5,597,696호; 5,599,923호; 5,599,928호 및 5,688,941호를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 비천연 핵산은 비천연 염기쌍을 추가로 형성한다. 생체내 조건하에서 비천연 DNA 또는 RNA 염기쌍(UBP)을 형성할 수 있는 예시적인 비천연 뉴클레오티드는 5SICS, d5SICS, NAM, dNaM, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 비천연 뉴클레오티드는 다음을 포함한다:
Figure pct00030
; 및
Figure pct00031
.
일부 경우에, 비천연 핵산은 비천연 염기쌍을 추가로 형성한다. 생체내 조건하에서 비천연 DNA 또는 RNA 염기쌍(UBP)을 형성할 수 있는 예시적인 비천연 뉴클레오티드는 TPT3, dTPT3, 5SICS, d5SICS, NaM, dNaM, CNMO, dCNMO, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본원에 개시된 IL-10 접합체를 제조하는 데 사용될 수 있는 비천연 UBP를 형성할 수 있는 비천연 뉴클레오티드의 다른 예는 문헌[Dien et al., J Am Chem Soc., 2018, 140:16115-16123; Feldman et al., J Am Chem Soc, 2017, 139:11427-11433; Ledbetter et al., J Am Chem Soc., 2018, 140:758-765; Dhami et al., Nucleic Acids Res. 2014, 42:10235-10244; Malyshev et al., Nature, 2014, 509:385-388; Betz et al., J Am Chem Soc., 2013, 135:18637-18643; Lavergne et al., J Am Chem Soc. 2013, 135:5408-5419; 및 Malyshev et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109:12005-12010]에서 확인할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 접합체를 제조하는 데 사용될 수 있는 비천연 뉴클레오티드는 하기 화학식의 화합물로부터 유도될 수 있으며,
Figure pct00032
식 중 R2는 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 메톡시, 메탄티올, 메탄셀레노, 할로겐, 시아노, 및 아지도로 이루어진 군으로부터 선택되고;
물결선은 리보실 또는 2'-데옥시리보실에 대한 결합을 나타내고, 리보실 또는 2'-데옥시리보실 모이어티의 5'-하이드록시기는 유리 형태이거나, 선택적으로 모노포스페이트, 디포스페이트, 또는 트리포스페이트기에 결합된다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 접합체를 제조하는 데 사용될 수 있는 비천연 뉴클레오티드는
Figure pct00033
,
Figure pct00034
,
Figure pct00035
,
Figure pct00036
,
Figure pct00037
, 및
Figure pct00038
로부터 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 IL-10 접합체를 제조하는 데 사용될 수 있는 비천연 뉴클레오티드는
Figure pct00039
,
Figure pct00040
,
Figure pct00041
,
Figure pct00042
,
Figure pct00043
, 및
Figure pct00044
, 또는 이들의 염을 포함한다.
일부 구현예에서, 비천연 아미노산은 하기 열거된 것들을 포함하는 합성 코돈/안티코돈 쌍에 의해 IL-10 폴리펩티드에 통합된다.
Figure pct00045
여기서, X 및 Y는 본원에 개시된 바와 같은 비천연 염기를 포함한다. 예를 들어, X는
Figure pct00046
로부터 유도된 뉴클레오티드일 수 있고, Y는
Figure pct00047
로부터 유도된 뉴클레오티드일 수 있다.
일부 구현예에서, 비천연 염기쌍은 문헌[Dumas et al., "Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology," Chemical Science, 6: 50-69 (2015)]에 기재된 비천연 아미노산을 생성한다.
본원에 개시된 작제물 또는 벡터가 도입되는 숙주 세포는 관심 tRNA, tRNA 합성효소, 및 단백질이 생산되도록 적합한 배지에서 배양되거나 유지된다. 배지는 또한, 관심 단백질이 비천연 아미노산(들)을 통합하도록 비천연 아미노산(들)을 포함한다.
직교성 tRNA 합성효소/tRNA 쌍은 tRNA를 비천연 아미노산으로 하전시키고, 코돈에 반응하여 비천연 아미노산을 폴리펩티드 사슬에 통합시킨다. 예시적인 aaRS-tRNA 쌍은 Methanococcus jannaschii(Mj-Tyr) aaRS/tRNA 쌍, E. coli TyrRS(Ec-Tyr)/B. stearothermophilus tRNACUA 쌍, E. coli LeuRS(Ec-Leu)/B. stearothermophilus tRNACUA 쌍, 및 피롤리실-tRNA 쌍을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
비천연 아미노산(들)을 포함하는 IL-10 폴리펩티드는, tRNA 및 tRNA 합성효소를 포함하고 하나 이상의 인-프레임 직교성 (종결) 코돈과 함께 관심 핵산 서열을 포함하는 본원에 기재된 핵산 작제물을 숙주 세포에 도입함으로써 제조된다. 숙주 세포는 비천연 아미노산(들)을 포함하는 생리학적 용액에 노출되고, 숙주 세포는 이후 관심 암호화 서열의 단백질의 발현을 허용하는 조건하에 유지된다. 비천연 아미노산(들)은 코돈에 반응하여 폴리펩티드 사슬에 통합된다. 예를 들어, 하나 이상의 비천연 아미노산이 IL-10 폴리펩티드에 통합된다. 대안적으로, 2개 이상의 비천연 아미노산이 단백질의 2개 이상의 부위에서 IL-10 폴리펩티드에 통합될 수 있다.
다수의 비천연 아미노산이 IL-10 폴리펩티드에 통합되는 경우, tRNA 합성효소/tRNA 쌍이 코돈(들)에 반응하여 비천연 아미노산의 통합을 지시할 수 있도록 다수의 코돈이 원하는 위치에서 암호화 핵산 서열에 통합될 필요가 있음이 이해될 것이다. 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 또는 그 이상의 코돈 암호화 핵산이 관심 핵산 서열에 통합될 수 있다.
하나 초과의 유형의 비천연 아미노산을 단일 단백질로 관심 단백질에 통합하는 것이 요구되는 경우, 제2의 또는 추가의 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍이 제2의 또는 추가의 비천연 아미노산을 통합하도록 사용될 수 있고; 적합하게는 2개 이상의 비천연 아미노산이 단일 제조 단계에서 단백질의 다른 정의된 부위에 특이적으로 통합될 수 있도록 상기 제2의 또는 추가의 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍은 관심 단백질을 암호화하는 핵산에서 다른 코돈을 인식한다. 따라서 특정 구현예에서, 2개 이상의 직교성 tRNA-tRNA 합성효소 쌍이 사용될 수 있다.
비천연 아미노산(들)을 포함하는 IL-10 폴리펩티드가 숙주 세포에서 생성되면, 효소적, 화학적, 및/또는 삼투적 용해 및 물리적 파괴를 포함하여 당업계에 알려진 다양한 기법에 의해 숙주 세포로부터 추출될 수 있다. IL-10 폴리펩티드는 당업계에 알려진 표준 기법, 예컨대 분취 크로마토그래피, 친화성 정제, 또는 임의의 다른 적합한 기법에 의해 정제될 수 있다.
적합한 숙주 세포는 박테리아 세포(예를 들어, E. coli)를 포함할 수 있지만, 가장 적합하게는 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 곤충 세포(예를 들어, Drosophila melanogaster와 같은 초파리), 효모 세포, 선충(예를 들어, Caenorhabditis elegans), 마우스(예를 들어, Mus musculus), 또는 포유류 세포(예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포, 인간 293T 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, 및 마우스 적백혈병(MEL) 세포) 또는 인간 세포 또는 기타 진핵 세포이다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 알려져 있다. 적합하게는, 숙주 세포는 포유류 세포, 예컨대 인간 세포 또는 곤충 세포이다.
적합한 숙주 세포는 박테리아 세포(예를 들어, E. coli, BL21(DE3))를 포함할 수 있지만, 가장 적합하게는 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들어 곤충 세포(예를 들어, Drosophila melanogaster와 같은 초파리), 효모 세포, 선충(예를 들어, C. elegans), 마우스(예를 들어, Mus musculus), 또는 포유류 세포(예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포, 인간 293T 세포, Hela 세포, NIH 3T3 세포, 및 마우스 적백혈병(MEL) 세포) 또는 인간 세포 또는 기타 진핵 세포이다. 다른 적합한 숙주 세포는 당업자에게 알려져 있다. 적합하게는, 숙주 세포는 포유류 세포, 예컨대 인간 세포 또는 곤충 세포이다. 일부 구현예에서, 적합한 숙주 세포는 대장균(E. coli)을 포함한다.
본 발명의 구현예에서 일반적으로 사용될 수 있는 다른 적합한 숙주 세포는 실시예 부문에 언급된 것들이다. 벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 형질주입 기법을 통해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "형질전환" 및 "형질주입"은 인산칼슘 또는 염화칼슘 동시침전, DEAE-덱스트란-매개 형질주입, 리포펙션, 또는 전기천공을 포함하여, 외부 핵산 분자(예를 들어, DNA)를 숙주 세포에 도입하기 위한 잘 알려진 다양한 기법을 의미하는 것이다. 숙주 세포를 형질전환 또는 형질주입하기 위한 적합한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다.
세포주를 생성할 때, 안정한 세포주를 제조하는 것이 일반적으로 바람직하다. 예를 들어 포유류 세포의 안정한 형질주입에 있어서, 사용된 발현 벡터 및 형질주입 기법에 따라, 세포의 극히 일부만이 외부 DNA를 자신의 게놈에 통합시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 통합체를 확인하고 선택하기 위해, (예를 들어, 항생제에 대한 내성에 대해) 선별 마커를 암호화하는 유전자가 관심 유전자와 함께 숙주 세포에 일반적으로 도입된다. 바람직한 선별 마커는 G418, 하이그로마이신, 또는 메토트렉세이트와 같은 약물에 내성을 부여하는 것들을 포함한다. 선별 마커를 암호화하는 핵산 분자는 동일한 벡터 상의 숙주 세포에 도입될 수 있거나, 별개의 벡터 상에 도입될 수 있다. 도입된 핵산 분자로 안정하게 형질주입된 세포는 약물 선택에 의해 식별될 수 있다(예를 들어, 선별 마커 유전자가 포함된 세포는 생존하는 반면에, 다른 세포는 죽는다).
일 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 안정한 통합의 장점은 개별 세포 또는 클론 간의 균일성이 달성된다는 것이다. 다른 장점은 최적의 생산자가 선택될 수 있다는 것이다. 따라서, 안정한 세포주를 생성하는 것이 바람직하다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 작제물은 숙주 세포에 형질주입된다. 숙주 세포에 작제물을 형질주입하는 것의 장점은 단백질 수율이 최대화될 수 있다는 것이다. 일 양태에서, 본원에 기재된 핵산 작제물 또는 벡터를 포함하는 세포가 기재된다.
약학적 조성물 및 제형
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물 및 제형은, 비경구, 경구, 또는 경피 투여 경로를 비제한적인 예로서 포함하는 다수의 투여 경로에 의해 대상체에게 투여된다. 일부 경우에, 비경구 투여는 정맥내, 피하, 근육내, 뇌내, 비강내, 동맥내, 관절내, 진피내, 유리체내, 골내 주입, 복강내 또는 척수강내 투여를 포함한다. 일부 경우에, 약학적 조성물은 국소 투여용으로 제형화된다. 다른 경우에, 약학적 조성물은 전신 투여용으로 제형화된다.
일부 구현예에서, 약학적 제형은 수성 액체 분산액, 자가-유화 분산액, 리포솜 분산액, 에어로졸, 속방형 제형, 제어방출형 제형, 서방형 제형, 지속방출형 제형, 박동방출형 제형, 및 속방 및 제어방출 혼합형 제형을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 약학적 제형은 본원에 개시된 조성물과의 상용성 및 원하는 투여 형태의 방출 프로파일 특성에 기초하여 선택된 담체 또는 담체 물질을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995), Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975, Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980, 및 Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins1999)] 참조.
일부 경우에, 약학적 조성물은 리포솜의 지질 이중층에 직접 또는 간접적으로 결합된 복수의 IL-10 접합체를 포함하는 면역리포솜으로서 제형화된다. 예시적인 지질은 지방산; 인지질; 콜레스테롤과 같은 스테롤; 스핑고미엘린과 같은 스핑고지질; 강글리오시드, 글로보시드, 및 세레브로시드와 같은 글리코스핑고지질; 스테아릴, 올레일, 및 리놀레일 아민과 같은 계면활성제 아민을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 경우에, 지질은 양이온성 지질을 포함한다. 일부 경우에, 지질은 인지질을 포함한다. 예시적인 인지질은 포스파티드산("PA"), 포스파티딜콜린("PC"), 포스파티딜글리세롤("PG"), 포파티딜에탄올아민("PE"), 포파티딜이노시톨("PI"), 및 포스파티딜세린("PS"), 스핑고미엘린(뇌 스핑고미엘린 포함), 레시틴, 리소레시틴, 리소포스파티딜에탄올아민, 세레브로시드, 디아라키도일포스파티딜콜린("DAPC"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜콜린("DDPC"), 디엘라이도일포스파티딜콜린("DEPC"), 디라우로일포스파티딜콜린("DLPC"), 디리놀레오일포스파티딜콜린, 디미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"), 디올레오일포스파티딜콜린("DOPC"), 디팔미토일포스파티딜콜린("DPPC"), 디스테아로일포스파티딜콜린("DSPC"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜콜린("POPC"), 디아라키도일포스파티딜글리세롤("DAPG"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜글리세롤("DDPG"), 디엘라이도일포스파티딜글리세롤("DEPG"), 디라우로일포스파티딜글리세롤("DLPG"), 디리놀레오일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤("DMPG"), 디올레오일포스파티딜글리세롤("DOPG"), 디팔미토일포스파티딜글리세롤("DPPG"), 디스테아로일포스파티딜글리세롤("DSPG"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜글리세롤("POPG"), 디아라키도일포스파티딜에탄올아민("DAPE"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜에탄올아민("DDPE"), 디엘라이도일포스파티딜에탄올아민("DEPE"), 디라우로일포스파티딜에탄올아민("DLPE"), 디리놀레오일포스파티딜에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜에탄올아민("DMPE"), 디올레오일포스파티딜에탄올아민("DOPE"), 디팔미토일포스파티딜에탄올아민("DPPE"), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민("DSPE"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민("POPE"), 디아라키도일포스파티딜이노시톨("DAPI"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜이노시톨("DDPI"), 디엘라이도일포스파티딜이노시톨("DEPI"), 디라우로일포스파티딜이노시톨("DLPI"), 디리놀레오일포스파티딜이노시톨, 디미리스토일포스파티딜이노시톨("DMPI"), 디올레오일포스파티딜이노시톨("DOPI"), 디팔미토일포스파티딜이노시톨("DPPI"), 디스테아로일포스파티딜이노시톨("DSPI"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜이노시톨("POPI"), 디아라키도일포스파티딜세린("DAPS"), 디데카노일-L-알파-포스파티딜세린("DDPS"), 디엘라이도일포스파티딜세린("DEPS"), 디라우로일포스파티딜세린("DLPS"), 디리놀레오일포스파티딜세린, 디미리스토일포스파티딜세린("DMPS"), 디올레오일포스파티딜세린("DOPS"), 디팔미토일포스파티딜세린("DPPS"), 디스테아로일포스파티딜세린("DSPS"), 1-팔미토일-2-올레오일-포스파티딜세린("POPS"), 디아라키도일 스핑고미엘린, 디데카노일 스핑고미엘린, 디엘라이도일 스핑고미엘린, 디라우로일 스핑고미엘린, 디리놀레오일 스핑고미엘린, 디미리스토일 스핑고미엘린, 스핑고미엘린, 디올레오일 스핑고미엘린, 디팔미토일 스핑고미엘린, 디스테아로일 스핑고미엘린, 및 1-팔미토일-2-올레오일-스핑고미엘린을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 약학적 제형은 아세트산, 붕산, 시트르산, 락트산, 인산, 및 염산과 같은 산, 수산화나트륨, 인산나트륨, 붕산나트륨, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 및 트리스-하이드록시메틸아미노메탄과 같은 염기, 시트레이트/덱스트로스, 중탄산나트륨, 및 염화암모늄과 같은 완충액을 포함하는 pH 조정제 또는 완충제를 추가로 포함한다. 이러한 산, 염기, 및 완충액은 조성물의 pH를 허용 가능한 범위로 유지하는 데 필요한 양으로 포함된다.
일부 경우에, 약학적 제형은 조성물의 삼투압 농도를 허용 가능한 범위로 만드는 데 필요한 양의 하나 이상의 염을 포함한다. 이러한 염은 나트륨, 칼륨, 또는 암모늄 양이온 및 클로라이드, 시트레이트, 아스코르베이트, 보레이트, 포스페이트, 바이카보네이트, 설페이트, 티오설페이트, 또는 바이설파이트 음이온을 갖는 것들을 포함하고, 적합한 염은 염화나트륨, 염화칼륨, 티오황산나트륨, 중아황산나트륨, 및 황산암모늄을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학적 제형은 트레할로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 말토스, 글루코스와 같은 당, 또는 인산칼륨, 시트르산나트륨, 황산암모늄과 같은 염, 및/또는 폴리펩티드의 용해도 및 생체내 안정성을 증가시키기 위한 헤파린과 같은 기타 제제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 약학적 제형은 보다 안정한 환경을 제공할 수 있으므로 화합물을 안정화시키기 위해 사용되는 희석제를 추가로 포함한다. (pH 제어 또는 유지를 제공할 수도 있는) 완충 용액에 용해된 염은 당업계에서 희석제(인산염 완충 식염수 용액을 포함하나, 이에 한정되지 않음)로서 사용된다.
안정화제는 임의의 항산화제, 완충액, 산, 보존제 등과 같은 화합물을 포함한다. 예시적인 안정화제는 L-아르기닌 하이드로클로라이드, 트로메타민, 알부민(인간), 시트르산, 벤질 알코올, 페놀, 이인산이나트륨 이수화물, 프로필렌 글리콜, 메타크레솔 또는 m-크레솔, 아세트산아연, 폴리소르베이트-20 또는 Tween® 20, 또는 트로메타몰을 포함한다.
계면활성제는 황산 라우릴 나트륨, 도큐세이트 나트륨, Tween 60 또는 80, 트리아세틴, 비타민 E TPGS, 소르비탄 모노올레에이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트, 폴리소르베이트, 폴록사머, 담즙염, 글리세릴 모노스테아레이트, 에틸렌 옥사이드와 프로필렌 옥사이드의 공중합체, 예를 들어 Pluronic®(BASF) 등과 같은 화합물을 포함한다. 추가의 계면활성제는 폴리옥시에틸렌 지방산 글리세리드 및 식물성 오일, 예를 들어 폴리옥시에틸렌(60) 경화 캐스터 오일, 및 폴리옥시에틸렌 알킬에테르 및 알킬페닐 에테르, 예를 들어 옥톡시놀 10, 옥톡시놀 40을 포함한다. 때로는, 물리적 안정성을 향상시키기 위해 또는 다른 목적을 위해 계면활성제가 포함된다.
치료 요법
일부 구현예에서, 본원에 기재된 약학적 조성물은 치료 용도로 투여된다. 일부 구현예에서, 약학적 조성물은 날마다, 매일, 격일로, 주 5일, 주 1회, 격주로, 월 2주, 월 3주, 월 1회, 월 2회, 월 3회, 또는 그 이상 투여된다. 약학적 조성물은 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 18개월, 2년, 3년, 또는 그 이상 동안 투여된다.
환자의 상태가 호전되는 경우에, 의사의 재량에 따라 조성물의 투여는 연속적으로 제공되며, 대안적으로, 투여되는 조성물의 용량이 특정 기간(즉, "휴약기") 동안 일시적으로 감소되거나 일시적으로 중단된다. 일부 경우에, 휴약기의 기간은 단지 예로서 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 10일, 12일, 15일, 20일, 28일, 35일, 50일, 70일, 100일, 120일, 150일, 180일, 200일, 250일, 280일, 300일, 320일, 350일, 또는 365일을 포함하여, 2일에서 1년 사이로 다양하다. 휴약기 동안 용량 감소는 단지 예로서 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%를 포함하여, 10%~100%이다.
환자의 상태가 호전되면, 필요에 따라 유지 용량이 투여된다. 이후, 증상에 따라 투여량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두가, 호전된 질환, 장애, 또는 병태가 유지되는 수준으로 감소될 수 있다.
일부 구현예에서, 이러한 양에 상응하는 소정 제제의 양은 특정 화합물, 질환의 중증도, 치료가 필요한 대상체 또는 숙주의 독자성(예를 들어, 체중)과 같은 인자에 따라 다르지만, 그럼에도 불구하고, 예를 들어 투여되는 특정 제제, 투여 경로, 및 치료받는 대상체 또는 숙주를 비롯한 사례 주변의 특정 상황에 따라 당업계에 알려진 방식으로 통상적으로 결정된다. 일부 경우에, 원하는 용량은 단일 용량으로, 또는 동시에(또는 단기간에 걸쳐) 또는 적절한 간격으로 투여되는 분할 용량으로, 예를 들어 매일 2회, 3회, 4회 이상의 하위용량으로 편리하게 제시된다.
개별 치료 요법과 관련된 변수의 수가 많고 이러한 권장 값에서 상당한 편차가 드물지 않기 때문에, 상기 범위는 제안적일 뿐이다. 이러한 투여량은 사용된 화합물의 활성, 치료할 질환 또는 병태, 투여 방식, 개별 대상체의 요건, 치료되는 질환 또는 병태의 중증도, 및 의사의 판단을 비롯한 여러 변수에 따라 달라진다.
일부 구현예에서, 이러한 치료 요법의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물의 표준 제약 절차에 의해 결정된다(LD50(집단의 50%에 치사인 용량) 및 ED50(집단의 50%에 치료 효과적인 용량)의 결정을 포함하나, 이에 한정되지 않음) 독성과 치료 효과 간의 용량비는 치료 지수이며, LD50과 ED50 간의 비로 표시된다. 높은 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻은 데이터는 인간에게 사용하기 위한 투여량의 범위를 정하는 데 사용된다. 이러한 화합물의 투여량은 바람직하게는 최소 독성으로 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용된 투여 형태 및 사용된 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 다양하다.
키트/제조 물품
특정 구현예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 키트 및 제조 물품이 본원에 개시된다. 이러한 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 캐리어, 패키지, 또는 용기를 포함하고, 각각의 용기는 본원에 기재된 방법에 사용될 개별 요소들 중 하나를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 일 구현예에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성된다.
본원에 제공된 제조 물품은 패키징 재료를 포함한다. 약학적 패키징 재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 백, 용기, 병, 및 선택된 제형 및 의도된 투여 및 치료 방식에 적합한 임의의 패키징 재료를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
예를 들어, 용기(들)는 본원에 개시된 하나 이상의 IL-10 폴리펩티드 또는 접합체, 및 필요에 따라 IL-10 폴리펩티드 또는 접합체의 전달을 용이하게 하기 위한 본원에 기재된 하나 이상의 약학적 부형제를 포함한다. 이러한 키트는 또한 필요에 따라, 본원에 기재된 방법에서의 사용과 관련된 식별 표시 또는 라벨 또는 설명서를 포함한다.
일반적으로 키트는 내용물을 열거한 라벨 및/또는 사용 설명서, 및 사용 설명서가 있는 패키지 삽입물을 포함한다. 일반적으로 설명서 세트도 포함될 것이다.
일 구현예에서, 라벨은 용기 상에 있거나 용기와 결합되어 있다. 일 구현예에서, 라벨을 구성하는 글자, 숫자, 또는 다른 문자가 용기 자체에 부착, 성형, 또는 에칭된 경우 라벨은 용기 상에 있고, 라벨이 예를 들어 패키지 삽입물로서, 용기를 또한 수용하는 리셉터클 또는 캐리어 내에 존재하는 경우 라벨은 용기와 결합되어 있다. 일 구현예에서, 라벨은 내용물이 특정 치료 용도로 사용될 것임을 나타내기 위해 사용된다. 라벨은 또한, 예컨대 본원에 기재된 방법에서 내용물의 사용 지침을 나타낸다.
특정 구현예에서, 약학적 조성물은 본원에 제공된 화합물을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 포함하는 팩 또는 디스펜서 장치에 제공된다. 팩은 예를 들어 금속 또는 플라스틱 호일, 예컨대 블리스터 팩을 포함한다. 일 구현예에서, 팩 또는 디스펜서 장치에는 투여 설명서가 함께 제공된다. 일 구현예에서, 팩 또는 디스펜서에는 또한 의약품의 제조, 사용, 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 정한 형태로 용기와 관련된 안내문이 함께 제공되며, 이 안내문은 인체 또는 수의학적 투여용 약물 형태에 대한 기관의 승인을 반영한다. 이러한 안내문은, 예를 들어 미국 식품의약국에서 의약품에 대해 승인한 표지, 또는 승인된 제품 삽입물이다. 일 구현예에서, 적합한 약학적 담체에 제형화된 본원에 제공된 화합물을 함유하는 조성물이 또한 제조되고, 적절한 용기에 배치되고, 표시된 병태의 치료에 대해 표지된다.
특정 용어
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 청구된 요지가 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상세한 설명은 단지 예시적이고 설명적인 것이며 청구된 어떠한 요지도 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 본 출원에서, 단수형의 사용은 특별히 달리 언급하지 않는 한, 복수형을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 복수 대상을 포함한다. 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급하지 않는 한, "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는" 및 "포함한다"와 "포함된"과 같은 다른 형태의 사용은 제한하는 것이 아니다.
본 발명의 다양한 특징이 단일 구현예의 맥락에서 기술될 수 있지만, 이러한 특징은 개별적으로 또는 임의의 적합한 조합으로 제공될 수도 있다. 반대로, 명확성을 위해 별개의 구현예의 맥락에서 본 발명이 본원에 기술될 수 있지만, 본 발명은 단일 구현예로 구현될 수도 있다.
명세서에서 "일부 구현예", "일 구현예", "하나의 구현예", 또는 "다른 구현예"에 대한 언급은 구현예와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조, 또는 특성이 본 발명의, 반드시 모든 구현예에 포함되지는 않지만, 적어도 일부 구현예에 포함된다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 범위 및 양은 "대략적인" 특정 값 또는 범위로 표현될 수 있다. 약은 정확한 양도 포함한다. 따라서, "약 5 μL"는 "약 5 μL" 뿐만 아니라 "5 μL"를 의미한다. 일반적으로, 용어 "약"은 예를 들어 15%, 10%, 또는 5% 이내와 같은 실험 오차 내에 있을 것으로 예상되는 양을 포함한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 구성 목적만으로 사용된 것으로, 기술된 요지를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본원에 사용된 용어 "개체(들)", "대상체(들)", 및 "환자(들)"는 임의의 포유류를 의미한다. 일부 구현예에서, 포유류는 인간이다. 일부 구현예에서, 포유류는 비인간이다. 어떠한 용어도 의료 종사자(예를 들어, 의사, 공인 간호사, 실무 간호사, 의사 보조원, 잡역 또는 호스피스 종사자)의 감독을 특징으로 하는 상황을 요하거나 그러한 상황으로 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 수용체 결합과 관련하여 용어 "유의미한" 및 "유의미하게"는 표적 수용체에 대한 IL-10 폴리펩티드의 결합에 영향을 미치기에 충분한 변화를 의미한다. 일부 경우에, 상기 용어는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 그 이상의 변화를 의미한다. 일부 경우에, 상기 용어는 적어도 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 50배, 100배, 500배, 1000배, 또는 그 이상의 변화를 의미한다.
일부 경우에, 이량체화와 관련하여 용어 "실질적으로"는 IL-10 이량체의 형성을 방지하기에 충분한 변화를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "종양 침윤 면역세포(들)"는 (예를 들어, 종양 미세환경에서) 종양세포를 포함하는 영역에 침윤된 면역세포를 의미한다. 일부 경우에, 종양 침윤 면역세포는 종양세포 파괴, 종양세포 증식의 감소, 종양 부담의 감소, 또는 이들의 조합과 관련된다. 일부 경우에, 종양 침윤 면역세포는 종양 침윤 림프구(TIL)를 포함한다. 일부 경우에, 종양 침윤 면역세포는 T세포, B세포, 자연살해 세포, 대식세포, 호중구, 수지상 세포, 비만세포, 호산구, 또는 호염기구를 포함한다. 일부 경우에, 종양 침윤 면역세포는 CD4+ 또는 CD8+ T세포를 포함한다.
실시예
이들 실시예는 예시 목적으로만 제공되고, 본원에 제공된 청구범위를 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
PEG화 IL-10과 인간 IL-10 수용체의 생화학적 상호작용
인간 IL-10 수용체와의 PEG화 IL-10 화합물 상호작용의 속도론적 및 평형 해리 상수는 Biosensor Tools LLC에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용하여 측정된다. 이 연구를 위해, 인간 IgG1 Fc-융합 IL-10R 세포외 도메인을 단백질 A-코팅 CM4 바이오센서 칩의 표면에 포획한다. Biacore 2000 또는 유사한 SPR 기기를 사용하여 2 μM의 천연 IL-10 또는 IL-10 뮤테인에서 시작하는 2배 희석 시리즈로 표면을 이중 조사한다. 안정기에 도달할 때까지 결합을 측정할 수 있도록 60초 이상 동안 시험 샘플을 주입한 후, 30초 이상 동안 완충액만 주입하여 해리를 측정한다. 응답 단위(RU, Y축)를 시간(초, X축)에 대해 플롯팅한다.
1차 인간 백혈구 감소 시스템(LRS)-유래 PBMC 샘플에서의 IL-10 뮤테인의 생체외 면역 반응 프로파일링
IL-10 뮤테인의 차등적 수용체 특이성이 1차 면역세포 하위집단의 활성화에 어떻게 영향을 미치는지 확인하기 위해, 인간 LRS-유래 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플에서의 림프구 활성화의 농도-반응 프로파일링을 다색 유세포분석을 사용하여 수행한다. 이 연구는 PrimityBio LLC(캘리포니아주 프리몬트)에서 수행된다. 30 μg/mL의 상부 농도로 시작하는 5배 희석 시리즈에서 천연 IL-10 또는 IL-10 뮤테인으로 새로운 LRS-유래 샘플을 처리한다. 45분의 인큐베이션 후, 샘플을 고정하고 항체로 염색하여 전사 인자 STAT3의 인산화 형태(pSTAT3), IL-10 수용체 신호전달 복합체의 상류 결합 및 활성화 마커, 및 표면 마커 패널을 검출하여(표 1) 특정 T세포 및 자연살해(NK) 세포 하위집단에서 pSTAT3 형성을 추적한다.
Figure pct00048
실시예 2
Figure pct00049
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 제시되고 설명되었지만, 이러한 구현예가 단지 예로서 제공된다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명으로부터 벗어나지 않으면서 여러 변형, 변경, 및 대체가 당업자에 의해 이루어질 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안예가 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음의 청구범위는 본 발명의 범위를 정의하고자 하는 것으로, 이러한 청구범위 내의 방법과 구조 및 그 균등물은 청구범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> SYNTHORX, INC. <120> INTERLEUKIN 10 CONJUGATES AND USES THEREOF <130> 46085-727.601 <140> <141> <150> 62/911,036 <151> 2019-10-04 <150> 62/757,690 <151> 2018-11-08 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 160 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His Phe Pro 1 5 10 15 Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe Ser Arg 20 25 30 Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu Leu Leu 35 40 45 Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys Gln Ala 50 55 60 Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu Gly Glu 85 90 95 Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg Phe Leu 100 105 110 Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn Ala Phe 115 120 125 Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu Phe Asp 130 135 140 Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile Arg Asn 145 150 155 160 <210> 2 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val 1 5 10 15 Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His 20 25 30 Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe 35 40 45 Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu 50 55 60 Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys 65 70 75 80 Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro 85 90 95 Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu 100 105 110 Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg 115 120 125 Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu 145 150 155 160 Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile 165 170 175 Arg Asn <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Any amino acid except proline <400> 4 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 5 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 5 Phe Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro 1 5 10 15 Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln 20 25 30

Claims (20)

  1. 적어도 하나의 접합 모이어티에 결합된 적어도 하나의 비천연 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함하되, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 33 내지 158과 99.0% 동일한, 변형된 인터류킨 10(IL-10) 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 1 내지 160과 적어도 95.0% 동일한, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 1 내지 160과 적어도 97.0% 동일한, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 서열번호 1의 아미노산 1 내지 160과 적어도 98.0% 동일한, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열은 13개의 리신 아미노산 잔기를 포함하는, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  6. 제1항에 있어서, 상기 비천연 아미노산은 서열번호 1 내의 E67, Q70, E74, E75, Q79, N82, K88, K125, N126, N129, K130, 또는 Q132로부터 선택되는 아미노산 위치에 위치하는, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  7. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 비천연 아미노산은 N6-((2-아지도에톡시)-카보닐)-L-리신(AzK)을 포함하는, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  8. 제6항에 있어서, 상기 적어도 하나의 접합 모이어티는 수용성 중합체, 지질, 단백질, 또는 펩티드를 포함하는, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 포함하는, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단리되고 정제된, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학적 제형으로 제형화된, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, 상기 약학적 제형은 전신 전달용으로 제형화된, 변형된 IL-10 폴리펩티드.
  13. 제1항의 변형된 IL-10 폴리펩티드 2개를 포함하는 변형된 IL-10 동종이량체.
  14. IL-10 수용체(IL-10R)에 결합된 제12항의 변형된 동종이량체의 복합체를 포함하는 조성물.
  15. 증식성 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 제1항 또는 제11항의 변형된 IL-10 폴리펩티드의 치료 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 증식성 질환 또는 병태는 암인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 암은 고형 종양 암인, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 고형 종양 암은 방광암, 골암, 뇌암, 유방암, 대장암, 식도암, 안암, 두경부암, 신장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 또는 전립선암인, 방법.
  19. 제1항의 변형된 IL-10 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
  20. 제19항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20200181220A1 (en) 2017-08-03 2020-06-11 Synthorx, Inc. Cytokine conjugates for the treatment of proliferative and infectious diseases
CN112004547A (zh) 2018-02-26 2020-11-27 新索思股份有限公司 Il-15缀合物及其用途
CN114949240A (zh) 2019-02-06 2022-08-30 新索思股份有限公司 Il-2缀合物及其使用方法
CH716227B1 (it) * 2020-04-16 2020-11-30 Contrad Swiss Sa Composizione in gel per applicazione topica per la riduzione dell'infiammazione locale.
WO2022125712A1 (en) * 2020-12-09 2022-06-16 Asher Biotherapeutics, Inc. Fusions of mutant interleukin-10 polypeptides with antigen binding molecules for modulating immune cell function
CN112618699A (zh) * 2020-12-31 2021-04-09 深圳先进技术研究院 一种能够提供治疗有效量的白介素10的试剂及其抗肿瘤应用
KR20240024235A (ko) * 2021-07-29 2024-02-23 노보코덱스 바이오파마슈티컬즈 컴퍼니 리미티드 비천연 아미노산, 및 이의 용도, 이를 함유하는 재조합 단백질, 및 재조합 단백질 컨주게이트

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004044006A1 (en) * 2002-11-14 2004-05-27 Maxygen, Inc. Conjugates of interleukin-10 and polymers
WO2004089421A2 (en) * 2003-03-31 2004-10-21 Xencor, Inc Methods for rational pegylation of proteins
WO2013130913A1 (en) * 2012-02-29 2013-09-06 Ambrx, Inc. Interleukin-10 polypeptide conjugates and their uses
CA2914837A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 Armo Biosciences, Inc. Method for assessing protein identity and stability
AU2016312510A1 (en) * 2015-08-25 2018-03-08 Armo Biosciences, Inc. Methods of using Interleukin-10 for treating diseases and disorders
CN113366015A (zh) * 2018-10-19 2021-09-07 Ambrx公司 白细胞介素-10多肽缀合物、其二聚体及其用途

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