KR20210089265A - 암 치료 방법 - Google Patents

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prostate cancer
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vasopressin
cancer
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로렌스 에이치. 클로츠
바선다라 벤케이트스와랜
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서니브룩 리서치 인스티튜트
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Abstract

본 발명은 치료적 유효량의 바소프레신 유사체를, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 전립선암 치료 방법에 관한 것이다.

Description

암 치료 방법{METHOD FOR TREATING CANCER}
관련 출원
본 출원은 2015년 3월 30일에 출원된 US 62/139,976에 대해 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 원용에 의해 본 명세서에 포함되어 있다.
기술분야
본 발명은 바소프레신 유사체를 사용한 암 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 바소프레신 유사체를 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암 치료 방법에 관한 것이다.
전립선암은 서방 국가에서 암-관련 사망의 두번째 주된 원인이다.1 전립선암으로 사망하는 환자의 대부분은 전이성 거세(castrate) 저항성 질병을 가진다(CRPC).2 CRPC의 치료를 위한 치료제는 존재하지 않는다.
도세탁셀(docetaxel)은 CRPC의 관리를 위해 선택된 제1 약물이다.3,4 도세탁셀-기반 병용 화학치료법이 CRPC 환자의 생존력을 상당히 개선하긴 했어도, 지속력 있는 반응(durable response)은 흔하지 않다.4-6 더욱이, 도세탁셀은 부작용, 예컨대 등급 3 또는 등급 4의 호중구 감소증(neutropenia), 피로, 탈모증 및 메스꺼움을 유발한다. 고용량 도세탁셀은 상당한 독성을 유도한다.4,5,7
데스모프레신(desmopressin)은 항이뇨 호르몬의 합성 유도체이다. 데스모프레신은 폰 빌레브란트 질병(von Willbrand disease), A형 혈우병 및 다른 출혈 장애를 가진 환자에서 안전하고 효과적인 지혈제이다.8-10 데스모프레신은 응고 인자 VIII, 폰 빌레브란트 인자(VWF; von Willbrand factor) 및 조직 플라스미노겐 활성자(t-PA)의 혈장 수준의 증가를 유도한다.9 최근의 보고는, 데스모프레신이 생체내 모델에서 종양 전이를 저해한다고 제시하고 있다.11-13 Alonso 등은, 데스모프레신이 생체내 모델에서 혈액-매개(blood-borne) 유방암세포에 의한 폐 집락화(lung colonization)를 저해한다고 보고하였다.11 수술 전에 주사된 데스모프레신은 유선 종양(mammary tumor) 모델에서 림프절 및 폐 전이를 감소시켰다.12 데스모프레신은 화학치료법 동안 잔여 유선 종양의 공격성을 약화시킨다.13
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본 발명은 바소프레신 유사체, 예컨대 데스모프레신을 사용한 암 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 방법은 전립선암 치료 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 데스모프레신 또는 이의 바소프레신 유사체를, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암 치료 방법에 관한 것이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 추가로, 약제학적 조성물 탁산(taxane) 또는 이의 기능성 유도체를, 이를 필요로 하는 환자에게 공동-투여하는 단계를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 바소프레신 유사체, 예컨대 데스모프레신을, 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 전이성 거세-저항성 전립선암의 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 또한, 전립선암의 치료를 위한, 치료적 유효량의 바소프레신 유사체, 예컨대 데스모프레신의 용도를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 발명은 전립선암의 치료를 위한, 치료적 유효량의 (i) 데스모프레신 또는 이의 바소프레신 유사체; 및 (ii) 탁산 또는 이의 기능성 유도체의 용도를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 또한, 전이성 거세-저항성 전립선암의 치료를 위한, 치료적 유효량의 바소프레신 유사체, 예컨대 데스모프레신의 용도를 포함한다.
본 발명은 또한, (i) 치료적 유효량의 바소프레신 유사체, 예컨대 데스모프레신, 및 (ii) 치료적 유효량의 탁산 또는 이의 기능성 유도체, 및 키트의 사용 설명서를 포함하는, 전립선암 치료용 키트를 포함한다.
본 출원의 다른 특징 및 이점들은 하기 상세한 설명으로부터 명확해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 본 출원의 바람직한 실시형태를 가리키면서, 본 출원의 사상 및 범위 내에서 다양한 변화 및 변형들이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명확해질 것이기 때문에, 단지 예시로서 제공될 뿐임을 이해해야 한다.
본 발명은 이제, 하기 도면을 참조로 하여 보다 상세히 기재될 것이며, 여기서,
도 1A는 PC3 세포에 미치는 데스모프레신의 효과를 보여주는 막대 그래프이며; 도 1B는 PC3 세포에 미치는 도세탁셀의 효과를 보여주는 막대 그래프이고; 도 1C는 PC3 세포에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 보여주는 막대 그래프이며;
도 2A는 세포 이동에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 보여주는 현미경 사진이며; 도 2B는 세포 침범에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 보여주는 현미경 사진이고; 도 2C는 세포 이동에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 보여주는 막대 그래프이며;
도 3A는 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 항-침범 효과를 보여주는 현미경 사진이고; 도 3B는 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 항-침범 효과를 보여주는 막대 그래프이며;
도 4A는 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 세포 증식 효과에 대한 웨스턴 블롯 분석을 보여주며; 도 4B는 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 세포 세포자멸사 효과에 대한 웨스턴 블롯 분석을 보여주며; 도 4C는 Bax/Bcl-2의 비율에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 보여주는 막대 그래프이고; 도 4D는 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 세포 주기 효과를 보여주는 막대 그래프이며;
도 5A 내지 도 5D는 프로(pro)-uPA, 활성 uPA, MMP-2, MMP-9 및 uPAR의 발현에 미치는 데스모프레신의 효과를 보여주는 막대 그래프이며;
도 6A 내지 도 6D는 프로-uPA, 활성 uPA, MMP-2, MMP-9 및 uPAR의 발현에 미치는 데스모프레신의 효과를 시간-의존적인 방식으로 보여주는 막대 그래프이며;
도 7은 일 실시형태에서, uPA-MMP 경로를 통한 종양 세포 이동 및 침범 상에 미치는 데스모프레신의 효과를 보여주는 반응 도식이며;
도 8A 내지 도 8D는 프로-uPA, 활성 uPA, MMP-2, MMP-9 및 uPAR의 발현에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 보여주는 막대 그래프이며;
도 9는 종양 부피에 미치는 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 보여주고, 또한 치료 스케쥴을 보여주는 막대 그래프이며;
도 10은 DU145 세포에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀(DTX) 또는 데스모프레신(Desmo)의 효과를 보여주는 막대 그래프이며;
도 11은 상처 치유 검정법을 사용하여 평가된, DU145 세포에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀(DTX) 또는 데스모프레신(Desmo)의 효과를 보여주는 막대 그래프이며;
도 12A 내지 도 12D는 상처 치유 검정법을 사용하여 평가된, DU145 세포에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀(DTX) 또는 데스모프레신(Desmo)의 효과를 보여주는 현미경 사진이며;
도 13은 전립선암 이종이식편 모델에서 종양 부피에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 도시한 그래프이며;
도 14는 전립선암 이종이식편 모델에서 동물의 체중에 미치는, 단독 또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 도시한 그래프이고;
도 15A 내지 도 15D는 전립선암 이종이식편 모델에서 종양 크기에 미치는, 단독 및/또는 병용된 도세탁셀 및 데스모프레신의 효과를 보여주는 현미경 사진이다.
(I) 정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바소프레신 유사체"는 바소프레신과 유사한 기능을 갖지만 본질적으로 유사한 구조는 갖지 않는 화합물 또는 유도체를 지칭하고, 전구약물을 포함하여 항-증식 활성을 가진 모든 화합물 또는 유도체들을 포함한다. 바소프레신 유사체로는, 합성 아르기닌 바소프레신, 라이신 바소프레신, 테를리프레신(terlipressin), 펠리프레신(felypressin) 또는 오르니프레신(ornipressin) 등이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "데스모프레신" 또는 "DDAVP®", 바소프레신 유사체는 1-데스아미노-8-D-아르기닌 바소프레신을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "탁산"은 일반적으로, 천연 공급원, 예컨대 탁수스(Taxus) 속 식물(주목(Yew tree))로부터 또는 세포 배양물로부터 생성되고 단리된 디테르펜(diterpene) 부류를 지칭한다. 이 용어는 또한, 인공적으로 합성되었던 탁산을 포함한다. 예를 들어, 이러한 용어는 도세탁셀 및 파클리탁셀, 및 이들의 유도체를 포함한다. 본 발명은 또한, 전구약물을 포함하여 항-증식 활성을 또한 가진 탁산의 "기능성 유도체"를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 대상, 예를 들어, 인간의 치료와 융화성이라는 것을 의미한다.
용어 "약제학적으로 허용 가능한 염"은 예를 들어, 본 발명의 화합물의 요망되는 생물학적 활성을 보유하지만 이에 요망되지 않는 독성학적 효과를 부여하지 않는 염을 지칭하고; 산 부가염 또는 염기 부가염을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 구(phrase) "거세 저항성 전립선암"(호르몬-불응성 전립선암, 안드로겐-독립적 전립선암 또는 내분비 저항성 전립선암으로도 알려져 있음)은 호르몬 치료법에 저항성인 전립선암을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전이성"은 하나의 기관 또는 부분으로부터, 이와 직접적으로 연결되지 않은 또 다른 기관 또는 부분으로 암세포의 이송으로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, "대상"는 포유류를 포함하는 동물계의 모든 구성원들을 지칭하고, 적합하게는 인간을 지칭한다. 동물계의 구성원으로는 제한 없이, 포유류(예컨대 인간, 영장류, 돼지, 양, 소, 말과 동물(equine), 말(horse), 낙타, 개과 동물(canine), 개, 고양이과 동물(feline), 고양이, 호랑이, 레오파드, 애완동물, 가축, 토끼, 마우스, 래트, 기니피그 또는 다른 설치류, 바다표범, 고래 등)가 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 대상는 본 발명의 치료가 필요하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전구약물"은 예를 들어, 내인성 효소 또는 다른 화학물질 및/또는 조건의 작용에 의해 신체 또는 이의 세포 내에서 활성 형태(즉, 약물)로 전환되는 불활성 형태로 제조된 성분을 지칭한다. 데스모프레신의 전구약물 유도체, 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물은 당업자에게 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료적 유효량"은 요망되는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량에서 기간 동안 효과적인 양을 의미한다. 유효량은 대상의 질병 상태, 연령, 성별 및/또는 체중과 같은 인자들에 따라 다양할 수 있다. 이러한 양에 상응할 주어진 화합물 또는 조성물의 양은 다양한 인자들, 예컨대 주어진 약물 또는 화합물, 약제학적 제형, 투여 경로, 치료를 받는 대상의 아이덴터티(identity) 등에 따라 다양할 것이지만, 그렇다고는 해도 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여되는" 또는 "투여하는"은 치료적 유효 용량의 본 발명의 화합물 또는 조성물을 대상에게 투여하는 것을 의미한다.
본 발명의 범위를 이해하는 데 있어서, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "포함하는" 및 이의 유도된 표현은, 언급된 특징, 원소, 구성성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 명시하는 종점이 개방된 용어인 것으로 의도되지만, 언급되지 않은 다른 특징, 원소, 구성성분, 그룹, 정수 및/또는 단계의 존재를 배제하지 않는다. 상기 내용은 또한, 용어 "수반하는", "갖는" 및 이들의 유도된 표현과 같이 유사한 의미를 가진 단어들에 적용된다. 마지막으로, 본원에 사용된 바와 같이 정도(degree)의 용어, 예컨대 "실질적으로", "약" 및 "대략"은, 종점 결과가 상당히 변하지 않도록 변형된 용어의 편차의 합리적인 양을 의미한다. 이들 정도의 용어는, 이러한 편차가 이것이 변형하는 단어의 의미를 무효화할 것이라면, 변형된 용어의 적어도 ±5%의 편차를 포함하는 것으로 간주되어야 한다.
(II) 암 치료 방법
본 발명은 암 치료 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 치료적 유효량의 바소프레신 유사체를, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암 치료에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 바소프레신 유사체를, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 호르몬-의존적 암, 예컨대 폐암, 자궁암, 신장암, 난소암, 고환암, 유방암 또는 결장직장암의 치료 방법을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 바소프레신 유사체를, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 전립선암 치료 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 데스모프레신, 합성 아르기닌 바소프레신, 라이신 바소프레신, 테를리프레신, 펠리프레신 또는 오르니프레신이다. 추가의 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 데스모프레신이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 또한, 전립선암 치료를 위한, 치료적 유효량의 바소프레신 유사체의 용도를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 또한, 전립선암 치료용 약제의 제조를 위한, 치료적 유효량의 바소프레신 유사체의 용도를 포함한다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 데스모프레신이다. 다른 실시형태에서, 본 발명은 호르몬-의존적 암, 예컨대 폐암, 자궁암, 신장암, 난소암, 고환암, 유방암 또는 결장직장암의 치료를 위한, 치료적 유효량의 바소프레신 유사체의 용도를 포함한다.
일 실시형태에서, 전립선암은 전이성 전립선암이다. 또 다른 실시형태에서, 전립선암은 거세-저항성 전립선암이다. 추가의 실시형태에서, 암은 전이성 거세-저항성 전립선암이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 데스모프레신 또는 이의 유사체, 예를 들어 데스모프레신의 전구약물이 대상에게 투여된다. 데스모프레신의 전구약물은 지방족 카르복실산 에스테르 및 티로신 페놀기의 카르보네이트 에스테르를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 데스모프레신은 대상에게 투여된다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 방법은 탁산을 공동-투여하는 단계를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "공동-투여하다"는, 바소프레신 유사체, 예컨대 데스모프레신, 및 탁산(또는 기능성 유도체)을 순차적인 방식으로 개별 투여하는 것뿐만 아니라 이들 제제를 예컨대 단일 혼합물/조성물에서 또는 개별적으로 주어지지만 그렇다 해도 대상에게 실질적으로 동시에 투여되는 용량에서 실질적으로 동시적인 방식으로 공동-투여하는 것을 포함하고자 한다.
일 실시형태에서, 탁산은 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀(larotaxel), 카바지탁셀(cabazitaxel), 바카틴(baccatin), 세팔로만닌(cephalomannine), 브레비폴리올(brevifoliol), BMS-275183, 아브락산(abraxane), 탁소프렉신(taxoprexin), 자이토탁스(xytotax) 또는 이들의 기능성 유도체이다. 또 다른 실시형태에서, 탁산은 도세탁셀, 파클리탁셀, 카바지탁셀 또는 이들의 기능성 유도체이다. 추가의 실시형태에서, 탁산은 도세탁셀이다.
본 발명의 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 예를 들어 세포 주기 억제를 유도함으로써, 암세포의 증식을 감소시키거나 중단시키기에 효과적인 용량으로 투여된다. 일 실시형태에서, 암세포는 전립선암 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 데스모프레신이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 암성 종양 성장을 감소시키거나 중단시키고 종양 부피를 감소시키기에 효과적인 용량으로 투여된다. 일 실시형태에서, 암성 종양 성장은 암성 전립선 종양이다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 데스모프레신이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 대상의 신체의 다른 조직 및 기관으로의 암세포의 전이를 감소시키거나 예방하기에 효과적인 용량으로 투여된다. 일 실시형태에서, 암세포는 전립선암 세포이다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 데스모프레신이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 탁산 또는 이의 기능성 유도체와 함께, 탁산의 항-증식 효능을 증강시키는 용량으로 공동-투여된다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 데스모프레신이다. 당업자에게, 탁산은 심각한 부작용, 예컨대 등급 3 또는 등급 4의 호중구 감소증을 유발하는 것으로 잘 알려져 있다. 바소프레신 유사체, 예컨대 이의 데스모프레신의 투여는 암 치료를 위한 탁산의 효능을 손상시키지 않으면서, 보다 낮은 독성 용량의 탁산의 사용을 허용한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 암 치료용 키트를 포함한다. 일 실시형태에서, 암은 전립선암이다.
일 실시형태에서, 본 발명은 (i) 치료적 유효량의 바소프레신 유사체, 및 (ii) 치료적 유효량의 탁산 또는 이의 기능성 유도체, 및 키트의 사용 설명서를 포함하는, 암 치료용 키트를 포함한다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 데스모프레신이다.
일 실시형태에서, 본 키트는 전립선암, 폐암, 자궁암, 신장암, 난소암, 고환암, 유방암 또는 결장직장암의 치료를 위한 것이다. 일 실시형태에서, 암은 전립선암이다. 또 다른 실시형태에서, 전립선암은 전이성 전립선암이다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 키트는 거세-저항성 전립선암의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시형태에서, 이러한 키트는 전이성 거세-저항성 전립선암의 치료를 위한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 키트는 대상에게 투여되는 바소프레신 유사체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 이러한 키트는 대상에게 투여되는 데스모프레신을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 본 키트는 (바소프레신 유사체와 함께) 대상에게 공동-투여되는 탁산을 포함한다. 공동-투여는 바소프레신 유사체(예컨대 데스모프레신) 및 탁산(또는 기능성 유도체)을 순차적인 방식으로 개별 투여하는 것뿐만 아니라 이들 제제를 실질적으로 동시적인 방식으로, 예컨대 단일 혼합물/조성물에서 또는 개별적으로 주어지지만 그렇다 해도 대상에게 실질적으로 동시에 투여되는 용량으로 공동-투여하는 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 키트는 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 카바지탁셀, 바카틴, 세팔로만닌, 브레비폴리올, BMS-275183, 아브락산, 탁소프렉신 또는 자이토탁스, 또는 이들의 기능성 유도체인 탁산을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 탁산은 도세탁셀, 파클리탁셀, 카바지탁셀 또는 이들의 기능성 유도체이다. 추가의 실시형태에서, 탁산은 도세탁셀이다.
일 실시형태에서, 바소프레신 유사체, 예컨대 데스모프레신은 약제학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 데스모프레신 아세테이트로서 제형화된다. 추가의 실시형태에서, 바소프레신 유사체는, 바소프레신 유사체 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에서 제형화된다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 데스모프레신이다.
일 실시형태에서, 바소프레신 유사체, 예를 들어 데스모프레신 아세테이트는 약 4 ㎍/ml 또는 약 15 ㎍/ml의 농도로 존재하는 데스모프레신 아세테이트 수용액으로서 제형화된다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 1.0 ㎍/kg, 선택적으로 0.2 ㎍/kg 내지 약 0.5 ㎍/kg 또는 약 0.4 ㎍/kg의 용량으로 투여된다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 정맥내, 근육내 또는 피하 투여용으로 제형화된다. 일 실시형태에서, 바소프레신 유사체는 즉시 방출(immediate release), IV 주입, 지연 방출 또는 데폿(depot) 투여용으로 제형화된다.
일 실시형태에서, 탁산 또는 이들의 기능성 유도체는 탁산 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제 및/또는 담체를 포함하는 약제학적 조성물용으로 제형화된다.
일 실시형태에서, 탁산은 도세탁셀이다. 추가의 실시형태에서, 도세탁셀은 약 50 mg/ml 내지 약 100 mg/ml, 선택적으로 약 80 mg/ml의 농도로 존재하는 수용액에서 제형화된다. 일 실시형태에서, 도세탁셀은 3주마다 1시간 정맥내 주입으로서 50 mg/m2 내지 약 100 mg/m2, 또는 약 75 mg/m2의 용량으로 투여된다. 선택적으로, 프레드니손(prednisone) 5 mg은 1일 2회 경구로, 도세탁셀과 동시에 투여된다. 일 실시형태에서, 도세탁셀은 정맥내 투여용으로 제형화된다.
주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 이러한 멸균 주사액 또는 분산액의 임기(extemporaneous) 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우, 이러한 형태는 멸균되어야 하고, 용이한 주사기 적용성(syringability)이 존재하는 범위까지 유체성이어야 한다.
일 실시형태에서, 탁산은 4회 주기 동안 3주마다 환자에게 투여되고, 바소프레신 유사체는 탁산의 용량이 투여되기 전 약 30분째에 투여되고, 또한 탁산의 용량이 투여된 후 24시간째에 투여된다.
본 발명이 이의 구체적인 실시형태와 함께 기재되긴 했어도, 많은 대안, 변형 및 변화들이 당업자에게 분명할 것임이 명백하다. 이에, 이러한 모든 대안, 변형 및 변화들은 첨부된 청구항의 사상 및 넓은 범위에 속함을 포함하고자 한다. 또한, 본 출원에서 임의의 원용의 인용 또는 식별(identification)은, 이러한 원용이 본 발명에 선행 기술로서 이용 가능함을 허용하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 발명의 작업은 하기 대표적인 실시예에 의해 예시된다. 당업자에게 명백해지는 바와 같이, 실시예에 관한 많은 상세한 사항들은 본원에 기재된 개시내용을 여전히 실시하면서 변화될 수 있다.
(III) 실시예
본 발명의 작업은 하기 대표적인 실시예에 의해 예시된다. 당업자에게 명백해지는 바와 같이, 실시예에 관한 많은 상세한 사항들은 본원에 기재된 개시내용을 여전히 실시하면서 변화될 수 있다.
실시예 I
재료 및 방법
세포 배양
PC3 인간 전립선 암종 세포를 American Type Culture Collection사(Rockville, MD, USA)로부터 수득하였다. 세포를 10% 태아 소 혈청(FBS; Gibco, NY, USA), 100 IU/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 0.3 mg/ml 1-글루타민이 포함된 DMEM/F12 배지(Invitrogen, ON, Canada)에서 배양하고, 37℃, 공기 중 5% CO2의 보습된 분위기에서 유지시켰다. 세포를 10-cm 조직 배양 플레이트에서 80% 포화도(confluence)까지 성장시켰다.
화학물질
도세탁셀을 Santa Cruz Biotechnology사(CA, USA)로부터 구매하였다. 도세탁셀을 다이메틸 설폭사이드(DMSO; Sigma, St Louis, USA)에서 준비하고, 세포 배양 배지를 이용하여 0.01% DMSO의 최종 농도로 희석시켰다. 데스모프레신은 Ferring Pharmaceutical사(CA, USA)에 의해 본 발명자들에게 친절하게 제공되었다.
세포 증식 검정법
세포 증식을 이전에 기재된 바와 같이 MTS 검정법에 의해 확인하였다.14 세포(5x103/웰)를 96웰 플레이트를 사용하여 평판배양하였다. 24시간 동안 배양한 후, 광범위한 농도의 데스모프레신(100 pM 내지 1 μM) 및/또는 도세탁셀(1 nM 내지 100 nM)을 첨가하고, 배양을 72시간 이하 동안 계속하였다. MTS와 함께 2시간 동안 인큐베이션함으로써 세포 생존력을 평가하고, 결과적인 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기를 사용하여 595 nm에서 측정하였다. 병용 연구에서, 각각의 제제를 다양한 농도로 시험하였다. 실험을 3벌로 3회 반복하였으며, 통계학적 분석을 수행하였다.
상처 치유 검정법
세포 운동성(motility)을 Liang 등에 의해 기재된 프로토콜에 따라 수행되는 상처 치유 검정법을 사용하여 평가하였다.15 세포(2x104/웰)를 6-웰 플레이트에 평판배양하였다. 증식 효과를 배제하기 위해, 90%가 넘는 포화도에서 세포를 1 mg/l의 미토마이신 C(Sigma-Aldrich, St Louis, USA)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 미토마이신 C 처리 후, 손상 라인(injury line)을 200 ㎕ 팁(tip)을 사용하여 만들었으며, 세포 단층(monolayer)을 PBS로 헹구었다. 상기 세포에 데스모프레신 및/또는 도세탁셀을 처리하고, 24시간 동안 이동하도록 놔두었다. 상기 플레이트에 스크래치를 낸 후, 컴퓨터-기반 현미경 이미징 시스템을 사용하여, 200X 배율에서 현미경을 이용하여 상처 치유를 확인하였다. 몇몇 상처난 영역을 세포 이동에 대해 관찰하였다. 실험을 3벌로 3회 반복하였다.
세포 이동 및 침범 검정법
세포 이동을 트랜스웰 인서트 플레이트(transwell insert plate)(BD Biosciences, Bedford MA)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다. 세포를 FBS가 보충된 DMEM/F12에서 혈청 24시간 동안 혈청 결핍(deprivation)시켰다. PC3(5x104) 세포를 8.0-㎛ 트랜스웰 인서트 플레이트에서 필터 상으로 평판배양하고, 혈청-무함유 배지에서 이들 화합물, 데스모프레신(1 nM, 1 μM) 및 5 nM 도세탁셀로 처리하였다. 아래의(lower) 챔버 또한, 10% FBS를 함유하였다. 세포를 24시간 동안 이동하도록 놔두었다. 처리 후, 필터의 상부 표면 상에 잔존하는 세포를 면봉을 사용하여 제거하였다. 이동하여 필터의 하부 표면에 부착된 세포를 실온에서 4% 포름알데하이드에서 30분 동안 고정한 다음, 크리스탈 바이올렛으로 20분 동안 염색하였다. 랜덤 필드(random field)로부터 이동된 세포를 선택하고, 컴퓨터-기반 현미경 이미징 시스템을 사용하여 계수하였다. 침범 검정법을 위해, 세포를 24-웰 마트리겔-코팅된 트랜스웰 플레이트(BD Biosciences, Bedford MA) 상에 평판배양하는 점을 제외하고는, 이동 검정법에 기재된 바와 동일한 절차를 수행하였다. 실험을 2벌로 2회 반복하고, 통계학적 분석을 수행하였다.
유세포분석
세포 주기 프로파일을 분석하기 위해, 세포를 1x106개/10 cm 디쉬의 밀도로 평판배양하였다. 비동시적으로(asynchronously) 성장하는 세포를, 24시간의 종료 시 항산화제를 선행 처리하면서 또는 처리하지 않으면서, 10 mM 브로모데옥시우리딘(BrdU)으로 2시간 동안 감작 표지(pulse labeling)하였다. 그런 다음, 상기 세포를 수집하고, 70% 에탄올로 고정한 다음, 0.1% HCl을 처리하고, 90℃에서 10분 동안 가열하여, 표지된 DNA를 노출시켰다. 세포를 항-BrdU-컨쥬게이트된 FITC(Becton-Dickinson)를 이용하여 염색하고, 프로피듐 요오다이드를 이용하여 대조염색한 다음, 얼음 상에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 시료를 나일론 메쉬를 통해 여과하였다. 세포 주기 분석을 FACS Calibur 유세포분석기 상에서 Cell Quest Pro 소프트 패키지(Becton-Dickinson, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. 실험을 3벌로 3회 반복하고, 통계학적 분석을 하기 언급된 바와 같이 수행하였다.
웨스턴 블롯 분석
데스모프레신 단독치료법 용량 반응 연구(100 pM 내지 1 μM), 데스모프레신 단독치료법 시점 연구(1 μM, 0시간 내지 48시간) 및 병용 연구로부터의 단백질 용해물, 및 웨스턴 블롯 분석에 이용되는 농축된 배지를 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다.14 단백질을 10% 내지 12% SDS-PAGE로 처리하고, 반건조 이송 장치(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 100 V/300 mA에서 PVDF 막 상으로 밤새 전기영동적으로 이송시켰다. 메탄올(100%)에서의 활성화 후, 블롯을, 5% 스킴드 밀크(skimmed milk)를 함유하는 TBST에서 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 상기 막을 Bax, bcl-2, p21(waf1/cip1), p27(kip1), cdk2, cdk4, uPA, uPAR, MMP-2 및 MMP-9에 대한 1차 항체(1:100-200, Santacruz Biotechnology, Santacruz, CA, USA)와 함께 인큐베이션하였다. 각각의 1차 항체와의 인큐베이션 후, 상기 막을 TBST로 5분 동안 3회 세척한 다음, 적절한 2차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하고, TBST로 5분 동안 3회 세척하였다. 단백질 검출을 증강된 화학발광 웨스턴 블로팅 시약(Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 수행하였다.
이종이식편을 사용한 시험관내 연구
마우스를, 토론토 대학교 동물 연구 윤리 위원회(Animal Research Ethics Board)에 의해 승인된 시설에서 캐나다 동물 감독 기관(CCAC; Canadian Council on Animal Care)에 의한 이들의 규제 및 기준에 따라 특정 병원균-무함유 조건 하에 라미나 플로우 캐비넷(laminar flow cabinet)에서 사육하고 유지시켰다. 세포(100 ㎕ 마트리겔 용액(BD Biosciences, CA, USA)과 함께 1x106개 PC3 세포)를 6주령 내지 8주령의 수컷 누드 마우스(Harlan Sprague Dawley, Inc.)에 피하(sc) 접종하였다. 14일 후, 발달중인(developing) 종양을 측정하고, 마우스를 상이한 치료군으로 무작위 배정하였다. 종양 부피를, 1주에 2회 칼리퍼(caliper)를 이용하여 종양 길이(L) 및 폭(W)을 측정하여 확인하고, 식: V=(L x W2)(Π/6)에 따라 계산하였다. 주어진 마우스를 포함시키는 데에는 100 mm3 범위의 종양 부피가 필요하였다. 이종이식편 모델을 사용하여, 종양 성장을 대조군 마우스 및 각각의 치료 마우스에 대해 확인하였다. 마우스를 4개의 그룹으로 무작위로 나누었다; 대조군(n=15), 데스모프레신 단독(n=15), 도세탁셀 단독(n=10), 및 도세탁셀과 병용된 데스모프레신(n=10). 대조군 동물에게는 식염수 비히클만 제공하였다. Ferring Pharmaceuticals사(Ferring Inc, CA, USA)의 데스모프레신을 2개의 용량으로 0시간 및 24시간째에 투여하였다. 마우스에게 데스모프레신을 식염수에서 2 ㎍/ml/체중(50 ng/0.3 ml 식염수 용량)의 최종 용량으로 정맥내로 제공하였다. 마우스에게 도세탁셀을 5 mg/kg의 용량으로 정맥내로 3주 사이클로서 투여하였다. 데스모프레신을 2개의 용량으로, 도세탁셀의 투여 전 30분째 및 도세탁셀의 투여 후 24시간째에 투여하였다. 도세탁셀, 또는 도세탁셀과 병용된 데스모프레신을 투여한 동물을 세포 접종 후 35일째에 안락사시켰다. 대조군 마우스 및 데스모프레신 마우스를, 종양 부피가 대략 1500 mm3가 될 때까지 또는 제49일까지, 어느것이 먼저이든지 간에 모니터링하여, 데스모프레신 생체내 연구의 항종양 효과를 평가하였다.
통계학적 분석
모든 실험을 3벌로 수행하였다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차를 나타내었다. 통계학적 분석을 스튜던츠 t 테스트(Student's t test)에 의해 P<0.05의 유의성 수준에서 수행하였다. 생체내 결과의 분석을, 스튜던츠 t 테스트 또는 반복된 측정 원-웨이 ANOVA 기술을 사용하여 수행하였다.
실시예 1 - PC3 세포의 세포 증식에 미치는 도세탁셀 및/또는 데스모프레신의 효과
도세탁셀 및/또는 데스모프레신은 PC3 세포 상에서 세포 증식을 저해한다. MTS 세포 증식 검정법을 수행하여, 도세탁셀 및/또는 데스모프레신이 세포 증식을 억제하는지 조사하였다. 상기 검정법을, 0 nM 내지 100 nM 용량 범위의 도세탁셀로 처리한 세포를 이용하여 72시간째에 수행하였다. 세포 성장을, 비처리된 대조군 세포의 세포 성장에 대한 상대적인 값으로서 표현하였다. 도세탁셀로 72시간 동안 처리한 PC3 세포는 세포 생존력을 용량 의존적인 방식으로 감소시켰다(도 1A). 광범위한 용량의 데스모프레신(1 nM 내지 1 μM)으로 처리한 세포는 72시간까지 대조군과 비교하여 세포 증식을 상당히 감소시켰다(도 1B, p<0.01). 더욱이, 데스모프레신(1 nM, 1 μM) 및 5 nM 도세탁셀의 병용 치료법 또한, 세포 증식에 있어서 상당한 감소를 초래하였다(도 1C, p<0.01).
실시예 2 - PC3 세포의 이동에 미치는 데스모프레신의 용량 의존적인 방식의 차별적인 영향
데스모프레신 및 도세탁셀 처리가 배양물 내 PC3 세포에 대해 항-증식 효과를 초래하였기 때문에, 상처 치유 검정법에 의한, 세포 이동에 미치는 데스모프레신 단독(1 nM, 1 μM)의 효과 및 5 nM 도세탁셀 처리와의 병용 효과를 확인하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 0시간 내지 24시간에 대조군에 의해 이동된 거리의 차이를 측정하고, 처리된 세포의 이동된 거리와 비교하였다. 24시간의 종료 시, 데스모프레신 및 도세탁셀의 병용에서 세포 이동의 상당한 감소가 관찰되었다(도 2A). 세포의 이동 능력을, 이동 챔버 트랜스웰 플레이트를 사용하여 추가로 정량화하였다. 상이한 용량의 데스모프레신(1 nM 및 1 μM) 처리는 세포 이동을 상당히 저해하였다(도 2B 및 도 2C, p<0.01). 더욱이, 데스모프레신(1 nM 및 1 μM) 및 5 nM 도세탁셀을 이용한 각각의 병용 치료는 세포 이동에서 추가의 상당한 감소를 초래하였다(도 2B 및 도 2C, p<0.01).
실시예 3 - PC3 세포에 미치는 데스모프레신의 항-침범 효과
데스모프레신의 항-전이성 능력을 평가하기 위해, 마트리겔 침범 검정법을 수행하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 5 nM 도세탁셀 단독 및 2개의 상이한 용량의 데스모프레신(1 nM 및 1 μM) 처리는 세포 침범의 상당한 저해를 유도하였다. 더욱이, 5 nM 도세탁셀 및 데스모프레신(1 nM 및 1 μM)의 각각의 병용 처리는 세포 침범에서 상당한 감소를 초래하였다(도 3A 및 도 3B, p<0.01).
실시예 4 - 세포 주기에 미치는 도세탁셀과 병용된 데스모프레신의 효과
도세탁셀과 병용된 데스모프레신은 세포 주기 억제를 유도하고, 데스모프레신은 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된 바와 같이 도세탁셀의 세포자멸사 효과를 증강시킨다.
MTS 검정법의 결과를 확인하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 세포 증식을 검사하였다. 도세탁셀은, 미세소관을 억제시켜 결과적으로 유사분열 방추를 방해하고, 이로써 G2/M 기 세포 주기 억제를 초래하고, bcl-2 인산화를 유도하여 궁극적으로 세포자멸사의 초래를 포함하는 주요 조절 분자를 변경시키는 능력을 가진다.16-18 사이클린 A, 사이클린 B, CDK2 및 CDK4의 발현은 데스모프레신 및 도세탁셀로 처리된 세포에서 감소되었다(도 4A). CDK 저해 단백질의 발현 외에도, p21(waf1/cip1) 및 p27(kip1)이 동일한 조건 하에 상승되었다(도 4A). 이러한 결과는, 도세탁셀과 병용된 데스모프레신 치료법이 세포 주기 진행과 연관된 분자를 저해하고, 부수적으로 세포 주기 억제를 유도할 수 있음을 가리킨다. Bax/Bcl-2의 비율은, 도세탁셀과 병용된 1 nM 데스모프레신, 및 도세탁셀과 병용된 1 μM 데스모프레신으로 처리된 세포에서 각각 4배 및 8배 증가된 발현을 보여주었으며, 이들은 모두 대조군과 비교하여 표현되었다(도 4C). 또한, 두 병용 치료법은 모두 총 카스파제 3의 발현을 감소시켰다. 데스모프레신 처리 단독은 bcl-2, PARP 또는 카스파제 3의 발현을 감소시키지 않았으며(도 4B), 이는 데스모프레신이 도세탁셀의 세포자멸사 효과를 증강시킴을 가리킨다.
실시예 5 - 데스모프레신은 PC3에 미치는 처리에 대해 세포 주기 분포를 변경시키지 않는다
데스모프레신 및 DTX 단독 및 병용으로 처리된 세포 상에서 BrdU 표지화를 사용한 유세포분석에 의한 세포 주기 프로파일에서의 변경을 검사하였다. 5 nM 도세탁셀, 또는 1 nM/1 μM 데스모프레신과의 병용에 의한 처리는 G2 기 세포의 비율의 상당한 증가를 보여주었으며, 이는 G2M 세포 주기 억제와 일치한다(도 4D). 더욱이, 각각의 병용 치료는 서브 G1 기에서 세포 집단을 증가시켰으며, 이는 세포자멸사를 가리킨다.
실시예 6 - 전립선암 세포의 이동 및 침범에 미치는 데스모프레신의 효과 및 uPA-MMP 경로가 매개한다
2개의 분자인 MMP 및 uPA는 암세포 침범, 운동성 및 종양 휴면에 관여한다.19 이동 검정법 및 침범 검정법의 결과를 기반으로, 데스모프레신을 단독치료법에서 이의 항-전이성 특성에 대해 검사하였다. 데스모프레신을 이용하여 용량 표준화 및 시점 연구를 수행하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 데스모프레신 단독치료법은 전구체 프로-uPA, 활성 uPA, MMP-2 및 MMP-9의 발현을 변경하였으며, 이들은 모두 용량 의존적인 방식으로 감소되었다(도 5A, 5C 및 5D). 이와는 대조적으로, uPAR의 발현은 변경되지 않았다(도 5B). 1 μM 농도의 데스모프레신을 이용하여 수행된 시점 연구에서, uPA, MMP-2 및 MMP-9의 발현 또한, 시점 의존적인 방식으로 감소되었다(도 6A, 6C 및 6D). 그러나, uPAR 발현은 변경되지 않았다(도 6B). 데스모프레신 단독치료법은 자이모겐(zymogen) 유형 uPA(프로-uPA라고도 함) 발현을 감소시켰으며, 따라서, 세포 표면 상에서 uPA 활성을 약화시켰다. 이들 결과는, 데스모프레신이 uPA-MMP 경로를 통한 종양 세포 이동 및 침범을 저해하는 능력을 갖고 있음을 나타낸다(도 7).
도세탁셀과 병용된 데스모프레신은 종양 세포 이동 및 침범을 저해한 것으로 나타났다. 도 6에 도시된 바와 같이, 5 nM 도세탁셀 및 데스모프레신(1 nM 및 1 μM)의 병용 치료는 대조군과 비교하여 uPA의 발현을 감소시켰다(도 8A, p<0.01). 또한, MMP-2의 발현 또한, 대조군과 비교하여 각각의 병용 치료법으로 처리된 세포에서 상당히 감소되었다(도 8C, p<0.01). 도 8b에 도시된 바와 같이 uPAR의 발현은 변경되지 않았다. MMP-9의 발현은 대조군과 비교하여 각각의 병용 치료법으로 처리된 세포에서 상당히 감소되었다(도 8D, P<0.01). 결과적으로, 도세탁셀과 병용된 데스모프레신은 uPA-MMP 경로에 영향을 미친다.
실시예 7 - 이종이식편 모델에서 PC-3 세포 성장에 미치는 데스모프레신의 효과
종양 성장에 미치는 데스모프레신 단독의 효과를 검사하였다. 제1 단계로서, 데스모프레신 처리를 이용한 종양 성장의 저해를 대조군 동물과 비교하였다. 무흉선 누드 마우스를 사용하여, 세포를 상기 기재된 바와 같이 마트리겔에 접종하였다. 종양 부피를 1주일에 2회 평가하였다. 대조군 동물에서 종양은 신속하게 성장하여, 종양 접종 후 제35일에 부피가 923 mm3인 것으로 측정되었다. 이와는 대조적으로, 데스모프레신으로 처리한 마우스에서 종양 성장은 상당히 더 느린 속도의 종양 발달을 가졌으며, 제35일에 평균 부피가 642 mm3에 달하였다(도 9, 스튜던츠 t-테스트 p<0.01). 대조군과 데스모프레신 치료 사이의 종양 부피는 상당히 상이하였다(ANOVA, p<0.0001). 그런 다음, 데스모프레신이 생체내에서 도세탁셀에 대한 PC3 세포의 민감성을 증강시킬 수 있는지 확인하기 위해, 데스모프레신을 검사하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 병용군에서 종양은 대조군 마우스 및 도세탁셀 치료 단독보다 상당히 더 작았다(ANOVA, p<0.05). 도세탁셀 및/또는 데스모프레신의 정맥내 주사에 의한 치료는 관용성(tolerance)이 양호하였다. 모든 마우스들은 각각의 연구 동안 이들의 체중을 일관적으로 유지시켰다.
고찰
피브린분해 시스템의 구성성분인 유로키나제　플라스미노겐　활성자(uPA) 및 유로키나제　플라스미노겐 활성자　수용체(uPAR)는 신혈관형성(neovascularization)이 발생하도록 기저막 기질(basement matrix)의 표적화된 단백분해를 촉진한다. 종양 조직에서 이들 인자의 과발현은 호르몬 의존적 암을 포함하여 많은 인간 암, 예컨대 위장관암, 폐암, 폐암, 자궁암, 자궁내막암, 방광암, 난소암, 고환암, 유방암, 결장암 또는 전립선암에서 전이성 확산 및 총 생존율에 대한 예후로서 확인되었다. 이들 인자는 암세포 침범 및 전이에 직접 관여하는 것으로 생각된다. uPA는 데스모프레신에 의해 특이적으로 저해된다.
데스모프레신은 시험관내 및 생체내에서 PC3 세포에 대해 항-증식, 항-이동 및 항-침범 효과를 가지는 것으로 발견되었다. 이전의 보고들은, 데스모프레신이 진행성 유선암에 대한 일차적인 수술 시 국소영역 질병(locolegional disease)의 감소에 기여하고11, 전이성 유선 종양 세포와 함께 정맥내로 공동-주사된 경우 실험 폐 집락화를 저해하였다12고 보고하였다. Ripoll 등은, 데스모프레신이 인간 colo-205 및 마우스 CT-26 결장 암종 세포주에 대해 항-증식 효과를 가졌다고 언급하였다20. 이들 연구는 V2 수용체를 발현하는 암세포에 초점을 맞추었다. 데스모프레신은 바소프레신 V2 수용체에 대한 선택적인 효능제이다21. 전형적으로, V2 수용체는 내피 세포 및 신장 집합관에서 발현하여, 항이뇨 효과 및 지혈 효과를 매개한다. 전립선암 세포주는 V2 수용체를 발현하는 것으로 보이지 않는다21-24. 실시예는, V2 수용체가 결여된 PC3 세포 상에서 데스모프레신 항-종양 및 항-전이 효과를 나타내었다.
상기 실시예는, 데스모프레신의 항-전이 활성이 uPA 경로를 통해 매개됨을 보여주었다. 데스모프레신 단독치료법은 uPA 발현의 용량 의존적인 감소를 초래하였다(도 5A). uPA 및 이의 수용체 uPAR은 PC3 세포를 포함하여 대부분의 고형암 및 침범성 암에서 발현된다. uPA 단백질은 세포외 기질의 분해에 관여하여, 침범 및 성장을 촉진하였다25, 26. uPA의 발현은 종양 조직에서 상향조절되므로, 암 치료법을 위한 매력적인 치료 표적이 된다27, 28. uPA는 전립선암을 포함하여 다양한 인간 악성물에서 종양 진행의 촉진자로서 강하게 관여하는 세린 프로테아제 패밀리의 구성원이다. 이는 전구-효소(pro-enzyme)로서 합성되고 분비된다. uPA는 uPAR에 결합하여, 불활성 자이모겐인 플라스미노겐을 활성 세린 프로테아제인 플라스민으로 효율적으로 전환시킨다. 플라스민은, 여러가지 세포외 기질 구성성분을 또한 분해시킬 수 있는 강력한 효소인 MMP를 활성화시킬 수 있다29. 실시예는, 단독치료법 및 도세탁셀과의 병용치료법에서의 데스모프레신이 uPA, MMP-2 및 MMP-9의 발현을 상당히 저해하였음을 나타내었다. 데스모프레신은 uPAR의 발현을 변경시키지 않았다. uPA는 전립선암의 이동 및 침범 동안 MMP-2 및 MMP-9을 활성화시킨다30-32. uPAR에의 uPA의 결합의 주요 역할에 관한 개념은, 종양 세포의 침범 및 전이 능력이 uPA 저해제에 의해 하향조절됨을 나타낸 몇몇 연구들로부터 유래된다. 이러한 결과는, 데스모프레신 단독치료법이 프로-uPA 발현뿐만 아니라 활성 uPA를 감소시켰으며, 따라서 세포 표면 상에서의 uPA 활성을 약화시킴을 가리킨다. 데스모프레신에 의한 uPA의 하향조절은 전립선암 세포의 침범 및 이동을 저해하는 것으로 나타났다. 따라서, 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 데스모프레신은 전립선암에서 uPA 활성을 저해하는 작용을 할 수 있다(도 7).
플라스미노겐 활성자 시스템의 활성화와 관련된 전립선 종양 세포의 성장은, 낮은 밀도로 배양된 종양 세포에서 성장 속도 및 uPA 생성은 더 높은 세포 밀도에서 성장된 세포에서 관찰된 것들보다 더 높다는 언급으로부터 유래된다. 이러한 조정은 종양 세포 증식에 영향을 미칠 수 있다27. 그러나, 세포 증식의 결과는 데스모프레신 단독치료법에서 uPA 발현의 결과와 일치하지 않았다. 많은 사이토카인 및 성장인자들, 예컨대 TGFβ1, IGF-1, FGF, EGF 및 봄베신(bombesin)은 uPA 시스템의 구성성분들의 발현을 유도한다19, 28, 33, 34. 이들 인자는 또한, uPA 발현 및 종양 세포 증식과 연관이 있을 수 있다.
도세탁셀의 용량-제한적 독성을 감소시키고/거나 이의 효능을 증가시키기 위한 약제학적 병용이 매력적이다. 실시예는, 데스모프레신 단독치료법이 세포 증식을 저해하였고(도 1B), 병용 치료법(데스모프레신 및 도세탁셀)이 대조군과 비교하여 시험관내에서 세포 증식 및 생체내에서 종양 성장을 상당히 저해하였음을 언급하였다(도 1C, 도 9). 데스모프레신 단독치료법은 세포 주기 분포, 및 세포자멸사-관련 단백질의 발현 수준을 변경하지 않았다. 그렇긴 하지만, 데스모프레신은 병용된 도세탁셀의 세포 주기 억제 및 세포자멸사 효과를 증강시킨 것으로 관찰되었다.
데스모프레신은 vWF 및 tPA를 포함하여 다수의 인자들의 분비에 영향을 미친다. vWF는 1차 지혈에서 중요한 역할을 하는 다량체성 혈장 당단백질로서, 노출된 내피하층(subendothelium)에 혈소판이 접착되게 한다35. Terraube V등36은, vWF 결핍 돌연변이체 마우스 모델에서 vWF가 종양 세포 전파에 대해 보호 역할을 한다고 보고하였다. 재조합 vWF의 투여에 의한 vWF 혈장 수준의 회복은 폐 전이를 감소시켰다35, 36. 데스모프레신의 정맥내 주사는 vWF의 방출을 유도하며, 약 1시간째에 시간 피크 수준에 도달한다21, 37. vWF는 종양 세포와 혈소판 및 내피하층의 상호작용에 관여할 것으로 생각된다. 다른 한편으로, t-PA의 주요 기능은 혈관내 피브린분해이다. t-PA가 혈관 내피 세포에 의해 합성되고 혈류 내로 분비되기 때문에, t-PA가 피브린에 대해 갖는 높은 친화성이 존재하며, 이는 높은 혈전용해 효능을 반영한다38-40. 또한, tPA는 혈관신생을 음성적으로 조절할 수 있고, tPA의 저해제는 혈관신생을 촉진할 수 있다41-46. 따라서, vWF 및 tPA는 종양 세포 침범 및 전이에 미치는 데스모프레신의 효과에 영향을 미치는 중요한 인자들이다(도 7).
실시예는, 데스모프레신 단독치료법이 PC3 세포 상에서의 uPA-MMP 발현을 DNA 또는 RNA 수준에서가 아니라 단백질 수준에서 조절하였음을 보여주었다. 데스모프레신 단독, 또는 도세탁셀과 병용된 데스모프레신은 종양 부피를 감소시키고, 전립선암 세포의 세포 증식, 침범 및 이동을 저해하는 것으로 나타났다. 데스모프레신은 전립선암에서 항-증식, 항-이동 및 항-침범 효과를 가진다.
실시예 II
이 연구에서, 도세탁셀과 병용된 데스모프레신의 항-종양 효과를 시험관내 및 생체내에서 DU145 세포를 사용하여 조사하였다.
재료 및 방법
세포 배양
거세 저항성 전립선암 세포 DU145를 사용하였다. 세포 배양 절차는 이전에 기재된 절차에 따라 수행하였다48, 49.
화학물질
도세탁셀을 Sigma-Aldrich사로터 구매하였다. 도세탁셀을 다이메틸 설폭사이드(DMSO; Sigma-Aldrich, MO, USA)에서 준비하고, 세포 배양 처리를 위해 세포 배양 배지(0.01% DMSO)를 이용하여 희석시켰다. 데스모프레신을 Ferringⓒ(Octostim 15 ㎍/mL/앰플)사로부터 구매하였다.
세포 증식 검정법
세포 증식을 MTS 검정법에 의해 확인하였다48,49. DU145 세포를 96웰 플레이트에 4000개 세포/웰의 농도로 평판배양하였다. 24시간 동안 부착시킨 후, 다양한 농도의 DTX(1 nM, 10 nM, 100 nM 및 1 μM) 및 데스모프레신(각각 1 nM, 10 nM, 100 nM 및 1 μM)을 사용하여 용량 표준화를 수행하였다. 처리 후, 24시간, 48시간 및 72시간째에 MTS 검정법을 사용하여 세포 증식을 평가하였다. 그 결과를 기반으로, DTX 10 nM 및 100 nM과 데스모프레신 1 μM의 병용 치료에 대한 유사한 시점에서 세포 증식 검정법을 완료하였다. 결과를 2-테일드 스튜던트 t-테스트(two-tailed student t-test)를 사용하여 분석하였으며, p<0.05의 유의성 수준은 통계학적으로 유의한 것으로 간주되었다.
상처 치유 검정법
데스모프레신 단독, 및/또는 도세탁셀과 병용된 데스모프레신의 운동성 저해 잠재성을 이전에 기재된 프로토콜에 따라 상처 치유 검정법에 의해 평가하였다49,50. DU145 세포를 24-웰 플레이트 상에 50,000개 세포/웰의 농도로 평판배양하고, 이들이 90% 내지 100%의 포화도에 도달할 때까지 성장시켰다. 세포를 1 mg/l의 미토마이신 C(Sigmaⓒ)와 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 웰을 가로질러 수직의 스크래치를 만들었으며; 부유 세포를 제거하고, 세포 배지, 또는 치료 용액이 포함된 배지를 첨가하였다. 이미지를 제로 시점 및 치료 후 24시간째에 수득하였다. 200X 배율에서 컴퓨터-기반 현미경 이미징 시스템(Axiovisionⓒ)을 사용하여, 각각의 웰의 상처 치유를 측정하였다. 각각의 실험을 2벌로 수행하고, 3회 반복하였다.
이종이식편 모델을 이용한 생체내 연구
모든 절차를 캐나다 동물 감독 기관(CCAC) 규제 및 지역 동물 연구 윤리 위원회의 절차 및 승인에 따라 수행하였다.
6주령의 수컷 무흉선 누드 마우스(Charles river, QC, Canada)를 사용하여, 생체내에서 DU145 종양 성장에 미치는 병용 치료법의 효과를 평가하였다. 마우스를 병원균-무함유 조건 하에 라미나 플로우 캐비넷에서 사육하고, 유지시켰다. 사육 2주 후, 동물 1마리 당 100 ㎕ 마트리겔 용액(BD Bioscience, CA, USA) 중 1x106개 DU145 세포를 Fridman 등(51)에 의해 기재된 절차에 따라 피하 접종하였다. 접종 후 14일이 지난 후, 체중 및 종양 크기를 측정하고, 마우스를 상이한 치료군으로 무작위 배정하였다. 그룹은 대조군(sham 치료군), 복강내 DTX(5 mg/kg 체중), IP 주사 전 30분째 및 주사 후 24시간째에 정맥내 데스모프레신(2 ㎍/ml/체중), 또는 병용 치료법(1개 그룹 당 n = 4)을 포함하였다. 각각의 그룹은 총 3회의 치료 동안 2주마다 1회 치료를 받았다. 동물 체중 및 종양 크기를 규칙적으로 평가하였다. 종양 크기를 칼리퍼를 이용하여 길이(L) 및 폭(W)에 의해 측정하고, 하기 식: V = (L x W2) (Π/6)에 따라 계산하였다.
마지막 치료 후 2주째에, 마우스를 안락사시키고; 종양을 절제한 다음, 칼리퍼를 이용하여 직접 측정하고, 조직학적 분석에 보내었다.
통계학: 치료 기간 동안 계산된 종양 부피를 반복된 측정 원-웨이 ANOVA 테스트(SPSSⓒ)를 사용하여 비교하였다. 마지막 종양 부피 및 체중 측정을 원-웨이 ANOVA 테스트를 사용하여 개별적으로 비교하였다.
결과
세포 증식
데스모프레신 및 도세탁셀의 최적의 농도를 확인한 후(데이터는 도시되지 않음), 10 nM 및 100 nM의 DTX 및 1 μM 데스모프레신의 병용 치료법을 사용하였다. 병용된 용량의 100 nM DTX + 1 μM 데스모프레신은 치료 후 72시간째에 세포 증식의 저해를 초래하였다(p < 0.05)(도 10). 유사한 분석을 24시간 시점 및 48시간 시점에 완료하였으며, 이때 농도는 10 nM DTX이었고, DTX 치료 단독과 비교 시 통계학적 유의성이 없는 최소의 반응을 보여주었다(데이터는 도시되지 않음).
세포 이동
시험관내 상처 봉합은 대조군과 비교하여 병용 치료군에 의해 저해되었으며. 각각의 치료군은 1 μM 데스모프레신과 병용된 10 nM 농도의 DTX, 및 DTX 치료 단독이었다(24.8% vs 48.9%, p < 0.05, 투-웨이 스튜던트 t-테스트)(도 11). 10 nM DTX 단독은 대조군과 비교하여 이동 저해 효과를 가졌으며, 한편 데스모프레신 치료 단독은 통계학적으로 유의한 효과를 갖지 않았다. DTX는 100 μM 농도에서 상당한 세포 살해를 유발하고 있었다. 이 농도에 대한 결과가 도 11에 나타나 있긴 하지만, 신뢰할 만한 측정은 도시될 수 없었고, 결과적으로 이들 농도에 대해 결과가 관찰될 수 없었다. 시험관내 상처 봉합의 대표적인 사진들은 도 12에 제시되어 있다.
생체내: 이종이식편 마우스 모델
병용 치료법(DTX 5 mg/kg I.P 및 데스모프레신 2 ㎍/ml/체중 IV, 화학치료법 전 30분째 및 치료법 후 24시간째)은 종양 부피를 감소시켰으며(도 13), 한편, 동물의 체중에서 변화를 초래하지 않았다(도 14). ANOVA 분석은 DU145 접종 후 제42일에 출발하는 병용 치료법에 대해 평균 종양 크기의 유의한 차이를 보여주었으며, 이는 동물에게 투여된 제3 치료 주기이었다. 종양을 가진 마우스 및 절제 후 종양의 대표적인 사진은 도 15에 제시되어 있다.
접종 후 제55일인 날에 종양을 절제한 후, 마지막 측정을 직접적으로 수행하였으며, 직접적인 측정은 보다 정밀한 측정일 것이라고 가정하였다. 결과는, 대조군, 데스모프레신 단독 치료법, DTX 단독 치료법 및 병용 치료법 각각에 대해 2049 ± 520 mm3, 1597 ± 681 mm3, 1330 ± 550 mm3 및 773 ± 314 mm3의 평균 종양 크기를 보여주었다(DTX 치료와 비교하여 병용 치료의 경우 P<0.05).
고찰
DTX 및 데스모프레신의 병용 치료는 전립선암 세포 증식 및 이동을 상당히 저해하는 것으로 나타났다. 이들 데이터는 마찬가지로, DU-145 세포의 증식 및 이동 잠재성의 변화를 보여주었다. 마우스 이종이식편 모델에서, 데스모프레신 및 DTX의 병용은 단일 제제를 사용한 치료와 비교하여, 병용 치료법의 3회 치료 후 (종양 부피에 의해 확인된 바와 같이) 종양 성장을 상당히 감소시킨 것으로 관찰되었다.

Claims (15)

  1. 바소프레신 유사체를 유효성분으로 포함하는 전립선 암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기, 바소프레신 유사체는 데스모프레신(desmopressin), 합성 아르기닌 바소프레신, 라이신 바소프레신, 테를리프레신(terlipressin), 펠리프레신(felypressin) 또는 오르니프레신(ornipressin)인 것인, 전립선 암 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    전립선암이 전이성 전립선암인 것인, 전립선 암 치료용 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    전립선암이 전이성 거세-저항성(castrate-resistant) 전립선암인 것인, 전립선 암 치료용 약학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    바소프레신 유사체가 치료적 유효량의 탁산(taxane)과 공동-투여되는 것인, 전립선 암 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    탁산은 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 라로탁셀(larotaxel), 카바지탁셀(cabazitaxel), 바카틴(baccatin), 세팔로만닌(cephalomannine), 브레비폴리올(brevifoliol), BMS-275183, 아브락산(abraxane), 탁소프렉신(taxoprexin) 또는 자이토탁스(xytotax)인 것인, 전립선 암 치료용 약학적 조성물.
  6. 치료적 유효량의 바소프레신 유사체 및 치료적 유효량의 탁산(taxane)을 포함하는 전립선 암의 치료에 사용되는 키트로서,
    상기, 바소프레신 유사체는 데스모프레신(desmopressin), 합성 아르기닌 바소프레신, 라이신 바소프레신, 테를리프레신(terlipressin), 펠리프레신(felypressin) 또는 오르니프레신(ornipressin)인 것인 전립선 암 치료에 사용되는 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    전립선암이 전이성 전립선암인, 키트.
  8. 제7항에 있어서,
    전립선암이 전이성 거세-저항성(castrate-resistant) 전립선암인, 키트.
  9. 제6항에 있어서,
    탁산이 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 라로탁셀(larotaxel), 카바지탁셀(cabazitaxel), 바카틴(baccatin), 세팔로만닌(cephalomannine), 브레비폴리올(brevifoliol), BMS-275183, 아브락산(abraxane), 탁소프렉신(taxoprexin) 또는 자이토탁스(xytotax)인, 키트.
  10. 제7항에 있어서,
    탁산이 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 카바지탁셀, 바카틴, 세팔로만닌, 브레비폴리올, BMS-275183, 아브락산, 탁소프렉신 또는 자이토탁스인, 키트.
  11. 제8항에 있어서,
    탁산이 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 카바지탁셀, 바카틴, 세팔로만닌, 브레비폴리올, BMS-275183, 아브락산, 탁소프렉신 또는 자이토탁스인, 키트.
  12. 제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    바소프레신 유사체는 데스모프레신이고 탁산은 도세탁셀인, 키트.
  13. 바소프레신 유사체, 및 탁산(taxane)을 유효성분으로 포함하는 전립선 암 치료용 약학적 조성물로서,
    상기, 바소프레신 유사체는 데스모프레신(desmopressin), 합성 아르기닌 바소프레신, 라이신 바소프레신, 테를리프레신(terlipressin), 펠리프레신(felypressin) 또는 오르니프레신(ornipressin)인 것인, 전립선 암 치료용 약학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    탁산은 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 라로탁셀(larotaxel), 카바지탁셀(cabazitaxel), 바카틴(baccatin), 세팔로만닌(cephalomannine), 브레비폴리올(brevifoliol), BMS-275183, 아브락산(abraxane), 탁소프렉신(taxoprexin), 또는 자이토탁스(xytotax)인 것인, 전립선 암 치료용 약학적 조성물.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서,
    바소프레신 유사체는 데스모프레신이고 탁산은 도세탁셀인 것인, 전립선 암 치료용 약학적 조성물.
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