CN107635574B

CN107635574B - 治疗癌症的方法

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Publication number: CN107635574B
Application number: CN201680020100.8A
Authority: CN
Inventors: 劳伦斯·H·克洛茨; 瓦松达拉·温卡特斯瓦兰
Original assignee: Sunnybrook Research Institute
Current assignee: Sunnybrook Research Institute
Priority date: 2015-03-30
Filing date: 2016-03-29
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2036-03-29
Also published as: US20180042987A1; CA2977061A1; EP3247376B1; KR102345773B1; US10786544B2; AU2016240068B2; US11395845B2; EP3247376A4; KR20210089265A; CA2977061C; US10500248B2; JP2018510188A; EP3247376A1; AU2016240068A1; CN107635574A; JP6956239B2; KR20180008430A; WO2016154748A1; US20200101131A1; US20200397851A1

Abstract

本公开涉及一种治疗前列腺癌的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的加压素类似物。

Description

治疗癌症的方法

相关申请

本申请要求2015年3月30日提交的US 62/139,976的优先权，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本公开涉及一种使用加压素类似物治疗癌症的方法。具体地，本公开涉及治疗前列腺癌的方法，其包括施用加压素类似物。

背景技术

前列腺癌是西方国家癌症相关死亡的第二大原因¹。大多数死于前列腺癌的患者患有转移性去势抵抗性疾病(CRPC)²。没有用于治疗CRPC的治疗药剂。

多西他赛是治疗CRPC的首选药物^3,4。尽管基于多西他赛的联合化疗显著提高了CRPC患者的生存率，但持久的反应并不常见^4-6。此外，多西他赛引起不良事件，例如3级或4级中性粒细胞减少症、疲劳、脱发和恶心。高剂量多西他赛诱导显著毒性^4,5,7。

去氨加压素是抗利尿激素的合成衍生物。去氨加压素在患有血管性血友病、血友病A和其它出血性疾病的患者中是安全有效的止血剂^8-10。去氨加压素诱导凝血因子VIII、血管性血友病因子(VWF)和组织型纤溶酶原激活物(t-PA)的血浆水平升高⁹。最近的报道表明，去氨加压素抑制体内模型中的肿瘤转移^11-13。Alonso等人报道去氨加压素在体内模型中通过血源性乳腺癌细胞抑制肺定植¹¹。术前注射的去氨加压素减少乳腺肿瘤模型中的淋巴结和肺转移¹²。在化疗期间去氨加压素削弱残余乳腺肿瘤的侵袭性¹³。

发明内容

本公开涉及一种使用加压素类似物如去氨加压素治疗癌症的方法。特别地，该方法涉及前列腺癌的治疗。

在一个实施方案中，本公开包括治疗前列腺癌的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的去氨加压素或其加压素类似物。

在一个实施方案中，所述方法还包括向有需要的患者共同施用药物组合物，紫杉烷或其功能衍生物。

在一个实施方案中，本公开涉及治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的加压素类似物如去氨加压素。

在本公开的另一个实施方案中，还包括治疗有效量的加压素类似物如去氨加压素用于治疗前列腺癌的用途。在一个实施方案中，本公开包括治疗有效量的(i)去氨加压素或其加压素类似物；和(ii)紫杉烷或其功能衍生物用于治疗前列腺癌的用途。

在本公开的另一个实施方案中，还包括治疗有效量的加压素类似物如去氨加压素用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌的用途。

本公开还包括用于治疗前列腺癌的试剂盒，其包含(i)治疗有效量的加压素类似物如去氨加压素，和(ii)治疗有效量的紫杉烷或其功能衍生物以及试剂盒的使用说明。

从以下详细描述中，本申请的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应当理解，仅通过例示给出了详细描述和具体示例同时指出了本申请的优选实施方案，因为对于本领域技术人员而言在本申请的精神和范围内的各种改变和修改根据该详细描述将是显而易见的。

附图说明

现在将参考以下附图更详细地描述本公开，其中

图1A是显示去氨加压素对PC3细胞的作用的柱状图；图1B是显示多西他赛对PC3细胞的作用的柱状图；图1C是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合对PC3细胞的作用的柱状图；

图2A是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合对细胞迁移的作用的显微照片；图2B是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合对细胞侵袭的作用的显微照片；图2C是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合对细胞迁移的作用的柱状图；

图3A是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合的抗侵袭作用的显微照片；图3B是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合的抗侵袭作用的柱状图；

图4A显示多西他赛和去氨加压素单独或组合的细胞增殖作用的免疫印记分析；图4B显示多西他赛和去氨加压素单独或组合的细胞凋亡作用的免疫印记分析；图4C是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合对Bax/Bcl-2比例的作用的柱状图；图4D是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合的细胞周期作用的柱状图；

图5A-5D是显示去氨加压素对pro-uPA、活性uPA、MMP-2、MMP-9和uPAR的表达的作用的柱状图；

图6A-6D是显示去氨加压素以时间依赖的方式对pro-uPA、活性uPA、MMP-2、MMP-9和uPAR的表达的作用的柱状图；

图7是显示在一个实施方案中去氨加压素经由uPA-MMP途径对肿瘤细胞迁移和侵袭的作用的示意图；

图8A-8D是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合对pro-uPA、活性uPA、MMP-2、MMP-9和uPAR的表达的作用的柱状图；

图9是显示多西他赛和去氨加压素单独或组合对肿瘤体积的作用的图表，并且还显示了治疗方案；

图10是显示多西他赛(DTX)或去氨加压素(Desmo)单独和/或组合对DU145细胞的作用的柱状图；

图11是显示使用伤口愈合测定评估的多西他赛(DTX)或去氨加压素(Desmo)单独和/或组合对DU145细胞的作用的柱状图；

图12A-D是显示使用伤口愈合测定评估的多西他赛(DTX)或去氨加压素(Desmo)单独和/或组合对DU145细胞的作用的显微照片；

图13是描绘多西他赛和去氨加压素单独和/或组合对前列腺癌异种移植模型中的肿瘤体积的作用的图表；

图14是描绘多西他赛和去氨加压素单独和/或组合对前列腺癌异种移植模型中的动物体重的作用的图表；

图15A-D是显示多西他赛和去氨加压素单独和/或组合对前列腺癌异种移植模型中的肿瘤大小的作用的显微照片。

具体实施方式

(I)定义

本文所用，术语“加压素类似物”是指具有与加压素相似的功能但不一定相似的结构的化合物或衍生物，并且包括具有抗增殖活性的所有化合物或衍生物，包括前药。加压素类似物包括但不限于合成精氨酸加压素、赖氨酸加压素、特利加压素、苯赖加压素或鸟氨加压素。如本文所用，术语“去氨加压素”或

加压素类似物是指1-脱氨基-8-D-精氨酸加压素。

如本文所用，术语“紫杉烷”通常是指从天然来源如紫杉属植物(紫杉树)或从细胞培养物产生和分离的一类二萜类。该术语还包括已被人工合成的那些紫杉烷类。例如，该术语包括多西他赛和紫杉醇及其衍生物。还包括也具有抗增殖活性的紫杉烷类的“功能衍生物”，包括前药。

本文所用，术语“药学上可接受的”意指与受试者如人的治疗相容。

术语“药学上可接受的盐”是指例如，保留本公开的化合物的期望生物活性并且不对其给予不期望的毒理作用的盐；并且可以是指酸加成盐或碱加成盐。

如本文所用，短语“去势抵抗性前列腺癌”(还称为激素难治性前列腺癌或雄激素非依赖性前列腺癌或内分泌抵抗性前列腺癌)是指对激素治疗具有抵抗性的前列腺癌。

如本文所用，术语“转移性”被定义为癌细胞从一个器官或部分转移到与其不直接相连的另一个器官或部分。

如本文所用，“受试者”是指动物界的所有成员，包括哺乳动物，并适当地是指人。动物界的成员包括但不限于哺乳动物(例如人、灵长类动物、猪、绵羊、牛、马科动物、马、骆驼、犬科动物、狗、猫科动物、猫、老虎、豹、宠物、家畜、兔、小鼠、大鼠、豚鼠或其它啮齿动物、海豹、鲸鱼等)。在本公开的实施方案中，受试者需要本公开的治疗。

如本文所用，术语“前药”是指以非活性形式制备的物质，其通过例如内源酶或其它化学物质和/或条件的作用在体内或其细胞内转化为活性形式(即，药物)。可通过本领域普通技术人员已知的方法制备去氨加压素的前药衍生物或其药学上可接受的盐或溶剂合物。

如本文所用，术语“治疗有效量”意指在实现期望结果所需的剂量和时间段内的有效的量。有效量可根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别和/或体重的因素而变化。对应于这种量的给定的化合物或组合物的量将根据各种因素而变化，例如给定的药物或化合物、药物制剂、给药途径、受治疗的受试者的身份等，但然而可由本领域技术人员常规地确定。

如本文所用，术语“施用的”或“施用”意指向受试者施用治疗有效剂量的本公开的化合物或组合物。

在理解本公开的范围时，如本文所用，术语“包括”及其衍生物旨在是开放式术语，其指定陈述的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤的存在，但不排除其它未陈述的特征、元素、组分、基团、整数和/或步骤的存在。上述内容也适用于具有类似含义的词语，例如术语“包括(including)”、“具有(having)”及它们的派生词。最后，如本文所用，诸如“基本上”、“约”和“近似”的程度术语意指修改的术语的合理的偏差量，使得最终结果不会显著改变。如果该偏差不否定它修饰的词语的含义，则这些程度术语应被解释为包括修饰的术语的至少±5％的偏差。

(II)癌症的治疗方法

本公开涉及癌症的治疗。特别地，本公开涉及前列腺癌的治疗，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的加压素类似物。在其它实施方案中，本公开包括一种用于治疗激素依赖性癌症如肺、子宫、肾、卵巢、睾丸、乳腺或结肠直肠癌的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的加压素类似物。

在一个实施方案中，本公开涉及一种治疗前列腺癌的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的加压素类似物。在一个实施方案中，加压素类似物是去氨加压素、合成精氨酸加压素、赖氨酸加压素、特利加压素、苯赖加压素或鸟氨加压素。在其它实施方案中，加压素类似物是去氨加压素。

在本公开的另一个实施方案中，还包括治疗有效量的加压素类似物用于治疗前列腺癌的用途。在本公开的另一个实施方案中，还包括治疗有效量的加压素类似物在制备用于治疗前列腺癌的药物中的用途。在一个实施方案中，加压素类似物是去氨加压素。在其它实施方案中，本公开包括治疗有效量的加压素类似物用于治疗激素依赖性癌症如肺、子宫、肾、卵巢、睾丸、乳腺或结肠直肠癌的用途。

在一个实施方案中，前列腺癌是转移性前列腺癌。在另一个实施方案中，前列腺癌是去势抵抗性前列腺癌。在其它实施方案中，癌症是转移性去势抵抗性前列腺癌。

在本公开的另一个实施方案中，将去氨加压素或其类似物施用于受试者，例如去氨加压素的前药。去氨加压素的前药包括酪氨酸酚基的脂肪族羧酸酯和碳酸酯。在另一个实施方案中，将去氨加压素施用于受试者。

在本公开的另一个实施方案中，该方法还包括共同施用紫杉烷。如本文所用，术语“共同施用”旨在包括以顺序方式单独施用加压素类似物，例如去氨加压素和紫杉烷(或功能衍生物)，以及以基本上同时的方式共同施用这些药剂，例如以单一混合物/组合物形式或以单独施用的剂量，但是基本上同时施用于受试者。

在一个实施方案中，紫杉烷为多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、卡巴他赛、浆果赤霉素、三尖杉宁碱、短叶醇(brevifoliol)、BMS-275183、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、二十二碳六烯酸紫杉醇(taxoprexin)、多聚谷氨酸紫杉醇(xytotax)或其功能衍生物。在另一个实施方案中，紫杉烷为多西他赛、紫杉醇、卡巴他赛或其功能衍生物。在其它实施方案中，紫杉烷为多西他赛。

在本公开的一个实施方案中，以有效减少或停止癌细胞增殖的剂量施用加压素类似物，例如通过诱导细胞周期停滞。在一个实施方案中，癌细胞是前列腺癌细胞。在另一个实施方案中，加压素类似物是去氨加压素。

在本公开的另一个实施方案中，以有效减少或停止癌性肿瘤生长的剂量施用加压素类似物，并减小肿瘤体积。在一个实施方案中，癌性肿瘤生长是癌性前列腺肿瘤。在一个实施方案中，加压素类似物是去氨加压素。

在本公开的另一个实施方案中，以有效减少或预防癌细胞转移到受试者身体的其它组织和器官的剂量施用加压素类似物。在一个实施方案中，癌细胞是前列腺癌细胞。在一个实施方案中，加压素类似物是去氨加压素。

在本公开的另一个实施方案中，以增强紫杉烷的抗增殖功效的剂量将加压素类似物与紫杉烷或其功能衍生物共同施用。在一个实施方案中，加压素类似物是去氨加压素。本领域技术人员众所周知，紫杉烷类引起严重的副作用，例如3级或4级中性粒细胞减少。其加压素类似物如去氨加压素的施用允许使用较小中毒剂量的紫杉烷，而不损害紫杉烷用于治疗癌症的功效。

在本公开的另一个实施方案中，包括用于治疗癌症的试剂盒。在一个实施方案中，癌症是前列腺癌。

在一个实施方案中，本公开包括用于治疗癌症的试剂盒，其包含(i)治疗有效量的加压素类似物，和(ii)治疗有效量的紫杉烷或其功能衍生物；以及试剂盒的使用说明。在一个实施方案中，加压素类似物是去氨加压素。

在一个实施方案中，试剂盒用于治疗前列腺癌、肺、子宫、肾、卵巢、睾丸、乳腺或结肠直肠癌。在一个实施方案中，癌症是前列腺癌。在另一个实施方案中，前列腺癌是转移性前列腺癌。在另一个实施方案中，试剂盒用于治疗去势抵抗性前列腺癌。在其它实施方案中，试剂盒用于治疗转移性去势抵抗性前列腺癌。

在本公开的另一个实施方案中，试剂盒包含施用于受试者的加压素类似物。在另一个实施方案中，试剂盒包含施用于受试者的去氨加压素。

在本公开的另一个实施方案中，试剂盒包含紫杉烷，将其与加压素类似物共同施用于受试者。共同施用包括以顺序方式单独施用加压素类似物(例如去氨加压素)和紫杉烷(或功能衍生物)，以及以基本上同时的方式共同施用这些药剂，例如以单一混合物/组合物形式或以单独施用的剂量，但是基本上同时施用于受试者。

在一个实施方案中，试剂盒包含紫杉烷，其为多西他赛、紫杉醇、拉洛他赛(larotaxel)、卡巴他赛、浆果赤霉素、三尖杉宁碱，短叶醇(brevifoliol)、BMS-275183、白蛋白结合型紫杉醇(abraxane)、二十二碳六烯酸紫杉醇(taxoprexin)或多聚谷氨酸紫杉醇(xytotax)或其功能衍生物。在另一个实施方案中，紫杉烷为多西他赛、紫杉醇、卡巴他赛或其功能衍生物。在其它实施方案中，紫杉烷为多西他赛。

在一个实施方案中，加压素类似物如去氨加压素被配制为药学上可接受的盐，例如醋酸去氨加压素。在其它实施方案中，将加压素类似物配制在药物组合物中，所述药物组合物包含加压素类似物和药学上可接受的赋形剂和/或载体。在一个实施方案中，加压素类似物是去氨加压素。

在一个实施方案中，加压素类似物如醋酸去氨加压素被配制为以约4μg/ml或约15μg/ml的浓度存在的醋酸去氨加压素的水溶液。在一个实施方案中，以约0.1μg/kg至约1.0μg/kg，任选为0.2μg/kg至约0.5μg/kg或约0.4μg/kg的剂量施用加压素类似物。在一个实施方案中，加压素类似物被配制用于静脉内、肌内或皮下施用。在一个实施方案中，加压素类似物被配制用于立即释放、IV输注、延迟释放或贮库施用。

在一个实施方案中，紫杉烷或其功能衍生物被配制在包含紫杉烷和药学上可接受的赋形剂和/或载体的药物组合物中。

在一个实施方案中，紫杉烷为多西他赛。在其它实施方案中，多西他赛被配制在浓度为约50mg/ml至约100mg/ml，任选为约80mg/ml存在的水溶液中。在一个实施方案中，多西他赛以1小时静脉输注的形式每3周以约50mg/m2至约100mg/m2，或约75mg/m2的剂量施用。任选地，与多西他赛同时施用每天口服两次5mg的强的松。在一个实施方案中，多西他赛被配制用于静脉内施用。

适用于注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于无菌注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉末。在所有情况下，该形式必须是无菌的，并且必须是存在容易的可注射性的程度的液体。

在一个实施方案中，将紫杉烷每三周施用于患者持续四个周期，并且在施用紫杉烷的剂量之前约30分钟以及在施用紫杉烷的剂量之后24小时施用加压素类似物。

虽然已经结合其具体实施方案描述了本公开，但很显然许多替代方案、修改和变型对于本领域技术人员将是显而易见的。因此，旨在包括落在所附权利要求的精神和宽范围内的所有这样的替代方案、修改和变型。此外，本申请中引用或标识的任何参考文献不应被解释为承认该参考文献可用作本公开的现有技术。

通过以下代表性实施例说明本公开的操作。对于本领域技术人员显而易见的是，可在仍实施本文所述的公开内容的同时改变实施例的许多细节。

(III)实施例

实施例I

材料和方法

细胞培养

PC3人前列腺癌细胞获自美国模式培养物保藏所(Rockville,MD,USA)。将细胞在含有10％胎牛血清(FBS；Gibco,NY,USA)，100IU/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素和0.3mg/ml的1-谷氨酰胺的DMEM/F12培养基(Invitrogen,ON,Canada)中培养，并在空气中在5％CO₂的潮湿气氛中保持在37℃下。将细胞在10-cm组织培养板中生长至80％细胞覆盖(confluence)。

化学品

多西他赛购自Santa Cruz Biotechnology(CA，USA)。在二甲亚砜(DMSO；Sigma,StLouis,USA)中制备多西他赛，并以0.01％的DMSO的终浓度用细胞培养基稀释。去氨加压素由Ferring Pharmaceutical(CA,USA)友情提供给我们。

细胞增殖测定

通过如前所述的MTS测定法测定细胞增殖¹⁴。用96孔板将细胞(5×10³/孔)制板。在培养24小时后，加入一系列浓度的去氨加压素(100pM-1μM)和/或多西他赛(1nM-100nM)，并持续培养多达72小时。通过用MTS孵育2小时来评估细胞活力，并且使用ELISA酶标仪在595nm下测量所得吸光度。在组合研究中，测试了每种药剂的不同剂量。将实验一式三份地重复3次，并进行统计学分析。

伤口愈合测定

使用根据Liang等人描述的方案进行的使用伤口愈合测定来评估细胞运动性¹⁵。在6孔板中将细胞(2×10⁴/孔)制板。使用1mg/l的丝裂霉素C(Sigma-Aldrich,St Louis,USA)将超过90％细胞覆盖的细胞孵育1小时以排除增殖效应。在丝裂霉素C处理后，使用200μl吸头制备损伤线，并用PBS冲洗细胞单层。用去氨加压素和/或多西他赛处理细胞，并允许迁移24小时。使用基于计算机的显微镜成像系统以用200倍放大倍数的显微镜确定刮板后的伤口愈合。观察几个伤口区域的细胞迁移。将实验一式三份地重复3次。

细胞迁移和侵袭测定

根据制造商的方案，使用transwell嵌入板(BD Biosciences,Bedford MA)测量细胞的迁移。将细胞在补充有FBS的DMEM/F12中进行24小时的血清剥夺。将PC3(5×10⁴)细胞制板在8.0-μm的transwell嵌入板中的过滤器上，并在无血清培养基中用这些化合物、去氨加压素(1nM,1μM)和5nM的多西他赛处理。下腔室还含有10％的FBS。允许细胞迁移24小时。处理后，使用棉签将残留在过滤器顶面上的细胞除去。将连接到过滤器下表面的迁移的细胞在室温下在4％的甲醛中固定30分钟，然后用结晶紫染色20分钟。使用基于计算机的显微镜成像系统选择并计数来自随机场的迁移细胞。对于侵袭测定，如在迁移测定中所述进行相同的程序，除了将细胞在24孔基质胶涂布的transwell板(BD Biosciences,Bedford Ma)上制板之外。将实验一式两份地重复2次，并进行统计学分析。

流式细胞术

为了分析细胞周期分布，将细胞以每10cm的皿为1×10⁶的密度制板。在24小时结束时在有或没有抗氧化剂的预先处理的情况下，用10mM的溴脱氧尿苷(BrdU)将异步生长的细胞脉冲标记2小时。然后，收获细胞，用70％的乙醇固定，用0.1％的HCl处理，并在90℃下加热10分钟以暴露标记的DNA。将细胞用抗BrdU缀合的FITC(Becton-Dickinson)染色并用碘化丙啶复染，然后使其在冰上孵育30分钟。将样品通过尼龙网过滤。使用Cell Quest Pro软件包(Becton-Dickinson,CA,USA)在FACS Calibur流式细胞仪上进行细胞周期分析。将实验一式三份地重复3次，并如下述提及的进行统计学分析。

免疫印迹分析

如前所述制备来自去氨加压素单药治疗剂量反应研究(100pM-1uM)、去氨加压素单药治疗时间点研究(1uM，0-48h)和组合研究和用于免疫印迹分析的浓缩培养基的蛋白质裂解物¹⁴。将蛋白质进行10-12％的SDS-PAGE，并使用半干转移装置(Bio-RadLaboratories,Hercules,Ca)以100V/300mA电泳转移到PVDF膜上。在甲醇(100％)中激活后，在含有5％脱脂乳的TBST中将印迹在室温下孵育60分钟。洗涤后，将膜用抗Bax、bcl-2、p21(waf1/cip1)、p27(kip1)、cdk2、cdk4、uPA、uPAR、MMP-2和MMP-9(1:100-200，SantacruzBiotechnology,Santacruz,CA,USA)的一级抗体孵育。在用相应的一级抗体孵育后，用TBST将膜洗涤3次，每次5分钟，然后用适当的二级抗体在室温下孵育1小时，并用TBST洗涤3次，每次5分钟。用增强化学发光免疫印迹试剂(Amersham Pharmacia Biotech,Buckinghamshire,UK)进行蛋白质检测。

使用异种移植物的体外研究

在多伦多大学动物研究伦理委员会批准的设施中并根据加拿大动物护理委员会(CCAC)的规定和标准，在无特定病原体的条件下将小鼠圈养并维持在层流柜内。将细胞(1×10⁶个PC3细胞与100μl的martrigel溶液(BD Biosciences,CA,USA))皮下(sc)接种到6-8周龄的雄性裸鼠(Harlan Sprague Dawley,Inc.)中。14天后，测量发展的肿瘤，并将小鼠随机分配到不同的治疗组。每周两次通过用卡尺测量肿瘤长度(L)和宽度(W)来测定肿瘤体积，并根据下式计算：V＝(L×W²)(π/6)。对于待纳入的给定的小鼠，需要在100mm³的范围内的肿瘤体积。使用异种移植模型，测定对照和每只处理小鼠的肿瘤生长。将小鼠随机分为4组；对照组(n＝15)、单独的去氨加压素(n＝15)、单独的多西他赛(n＝10)和去氨加压素联合多西他赛(n＝10)。对照动物只接受盐水介质。在2个剂量(0小时和24小时)中施用来自Ferring Pharmaceuticals(Ferring Inc,CA,USA)的去氨加压素。小鼠静脉内接受2μg/ml/体重(50ng/0.3ml的盐水剂量)的最终剂量的去氨加压素的盐水溶液。以3个周周期(3weekly cycles)形式将小鼠静脉内施用5mg/kg的剂量的多西他赛。在施用多西他赛之前30分钟和之后24小时，以2个剂量施用去氨加压素。在细胞接种后35天处死施用多西他赛或去氨加压素联合多西他赛的动物。监测对照和去氨加压素小鼠，直到肿瘤体积为约1500mm³或第49天，以较早者为准，以评估去氨加压素体内研究的抗肿瘤作用。

统计分析

一式三份地进行所有实验。日期表示平均值±平均值的标准误差。通过学生t检验在P<0.05的显著性水平下进行统计分析。使用学生t检验或重复测量单因素方差分析技术进行体内结果的分析。

实施例1-多西他赛和/或去氨加压素对PC3细胞的细胞增殖的影响。

多西他赛和/或去氨加压素抑制PC3细胞上的细胞增殖。进行MTS细胞增殖测定以研究多西他赛和/或去氨加压素是否抑制细胞增殖。在72小时进行该测定，其中细胞用0-100nM的剂量范围的多西他赛处理。细胞生长被表达为相对于未处理的对照细胞的细胞生长的相对值。用多西他赛处理72小时的PC3细胞以剂量依赖的方式降低细胞活力(图1A)。与对照相比，用一系列剂量的去氨加压素(1nM-1μM)处理的细胞经过72小时显著降低细胞增殖(图1B，p<0.01)。此外，去氨加压素(1nM，1μM)和5nM的多西他赛的联合治疗也导致细胞增殖的显著降低(图1C，p<0.01)。

实施例2-去氨加压素以剂量依赖方式对PC3细胞迁移的差异影响

由于去氨加压素和多西他赛治疗对培养物中的PC3细胞产生抗增殖作用，因此确定了单独的去氨加压素(1nM，1μM)和联合5nM的多西他赛治疗的去氨加压素对通过伤口愈合测定的细胞迁移的影响。如图2所示，测量在0小时至24小时通过对照迁移的距离差异，并与处理的细胞进行比较。在24小时结束时，观察到使用去氨加压素和多西他赛组合的细胞迁移显著减少(图2A)。使用迁移室transwell板进一步定量细胞的迁移能力。不同剂量的去氨加压素(1nM和1μM)治疗显著抑制细胞迁移(图2B和C，p<0.01)。此外，用去氨加压素(1nM和1μM)和5nM多西他赛的各种联合治疗导致细胞迁移的进一步显著降低(图2B和C，p<0.01)。

实施例3-去氨加压素对PC3细胞的抗侵袭作用

为了评估去氨加压素的抗转移能力，进行基质胶侵袭测定。如图3所示，单独的5nM的多西他赛和两种不同剂量的去氨加压素(1nM和1uM)治疗诱导细胞侵袭的显著抑制。此外，5nM的多西他赛和去氨加压素(1nM和1μM)的每种组合治疗导致细胞侵袭的显著降低(图3，A和B，p<0.01)。

实施例4-去氨加压素联合多西他赛对细胞周期的影响

去氨加压素联合多西他赛诱导细胞周期停滞，并且去氨加压素增强多西他赛的细胞凋亡作用，如通过免疫印迹分析测定的。

为了确定MTS测定的结果，进行免疫印迹分析以检查细胞增殖。多西他赛具有改变关键调控分子的能力，包括抑制微管与随后的有丝分裂纺锤体破坏，导致G2/M阶段细胞周期停滞和诱导最终导致细胞凋亡的bcl-2磷酸化^16-18。细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白B、CDK2和CDK4的表达在用去氨加压素和多西他赛处理的细胞中减少(图4A)。此外，在相同条件下，CDK抑制蛋白p21(waf1/cip1)和p27(kip1)的表达升高(图4A)。结果表明，去氨加压素联合多西他赛治疗可能抑制与细胞周期进程相关的分子，并伴随诱导细胞周期停滞。Bax/Bcl-2的比例显示用1nM的去氨加压素联合多西他赛以及1μM的去氨加压素联合多西他赛治疗的细胞中的表达分别增加4倍和8倍，所有表达都相对于对照(图4C)。此外，两种联合治疗降低了总胱天蛋白酶3的表达。单独的去氨加压素治疗不降低bcl-2、PARP或胱天蛋白酶3的表达(图4，B)，这表明去氨加压素增强多西他赛的细胞凋亡作用。

实施例5-去氨加压素不改变用于PC3上的处理的细胞周期分布

通过流式细胞术分析，使用BrdU标记在用单独和联合的去氨加压素和DTX处理的细胞上检验细胞周期分布的变化。用5nM的多西他赛或联合1nM/1μM的去氨加压素的治疗显示与G2M细胞周期停滞相一致的G2阶段中的细胞比例的显著增加(图4D)。此外，每次联合治疗增加了指示细胞凋亡的亚G1阶段的细胞群体。

实施例6-去氨加压素对前列腺癌细胞以及uPA-MMP途径介导物的迁移和侵袭的影响

两种分子MMP和uPA都参与癌细胞侵袭、运动和肿瘤休眠¹⁹。基于迁移测定和侵袭测定的结果，检验去氨加压素在单药治疗中的抗转移性。用去氨加压素进行剂量标准化和时间点研究。如图5所示，去氨加压素单药治疗改变了前体pro-uPA、活性uPA、MMP-2和MMP-9的表达，其所有都以剂量依赖性方式被降低(图5A、C和D)。相比之下，uPAR的表达没有改变(图5B)。在使用浓度为1μM的去氨加压素进行的时间点研究中，uPA、MMP-2和MMP-9的表达也以时间依赖性方式被降低(图6A、C和D)。然而，uPAR表达没有改变(图6B)。去氨加压素单药治疗减少酶原型uPA(还称为pro-uPA)表达，从而减弱细胞表面上的uPA活性。这些结果表明，去氨加压素具有通过uPA-MMP途径抑制肿瘤细胞迁移和侵袭的能力(图7)。

还表明，去氨加压素联合多西他赛抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。如图6所示，当与对照相比时，用5nM的多西他赛和去氨加压素(1nM和1μM)的联合治疗导致uPA的表达降低(图8、A、p<0.01)。此外，与对照相比，用每种联合治疗处理的细胞中的表达MMP-2也显著降低(图8C，p<0.01)。uPAR的表达没有改变，如图8B所示。与对照相比，用每种联合疗法治疗的细胞中的MMP-9的表达显著降低(图8，D。P<0.01)。因此，去氨加压素联合多西他赛影响uPA-MMP途径。

实施例7-去氨加压素对异种移植模型中的PC-3细胞生长的影响

检查了单独的去氨加压素对肿瘤生长的影响。作为第一步，将使用去氨加压素治疗的肿瘤生长抑制与对照动物比较。使用无胸腺裸鼠，如上所述将细胞接种于基质胶中。每周评估两次肿瘤体积。在肿瘤接种后第35天，对照动物中的肿瘤迅速生长，测量体积为923mm³。相反，去氨加压素治疗的小鼠中的肿瘤生长具有显著减慢的肿瘤发展速度，在第35天达到642mm³的平均体积(图9，学生t检验，p<0.01)。对照和去氨加压素治疗之间的肿瘤体积显著不同(方差分析，p<0.0001)。然后检查去氨加压素以确定它是否能够增强PC3细胞对体内多西他赛的敏感性。如图9所示，联合组的肿瘤显著小于对照小鼠和单独的多西他赛治疗(方差分析，p<0.05)。使用静脉注射的多西他赛和/或去氨加压素治疗耐受良好。所有小鼠在每项研究期间一致地保持它们的体重。

讨论

纤维蛋白溶解系统尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)和尿激酶纤溶酶原激活物受体(uPAR)的组分促进基底基质的靶向蛋白水解以用于发生新生血管形成。这些因素在肿瘤组织中的过表达已被确定为用于许多人类癌症的转移性扩散和总体存活的预后，包括激素依赖性癌症如胃肠道、肺、肺、子宫、子宫内膜、膀胱、卵巢、睾丸、乳腺、结肠或前列腺癌。这些因素被认为是直接参与癌细胞侵袭和转移。uPA被去氨加压素特异性抑制。

发现去氨加压素在体外和体内对PC3细胞具有抗增殖、抗迁移和抗侵袭作用。先前的报道表明，去氨加压素对晚期乳腺癌的初次手术时的局灶性疾病的减少有促进作用¹¹，并且在转移性乳腺肿瘤细胞的静脉共同注射时抑制实验性肺定植¹²。Ripoll等人证实去氨加压素对人colo-205和小鼠CT-26结肠癌细胞系具有抗增殖作用²⁰。这些研究集中在表达V2受体的癌细胞上。去氨加压素是加压素V2受体的选择性激动剂²¹。通常，V2受体在内皮细胞和肾脏收集管中表达，介导抗利尿和止血作用。前列腺癌细胞系似乎不表达V2受体^21-24。实施例已经证明去氨加压素对缺乏V2受体的PC3细胞的抗肿瘤和抗转移作用。

上述实施例已经证实通过uPA途径介导的去氨加压素的抗转移活性。去氨加压素单药治疗导致uPA表达的剂量依赖性降低(图5A)。uPA及其受体uPAR在包含PC3细胞的大多数实体和侵袭性癌症中表达。uPA蛋白参与细胞外基质的降解，促进侵袭性和生长^25,26。uPA的表达在肿瘤组织中上调，使其成为用于癌症治疗的有吸引力的治疗靶点^27,28。uPA是丝氨酸蛋白酶家族的成员，强烈暗示作为各种人类恶性肿瘤包括前列腺癌的肿瘤进展的启动子。它以酶原形式被合成和分泌。与uPAR结合，uPA可有效地将无活性酶原、纤溶酶原转化为活性丝氨酸蛋白酶、纤溶酶。纤溶酶可激活MMP，即还可消化各种细胞外基质成分的有效酶²⁹。实施例已证明去氨加压素作为单药治疗，并且联合多西他赛显著抑制uPA、MMP-2和MMP-9的表达。它没有改变uPAR的表达，uPA在前列腺癌的迁移和侵袭期间激活MMP-2和MMP-9^30-32。uPA与uPAR结合的关键作用的概念源自几项研究，其证实了肿瘤细胞侵袭和转移的能力被uPA抑制剂下调。结果表明，去氨加压素单药治疗降低pro-uPA表达以及活性uPA，从而减弱细胞表面上的uPA活性。已经表明，去氨加压素对uPA的下调抑制前列腺癌细胞的侵袭和迁移。因此，不受理论束缚，去氨加压素可能起作用以抑制前列腺癌中的uPA活性(图7)。

与纤溶酶原激活物系统的激活相关的前列腺肿瘤细胞的生长来源于以下证实：以低密度培养的肿瘤细胞中的生长速率和uPA产量高于在较高细胞密度下生长的细胞中观察到的生长速率和uPA产量。这种调节可能影响肿瘤细胞增殖²⁷。然而，细胞增殖的结果与去氨加压素单药治疗中的uPA表达的结果不一致。许多细胞因子和生长因子如TGFβ1、IGF-1、FGF、EGF和铃蟾肽诱导uPA系统的组分的表达^19,28,33,34。这些因素也可能与uPA表达和肿瘤细胞增殖有关。

降低多西他赛的剂量限制性毒性和/或增加其功效的药物组合是有吸引力的。实施例已经证明去氨加压素单药治疗抑制细胞增殖(图1B)，并且与对照相比联合疗法(去氨加压素和多西他赛)显著抑制体外细胞增殖和体内肿瘤生长(图1C，图9)。去氨加压素单药治疗没有改变细胞周期分布和细胞凋亡相关的蛋白质的表达水平。然而，观察到去氨加压素增强细胞周期停滞和联合的多西他赛的细胞凋亡作用。

去氨加压素影响许多因子的分泌，包括vWF和tPA。vWF是一种多度量血浆糖蛋白，其在初期止血中起重要作用，允许血小板粘附到暴露的内皮下膜³⁵。Terraube V等人³⁶报道vWF在vWF缺陷突变体小鼠模型中发挥抗肿瘤细胞播散的保护作用。通过施用重组vWF恢复vWF血浆水平减少肺转移^35,36。静脉注射去氨加压素诱导vWF的释放，其中时间峰值水平为约1小时^21,37。人们认为vWF可能参与肿瘤细胞与血小板和内皮下膜的相互作用。另一方面，t-PA的主要功能是血管内纤维蛋白溶解。由于t-PA由血管内皮细胞合成并分泌到血液中，因此t-PA对纤维蛋白具有高亲和力，这反映了高溶栓功效^38-40。此外，tPA可能负调节血管生成，并且它们的抑制剂可能促进血管生成^41-46。因此，vWF和tPA是影响去氨加压素对肿瘤细胞侵袭和转移的作用的重要因素(图7)。

实施例已经表明，去氨加压素单药治疗调节在蛋白质水平而不是DNA或RNA水平下的PC3细胞上的uPA-MMP表达。单独或联合多西他赛的去氨加压素被证实减小肿瘤体积，抑制前列腺癌细胞的细胞增殖、侵袭和迁移。去氨加压素在前列腺癌中具有抗增殖、抗迁移和抗侵袭作用。

实施例II

在本研究中，研究了使用DU145细胞的去氨加压素联合多西他赛的体外和体内抗肿瘤作用。

材料和方法

细胞培养

使用去势抵抗性前列腺癌细胞DU145。遵循根据先前描述的程序的细胞培养程序^48,49。

化学品

多西他赛购自Sigma-Aldrich。在二甲亚砜(DMSO；Sigma-Aldrich,MO,USA)中制备多西他赛，并用细胞培养基(0.01％的DMSO)稀释用于细胞培养处理。去氨加压素购自

(或依他停(Octostim)15μg/mL每安瓿)。

细胞增殖测定

通过MTS测定法测定细胞增殖^48,49。将DU145细胞以4000个细胞/孔的浓度在96孔板中制板。在24小时的附着之后，使用各种浓度的DTX(1nM、10nM、100nM和1μM)和去氨加压素(各自为1nM、10nM、100nM和1μM)进行剂量标准化。在处理后24小时、48小时和72小时，使用MTS测定法评估细胞增殖。基于结果，在相似的时间点完成DTX 10nM和100nM以及去氧加压素1μM的联合治疗的细胞增殖测定。使用双尾学生t检验分析结果，其中p<0.05的显著性水平被认为是统计学显著的。

伤口愈合测定

通过根据先前描述的方案的伤口愈合测定获取单独的和/或联合多西他赛的去氨加压素的运动抑制潜力^49,50。将DU145细胞以每孔50,000个细胞的浓度在24孔板上制板，并使其生长直至它们达到90-100％细胞覆盖。在用1mg/L的丝裂霉素C

孵育细胞1小时后，产生通过每个孔的垂直划痕；移除浮动细胞，并加入细胞培养基或含有处理溶液的培养基。在零时间点和处理24小时后获得图像。使用具有X200放大倍数的基于计算机的显微成像系统

来测量每个孔的伤口愈合。一式二份地进行每个实验并重复三次。

使用异种移植模型的体内研究

根据加拿大动物护理委员会(CCAC)规定和当地动物研究伦理委员会程序和批准进行所有程序。

6周龄的雄性无胸腺裸鼠(Charles river,QC,Canada)用于评估联合治疗对体内DU145肿瘤生长的影响。在无病原体条件下将小鼠圈养并维持在层流柜中。按照Fridman等人(51)所述的程序，在2周的圈养后，将每只动物皮下接种1x 10⁶个DU145细胞的100μL的基质胶溶液(BD Bioscience,CA,USA)。接种后14天之后，测量体重和肿瘤大小，并将小鼠随机分配到不同的治疗组。在IP注射之前30分钟和24小时后或联合治疗(每组n＝4)，分组包括对照(假治疗)、腹膜内DTX(5mg/kg体重)、静脉内去氨加压素(2μg/ml/体重)。每组每隔一周接受一次治疗，共3次治疗。定期评估动物体重和肿瘤测量。根据以下公式通过用卡尺测量的长度(L)和宽度(W)计算肿瘤大小：V＝(L x W2)(л/6)。

最后一次治疗后的两周，将小鼠安乐死，切除肿瘤，用卡尺直接测量，并送组织学分析。

统计学：使用重复测量单因素方差分析

比较治疗期间计算的肿瘤体积。使用单因素方差分析分别比较最终肿瘤体积和体重测量结果。

结果

细胞增殖

在确定去氨加压素和多西他赛的最佳浓度后(数据未示出)，使用10nM和100nM的DTX和1μM的去氨加压素的联合治疗。100nM的DTX+1μM的去氨加压素的联合剂量在治疗后72小时导致细胞增殖的抑制(p<0.05)(图10)。当与单独的DTX治疗相比时，完成了24小时和48小时的时间点的相似分析，并且使用10nM的DTX的浓度，这显示无统计显著性的最小反应(数据未示出)。

细胞迁移

通过与对照相比的联合治疗和与单独的DTX治疗相比的DTX浓度为10nM联合1μM的去氨加压素的每个单独的治疗抑制体外伤口闭合(24.8％与48.9％，p<0.05，双因素学生t检验)(图11)。当与对照相比时，单独的10nM的DTX具有迁移抑制作用，而单独的去氨加压素治疗没有统计学显著影响。DTX在100μM的浓度下引起明显的细胞杀伤。尽管该浓度的结果示出在图11中，但不能得出可靠的测量结果，因此对于那些浓度不能观察到结果。图12示出体外伤口闭合的代表性图片。

体内：异种移植物小鼠模型

联合治疗(DTX 5mg/kg I.P和去氨加压素2μg/ml/体重IV，化疗前30分钟和24小时后)导致肿瘤体积减小(图13)，同时不影响动物体重的变化(图14)。方差分析显示DU145接种后第42天开始的联合治疗的平均肿瘤大小的显著差异，这是施用于动物的第三个治疗周期。荷瘤小鼠和切除后的肿瘤的代表性图片示于图15中。

在切除肿瘤后直接进行接种后第55天的最后测量，假设直接测量将是更精确的测量。结果显示对照、单独的去氨加压素、单独的DTX和联合治疗的平均肿瘤大小分别为2049±520、1597±681、1330±550和773±314mm³。(与DTX治疗相比，对于联合治疗P<0.05)。

讨论

DTX和去氨加压素的组合治疗被证实显著抑制前列腺癌细胞增殖和迁移。这些数据同样地表明DU-145细胞的增殖和迁移潜力的变化。在小鼠异种移植模型中，与使用单一药剂的治疗相比，在三次联合治疗的治疗之后，观察到去氨加压素和DTX的组合显著降低肿瘤生长(如通过肿瘤体积测定的)。

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Claims

1.去氨加压素和多西他赛在制备用于治疗受试者的转移性去势抵抗性前列腺癌的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述去氨加压素降低uPA蛋白表达。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述去氨加压素减小肿瘤体积。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述去氨加压素抑制细胞增殖。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述去氨加压素减少细胞侵袭和/或迁移。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述受试者是人。