KR20210089104A - 참김 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

참김 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 더욱 상세하게는 참김 추출물이 비강 세포 및 폐 세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호 효과를 확인하고, 초미세먼지에 노출된 동물모델의 폐 조직에서 지질과산화 억제효과 및 염증 관련 단백질 발현량을 억제하는 것의 항염증 효과를 검증함으로써 초미세먼지로 인한 염증성 질환 중 폐질환의 예방 및 치료 효능을 확인하여, 본 발명을 완성하였다. 이는 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물, 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환의 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물, 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환의 예방 및 개선용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

참김 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 조성물 {Composition for preventing and treating inflammatory Lung diseases caused by ultrafine dust containing Porphyra tenera extract as an active ingredient}
본 발명은 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환(inflammatory Lung diseases)의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 참김(Porphyra tenera; P. tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로서, 상기 폐질환의 종류로는 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환, 낭포성 섬유증 등이 있다.
한편, 최근 미세먼지(particulate matter, PM)의 농도가 증가하고 지속기간이 증가됨에 따라 미세먼지에 의한 인체영향성에 대한 관심이 증가되고 있는 추세이다(Kim 등, 2017). 미세먼지는 우리나라의 오랜 역사와 함께 해왔으며, 예로부터 몽고와 중국 사막지역 및 황화강 유역에서 발원된 황사의 영향을 받았고, 최근에는 우리나라 및 동북아시아 국가들의 급격한 산업화가 미세먼지의 주요 발생 원인으로 보고되고 있다(Myung, 2016).
초미세먼지(PM2.5)는 공기역학적 지름이 2.5 μm 이하인 미세먼지를 의미하며, 대기 오염 발생원에서 직접 배출되어지는 1차오염 물질과 대기에서 반응하여 생성되는 2차 대기오염 물질(NO3 -, SO4 -, NH4-, polyacromatichydrocarbon(PAH), quinone등)이 주를 이룬다(Kim 등, 2017). 세계보건기구(World Health Organization, 2013)에 의하면, PM10(공기역학적 지름이 10 μm 이하인 미세먼지)에 장기 노출될 경우 호흡기관 관련 질환과 사망률이 증가하게 되는데, PM2.5는 이보다 더 강한 위험 인자로 작용한다고 보고하였다.
지름 5~10 μg/m3이하의 먼지는 코 점막을 통해 체내에 흡수가 가능하며 2~5 μg/m3이하는 기도(호흡기)를 통과하고, 0.1~1 μg/m3는 폐포 손상까지 유발하게 된다. 미세먼지가 인체에 흡입되었을 경우, 충돌·중력침강·확산·정전기적 흡착 등과 같은 다양한 기전에 의해서 조직에 침착될 수 있으며, 일부는 혈액을 따라서 전신을 순환하기도 한다.
특히, 체내에 침착된 미세먼지는 산화적 스트레스와 염증 반응을 유도하고 호흡계 및 순환계 질환의 급성 악화 등을 유발하는 것으로 보고되고 있다(Myung, 2016). 또한, 후각상피세포를 거치면 혈관 뇌 장벽(Blood-Brain Barrier; BBB)을 거치지 않고도 뇌로 직접 도달 할 수 있으며, 자성을 띄는 입자의 경우 뇌조직에 직접 침착 됨으로써 미세아교세포(Microglia)를 활성화 하여 pro-inflammatory cytokines(IL-1, TNF-a 및 IFN-r) 등을 생산함으로써 뇌신경 염증을 유도하고 더 나아가 인지장애를 유도하는 것으로 보고되었다(Block, 2004). 따라서, 이러한 미세먼지로 유도될 수 있는 인체 내 산화적 스트레스 억제 및 염증반응을 억제시켜 줄 수 있는 천연 식품 소재에 대한 연구가 필요하다고 사료된다.
한편, 최근 육상자원고갈로 해양자원을 활용한 연구가 주목을 받고 있으며, 특히 해조류는 다양한 생리활성물질의 함유한 식품소재로서 연구 중요성이 대두되고 있다(Lee 등, 2017). 우리나라 연안에 분포하는 해조류는 약 600여 종이며 그 중 김은 2014년도 기준으로 397천 톤으로 전체 해조류의 36.2%으로 가장 높은 생산량을 가지고 있다. 참김(Porphyra tenera; P. tenera)은 보라털 목 보라털 과 김 속에 속하는 홍조류로 해태(海苔), 해의(海衣), 해우라고도 부르며, 아시아 지역인 우리나라, 일본, 중국 등지에서 널리 섭취되고 있다(Lee 등, 2017). 김에는 비타민 A, 칼슘 및 요오드를 포함하는 무기질, 콜레스테롤을 낮추는 타우린(taurine) 등이 풍부하며, 다른 해조류와 달리 트레오닌(threonine), 트립토판(tryptophan), 메티오닌(methionine)과 같은 필수 아미노산이 풍부하다. 더불어 단백질 함량이 높고 열량이 낮아 식물성 고단백식품으로 알려져 있다(An과 Koo, 2017; Noda, 1993). 또한, 김에 함유된 페놀성 화합물, 플라보노이드는 항산화 활성 및 아질산염 소거능을 가지는 것으로 보고되고 있다(Heo 등, 2006). 김에 존재하는 복합다당체에는 3,6-anhydro-L-galactose와 에스테르황산(ester sulfate)으로 구성된 포피란(porphyran)이 가장 대표적이며, 자일로스(xylose), 만노스(mannose)로 이루어진 헤미셀룰로스(hemicellulose)와 같은 김 고유의 복합당 또한 보고되고 있다(An과 Koo, 2017). 특히, 포피란(porphyran)이 나타내는 항산화, 대식세포(macrophage) 활성화, 혈중 콜레스테롤 저하, 항암, 면역활성 및 항염증에 대한 연구들이 보고되고 있으며, 식품 이상의 가치를 지닌 기능성 소재로의 가능성이 대두되고 있다(An과 Koo, 2017; Jiang 등, 2017; Lee 등, 2015). 따라서, 본 연구에서는 참김(Porphyra tenera)을 활용하여 초미세먼지에 노출된 다양한 세포 및 동물 조직에서 그 보호효과를 검증함으로써 초미세먼지 유도성 관련 염증성 질환 및 예방 소재로의 가능성을 확인하고 이를 산업화 기초자료로 활용하고자 하였다.
따라서, 본 연구에서는 비강 및 폐세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호효과, 동물실험에서의 항염증 효과 등을 검증함으로써 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환의 예방 및 치료용 조성물을 완성하기에 이르렀다.
KR 10-2008-0115315
본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위해, 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 하며, 더욱 상세하게는 참김 추출물이 비강 세포 및 폐 세포에서 발생되는 세포 독성에 대한 세포 보호 효과를 확인하고, 초미세먼지에 노출된 동물모델의 폐 조직에서 지질과산화 억제효과 및 염증 관련 단백질 발현량을 억제하는 것의 항염증 효과를 검증함으로써 초미세먼지로 인한 염증성 질환 중 폐질환의 예방 및 치료 효능을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “추출물”은 참김 건조분말에 증류수를 첨가하여, 35 내지 45℃에서 1 내지 3시간 동안 환류냉각기를 사용하여 추출하는 것 일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “추출물”은 휘발성 용제를 이용하여 유기용매 추출법에 의해 추출될 수 있고, 바람직하게는 80% 에탄올을 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “초미세먼지로 인한 염증성 폐질환”은 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초비강세포 또는 폐세포에서 세포 내 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제시키는 효과를 가지고, 초미세먼지(PM2.5) 유도성 비강세포 또는 폐세포에서 초미세먼지(PM2.5)로 인한 세포독성에 대한 세포 생존율이 증가되는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초미세먼지(PM2.5) 유도성 폐 조직에서 감소된 SOD(Superoxide dismutase)의 활성을 증가시키고, 감소된 글루타티온(Glutathione) 함량을 증가시키며, 말론디알데히드(Malondialdehyde, MDA)의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초미세먼지(PM2.5) 노출로 손상된 폐 조직의 미토콘드리아 손상을 개선시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 “조성물”은 초미세먼지(PM2.5)가 처리된 상태에서 손상된 폐 조직의 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α 및 MCP-1을 세포 외부로 방출 시켜 폐 조직의 염증 반응을 억제시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 참김(Porphyra tenera; P. tenera) 추출물은 초미세먼지로 인한 염증성 폐질환에 대해 예방, 개선 및 치료 효과가 뛰어나므로 초미세먼지로 인한 폐질환에 대한 예방 및 치료용 약학적 조성물, 초미세먼지로 인한 폐질환에 대한 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물 또는 초미세먼지로 인한 폐질환에 대한 예방 및 개선용 화장료 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 참김 추출물의 (A) RPMI-2650 및 (B) A549 세포에서 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 산화 스트레스에 대한 참김(Porphyra tenera)의 물 및 80 % 에탄올 추출물의 세포 내 ROS 함량을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 참김 추출물의 (A) RPMI-2650 및 (B) A549 세포에서 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 세포 독성에 대한 참김(Porphyra tenera)의 물 및 80 % 에탄올 추출물의 세포 생존력을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 참김 추출물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 폐 조직 내의 항산화물질 바이오마커(antioxidant biomarker) 측정을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 참김 추출물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 폐 조직에서의 미토콘드리아 활성 측정을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 참김 추출물의 초미세먼지(PM2.5)로 유도된 폐 조직에서의 항염증 효과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 참김 추출물의 주요한 생리활성물질을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물 제공을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 개선용 화장료 조성물 제공을 목적으로 한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는(w/w) %, 고체/액체는(w/v) %, 그리고 액체/액체는(v/v) %이다.
일 측면에서, 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 추출물은 당업계에 공지된 추출 및 분리방법을 사용하여 천연으로부터 추출 및 분리하여 수득한 것을 사용할 수 있으며, 본 발명에서 정의된 "추출물"은 적절한 용매를 이용하여 참김(Porphyra tenera)으로부터 추출한 것이며, 예를 들어, 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성용매 가용 추출물을 모두 포함한다. 상기 참김(Porphyra tenera)으로부터 추출물을 추출하기 위한 적절한 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 추출 방법으로는 열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 약학 조성물에는 유효성분 이외에 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경질, 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
또한, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제제이며, 주사용 제제의 용매로서 물, 링거액, 등장성 생리식염수 또는 현탁액을 들 수 있다. 상기 주사용 제제의 멸균 고정 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용할 수있으며 모노-, 디-글리세라이드를 포함하여 어떠한 무자극성 고정오일도 이러한 목적으로 사용될 수 있다.
또한, 상기 주사용 제제는 올레산과 같은 지방산을 사용할 수 있다.
일 측면에서, 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분인 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨,소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제(타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 상기 약학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 유효성분인 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공될 수 있다. 본 발명에서 '건강기능식품 조성물'이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 본 발명의 건강 기능성 식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다. 상기 '식품 첨가물 공전'에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료 제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다. 예를 들어, 정제 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강 기능성 식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다. 캅셀 형태의 건강 기능성 식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 본 발명의 유효성분을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다. 환 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다. 과립 형태의 건강 기능성 식품은 본 발명의 유효성분의 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
일 측면에서, 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 “화장료 조성물”은 상술한 본 발명의 참김(Porphyra tenera)에서 추출한 추출물의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체를 포함하여 제조할 수 있다.
본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 표피 각질형성세포의 증식을 통한 피부 재생 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 스킨, 로션, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 색조화장품, 선크림, 투웨이케이크, 페이스파우더, 콤팩트, 메이크업베이스, 스킨커버, 아이쉐도우, 립스틱, 립글로스, 립픽스, 아이브로우 펜슬, 화장수 등의 화장품 및 샴푸, 비누 등의 세정제에 적용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물에는 상기 참김(Porphyra tenera)에서 추출한 추출물 이외에 기능성 첨가물 및 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분이 추가로 포함될 수 있다. 상기 기능성 첨가물로는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 성분을 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물에는 또한, 상기 기능성 첨가물과 더불어 필요에 따라 일반적인 화장료 조성물에 포함되는 성분을 배합해도 된다. 이외에 포함되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 상기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
준비예 1. 참김( Porphyra tener a) 추출물의 제조
본 실험에 사용된 참김(Porphyra tenera)는 2018년 2월 전라남도 완도에서 채취된 것을 구입하였으며, 염분 및 불순물 제거를 위하여 흐르는 물에 수세하였다. 수세된 김은 동결 건조기(Ilshin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea)를 이용하여 건조시키고 분말화하여 냉동보관(-20°C)하였다. 참김 추출물은 건조분말 10 g에 물(증류수)과 80% 에탄올을 각각 500 mL를 첨가하여, 40℃에서 2시간 동안 환류냉각기를 사용하여 추출하였다. 추출물은 No.2 거름종이(Whatman Inc., Kent, UK)를 사용하여, 진공여과하였다. 여과액은 회전진공농축기(N-N series, EYELA Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축 후, 동결건조하여 냉동보관(-20°C)하며 실험에 사용하였다.
준비예 2. 동물실험 디자인
본 실험에 사용된 동물은 6주령의 수컷 BALB/c 마우스(Samtako, Osan, Korea)로부터 구입하였으며, 온도 22±2°C, 상대습도 50±5%를 유지하며 충분한 물과 사료를 지급하는 일정한 사육환경을 유지하였다. 모든 실험은 경상대학교 동물실험 윤리위원회(IACUC 승인번호: GNU-180927-M0050)의 승인하에 수행하였다. 실험동물은 반입 1주일 동안의 적응 기간을 거친 뒤 정상대조군(Normal control; NC), 미세먼지 노출군(PM2.5)및 참김 추출물 식이군으로 나누어 사육하였다. 미세먼지 군과 참김 추출물 식이 군은 whole body exposure 챔버 내에서 미세먼지에 노출시켰으며, 정상 대조군은 여과된 공기를 주입시켰다. 참김 물 추출물 (water extract from P. tenera; WP)과 참김 혼합물(80% ethanolic extract : water extract = 8:2; Mix)은 음용수에 녹인 후, 노출 전 50, 200 mg/kg of body weight 농도(WP50, WP200, Mix50, Mix200)로 경구 투여하였다.
실험예 1. 초미세먼지(PM 2.5 ) 유도의 항염증 효과( in vitro 실험)
1.1. 세포 배양
본 실험에 사용된 비강세포(RPMI-2650)는 한국세포주은행(Seoul, Korea)으로부터 구입하여, 10% fetal bovine serum(FBS) 및 1% 페니실린(50 units/mL)/스트렙토마이신(100 μg/mL)이 포함된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI1640) 배지를 사용하였다. 폐(A549)세포는 American type culture collection(ATCC, Manasas, VA, USA)로부터 구입하여, 10% bovine calf serum(CS) 및 1% 페니실린(50 units/mL)/스트렙토마이신(100 μg/mL)이 포함된 dulbecco's modified eagle medium(DMEM)를 사용하였다.
1.2. 초미세먼지(PM 2.5 ) 유도성 세포 내 ROS 생성 함량 측정
세포 내 ROS 생성억제 효과는 96 well plate에 1×104 cells/well로 분주하여, 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시간 후, 0.5% FBS 또는 CS가 포함된 배지로 교환하여 시료를 처리하고, 30분 후 초미세먼지(PM2.5)를 최종농도가 100μg/mL 되도록 전처리하여 24시간 동안 배양시켰다. 그 후, 50μM dichlorofluorescin diacetate(DCF-DA)를 처리하여 40분간 반응시켜 형광광도계(Infinite F200, Tecan, Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 485nm(excitation wave) 및 535 nm(emission wave)에서 형광강도를 측정하였다.
도 1a에 나타난 것과 같이 비강세포(RPMI-2650)에서 초미세먼지 처리군(325.99%)은 대조군(100.00%) 대비 약 3.26배 증가된 세포 내 ROS 함량을 나타냈으며, 양성대조군으로 사용된 비타민 C는 약 72.29%로 효과적인 세포 내 ROS 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 반면, 참김 추출물 처리군에서는 5μg/mL 이상의 농도에서 80% 에탄올 추출물이 물 추출물 대비 상대적으로 높은 세포 내 ROS 생성억제 효과를 나타냈으며, 50μg/mL 농도에서 80% 에탄올 추출물(143.03%)과 물 추출물(198.87%)은 초미세먼지에 대하여 효과적으로 비강세포 내 ROS 생성을 억제하는 것으로 나타났다.
도 1b에 나타난 것과 같이 폐세포(A549)에서 초미세먼지 처리군(596.70%)에서는 대조군(100.00%) 대비 약 5.97배 증가된 세포 내 ROS 함량을 나타냈으며, 양성대조군으로 사용된 비타민 C는 약 109.98%로 대조군과 유의적인 수준으로 세포 내 ROS 생성을 억제시켰다. 참김 추출물은 80% 에탄올 추출물이 물 추출물 대비 상대적으로 높은 ROS 생성억제 효과를 나타냈으며, 50μg/mL 농도에서 80% 에탄올 추출물(306.20%)은 물 추출물(374.14%) 대비 유의적으로 높은 ROS 생성억제 효과를 나타냈다.
1.3. 초미세먼지(PM 2.5 ) 유도성 세포독성에 대한 세포 생존율 측정
세포 생존율 측정은 시료와 초미세먼지를 전처리한 세포에 MTT stock solution(10mg/mL)을 처리하여, 2시간 동안 반응시켰다. 생성된 formazan crystal은 배지를 모두 제거하고 dimethyl sulfoxide를 첨가하여 20분간 상온에서 녹여낸 뒤 microplate reader(Epoch 2, Bio Tek Instruments inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여, 570nm(determination wave) 및 650nm(reference wave)에서 흡광도를 측정하였다.
도 2a에 나타난 것과 같이 비강세포(RPMI-2650)에서 초미세먼지 처리군(42.55%)에서는 대조군(100.00%) 대비 약 57.45%의세포 사멸을 나타냈으며, 양성대조군으로 사용된 비타민 C는 44.26%의 생존율을 나타냈다. 참김 물 추출물은 농도 50μg/mL(45.45%)에서 양성대조군과 유의적인 결과를 나타냈다. 반면, 80% 에탄올 추출물 20μg/mL(49.88%)에서 초미세먼지 처리군 대비 증가된 세포 생존율을 나타냈으며, 50μg/mL 농도에서는 오히려 감소된 세포 생존율을 나타냈다.
도 2b에 나타난 것과 같이 폐세포(A549)에서 초미세먼지 처리군(81.01%)로 대조군(100.00%) 대비 약 18.99%의 세포사멸이 유도되었으며, 비타민 C처리군은 92.79%로 증가된 세포생존율을 나타냈다. 반면, 참김 추출물은 2μg/mL 이상의 농도에서부터 점차 증가하는 세포 생존율을 나타냈으며, 물 추출물에서는 10μg/mL(97.56%)에서 대조군과 통계적으로 유의적인 결과를 80% 에탄올 추출물에서는 5μg/mL 농도에서 유의적인 결과를 나타냈다. 반면 80% 에탄올 추출물의 경우 50μg/mL에서는 오히려 감소된 세포 생존율을 나타냈다.
실험예 2. 폐 조직 내 antioxidant biomarker 측정
2.1. 폐 조직 내 Superoxide dismutase (SOD) 함량 측정
조직에 존재하는 superoxide dismutase(SOD) 활성 측정은 적출한 조직에 10배 부피의 PBS를 넣고 bullet blander로 균질화 한 후, 원심분리(400 ×g, 10분, 4℃)하여 상층액을 버리고 pellet을 취하였다. 1×Cell Extraction Buffer [10×SOD Buffer 1 mL, 20% triton X-100 0.2 mL, 증류수 8.8 mL, 200mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) 10μL]을 넣고 30분 동안 반응시킨 후, 원심분리(10,000 ×g, 30분, 4℃)하여 상층액을s[q 실험에 사용하였다. SOD 활성 평가는 SOD determination kit(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 사용하였으며 측정된 흡광도값을 표준곡선에 대입하여 SOD 활성 (U/mg protein)으로 나타냈다.
폐 조직내 SOD 활성을 측정한 결과, PM2.5노출군(1.49 U/mg of protein)은 정상 대조군(1.69 U/mg of protein) 대비 상대적으로 감소한 결과를 나타냈으며, 물 추출물 식이군(WP200; 1.85 U/mg of protein)과 혼합물 식이군(Mix200; 1.70 U/mg of protein)에서는 항산화 효소인 SOD의 활성이 증가됨을 확인 할 수 있었다(도 3a).
2.2. 폐 조직 내 Reduced glutathione (reduced GSH) 함량 측정
조직에 존재하는 reduced GSH 함량 측정은 적출한 조직에 10배 부피의 인산 완충용액을 넣고 균질화 후, 원심분리 (10,000 ×g, 15분, 4℃)하여 얻어진 상층액을 실험에 사용하였다. 상층액에 30% metaphosphoric acid를 넣어 2,000 ×g에서 원심분리하였고, 상층액을 얻어 0.26 M Tris-HCl용액(pH 7.8)과 0.65 N NaOH, 1 mg/mL 농도의 OPT을 넣고 15분 동안 상온에서 빛을 차단하여 반응시킨 뒤, 형광 광도계를 사용하여 excitation wave 320nm 및 emission wave 420 nm에서 형광강도를 측정하였다. Reduced GSH 함량은 측정된 값을 표준곡선에 대입하여nmole/mg of protein으로 나타내었다.
폐 조직에서 reduced glutathione 함량을 측정한 결과 PM2.5노출군(2.27 nmole/mg of protein)은 정상 대조군(4.04 nmole/mg of protein) 대비 상대적으로 감소한 결과를 나타냈으며, 김 물 추출물 식이군(WP200; 4.19 nmole/mg of protein)은 정상대조군 수준으로 개선된 효과를 나타냈다(도 3b).
2.3. Malondialhehyde (MDA) 함량 측정
조직에서의 지질과산화 정도를 평가하기 위하여, MDA함량을 측정하였다. 조직 무게의 10배에 해당하는 PBS를 넣고 균질화한 후 원심분리(6,000 ×g, 10분, 4°C) 하여 상등액을 취해 실험에 사용하다. 추출한 마우스 조직 균질액에 1% phosphoric acid를 혼합한 후 0.67% thiobarbituric acid를 넣고 95°C에서 1시간 동안 반응시켰다. 해당 반응액은 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며, MDA 함량은 nmole/mg protein의 농도로 표시하였다.
조직 내 지질과산화 생성 지표인 MDA 함랑을 측정한 결과, PM2.5노출군(9.84 nmole/mg of protein)은 정상 대조군(8.05 nmole/mg of protein) 대비 상대적으로 증가된 결과를 나타냈다. 반면, 혼합물 식이(Mix200; 9.05 nmole/mg of protein)는 다소 감소된 함량을 확인 할 수 있었다(도 3c).
실험예 3. 폐 조직에서의 미토콘드리아 활성 측정
3.1. 조직 내 미토콘드리아 분리
미토콘드리아 분리를 위하여 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA)가 포함된 isolation buffer [215 mM mannitol, 75 mM sucrose, 0.1% BSA, 20 mM HEPES(Na+),pH7.2]를 첨가하여 균질화 한다. 균질화 된 조직은 원심분리(1,300 ×g, 5분, 4°C)하고, 상층액을 다시 원심분리(13,000 ×g, 10분, 4°C)하였다. Pellet에 1 mM EGTA와 0.1% digitonin이 포함된 isolation buffer를 첨가하여 5분동안 얼음 위에서 반응시키고, 원심분리(13,000 ×g, 10분, 4°C)하였다. Pellet에 isolation buffer를 첨가하여 원심분리(10,000 ×g, 15분, 4°C)하여 최종 pellet을 조직의 미토콘드리아로 활용하여 실험하였다.
3.2. 미토콘드리아 내 Reactive oxygen species (ROS) 함량 측정
미토콘드리아 ROS 함량은 분리된 미토콘드리아 추출물을 KCl-based respiration buffer [125 mM 염화칼륨, 2 mM 인산칼륨, 20 mM HEPES, 1 mM 염화마그네슘, 500μM EGTA, 2.5 mM malate 및 5 mM pyruvate]와 25 μM DCF-DA를 20분간 반응시킨 후, 형광광도계를 이용하여 excitation wave 485 nm와 emission wave 535 nm에서 형광강도를 측정함으로써 평가하였다.
미세먼지 노출로 유도된 폐 조직의 미토콘드리아 손상에 대한 개선효과는 도 4와 같다. 폐 조직으로부터 분리된 미토콘드리아 ROS 함량을 측정한 결과, 정상 대조군(100.00%) 대비 PM2.5노출군(141.84%)에서는 상대적으로 증가된 결과를 나타냈다. 물 추출물 식이군(WP200)과 혼합물 식이군(Mix200)에서는 각각 107.71% 및 89.19%로 효과적으로 미토콘드리아 내 ROS의 생성을 억제시키는 것으로 나타났다(도 4a).
3.3. 미토콘드리아 막 전위 측정 (Mitochondria membrane potential; MMP)
미토콘드리아 막 전위(MMP) 측정은 분리된 미토콘드리아에 assay 용액[5 mM pyruvate, 5 mM malate in isolation buffer]과 1 μM 5,5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1) dye를 black 96 well에서 혼합하여, 암실에서 20분간 반응시킨다. 반응 후, 형광광도계를 이용하여 530 nm (excitation wave) 및 590 nm (emission wave)에서 형광강도를 측정하였다.
미토콘드리아 막 전위(MMP) 측정 결과는 도 4b와 같다. PM2.5노출군(79.15%)이 정상대조군 대비 (100.00%) 약 20.85% 감소된 결과를 나타냈으며, 물 추출물 식이군 (WP200; 90.70%) 및 김 혼합물 식이군 (Mix200; 94.22%)에서는 PM2.5노출군 대비 다소 미토콘드리아 막 전위가 회복된 결과를 나타냈으나 통계적으로 유의적인 차이는 나타나지 않았다(도 4b).
3.4. 미토콘드리아 내 ATP 함량 측정
미토콘드리아 내 ATP 함량은 분리된 미토콘드리아에 1% TCA 용액을 첨가하여 얼음 위에서 방치한 후, 25 mM sodium acetate buffer (pH 7.4)를 첨가한다. 상층액은 ATP level은 ENLITEN®ATPassaysystemkit(Promega,Madison,WI,USA)를 사용하여 luminometer (Promega)에서 측정하였다.
ATP 함량을 측정한 결과에서는 PM2.5노출군(63.52%)이 정상대조군(100.00%) 대비 약 36.48% 감소된 함량을 나타냈다. 반면, 물 추출물 식이군(WP200; 82.27%)은 미세먼지 노출로 인한 미토콘드리아 내 ATP 함량을 다소 증가 시키는 것으로 나타났다(도 4c).
3.5. Western blot법을 활용한 단백질 발현측정
조직에서의 단백질 발현은 1% protease inhibitor cocktails (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)이 함유되어 있는 ProtinExTMAnimalcell/tissue(GeneAllBiotechnology,Seoul,Korea)로 균질화 시켰다. 균질액은 원심분리(13,000 ×g, 12분, 4°C) 시킨 후, 상층액은 Bradford 시약(Bio-rad)을 사용하여 동량의 단백질이 되도록 맞추었다. 이 후, Laemelli buffer (5X)를 첨가하여 95°C에서 5분간 반응시켜, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel(SDS-PAGE)을 통하여 분리하다. 분리된 단백질은 polyvinylidene difluoride membrane (Millipore, Billerica, MA, USA)으로 transfer시켜 5% 탈지유를 사용하여 blocking 하였다. Blocking시킨 membrane은 4°C에서 1:1000로 희석한 1차 항체 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)와 함께 반응시켰다. Overnight 후, membrane을 1:5000로 희석한 2차 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 반응시켰고, ProNA™ ECL Ottimo (TransLab, Daejeon, Korea)를 첨가하여 ChemiDoc (Korea Biomics, Seoul, Korea)를 통해 검출하였다.
미토콘드리아의 기능저하는 세포의 apoptosis pathway의 활성화를 유도함으로써 조직의 기능저하를 유도하는 것으로 알려져 있다. 미토콘드리아 기능저하에 따른 ATP/ADP의 감소는 p-AMPKα의 증가를 유도하고, p-Akt의 발현이 감소시킴으로써 Bcl-2의 발현을 저하시키게 된다. 이러한 Bcl-2의 감소는 미토콘드리아 내부의 cytochrome C를 cytosol 로 방출시켜, caspase-3의 활성화를 유도하고 세포의 apoptosis를 유발시키게 된다. 미세먼지에 노출된 폐 조직은 미토콘드리아 기능저하로 인해 ATP의 감소가 p-AMPKα의 증가로 이어졌으며, p-Akt와 Bcl-2의 발현을 감소시킴으로써 caspase-3의 발현을 증가시키는 것으로 나타났다(도 4d 및 도 4e). 반면, 물 추출물 식이군 (WP200)은 이러한 미세먼지 유도성 미토콘드리아 관련 apoptosis 단백질(p-AMPKα, Bcl-2, p-Akt, caspase-3)을 효과적으로 조절하는 것으로 나타났다(도 4d 및 도 4e). 김 혼합물 식이군 (Mixture 200)에서는 p-AMPKα의 발현량은 증가하였지만, Bcl-2, and cleaved caspase-3 단백질은 효과적으로 조절하는 것으로 나타났다.
실험예 4. 초미세먼지(PM 2.5 )에 노출된 마우스 폐 조직에서의 항염증 효과
염증성 cytokine(IL-1β, IL-6, IL-12(p70), IFN-γ, MCP-1 TNF-α) 분석은 Milliplex MAP mouse high sensitivity T cell magnetic bead panel kit (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)를 사용하였으며, MAGPIXⓡ instrument (Luminex Corporation, Austin, TX, USA) 분석장비와 xMAP technology and xPONENT 4.2 software를 활용하여 분석하였다.
폐 조직에서의 미세먼지 유도성 염증반응에 대한 효과를 측정한 결과는 도 5와 같다. 미세먼지 노출로 인하여 toll-like receptor(TLR)-4의 발현을 증가시킴으로써 염증반응이 개시되는 것을 확인하였다. TLR-4의 발현은 p-c-Jun N-terminal kinases(JNK)의 발현과 inhibitor kappa B-alpha(IκB)의 인산화를 유도하였고, nuclear factor(NF)-κB 경로 및 inflammasome의 형성을 통한 caspase-1 활성화를 유도하는 것으로 나타났다(도 5a 및 도 5b). NF-κB 경로 활성화와 inflammasome의 형성은 염증성 cytokine (IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α 및 MCP-1)들을 세포 외부로 방출시키는 것으로 나타났다(도 5c). 물 추출물 식이군(WP200)은 혼합물 식이군(Mix200) 대비 상대적으로 미세먼지 유도성 염증반응에 대하여 효과적으로 NF-κB 경로의 활성 및 inflammasome의 형성 억제시키는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 최종적으로 염증성 cytokine들의 방출을 효과적으로 조절함으로써, 폐 조직의 염증 반응 억제 및 기능 개선에 도움을 줄 수 있는 것으로 나타났다.
실험예 5. 주요생리활성 물질 분석
5.1. 총 polysaccharide 함량 측정
참김 추출물에 함유되어 있는 총 polysaccharide 함량은 페놀-황산(Phenol-sulfuric acid)법을 변형하여 측정하였다. 추출물에 5% phenol 용액, 진한 황산을 넣어 20분간 실온에 방치한 후 470 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질 glucose 이용하여 표준곡선을 작성하고, 이에 대입하고 계산하여 나타냈다.
5.2. 평균 분자량(Molecular weight; Mw) 측정
참김 추출물의 평균 분자량은 gel permeation chromatography (HLC-8320, Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)를 이용하여 측정하였다. 시료는 증류수에 용해시켜 0.45 μm Nylon filter (Millipore Co., Bedford, MA, USA)로 여과하였다. Tskgel guard PWxl, 2 x TSKgel GMPWxl, TSKgel G2500PWxl (7.8 x 300 mm, Tosoh Bioscience, Stuttgart, Germany)가 결합된 column을 사용하여 0.1 M NaNO3를 이동상으로 하여 1 mL/min으로 RI-detector로 분석하였다.
5.3. Sulfate 함량 측정
참김 추출물 0.2 mL에 4% TCA용액 3.8 mL 및 BaCl2-gelatin시약 1 mL를 첨가하여 교반하고 20분간 방치한 후 360nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선은 K2SO4로 작성하여 황산기 함량을 정량하였다.
5.4. 구성당 분석
참김 추출물에 함유되어 있는 구성당 분석은 HPAEC-PAD system (Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 시료는 Trifluoroacetic acid로 가수분해한 후, 동결건조하고 증류수에 용해시켜 0.45 μm membrane filter (Millipore Co., Bedford, MA, USA)로 여과하였다. CarboPacTM PA1 column (0.4 X 25 cm, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하여 18 mM NaOH/200 mM NaOH를 이동상으로 하여 1 mL/min으로 RI detector로 분석하였다. 구성당의 동정·확인은 당류 표준품(Fucose, Rhamnose, Galactose, Glucose, Xylose)의 머무름시간(retention time, Rt)과 비교·검증하여 나타내었다.
5.5. 결과
물 추출물에 함유된 총 polysaccharide 함량과 구성성분(sulfate 및 구성당)을 측정한 결과는 하기 표 1과 같다. 총 polysaccharide 함량은 46.23%으로 나타났으며, 평균 분자량은 220.49 kDa로 나타났다. Sulfate 함량은 43.25%, 상대적인 구성당의 비율은 galactose(44.24%) > xylose(23.18%) > rhamnose(7.83%) > fructose(6.52%) 순으로 나타났다.
Total polysaccharide (%)
Mw (kDa)
sulfate (%) 		Relative Area (%)
Fucose Rhamnose Galactose Glucose Xylose Others
46.23 ± 0.39 220.49 43.25 6.52 7.83 44.24 - 23.18 18.23
5.6. UPLC Q-TOF MS를 활용한 주요생리 활성 분석
주요 생리활성 물질을 동정하기 위해 UPLC IMS-QTOF/MS (Vion, Waters, Milford, MA, USA)를 이용하여 분석하였으며. 시료는 50% 메탄올에 용해한 후 0.2 μm filter를 이용하여 여과하였다. 컬럼은 C18 column (100×2.1 mm, 3.5 μm, Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하였으며, 이동상 용매로는 0.1% formic acid가 혼합된 3차 증류수(A)와 0.1% formic acid가 혼합된 acetonitrile(B)을 사용하였고, B 용매의 비율 조건은 다음과 같다: 0.1-25% 0-2분, 25-50% 2-8분으로 총 8분간 분석하였다. Electrospray ionization (ESI)의 positive ion 모드를 사용하여 다음 조건으로 수행되었다: 시료 온도, 100°C; desolvation line 온도. 400°C; 램프 충돌 에너지. 10-30 v; 모세관 전압, 2.5 kV. 검출된 물질들은 50-1500 m/z 범위 내에서 분석되었다.
참김 물 추출물의 주요한 생리활성물질을 분석한 결과는 도 6 및 표 2와 같다. Peak 1과 Peak 2 (0.85, 1.58 min); porphyra-334 isomer (m/z 347.1450; 303, 244, 227, 186), Peak 3 (4.36 min); palythene (m/z 285.1438; 241, 197), Peak 4 (4.93 min); palythenic acid (m/z 329.1333; 279, 253, 233, 205, 187, 150), Peak 5 (9.92 min); pheophorbide a(m/z 593.2760; 533, 460, 447)으로 5가지 물질이 동정 및 검출되었다. porphyra-334, palythene, palythenic acid는 해조류에 존재하는 것으로 알려진 mycosporine-like amino acids 계열의 생리활성물질이며, phaophorbide a는 chlorophyll a 유래의 항산화물질로 확인되었다.
Retention time
(min) 		ESI+
( m / z ) 		Collision
energy
(eV) 		Fragment ion Identified compounds
0.85 347.1450 25 303, 244, 227, 200, 186 porphyra-334 isomer
1.58 347.1450 25 303, 244, 227, 200, 186 porphyra-334 isomer
4.36 285.1438 25 241, 197 palythene
4.93 329.1333 20 279, 253, 233, 205, 187, 150 palythenic acid
9.92 593.2760 40 533, 460, 447 pheophorbide a
실험예 6. 통계처리
모든 실험은 반복 실행 후, mean±SD로 나타냈다. 실험 결과의 통계적 유의성은 SAS software (version 9.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 평균값에 대한 유의성 검증은 one-way analysis of variance (ANOVA)에 의하여 계산되었으며, 각 그룹 간의 유의성은 Duncan의 다중범위검정법(Duncan’s new multiple-range test)으로 유의차를 5% 수준(p < 0.05)에서 검증하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다.
본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 참김 건조분말에 증류수를 첨가하여, 35 내지 45℃에서 1 내지 3시간 동안 환류냉각기를 사용하여 추출하는 것인, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 추출물은 휘발성 용제를 이용한 유기용매 추출법을 이용하여 추출한 것인, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 유기용매 추출법은 80% 에탄올을 이용한 것인, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 폐질환은 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종, 만성 폐쇄성 폐 질환 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나인 것인, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 초미세먼지(PM2.5) 유도성 비강세포 또는 폐세포에서 세포 내 활성산소(reactive oxygen species, ROS)의 생성을 억제시키는 효과를 가지고, 초미세먼지(PM2.5) 유도성 비강세포 또는 폐세포에서 초미세먼지(PM2.5)로 인한 세포독성에 대한 세포 생존율이 증가되는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 초미세먼지(PM2.5) 유도성 폐 조직에서 감소된 SOD(Superoxide dismutase)의 활성을 증가시키고, 감소된 글루타티온(Glutathione) 함량을 증가시키며, 말론디알데히드(Malondialdehyde, MDA)의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 초미세먼지(PM2.5) 노출로 손상된 폐 조직의 미토콘드리아 손상을 개선시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 초미세먼지(PM2.5)가 처리된 상태에서 손상된 폐 조직의 염증성 사이토카인 IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ, TNF-α 및 MCP-1을 세포 외부로 방출 시켜 폐 조직의 염증 반응을 억제시키는 것을 특징으로 하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  10. 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 개선용 건강기능식품 조성물.
  11. 참김(Porphyra tenera) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 초미세먼지(PM2.5)로 인한 염증성 폐질환 예방 및 개선용 화장료 조성물.
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