KR20210086547A - 골수세포로의 분화 유도를 위한 조성물과 방법 및 이의 용도 - Google Patents

골수세포로의 분화 유도를 위한 조성물과 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

체세포로부터 골수세포(myeloid cell)로의 직접 교차분화 유도하기 위한 조성물과 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 단일 직접 교차분화 유도 인자의 발현을 통해 유도 만능 줄기세포의 전분화능(Pluripotency) 단계를 거치지 않고 효율적으로 체세포로부터 골수세포로의 분화를 유도할 수 있어, 면역 질환에 대한 효과적인 예방 및 치료제로서 널리 활용될 것이다.

Description

골수세포로의 분화 유도를 위한 조성물과 방법 및 이의 용도{Composition and method for inducing myeloid cell and use thereof}
체세포로부터 골수세포(myeloid cell)로의 직접 교차분화 유도를 위한 조성물과 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
기존의 배아 줄기세포 및 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cells)를 이용한 골수세포(myeloid cell) 분화 방법은 배아를 파괴하여 배아 줄기세포를 확립하거나 체세포에서 유도 만능 줄기세포로 리프로그래밍(Reprogramming)한 후에 골수세포로의 분화(Differentiation) 단계를 거쳐야 제작할 수 있었다. 이러한 종래의 방법은 배아 줄기세포를 이용한다는 점에서 윤리적 문제가 발생할 수 있으며, 유도 만능 줄기세포를 이용할 경우 분화를 수행하는 단계에 있어서 시간적, 금전적 비용과 노력이 소요되고, 인위적인 분화능의 조절이 용이하지 않으므로 수율이 낮아 비효율적이라는 문제점이 있었다. 또한, 시험관(in vitro) 수준에서 약물 대사와 독성 검증에 요구되는 충분한 수의 세포를 확보하기 어렵고, 골수세포 기능 재생을 위한 세포 치료를 적용 단계에서 미분화세포로부터 유래한 기형종(teratoma)이 형성될 가능성이 높아 안전성의 문제점도 있었다.
상기와 같은 기형종 형성의 위험성을 없애기 위하여, 만능 줄기세포 상태를 통하지 않고 체세포를 다른 계통의 체세포로 또는 다분화능 줄기세포로 직접 교차분화(direct conversion)하기 위한 연구가 진행되고 있으나, 이러한 직접 교차분화 과정의 유도를 위해 사용된 유전자의 수가 너무 많아 자세한 기작을 규명하기 어렵기 때문에 현재까지 밝혀진 수준이 미미한 상태이다. 또한, 체세포로부터 특정 유전자만을 발현시켜 골수세포를 제조하는 방법은 아직까지 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 체세포에서 골수세포로의 직접 교차분화 방법에 관한 연구를 수행하던 중 단일 유전자인 FLI1(Friend leukemia (virus) integration 1, ETS transcription factor)를 체세포에 도입하여 이소성 발현을 유도하면 효과적으로 체세포를 골수세포로 직접 교차분화 할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은, 체세포에 특정 유전자의 도입 또는 특정 단백질의 발현을 통하여 골수세포(myeloid cell)로 직접 교차분화를 유도하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
다른 목적은, 상기 조성물을 이용하여 시험관 내에서 체세포를 골수세포로 직접 교차분화하는 방법을 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 방법에 의해 직접 교차분화 유도된 골수세포를 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 조성물을 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 골수세포를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공하는데 있다.
또 다른 목적은, 상기 골수세포를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝용 조성물을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 일 양상은 (1) FLI1(Friend leukemia (virus) integration 1) 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 체세포로부터 골수세포(myeloid cell)로의 직접 교차분화 유도용 조성물을 제공한다.
용어 "직접 교차분화(Direct Conversion)"는 고등생물에서 전혀 다른 세포 타입을 가지는 성숙한(분화가 끝난) 세포간의 전환을 유도하는 과정을 말한다. 이는 체세포를 유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs)로 리프로그래밍 하고 이를 재분화하여 목적하는 세포로 만들어야 하는 종래 기술과 달리, 배아 줄기세포(embryonic stem cells) 및 유도 만능 줄기세포와 같은 만능 줄기세포 단계를 거치지 않고 바로 목적하는 세포로의 전환을 유도한다는 점에서 차이를 가지며, 현재 직접 교차분화는 질병 모델링과 신약 개발 등에 이용될 가능성을 인정받고 있어 유전자 치료 및 재생 의학 등에도 응용될 수 있는 기술로 알려져 있다.
일 양상에서 제공되는 직접 교차분화 유도용 조성물은 (1) FLI1(Friend leukemia (virus) integration 1) 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다. 또한 일 양상에서 제공되는 직접 교차분화 유도용 조성물은 FLI1 단백질을 포함할 수 있다.
일 구현예로 FLI1(Friend leukemia (virus) integration 1) 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 체세포에 도입하여 골수세포로 직접 교차분화되는 것을 확인할 수 있다.
용어 "벡터"는 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 전달체를 의미할 수 있다.
상기 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.
또한, 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예로, 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다.
상기 FLI1 단백질은 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 모든 FLI1 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 사용 가능한 FLI1 단백질은 이들의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 FLI1 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 변이체(예컨대, 각 단백질의 아형(subtype)들)를 포함할 수 있다.
상기 FLI1 단백질의 변이체란 FLI1 단백질의 천연 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 천연 아미노산 서열과 상이한 서열을 가지면서 천연(wild-type) 단백질의 고유의 생물학적 기능을 유지하는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있고, 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.
상기 FLI1 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 분리되거나, 재조합적 또는 합성적으로 제조된(non-naturally occurring) 것 일 수 있다.
또한, 상기 FLI1 단백질을 코딩하는 핵산은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 FLI1 단백질을 코딩하는 염기서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 FLI1 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA (mRNA) 분자일 수 있다.
용어 "체세포" 생식세포를 제외한 모든 세포를 의미하는 것일 수 있으며, 예컨대, 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 것 또는 분리된 것일 수 있다.
상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포, 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 신경 줄기세포, 조혈모 줄기세포, 제대혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예로, 섬유아세포를 사용할 수 있다.
용어 "골수세포(myeloid cell) "는 발육 과정에 있어 전골수구와 후골수구 사이의 중간세포로서 과립구계열의 전구체로서, 골수아구, 전골수구를 거쳐 골수구가 되고, 다시 후골수구, 간상핵구, 분엽핵구로 성숙하는 세포를 의미한다.
상기 골수세포는 단핵구 전구세포(monocyte progenitor cells), 단핵구(monocytes), 대식세포(macrophages), 수지상세포(Dendritic cells), 거대핵세포(megakaryocytes), 및 혈소판(platelets)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예로, 단핵구 전구세포 일 수 있다.
용어 "단핵구 전구세포(monocyte progenitor cell)"는 사람의 백혈구 중 4~8%를 차지하며 단핵세포로 골수나 비장의 조혈간세포로부터 발생하는 무과립백혈구의 일종으로, 대식세포계 세포의 특정 분화 단계에 있는 세포로서, 골수에서 조혈간세포, 단아구, 전단구를 거쳐 단구로 분화 및 성숙하여 혈액 내에 유출된 후 조직으로 이행하여 대식세포(macrophage), 조직구, 랑게르한스세포, 수지상세포(dendritic cell)등으로 분화하여 세망내피계를 이룰 수 있는 세포를 의미한다.
용어 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형성을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않은 증식이 가능한 미분화 친세포를 의미한다.
또한, 용어 "유도된 단핵구 전구세포", "iMac" 및 "iMOP"는 예를 들어, 일 양상에 따른 직접 교차분화를 통하여 체세포로부터 유도된 단핵구 전구세포를 의미할 수 있다.
다른 양상은 (1) FLI1(Friend leukemia (virus) integration 1) 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 체세포에 접촉 또는 삽입시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 체세포를 골수세포로 직접 교차분화하는 방법을 제공한다.
상기 직접 교차분화 방법은 체세포를 배지에서 배양하는 단계, 상기 배양한 체세포에 FLI1 유전자를 삽입한 벡터를 형질전환(transformation)시키는 단계 및 상기 감염된 체세포를 직접 교차분화를 유도할 수 있는 배양 조건에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 체세포의 배양에 사용되는 배지는 당해 분야에서 체세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.
또한, 상기 체세포를 골수세포로 직접 교차분화 유도할 수 있는 배양 조건은 당해 분야에서 체세포에 대하여 직접 교차분화를 유도하는 데 통상적으로 사용되는 배지 및/또는 통상적인 배양 조건을 포함할 수 있다.
상기 직접 교차분화 유도용 조성물을 체세포에 도입하는 단계를 통하여, 직접 교차분화인자인 FLI1의 이소성 발현(Ectopic expression)을 유도할 수 있다. 이소성 발현이란, 어떤 유전자가 원래 발현하는 조직이나 세포 외에서 발현하는 것, 또는 원래 발현하는 시기와 다른 시기에 발현하는 것을 의미한다. 일 양상의 방법에 따르면 체세포로부터 골수세포가 효과적으로 제조될 수 있다.
또 다른 양상은 (1) FLI1(Friend leukemia (virus) integration 1) 단백질; (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및 (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 체세포에 접촉 또는 삽입시켜 직접 교차분화 유도된 골수세포를 제공한다.
일 양상에 따른 조성물 또는 방법에 의하여 유도된 골수세포는 유래된 본래 체세포 특이적 마커를 발현하지 않으면서 골수세포 특이적 마커를 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다.
또한, 상기 유도된 골수세포는 포식작용 능력이 있으며, 대식세포 등의 면역 반응성 세포로의 분화능이 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
일 양상에 따라 제조된 골수세포는 면역계에서 필수적인 역할을 하므로 면역 질환으로 인한 질병의 예방 또는 치료에 적용될 수 있다.
용어 "예방"은 면역 질환의 병인을 제거하거나 조기 발견하여 해당 질환을 막는 모든 행위를 의미한다.
용어 "치료"는 면역 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
예방 또는 치료가 가능한 상기 면역 질환은 예컨대 자가면역질환, 이식거부, 관절염, 이식편대숙주병, 세균감염, 패혈증 및 염증으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 상기 면역 질환은 구체적으로 예를 들면 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증, 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후근(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 면역계의 기능 저하, 소실, 및/또는 비정상적 기능에 의하여 야기되는 모든 질병 및/또는 병적 증상을 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 유도된 골수세포와 함께 면역 질환 예방 또는 치료 효과를 가지는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약학적으로 허용 가능한 첨가제로는 예컨대 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 약학 조성물에 대해 0.1 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 예컨대 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위하여 일 양상에 따른 직접 교차분화 유도된 골수세포는 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때 예를 들어 약 1,000~10,000 세포/회, 1,000~100,000세포/회, 1,000~1000,000 세포/회, 1,000~10,000,000, 1,000~100,000,000 세포/회, 1,000~1,000,000,000세포/회, 1,000~10,000,000,000 세포/회로, 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회에 분할 투여할 수도 있고, 일정 시간 간격으로 여러 번 투여할 수 있다.
상기 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육 또는 피하 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
용어 "개체"란 면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
상기 약학 조성물은 면역 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 직접 교차분화 시켜 유도된 골수세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 세포 치료제를 제공한다.
용어 "세포 치료제"는 조직의 기능을 복원하기 위하여 자가(autologous), 동종(allogenic), 이종(xenogenic) 세포를 이용한 치료제로, 면역 질환의 예방 또는 치료를 위해 사용되는 치료제를 의미한다. 상기 직접 교차분화 유도된 골수세포를 유효성분으로 포함하면 면역 질환의 예방 또는 치료를 위한 세포 치료제로 활용할 수 있다.
상기 세포 치료제는 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 예컨대 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, HSA(Human serum albumin) 및 이들 성분 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 세포 치료제는 예컨대 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가할 수 있으며, 예컨대 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화 할 수 있다.
또 다른 양상은 직접 교차분화 유도된 골수세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝용 조성물을 제공한다.
상기 면역 질환의 예방 또는 치료 약물 스크리닝용 조성물을 면역 질환의 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 일 양상에 따른 유도된 골수세포의 반응성을 확인하는 방법으로 면역 질환의 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 예를 들어, 일 양상에 따른 유도된 골수세포를 면역 질환의 회복 또는 치료에 중요한 세포로서 후보 물질에 대한 독성 또는 약효를 평가하는데 사용할 수 있다.
상기 독성의 평가는 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 또는 일 양상에 따른 유도된 골수세포의 IC50 등 당업계에서 통상적으로 독성을 판단하는 방법에 따라 평가할 수 있다. 또한, 상기 약효의 평가는 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 일 양상에 따른 유도된 골수세포가 손상된 면역 세포의 재생, 또는 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell)와 같은 면역 세포로의 분화능을 촉진하는 등 당업계에서 면역 질환의 치료에 효과가 있음을 확인할 수 있는 방법에 따라 평가할 수 있다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
일 양상에 따른 체세포로부터 골수세포(myeloid cell)로의 직접 교차분화 유도용 조성물을 이용하면 단일 직접 교차분화 유도 인자의 발현을 통해 유도 만능 줄기세포의 전분화능(Pluripotency) 단계를 거치지 않고 효율적으로 체세포로부터 골수세포로의 분화를 유도할 수 있어, 면역 질환에 대한 효과적인 예방 및 치료가 가능하다.
또한, 다른 양상에 따른 체세포로부터 골수세포 직접 교차분화 유도 방법에 의하여 제조된 골수세포는 대식세포(macrophage) 및 수지상세포(dendritic cell)와 같은 면역 세포로의 분화능을 가지므로, 환자 특이적인 면역 세포의 제작을 통하여 면역 거부 반응을 배제할 수 있어 면역 질환 치료 분야에서 널리 활용될 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 단핵구 전구세포 유도 과정의 모식화(도 1A) 및 단핵구 전구세포 유도 과정에서 수득한 세포의 세포 형태(도 1B)이다.
도 2는 일 양상에 따른 유도된 단핵구 전구세포(iMac), 마우스 섬유아세포 및 골수 유래의 단핵구 전구세포(BMDM)의 CD11b 및 F4/80 항체에 대한 유세포 분석을 수행한 결과이다.
도 3은 일 양상에 따른 유도된 단핵구 전구세포에 대하여 면역세포화학염색을 수행하여 CD45, CX3CR1, CD11b, IBA-1의 발현 여부를 확인한 결과이다.
도 4는 일 양상에 따른 유도된 단핵구 전구세포의 포식작용 능력을 확인한 결과이다.
도 5는 일 양상에 따른 유도된 단핵구 전구세포를 활성화시킨 후, 세포 모양 변형과 면역 반응에 관련된 유전자 발현량의 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 염증성 장 질환 동물 모델에 일 양상에 따른 유도된 단핵구 전구세포 또는 활성화된 대식세포를 이식한 후, 생존률 및 체중 변화(도 6A), 질환 활성도(도 6B), 대장 길이(도 6C), 조직학적 점수(도 6F) 및 장 조직의 H&E 염색(도 6D) 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실험예 및 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실험예 및 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 범위가 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 및 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 클로닝 및 렌티바이러스 플라스미드의 패키징
전사 인자(FLI1)를 HepG2의 cDNA를 이용하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR)으로 증폭시켰다. 이후, 증폭된 FLI1를 렌티바이러스 벡터에 도입하고 염기 서열 분석으로 이를 확인하였다. 렌티바이러스의 패키징을 X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent(Roche, 06365787001)를 사용하여 렌티바이러스 트랜스퍼 플라스미드(lentiviral transfer plasmid), 패키징 플라스미드(packaging plasmid, psPAX2) 및 엔벨로프 플라스미드(envelope plasmid, VSV-G)를 각각 3 대 2 대 1 비율로 첨가하여 수행하였다. DMEM(Gibco, 10313-021)을 첨가하여 총 부피를 200 ㎕로 한 혼합물을 50% 컨플루언시(confluency) 상태의 293T 세포(Thermo Fisher Scientific)에 처리하여 48시간 동안 형질전환시켰다. 이후, 세포 배양 배지를 초원심분리기에서 1시간 30분 동안 80,000 g로 원심 분리하였으며, 이후 원심 분리된 상등액에서 수득한 렌티바이러스 펠렛을 1 ㎖의 DMEM에 희석하였다.
실시예 2. RNA 추출 및 cDNA 합성
세포 용해물의 total RNA를 RiboEX(Geneall, 301-001)로 추출하였다. RNA 추출은 제조사의 프로토콜에 따라 수행하였다. 총 20 ㎕의 반응 혼합물에 500 ng의 RNA 및 oligo-dT 프라이머를 첨가하여 M-MuLV-역전사효소(NEB, M0253L)로 cDNA를 합성하였다.
실시예 3. 면역세포화학염색
세포를 실온에서 10분 동안 4% 파라 포름 알데히드(Tech & Innovation, BPP-9004)로 고정시켰다. 고정된 세포를 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS, Corning, 21-031-CV)로 3번 세척하였다. 이후, 실온에서 10분 동안 0.1% Triton X-100(Sigma, T9284)을 포함한 DBPS를 처리하여 세포를 투과성으로 만들었다. DPBS로 3회 세척한 후, 4% FBS를 포함한 DPBS로 실온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적 결합을 차단하였다. 세포를 실온에서 1차 항체와 함께 1시간 동안 배양한 후, 0.05% Tween-20(Sigma, P7949)을 포함하는 DPBS로 3회 세척하였다. 이후, 2차 형광 항체를 처리하고, 암소에서 1시간 동안 배양하였다. 이중 염색이 필요하면 상기의 절차에 따른 1차 항체를 처리하기 전 30분 동안 추가적인 차단 (blocking) 단계를 수행하였다.
실시예 4. 정량 실시간 PCR을 통한 면역 반응 및 염증 반응 확인
DNA가 없는 전체 RNA를 RNeasy mini kit(Qiagen)을 이용하여 추출하였다. 반응 당 총 500 ng의 RNA를 이용하여 SuperScript® III 역전사효소(Invitrogen)로 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 총 부피 20 ㎕로 LightCycler 480 SYBR Green I Mastermix(Roche)을 이용하여 주형으로 사용하였다. 면역 반응 관련 유전자에 대하여 실험은 3회 반복하여 실시하였고, 항존 유전자(housekeeping gene) GAPDH로 정상화하였다. 유전자 발현은 Ct값 계산 방법으로 측정하였으며, 모든 실험은 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
실시예 5. 염증성 장 질환(inflammatory bowel disease, IBD) 동물 모델 제작 및 세포 이식
대장염 동물 모델은 4주령의 쥐에게 dextran sulfate sodium(DSS)을 경구 투여 하여 제작하였다. 5일간 DSS를 섭취시켜 급성 대장염을 유발한 후, 유도된 단핵구 전구세포 또는 활성화된 M1/M2 대식세포를 쥐의 대장에 이식하였다.
실험예 1. 직접 교차분화 인자에 의한 유도 단핵구 전구세포(induced monocyte progenitor cells)의 제조
체세포로부터 단핵구 전구세포를 직접 교차분화 하기 위하여, 마우스 섬유아세포를 1.5 x 104 cells로 배양 배지에 분주하고, 24시간 후에 실시예 1에서 제조한 렌티바이러스 발현 시스템을 통하여 전사 인자인 FLI1를 섬유아세포에 형질전환시켰다. 24시간 경과 후, 배지 조성물을 단핵구 전구세포 유도 배지로 교체하여 단핵구 전구세포로의 분화를 유도하였다. 단핵구 전구세포 군집을 기계적으로 분리하여 유도된 단핵구 전구세포를 선별(picking) 및 계대배양(subculture) 하였다. 상기 실험의 과정을 도식화하여 도 1A에 나타냈으며, 상기 유도된 단핵구 전구세포를 배양한 세포의 조직학적 형태를 도 1B에 나타냈다.
도 1B에 나타난 바와 같이, 렌티바이러스로 형질전환 이후 36일 정도에 세포 집합체가 형성되며, 이를 분리 및 배양한 후에 전형적인 단핵구 전구세포의 형태가 나타나는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과를 통하여 FLI1을 체세포인 섬유아세포에 처리하여 상기 인자들의 이소성 발현(ectopic expression)을 유도하면 효과적으로 단핵구 전구세포를 제조할 수 있음을 확인하였다. 특히, 상기 과정에 의하여 유도된 단핵구 전구세포는 실제 단핵구 전구세포에서 나타나는 조직학적 형태가 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 2. 유도된 단핵구 전구세포의 특징 확인
실험예 2.1. 유세포 분석법
실험예 1에서 유도된 단핵구 전구세포(iMac)가 조직학적 형태뿐만 아니라 실제 단핵구 전구세포의 특징을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 형광 표지 세포 분류기(fluorescence activated cell sorter: FACS) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 실험예 1에서 수득한 유도된 단핵구 전구세포가 단핵구 전구세포 특이적 마커인 CD11b 및 F4/80를 발현하는지 여부를 확인하기 위하여, 섬유아세포 및 골수 유래의 단핵구 전구세포 각각에 대하여 CD11b 및 F4/80 항체를 이용한 FACS 분석을 수행하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 유도된 단핵구 전구세포는 섬유아세포와 발현 양상이 확연하게 달랐고, 골수 유래의 단핵구 전구세포와 동일하게 섬유아세포에서는 발현하지 않았던 단핵구 전구세포 마커인 CD11b 및 F4/80가 강하게 나타나는 것을 확인하였다. 유도된 단핵구 전구세포는 CD11b 및 F4/80 마커의 발현 수준은 골수 유래 단핵구 전구세포의 발현 수준인 97.2와 유사한 정도로 85.4를 나타내는 것을 확인하였다.
이를 통하여, 실험예 1에 기재된 방법은 효율적으로 단핵구 전구세포를 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2.2. 면역세포화학염색
실험예 1에서 유도된 단핵구 전구세포가 단핵구 전구세포 특이적 마커인 CD45, CX3CR1, CD11b, IBA-1를 발현하는지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 3에 기재된 방법으로 면역세포화학염색을 수행하여 그 결과를 도 3에 나타냈다.
도 3에 나타난 바와 같이, 유도된 단핵구 전구세포가 CD45, CX3CR1, CD11b, IBA-1를 모두 발현하는 것을 확인하였다.
이를 통하여, 실험예 1에 기재된 방법에 의해 체세포로부터 직접 교차분화 유도된 단핵구 전구세포는 단핵구 전구세포의 형태뿐만 아니라 실제 특성도 갖는 것을 알 수 있었다.
실험예 3. 유도된 단핵구 전구세포의 포식작용(phagocytosis) 능력 확인
실험예 1에서 유도된 단핵구 전구세포가 면역 세포의 대표적인 특성인 포식작용 능력을 가지고 있는지 여부를 확인하기 위하여, 세포 배양액에 녹색 형광 표지된 latex bead를 처리하고, 포식 작용을 통해 bead가 세포질에 유입되는지 여부를 형광현미경으로 확인하여 그 결과를 도 4에 나타냈다.
도 4에 나타난 바와 같이, 유도된 단핵구 전구세포의 세포질 내로 녹색의 bead가 유입된 것을 통하여 유도된 단핵구 전구세포가 외부 물질을 포식하는 능력이 있음을 확인하였다.
실험예 4. 유도된 단핵구 전구세포의 면역 반응(immune response) 확인
단핵구 전구세포는 면역 세포로서, 외부 물질이나 병원균에 의해 염증 반응을 일으키는 M1 대식세포 또는 항염증 작용을 하는 M2 대식세포로 활성화 된다. 실험예 1에서 유도된 단핵구 전구세포의 면역 반응을 확인하기 위하여, 면역 반응 유발물질인 LPS, IL-4, TGFb1, IFN-gamma를 각각 또는 조합으로 처리하여 유도된 단핵구 전구세포를 활성화시킨 후, 세포 형태를 관찰하고, 실시예 4에 기재된 방법으로 면역 반응 관련 유전자의 발현 정도를 실시간 RT-PCR 분석을 통해 확인하여, 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에 나타난 바와 같이, 활성화된 단핵구 전구세포는 포식작용 세포의 특징인 납작한 아메바 모양 또는 막대기 모양의 세포 형태를 나타내고, 염증 작용 또는 항염증 작용에 관여하는 유전자의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
실험예 5. 유도된 단핵구 전구세포의 생체내 면역 질환 치료 효과 확인
실험예 1에서 유도된 단핵구 전구세포의 In vivo 기능적인 특성을 확인하기 위하여, 실시예 5에서 제작한 염증성 장 질환 동물 모델 쥐에 유도된 단핵구 전구세포 이식을 수행하고, 쥐의 생존률과 체중 변화를 분석하여 그 결과를 도 6에 나타냈다.
도 6에 나타난 바와 같이, 유도된 단핵구 전구세포를 이식해준 그룹의 생존률이 높고 체중 감소가 덜 나타나는 것을 확인하였다. 또한, 질병 활성도 지표 및 대장의 정상적인 길이 유지도 유도된 단핵구 전구세포를 이식해준 그룹에서 향상되었다.

Claims (10)

  1. (1) FLI1(Friend leukemia (virus) integration 1, ETS transcription factor) 단백질;
    (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
    (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는, 체세포로부터 골수세포(myeloid cell)로의 직접 교차분화 유도용 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 골수세포는 단핵구 전구세포(monocyte progenitor cells), 단핵구(monocytes), 대식세포(macrophages), 수지상세포(Dendritic cells), 거대핵세포(megakaryocytes), 및 혈소판(platelets)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 골수세포로의 직접 교차분화 유도용 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포(fibroblast), 상피세포, 근육세포, 신경세포, 모발세포, 모근세포, 모낭세포, 구강상피세포, 소변에서 추출한 체세포, 위점막세포, 배상세포, G세포, B세포, 주피세포(pericyte), 별아교세포(astrocyte), 혈액세포, 신경 줄기세포, 희소돌기아교 전구세포, 조혈모 줄기세포, 제대혈 줄기세포 및 중간엽 줄기세포로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 골수세포로의 직접 교차분화 유도용 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adeno-associated virus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말(episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 체세포로부터 골수세포로의 직접 교차분화 유도용 조성물.
  5. (1) FLI1(Friend leukemia (virus) integration 1) 단백질;
    (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
    (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 체세포에 접촉 또는 삽입시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 체세포를 골수세포로 직접 교차분화하는 방법.
  6. (1) FLI1(Friend leukemia (virus) integration 1) 단백질;
    (2) 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자; 및
    (3) 상기 핵산 분자가 도입된 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 조성물을 체세포에 접촉 또는 삽입시켜 직접 교차분화 유도된 골수세포.
  7. 청구항 1의 조성물을 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 면역 질환은 크론씨병, 홍반병, 아토피, 류마티스 관절염, 하시모토 갑상선염, 악성빈혈, 에디슨씨 병, 제1형 당뇨, 루프스, 만성피로증후군, 섬유근육통, 갑상선기능저하증, 항진증, 경피증, 베체트병, 염증성 장질환, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병, 중증 근무력증, 메니에르 증후군(Meniere's syndrome), 길리안-바레 증후군(Guilian-Barre syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 백반증, 자궁내막증, 건선, 백반증,　전신성 경피증, 천식 및 궤양성 대장염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 면역 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 청구항 6의 직접 교차분화 유도된 골수세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 세포 치료제.
  10. 청구항 6의 직접 교차분화 유도된 골수세포를 유효성분으로 포함하는 면역 질환의 예방 또는 치료용 약물 스크리닝용 조성물.
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