KR20210084453A - Cav-1 단백질의 변형된 펩타이드 단편 및 섬유증의 치료에 있어서 이의 용도 - Google Patents

Abstract

변형된 카베올린-1(Cav-1) 펩타이드를 포함하는 조성물이 본 명세서에서 제공된다. 폐 감염 또는 급성 또는 만성 폐 손상, 특히 폐 섬유증의 치료를 위해 변형된 Cav-1 펩타이드를 사용하는 방법이 추가로 제공된다.

Description

CAV-1 단백질의 변형된 펩타이드 단편 및 섬유증의 치료에 있어서 이의 용도

본 출원은 2018년 9월 10일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/728,997호의 이익을 주장하며, 이의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.

본 발명은 본 발명이 이루어진 시점에 유효한 공동 연구 계약의 범주 내에서 수행된 활동의 결과로 이루어진 것이다. 상기 공동 연구 계약의 당사자는 텍사스 대학 시스템의 이사회(Board of Regents of the University of Texas System) 및 렁 테라퓨틱스(Lung Therapeutics)이다.

본 발명의 분야

본 발명은 대체적으로 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은, 예컨대, 호흡기계로의 전달에 의해, 대상체에게 치료용 폴리펩타이드 조성물을 전달하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

폐 손상 동안, p53 발현은 증가하여 플라스미노겐 활성화인자 저해제-1(PAI-1)을 유도하는 한편, 우로키나아제형 플라스미노겐 활성화인자(uPA) 및 이의 수용체(uPAR)의 발현을 억제하여, 폐 상피 세포(LEC)의 아포토시스를 초래한다. 손상의 메커니즘은 uPA, uPAR, 카베올린-1(caveolin-1: "Cav-1")과 β1-인테그린 사이의 세포 표면 신호전달 상호작용을 수반한다(Shetty et al., 2005). 이러한 상호작용을 조절하는 조성물은 상처를 입거나 손상된 폐 상피 세포의 아포토시스를 억제하고 급성 폐 손상 및 그에 따른 폐 섬유증을 치료하기 위한 방법에서 사용될 수 있다. 따라서, 폐 손상을 예방하거나 치료하는 데 사용될 수 있는 폴리펩타이드, 구체적으로 이와 같은 폴리펩타이드의 치료적 전달을 위한 제형 및 방법에 대한 필요성이 존재한다.

본 개시내용에 따르면, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드가 제공되며, 여기서 펩타이드는 적어도 하나의 N- 또는 C-말단 부가물을 포함한다. N- 또는 C-말단 부가물은 표준 아미노산, 비-표준 아미노산, 또는 화학적 변형일 수 있다. 본 개시내용의 펩타이드의 펩타이드 다량체가 제공된다. 또한 펩타이드의 약제학적 조성물이 제공된다. 본 개시내용의 펩타이드는 폐 손상, 감염 또는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 추가 양태에서, 실시형태의 펩타이드는 섬유증 병태, 예를 들어 기관 섬유증 또는 염증을 치료하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 아미노산 서열 ASFTTFTVT(서열번호 3)를 포함하는 펩타이드를 제공하며, 여기서 펩타이드는 서열번호 1에 대한 동일성이 결여된 적어도 하나의 N- 또는 C-말단 부가물을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 N-말단에 부가된 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 C-말단에 부가된 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 N-말단 및 C-말단에 부가된 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 카베올린-1(Cav-1)의 생물학적 활성을 유지한다. 추가 양태에서, 실시형태의 펩타이드는 하나 이상의 중수소화 잔기를 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 펩타이드는 L-아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 D-아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 L- 및 D-아미노산을 둘 다 포함한다.

일부 양태에서, 펩타이드는 적어도 하나의 비-표준 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 2개 이상의 비-표준 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 4개 이상의 비-표준 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 비-표준 아미노산은 오르니틴이다. 일부 양태에서, 비-표준 아미노산을 D-알라닌이다.

일부 양태에서, 펩타이드는 N- 또는 C-말단 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 N-말단 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 C-말단 변형을 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 N- 및 C-말단 변형을 포함한다. 일부 양태에서, N-말단 변형은 아실화이다. 일부 양태에서, C-말단 변형은 아미드화이다.

일부 양태에서, 펩타이드는 아미노산 서열 KASFTTFTVTKGS(서열번호 4)를 포함한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 아미노산 서열 aaEGKASFTTFTVTKGSaa(서열번호 6)를 포함한다. 다른 양태에서, 펩타이드는 아미노산 서열 OASFTTFTVTOS(서열번호 9)를 포함한다. 다른 양태에서, 펩타이드는 아미노산 서열 aaEGKASFTTFTVTKGSaa-NH2(서열번호 7)를 포함한다. 또 다른 양태에서, 펩타이드는 아미노산 서열 Ac-aaEGKASFTTFTVTKGSaa-NH2(서열번호 8)를 포함한다. 다른 양태에서, 펩타이드는 아미노산 서열 OASFTTFTVTOS-NH2(서열번호 10)를 포함한다.

일부 양태에서, 펩타이드는 세포-침투 펩타이드(CPP)를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CPP는 GRKKRRQRRRPPQ(서열번호 21), RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호22), 및 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(서열번호23)를 포함하는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 적어도 2개의 펩타이드를 포함하는 펩타이드 다량체를 제공한다. 일부 양태에서, 적어도 2개의 펩타이드 중 제1 펩타이드는 적어도 2개의 펩타이드 중 제2 펩타이드와 본질적으로 동일하다. 다른 양태에서, 적어도 2개의 펩타이드 중 제1 펩타이드는 적어도 2개의 펩타이드 중 제2 펩타이드와 동일하지 않다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 펩타이드는 실질적으로 순수하다. 일부 양태에서, 펩타이드는 적어도 95% 순수하거나, 적어도 96% 순수하거나, 적어도 97% 순수하거나, 적어도 98% 순수하거나, 또는 적어도 99% 순수하다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 관절내, 비경구, 장내, 국부, 피하, 근육내, 협측, 설하, 직장, 질내, 음경내, 안내, 경막외, 두개내, 또는 흡입 투여용으로 제형화된다. 일부 양태에서, 약제학적 조성물은 폐 점적용으로 제형화된다. 일부 양태에서, 약제학적 조성물은 분무되는 용액으로 제형화된다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 바와 같은 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

특정 양태에서, 실시형태의 펩타이드 조성물은 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 질환은 섬유증 또는 염증성 질환이다. 예를 들어, 섬유증 질환은 기관 섬유증 질환일 수 있고, 신장, 간, 폐 또는 심장 섬유증일 수 있다. 일부 양태에서, 염증성 질환은 염증성 안 질환이다. 실시형태의 조성물은 전신으로 또는 국소적으로(예를 들어, 이환된 조직의 부위에서) 투여될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에게 유효량의 본 명세서에 기재된 바와 같은 펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 급성 폐 손상, 폐 감염 또는 폐 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 대상체는 페 염증을 가진다. 일부 양태에서, 대상체는 화학요법 또는 방사선요법을 받고 있다. 일부 양태에서, 대상체는 급성 폐 손상 또는 감염을 가진다. 일부 양태에서, 대상체는 화학적으로 유발된 폐 손상을 가진다. 일부 양태에서, 대상체는 플라스틱 기관지염, 만성 폐쇄성 폐질환, 기관지염, 세기관지염, 폐쇄 세기관지염, 천식, 급성 호흡곤란 증후군(ARDS) 또는 흡입 연기 유발 급성 폐 손상(ISALI)을 가진다. 일부 양태에서, 폐 질환은 폐의 섬유증 병태이다. 일부 양태에서, 폐 질환은 간질성 폐 질환이다. 일부 양태에서, 폐 질환은 특발성 폐 섬유증(IPF) 또는 폐 반흔이다. 일부 양태에서, 투여는 펩타이드를 포함하는 용액을 분무하는 것을 포함한다. 일부 양태에서, 방법은 적어도 하나의 추가적인 항-섬유증 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 추가적인 항-섬유증 치료제는 NSAID, 스테로이드, DMARD, 면역억제제, 생물학적 반응 조절제, 또는 기관지확장제이다. 일부 양태에서, 대상체는 인간이다.

본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물과 관련하여 구현될 수 있음이 고려된다. 본 개시내용의 다른 목적, 특징 및 이점은 하기 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 개시내용의 사상 및 범주 내에서 다양한 변화 및 변형이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이므로, 상세한 설명 및 특정 실시예는 본 개시내용의 특정 실시형태를 나타내지만 단지 예시로서 제공된다는 것을 이해해야 한다.

하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 양태를 추가로 설명하기 위해 포함된다. 본 발명은 본 명세서에 제시된 특정 실시형태의 상세한 설명화 함께 이들 도면의 하나 이상을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1: Cav-1 펩타이드로 처리된 SMA 및 튜불린 특발성 폐 섬유증 세포의 웨스턴 블롯. IPF 세포를 1: 비처리, 2: 10μM LTI-03, 3: 90μM LTI-03, 4: 10μM APi2350, 5: 10μM APi2354, 6: 10μM APi2355, 7: 10μM APi2356, 및 8: DMSO로 처리하고, SMA 및 튜불린 발현을 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다.
도 2: Cav-1 펩타이드를 이용한 처리는 IPF 세포에서 튜불린에 비해 SMA를 증가시킴. 표시된 처리를 받은 세포에서 SMA 대 튜불린의 비율에 대한 그래픽 표현.

본 개시내용은 변형된 카베올린-1(Cav-1) 펩타이드 및 질환 치료 및 예방, 특히 폐 섬유증에 있어서 이의 용도를 제공함으로써 현재 기술과 연관된 난제를 극복한다. 일부 양태에서, 변형된 Cav-1 펩타이드의 약제학적 제형이 제공된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 펩타이드는 호흡기계로의 전달을 위해 제형화된다. 예를 들어, 펩타이드는 수용액으로 제형화되고 네뷸라이저를 사용하여 용액을 분무함으로써 대상체의 기도에 투여하기 위해 제조될 수 있다. 다른 양태에서, 펩타이드는 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 대상체에게 치료적 유효량의 변형된 Cav-1 펩타이드를 (예를 들어, 기도를 통해) 투여함으로써 폐 손상 및 질환을 치료하는 방법이 본 명세서에서 제공된다.

I. 정의

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 명시된 구성요소와 관련하여 "본질적으로 없는"은 본 명세서에서 명시된 구성요소 중 어느 것도 의도적으로 조성물로 제형화되지 않았고/않았거나 단지 오염물질 또는 미량으로만 존재함을 의미하는 것으로 사용된다. 따라서 임의의 의도하지 않은 조성물의 오염으로 인한 명시된 구성요소의 총 양은 0.01% 미만이다. 가장 바람직한 것은 명시된 구성요소의 양이 표준 분석 방법을 이용하여 검출될 수 없는 조성물이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 표현은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본 명세서의 청구항(들)에서 사용되는 바와 같이, 단어 "포함하는"과 함께 사용될 때, 부정 관사 단어는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.

본 개시내용은 단지 대안 및 "및/또는"을 말하는 정의를 뒷받침하지만, 청구범위에서 용어 "또는"의 사용은 대안만을 말하는 것으로 명시적으로 표시되거나 대안이 상호 배타적인 것이 아닌 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "다른"은 적어도 두 번째 이상을 의미할 수 있다.

본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 장치에 대한 고유한 오차 변동, 값을 결정하는 데 이용되는 방법, 또는 연구 대상체 사이에 존재하는 변동을 포함하는 것을 표시하는 데 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "펩타이드"는 전형적으로 펩타이드 결합에 의해 연결된 아미노산의 단일 사슬로 구성된 아미노산의 서열을 말한다. 일반적으로, 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산 잔기를 포함하고, 달리 정의되지 않는 한 길이가 약 50개 미만의 아미노산이다.

"생물학적으로 활성인" 카베올린-1(Cav-1) 펩타이드는 세포, 예컨대, 섬유증 폐 섬유아세포에서 p53 단백질 수준을 증가시키고/시키거나, 우로키나제 플라스미노겐 활성화인자(uPA) 및 uPA 수용체(uPAR)를 감소시키고/시키거나, 플라스미노겐 활성화인자 저해제-1(PAI-1) 발현을 증가시키는 펩타이드를 말한다. 일부 양태에서, 생물학적으로 활성인 펩타이드는 (예를 들어, 시험관 내 또는 생체 내 분석에 의해 측정될 때) 서열번호 1의 천연 Cav-1 폴리펩타이드의 생물학적 또는 생화학적 활성의 적어도 20%를 가진다. 일부 양태에서, 생물학적 활성 펩타이드는 천연 Cav-1 폴리펩타이드와 비교하여 증가된 생물학적 또는 생화학적 활성을 가진다.

용어 "동일성" 또는 "상동성"은, 필요한 경우 전체 서열에 대한 최대 동일성 백분율을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭을 도입한 후 비교되고, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않는 상응하는 서열의 잔기와 동일한 후보 서열에서 아미노산 잔기의 백분율을 의미하는 것으로 해석되어야 한다. N- 또는 C-말단 확장 또는 삽입 어느 것도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되어서는 안된다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다.

용어 "폴리펩타이드" 또는 "단백질"은 2개 이상의 소단위 아미노산, 아미노산 유사체, 또는 펩타이드모방체(peptidomimetic)의 화합물을 말하는 데 가장 넓은 의미로 사용된다. 소단위는 펩타이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 소단위는 다른 결합, 예를 들어 에스터, 에터 등에 의해 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은, 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 둘 다를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩타이드모방체를 말한다. 용어 "펩타이드모방체" 또는 "펩타이드 모사체"는 본 발명에 따른 펩타이드가 예를 들어 우레아 결합, 카바메이트 결합, 설폰아마이드 결합, 하이드라진 결합, 또는 임의의 다른 공유 결합과 같은 적어도 하나의 비-펩타이드 결합을 포함하는 방식으로 변형됨을 의미한다. 3개 이상 아미노산의 펩타이드는 펩타이드 사슬이 짧은 경우 일반적으로 올리고펩타이드라고 한다. 펩타이드 사슬이 긴 경우, 펩타이드는 일반적으로 폴리펩타이드 또는 단백질이라고 한다.

용어 "대상체" 및 "개체" 및 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 본 명세서에 개시된 바와 같은 약제학적 조성물을 이용한 예방적 치료를 포함한 치료가 제공되는 동물, 예를 들어 인간 또는 비-인간 동물(예를 들어, 포유동물)을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "대상체"는 인간 및 비-인간 동물을 말한다. 용어 "비-인간 동물"은 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물, 예컨대, 비-인간 영장류, (특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 기니피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소, 및 비-포유동물, 예컨대, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 질환 모델로서 실험 동물 또는 동물 대체물이다. 비-인간 포유동물은 비-인간 영장류, (특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 기니피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼 및 소와 같은 포유동물을 포함한다. 일부 양태에서, 비-인간 동물은 반려 동물, 예컨대, 개 또는 고양이이다.

대상체에서 질환 또는 병태를 "치료하는 것" 또는 질환 또는 병태를 갖는 환자를 "치료하는 것"은 개체에게 약제학적 치료, 예를 들어 약물의 투여를 적용하여 질환 또는 병태의 적어도 하나의 증상이 감소되거나 안정화되게 하는 것을 말한다. 전형적으로, 펩타이드가 치료로서 치료적으로 투여되는 경우, 폐 손상 또는 폐 섬유증의 하나 이상의 증상을 나타내는 대상체에게 투여된다.

"단리된"이란 폴리펩타이드가 임의의 자연 환경, 예컨대, 체액, 예를 들어 혈액으로부터 분리되고 자연적으로 펩타이드를 동반하는 구성요소로부터 분리되었음을 의미한다.

단리되고 "실질적으로 순수한"이란 자연적으로 폴리펩타이드를 동반하는 구성요소로부터 적어도 어느 정도로 분리되고 정제된 폴리펩타이드를 의미한다. 전형적으로, 폴리펩타이드는 자연적으로 연관된 천연 유래 유기 분자 및 단백질이 중량 기준으로 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 심지어 적어도 약 99% 없는 경우 실질적으로 순수하다. 예를 들어, 실질적으로 순수한 폴리펩타이드는 천연 공급원으로부터 추출에 의해, 일반적으로 해당 단백질을 발현하지 않는 세포에서 재조합 핵산의 발현에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 얻어질 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "변이체"는 하나 이상의 아미노산 또는 핵산 결실, 부가, 치환 또는 측쇄 변형에 의해 폴리펩타이드 또는 핵산과 상이하지만, 천연 유래 분자의 하나 이상의 특정 기능 또는 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드 또는 핵산을 말한다. 아미노산 치환은 아미노산이 상이한 자연적으로 발생하거나 비-통상적 아미노산 잔기로 대체된 변경을 포함한다. 이와 같은 치환은 "보존적"으로 분류될 수 있으며, 이 경우 폴리펩타이드에 포함된 아미노산 잔기는 극성, 측쇄 기능성 또는 크기와 관련하여 유사한 특징의 또 다른 천연 유래 아미노산으로 대체된다. 이와 같은 보존적 치환은 당업계에 잘 알려져 있다. 본 발명에 포함되는 치환은 또한 "비-보존적"일 수 있으며, 여기서 펩타이드에 존재하는 아미노산 잔기는 상이한 특성을 갖는 아미노산, 예컨대, 상이한 그룹 유래의 천연 유래 아미노산으로 치환(예를 들어, 하전된 또는 소수성 아미노산을 알라닌으로 치환)되거나, 대안적으로 천연 유래 아미노산은 비-통상적 아미노산으로 치환된다. 일부 실시형태에서, 아미노산 치환은 보존적이다. 또한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용될 때 각각 참조 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여(예를 들어, 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여) 1차, 2차, 또는 3차 구조가 변할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드를 말하는 것이 용어 변이체 내에 포함된다.

용어 "삽입" 또는 "결실"은 전형적으로 약 1 내지 5개 아미노산의 범위에 있다. 허용되는 변이는 재조합 DNA 기법을 사용하여 서열에서 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환을 체계적으로 수행하면서 펩타이드를 합성으로 생성함으로써 실험적으로 결정될 수 있다.

펩타이드를 말할 때 용어 "치환"은 상이한 실체, 예를 들어 또 다른 아미노산 또는 아미노산 모이어티를 위한 아미노산의 변화를 말한다. 치환은 보존적이거나 비-보존적 치환일 수 있다.

분자, 예컨대, 펩타이드의 "유사체"는 전체 분자 또는 이의 단편과 기능이 유사한 분자를 말한다. 용어 "유사체"는 또한 대립유전자 종 및 유도된 변이체를 포함하는 것으로 의도된다. 유사체는 전형적으로 종종 보존적 치환에 의해, 하나 또는 몇 개 위치에서 천연 유래 펩타이드와 상이하다. 유사체는 전형적으로 천연 펩타이드와 적어도 80 또는 90% 서열 동일성을 나타낸다. 일부 유사체는 또한 비천연 아미노산 또는 N 또는 C 말단 아미노산의 변형을 포함한다. 비천연 아미노산의 예에는, 예를 들어 이치환 아미노산, N-알킬 아미노산, 락트산, 4-하이드록시프롤린, γ-카복시글루타메이트, ε-N,N,N-트라이메탈라이신, ε-N-아세틸라이신, O-포스포세린, N-아세틸세린, N-폼일메티오닌, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시라이신, σ-N-메틸아르기닌이 있지만 이에 제한되지 않는다. 단편 및 유사체는 하기에 기재된 바와 같이 유전자이식 동물 모델에서 예방적 또는 치료적 효능에 대해 스크리닝될 수 있다.

"공유 결합된"은 공유 화학 결합에 의해 직접 또는 간접적으로(예를 들어, 링커를 통해) 연결되는 것을 의미한다. 본 발명의 모든 실시형태의 일부 양태에서, 융합 펩타이드는 공유 결합된다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "융합 단백질"은 2개 이상의 단백질의 재조합 단백질을 말한다. 융합 단백질은, 예를 들어 하나의 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 또 다른 단백질을 인코딩하는 핵산에 연결시켜 이들이 세포에서 의도된 단백질을 모두 보유하는 단일 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 단일 오픈 리딩 프레임을 구성하도록 함으로써 생성될 수 있다. 단백질의 배열 순서는 다를 수 있다. 융합 단백질은 에피토프 태그 또는 반감기 연장제를 포함할 수 있다. 에피토프 태그는 비오틴, FLAG 태그, c-myc, 헤마글루티닌, His6, 디곡시게닌, FITC, Cy3, Cy5, 녹색 형광 단백질, V5 에피토프 태그, GST, β-갈락토시다제, AU1, AU5, 및 아비딘을 포함한다. 반감기 연장제는 Fc 도메인 및 혈청 알부민을 포함한다.

용어 "기도"는 본 명세서에서 상기도, 호흡기도, 및 폐를 포함하는 호흡관의 임의의 부분을 말한다. 상기도는 코 및 비강, 입, 및 목을 포함한다. 호흡기도는 후두, 기관, 기관지 및 세기관지를 포함한다. 폐는 호흡 세기관지, 폐포관, 폐포낭 및 폐포를 포함한다.

용어 "흡입 연기 유발 급성 폐 손상" 및 "ISALI"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며 연기 흡입에 의해 유발된 급성 폐 손상(ALI)의 형태를 말한다. ALI는 또한 "경증 급성 호흡곤란 증후군; ARDS"로도 지칭된다. ARDS는 대상체에서 다음 조건 중 하나 이상을 찾는 것에 의해 정의될 수 있다: 1) 흉부 X-레이 상에서 양측 폐 침윤, 2) 임상적으로 지시된 대로 우측 심장 카테터삽입에 의해 측정할 때, 폐 모세관 쐐기압이 18 mmHg(2.4 ㎪) 미만, 및 3) PaO₂/FiO₂가 300 mmHg(40 ㎪) 미만. 일부 실시형태에서, ISALI의 치료는, 산소화 감소, 기도 폐쇄(심각한 기도 폐쇄를 포함함), 섬유성 기도 캐스트 또는 파편, 및 폐포 피브린 침착 중 하나 이상의 상태의 치료를 포함한다.

용어 "분무(nebulizing)", "분무화된" 및 다른 문법적 변형은 본 명세서에서액체를 작은 에어로졸 액적으로 전환시키는 과정을 말한다. 일부 실시형태에서, 에어로졸 액적은 중앙 직경이 대략 2 내지 10㎛이다. 일부 실시형태에서, 에어로졸 액적은 중앙 직경이 대략 2 내지 4㎛이다.

II. 카베올린-1 펩타이드

본 개시내용의 실시형태는 카베올린-1(Cav-1) 단백질의 펩타이드 변이체를 제공한다. 카베올린-1(Cav-1) 스캐폴딩 도메인 또는 폴리펩타이드는 Src 키나제와 Cav-1 상호작용을 방해하여 uPA 및 항-β1-인테그린 항체의 조합된 효과를 모방한다. 천연 인간 Cav-1은 길이가 178개 아미노산이고 분자량이 22 kDa이다. Cav-1의 아미노산 서열은 하기(서열번호 1)에 표시되어 있다.

일부 양태에서, 펩타이드는 서열번호 2인 FTTFTVT와 적어도 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 스캐폴딩 도메인 펩타이드이다. 펩타이드는, 예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 또는 19개 잔기의 폴리펩타이드를 유도하기 위해, 서열번호 1의 서열에 비해 1, 2, 3, 4개 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 삽입을 포함할 수 있다. 특정 양태에서, 펩타이드는 천연 Cav-1 폴리펩타이드의 절단체, 예컨대, 표 1에 나타낸 예시적인 폴리펩타이드이다.

본 개시내용에서 제공되는 펩타이드는 결합 또는 생물학적 활성에 대한 시험관 내 또는 생체 내 분석에서 천연 CAV-1 폴리펩타이드의 활성을 갖는 생물학적으로 활성인 유도체이다. 특정 양태에서, 펩타이드는 천연 CAV-1 폴리펩타이드 활성의 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60 %, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 약 95%, 97%, 99%, 및 이 안에서 유도가능한 임의의 범위, 예컨대, 약 70% 내지 약 80%, 더 바람직하게는 약 81% 내지 약 90%; 또는 훨씬 더 바람직하게는 약 91% 내지 약 99%의 활성으로 시험관 내 또는 생체 내에서 BLM에 의해 유도된 LEC의 아포토시스를 억제하거나 예방한다. 펩타이드는 천연 CAV-1 폴리펩타이드보다 100% 또는 훨씬 더 큰 활성을 가질 수 있다. 생물학적 활성, 예를 들어 항-섬유증 활성, uPA, uPAR 및 PAI-1 mRNA의 발현에 영향을 미치거나 폐 섬유아세포의 증식을 억제하는 능력을 테스트하기 위한 분석은 당업계에 잘 알려져 있다.

본 개시내용의 펩타이드는 천연 Cav-1 폴리펩타이드의 펩타이드 또는 이의 변형된 형태이다. 펩타이드는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 단리되거나 생성된 합성, 재조합, 또는 화학적으로 변형된 펩타이드일 수 있다. 변형은 N-말단, C-말단에서, 또는 내부적으로 아미노산에 대하여 이루어질 수 있다. N-말단 변형은, 예를 들어 아실화, 아세틸화, 또는 C-말단 아미드화일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 펩타이드는 하기 기재된 바와 같이 보존적 또는 비-보존적 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변화는 참조 서열에 의해 인코딩된 폴리펩타이드에서 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및 절단을 초래할 수 있다. 펩타이드는 또한 변형된 변이체의 기초인 펩타이드 서열에서 일반적으로 발생하지 않는 아미노산(및 다른 분자)의 삽입 및 치환을 포함하여, 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환, 예를 들어 인간 단백질에서 일반적으로 발생하지 않는 L-아미노산, 또는 비-표준 아미노산, 예컨대, 오르니틴의 삽입(이에 제한되지 않음)을 포함할 수 있다. 펩타이드를 설명할 때 용어 보존적 치환은 펩타이드의 활성을 실질적으로 변경하지 않는 펩타이드의 아미노산 조성의 변화를 말한다. 예를 들어, 보존적 치환은 유사한 화학적 특성을 갖는 상이한 아미노산 잔기로 아미노산 잔기를 대체하는 것을 말한다. 보존적 아미노산 치환은 류신을 아이소류신 또는 발린으로, 아스파테이트를 글루타메이트로, 또는 트레오닌을 세린으로 대체하는 것을 포함한다.

보존적 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것, 예컨대, 류신을 아이소류신 또는 발린으로, 아스파테이트를 글루타메이트로, 또는 트레오닌을 세린으로 대체함으로써 일어난다. 따라서, 특정 아미노산 서열의 보존적 치환은 폴리펩타이드 활성에 중요하지 않는 아미노산을 치환하거나 또는 유사한 특성(예를 들어, 산성, 염기성, 양전하 또는 음전하로 하전된, 극성 또는 비극성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 아미노산을 치환하여 심지어 중요한 아미노산의 치환이 펩타이드의 활성을 감소시키지 않도록 하는 것을 말한다. 기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 하기 6개의 그룹은 각각 서로에 대한 보존적 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T); 2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E); 3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q); 4) 아르기닌(R), 라이신(K); 5) 아이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및 6) 페닐알라닌(F), 타이로신(Y), 트립토판(W). (또한, 전문이 참조로 포함된, 문헌[Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)] 참조.) 일부 실시형태에서, 단일 아미노산 또는 소량의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 개별 치환, 결실 또는 부가는 또한 변화가 펩타이드의 활성을 감소시키지 않는 경우 보존적 치환인 것으로 간주될 수 있다. 삽입 또는 결실은 전형적으로 약 1 내지 5개 아미노산의 범위이다. 보존적 아미노산의 선택은 펩타이드에서 치환될 아미노산의 위치를 기준으로, 예를 들어 아미노산이 펩타이드의 외부에 있고 용매에 노출되거나, 내부에 있고 용매에 노출되지 않는 경우 선택될 수 있다.

대안적인 실시형태에서, 기존 아미노산의 위치, 즉, 용매에 대한 노출(즉, 용매에 노출되지 않은 내부적으로 국재화된 아미노산과 비교하여 아미노산이 용매에 노출되거나 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 외부 표면에 존재하는 경우)을 기반으로 기존 아미노산을 치환할 아미노산을 선택할 수 있다. 이와 같은 보존적 아미노산 치환의 선택은, 예를 들어 문헌[Dordo et al, J. Mol Biol, 1999, 217, 721-739] 및 [Taylor et al, J. Theor. Biol. 119(1986); 205-218] 및 [S. French and B. Robson, J. Mol. Evol. 19(1983)171]에 개시된 바와 같이 당업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 단백질 또는 펩타이드의 외부에 있는 아미노산(즉, 용매에 노출된 아미노산)에 적합한 보존적 아미노산 치환을 선택할 수 있으며, 예를 들어 하기 치환이 사용될 수 있지만 이에 제한되지 않는다: Y는 F, T는 S 또는 K, P는 A, E는 D 또는 Q, N은 D 또는 G, R은 K, G는 N 또는 A, T는 S 또는 K, D는 N 또는 E, I는 L 또는 V, F는 Y, S는 T 또는 A, R은 K, G는 N 또는 A, K는 R, A는 S, K 또는 P로 치환.

대안적인 실시형태에서, 또한 단백질 또는 펩타이드의 내부에 있는 아미노산에 적합한 것으로 포함되는 보존적 아미노산 치환을 선택할 수 있으며, 예를 들어 단백질 또는 펩타이드의 내부에 있는 아미노산(즉, 아미노산이 용매에 노출되지 않음)에 대한 적합한 보존적 치환을 사용할 수 있고, 예를 들어 하기 보존적 치환을 사용할 수 있지만 이에 제한되지 않는다: Y가 F로, T가 A 또는 S로, I가 L 또는 V로, W가 Y로, M이 L로, N이 D로, G가 A로, T가 A 또는 S로, D가 N으로, I가 L 또는 V로, F가 Y 또는 L로, S가 A 또는 T로 및 A가 S, G, T 또는 V로 치환되는 경우. 일부 실시형태에서, 비-보존적 아미노산 치환은 또한 변이체의 용어 내에 포함된다.

일부 양태에서, 폴리펩타이드는 천연 Cav-1 폴리펩타이드의 유도체이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "유도체"는, 예를 들어 아세틸화, 유비퀴틴화, 표지화, 페길화(폴리에틸렌 글라이콜을 이용한 유도체화), 지질화, 글라이코실화, 아미드화, 또는 다른 분자의 부가와 같은 기법에 의해(이에 제한되지 않음) 화학적으로 변형된 펩타이드를 말한다. 분자는 또한 일반적으로 분자의 일부가 아닌 추가적인 화학적 모이어티를 포함할 때 또 다른 분자의 "유도체"이다. 이와 같은 모이어티는 pH를 변경하거나 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 개선시킬 수 있다. 모이어티는 대안적으로 분자의 독성을 감소시키고, 분자의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시키는 것 등을 할 수 있다. 이와 같은 효과를 매개할 수 있는 모이어티는, 본 명세서에 전문이 참조로 포함된, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA (1990)]에 개시되어 있다.

"유도체" 또는 "변이체"와 함께 사용될 때 용어 "기능적"은 실체 또는 이의 기능적 유도체 또는 기능적 변이체인 분자의 생물학적 활성과 실질적으로 유사한 생물학적 활성(기능적 또는 구조적)을 갖는 본 발명의 폴리펩타이드를 말한다. 용어 기능적 유도체는 분자의 단편, 유사체 또는 화학적 유도체를 포함하는 것으로 의도된다.

일부 양태에서, 아미노산 치환은 치환이 유사한 친수성을 갖는 아미노산에 대한 것인 하나 이상의 위치에서의 폴리펩타이드에서 이루어질 수 있다. 단백질에 대한 상호작용적 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당업계에서 이해된다(Kyte and Doolittle, 1982). 아미노산의 상대적인 소수성 특징은 생성된 단백질의 2차 구조에 기여하며, 이는 결국 단백질과 다른 분자, 예를 들어 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 한정하는 것으로 인정된다. 따라서 이와 같은 보존적 치환은 폴리펩타이드에서 이루어질 수 있으며, 활성에 약간의 영향을 미칠 가능성이 있을 것이다. 미국 특허 제4,554,101호에서 상세히 기술된 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 이들 값은 지침으로서 사용될 수 있고 따라서 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, 친수성 값이 ±1 이내인 것이 특히 바람직하고, ±0.5 이내인 것이 훨씬 더 특히 바람직하다. 따라서, 본 명세서에 기재된 임의의 폴리펩타이드는 아미노산을 상이하지만 유사한 친수성 값을 갖는 상동성 아미노산으로 치환함으로써 변형될 수 있다. +/- 1.0, 또는 +/- 0.5점 이내의 친수성을 갖는 아미노산은 상동성인 것으로 간주된다.

변형된 Cav-1 펩타이드는, 예를 들어 이황화 결합 형성, 글라이코실화, 아세틸화, 인산화, 단백질분해 절단(예를 들어, 퓨린 또는 메탈로프로테아제에 의한 절단) 등과 같은 동시-번역 및 번역 후(C-말단 펩타이드 절단) 변형을, 이와 같은 변형이 단리된 펩타이드의 항-염증 특성 또는 혈당 조절을 개선시키는 능력에 영향을 미치지 않는 정도까지 포함할 수 있다.

일부 양태에서, 변형된 Cav-1 펩타이드는 비천연 유래 아미노산을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 유래 아미노산 및 비천연 유래 아미노산의 조합을 포함할 수 있거나, 비천연 유래 아미노산만을 포함할 수 있다. 비천연 유래 아미노산은, 특정 상황에서 바람직한, 합성 비-천연 아미노산, 치환된 아미노산, 또는 하나 이상의 D-아미노산을 펩타이드(또는 프로테아제 인식 서열의 경우를 제외하고 조성물의 다른 구성요소)에 포함할 수 있다. D-아미노산-포함 펩타이드는 L-아미노산-포함 형태와 비교하여 시험관 내 또는 생체 내에서 증가된 안정성을 나타낸다. 따라서, D-아미노산을 포함하는 펩타이드의 구성은 더 큰 생체 내 또는 세포 내 안정성이 요구되거나 필요할 때 특히 유용할 수 있다. 보다 구체적으로, D-펩타이드는 내인성 펩티다제 및 프로테아제에 대하여 내성이 있어, 연결된 약물 및 접합체의 보다 양호한 경구 경상피(trans-epithelial) 및 경피 전달, 막-영구적 복합체(추가 논의는 하기 참조)의 개선된 생체이용률, 및 이와 같은 특성이 바람직할 때 장기적인 혈관 내 및 간질성 수명을 제공한다. D-이성질체 펩타이드의 사용은 또한 연결된 약물 및 다른 카고(cargo) 분자의 경피 및 경구 경상피 전달을 향상시킬 수 있다. 추가적으로, D-펩타이드는 T 헬퍼 세포에 대한 주요 조직적합성 복합체 클래스 II-제한 제시를 위해 효율적으로 처리될 수 없으므로, 따라서 전체 유기체에서 체액성 면역 반응을 유도할 가능성이 적다. 따라서 펩타이드 접합체는, 예를 들어 세포 침투 펩타이드 서열의 D-이성질체 형태, 절단 부위의 L-이성질체 형태, 및 치료 펩타이드의 D-이성질체 형태를 사용하여 구축될 수 있다.

20개의 "표준" L-아미노산에 추가적으로, D-아미노산 또는 당업계에 잘 정의된 비-표준, 변형된 또는 흔치 않는 아미노산도 또한 본 개시내용에서의 사용을 위해 고려된다. 인산화된 아미노산(Ser, Thr, Tyr), 글라이코실화된 아미노산(Ser, Thr, Asn), β-아미노산, GABA, ω-아미노산이 본 개시내용에서의 사용을 위해 추가로 고려된다. 이들은, 예를 들어 β-알라닌(β-Ala) 및 다른 ω-아미노산, 예컨대, 3-아미노프로피온산, 2,3-다이아미노프로피온산(Dpr), 4-아미노부티르산 등; α-아미노아이소부티르산(Aib); ε-아미노헥산산(Aha); δ-아미노발레르산(Ava); N-메틸글리신 또는 사르코신(MeGly); 오르니틴(Orn); 시트룰린(Cit); t-부틸알라닌(t-BuA); t-부틸글리신(t-BuG); N-메틸아이소류신(MeIle); 페닐글리신(Phg); 노르류신(Nle); 4-클로로페닐알라닌(Phe(4-Cl)); 2-플루오로페닐알라닌(Phe(2-F)); 3-플루오로페닐알라닌(Phe(3-F)); 4-플루오로페닐알라닌(Phe(4-F)); 페니실라민(Pen); 1,2,3,4-테트라하이드로아이소퀴놀린-3-카복실산(Tic); 호모아르기닌(hArg); N-아세틸 라이신(AcLys); 2,4-다이아미노부티르산(Dbu); 2,4-다이아미노부티르산(Dab); p-아미노페닐알라닌(Phe(pNH₂)); N-메틸 발린(MeVal); 호모시스테인(hCys), 호모페닐알라닌(hPhe) 및 호모세린(hSer); 하이드록시프롤린(Hyp), 호모프롤린(hPro), N-메틸화 아미노산 및 펩토이드(N-치환된 글리신)를 포함한다.

카복시 말단 변형은 카복실산, 즉, 폼산, 아세트산, 프로피온산, 지방산(미리스트산, 팔미트산, 스테아르산), 석신산, 벤조산, 카보벤족시(Cbz)를 이용한 아실화; 아세틸화 및 비오티닐화를 포함한다. 아미노 말단 변형은, (i) 카복실산, 즉, 폼산, 아세트산, 프로피온산, 지방산(미리스트산, 팔미트산, 스테아르산 등), 석신산, 벤조산, 카보벤족시(Cbz)를 이용한 아실화; (ii) 비오티닐화; (iii) 아미드화; (iv) 염료, 예컨대, 플루오레세인(FITC, FAM 등), 7-하이드록시-4-메틸쿠마린-3-아세트산, 7-하이드록시쿰린-3-아세트산, 7-메톡시쿠마린-3-아세트산 및 다른 쿠마린; 로다민(5-카복시로다민 110 또는 6G, 5(6)-탐라(TAMRA), 록스(ROX)); N-[4-(4-다이메틸아미노)페닐아조]벤조산(Dabcyl), 2,4-다이나이트로벤젠(Dnp), 5-다이메틸아미노나프탈렌-1-설폰산(Dansyl) 및 다른 염료의 부착; 및 (v) 폴리에틸렌글라이콜을 포함한다.

폴리펩타이드는, 예를 들어 N 말단에서 아세틸(CH₃CO-) 및 C 말단에서 아미도(-NH₂)로, 아실("Ac"로 약칭됨)- 및 아미도("Am"으로 약칭됨) 기로 각각 N 및 C 말단에서 캡핑될 수 있다. 바람직하게는 말단 아미노기에 대한 연결에서, 광범위한 N-말단 캡핑 기능이 고려되며, 예를 들어 폼일;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알칸오일, 예컨대, 아세틸, 프로피온일, 부티릴;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알켄오일, 예컨대, 헥스-3-엔오일;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알카인오일, 예컨대, 헥스-5-아인오일;

아로일, 예컨대, 벤조일 또는 1-나프토일;

헤테로아로일, 예컨대, 3-피로일 또는 4-퀴놀로일;

알킬설폰일, 예컨대, 메탄설폰일;

아릴설폰일, 예컨대, 벤젠설폰일 또는 설파닐릴;

헤테로아릴설폰일, 예컨대, 피리딘-4-설폰일;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 치환된 알칸오일, 예컨대, 4-아미노부티릴;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 치한된 알켄오일, 예컨대, 6-하이드록시-헥스-3-엔오일;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 치환된 알카인오일, 예컨대, 3-하이드록시-헥스-5-아인오일;

치환된 아로일, 예컨대, 4-클로로벤조일 또는 8-하이드록시-나프트-2-오일;

치환된 헤테로아로일, 예컨대, 2,4-다이옥소-1,2,3,4-테트라하이드로-3-메틸-퀴나졸린-6-오일;

치환된 알킬설폰일, 예컨대, 2-아미노에탄설폰일;

치환된 아릴설폰일, 예컨대, 5-다이메틸아미노-1-나프탈렌설폰일;

치환된 헤테로아릴설폰일, 예컨대, 1-메톡시-6-아이소퀴놀린설폰일;

카바모일 또는 티오카바모일;

치환된 카바모일(R'-NH-CO) 또는 치환된 티오카바모일(R'-NH-CS)(여기서 R'은 알킬, 알켄일, 알카인일, 아릴, 헤테로아릴, 치환된 알킬, 치환된 알켄일, 치환된 알카인일, 치환된 아릴, 또는 치환된 헤테로아릴임);

치환된 카바모일(R'-NH-CO) 및 치환된 티오카바모일(R'-NH-CS)(여기서, R'은 알칸오일, 알켄오일, 알카인오일, 아로일, 헤테로아로일, 치환된 알칸오일, 치환된 알켄오일, 치환된 알카인오일, 치환된 아로일, 또는 치환된 헤테로아로일임, 모두 상기 정의된 바와 같음).

C-말단 캡핑 기능은 말단 카복실과의 아마이드 또는 에스터 결합에 있을 수 있다. 아마이드 결합을 제공하는 캡핑 기능은 NR¹R²로 지정되며, 여기서 R¹ 및 R²는 독립적으로 하기 기로부터 추출될 수 있다: 수소;

바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알킬, 예컨대, 메틸, 에틸, 아이소프로필;

바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알켄일, 예컨대, 프로프-2-엔일;

바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알카인일, 예컨대, 프로프-2-아인일;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 치환된 알킬, 예컨대, 하이드록시알킬, 알콕시알킬, 머캅토알킬, 알킬티오알킬, 할로게노알킬, 시아노알킬, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 다이알킬아미노알킬, 알칸오일알킬, 카복시알킬, 카바모일알킬;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 치환된 알켄일, 예컨대, 하이드록시알켄일, 알콕시알켄일, 머캅토알켄일, 알킬티오알켄일, 할로게노알켄일, 시아노알켄일, 아미노알켄일, 알킬아미노알켄일, 다이알킬아미노알켄일, 알카노일알켄일, 카복시알켄일, 카바모일알켄일;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 치환된 알카인일, 예컨대, 하이드록시알카인일, 알콕시알카인일, 머캅토알카인일, 알킬티오알카인일, 할로게노알카인일, 시아노알카인일, 아미노알카인일, 알킬아미노알카인일, 다이알킬아미노알카인일, 알카노일알카인일, 카복시알카인일, 카바모일알카인일;

최대 10개의 탄소 원자를 갖는 아로일알킬, 예컨대, 페나실 또는 2-벤조일에틸;

아릴, 예컨대, 페닐 또는 1-나프틸;

헤테로아릴, 예컨대, 4-퀴놀일;

1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 알칸오일, 예컨대, 아세틸 또는 부티릴;

아로일, 예컨대, 벤조일;

헤테로아로일, 예컨대, 3-퀴놀로일;

OR' 또는 NR'R''(여기서, R' 및 R''은 독립적으로 수소, 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아실, 아로일, 설폰일, 설피닐, 또는 SO₂-R''' 또는 SO-R'''이고, R'''은 치환 또는 비치환된 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 알켄일, 또는 알카인일임).

에스터 결합을 제공하는 캡핑 기능은 OR로 지정되며, 여기서 R은 알콕시; 아릴옥시; 헤테로아릴옥시; 아랄킬옥시; 헤테로아랄킬옥시; 치환된 알콕시; 치환된 아릴옥시; 치환된 헤테로아릴옥시; 치환된 아랄킬옥시; 또는 치환된 헤테로아랄킬옥시일 수 있다.

N-말단 또는 C-말단 캡핑 기능 중 하나, 또는 둘 다는 캡핑된 분자가 활성 약물을 방출하기 위하여 신체 내에서 자발적 또는 효소적 변형을 겪고 모 약물 분자보다 개선된 전달 특성을 갖는 전구약물(모 약물 분자의 약리학적으로 불활성인 유도체)로서 기능하는 구조를 가질 수 있다(Bundgaard H, Ed: Design of Prodrugs, Elsevier, Amsterdam, 1985).

캡핑 기의 신중한 선택은 펩타이드에 다른 활성의 추가를 가능하게 한다. 예를 들어, N- 또는 C-말단 캡에 연결된 설파이드릴 기의 존재는 다른 분자에 대한 유도체화된 펩타이드의 접합을 허용할 것이다.

또한 추가 양태에서, 펩타이드 또는 이의 단편 또는 유도체는 "레트로-인버소(retro-inverso) 펩타이드"일 수 있다. "레트로-인버소 펩타이드"는 적어도 하나의 위치에서 펩타이드 결합 방향의 역전, 즉, 아미노산의 측쇄에 대하여 아미노- 및 카복시-말단의 역전이 있는 펩타이드를 말한다. 따라서, 레트로-인버소 유사체는 천연 펩타이드 서열에서와 같이 측쇄의 위상(topology)을 거의 유지하면서 역전된 말단 및 역전된 펩타이드 결합 방향을 가진다. 레트로-인버소 펩타이드는 L-아미노산 또는 D-아미노산, 또는 L-아미노산과 D-아미노산의 혼합물을 포함할 수 있으며, 최대로 모든 아미노산이 D-이성질체이다. 부분 레트로-인버소 펩타이드 유사체는 서열의 일부만이 역전되고 거울상이성질체 아미노산 잔기로 대체된 폴리펩타이드이다. 이와 같은 유사체의 레트로-역전(retro-inverted) 부분은 역전된 아미노 및 카복실 말단을 가지기 때문에, 레트로-역전 부분에 측접하는 아미노산 잔기는 각각 측쇄-유사 α-치환된 제미날(geminal)-다이아미노메탄 및 말로네이트에 의해 대체된다. 세포 침투 펩타이드의 레트로-인버소 형태는 자연 형태만큼 막을 가로질러 전좌하는 데 효율적으로 작용하는 것으로 밝혀졌다. 레트로-인버소 펩타이드 유사체의 합성은 문헌[Bonelli, F. et al., Int J Pept Protein Res. 24(6):553-6 (1984)]; [Verdini, A and Viscomi, G. C, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 :697-701 (1985)]; 및 미국 특허 제6,261,569호에 기재되어 있으며, 이들은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다. 부분 레트로-인버소 펩타이드 유사체의 고상 합성을 위한 공정이 기재된 바 있으며(EP 97994-B), 이는 또한 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다.

폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역(또는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 영역)이 "서열 동일성"의 특정 백분율(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)을 가지거나 또 다른 서열에 대하여 "상동성"을 가짐은, 정렬될 때, 염기(또는 아미노산)의 백분율이 2개의 서열을 비교할 때 동일함을 의미한다. 이러한 정렬 및 상동성 또는 서열 동일성 백분율은 당업계에 알려진 소프트웨어 프로그램, 예를 들어 문헌[Current Protocols In Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30, section 7.7.18, Table 7.7.1]에 기재된 것을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직하게는 디폴트 매개변수가 정렬에 사용된다. 바람직한 정렬 프로그램은 디폴트 매개변수를 사용하는 블라스트(BLAST)이다. 구체적으로, 바람직한 프로그램은 블라스트엔(BLASTN) 및 블라스트피(BLASTP)이며, 이들은 다음의 디폴트 매개변수를 사용한다: 유전 코드=표준; 필터=없음; 가닥=둘 다; 컷오프=60; 예상=10; 매트릭스=블로섬(BLOSUM)62; 설명=50개 서열; 정렬 기준=높은 점수; 데이터베이스=비-중복, 젠뱅크(GenBank)+EMBL+DDBJ+PDB+젠뱅크 CDS 번역+스위스프로틴(SwissProtein)+에스피업데이트(SPupdate)+PIR.

A. 다량체 폴리펩타이드

본 개시내용의 실시형태는 또한 변형된 Cav-1 변이 폴리펩타이드의 반복 단위로부터 구축된 더 긴 폴리펩타이드를 포함한다. 폴리펩타이드 다량체는 상이한 조합의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 이와 같은 다량체 폴리펩타이드는 본 명세서에 논의된 바와 같이 화학적 합성 또는 재조합 DNA 기법에 의해 제조될 수 있다. 화학적 합성에 의해 생성될 때, 올리고머는 바람직하게는 코어 폴리펩타이드 서열에 2 내지 5개 반복부를 가지고, 다량체에서 아미노산의 총 수는 약 160개 잔기를 초과해서는 안 되며, 바람직하게는 100개 이하의 잔기(또는 링커 또는 스페이서를 포함할 때 이의 등가물)이다.

B. 펩타이드모방체

변형된 Cav-1 펩타이드는 천연 Cav-1 폴리펩타이드의 생물학적 효과를 모방하는 펩타이드모방체 화합물일 수 있다. 펩타이드모방체 작용제는, 천연 Cav-1 폴리펩타이드의 결합 활성 및 생물학적 활성을 가지도록 천연 Cav-1 폴리펩타이드의 결합 요소의 입체공간적 특성을 재현하는 비천연 펩타이드 또는 비-펩타이드 작용제일 수 있다. 천연 Cav-1 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 다량체와 유사하게, 펩타이드모방체는 결합면(천연 Cav-1이 결합하는 임의의 리간드와 상호작용함) 및 비-결합면을 가질 것이다.

일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 부분 펩타이드 특징을 보유하는 화합물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드 내의 임의의 단백질가수분해로 불안정적인 결합은 선택적으로 비-펩타이드 요소, 예컨대, 등배전자체(N-메틸화; D-아미노산) 또는 감소된 펩타이드 결합에 의해 대체될 수 있는 반면, 분자의 나머지는 이의 펩타이드 성질을 보유한다.

효현제, 기질 또는 저해제인 펩타이드모방체 화합물은 다수의 생물활성 펩타이드/폴리펩타이드, 예컨대, 오피오이드 펩타이드, VIP, 트롬빈, HIV 프로테아제 등에 대하여 설명된 바 있다. 펩타이드모방체 화합물을 설계 및 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(Hruby, VJ, Biopolymers 33:1073-1082 (1993); Wiley, RA et al., Med. Res. Rev. 13:327-384 (1993); Moore et al., Adv. in Pharmacol 33:91-141 (1995); Giannis et al., Adv. in Drug Res. 29:1-78 (1997)). 2차 구조를 모방하는 특정 모방체는 문헌[Johnson et al., In: Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Chapman and Hall (Eds.), NY, 1993]에 기재되어 있다. 이러한 방법은 적어도 천연 Cav-1 폴리펩타이드의 결합 능력 및 특이성을 가지고 바람직하게는 또한 생물학적 활성을 갖는 펩타이드모방체를 제조하는 데 사용된다. 본 개시내용을 고려하여, 이와 같은 화합물을 설계하고 합성하기 위하여, 당업자가 이용 가능한 펩타이드 화학 및 일반 유기 화학에 대한 지식은 충분하다.

예를 들어, 이와 같은 펩타이도모방체는 리간드(예를 들어, 가용성 uPAR 또는 이의 단편)와 복합체로 결합되거나 유리 상태로 본 발명의 폴리펩타이드의 3차원 구조의 검사에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로, 리간드에 결합된 본 발명의 폴리펩타이드의 구조는 핵 자기 공명 분광법의 기법에 의해 얻을 수 있다. 펩타이드와 이의 리간드 또는 수용체의 상호작용에 대한 입체화학의 더 많은 지식은 이와 같은 펩타이드모방체 작용제의 합리적인 설계를 가능하게 할 것이다. 리간드의 부재 하에 본 발명의 펩타이드 또는 폴리펩타이드의 구조는 또한 모방체 분자의 설계를 위한 스캐폴드를 제공할 수 있다.

C. 페길화

변형된 Cav-1 펩타이드는 이종성 폴리펩타이드 분절 또는 중합체, 예컨대, 폴리에틸렌 글라이콜과 접합될 수 있다. 폴리펩타이드는 PEG에 연결되어 효소의 유체역학적 반경을 증가시켜 따라서 혈청 지속성을 증가시킬 수 있다. 폴리펩타이드는 임의의 표적화제, 예컨대, 외부 수용체에 특이적이고 안정적으로 결합하는 능력을 갖는 리간드에 접합될 수 있다(미국 특허 공개 제2009/0304666호).

특정 양태에서, 실시형태의 방법 및 조성물은 개시된 폴리펩타이드의 페길화와 관련된다. 페길화는 폴리(에틸렌 글라이콜) 중합체 사슬을 또 다른 분자, 일반적으로 약물 또는 치료 단백질에 공유 부착하는 과정이다. 페길화는 일상적으로 PEG의 반응성 유도체를 표적 거대분자와 함께 인큐베이션함으로써 달성된다. 약물 또는 치료 단백질에 대한 PEG의 공유 부착은 작용제를 숙주의 면역계로부터 "마스킹"하거나(면역원성 및 항원성 감소) 작용제의 유체역학적 크기(용액 중 크기)를 증가시켜 신장 클리어런스를 감소시킴으로써 순환 시간을 연장시킬 수 있다. 페길화는 또한 소수성 약물 및 단백질에 대하여 수용성을 제공할 수 있다.

페길화의 제1 단계는 한쪽 또는 양쪽 말단에서 PEG 중합체의 적합한 작용화이다. 동일한 반응성 모이어티로 각각의 말단에서 활성화되는 PEG는 "동종이작용성(homobifunctional)"으로 알려져 있는 반면, 존재하는 작용기가 상이하다면 PEG 유도체는 "이종이작용성(heterobifunctional)" 또는 "이종작용성"으로 지칭된다. PEG 중합체의 화학적으로 활성인 또는 활성화된 유도체는 PEG를 원하는 분자에 부착하기 위해 제조된다.

PEG 유도체에 적합한 작용기의 선택은 PEG에 커플링될 분자에서 이용 가능한 반응성 기의 유형을 기반으로 한다. 단백질에 있어서, 전형적인 반응성 아미노산은 라이신, 시스테인, 히스티딘, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 및 타이로신을 포함한다. N-말단 아미노기 및 C-말단 카복실산이 또한 사용될 수 있다.

제1 세대 PEG 유도체를 형성하는 데 사용되는 기법은 일반적으로 PEG 중합체를 하이드록실기, 전형적으로 무수물, 산 클로라이드, 클로로폼메이트, 및 카보네이트와 반응성인 기와 반응시키는 것이다. 제2 세대 페길화 화학에서는, 더 효율적인 작용기, 예컨대, 알데하이드, 에스터, 아마이드 등이 접합에 이용될 수 있다.

페길화의 응용이 점점 더 발전되고 정교해짐에 따라, 접합을 위한 이종이작용성 PEG에 대한 필요성이 증가하였다. 이러한 이종이작용성 PEG는, 친수성, 가요성, 및 생체적합성 스페이서가 필요한 2개의 실체를 연결하는 데 매우 유용하다. 이종이작용성 PEG에 대한 바람직한 말단기는 말레이미드, 비닐 설폰, 피리딜 다이설파이드, 아민, 카복실산, 및 NHS 에스터이다.

가장 일반적인 변형제, 또는 링커는 메톡시 PEG(mPEG) 분자를 기반으로 한다. 이의 활성은 알코올 말단에 단백질-변형기를 부가하는 것에 따라 다르다. 일부 경우에, 폴리에틸렌 글라이콜(PEG 다이올)은 전구체 분자로서 사용된다. 다이올은 이종- 또는 동종-이량체 PEG-연결 분자를 만들기 위해 양쪽 말단에서 후속적으로 변형된다.

단백질은 일반적으로 친핵성 부위, 예컨대, 비양성자화된 티올(시스테인일 잔기) 또는 아미노기에서 페길화된다. 시스테인일-특이적 변형 시약의 예는 PEG 말레이미드, PEG 요오도아세테이트, PEG 티올, 및 PEG 비닐설폰을 포함한다. 4가지 모두 온화한 조건 및 중성 내지 약 알칼리성 pH 하에서 강하게 시스테인일-특이적이지만, 각각 일부 단점을 가진다. 말레이미드와 형성된 티오에스터는 알칼리 조건 하에서 다소 불안정할 수 있으므로 이 링커를 이용하는 제형 옵션에 일부 제한이 있을 수 있다. 요오도 PEG와 형성된 카바모티오에이트 연결은 더 안정적이지만, 유리 요오드는 일부 조건 하에서 타이로신 잔기를 변형시킬 수 있다. PEG 티올은 단백질 티올과 이황화 결합을 형성하지만, 이 연결은 또한 알칼리 조건 하에서 불안정할 수 있다. PEG-비닐설폰 반응성은 말레이미드 및 요오도 PEG와 비교하여 상대적으로 느리지만; 그러나, 형성된 티오에스터 연결은 마우 안정적이다. 더 느린 반응 속도는 또한 PEG-비닐설폰 반응을 제어하기 더 쉽게 만들 수 있다.

천연 시스테인일 잔기에서 부위-특이적 페길화는 거의 수행되지 않는데, 이는 이들 잔기가 보통 이황화 결합의 형태이거나 생물학적 활성에 필요하기 때문이다. 반면에, 부위-지정 돌연변이유발은 티올-특이적 링커에 대한 시스테인일 페길화 부위를 포함하는 데 사용될 수 있다. 시스테인 돌연변이는 페길화 시약에 접근할 수 있고 페길화 후에도 여전히 생물학적으로 활성적이도록 설계되어야 한다.

아민-특이적 변형제는 PEG NHS 에스터, PEG 트레실레이트, PEG 알데하이드, PEG 아이소티오시아네이트, 및 기타 여러 가지를 포함한다. 모두 온화한 조건 하에서 반응하며 아미노기에 매우 특이적이다. PEG NHS 에스터는 아마도 더 반응성인 작용제 중 하나일 것이지만; 그러나, 이의 높은 반응성은 대규모로 페길화 반응을 제어하기 어렵게 만들 수 있다. PEG 알데하이드는 아미노기와 이민을 형성한 다음, 소듐 시아노보로하이드라이드를 이용하여 2차 아민으로 환원된다. 소듐 보로하이드라이드와 달리, 소듐 시아노보로하이드라이드는 이황화 결합을 환원시키지 않을 것이다. 그러나, 이러한 화학물질은 매우 독성이 강하므로, 특히 휘발성으로 되는 더 낮은 pH에서 조심스럽게 취급되어야 한다.

대부분의 단백질에 있는 다중 라이신 잔기로 인해, 부위-특이적 페길화는 난제일 수 있다. 다행히, 이러한 시약은 비양성자화된 아미노기와 반응하기 때문에, 더 낮은 pH에서 반응을 수행함으로써 더 낮은 pK 아미노기로 페길화를 유도하는 것이 가능하다. 일반적으로 알파-아미노기의 pK는 라이신 잔기의 엡실론-아미노기보다 1 내지 2 pH 단위 더 낮다. pH 7 이하에서 분자를 페길화함으로써, N-말단에 대한 높은 선택성을 자주 얻을 수 있다. 그러나, 이는 단백질의 N-말단 부분이 생물학적 활성에 필요하지 않은 경우에만 실현 가능하다. 또한, 페길화로 인한 약동학적 이점은 종종 시험관 내 생물활성의 상당한 손실보다 더 커서, 페길화 화학에 관계없이 훨씬 더 큰 생체 내 생물활성을 갖는 생성물을 생성한다.

페길화 절차를 개발할 때 고려해야 할 몇 가지 매개변수가 있다. 다행히, 보통 4개 또는 5개 이하의 주요 매개면수가 있다. 페길화 조건의 최적화에 대한 "실험 설계" 접근법은 매우 유용할 수 있다. 티올-특이적 페길화 반응의 경우, 고려해야 할 매개변수는, 단백질 농도, PEG-대-단백질 비율(몰 기준), 온도, pH, 반응 시간, 및 일부 경우에 산소의 배제를 포함한다. (산소는 단백질에 의한 분자간 이황화물 형성에 기여할 수 있어, 페길화 생성물의 수율을 감소시킬 것이다.) 특히 N-말단 아미노기를 표적화할 때 pH가 훨씬 더 중요할 수 있다는 점을 제외하고, 동일한 인자가 (산소를 제외하고) 아민-특이적 변형에 대해 고려되어야 한다.

아민- 및 티올-특이적 변형 둘 다에 있어서, 반응 조건은 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 이는 온도, 단백질 농도, 및 pH를 제한할 수 있다. 추가적으로, 페길화 반응을 시작하기 전에 PEG 링커의 반응성을 알아야 한다. 예를 들어, 페길화제가 70%만 활성인 경우, 사용되는 PEG의 양은 활성 PEG 분자만 단백질-대-PEG 반응 화학량론에서 계산되는 것을 보장하여야 한다.

D. 융합 단백질

본 발명의 특정 실시형태는 변형된 Cav-1 펩타이드의 융합 단백질에 관한 것이다. 이들 분자는 N- 또는 C-말단에서 이종 도메인에 연결된 실시형태의 폴리펩타이드를 가질 수 있다. 예를 들어, 융합은 또한 다른 종 유래의 리더 서열을 이용하여 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용할 수 있다. 융합 단백질은 반감기 연장제를 포함할 수 있다. 또 다른 유용한 융합은 단백질 친화성 태그, 예컨대, 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개의 히스티딘 잔기, 또는 면역학적으로 활성인, 바람직하게는 절단가능한, 도메인, 예컨대, 항체 에피토프의 부가를 포함하여, 융합 단백질의 정제를 용이하게 한다. 비-제한적인 친화성 태그는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP), 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)를 포함한다.

특정 실시형태에서, 실시형태의 펩타이드는 생체 내 반감기를 증가시키는 펩타이드, 예컨대, XTEN® 폴리펩타이드(Schellenberger et al., 2009), IgG Fc 도메인, 알부민, 또는 알부민 결합 펩타이드에 연결될 수 있다.

융합 단백질을 생성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이와 같은 단백질은, 예를 들어 완전한 융합 단백질의 새로운 합성에 의해, 또는 이종 도메인을 인코딩하는 DNA 서열의 부착에 이어, 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다.

모 단백질의 기능적 활성을 회복하는 융합 단백질의 생성은 나란히 연결된 폴리펩타이드 사이에서 스플라이싱된 펩타이드 링커를 인코딩하는 가교 DNA 분절과 유전자를 연결함으로써 용이하게 될 수 있다. 링커는 생성된 융합 단백질의 적절한 접힘을 가능하게 하기에 충분한 길이를 가질 것이다.

1. 링커

특정 실시형태에서, 실시형태의 폴리펩타이드는 이작용성 가교결합 시약을 사용하여 화학적으로 접합되거나 단백질 수준에서 펩타이드 링커와 융합될 수 있다.

이작용성 가교결합 시약은 친화성 매트릭스의 제조, 다양한 구조체의 변형 및 안정화, 리간드 및 수용체 결합 부위의 확인, 및 구조 연구를 포함하여, 다양한 목적에서 광범위하게 사용되어 왔다. 적합한 펩타이드 링커는 또한 실시형태의 폴리펩타이드, 예컨대, Gly-Ser 링커를 연결하는 데 사용될 수 있다.

2개의 동일한 작용기를 갖는 동종이작용성 시약은 동일 및 상이한 거대분자 또는 거대분자의 소단위 사이의 가교결합을 유도하고, 폴리펩타이드 리간드를 이들의 특이적 결합 부위에 연결시키는 데 매우 효율적인 것으로 입증되었다. 이종이작용성 시약은 2가지 상이한 작용기를 포함한다. 2가지 상이한 작용기의 차별적인 반응성을 이용함으로써, 가교결합은 선택적으로 그리고 순차적으로 제어될 수 있다. 이작용성 가교결합 시약은 이의 작용기, 예를 들어 아미노-, 설파이드릴-, 구아니딘-, 인돌-, 카복실-특이적 기의 특이성에 따라 나뉠 수 있다. 이 중에서, 유리 아미노기로 유도되는 시약은 이의 상업적 이용 가능성, 합성 용이성, 및 적용될 수 있는 온화한 반응 조건으로 인해 특히 인기가 있다.

대부분의 이종이작용성 가교결합 시약은 1차 아민-반응기 및 티올-반응기를 포함한다. 또 다른 예에서, 이종이작용성 가교결합 시약 및 가교결합 시약을 사용하는 방법은 설명되어 있다(구체적으로 본 명세서에 전문이 참조로 포함된, 미국 특허 제5,889,155호). 가교결합 시약은 친핵성 하이드라지드 잔기를 친전자성 말레이미드 잔기와 조합하여, 일 예에서 유리 티올에 대한 알데하이드의 커플링을 가능하게 한다. 가교결합 시약은 다양한 작용기를 가교결합시키도록 변형될 수 있다.

추가적으로, 당업자에게 알려진 임의의 다른 연결/커플링 작용제 및/또는 메커니즘이, 예를 들어 항체-항원 상호작용, 아비딘 비오틴 연결, 아마이드 연결, 에스터 연결, 티오에스터 연결, 에터 연결, 티오에터 연결, 포스포에스터 연결, 포스포르아마이드 연결, 무수물 연결, 이황화 연결, 이온 및 소수성 상호작용, 이중특이성 항체 및 항체 단편, 또는 이들의 조합과 같은 실시형태의 폴리펩타이드를 조합하는 데 사용될 수 있다.

혈액에서 합리적인 안정성을 갖는 가교결합제를 이용하는 것이 바람직하다. 표적화제 및 치료제/예방제를 접합시키는 데 성공적으로 이용될 수 있는 수많은 유형의 이황화-결합 포함 링커가 알려져 있다. 입체적으로 방해되는 이황화 결합을 포함하는 링커는 생체 내에서 더 큰 안정성을 제공하는 것으로 입증될 수 있다. 따라서 이러한 링커는 연결 작용제의 하나의 그룹이다.

장애 가교결합제에 추가적으로, 장애가 없는 링커도 또한 이에 따라 이용될 수 있다. 보호된 이황화물을 포함하거나 생성하는 것으로 간주되지 않는 다른 유용한 가교결합제는 SATA, SPDP, 및 2-이미노티올란을 포함한다(Wawrzynczak and Thorpe, 1987). 이와 같은 가교결합제의 사용은 당업계에서 잘 이해된다. 또 다른 실시형태는 가요성 링커의 사용을 포함한다.

일단 화학적으로 접합되면, 펩타이드는 일반적으로 정제되어 비접합된 작용제 및 다른 오염물질로부터 접합체를 분리할 것이다. 임상적으로 유용하게 만들기에 충분한 순도의 접합체를 제공하는 데 사용하기 위해 다수의 정제 기법이 이용 가능하다.

크기 분리를 기반으로 한 정제 방법, 예컨대, 겔 여과, 겔 투과, 또는 고성능 액체 크로마토그래피가 일반적으로 가장 많이 사용될 것이다. 다른 크로마토그래피 기법, 예컨대, 블루-세파로스(Blue-Sepharose) 분리가 또한 사용될 수 있다. 예컨대, 약한 세제, 예컨대, 소듐 N-라우로일-사르코신(SLS)을 사용하여, 봉입체로부터 융합 단백질을 정제하는 통상적인 방법이 유용할 수 있다.

2. 세포 침투 및 막 전좌 펩타이드

또한, 특정 양태에서, 변형된 Cav-1 펩타이드는 세포-결합 도메인 또는 세포 침투 펩타이드(CPP)를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "세포 침투 펩타이드" 및 "막 전좌 도메인"은 상호교환적으로 사용되며, 폴리펩타이드가 세포 막(예를 들어, 진핵 세포의 경우 원형질막)을 가로지르는 것을 가능하게 하는 폴리펩타이드 서열의 분절을 말한다. CPP 분절의 예는 HIV 태트(Tat)로부터 유래된 분절(예를 들어, GRKKRRQRRRPPQ(서열번호 21)), 헤르페스 바이러스 VP22, 드로소필라(Drosophila) 안테나페디아 호메오박스(Antennapedia homeobox) 유전자 산물, 프로테그린 I, 페네트라틴(Penetratin)(RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호 22)) 또는 멜리틴(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(서열번호 23))을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 특정 양태에서, CPP는 T1(TKIESLKEHG(서열번호 24)), T2(TQIENLKEKG(서열번호 25)), 26(AALEALAEALEALAEALEALAEAAAA(서열번호 26)) 또는 INF7(GLFEAIEGFIENGWEGMIEGWYGCG(서열번호 27)) CPP 서열을 포함한다.

III. 사용 방법

본 발명의 일 양태는 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드 및 이의 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 유도체의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 이들 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드 중 임의의 하나 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 담체 중 약제학적으로 허용 가능한 변형물을 대상체에게 투여하는 것, 폐의 질환, 손상 또는 감염(예를 들어, 폐의 섬유증 상태)을 치료 또는 예방의 처치에 사용하기 위한 조성물과 관련되며, 상기 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 중에 실시형태의 폴리펩타이드를 포함한다.

A. 약제학적 조성물

변형된 Cav-1 펩타이드는 세포 아포토시스를 억제하고 폐 조직에 대한 손상을 치료 및 예방하기 위해 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 이는 정맥내, 초내, 및/또는 복강내 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 폴리펩타이드는 기도로 국소적으로, 예컨대, 분무화 제형 또는 흡입용 건조 분말 제형의 투여로 전달된다. 이는 단독으로 또는 항-섬유증 화합물과 조합하여 투여될 수 있다.

변형된 Cav-1 펩타이드는 폐 섬유증에 대한 적어도 하나의 추가적인 치료제와 조합하여 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 추가적인 치료제는 NSAID, 스테로이드, DMARD, 면역억제제, 생물학적 반응 조절제, 기관지확장제, 또는 항섬유증 작용제, 예컨대, 피르페니돈, 항섬유증 작용 메커니즘이 완전하게 이해되지 않지만 TGF-베타의 차단을 포함할 수 있는 작용제, 닌테다닙, 광범위한 타이로신 키나제 차단제 또는 임의의 다른 항섬유증 작용제일 수 있다. 적합한 NSAID는 비-선택적 COX-저해제 아세틸살리실산, 메살라진, 이부프로펜, 나프록센, 플루르비프로펜, 페노프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, 인도프로펜, 피르프로펜, 카프로펜, 옥사프로진, 프라노프로펜, 미로프로펜, 티옥사프로펜, 수프로펜, 알미노프로펜, 티아프로펜산, 플루프로펜, 인도메타신, 설린닥, 톨메틴, 조메피락, 나부메톤, 디클로페낙, 펜클로페낙, 알클로페낙, 브롬페낙, 이부페낙, 아세클로페낙, 아세메타신, 펜티아작, 클리다낙, 에토돌락, 옥스피낙, 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 니플루민산, 톨페남산, 디플루니살, 플루페니살, 피록시캄, 테녹시캄, 로르녹시캄 및 니메설리드 및 이들의 약제학적으로 허용 가능한 염, 선택적인 COX 2-저해제인 멜록시캄, 셀레콕십 및 로페콕십 및 이들의 약제학적으로 서용가능한 염으로부터 선택된다. 적합한 스테로이드는 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손, 부데노사이드, 플루오코르톨론 및 트리암시놀론이다. 적합한 DMARD는 설파살라진, 올살라진, 클로로퀸, 금 유도체(오라노핀), D-페니실라민 및 세포증식억제제, 예컨대, 메토트렉세이트 및 사이클로포스파미드이다. 적합한 면역억제제는 사이클로스포린 A 및 이의 유도체, 마이코페놀레이트 모페틸, FK 506, OKT-3, ATG, 15-데스옥시스페르구알린, 미조리빈, 미소프로스톨, 라파마이신, 레플루노미드 및 아자티오프린이다. 적합한 생물학적 반응 조절제는 인터페론 β, 항-TNF-α(에타너셉트), IL-10, 항-CD3 또는 항-CD25이다. 적합한 기관지확장제는 이프라트로피움브로마이드, 옥시트로피움브로마이드, 티오트로피움브로마이드, 에피네프린하이드로클로라이드, 살부타몰, 테르부탈린설페이트, 페노테롤하이드로브로마이드, 살메테롤 및 포르모테롤이다. 이와 같은 조합에서 각각의 활성 성분은 통상적인 투약량 범위 또는 통상적인 투약량 범위 미만의 용량에 따라 투여될 수 있다. 조합된 NSAID, 스테로이드, DMARD, 면역억제제 및 생물학적 반응 조절제에 대한 투약량은 일반적으로 권장되는 최저 용량의 대략 1/50 내지 최대 일반적으로 권장되는 투약량의 1/1, 바람직하게는 1/20 내지 1/2, 더 바람직하게는 1/10 내지 1/5이다. 조합된 약물에 대해 일반적으로 권장되는 용량은 예를 들어 독일의약품집(Rote Liste® 2002; 에디티오 칸토르 페어락(Editio Cantor Verlag), 독일 아울렌도르프 소재) 또는 미국 의사처방참고집(Physician's Desk Reference)에 개시된 용량인 것으로 이해되어야 한다.

임상 적용이 고려되는 경우, 의도된 적용에 적절한 형태로 단백질, 항체, 및 약물을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 유효량의 실시형태의 폴리펩타이드 또는 약제학적으로 허용 가능한 담체에 용해되거나 분산된 추가적인 작용제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 어구 "약제학적으로 또는 약리학적으로 허용 가능한"은, 예를 들어 적절한 경우 인간과 같은 동물에게 투여될 때 유해, 알레르기, 또는 다른 불리한 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 말한다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해 단리된 실시형태의 적어도 하나의 폴리펩타이드, 또는 추가적인 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 제조는, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990]에 예시된 바와 같이, 본 개시내용에 비추어 당업자에게 알려질 것이다. 또한, 동물(예를 들어, 인간) 투여의 경우, 제제는 생물 표준 FDA 사무국(FDA Office of Biological Standards)이 요구하는 무균성, 발열성, 일반 안전성, 및 순도 표준을 충족해야 한다는 것이 이해될 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 당업자에게 알려진 바와 같은 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 보존제(예를 들어, 항균제, 항진균제), 등장화제, 흡수지연제, 염, 보존제, 약물, 약물 안정화제, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 이들의 유사 물질 및 조합을 포함한다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] 참조). 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 약제학적 조성물에서 이의 사용이 고려된다.

본 발명의 특정 실시형태는 이것이 고체, 액체, 또는 에어로졸 형태로 투여되어야 하는지 여부, 및 투여 경로, 예컨대, 주사를 위해 멸균될 필요가 있는지 여부에 따라서 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 당업자에게 공지된 바와 같이 정맥내, 초내, 피내, 경피내, 초내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국부, 국소로, 흡입에 의해(예를 들어, 분무 또는 건조 분말 제형의 흡입), 주사에 의해, 주입에 의해, 연속 주입에 의해, 직접적으로 표적 세포를 적시는 국소 관류에 의해, 카테터를 통해, 세척(lavage)을 통해, 지질 조성물(예를 들어, 리포좀)로, 또는 다른 방법 또는 상기한 것의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990] 참조).

변형된 폴리펩타이드는 유리 염기, 중성, 또는 염 형태로 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염, 예를 들어 단백질 조성물의 유리 아미노기로 형성된 것, 또는 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 또는 만델산과 같은 유기산으로 형성된 것을 포함한다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한, 예를 들어 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 또는 수산화3가철과 같은 무기 염기; 또는 아이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 또는 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화시, 용액은 투약 제형과 양립가능한 방식으로 그리고 치료적으로 유요한 양으로 투여될 것이다. 제형은 비경구 투여, 예컨대, 주사가능한 용액, 또는 폐로 전달하기 위한 에어로졸용으로 제형화된 것, 또는 소화기 투여용, 예컨대, 약물 방출 캡슐 등으로 제형화된 것과 같은 다양한 투약 형태로 용이하게 투여된다.

또한 본 발명의 특정 양태에 따르면, 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제를 포함하거나 포함하지 않는 약제학적으로 허용 가능한 담체로 제공될 수 있다. 담체는 동화가능하여야 하고 액체, 반고체, 즉, 페이스트, 또는 고체 담체를 포함한다. 임의의 통상적인 매질, 작용제, 희석제, 또는 담체가 수용자에게 또는 이에 포함된 조성물의 치료적 효과에 해로운 경우를 제외하고, 방법을 실시하는 데 사용하기 위한 투여가능한 조성물에서 이의 사용은 적절하다. 담체 또는 희석제의 예는 지방, 오일, 물, 식염수 용액, 지질, 리포좀, 수지, 결합제, 충전제 등, 또는 이들의 조합을 포함한다. 조성물은 또한 하나 이상의 성분의 산화를 지연시키기 위해 다양한 항산화제를 포함할 수 있다. 추가적으로, 미생물의 작용 방지는 보존제, 예컨대, 파라벤(예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 항균제 및 항진균제에 의해 야기될 수 있다.

본 발명의 특정 양태에 따르면, 조성물은 임의의 편리하고 실질적인 방식으로, 즉, 용액, 현탁액, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 조합된다. 이와 같은 절차는 당업자에게 일상적이다.

본 발명의 특정 실시형태에서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 완전히 조합되거나 혼합된다. 혼합은 임의의 편리한 방식, 예컨대, 분쇄로 수행될 수 있다. 치료 활성의 손실, 즉, 위에서의 변성으로부터 조성물을 보호하기 위해 안정화제가 또한 혼합 공정에 추가될 수 있다. 조성물에서 사용하기 위한 안정화제의 예는 완충액, 아미노산, 예컨대, 글리신 및 라이신, 탄수화물, 또는 동결건조보조제, 예컨대, 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 솔비톨, 만니톨 등을 포함한다.

일부 양태에서, 약제학적 제형은 하나 이상의 계면활성제를 포함한다. 개시된 방법에 따라 사용되는 계면활성제는 이온성 및 비이온성 게면활성제를 포함한다. 대표적인 비이온성 계면활성제는 폴리솔베이트, 예컨대, TWEEN®-20 및 TWEEN-80® 계면활성제(ICI 아메리카스 인코포레이티드(ICI Americas Inc.), 미국 뉴저지주 브리지워터 소재); 폴록사머(예를 들어, 폴록사머 188); TRITON® 계면활성제(시그마(Sigma), 미국 미주리주 세인트루이스 소재); 소듐 도데실 설페이트(SDS); 소듐 라우렐 설페이트; 소듐 옥틸 글라이코사이트; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일-, 또는 스테아릴-설포베타인; 라우릴-, 미리스틸-, 리놀레일- 또는 스테아릴-사르코신; 리놀레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필-, 코카미도프로필-, 리놀레아미도프로필-, 미리스트아미도프로필-, 팔니도프로필-, 또는 (예를 들어, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 아이소스테아르아미도프로필-다이메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 다이소듐 메틸 올레일-타우레이트; 모나쿠아트(MONAQUAT)(상표) 계면활성제(모나 인더스트리스 인코포레이티드(Mona Industries Inc.), 미국 뉴저지주 패터슨 소재); 폴리에틸 글라이콜; 폴리프로필 글라이콜; 에틸렌 및 프로필렌 글라이콜의 블록 공중합체, 예컨대, PLURONIC® 계면활성제(바스프(BASF), 미국 뉴저지주 마운트 올리브 소재); 올리고 (에틸렌 옥사이드) 알킬 에터; 알킬 (티오) 글루코사이드, 알킬 말토사이드; 및 인지질을 포함한다. 예를 들어, 계면활성제는 약 0.01% 내지 약 0.5%(제형의 다른 고체 성분의 총 중량에 대한 계면활성제의 중량; "w/w"), 약 0.03% 내지 약 0.5%(w/w), 약 0.05% 내지 약 0.5%(w/w), 또는 약 0.1% 내지 약 0.5%(w/w)의 양으로 제형에 존재할 수 있다. 그러나, 추가 양태에서, 실시형태의 약제학적 제형에는 본질적으로 비이온성 계면활성제가 없거나 본질적으로 모든 계면활성제가 없다.

본 발명의 치료 방법과 관련하여, 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 펩타이드 또는 이의 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 유도체의 투여는 특정 투여 방식, 투약량, 또는 투약 빈도로 제한되는 것으로 의도되지 않으며; 본 발명은, 근육내, 정맥내, 복강내, 방광내, 관절내, 병변내, 피하, 또는 염증-관련 장애를 치료하기에 적절한 용량을 제공하기에 충분한 임의의 다른 경로를 포함하는 모든 투여 방식을 고려한다. 치료제는 단일 용량 또는 다중 용량으로 환자에게 투여될 수 있다. 다중 용량이 투여될 때, 용량은, 예를 들어 1시간, 3시간, 6시간, 8시간, 1일, 2일, 1주, 2주, 또는 1개월만큼 서로 분리될 수 있다. 예를 들어, 치료제는, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20주, 또는 그 이상 동안 투여될 수 있다. 임의의 특정 대상체에 대해, 특정 투약 요법은 조성물을 투여하거나 조성물의 투여를 감독하는 사람의 개인적인 필요 및 전문적인 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정되어야 함이 이해되어야 한다. 예를 들어, 더 낮은 용량이 충분한 치료 활성을 제공하지 않는다면, 치료제의 투약량은 증가될 수 있다.

주치의가 궁극적으로 적절한 양 및 투약 요법을 결정할 것이지만, 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이의 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 유도체의 치료적으로 유효한 양은 0.0001, 0.01, 0.01 0.1, 1, 5, 10, 25, 50, 100, 500, 또는 1,000㎎/㎏ 또는 g/㎏의 용량으로 제공될 수 있다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 생물검정 또는 시스템으로부터 유래된 용량-반응 곡선에서 추정될 수 있다.

특정 환자 또는 대상체에 대한 투약량은 통상적인 고려사항을 사용하여 (예를 들어, 적절한 통상적인 약리학적 프로토콜에 의해) 당업자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 의사는 처음에는 상대적으로 낮은 용량을 처방한 다음, 적절한 반응이 얻어질 때까지 용량을 증가시킬 수 있다. 환자에게 투여되는 용량은 시간이 경과함에 따라 환자에서 유익한 치료 반응을 가져오거나, 예를 들어 적용에 따라 증상, 또는 다른 적절한 활성을 감소시키기에 충분하다. 용량은 특정 제형의 효능, 및 본 명세서에 개시된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 이의 돌연변이체, 변이체, 유사체 또는 유도체의 활성, 안정성 또는 혈청 반감기 및 환자의 상태뿐만 아니라, 치료될 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정된다.

일부 양태에서, 대상체는 단일 용량을 제공받고, 대상체, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 폐 섬유증을 앓고 있거나 이에 취약한 인간을 치료하기 위해 1일 1회, 약 0.2㎎/㎏ 내지 약 250㎎/㎏, 예컨대, 약 10㎎/㎏ 내지 약 50㎎/㎏으로, 예를 들어 (흡입에 의한) 점적주사를 통해 제공된다. 이와 같은 용량은 어디에서든 약 3일 내지 1주 이상 동안 매일 투여될 수 있다. 당업계에서 잘 이해되는 바와 같이 용량을 하향 조정해야 할 필요가 있을 수 있지만, 만성 투여도 또한 가능하다. 그러나, 개별 치료 요법에서 변수의 수가 많고, 이러한 바람직한 값으로부터 상당한 변동이 예상되기 때문에, 상기한 범위는 암시적이다.

예를 들어 하기 기재된 일부 실험에서 사용된 삼투 펌프와 같은 펌프 시스템에 의한 연속 투여의 경우, 약 1 내지 2주의 시간 경과 동안 총 투약량은 바람직하게는 1㎎/㎏ 내지 1 g/㎏, 바람직하게는 20 내지 300㎎/㎏, 더 바람직하게는 50 내지 200㎎/㎏의 범위이다. 이와 같은 연속 투약 요법 후, 활성 화합물의 총 농도는 바람직하게는 약 0.5 내지 약 50μM, 바람직하게는 약 1 내지 약 10μM의 범위이다.

시험관 내 아포토시스를 억제하거나 억제를 예방하기 위한 활성 화합물의 유효 농도는 약 0.5nM 내지 약 100nM, 더 바람직하게는 약 2nM 내지 약 20nM의 범위이다. 유효 용량 및 최적 용량 범위는 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 시험관 내에서 결정될 수 있다.

B. 에어로졸 분산 및 분무 장치

제트 네뷸라이저, 초음파 네뷸라이저, 정량흡입기(MDI), 및 제트 또는 노즐을 통한 강제 통과에 의한 액체의 에어로졸화를 위한 장치(예를 들어, 에러다임(Aradigm; 미국 캘리포니아주 헤이워드 소재)의 AERX® 약물 전달 장치)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 장치를 사용하여 제형이 에어로졸화될 수 있다. 또한, 화합물은 건조 분말 흡입기 장치를 사용하여 전달을 위한 건조 분말로서 제형화될 수 있다. 대상체에게 제형을 전달하기 위해, 본 명세서의 하기에서 추가로 기재되는 바와 같이, 폐 전달 장치는 또한 선택적으로 마스크, 마우스피스, 미스트 흡입 장치, 및/또는 사용자가 정확하게 흡입하도록 안내하고 호흡 중에 적절한 시간에 약물을 자동으로 전달하는 플랫폼과 조합하여, 산소호흡기를 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 대표적인 에어로졸화 장치는 미국 특허 제6,357,671호; 제6,354,516호; 제6,241,159호; 제6,044,841호; 제6,041,776호; 제6,016,974호; 제5,823,179호; 제5,797,389호; 제5,660,166호; 제5,355,872호; 제5,284,133호; 및 제5,277,175호 및 미국 공개 특허 출원 공개 제20020020412호 및 제20020020409호에 기재된 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.

제트 네뷸라이저를 사용하여 압축기 또는 병원 공기 배관으로부터 압축된 기체가 제트로 알려진 좁은 협착부를 통과한다. 이는 저압 영역을 형성하고, 저장소 유래의 액체 약물이 공급 튜브를 통해 끌어올려져 기류에 의해 액적으로 부수어진다. 가장 작은 방울만 네뷸라이저를 직접 떠나는 반면, 배플과 벽에 미치는 대부분의 영향은 저장소로 되돌아간다. 결과적으로 제트 분무를 수행하는 데 필요한 시간은 다른 요인들 중에서 분무될 조성물의 부피에 따라 달라지며, 이와 같은 시간은 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있다.

정량흡입기(MDI)는 네뷸라이저를 사용하여 전형적으로 전달되는 것보다 더 농축된 형태로 본 발명의 조성물을 전달하는 데 사용될 수 있다. 최적 효과를 위해, MDI 전달 시스템은 적절한 투여 기법이 필요하며, 이는 흡입과 함께 에어로졸 전달의 통합된 작동, 초당 약 0.5 내지 0.75 리터의 느린 흡입, 흡기 용량 흡입에 접근하는 심호흡, 및 적어도 4초의 숨참기를 포함한다. MDI를 사용한 폐 전달은 치료가 비교적 짧은 치료 시간과 저렴한 비용으로 이익을 얻을 때 편리하고 적합하다. 선택적으로, 제형은 효과적인 액적 제형 및 후속 전달을 촉진시키기 위해 분무 동안 약 25℃ 내지 90℃로 가열될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,299,566호를 참조한다.

실시형태의 에어로졸 조성물은 폐 내에서 효율적인 전달에 적합한 크기인 조성물을 액적을 포함한다. 일부 경우에, 계면활성제 제형은 폐 기관지, 더 바람직하게는 세기관지, 훨씬 더 바람직하게는 폐포관, 훨씬 더 바람직하게는 폐포로 전달된다. 에어로졸 액적은 전형적으로 직경이 약 15㎛ 미만, 직경이 약 10㎛ 미만, 직경이 약 5㎛ 미만, 또는 직경이 약 2㎛ 미만이다. 인간 대상체의 폐포 기관지로의 효율적인 전달을 위해, 에어로졸 조성물은 바람직하게는 직경이 약 1㎛ 내지 약 5㎛인 액적을 포함할 수 있다.

액적 크기는 당업계에 알려진 기법, 예를 들어 캐스케이드, 충돌, 레이저 회절, 및 광학 패턴화를 사용하여 평가될 수 있다. 문헌[McLean et al. (2000) Anal Chem 72:4796-804], [Fults et al. (1991) J Pharm Pharmacol 43:726-8], 및 [Vecellio None et al. (2001) J Aerosol Med 14:107-14]을 참조한다.

에어로졸화 후 단백질 안정성은 크기 배제 크로마토그래피; 전기영동 기법; 분광 기법, 예컨대, UV 분광법 및 원편광이색성 분광법, 및 단백질 활성(시험관 내 또는 생체 내에서 측정됨)을 포함하는 당업계의 알려진 기법을 사용하여 평가될 수 있다. 단백질 안정성의 시험관 내 분석을 수행하기 위해, 에어로졸 조성물을 수집한 다음 증류하거나 필터에 흡수시킬 수 있다. 생체 내 분석을 수행하거나, 대상체에게 조성물의 폐 투여를 위해, 에어로졸화 장치가 대상체에 의한 흡입에 적합화된다. 예를 들어, 단백질 안정성은 단백질 응집의 수준을 결정함으로써 평가될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 에어로졸 조성물에는 실질적으로 단백질 응집체가 없다. 가용성 응집체의 존재는 DLS(DynaPro-801TC, 프로틴솔루션즈 인코포레이티드(ProteinSolutions Inc.), 미국 버지니아주 샬러츠빌 소재)를 사용하여 및/또는 UV 분광광도법에 의해 정성적으로 결정될 수 있다.

용어 "진동 메쉬 네뷸라이저"는 본 명세서에서 미세 입자, 저속 에어로졸을 생성하기 위해 진동 메쉬 또는 다중 개구부를 갖는 플레이트(개구 플레이트)를 사용하는 일반적인 원리로 작동하는 임의의 네뷸라이저를 말한다. 일부 네뷸라이저는 1000 내지 7000개의 구멍이 있는 메쉬/막을 포함할 수 있으며, 메쉬/막은 액체 저장소의 상단에서 진동한다(예를 들어, 각각 본 명세서에 참조로 포함된, 미국 특허 공개 제20090134235호 및 문헌[Waldrep and Dhand 2008] 참조). 일부 실시형태에서, 진동 메쉬 네뷸라이저는 AERONEB® 프로페셔널 네뷸라이저(Professional Nebulizer), Omron MICROAIR®, Pari EFLOW® 또는 EZ Breathe Atomizer이다. 일부 양태에서, 진동 메쉬 네뷸라이저는 진동 주파수가 약 50 내지 250 ㎑, 75 내지 200 ㎑, 100 내지 150 ㎑ 또는 약 120 ㎑이다. 이들 장치는 폐로 에어로졸을 전달하는 효율이 높고 이들 장치에 남아있는 액체의 부피가 최소화되어, 플라스미노겐 활성화인자와 같은 값이 비싸고 강력한 화합물에 유리하다.

특정 양태에서, 실시형태의 분무된 조성물은 진동 메쉬 네뷸라이저를 사용하여 생성된다. 예를 들어, 조성물은 능동 진동 메쉬 네뷸라이저(예를 들어, Aeroneb® 프로페셔널 네뷸라이저 시스템)를 이용하여 생성될 수 있다. 이와 같은 시스템 및 작동에 대한 설명은, 예를 들어 미국 특허 제6,921,020호; 제6,926,208호; 제6,968,840호; 제6,978,941호; 제7,040,549호; 제7,083,112호; 제7,104,463호; 및 제7,360,536호에서 찾아볼 수 있으며, 이들 각각은 본 명세서에 전문이 참조로 포함된다. 또 다른 양태에서, 실시형태의 조성물은 수동 진동 메쉬 네뷸라이저, 예컨대, Omron MICROAIR® 또는 EZ Breathe Atomizer를 이용하여 생성될 수 있다.

IV. 치료 대상 폐 병태

본 발명의 변형된 펩타이드는 다양한 폐 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 치료 대상 폐 병태는 급성 또는 만성일 수 있다. 급성 폐 병태는 급성 폐 손상, 감염 또는 화학물질로 유발된 것일 수 있다. 만성 폐 병태는 손상, 감염 또는 질환의 결과일 수 있다.

A. 폐 손상

일부 양태에서, 대상체는 급성 폐 손상(ALI) 또는 감염 또는 화학물질로 유발된 폐 손상을 가진다. 특정 양태에서, 대상체는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS), 흡입 연기 유발 급성 폐 손상(ISALI), 기관지 확장증, 흡입 독소-유발 기도 질환(예를 들어, 염소 또는 기타 유발 기도 질환), 머스타드 가스에의 노출, 미립자 물질(예를 들어, 실리카 먼지)에의 노출, 폐쇄 세기관지염, 폐쇄 세기관지 기질화 폐렴, 약물 유발 폐 질환 및 가속화된 폐 섬유증(예를 들어, ARDS를 포함하는 급성 폐 손상 후 일어남)을 가진다. 급성 폐 손상(ALI)은 미국 군인들 사이에서 심각한 의학적 문제이다. 전투 동안 ALI는 매우 광범위한 원인으로 발생할 수 있다.

흡입 손상으로 인한 ALI는 흡입되는 항응고제, 스테로이드, 베타-작용제, 고주파환기, 및 체외막 산소공급으로 치료되었으며, 다양하면서, 일반적으로는 차선인 결과를 가져왔다. 호흡기 마스크가 있는 장벽 이외에 이용 가능한 효과적인 예방 조치는 없다. ARDS의 관리는 상당히 진전되었지만 내인성 치유 메커니즘이 효력을 발휘하는 것을 주의깊게 기다리면서 주로 유지 상태를 지속하고; 병원 내 사망률은 40% 초과로 유지된다(Matthay et al., 2012). ALI의 생존자는 종종 삶의 질이 감소되는 만성 호흡기 장애를 겪는다. 회복을 가속화하고/하거나 이후의 합병증, 예컨대, 만성 호흡 부전 및 폐 섬유증을 예방할 수 있는 임의의 양상이 매우 바람직할 것이다. 조기 진단 및 훨씬 더 중요하게는 ALI의 예방 및 치료를 개선해야 하는 절박한 필요성이 존재한다. 직접 흡입성 폐 손상 또는 전신 질병의 결과로 인한 ARDS로 인한 ALI의 병리생리학은 매우 복잡하고 이질적이며, 전신뿐만 아니라 국소 심폐 요인, 예컨대, 막 투과성 증가, 염증성 사이토카인의 유입, 산화성 세포 손상, 구획 유체 이동, 이온 채널 이상, 및 다수의 기타 요인이 있다(Matthay et al., 2012). 분명히, 폐 장애, 예컨대, ALI를 치료 및 예방하기 위한 신규 치료법이 필요하다.

일부 실시형태에서, FTTFTVT(서열번호 2)의 아미노산 서열에 대하여 적어도 하나의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입을 포함하는 유효량의 변이 폴리펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 급성 폐 손상, 폐 감염 또는 폐 질환을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되며, 여기서 변이 폴리펩타이드는 카베올린-1(Cav-1)의 생물학적 활성을 유지한다. 일부 양태에서, 실시형태의 약제학적 제형을 투여하는 방법은 변이 폴리펩타이드를 포함하는 용액을 분무하는 단계를 포함한다. 특정 양태에서, 대상체는 인간이다.

B. 폐 질환

폐 질환은 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 천식, 폐쇄 세기관지염, 플라스틱 기관지염, 및 폐 감염, 콜라겐 혈관 폐 질환(예를 들어, 루푸스, 피부경화증 또는 혼합 결합 조직병으로 인함), 간질성 폐 질환(예를 들어, 특발성 폐 섬유증 또는 사르코이드증)뿐만 아니라, 섬유증으로 이어지는 급성 및 만성 폐 손상을 포함한다(Murray et al., 1997; Rabe et al., 2007; Tsushima et al., 2009). 이들 질환은 전 세계적으로 세 번째 주요 사망 원인에 해당한다.

낭포성 섬유증은 주로 소화기계 및 호흡기계에 영향을 미치는 외분비선 및 외분비 땀샘의 유전 질환이다. 이 질환은 보통 만성 호흡기 감염, 췌장 부전증, 비정상적인 점성의 점액질 분비 및 조기 사망을 특징으로 한다. 낭포성 섬유증(CF)은 진행성 기류 폐쇄를 특징으로 한다. CF가 있는 개체의 하위집합은 또한 흡입되는 콜린성 효현제에 대해 기도 과민반응(Weinberger, 2002 및 Mitchell et al., 1978) 및 기관지확장제에 대한 반응으로 기류 제한의 가역성을 나타낸다(van Haren et al., 1991 및 van Haren et al., 1992). 기관지 과민반응 및 기도 폐쇄의 존재는 CF와 천식 또는 기도 평활근 기능 장애가 질환 과정에 기여하는 것으로 생각되는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)과 같이 기도를 협착시키는 다른 질환 사이에 질환의 가능한 병인 공유를 시사한다.

폐 감염은 박테리아 감염일 수 있다. 감염성 박테리아는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 살메넬로시스(Salmenellosis), 예르시나 페스티스(Yersina pestis), 마이코박테리움 레프래(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 아프리카눔(M. africanum), 마이코박테리움 아시아티쿰(M. asiaticum), 마이코박테리움 아비우인-인트라셀룰라레, 마이코박테리움 첼로네이 압세수스(M. chelonei abscessus), 마이코박테리움 팔락스(M. fallax), 마이코박테리움 포투이툼(M. fortuitum), 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii), 마이코박테리움 레프래(M. leprae), 마이코박테리움 말모엔스(M. malmoense), 마이코박테리움 시모이데이(M. shimoidei), 마이코박테리움 시미애(M. simiae), 마이코박테리움 스줄가이(M. szulgai), 마이코박테리움 제노피(M. xenopi), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(M. tuberculosis), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 브루셀라 수이스(Brucella suis), 브루셀라 아보르투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 레지오넬라 뉴모노필라(Legionella pneumonophilia), 프란시셀라 투라렌시스(Francisella tularensis), 뉴노시스티스 카리니(Pneurnocystis carinii), 마이코플라스마(mycoplasma), 또는 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia)일 수 있다. 박테리아 감염은 폐렴을 초래할 수 있다.

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 2가지 주요 기류 폐쇄 장애인 만성 기관지염 및 폐기종을 분류하는 데 사용되는 용어이다. 대략 1,600만 명의 미국인이 COPD를 앓고 있으며, 이 중 80 내지 90%는 평생 동안 흡연자였다. COPD는 2003년에 122,283명의 사망을 기록한, 미국에서 주요 사망 원인이다. COPD에 대한 미국의 비용은 2003년에 직접 의료비로 대략 209억 달러였다. 만성 기관지염은 기관지 기도의 염증이다. 기관지 기도는 기관을 폐와 연결한다. 염증이 생기면, 기관지관이 점액을 분비하여, 만성 기침을 유발한다.

폐기종에서, 폐포낭은 폐의 엘라스틴 골격의 손상으로 인해 과도하게 팽창된다. 폐기종성 폐에서 염증 세포는 엘라스타제 효소를 방출하며, 엘라스타제 효소는 폐 매트릭스 내에서 엘라스틴 섬유를 분해하거나 손상시킨다. 폐기종에는, 흡연, 환경 오염물질에 대한 노출, 알파-1 항트립신 결핍, 및 노화를 포함하여 다수의 원인이 있다.

기관지염은 바이러스성 하기도 감염에 의해 가장 흔하게 유발되며, 주로 급성염증, 부종, 소기도 내벽의 상피 세포의 괴사, 및 점액 생성 증가를 특징으로 한다(Ralston et al., 2014). 징후 및 증상은 전형적으로 비염과 기침으로 시작되며, 이는 빈호흡, 천명, 라음(rale), 부근(accessory muscle)의 사용, 및/또는 코벌렁임으로 진행될 수 있다.

폐쇄 세기관지염은 폐의 소기도의 비정상적인 재형성의 결과로 인한 점진적인 기류 감소이다(Meyer et al., 2014). 폐쇄 세기관지염 증후군은 폐 이식의 주요 합병증이며, 종종 다른 알려진 원인으로 유발된 것이 아닌 강제 호기량 및 힘의 지속적인 감소를 초래하는 지연된 동종이식편 기능장애를 설명하는 데 사용된다(Meyer et al., 2014).

용어 "천식"은 급성 천식, 만성 천식, 간헐적 천식, 경증 지속성 천식, 중등증 지속성 천식, 중증 지속성 천식, 만성 지속성 천식, 경증 내지 중등증 천식, 경증 내지 중등증 지속성 천식, 경증 내지 중등증 만성 지속성 천식, 알레르기성 (외인성) 천식, 비-알레르기성 (내인성) 천식, 야행성 천식, 기관지 천식, 운동 유발 천식, 직업성 천식, 계절성 천식, 침묵 천식, 위식도 천식, 특발성 천식 및 기침 변형 천식을 말할 수 있다. 천식 동안, 기도에 지속적으로 염증이 생기고 때때로 경련이 발생할 수 있다.

V. 실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기법은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 본 발명자에 의해 발견된 기법을 나타내며, 따라서 본 발명의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자는 이해해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 개시된 특정 실시형태에서 다양한 변화가 이루어질 수 있고 여전히 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 유사하거나 비슷한 결과를 얻을 수 있다는 것을 이해해야 한다.

실시예 1 - Cav -1 펩타이드 용해도

액체 제형에서 가장 가용성이 높을 수 있는 펩타이드를 결정하기 위해, 각각의 Cav-1 펩타이드 50㎎을 5㎖의 트리스 완충 식염수(pH 7.51)에 용해시켰다. 샘플이 완전하게 용해되는 것을 돕기 위해 각각의 샘플을 볼텍싱하였다. 불용성 펩타이드의 경우 펩타이드의 용해 직후, 또는 가용성 펩타이드의 경우 10분 후 600㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 각각 용해 후 15분, 5분 또는 15분 후에 두 번째로 측정한 샘플 APi2348, APi2352, APi2353을 제외하고 불용성 펩타이드의 경우 10분 후에 흡광도를 다시 측정하였다. 샘플 APi2345는, 용해가 불완전하였기 때문에, 용해 후 20분 후에만 측정하였다(표 2). 또한 24시간 후에 pH를 테스트하였다.

샘플 APi2350, APi2354, APi2355 및 APi2356은 다른 테스트한 펩타이드와 비교하여 pH 7.51에서 증가된 용해도를 가졌다(표 2). pH는 24시간 후에 모든 샘플에 대해 대략 pH 7.5에서 안정적으로 유지되었다.

실시예 2 - Cav -1 펩타이드는 평활근 액틴 생성을 증가시킨다

Cav-1 펩타이드를 DMSO에 용해시켜 10mM 스톡 용액을 만들었다. 그 다음 각각의 펩타이드의 10mM 스톡 용액을 HBSS에 희석하여 900μM 작업 스톡 용액을 만들었다. DMSO 재현탁된 폴리펩타이드뿐만 아니라 작업 스톡을 -20℃에서 저장하였다. 배양 배지의 경우, 작업 스톡을 DMEM 배양 배지에 첨가하여 Cav-1 펩타이드의 최종 농도가 10μM이 되게 하였다.

특발성 폐 섬유증(IPF) 세포주 2051을 구입하고 4번째 계대 유래의 IPF 세포를 DMEM, 10% FBS, 및 1% P/S를 포함하는 100㎜ 플레이트에 파종하였다. IPF 세포를 4㎖ DMEM + 1%P/S로 세척하고 밤새 혈청을 고갈시켰다. 그 다음 세포를 2일 동안 44㎕ HBSS(음성 대조군), 10μM LTI-03(서열번호 2), 90μM LTI-03(양성 대조군), 10μM APi2350, 10μM APi2354, 10μM APi2355, 10μM APi2356 또는 20㎕의 DMSO(음성 대조군)로 처리하였다.

2일의 처리 후, 세포를 차가운 멸균 HBSS로 1회 세척하였다. HBSS를 제거하고, 프로테아제 저해제 칵테일이 포함된 150㎕의 용해 완충액을 세포에 첨가하였다. 세포를 용해 완충액과 함께 10분 동안 인큐베이션시켰다. 세포 용해물을 플레이트에서 긁어내고 수집하였다. 그 다음 세포 용해물을 2회 초음파처리하였다. 초음파처리 후, 용해물을 13,000 RPM에서 20분 동안 원심분리하였다. 그 다음 용해물을 액체 질소에서 급속 냉동시키고, 해동한 다음, 볼텍싱하고, 13,000 RPM에서 30분 동안 다시 원심분리하였다. 그 다음 상청액을 수집하고 펠릿을 폐기하였다. 그 다음 세포 용해물의 농도를 BCA 분석에 의해 결정하였다.

치료 효과의 존재를 평가하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 간단히, 각각의 용해물 12㎍을 10% 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 실행하였다. 그 다음 겔을 막으로 옮기고 세척하였다. 평활근 액틴(SMA) 및 튜불린에 대한 1차 항체의 웨스턴 블롯 결과는 도 1에서 볼 수 있다. 촬영한 레인에서 용해물 각각에 대한 처리는 1: 비처리, 2: 10μM LTI-03, 3: 90μM LTI-03, 4: 10μM APi2350, 5: 10μM APi2354, 6: 10μM APi2355, 7: 10μM APi2356, 및 8: DMSO이다.

웨스턴 블롯을 촬영하고 이미지제이(ImageJ)로 분석하여 평활근 액틴 대 튜불린의 비율을 결정하였다(도 2). 예상한 바와 같이, LTI-03은 튜불린에 비해 SMA 생성의 증가를 유도하였다. 또한, Cav-1 펩타이드 APi2350, APi2354, APi2355, 및 APi2356을 이용한 처리는 모두 튜불린에 비해 SMA의 발현을 증가시켰다(도 2).

실시예 3 - Cav -1 펩타이드는 섬유증 폐 생검의 AEC2 세포를 보존한다

AEC2 세포 생존력에 대한 Cav-1 펩타이드 APi2355(서열번호 8)의 영향을 평가하기 위해, 비-특이적 간질성 폐렴 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS)의 제조를 위해 수술적 생검을 얻었다. 비-특이적 간질성 폐렴(NSIP)이 있는 개체와 말기 IPF가 있는 또 다른 개체를 처리하였다. 살아있는 세포의 산성 구획을 염색하고 폐 AEC2 세포의 층판소체(lamellar body)에 선택적으로 축적하는 라이소스택커(lysotracker) 염색(Van der Velden et al., 2013)을 수행하였다. Cav-1 펩타이드를 DMEM/5%FBS에 현탁시키고, PCLS 슬라이스(n=5 반복/처리 그룹)를 10, 100, 또는 500μM LTI-03 또는 APi2355(Var 55)로 처리하였다. 라이소스택커 염색(녹색 DND-26, 프로메가(Promega))을 단일 처리 48시간 후 NSIP PCLS 상에서 수행하였다. AEC2 세포 생존력의 강한 용량-의존적 증가가 관찰되었다. 추가적으로, 라이소스택커 염색(적색 DND-99, 프로메가)을 LTI-03 또는 APi2355로 매일 처리한 후 1, 2, 3, 5 및 7일째에 말기 IPF 상에서 수행하였다. LTI-03으로 연속 7일 동안 처리한 말기 IPF 생검에서 AEC2 세포 생존력의 용량-의존적 증가가 관찰되었다. APi2355(Var 55)에 대한 처리 효과는 3일째까지 관찰되었다.

* * *

본 명세서에서 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 이루어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 실시형태의 관점에서 기재되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범주를 벗어나지 않으면서 본 명세서에 기재된 방법 및 방법의 단계 또는 단계 순서에 변형이 적용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 모두 관련된 특정 작용제는 본 명세서에 기재된 작용제를 대체할 수 있는 한편, 동일하거나 유사한 결과가 달성될 것임은 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이와 같은 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 한정된 바와 같이 본 발명의 사상, 범주 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

V. 참조문헌

하기 참조문헌은 본 명세서에서 제시된 것에 보충적인 예시적인 절차적 또는 다른 세부 사항을 제공하는 정도로, 구체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.

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미국 특허 제7,083,112호

미국 특허 제7,104,463호

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미국 특허 공개 제2002/0020409호.

미국 특허 공개 제2002/0020412호

미국 특허 공개 제2009/0134235호

미국 특허 공개 제2009/0304666호

SEQUENCE LISTING <110> LUNG THERAPEUTICS, INC. <120> MODIFIED PEPTIDE FRAGMENTS OF CAV-1 PROTEIN AND THE USE THEREOF IN THE TREATMENT OF FIBROSIS <130> WO/2020/055812 <140> PCT/US2019/050443 <141> 2019-09-10 <150> US 62/728,997 <151> 2018-09-10 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 178 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Gly Gly Lys Tyr Val Asp Ser Glu Gly His Leu Tyr Thr Val 1 5 10 15 Pro Ile Arg Glu Gln Gly Asn Ile Tyr Lys Pro Asn Asn Lys Ala Met 20 25 30 Ala Asp Glu Leu Ser Glu Lys Gln Val Tyr Asp Ala His Thr Lys Glu 35 40 45 Ile Asp Leu Val Asn Arg Asp Pro Lys His Leu Asn Asp Asp Val Val 50 55 60 Lys Ile Asp Phe Glu Asp Val Ile Ala Glu Pro Glu Gly Thr His Ser 65 70 75 80 Phe Asp Gly Ile Trp Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys 85 90 95 Tyr Trp Phe Tyr Arg Leu Leu Ser Ala Leu Phe Gly Ile Pro Met Ala 100 105 110 Leu Ile Trp Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Leu Ser Phe Leu His Ile Trp 115 120 125 Ala Val Val Pro Cys Ile Lys Ser Phe Leu Ile Glu Ile Gln Cys Ile 130 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Xaa Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Acetyl group present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> NH2 functional group present <400> 17 Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys Gly Ser 1 5 10 <210> 18 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> NH2 functional group present <400> 18 Asp Ser Gly Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys 1 5 10 <210> 19 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Acetyl group present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> NH2 functional group present <400> 19 Asp Ser Gly Lys Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Acetyl group present <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X = Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X = Ornithine <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> NH2 functional group present <400> 20 Xaa Ala Ser Phe Thr Thr Phe Thr Val Thr Xaa Ser 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <400> 21 Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Pro Pro Gln 1 5 10 <210> 22 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <400> 22 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 23 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <400> 23 Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu 1 5 10 15 Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <400> 24 Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly 1 5 10 <210> 25 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <400> 25 Thr Gln Ile Glu Asn Leu Lys Glu Lys Gly 1 5 10 <210> 26 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <400> 26 Ala Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala 1 5 10 15 Leu Glu Ala Leu Ala Glu Ala Ala Ala Ala 20 25 <210> 27 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic amino acid <400> 27 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Glu Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Met Ile Glu Gly Trp Tyr Gly Cys Gly 20 25

Claims (65)

1. 펩타이드로서, 아미노산 서열 ASFTTFTVT(서열번호 3)을 포함하되, 서열번호 1에 대한 동일성이 결여된 적어도 하나의 N- 또는 C-말단 부가물을 포함하는, 펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 N-말단에 부가된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 펩타이드.
3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 C-말단에 부가된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 펩타이드.
4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 N-말단 및 C-말단에 부가된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 펩타이드.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 L-아미노산을 포함하는, 펩타이드.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 D-아미노산을 포함하는, 펩타이드.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 L-아미노산 및 D-아미노산을 둘 다 포함하는, 펩타이드.
8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 중수소화 잔기를 포함하는, 펩타이드.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 적어도 하나의 비-표준 아미노산을 포함하는, 펩타이드.
10. 제9항에 있어서, 상기 펩타이드는 2개의 비-표준 아미노산을 포함하는, 펩타이드.
11. 제9항에 있어서, 상기 비-표준 아미노산은 오르니틴인, 펩타이드.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 N-말단 변형을 포함하는, 펩타이드.
13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 C-말단 변형을 포함하는, 펩타이드.
14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 N- 및 C-말단 변형을 포함하는, 펩타이드.
15. 제12항에 있어서, 상기 N-말단 변형은 아실화인, 펩타이드.
16. 제13항에 있어서, 상기 C-말단 변형은 아미드화인, 펩타이드.
17. 제4항에 있어서, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 KASFTTFTVTKGS(서열번호 4)를 포함하는, 펩타이드.
18. 제7항에 있어서, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 aaEGKASFTTFTVTKGSaa(서열번호 6)를 포함하는, 펩타이드.
19. 제11항에 있어서, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 OASFTTFTVTOS(서열번호 9)를 포함하는, 펩타이드.
20. 제16항에 있어서, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 KASFTTFTVTKGS-NH2(서열번호 5)를 포함하는, 펩타이드.
21. 제16항에 있어서, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 aaEGKASFTTFTVTKGSaa-NH2(서열번호 7)를 포함하는, 펩타이드.
22. 제14항에 있어서, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 Ac-aaEGKASFTTFTVTKGSaa-NH2(서열번호 8)를 포함하는, 펩타이드.
23. 제16항에 있어서, 상기 펩타이드는 아미노산 서열 OASFTTFTVTOS-NH2(서열번호 10)를 포함하는, 펩타이드.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 세포-침투 펩타이드(CPP)를 추가로 포함하는, 펩타이드.
25. 제25항에 있어서, 상기 CPP는 GRKKRRQRRRPPQ(서열번호 21), RQIKIWFQNRRMKWKK(서열번호22), 및 GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(서열번호23)로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는, 펩타이드.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 카베올린-1(caveolin-1: Cav-1)의 생물학적 활성을 유지하는, 펩타이드.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 적어도 2개의 펩타이드를 포함하는, 펩타이드 다량체.
28. 제27항에 있어서, 상기 적어도 2개의 펩타이드 중 제1 펩타이드는 상기 적어도 2개의 펩타이드 중 제2 펩타이드와 본질적으로 동일한, 펩타이드 다량체.
29. 제25항에 있어서, 적어도 2개의 펩타이드 중 제1 펩타이드는 상기 적어도 2개의 펩타이드 중 제2 펩타이드와 동일하지 않은, 펩타이드 다량체.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 펩타이드를 포함하는, 조성물.
31. 제30항에 있어서, 상기 펩타이드는 실질적으로 순수한, 조성물.
32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 펩타이드는 적어도 95% 순수한, 조성물.
33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 적어도 98% 순수한, 조성물.
34. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
35. 제34항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 관절내, 비경구, 장내, 국부, 피하, 근육내, 협측, 설하, 직장, 질내, 음경내, 안내, 경막외, 두개내, 또는 흡입 투여용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
36. 제34항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 폐 점적용으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
37. 제34항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 분무되는 용액으로 제형화되는, 약제학적 조성물.
38. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 펩타이드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
39. 대상체에서 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 펩타이드를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 대상체는 섬유증 또는 염증성 질환을 갖는, 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 대상체는 기관 섬유증을 갖는, 방법.
42. 제41항에 있어서, 상기 대상체는 신장, 간, 폐 또는 심장 섬유증을 갖는, 방법.
43. 제39항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 안 질환인, 방법.
44. 제39항에 있어서, 대상체에서 폐 염증, 급성 폐 손상, 폐 감염 또는 폐 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서 추가로 정의되는, 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 폐 염증을 갖는, 방법.
46. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 만성 폐쇄성 폐질환(COPD)을 갖는, 방법.
47. 제39항에 있어서, 상기 대상체는 화학요법 또는 방사선요법을 받고 있는, 방법.
48. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 급성 폐 손상을 갖는, 방법.
49. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 폐 감염을 갖는, 방법.
50. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 화학물질로 유발된 폐 손상을 갖는, 방법.
51. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 플라스틱 기관지염을 갖는, 방법.
52. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 천식을 갖는, 방법.
53. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 급성 호흡곤란 증후군(ARDS)를 갖는, 방법.
54. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 흡입 연기 유발 급성 폐 손상(ISALI)을 갖는, 방법.
55. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 세기관지염을 갖는, 방법.
56. 제44항에 있어서, 상기 대상체는 폐쇄 세기관지염을 갖는, 방법.
57. 제44항에 있어서, 상기 폐 질환은 폐의 섬유증 병태인, 방법.
58. 제44항에 있어서, 상기 폐 질환은 간질성 폐 질환인, 방법.
59. 제44항에 있어서, 상기 폐 질환은 특발성 폐 섬유증(IPF) 또는 폐 반흔인, 방법.
60. 제44항에 있어서, 상기 투여는 변이 폴리펩타이드를 포함하는 용액을 분무하는 것을 포함하는, 방법.
61. 제39항에 있어서, 상기 펩타이드는 전신으로 투여되는, 방법.
62. 제39항에 있어서, 상기 펩타이드는 이환된 조직으로 국소적으로 투여되는, 방법.
63. 제39항에 있어서, 적어도 하나의 추가적인 항-섬유증 치료제를 투여하는 단계를 더 포함하는, 방법.
64. 제63항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가적인 항-섬유증 치료제는 NSAID, 스테로이드, DMARD, 면역억제제, 생물학적 반응 조절제 또는 기관지확장제인, 방법.
65. 제39항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.

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