KR20210082574A - 상백피 추출물 및 사삼 추출물을 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
상백피 추출물 및 사삼 추출물을 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은상백피 추출물 및 사삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 정상 세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서도, 암 세포에 대해서만 특이적으로 전이와 증식을 억제하는 효과를 나타낼 수 있다.
보다 구체적으로 상백피 추출물, 사삼 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출물을 유효성분으로 포함하여 비소세포폐암의 예방 및 치료제에 관한 것이다.
보다 구체적으로 상백피 추출물, 사삼 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출물을 유효성분으로 포함하여 비소세포폐암의 예방 및 치료제에 관한 것이다.
Description
본 발명은 상백피 추출물 및 사삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로 정상 세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서도, 암 세포에 대해서만 특이적으로 전이와 증식을 억제하는 효과를 가지고 있어, 암의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있는 조성물에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제1위의 질병으로서 연간 약 10 만명 이상이 진단되고, 약 6 만명 이상이 사망하고 있다.
이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독 성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.
서양의학의 암치료법은 화학요법, 방사선요법, 수술요법, 면역요법등이 시행되고 있는데, 암세포뿐만 아니라 인체의 정상조직과 기관에 대한 독성이 강하여 환자에게 소화기 장애, 골수기능억제, 면역기능저하, 염증반응, 신체쇠약 등의 부작용을 유발하는 단점이 많이 나타나고 있어, 최근 한약에서 부작용이 없으면서도 항암효과를 나타내는 치료제 개발이 연구되고 있다.
한의학에서의 암치료법은 건비익기(健脾益氣), 양혈자음(養血滋陰), 양음생진(養陰生津), 보신온탕(補腎溫陽), 건비익신(健脾益腎)등의 부정법(扶正法)과 청열해독(淸熱解毒), 활혈화어(活血化瘀), 화담소어(化痰消瘀), 이기소종(理 氣消腫) 등의 거사법(祛邪法)과, 부정법(扶正法)과 거사법을 배합한 부정거사법(扶正祛邪法)으로 요약된다. 부정법중 건비익기법은 암의 임상증후나 항암제, 화학요법제를 사용했을때 자주 나타나는 식욕부진, 납소, 오심, 구토, 설사 및 복부창만 등의 소화장애와 면역기능저하에 사용될 수 있는 방법으로, 대표처방인 사군자탕(四君子湯), 육군자탕(六君子湯), 보중익기탕(補中益氣湯) 등이 실험적으로 암치료 또는 화학 및 방사선 요법 등으로 나타나는 부작용 개선에 효과가 있음과, 임상적으로도 소화기암, 간암, 폐암에 활용 가능함이 보고되었다.
상기 한의학적 익기양음법(益氣養陰法) 및 거담법(祛痰法)을 활용하여, 부작용이 없으면서도 항암 효과를 나타낼 수 있는 치료제를 개발하여, 단독 항암제 또는 항암 보조용법으로 활용할 수 있는 치료제의 개발이 필요하다.
본 발명의 목적은 상백피 추출물 및 사삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 정상 세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서도, 암 세포에 대해서만 특이적으로 전이와 증식을 억제하는 효과를 가지고 있어, 암의 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상백피 추출물, 사삼 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출물을 유효성분으로 포함하는 비소세포폐암 예방 및 치료제를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 암 예방 및 치료용 조성물은 상백피 추출물, 사삼 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출물을 유효성분으로 포함하며, Src/STAT3 인산화 억제 또는 EGFR/STAT3 신호 전달 경로의 조절 효과가 우수한 것이다.
상기 추출물은 물, C1 내지 C4 알코올, 에테르, 클로로포름， 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용하여 추출하는 것이다.
상기 추출물은 메틸렌클로라이드를 용매로 하여 추출하는 것이다.
상기 상백피 추출물은 모루신(Morusin) 및 우르솔산(Ursolic acid)을 포함하는 것이다.
상기 사삼 추출물은 루페올(lupeol)인 것이다.
상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문 암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 폐암 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 암은 비소세포폐암(NSCLC)인 것이다
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 비소세포폐암 예방 및 치료용 약학 조성물은 상기 조성물을 포함하는 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 비소세포폐암 예방 및 치료용 기능성 식품 조성물은 상기 조성물을 포함하는 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 암 예방 및 치료용 조성물은 상백피 추출물, 사삼 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출물을 유효성분으로 포함하며, Src/STAT3 인산화 억제 또는 EGFR/STAT3 신호 전달 경로의 조절 효과가 우수한 것이다.
보다 구체적으로, 상백피 및 사삼 추출물 각각 암 예방 및 치료용 조성물로 이용하거나, 상백피 및 사삼 추출물의 혼합물을 암 예방 및 치료용 조성물로 이용할 수 있다.
상기 상백피(Mori Cortex Radicis)는 뽕나무과(Moraceae)에 속한 낙엽교목인 뽕나무 속 식물의 근피로, 뽕나무 뿌리껍질로서 두께는 1 내지 4 mm이며 외표면은 백색 또는 담황백색으로 비교적 평탄하고 황색 또는 황갈색의 비늘무늬가 있다. 예로부터 상백피는 해열, 항경련, 항알러지, 항당뇨, 항염증 작용과 더불어 최근에는 간 보호 효과 및 탈모증에 대한 모발 성장 효과를 비롯한 미백, 항산화, 이뇨촉진, 신경성 염증반응 억제 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다(Hikino et al., 1985; Kim et al., 1999,; Kim et al., 1995).
상기 사삼(Adenophoratriphylla var. japonica Hara)은 인삼(人蔘), 현삼(玄蔘), 단삼(丹蔘), 고삼(苦蔘)과 함께 오삼(五參) 중의 하나이다. 우리나라에서는 그 기원으로 도라지과(Campanulaceae)에 속하는 잔대의 뿌리를 말한다. 잔대는 우리나라, 일본, 중국 등지에 자생하는 높이 50 내지 100cm내외의 다년생 초본으로 지상부 전체에 털이 밀생하고 뿌리는 비대하며 꽃은 7 내지 9월에 자색의 종모양으로 핀다.
사삼은 북한 약전에 도라지과의 더덕(Cordonopsislanceolata)의 뿌리로 기재되어 있고 중화민국 약전에는 층층잔대 및 동속식물의 외피를 제거한 뿌리로 기재되어 있다. 식품의약품안전처 식품 원재료 베이스에 따르면 사삼은 잔대의 생약명으로 딱주, 남사삼, 지모, 무희, 양유, 대사삼, 선사삼, 포삼 또는 Japanese Lady Bell로 불린다.
특성으로는 초롱꽃과(Campanulaceae)의 여러해살이 풀로 어린순은 나물로 먹고 뿌리는 해독과 거담제로 쓰이며 한국, 일본, 중국에 분포한다. 주요성분으로는 아데노폴산메틸에스테르, 베타시토스테롤, 도코스테롤, 루페온, 트라이피롤이 알려져 있으며 약리작용으로는 거담, 강심, 면역조절 및 항진균, 항산화 작용이 보고되어 있다.
STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 Src는 암 전이에 중요한 세포 운동성 및 침습의 촉진과 연루되어 있는 단백질로 이들의 활성이 증가하는 경우 암세포의 증식 및 전이가 촉진된다.
특히, STAT3는 인터루킨 (IL)-6 수용체(IL-6R), 성장인자 수용체 및 비 수용체 티로신 키나제, 예컨대 Src(18)를 통해 티로신 705 또는 세린 727에서 인산화에 의해 활성화된다. STAT3의 활성화는 세포 증식, 분화, 혈관 신생, 전이 및 약물 내성을 포함한 다양한 세포 기능을 매개한다.
상기 상백피 추출물을 암 예방 및 치료용 조성물로 이용할 경우, STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3) 및 Src의 인산화수준을 감소시키는 작용을 통해 암세포의 증식 및 세포사멸(apoptosis)에 효과가 있다.
또한, 암의 진행에 관여하는 EMT(epithelial-mesenchymal transition) 마커 단백질의 발현수준을 감소시키는 효과가 우수하며, 밀착연접단백질(tight junction protein)인 오클루딘(Occludin)과 E-카드헤린(E-cadherin)의 발현을 향상시켜 암세포의 전이를 억제하는 효과를 나타낸다.
결과적으로 상백피 추출물이 STAT3 및 Src의 활성 조절을 통해 EMT를 억제함으로써 암세포의 전이 과정을 억제하는 과정을 통해 암의 예방 및 치료에 효과를 나타낼 수 있다.
한편, EGFR(표피생장인자수용체)은 세포의 성장, 분열, 생존 및 사멸을 조절하는 세포막 수용체의 그룹으로 많은 암에서 종양 조직 내에 EGFR의 발현이 증가되어 있다. 이러한 EGFR이 증가된 종양조직은 더 침습적이고 더 전이를 잘하며 항암요법에 더 저항적인 경향이 있다.
상기 사삼 추출물은 EGFR TK(표피생장인자 티로신 키나제 도메인)에 직접 결합함으로써 상기 EGFR의 인산화를 억제하는 결과 EGFR의 활성화를 억제하여 종양조직의 전이 및 증식을 억제하는 효과가 있다.
또한, STAT3를 탈인산화시킴으로써 STAT3의 활성을 억제하여 암세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 효과를 갖는다.
바람직하게는, 상기 상백피 추출물 및 사삼 추출물을 각각 단독으로 사용하는 경우에 상기와 같은 STAT3/Src의 인산화 억제 효과, EMT 마커단백질의 발현율 억제효과, 밀착연접단백질의 발현율 증가효과, EGFR의 활성화 억제효과 등을 통한 항암효과를 나타낼 수 있으나, 상백피 추출물 및 사삼 추출물을 혼합하여 사용하는 경우에 보다 우수한 항암효과를 나타낼 수 있다.
보다 바람직하게는, 상기 상백피 추출물 및 사삼 추출물에 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물을 더 포함하는 경우에 보다 더 우수한 항암효과를 나타낼 수 있다.
청미래덩굴(Smilax chine L.)은 전국적으로 산야지에 분포되고 있으며, 한국을 비롯하여 중국, 일본에 널리 분포되고 있다. 대한약전외한약(생약)규격집에 의하면 토복령(土茯笭) 또는 우계라고도 하며 백합과에 속하는 줄기뿌리 식물로 청미래덩굴 잎은 예로부터 민간에서 어린잎을 나물로 식용하거나 큰 잎은 여름철에 떡을 보존하는 천연 식품보존제로 사용하였다. 또한 청미래덩굴 뿌리는 해열, 해독, 이뇨 등의 증상완화와 체력증강 및 피부염, 신장염, 방광염과 같은 염증의 치료제로써 이용되고 있다.
작약(Peony Root)은 미나리아재비과의 여러해살이풀로, 백작약(Radix Paeoniae Alba)과 적작약(Radix Paeoniae Rubra)이 있다. 백작약과 적작약은 껍질의 유무로 결정하고 있으며, 껍질이 있는 것을 적작약, 껍질을 벗겨낸 것을 백작약이라고 한다(Altern. Med. Rev. 6(5), 495-499, 2001). 백작약은 적작약과 더불어 위, 장의 평활 근 및 자궁평활근에 대해 수축억제효과, 관동맥 확장 효과 및 혈관질환에 대해 죽상경화증 방지, 혈압강하 및 혈류 개선의 효과가 있다. 작약추출물의 이러한 효과는 항산화효과(J. Ethnopharmacol. 67, 111-119, 1999), 혈소판응집억제효과(Planta Med, 65, 595-599, 1999), 항혈전효과(Chem. Pharm. Bull, 35(2), 849-852, 1987), 고지혈증 방지(Fitoterapia, 75(1), 45-49, 2004) 등으로부터 오는 것으로 보여 진다. 또한, 작약의 구성성분 중의 일부인 글리코시드(glycoside)가 뇌경색의 치료에 효과가 있는 것으로 보고되었다(Zhong Yao Cai, 23(2), 95-97, 2000).
본 발명에서 사용되는 닥나무속에는 닥나무(Broussonetia kazinoki Sieb), 꾸지나무(Broussonetia papyrifera Vent), 애기닥나무(Broussonetia kazinoki var. humilis) 등이 있으며, 낙엽활엽성의 관목으로 한국의 대부분 지역(주로 남부에 많이 분포됨), 중국, 대만, 일본 등에 분포하며 지리적으로 산기슭 양지쪽, 밭둑 등에 난다. 닥나무는 그 인피섬유가 제지의 원료로 사용되어 오고 있으며 또한 여러 가지 약효를 갖고 있어 강장, 명목(明 目)작용, 음위, 수종, 익기, 이뇨 등에 효과가 있고 풍을 제거하며, 피를 맑게 하고 시력감퇴 등에 효능이 있는 것으로 알려지고 있다.
바람직하게, 상기 상백피 추출물, 사삼 추출물, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물은 1:1:1:1:1 내지 1:1:1:0.5:0.5의 중량비로 혼합하여 사용하는 것으로, 상기 중량 범위 내에서 우수한 STAT3/Src의 인산화 억제 효과, EMT 마커단백질의 발현율 억제효과, 밀착연접단백질의 발현율 증가효과 및 EGFR의 활성화 억제효과를 나타낼 수 있고, 상기 범위 값 미만이거나 초과인 경우에는 항암효과가 현저히 떨어진다.
상기 상백피 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에테르, 클로로포름， 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용하여 추출될 수 있다. 상기 '상백피 추출물'이란 상백피로부터 추출하여 수득한 추출물을 의미한다.
상기 상백피 추출물은 건조한 상백피를 분쇄한 분쇄물을 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 탄소수 1 내지 4의 알코올과 같은 극성 용매, 또는 알코올과 물의 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합 용매로 용출할 수 있으며, 보다 상세하게는 추출 용매로 에탄올을 이용할 수 있다. 이 때, 추출 온도는 10℃ 내지 100℃, 바람직하게는 25 ℃에서 추출한 추출물일 수 있다.
상기 추출 용매는 시료의 중량 기준으로 2 내지 50배를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 20배이다. 추출을 위해 시료는 추출 용매에서 침출을 위해 1 내지 72 시간 동안 방치될 수 있으며, 상세하게는 1 내지 24시간 동안 방치될 수 있다.
여과된 추출물을 진공 회전 농축기로 감압 농축하여 수득한 결과물일 수 있으나, 본 발명의 항암 효과를 나타낼 수 있는 상백피 추출물인 한, 이에 제한되지 않고, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이의 조정제물 또는 정제물을 모두 포함한다.
상기 사삼 추출물, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물 또한 상백피 추출물과 동일한 방식을 이용하여 제조할 수 있다.
또한, 상기 상백피 추출물 및 사삼 추출물은 메틸렌클로라이드를 추출 용매로 이용한 상백피 및 사삼의 메틸렌클로라이드 추출물일 수 있다.
상기 상기 상백피 추출물은 모루신(Morusin) 및 우르솔산(Ursolic acid)을 포함하는 것이다.
상백피의 주요성분 중 하나인 모루신(Morusin)은 항미생물 활성, 항산화 음이온 라디칼에 대한 스캐빈저 활성 및 항염증성 활성과 같은 다양한 생물학적 활성을 가지는 물질로 하기 화학식1 로 표시된다:
[화학식 1]
상기 우르솔산(Ursolic acid) 또한 상기 상백피의 주요성분 중 하나로 우르솔산은 테르페노이드 계열의 트리터펜의 하나로 매우 중요한 항암물질로 알려져 있는 물질이다. 자연상태의 우르솔산은 전통 의약에 사용하는 월귤나무, 월귤나무의 열매, 백당 나무, 씨벅슨, 덩굴 귤, 산사 나무, 도그로즈, 로덴드론 나무 등과 같은 초본성 관목 식물의 대사물질이다. 우르솔산은 강한 항산화작용, 살충작용, 항염, 항진균, 항경련, 항종양 및 돌연변이 억제 효과가 있는 것으로 보고되고 있다.
상기 우르솔산(Ursolic acid)은 하기 화학식2로 표시된다:
[화학식 2]
상기 사삼 추출물은 루페올(lupeol)로, 사삼 추출물의 주요 성분 중 하나인 루페올을 분리하여, 이를 조성물로 이용할 수 있다.
상기 루페올(lupeol)은 사삼의 주요 구성성분 중 하나로 테르펜 계열의 트리테르펜(triterpene)의 일종이다. 강력한 항산화작용과 항염, 항암작용 등 다양한 생물학적 활성을 가지고 있다.
구체적으로 염증매개전달 유전자인 프로스타글란딘(PGE2)이 활성화되는 것을 차단함으로써 류마티스 관절염이나 부종, 피부염, 종양 등의 질병을 치료해주는 효과가 있으며, 이외에도 사이토킨 계열의 식세포(TNF-α), 인터루킨(IL-4,5,13)등 을 차단함으로써 항염작용 및 기타 항암작용 등을 나타내는 효과가 있다.
상기 루페올(lupeol)은 하기 화학식 3으로 표시된다:
[화학식 3]
상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문 암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 폐암 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이다.
상기 암은 바람직하게는 비소세포폐암(NSCLC)인 암 예방 및 치료용 조성물인 것이다.
폐암은 조직형에 따라서 크게 소세포성 폐암과 비소세포성폐암, 즉 소세포 폐암이 아닌 다른 종류의 폐암으로 구분되며, 비소세포성 폐암은 암의 발생부위에 따라서 종류가 나뉘는데 편평상피세포암의 경우는 주로 큰 기관지에서 발생하여 기관지 내강으로 자라고 임상증상은 주로 기관지를 막아 나타난다. 선암종은 비교적 크기가 작은 세기관지 상피에서 발생하고, 대세포암종은 폐의 표면에 주로 발생하며, 절반가량이 큰 기관지에서 발생한다.
발생 위치는 다르지만 주로 나타나는 증상은 폐가 나빠지면 나타날 수 있는 기침, 객혈, 흉통, 호흡곤란 등으로 비슷하다고 볼 수 있으며 증상만으로 어떤 종류인지 구별하기는 어렵다. 또한 초기에는 증상이 없는 경우가 많아 이미 진행된 뒤에 병원을 찾는 경우가 많다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 비소세포폐암 예방 및 치료용 약학 조성물은 상기 조성물을 포함하는 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있으며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들어 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결 건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
본 발명의 상백피 추출물 및 사삼 추출물은 예로부터 식용 및 약용으로 사용되어 온 것으로 그 투여용량에 특별한 제약은 없고, 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 상백피 추출물 및 사삼 추출물은 상세하게는 체중 1 kg당 10 내지 1000 mg 정도를 투여할 수 있으며, 보다 상세하게는 체중 1 kg당 50 내지 500 mg 정도 투여할 수 있다.
본 발명의 상백피 추출물 및 사삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 유효량 범위를 고려하여 제조하도록 하며, 이렇게 제형화된 단위 투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정 시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 비소세포폐암 예방 및 치료용 기능성 식품 조성물은 상기 조성물을 포함하는 것이다.
본 발명의 기능성 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 추출 혼합물을 첨가할 수 있는 건강기능성 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능성 식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
본 발명의 목적은 상백피 추출물과 사삼 추출물을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물에 의하면 정상 세포의 생장에는 영향을 미치지 않으면서도, 암 세포에 대해서만 특이적으로 전이와 증식을 억제하는 효과가 있다.
보다 구체적으로 상백피 추출물, 사삼 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출물을 유효성분으로 포함하여 비소세포폐암 예방 및 치료제를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 MEMA 처리에 의한 NSCLC 세포의 이동에 대한 Transwell Assay 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 MEMA 처리에 의한 NSCLC 세포에서의 Wound-Healing Assay 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 MEMA 처리와 관련하여 NSCLC세포의 침입능력을 실험하기 위한 Transwell invasion assay 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 MEMA 처리에 따른 NSCLC 세포에서의 STAT3 및 Src의 활성에 대한 Western blot 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 MEMA 처리에 의한 H1299 세포에서의 EMT 조절에 대한 STAT3 및 Src의 영향을 분석하기 위한 Western blot 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 H1299 세포를 STAT3 CA 또는 Src CA로 형질 감염 후 48시간이 지난 후 단백질 발현 수준을 Western blot 분석에 의해 평가한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 H1299 세포를 STAT3 CA 또는 Src CA로 형질 감염 후 24시간 후에, 세포를 24시간 동안 MEMA로 처리한 후 Western blot 분석에 의해 EMT마커 단백질의 발현 수준을 평가한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 NSCLC 세포주에 대하여 일정량의 루페올을 처리하여 다양한 배양시간에 따라 그 생존력을 측정하는 MTT assay 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올을 NSCLC세포와 WI38 fibroblasts에 48시간 동안 처리 후, 그 생존력을 측정하는 MTT assay 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올을 NSCLC 세포에 72시간동안 처리 후, 생존한 세포들을 trypan blue exclusion assay 한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 colony 형성에 미치는 영향을 살피기 위해 루페올이 포함된 배지에 2주 동안 세포배양 후, 존재하는 colony의 수를 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 apoptosis에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, 핵을 DAPI staining 한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 apoptosis에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, annexin V-FITC 와 PI에 의해 이중 염색 후, 유세포 분석한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 apoptosis에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, PI용액으로 염색하여 각 세포단계에 해당하는 세포의 수를 유세포 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 apoptosis에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, 절단된 PARP와 절단된 caspase-3의 발현수준을 western blot 분석에 의해 측정한 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC 세포의 EGFR 활성에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, p-EGFR 및 t-EGFR의 발현 수준을 western blot 분석한 결과와 p-EGFR/t-EGFR의 비율을 actin을 대조군으로 하여 분석한 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올에 의한 STAT3 활성의 억제가 NSCLC 세포의 apoptosis를 유발하는지 실험하기 위해 H1299 와 A549 세포를 루페올로 24시간 처리 후, p-STAT3와 t-STAT3의 발현 정도를 western blot 분석한 결과와 p-STAT3/t-STAT3의 비율을 분석한 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올에 의한 STAT3 활성의 억제가 NSCLC 세포의 apoptosis를 유발하는지 실험하기 위해 A549 세포를 루페올로 24시간 처리 후, EGF(20ng/ml)를 첨가하여 배지에서 1시간 배양한 다음 western blot한 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올에 의한 STAT3 활성의 억제가 NSCLC 세포의 apoptosis를 유발하는지 실험하기 위해 H1299세포를 루페올로 24시간 처리한 후, p-STAT3의 핵의 이동을 nuclear/cytosol fractionation assay한 결과이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 H1299세포를 대조군 벡터 또는 Y705D에 형질 감염시킨 후, 루페올로 72시간동안 추가 처리한 것에 대하여 p-STAT3, 절단된 PARP 및 절단된 caspase-3의 발현을 western blot 분석한 결과이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 H1975 세포를 루페올 또는 erlotinib으로 72시간 처리 후, 세포의 생존력을 MTT assay에 의해 측정한 결과이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 H1975세포를 루페올에 72시간 처리 후, PI 염색된 세포를 각 세포 주기에서 유세포 분석한 결과 및 annexin V-FITC와 PI로 이중 염색한 세포를 유세포 분석한 결과이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 절단된 PARP 및 절단된 caspase-3의 발현 수준을 western blot 분석한 결과이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 H1975세포를 루페올로 24시간 처리한 후 단백질의 발현수준을 western blot 분석한 결과 및 p-EGFR/t-EGFR의 비율과 p-STAT3/t-STAT3의 비율을 actin을 대조군으로 하여 분석한 결과이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 H1975세포를 STAT3 -반응성 리포터 벡터(reporter vector)로 형질 감염시킨 후, 루페올을 48시간동안 처리하여 STAT3의 전사 활성을 측정한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 MEMA 처리에 의한 NSCLC 세포에서의 Wound-Healing Assay 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 MEMA 처리와 관련하여 NSCLC세포의 침입능력을 실험하기 위한 Transwell invasion assay 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 MEMA 처리에 따른 NSCLC 세포에서의 STAT3 및 Src의 활성에 대한 Western blot 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 MEMA 처리에 의한 H1299 세포에서의 EMT 조절에 대한 STAT3 및 Src의 영향을 분석하기 위한 Western blot 분석 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 H1299 세포를 STAT3 CA 또는 Src CA로 형질 감염 후 48시간이 지난 후 단백질 발현 수준을 Western blot 분석에 의해 평가한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 H1299 세포를 STAT3 CA 또는 Src CA로 형질 감염 후 24시간 후에, 세포를 24시간 동안 MEMA로 처리한 후 Western blot 분석에 의해 EMT마커 단백질의 발현 수준을 평가한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 NSCLC 세포주에 대하여 일정량의 루페올을 처리하여 다양한 배양시간에 따라 그 생존력을 측정하는 MTT assay 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올을 NSCLC세포와 WI38 fibroblasts에 48시간 동안 처리 후, 그 생존력을 측정하는 MTT assay 결과이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올을 NSCLC 세포에 72시간동안 처리 후, 생존한 세포들을 trypan blue exclusion assay 한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 colony 형성에 미치는 영향을 살피기 위해 루페올이 포함된 배지에 2주 동안 세포배양 후, 존재하는 colony의 수를 측정한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 apoptosis에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, 핵을 DAPI staining 한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 apoptosis에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, annexin V-FITC 와 PI에 의해 이중 염색 후, 유세포 분석한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 apoptosis에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, PI용액으로 염색하여 각 세포단계에 해당하는 세포의 수를 유세포 분석한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC세포의 apoptosis에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, 절단된 PARP와 절단된 caspase-3의 발현수준을 western blot 분석에 의해 측정한 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올이 NSCLC 세포의 EGFR 활성에 미치는 영향을 실험하기 위해 H1299세포와 A549세포를 루페올로 72시간 처리한 후, p-EGFR 및 t-EGFR의 발현 수준을 western blot 분석한 결과와 p-EGFR/t-EGFR의 비율을 actin을 대조군으로 하여 분석한 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올에 의한 STAT3 활성의 억제가 NSCLC 세포의 apoptosis를 유발하는지 실험하기 위해 H1299 와 A549 세포를 루페올로 24시간 처리 후, p-STAT3와 t-STAT3의 발현 정도를 western blot 분석한 결과와 p-STAT3/t-STAT3의 비율을 분석한 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올에 의한 STAT3 활성의 억제가 NSCLC 세포의 apoptosis를 유발하는지 실험하기 위해 A549 세포를 루페올로 24시간 처리 후, EGF(20ng/ml)를 첨가하여 배지에서 1시간 배양한 다음 western blot한 결과이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 루페올에 의한 STAT3 활성의 억제가 NSCLC 세포의 apoptosis를 유발하는지 실험하기 위해 H1299세포를 루페올로 24시간 처리한 후, p-STAT3의 핵의 이동을 nuclear/cytosol fractionation assay한 결과이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 H1299세포를 대조군 벡터 또는 Y705D에 형질 감염시킨 후, 루페올로 72시간동안 추가 처리한 것에 대하여 p-STAT3, 절단된 PARP 및 절단된 caspase-3의 발현을 western blot 분석한 결과이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 H1975 세포를 루페올 또는 erlotinib으로 72시간 처리 후, 세포의 생존력을 MTT assay에 의해 측정한 결과이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 H1975세포를 루페올에 72시간 처리 후, PI 염색된 세포를 각 세포 주기에서 유세포 분석한 결과 및 annexin V-FITC와 PI로 이중 염색한 세포를 유세포 분석한 결과이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 절단된 PARP 및 절단된 caspase-3의 발현 수준을 western blot 분석한 결과이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 H1975세포를 루페올로 24시간 처리한 후 단백질의 발현수준을 western blot 분석한 결과 및 p-EGFR/t-EGFR의 비율과 p-STAT3/t-STAT3의 비율을 actin을 대조군으로 하여 분석한 결과이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 H1975세포를 STAT3 -반응성 리포터 벡터(reporter vector)로 형질 감염시킨 후, 루페올을 48시간동안 처리하여 STAT3의 전사 활성을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
[제조예 1: 상백피 추출물(MEMA) 및 사삼 추출물(루페올)의 제조]
Morus alba L. (MA)의 말린 뿌리 껍질(상백피)은 누리 허브㈜에서 구입하였다. MA (100 g)를 잘게 썰고, 실온에서 진탕 및 간헐적인 초음파 처리를 하며 1.5L의 메틸렌클로라이드로 24시간 동안 반복적으로 추출하였다. 추출물을 여과하고 감압 하에 진공회전 증발기로 농축하고 동결 건조하였다.
분말을 50mg/mL의 DMSO용액으로 용해시키고 -80℃에서 저장하여 상백피 추출물(MEMA)을 제조하였다.
사삼의 성분인 루페올(lupeol)은 켐페이스(ChemFaces)로부터 구입하였고 DMSO용액에 용해시킨 후 -80℃에서 저장하여 사삼 추출물(lupeol)을 제조하였다.
[제조예 2: 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물의 제조]
상기 상백피 추출물의 제조 방법과 동일한 방법을 이용하여, 청미래덩굴 추출물(CE), 작약 추출물(JE) 및 닥나무 추출물(DE)을 제조하였다.
[제조예 3: 혼합 추출물의 제조]
상기 상백피 추출물인 MEMA(ME), 사삼 추출물인 루페올(lu), 청미래덩굴 추출물(CE), 작약 추출물(JE) 및 닥나무 추출물(DE)을 하기 표 1과 같은 중량 범위내로 혼합하여 혼합 추출물을 제조하였다.
| ML1 | ML2 | ML3 | ML4 | ML5 | ML6 | ML7 | ML8 | ML9 | ML10 | ML11 | |
| ME | 100 | - | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Lu | - | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| CE | - | - | - | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| JE | - | - | - | 100 | 70 | 20 | 150 | 60 | 60 | 150 | 30 |
| DE | - | - | - | 100 | 60 | 30 | 120 | 150 | 30 | 60 | 60 |
(단위 중량부)
[실험예1: 비소세포폐암세포주에 대한 항암 효과 실험]
1. 실험 방법
세포 배양
NSCLC 세포주인 H1299, A549, H460 및H292 과 WI38 human lung fibroblast는 American Type Culture Collection(ATCC)에서 구입하였다. H1975 NSCLC 세포주는 이호영 교수 (서울 대학교 약학 대학) 로부터 제공받았다.
세포를 5 % 이하의CO2 조건을 갖춘 가습 인큐베이터에서 37℃를 유지한 채 10 % fetal bovine serum(FBS) 및 1 % 항생제를 함유한 RPMI-1640에서 배양시켰다.
HPLC 분석
상백피의 메틸렌클로라이드추출물 (MEMA)에 상백피의 유효성분인 모루신 (morusin)이 함유되어 있는지 확인하기 위해 HPLC 분석이 활용되었다.
Agilent series 1290 system (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 사용하여 크로마토그래피 분석을 시행하였다. 표준 모루신 (standard morusin)을 30% acetonitrile에 용해시켰다. gradient elution solvent는 0.8 mL/min의 유속에서 0.1 %의 인산(용매A) 및 50%의 acetonitrile(용매B)의 조건이었다. 다양한 mobile condition에서 수행되었으며, 크로마토그래피 분석은 30℃에서 시행하였으며, 모루신(morusin)검출에 사용된 파장은 250nm였다.
MTT 분석
MEMA처리와 관련한 세포 생존력 분석을 위해 3x103세포를 96-well plate에 sesding하고 MEMA로 처리하였다. 이어서 0.4 mg/mL의 MTT용액을 배지에 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 상부층을 제거하고 100 μL의 DMSO를 첨가하여 formazan을 용해시켰다. 각 well의 흡광도는 microplate reader (SpectraMax M3; Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 540 nm에서 측정되었다.
또한, 루페올 처리와 관련하여 세포 생존력 분석을 위해 3x103 세포를 96-well plate에 다양한 시간 (24-72시간)동안 루페올 (10-100 μM)로 처리하거나 72 시간 동안 erlotinib(LC Labs;10-100 μM)으로 처리한 후, 0.4 mg/ml의 MTT용액을 배지에 첨가한 후 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 이어서 formazan을 용해시키기 위해 100㎕의 DMSO를 각 well에 첨가하였다. 540nm에서의 흡광도 값은 microplate reader(SpectraMax M3; Molecular Devices)를 사용하여 측정되었다. 또한, trypan blue exclusion assay를 위해, 2x104 세포를 12-well plate에 seeding하고 72시간 동안 50 또는 100 μM에서 루페올로 처리하였다. 이어서, 세포를0.4 %의 trypan blue solution으로 염색하였다. 생존한 세포의 수는 현미경 (Leica)하에서 hemocytometer를 사용하여 염색되지 않은 세포의 수를 측정함으로써 평가되었다.
Anchorage-dependent and -independent colony formation assay
Anchorage-dependent 2D colony formation assay를 위해, 3x102 세포를 12- well plate에 seeding하고 2주 동안 루페올로 처리하였다. 배지는 3일마다 교체되었다. Colony를 100 % 메탄올로 5분 동안 고정시키고 30분 동안 실온에서 hematoxylin으로 염색하였다. 염색된 colony의 이미지는 디지털카메라(Canon)를 사용하여 획득하였고, colony의 수는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. Anchorage-dependent colony formation assay를 위해, PBS에 용해된 4 % SeaPlaque agarose(Lonza)를 따뜻한 배지와 혼합하여 1 % bottom agar를 획득하였다. 그 후 bottom agar(1 ml)를 24-well plate에 첨가하고 실온에서 고화시켰다. 세포 (1x103)를 0.5 ml의 top agar(0.4 %)에 현탁시키고 bottom agar 상에 plating하였다. Top agar가 고화될 때까지 plate를 실온에서 유지시켰다. 이어서 세포를 2주 동안 25, 50 및 100 μM에서 루페올로 처리하고 매 3일마다 배지를 교체하였다. colony를 37℃에서 2시간 동안 MTT용액(최종 농도, 0.5 mg/ml)으로 염색하였다. 염색된 colony의 이미지는 디지털카메라(Canon)를 사용하여 획득하였고, colony의 수는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
DAPI staining
세포(1x105)를 6-well plate에 seeding하고 72시간 동안 100 μM에서 루페올로 처리하였다. 이어서 세포를 수거하고 3.7 %의 paraformaldehyde로 고정시키고, cytospin(Shandon)을 사용하여 슬라이드 글래스에 부착시켰다. 암실에서 DAPI용액 (2.5 μg/ml)으로 20분동안 실온에서 염색한 후, 부착된 세포를 PBS 및 증류수로 세척하고 aqueous mounting medium (Crystal Mount)에 처리하였다. 핵의 형태는 200배의 배율 상에서 형광현미경 (Carl Zeiss)으로 관찰되었다.
유세포분석
세포(1x105)를 6-well plate에 seeding하고 72시간동안 50 또는 100 μM에서 루페올로 처리하였다. 세포주기 분석을 위해, 세포를 수집하고, 차가운 PBS로 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 80 %의 에탄올로 고정시켰다. 이어서, 세포를 30 μg/ml의 DNase-free RNase A의 존재 하에 실온에서 30분 동안 50 μg/ml의 PI로 염색하였다. 이어서, 염색된 세포를 500 ㎕의 PBS에 재현탁 시켰다. 세포 주기의 각 단계에서 상대적인 DNA함량은 flow cytometer (FACSCalibeur, BD Biosciences) 및 CellQuest Pro software(version 5.1)를 사용하여 분석하였다. Annexin VPI 이중 염색 분석을 위해, 세포는 Annexin VFITC Apoptosis Detection kit I (BD Biosciences; PharMingen)을 사용하여 Annexin VFITC 및 PI로 이중 염색되었다. annexin V-positive 세포를 flow cytometer 및 CellQuest software를 사용하여 측정하였다.
STAT3-luciferase reporter gene assay
세포(3x104)를 24-well plate에 seeding하고, Lipofectamine 2000을 사용하여 100 ng의 p-STAT3-TA-luc(Clontech) 및 5 ng의 pRL-TK로 공동-형질 감염시켰다. 형질 감염된 이후 24시간이 경과된 때, 세포를 24 시간 내지 48 시간 동안 루페올로 처리하였다. 이어서 세포를 용해시키고 STAT3 reporter gene의 활성을 Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega)으로 측정하였다.
EGF 처리에 의한 EGFR 자극
세포(5x105)를 6-well plate에 seeding하고 24시간 동안 50 또는 100 μM에서 루페올로 처리하였다. 그 후 20 ng/ml의 EGF (Lifeline Cell Technology)를 배지에 첨가하여 EGFR을 활성화시켰다.
Transwell Assay
8.0㎛의 poresize를 갖는 24-well transwell을 사용하였다. 외부막을 0.1 %의 젤라틴 (Sciencell, Carlsbad, CA, USA)으로 코팅하였다. MEMA를 함유하는 serum-free medium의 2x104 세포를 화학유인제 (chemoattractant)로 10 % FBS배지를 첨가하여 upper chamber에 seeding하였다. 24시간 또는 48시간 동안 배양한 후, 이동된 세포를 hematoxylin으로 염색하고, 현미경 (Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)을 사용하여 측정하였다. Invasion assay는 upper well의 내부막을 300 μg/mL의 Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA, USA)로 코팅한 것을 제외하고는 Transwell Assay과 동일한 방식으로 수행되었다.
Wound-Healing Assay
세포를 6-well plate에 seeding하였다. 세포가 모두 응집된 경우, 200 μL 피펫 팁을 사용하여 수직으로 상처를 내었다. 이어서 배양 배지를 상백피의 메틸렌클로라이드 추출물(MEMA)을 함유하는 serum-free media 또는 2 % FBS media로 교체하였다. 상처가 봉합되는 과정을 현미경(DMI8; Leica, Wetzlar, Germany)을 통해서 48시간 동안 관찰하였다. 상처 봉합 과정은 Leica Application suit(Las V4.8) software를 사용하여 계산되었다.
Trnasfection
Constitutively active STAT3 plasmid (pExpress-STAT3Y705D)는 이호영 교수 (서울대학교)로부터 제공받았으며, constitutively active Src plasmid (pcSrc527)는 Addgene(# 17675)에서 구입하였다. 3x105세포를 6-well plate에 seeding하고, Lipofectamine 2000(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 pExpress-STAT3Y705D 또는 pcSrc527로 형질 감염시켰다.
Western Blot analysis
세포를 RIPA buffer 및 phosphatase inhibitor를 이용하여 용해시켰다. 동등한 양의 단백질을 sodium dodecyl sulfate(SDS)- polyacrylamide gel에 의해 분리하고 polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane으로 옮겼다. 막(membrane)은 특정1차 및 2차 항체로 probe되었다. 단백질과 항체의 복합체는 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Scientific)을 사용하여 검출되었다. phospho-STAT3 (Y705), phospho-Src (Y527), STAT3, Src 및 Snail에 대한 1차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입했으며, 다른 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa)에서 구입하였다. 항-토끼 이차 항체 (Anti-rabbit secondary antibody) 및 항-마우스 이차 항체 (anti-mouse secondary antibody)는 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA) 및 Bethyl Laboratories (Montgomery, TX, USA)에서 구입하였다.
Statistical Analysis
각 결과는 3중 실험으로부터 얻은 데이터의 평균 ±SD로 표현되었다. 한 쌍의 스튜던트 t-검정으로 통계 분석을 수행하였다. p<0.05에서의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
2. 실험결과
상백피의 메틸렌클로라이드 추출물(MEMA)이 비소세포폐암(NSCLC)세포의 이동에 미치는 영향
NSCLC 세포의 이동에 대한 MEMA의 영향을 평가하기 위해, Transwell assay 및 Wound-Healing Assay를 수행한 결과 MEMA의 처리는 NSCLC 셀에서 이동된 셀의 수를 크게 감소시켰다 (도 1).
또한, MEMA의 처리는 NSCLC 세포의 상처-치유 능력을 농도 및 시간 의존적 방식으로 유의하게 억제시킨다는 것이 확인되었다 (도 2).
위와 같은 결과는 MEMA가 NSCLC 세포의 전이되는 능력을 억제함을 종합적으로 입증하는 결과에 해당한다.
세포 외 기질로의 암세포의 침입은 암의 전이의 중요한 단계 중 하나에 해당한다.
따라서 MEMA의 NSCLC 세포의 침입을 억제하는 효과를 살피기 위해, Transwell assay 분석을 수행한 결과, MEMA의 처리에 따라 농도 의존적 방식으로 침습된 세포의 수를 현저하게 감소시키는 결과를 보였으며 이는 MEMA가 NSCLC 세포의 침입 능력을 억제함을 나타낸다고 볼 수 있다 (도3).
MEMA가 NSCLC 세포에서의 STAT3 및 Src의 활성에 미치는 영향
STAT3와 Src는 암 전이에 중요한 세포운동성에 연루되어 있다.
MEMA에 의해 STAT3 및 Src의 인산화는 H1299 및 H460 세포 모두에서 감소한 반면, 상응하는 총 단백질의 발현은 변하지 않은 채로 유지되었다 (도 4). STAT3가 항종양효과 및 면역작용의 촉진과 관계되는 STAT1과 반대되는 역할을 한다는 점을 고려할 때, STAT1의 인산화 수준이 H1299 및 H460세포 모두에서 MEMA에 의해 향상되었으며, 이는 STAT1과 STAT3이 서로의 활성화를 상호 억제한다는 것이 증명되며, 결과적으로 STAT3 및 Src의 조절이 MEMA가 NSCLC세포의 이동을 억제하는 효과와 관련됨을 증명한다.
MEMA에 의한 STAT3 및 Src에 의해 매개되는 EMT의 조절 및 그에 따른 NSCLC 세포의 이동억제 효과
EMT는 암의 전이 과정에 있어서 필수적으로 진행되는 과정인 바, MEMA가 EMT 관련 단백질의 발현율에 미치는 영향을 실험하였다.
특히 EMT 과정과 관련된 전사인자인 Slug와 Snail의 발현을 조사한 결과, slug와 Snail의 발현율이 MEMA에 의해 하향 조절됨을 확인할 수 있었다.
또한, MET과정에서 상피 마커인 E-cadherin 및 integrins은 각각 중간엽 마커인 Vimentin과 N-cadherin으로 대체되는 특징이 있는데, 실험 결과 MEMA에 의해 Vimentin과 N-cadherin이 하향 조절됨이 증명되었다.
나아가, MEMA의 처리는 밀착연접단백질인 occludin과 E-cadherin의 발현을 향상시킴을 확인할 수 있었으며, 이를 종합적으로 볼 때, MEMA가 NSCLC 세포에서 EMT를 억제함으로써 결과적으로 비소세포폐암의 전이 및 증식을 억제한다는 것을 알 수 있었다 (도 5).
또한, MEMA의 처리에 따른 STAT3 및 Src의 억제가 EMT 마커 단백질의 조절에 기여하는지 여부를 확인하기 위해 NSCLC세포를 Constitutively active STAT3 (STAT3 CA) 또는 Constitutively active Src (Src CA) 로 형질 감염시켰으며, 이러한 STAT3 CA 또는 Src CA의 과발현에 의해 STAT3의 표적 단백질인 cyclin D1의 발현 및 Src의 표적인 STAT3의 인산화의 정도가 증가하였다 (도 6).
다음으로, MEMA 처리된 이후에 STAT3 CA 또는 Src CA로 형질전환된 H1299세포에서 EMT마커 단백질의 발현을 조사하였다. MEMA 처리에 의해 감소되었던 slug, Snail, Vimentin 및 N-cadherin의 발현율은 STAT3 CA 또는 Src CA의 형질 감염에 의해 부분적으로 회복되었다 (도 7). 반면에, MEMA에 의해 높아졌던 E-cadherin과 Occludin의 발현율은 STAT3 CA 또는 Src CA의 과발현에 의해 현저하게 감소하였다 (도 7).
상기와 같은 결과는 MEMA가 STAT3 및 Src에 의해 매개되는 EMT의 억제를 통하여 비소세포폐암 세포의 전이를 억제함을 나타내는 결과에 해당한다.
루페올의 NSCLC 세포의 성장 및 colony 형성억제 효과
NSCLC 세포주의 성장에 대한 루페올의 효과를 조사하기 위해 H1299, A549 및 H460세포를 서로 다른 시간 동안 다양한 농도의 루페올로 처리하였으며, 분석 결과 루페올이 농도 및 시간 의존적 방식으로 세포 생존력을 현저하게 감소시킴을 알 수 있었다 (도 8).
또한, 정상 세포의 생존력에 대한 루페올의 효과를 조사하기 위해 WI38 fibroblasts를 사용하여 MTT분석을 수행한 결과, 루페올을 처리하고 48시간 후, WI38 fibroblasts의 생존율은 H460 및 A549 새포를 포함하는 NSCLC 세포의 생존력 보다 높았다. 이러한 결과는 루페올이 정상 세포보다 암 세포에 더 높은 민감성을 나타냄을 확인할 수 있다 (도 9).
더 나아가, NSCLC 세포에 대한 루페올의 성장 억제 효과를 확인하기 위해, trypan blue exclusion assay를 H1299, A549 및 H292 세포에서 수행한 결과 생존 세포의 수가 루페올에 의해 감소된 것으로 밝혀졌다 (도 10).
또한, 루페올의 NSCLC세포의 colony 형성에 대한 효과를 조사한 결과 루페올이 H1299 및 A549 세포에서 용량 의존적 방식으로 colony의 수를 유의하게 감소시켰음을 확인할 수 있었다 (도 11).
상기와 같은 결과들은 루페올이 NSCLC세포의 성장 및 colony 형성을 억제함을 나타내는 결과에 해당한다.
루페올에 의한 NSCLC세포의 apoptosis 효과
NSCLC세포에 대한 루페올의 항 증식효과를 살펴보기 위하여 DAPI 염색을 수행하였다. 그 결과 루페올로 처리된 NSCLC세포는 apoptosis되는 세포를 나타내는 고도로 축합되고 단편화된 핵을 관찰할 수 있었다 (도 12).
유세포 분석에 의한 apoptosis를 모니터링 하기 위해 Annexin V-PI 이중 염색 분석을 수행한 결과, 루페올로 처리한 72시간동안 NSCLC세포에서 apoptosis에 해당하는 Annexin V-positive 세포 집단이 현저하게 향상되었다는 것이 밝혀졌으며 (도 13), 세포주기 분석에 의해서도 sub G1단계 세포인 apoptosis 단계의 세포 비율이 점진적으로 증가하는 결과를 통해 유사한 실험결과를 얻을 수 있었다 (도14).
또한, apoptosis의 마커단백질에 해당하는 절단된 PARP 및 절단된 caspase-3의 발현수준은 루페올 처리에 의해 상향 조절되었다 (도 15).
상기 결과를 종합하면, 루페올이 NSCLC세포의 apoptosis를 유발한다는 것을 확인할 수 있다.
루페올의 EGFR 활성화 억제 효과
EGFR 활성에 대한 루페올의 영향을 조사하기 위해 Western blot 분석을 수행한 결과 EGFR의 인산화가 루페올에 의해 용량 의존적 방식으로 감소되는 반면, 상응하는 총 단백질의 발현 수준은 변경되지 않은 채로 유지됨을 확인할 수 있었다 (도 16).
또한, 루페올이 EGFR의 인산화를 억제하는 메커니즘을 분자도킹분석에 의해 확인하였다. EGFR TK의 inhibitor인 Erlotinib을 대조군으로 사용한 결과, 루페올은 Erlotinib이 TK도메인의 힌지 영역에 결합되는 결합자유에너지 (-7.94 kcal/mol)와 비슷한 수준의 결합자유에너지 (-7.37 kcal/mol)로 TK도메인에 결합되는 것으로 확인되었다.
이들 결과를 종합하면 루페올이 EGFR TK도메인에 직접 결합하고 ATP와 경쟁함으로써 EGFR활성을 차단함을 알 수 있다.
루페올에 의한 STAT3 활성억제에 의한 NSCLC세포의 apoptosis효과
실험 결과 루페올은 NSCLC 세포에서 STAT3의 인산화를 현저하게 억제하는 것으로 나타났다 (도 17).
위와 같은 결과가 EGFR와 관련되는지 확인하기 위해 EGF를 처리해본 결과, EGFR 및 STAT3의 인산화는 EGF 처리에 의해 향상되었으나, 이후 루페올의 처리로 상기 인산화는 다시 억제됨을 확인할 수 있었다 (도18). P-EGFR 및 p-STAT3의 동일한 발현 패턴은 루페올이 EGFR조절을 통해 STAT3 활성을 억제함을 확인시켜준다. 또한, H1299 세포의 핵 추출물에서 p-STAT3의 발현이 루페올에 의해 현저하게 감소한 결과를 볼 때, 루페올이 p-STAT3의 핵 전좌를 억제한다는 것을 입증하였다 (도 19).
이들 결과를 종합하면, 루페올이 NSCLC세포에서 STAT3의 전사활성을 차단함을 알 수 있다.
더 나아가, 루페올에 의한 STAT3 활성의 억제가 NSCLC세포의 apoptosis를 유발하는지 조사하기 위한 실험이 진행되었다. pExpress1-stat3Y705D로 형질 감염된 H1299세포는 대조군 벡터로 형질 감염된 세포에서와 비교하여 높은 수준의 p-STAT3발현을 나타내었으며, STAT3 Y705D에 의한 형질 감염은 루페올에 의해 증가된 절단 PARP 및 절단 caspase-3의 발현 수준을 낮추는 것으로 나타났다 (도 20).
이러한 결과를 종합할 때, 루페올에 의한 STAT3 활성의 억제가 NSCLC세포의 apoptosis에 기여한다고 볼 수 있다.
EGFR TK inhibitor의 내성을 갖는 NSCLC세포에 대한 루페올의 항암 효과
EGFR TK inhibitor의 내성을 갖는 H1975세포주에서 루페올이 항암활성을 나타내는지 여부에 대해 실험하였다.
MTT분석결과 Erlotinib-내성을 갖는 H1975세포의 생존력이 루페올에 의해 현저히 감소됨이 확인되었다 (도 21).
또한, 루페올은 sub-G1기의 세포 및 annexin V-positive 세포의 양을 증가시켰으며 (도 22), H1975세포에서 절단된 PARP 및 절단된 caspase-3의 발현 수준을 증가시켰다 (도 23). 상기 결과는 루페올이 apoptosis를 유발함으로써 H1975세포의 성장을 억제시킨다는 것을 나타낸다.
이후, 이러한 메커니즘이 EGFR/STAT3 신호 경로의 억제에 의한 것인지 확인하는 실험을 진행하였다.
루페올은 p-EGFR 및 p-STAT3의 발현 수준을 용량 의존적 방식으로 하향 조절하는 한편, 상응하는 총 단백질은 변경되지 않은 채로 유지시켰다 (도 24).
또한, 루페올로 처리한 후 STAT3의 전사 활성을 측정하기 위해, H1975세포를 STAT3-반응성 리포터 벡터 (reporter vector) 로 형질 감염시킨 후, 48시간 동안 루페올로 처리하였다. 그 결과 STAT3리포터 유전자 (reporter gene)의 활성은 용량 의존적 방식으로 감소됨이 확인되었다 (도 25).
이를 종합적으로 살피면, 루페올이 EGFR/STAT3 활성화의 억제를 통하여 EGFR TK inhibitor의 내성을 갖는 H1975세포에도 항암 효과를 갖는다는 것을 알 수 있다.
상백피 추출물, 사삼 추출물, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물의 병용처리에 의한 항암작용의 상승효과
상기 추출물들의 병용처리에 의한 비소세포폐암에 대한 항암효과가 증가되는지 실험하기 위하여,
상백피 추출물(MEMA) 또는 사삼 추출물(루페올)의 단독처리, 상백피 추출물(MEMA)과 사삼 추출물(루페올)을 1:1의 중량비로 혼합한 혼합 추출물의 처리 및 상백피 추출물(MEMA), 사삼 추출물(루페올), 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물을 일정 중량비로 혼합한 혼합 추출물의 처리에 따른 STAT3/Src의 인산화 억제 효과, EMT 마커단백질의 발현율 억제효과, 밀착연접단백질의 발현율 증가효과 및 EGFR의 활성화 억제효과를 western blot 분석 등을 이용하여 조사하였다.
상대적인 비교를 위해 MEMA 및 루페올을 단독 처리한 경우(ML1 및 ML2)의 STAT3의 인산화 억제효과를 지수 5로 놓고, 상기 혼합 추출물에 의한 STAT3의 인산화 억제효과를 지수로 평가하였다. 지수는 1부터 10까지로 평가하며, 높을수록 우수한 효과임을 의미한다.
| ML1 | ML2 | ML3 | ML4 | ML5 | ML6 | ML7 | ML8 | ML9 | ML10 | ML11 | |
| STAT3 | 5 | 5 | 6 | 7.8 | 6.6 | 4 | 3 | 4.2 | 4 | 3.8 | 4.1 |
상기 표 2에 따르면 MEMA 및 루페올을 1:1 중량비로 혼합한 경우 MEMA와 루페올의 단독처리보다 STAT3의 인산화 억제효과가 뛰어나며, 나아가 MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물을 1:1:1:0.5:0.5 중량비 내지 1:1:1:1:1의 중량비의 범위 내에서 혼합하여 사용한 경우 보다 더 뛰어난 인산화 억제 효과가 있음이 증명되었다.
한편, MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물의 혼합비가 상기 범위 값 미만이거나 초과인 경우 인산화 억제 효과가 떨어진다는 것이 증명되었다.
Src의 인산화 억제 효과를 실험을 통해 확인하였다. 상대적인 비교를 위해 MEMA를 단독 처리한 경우(ML1)의 Src의 인산화 억제효과를 지수 5로 놓고, 상기 혼합 추출물에 의한 Src의 인산화 억제효과를 지수로 평가하였다. 지수는 1부터 10까지로 평가하며, 높을수록 우수한 효과임을 의미한다.
| ML1 | ML3 | ML4 | ML5 | ML6 | ML7 | ML8 | ML9 | ML10 | ML11 | |
| Src | 5 | 5.7 | 8 | 7.6 | 4.2 | 4 | 3.8 | 3.9 | 4 | 3.4 |
상기 표 3에 따르면 MEMA 및 루페올을 1:1 중량비로 혼합한 경우 MEMA의 단독처리보다 Src의 인산화 억제효과가 뛰어나며, 나아가 MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물을 1:1:1:0.5:0.5 중량비 내지 1:1:1:1:1의 중량비의 범위 내에서 혼합하여 사용한 경우 보다 더 뛰어난 인산화 억제 효과가 있음이 증명되었다.
한편, MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물의 혼합비가 상기 범위 값 미만이거나 초과인 경우 인산화 억제 효과가 떨어진다는 것이 증명되었다.
EMT마커 단백질의 발현억제효과에 대해, 상대적인 비교를 진행하였다. 보다 구체적으로 MEMA를 단독 처리한 경우(ML1)의 EMT마커 단백질의 발현억제효과를 지수 5로 놓고, 상기 혼합 추출물에 의한EMT마커 단백질의 발현억제효과를 지수로 평가하였다. 지수는 1부터 10까지로 평가하며, 높을수록 우수한 효과임을 의미한다.
| ML1 | ML3 | ML4 | ML5 | ML6 | ML7 | ML8 | ML9 | ML10 | ML11 | |
| EMT 마커 단백질 | 5 | 6 | 7.7 | 7.9 | 4.3 | 3.8 | 3.5 | 4.2 | 3.3 | 4.6 |
상기 표 4에 따르면 MEMA 및 루페올을 1:1 중량비로 혼합한 경우 MEMA의 단독처리보다 EMT마커 단백질의 발현억제효과가 뛰어나며, 나아가 MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물을 1:1:1:0.5:0.5 중량비 내지 1:1:1:1:1의 중량비의 범위 내에서 혼합하여 사용한 경우 보다 더 뛰어난 발현억제 효과가 있음이 증명되었다.
또한, MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물의 혼합비가 상기 범위 값 미만이거나 초과인 경우 EMT 마커 단백질의 발현 억제 효과가 떨어진다는 것이 증명되었다.
밀착연접단백질의 발현증가효과의 상대적인 평가를 위해, MEMA를 단독 처리한 경우(ML1)의 밀착연접단백질의 발현증가효과를 지수 5로 놓고, 상기 혼합 추출물에 의한 밀착연접단백질의 발현증가효과를 지수로 평가하였다. 지수는 1부터 10까지로 평가하며, 높을수록 우수한 효과임을 의미한다.
| ML1 | ML3 | ML4 | ML5 | ML6 | ML7 | ML8 | ML9 | ML10 | ML11 | |
| 밀착연접단백질 | 5 | 6.6 | 7.8 | 8 | 3.5 | 3.4 | 3.6 | 4.1 | 4 | 3.8 |
상기 표 5에 따르면 MEMA 및 루페올을 1:1 중량비로 혼합한 경우 MEMA의 단독처리보다 밀착연접단백질의 발현증가효과가 뛰어나며, 나아가 MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물을 1:1:1:0.5:0.5 중량비 내지 1:1:1:1:1의 중량비의 범위 내에서 혼합하여 사용한 경우 보다 더 뛰어난 발현증가 효과가 있음이 증명되었다.
또한, MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물의 혼합비가 상기 범위 값 미만이거나 초과인 경우에는 밀착연접단백질의 발현증가효과가 감소된다는 것이 증명되었다.
EGFR의 활성화억제효과의 상대적인 평가를 위해, 루페올을 단독 처리한 경우(ML2)의 EGFR의 활성화억제효과를 지수 5로 놓고, 상기 혼합 추출물에 의한 EGFR의 활성화억제효과를 지수로 평가하였다. 지수는 1부터 10까지로 평가하며, 높을수록 우수한 효과임을 의미한다.
| ML2 | ML3 | ML4 | ML5 | ML6 | ML7 | ML8 | ML9 | ML10 | ML11 | |
| EGFR | 5 | 6.4 | 8 | 7.9 | 3.7 | 4.2 | 4.2 | 3.9 | 3.8 | 3.9 |
상기 표 6에 따르면 MEMA 및 루페올을 1:1 중량비로 혼합한 경우 루페올의 단독처리보다 EGFR의 활성화 억제 효과가 뛰어나며, 나아가 MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물을 1:1:1:0.5:0.5 중량비 내지 1:1:1:1:1의 중량비의 범위 내에서 혼합하여 사용한 경우 보다 더 뛰어난 활성화억제 효과가 있음이 증명되었다.
또한, MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물의 혼합비가 상기 범위 값 미만이거나 초과인 경우 EGFR의 활성화 억제 효과가 떨어진다는 것이 증명되었다.
이를 종합적으로 살펴보면, MEMA 와 루페올 각각의 처리보다 MEMA, 루페올, 청미래덩굴 추출물, 작약 추출물 및 닥나무 추출물을 1:1:1:0.5:0.5 내지 1:1:1:1:1의 중량비로 혼합 투여하는 경우 비소세포폐암의 항암효과가 상승한다는 것을 알 수 있다.
이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
Claims (9)
- 상백피 추출물, 사삼 추출물 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출물을 유효성분으로 포함하며,
Src/STAT3 인산화 억제 또는 EGFR/STAT3 신호 전달 경로의 조절 효과가 우수한
암 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 추출물은 물, C1 내지 C4 알코올, 에테르, 클로로포름， 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 추출 용매를 이용하여 추출하는 것인
암 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 추출물은 메틸렌클로라이드를 용매로 하여 추출하는 것인
암 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 상백피 추출물은 모루신(Morusin) 및 우르솔산(Ursolic acid)을 포함하는 것인
암 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 사삼 추출물은 루페올(lupeol)인
암 예방 및 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 결장암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문 암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 폐암 및 중추신경계 종양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을
암 예방 및 치료용 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 암은 비소세포폐암(NSCLC)인
암 예방 및 치료용 조성물. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는
비소세포폐암 예방 및 치료용 약학 조성물. - 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는
비소세포폐암 예방 및 치료용 기능성 식품 조성물.
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| KR20160011173A (ko) * | 2014-07-21 | 2016-01-29 | 셀루스원 주식회사 | 상백피, 차가버섯 및 고본 추출물을 유효성분으로 함유하는 암의 예방, 치료 또는 전이 억제용 및 면역력 증강용 조성물 |
| KR20200066910A (ko) * | 2018-12-03 | 2020-06-11 | 동의대학교 산학협력단 | 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 상백피 메틸렌클로라이드 추출물에 의한 폐암 세포의 Apoptosis 및 Autophagy 유발에 관한 연구, 박신형, 한의학석사학위논문, 동의대학교대학원 학의학과(2011.02.) 1부.* * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR102295141B1 (ko) | 2021-08-27 |
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