KR20210072212A - 식품 내 식중독 세균의 검출을 위한 증균 및 핵산의 추출 방법 - Google Patents

식품 내 식중독 세균의 검출을 위한 증균 및 핵산의 추출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 시료에 증균배지를 첨가하고 배양하여 증균액을 얻는 단계; (b) 상기 증균액을 제1 원심분리하여 얻어진 펠렛(pellet)에 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고 인큐베이션하여 용해액을 얻는 단계; (c) 상기 용해액을 column에 넣고 제2 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계; (d) 제2 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 세정 버퍼(washing buffer)를 첨가하고 제3 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계; 및 (e) 제3 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 용출 버퍼(elution buffer)를 첨가하고 제4 원심분리하여 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 식중독 세균의 핵산 추출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 추출 방법은 식육 또는 식육가공품 등에서 흔히 발견되는 식중독 세균, 특히 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 검출을 위한 핵산의 추출 방법으로, 기존에 상용화된 핵산 추출 방법 대비 추출 단계가 간소화되고, 추출 시간이 단축되며, 효소를 사용하지 않아 효소의 최적 온도를 조절할 필요 없이 실온에서 높은 순도와 수율로 핵산 추출을 수행할 수 있다.

Description

식품 내 식중독 세균의 검출을 위한 증균 및 핵산의 추출 방법 {Enrichment and extraction method of nucleic acid for detecting foodborne pathogenic bacteria in food}
본 발명은 (a) 시료에 증균배지를 첨가하고 배양하여 증균액을 얻는 단계; (b) 상기 증균액을 제1 원심분리하여 얻어진 펠렛(pellet)에 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고 인큐베이션하여 용해액을 얻는 단계; (c) 상기 용해액을 column에 넣고 제2 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계; (d) 제2 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 세정 버퍼(washing buffer)를 첨가하고 제3 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계; 및 (e) 제3 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 용출 버퍼(elution buffer)를 첨가하고 제4 원심분리하여 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 식중독 세균의 증균 및 핵산 추출 방법에 관한 것이다.
최근 현대인들의 식생활이 서구화되고 간편 조리식품 또는 즉석식품에 대한 소비가 늘어남에 따라, 소고기, 돼지고기 등 축육과 닭고기, 오리고기 등 가금육을 비롯한 식육뿐만 아니라 햄, 소시지, 육포 등 식육가공품에 대한 수요가 점차 증가하고 있다. 이러한 식육 또는 식육가공품은 풍부한 영양소와 수분을 함유하고 있어서 가공 또는 유통 과정 중에 미생물 증식에 의한 오염이 발생할 수 있으며, 나아가 분쇄 또는 혼합 등 가공 과정에서도 미생물의 오염에 의한 안전성 문제가 제기될 수 있다.
특히, '리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)'는 그람 양성의 간균, 통성혐기성 세균이자 저온에서도 성장 가능한 세균으로, 농수산물과 식육, 식육가공품 등 다양한 식품을 통해 사람에게 감염되어 식중독을 유발할 수 있는바, 전세계적으로 주목받고 있는 병원성 식중독 세균 중 하나이다. 감염 시 건강한 사람의 경우 증상이 없거나 가벼운 열, 복통 등을 일으키지만, 임산부, 신생아, 노인과 면역능력이 저하된 환자들의 경우 패혈증, 사산 등과 같은 심각한 질병을 일으킬 수 있어 특별한 주의가 필요하다. 이에, 식품 등 시료로부터 리스테리아 모노사이토제네스를 검출하기 위한 다양한 분자생물학적 방법과 키트 등이 개발되고 있다.
한편, 이러한 식중독 세균의 검출에 있어서 추출되는 핵산의 품질은 그 진단 결과를 좌우하는 것이므로, 시료로부터 핵산을 추출하고 정제하는 과정이 무엇보다 중요하다고 할 수 있다. 기존에는 세균으로부터의 핵산 추출과 정제 방법에 페놀 및 클로로포름을 이용한 방법이 사용되었으며, 최근에는 핵산을 실리카 레진에 결합시키는 실리카 흡착(silica adsorption) 방법도 이용되고 있다. 그러나, 기존에 상용화된 핵산 추출 방법 및 키트는 산업현장에서 사용하기 어려운 조건, 예컨대 proteinase K 및 lysozyme 등 효소를 사용함에 따라 효소의 최적 활성 온도 및 시간이 요구되며, 핵산 추출 및 정제에 소요되는 비용 또한 적지 않은 문제점이 있었다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 기존의 방법과 달리 산업현장에서 적용하기에 시간적, 경제적으로 적합한 핵산의 추출 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 효소 처리나 열 처리를 하지 않고 오직 Chemical reagent만을 이용하여, 저비용으로 단시간에 시료로부터 기존의 핵산 추출 방법과 유사한 수준의 순도와 수율을 갖는 핵산 추출방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 식중독 세균의 핵산 추출 방법을 제공하는 것으로, 기존에 상용화된 핵산 추출 방법 대비 추출 단계가 간소화되고, 추출 시간이 단축되며, 효소를 사용하지 않아 효소의 최적 온도를 조절할 필요 없이 실온에서 높은 순도와 수율로 리스테리아 모노사이토제네스 등 식중독 세균의 핵산 추출을 수행하고자 한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 양태는 (a) 시료에 증균배지를 첨가하고 배양하여 증균액을 얻는 단계; (b) 상기 증균액을 제1 원심분리하여 얻어진 펠렛(pellet)에 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고 인큐베이션하여 용해액을 얻는 단계; (c) 상기 용해액을 column에 넣고 제2 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계; (d) 제2 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 세정 버퍼(washing buffer)를 첨가하고 제3 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계; 및 (e) 제3 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 용출 버퍼(elution buffer)를 첨가하고 제4 원심분리하여 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 식중독 세균의 핵산, 구체적으로는 식중독 세균의 DNA 추출 방법을 제공한다.
본 발명에서 용어 "식중독 세균"은 식중독, 즉 급성위장염증상을 일으키는 세균을 의미하며, 식품 안에서 증식할 때 독소를 생성하여 식중독을 야기하는 독소형 식중독 세균(황색포도상구균, 보튤리누스균 등)과 생균의 형태로 섭취되어 그 증식이 식중독을 야기하는 감염형 식중독 세균(비브리오,　살모넬라, 리스테리아 모노사이토제네스 등)으로 나뉜다.
이 중 "리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)"는 그람 양성의 간균, 통성혐기성 세균으로, 이는 자연계에 광범위하게 분포하고 있어 오염된 식품이나 동물 등을 통해 인간에게도 감염될 수 있다. 리스테리아 모노사이토제네스 감염 시 발열, 두통, 설사, 근육통 및 관절통 등의 증상이 발생할 수 있으며, 일부 환자군에서는 패혈증이나 위장관염 등이 나타날 수 있으며 치사율이 30% 정도로 매우 높아, 식품으로부터 이를 미리 검출하여 식중독을 예방할 필요가 있다.
본 발명에서 "시료"는 식품, 구체적으로는 농수산물, 식육 또는 식육가공품일 수 있으며, 보다 구체적으로는 축육, 가금육, 어육을 비롯한 식육, 식용 가능한 장기류 및 부산물, 또는 이를 주원료로하여 제조 및 가공한 햄, 소시지, 베이컨, 건조저장육, 양념육, 분쇄육 또는 포장육을 의미하는 것일 수 있으며, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어 "증균배지"는 특정 균주의 성장 및 증식을 향상시키기 위한 배지로, 본 발명의 목적 상 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 증균에 적합한 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 증균배지는 기존의 LEB(Listeria Enrichment Broth) 배지(1 L 기준, Pancreatic digest of casein 17 g, soytone 3 g, dextrose 2.5 g, sodium chloride 5 g, dipotassium phosphate 2.5 g, yeast extract 6 g, cycloheximide 0.05 g, acriflavine HCl 0.015 g, nalidixic acid 0.04 g)에 0.1% pyruvate 및 0.1% ferric citrate (Ⅲ)를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 용어 "증균액"은 상기 시료에 증균배지를 첨가하고 배양하여 얻어지는 물질로, 리스테리아 모노사이토제네스 균주를 비롯한 식중독 세균을 포함할 수 있다. 구체적으로, 증균 온도는 30 내지 37℃일 수 있으며, 증균 시간은 12 내지 24시간일 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는, 시료(소시지, 돼지고기) 담긴 샘플백에 시료 무게의 약 9배에 해당하는 증균배지를 가하고 이를 30번 강하게 문지른 후, 이를 30℃에서 약 12시간 동안 두어 리스테리아 모노사이토제네스의 증균액을 수득하였다.
이어서 본 발명의 핵산 추출 방법은 상기 증균액을 제1 원심분리하여 펠렛(pellet)을 수득하고, 여기에 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고 인큐베이션하여 용해액을 수득하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제1 원심분리는 1,000 내지 3,500 xg, 4 내지 20℃ 조건에서 약 1분 동안 수행될 수 있다. 상기 용해 버퍼는 0.1 내지 1.5% N-lauroyl sarcosine (NLS) sodium salt, 0.1 내지 1.0 N NaOH 및 0.5 M EDTA를 포함할 수 있으며, 구체적으로는 0.1 내지 1.0% NLS sodium salt, 0.1 내지 0.5 N NaOH 및 0.5 M EDTA를 포함할 수 있고, 보다 구체적으로는 0.1 내지 0.5% NLS sodium salt, 0.5 N NaOH 및 0.5 M EDTA를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 용해 버퍼는 기존에 상용화된 핵산 추출 방법과 비교하여 proteinase K 및 lysozyme 등 효소를 포함하지 않아 효소의 최적 조건 및 온도를 조절할 필요 없이 실온에서 높은 순도와 수율로 핵산 추출을 수행할 수 있으며, 따라서 추출 단계가 간소화되고 추출 시간 또한 단축되었다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 증균액 중 50 mL를 취하여 멸균거즈로 거른 후, 원심분리(1,912 xg, 4℃, 15분)하고 상층액을 제거하여 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛은 용해 버퍼의 조성에 따라 크게 12 그룹으로 나누었고, 각 그룹은 동일한 용해 버퍼 조성으로 각각 3회씩 실험하였는데(표 1), 각각의 펠렛에 다양한 조합의 용해 버퍼를 1 mL씩 가하여 펠렛을 현탁시키고, 30분 동안 실온에서 인큐베이션(incubation)하였다.
또한, 이어서 본 발명의 핵산 추출 방법은 상기 인큐베이션이 완료된 용해액을 column에 넣고 제2 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계; 제2 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 세정 버퍼(washing buffer)를 첨가하고 제3 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계; 및 제3 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 용출 버퍼(elution buffer)를 첨가하고 제4 원심분리하여 핵산을 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 제2 원심분리 단계를 통해 용해액 중의 DNA가 column에 결합하고, 상기 제3 원심분리 단계를 통해 column에 존재하는 DNA 외 다른 불순물들을 세정한다. 상기 제2 내지 제4 원심분리는 5,000 내지 8,000 xg, 4 내지 20℃ 조건에서 약 1분 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 제3 원심분리는 2회 수행될 수 있다. 상기 세정 버퍼는 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, (pH 7.5) 및 80% ethanol을 포함할 수 있으며, 상기 용출 버퍼는 멸균 탈이온수(sterilized deionized water)일 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서는, 각 column에 상기 용해액을 넣고 제2 원심분리(8,000 xg, 4℃, 1분)하여 flow-through를 제거하고, 이후 0.6 mL의 세정 버퍼(20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80% ethanol)를 가하여 제3 원심분리(8,000 xg, 4℃)를 각 1분씩 2회 수행하고 flow-through를 제거하였다. 마지막으로 새로운 e-tube에 column을 끼워 넣고 용출 버퍼로 멸균 탈이온수(sterilized deionized water) 0.05 mL를 가하여 원심분리(8,000 xg, 4℃, 2분)를 통해 최종적으로 핵산을 추출하였다.
본 발명의 핵산 추출 방법은 식육 또는 식육가공품 등에서 발견되는 식중독 세균, 특히 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 검출을 위한 핵산의 추출 방법으로, 기존에 상용화된 핵산 추출 방법 대비 추출 단계가 간소화되고, 추출 시간이 단축되며, 효소를 사용하지 않아 효소의 최적 온도를 조절할 필요 없이 실온에서 높은 순도와 수율로 핵산 추출을 수행할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 리스테리아 모노사이토제네스( Listeria monocytogenes ) 검출을 위한 증균 및 핵산 추출 방법
1-1: 리스테리아 모노사이토제네스 증균
리스테리아 모노사이토제네스 증균을 위한 증균배지로, 기존의 LEB (Listeria Enrichment Broth) 배지에 0.1% pyruvate 및 0.1% ferric citrate (Ⅲ)를 첨가하여 증균배지를 제작하였다. 시료가 담긴 샘플백에 시료 무게의 약 9배에 해당하는 증균배지를 가하고 이를 30번 강하게 문지른 후, 이를 30℃에서 약 12시간 동안 두어 리스테리아 모노사이토제네스의 증균액을 수득하였다.
1-2: 리스테리아 모노사이토제네스 증균액으로부터 핵산 추출
실시예 1-1에서 수득한 증균액 중 50 mL를 취하여 멸균거즈로 거른 후, 원심분리(1,912 xg, 4℃, 15분)하고 상층액을 제거하여 펠렛을 수득하였다. 수득된 펠렛은 용해 버퍼의 조성에 따라 크게 12 그룹으로 나누었고, 각 그룹은 동일한 용해 버퍼 조성으로 각각 3회씩 실험하였다(표 1).
No. 용해 버퍼 조성
1 0.1% NLS sodium salt + 0.1 N NaOH + 0.5 M EDTA
2 0.1% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA
3 0.1% NLS sodium salt + 1.0 N NaOH + 0.5 M EDTA
4 0.5% NLS sodium salt + 0.1 N NaOH + 0.5 M EDTA
5 0.5% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA
6 0.5% NLS sodium salt + 1.0 N NaOH + 0.5 M EDTA
7 1.0% NLS sodium salt + 0.1 N NaOH + 0.5 M EDTA
8 1.0% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA
9 1.0% NLS sodium salt + 1.0 N NaOH + 0.5 M EDTA
10 1.5% NLS sodium salt + 0.1 N NaOH + 0.5 M EDTA
11 1.5% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA
12 1.5% NLS sodium salt + 1 N NaOH + 0.5 M EDTA
각각의 펠렛에 다양한 조합의 용해 버퍼를 1 mL씩 가하여 펠렛을 현탁시키고, 30분 동안 실온에서 incubation하였다. 이후 각 column에 얻어진 용해액을 넣고 원심분리(8,000 xg, 4℃, 1분)하고 flow-through를 제거하고, 0.6 mL의 세정 버퍼 (20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl (pH 7.5), 80% ethanol)를 가하여 원심분리(8,000 xg, 4℃, 1분)하고 flow-through를 제거하였다. 이어서 0.6 mL의 세정 버퍼를 가하여 한번 더 원심분리(8,000 xg, 4℃, 1분)하고 flow-through를 제거하였다. 마지막으로 새로운 e-tube에 column을 끼워 넣고 용출 버퍼로 멸균 탈이온수(sterilized deionized water) 0.05 mL를 가하여 원심분리(8,000 xg, 4℃, 2분)를 통해 핵산을 추출하였다. 각 단계 별 원심분리는 온도조절 장치가 없는 초소형 원심분리기(Micro-12 (Hanil))를 사용하였다. 각 그룹의 용해 버퍼 조성에 따라 추출된 핵산을 Take3 Micro-Volume Microplates(BioTek Instruments Inc.)에 1㎕ spotting한 후 Gen5 Microplate Reader and Imager Software(BioTek Instruments Inc.)를 사용하여 순도(260/280 ratio (nm))값과 수율(ng/㎕)을 측정하여그 평균값을 계산하였다(표 2).
No. 용해 버퍼 조성 순도 수율
260/280 (nm) 평균 ng/㎕ 평균
1 0.1% NLS sodium salt
+ 0.1 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 1.6 1.63 455.986 316.89
1.548 379.963
1.736 114.724
2 0.1% NLS sodium salt
+ 0.5 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 2.205 1.99 18.289 24.10
2.019 26.111
1.759 27.903
3 0.1% NLS sodium salt
+ 1.0 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 1.627 1.42 19.8 19.52
1.755 30.295
0.884 8.467
4 0.5% NLS sodium salt
+ 0.1 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 1.68 1.63 136.214 151.28
1.613 168.182
1.61 149.457
5 0.5% NLS sodium salt
+ 0.5 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 1.86 1.85 29.757 25.31
1.918 25.718
1.778 20.461
6 0.5% NLS sodium salt
+ 1.0 N NaOH
+ 0.5M EDTA		 2.1 2.11 16.11 19.96
2.591 23.488
1.647 20.28
7 1.0% NLS sodium salt
+ 0.1 N NaOH
+ 0.5M EDTA		 1.599 1.64 170.43 238.72
1.653 448.419
1.67 97.31
8 1.0% NLS sodium salt
+ 0.5 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 2.189 2.08 16.11 19.17
2.147 14.319
1.907 27.068
9 1.0% NLS sodium salt
+ 1.0 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 1.526 1.35 17.592 13.21
0.097 0.853
2.422 21.189
10 1.5% NLS sodium salt
+ 0.1 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 1.595 1.63 184.575 145.34
1.678 90.134
1.615 161.301
11 1.5% NLS sodium salt
+ 0.5 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 2.112 2.35 22.403 21.20
1.967 16.355
2.981 24.838
12 1.5% NLS sodium salt
+ 1 N NaOH
+ 0.5 M EDTA		 2.513 -0.47 9.363 3.49
2.433 9.622
-6.341 -8.528
그 결과, 0.1 N NaOH를 사용한 그룹 1, 그룹 4, 그룹 7 및 그룹 10의 경우 추출된 핵산의 평균 수율은 높았으나, background가 많아 핵산의 순도값은 1.35 내지 1.63로 비교적 낮은 것으로 확인되었다. 한편, 그룹 2, 그룹 5, 그룹 8 및 그룹 11의 결과로부터 1.5% NLS sodium salt를 사용한 그룹 11의 경우 순도 값이 2.35로 비교적 높은 것으로 확인되었으며, 이에 용해 버퍼 내 적절한 NLS sodium salt 농도 범위는 0.1 내지 1.0%인 것으로 평가하였다. 이에 추출된 핵산의 순도 및 수율을 종합적으로 고려하였을 때, 그룹 2(0.1% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA) 또는 그룹 5(0.5% NLS sodium salt + 0.5 N NaOH + 0.5 M EDTA)의 용해 버퍼를 사용하는 것이 기존의 핵산 추출 방법 대비 실온에서 추출 단계 및 시간을 단축하고(표 3) 적절한 순도를 나타내면서도, 높은 수율로 핵산을 추출할 수 있음을 확인하였다.
분류 Q P T 본 발명
가격 4,142원/sample 3,598원/sample 2,715원/sample 812원/sample
단계
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
소요시간(분) 80-90 150-160 140-150 50-60
필요장비 37℃ incubator,56℃ incubator,
Microcentrifuge		 37℃ incubator,
80℃ incubator,
Microcentrifuge,
Microcentrifuge
Microcentrifuge
(Q: DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen), P: Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega), T: TRIzol reagent (Thermo　Fisher Scientific))
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. (a) 시료에 증균배지를 첨가하고 배양하여 증균액을 얻는 단계;
    (b) 상기 증균액을 제1 원심분리하여 얻어진 펠렛(pellet)에 용해 버퍼(lysis buffer)를 첨가하고 인큐베이션하여 용해액을 얻는 단계;
    (c) 상기 용해액을 column에 넣고 제2 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계;
    (d) 제2 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 세정 버퍼(washing buffer)를 첨가하고 제3 원심분리하여 flow-through를 제거하는 단계; 및
    (e) 제3 원심분리 후 flow-through가 제거된 용해액에 용출 버퍼(elution buffer)를 첨가하고 제4 원심분리하여 핵산을 추출하는 단계를 포함하는, 식중독 세균의 핵산 추출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식중독 세균은 리스테리아(Listeria) 속 세균인, 핵산 추출방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 리스테리아 속 세균은 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes)인 것을 특징으로 하는, 핵산 추출 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시료는 축육 또는 가금육을 포함하는 식육, 또는 식육가공품인, 핵산 추출 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 증균배지는 LEB(Listeria Enrichment Broth) 배지에 pyruvate 및 ferric citrate (Ⅲ)를 추가로 더 포함하는 것인, 핵산 추출 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 용해 버퍼는 0.1 내지 1.0% NLS sodium salt, 0.1 내지 1.0 N NaOH 및 0.5 M EDTA를 포함하는 것인, 핵산 추출 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 용해 버퍼는 0.1 내지 0.5% NLS sodium salt, 0.5 N NaOH 및 0.5 M EDTA를 포함하는 것인, 핵산 추출 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1 원심분리는 1,000 내지 3,500 xg, 4 내지 20℃ 조건에서 1분 동안 수행되는 것인, 핵산 추출 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 제2 내지 제4 원심분리는 5,000 내지 8,000 xg, 4 내지 20℃ 조건에서 1 내지 2분 동안 수행되는 것인, 핵산 추출 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제3 원심분리는 2회 수행되는 것인, 핵산 추출 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20030006505A (ko) * 2001-07-13 2003-01-23 주식회사 인트론바이오테크놀로지 Ｄｎａ 추출용 세포 용해 버퍼 및 이를 이용한 ｄｎａ추출방법
KR20050082595A (ko) * 2004-02-19 2005-08-24 한국식품연구원 리스테리아 속 균종을 검출하는 방법 및 검출키트

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