KR20210064278A

KR20210064278A - 수분산성의 미립자

Info

Publication number: KR20210064278A
Application number: KR1020217011546A
Authority: KR
Inventors: 히로후미 하쿠바
Original assignee: 도요보 가부시키가이샤
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2019-09-20
Publication date: 2021-06-02
Also published as: EP3858136B1; JPWO2020066912A1; EP3858136A4; CN112739209A; JP7396289B2; TWI725542B; WO2020066912A1; CN112739209B; EP3858136A1; US20220030861A1; TW202019393A

Abstract

본 발명은 바이오필름의 형성을 억제 및/또는 형성된 바이오필름을 제거하는 제(劑)로서, 물에 분산 가능하면서도, 물을 사용하는 곳 등의 환경하에서도 효과가 지속되고, 또한 안전성이 높으며, 저 환경 부하의 재료를 제공하는 것에 있다.
본 발명은 폴리카르복실산 유도체와 약제로 이루어지는 복합체를 포함하는 수분산성의 미립자이다.

Description

수분산성의 미립자

본 발명은 미생물이 생산하는 바이오필름을 제거하는 재료에 관한 것으로, 특히, 바이오필름이 형성되기 쉬운 환경이거나, 바이오필름이 형성된 상태여도, 효과적으로 바이오필름을 억제 및 제거할 수 있는, 바이오필름 제거 조성물에 관한 것이다.

바이오필름은, 재료 표면에 정착한 미생물이 생산하는 구조체이며, 소위, 점액(슬라임)으로서 알려져 있고, 의료, 생활, 산업 등의 모든 환경에 있어서, 병원체의 발생, 재료의 부식 등에 관여하는 등, 많은 문제를 일으킨다.

예컨대, 병원, 개호(介護) 등의 의료 현장에서는, 항균제나 항생 물질 등의 약제에 대해, 내성을 획득한 병원성균(약물 내성균)의 발생이 문제가 되고 있다. 약물 내성균은, 바이오필름의 형성에 의해, 약제, 외적 스트레스에 대해, 내성을 획득하기 쉬운 환경을 만들어낸다고 여겨진다. 또한, 요개호자(要介護者) 등의 구강 내에 발생하는 치주병성 바이오필름은, 오연성 폐렴과 같은 위중한 질환을 초래하는 경우가 있다. 또한, 키친, 목욕탕, 화장실 등의 일상의 물을 사용하는 곳에 있어서도, 바이오필름에 의한 불쾌한 냄새나 식중독의 발생, 재료의 부식 등을 초래한다.

바이오필름은, 미생물이 재료 표면에 정착한 후, 미생물의 증식의 프로세스로 형성, 성장하여, 미생물과 병원성 물질을 포함하는 콜로니로서, 외부에 방출된다. 일단, 바이오필름이 형성되면, 환경 스트레스나 항균제 등에 대해, 내성을 나타내어, 바이오필름 중의 미생물의 제거가 곤란해진다.

바이오필름의 제거 방법으로서, 차아염소산, 오존, 이산화염소 등의 산화성 살균제에 의한 세정 처리가 행해지는 경우가 있다. 그러나, 산화성 살균제는, 높은 부식성을 갖고 있기 때문에, 환경, 안전의 면에서 적용 범위가 한정된다.

상기한 문제를 해결하기 위해서, 부식성이 높은 산화성 살균 방법 대신에, 비산화성의 바이오필름 살균제가 알려져 있다. 예컨대, 특허문헌 1에 있는 이소프로필메틸페놀(IPMP)은, 치주 병원성 바이오필름에 침투하여 살균성을 나타내는 것이 알려져 있다. IPMP는 수불용성이기 때문에, 액상으로서 사용하는 경우, 유기 용매, 계면 활성제 등의 가용화제와의 병용이 필요하고, 물을 기제(基劑)로 하는 처방을 적용할 수 없는 경우가 있다.

특허문헌 2에는, ε-폴리-L-리신(ε-PL)을 이용한 바이오필름 제거제가 개시되어 있다. 상기 발명에는, ε-PL을 함유하는 수용액을 바이오필름에 작용시키면, 바이오필름이 제거되는 내용이 기재되어 있다. ε-PL은, 안전성이 높은 항균성 폴리아미노산으로서 알려져 있고, 물에 대한 용해성이 높고, 수용액으로서의 처방성이 우수하다. 그러나, ε-PL은, 바이오필름 형성을 억제하기 위한 코트제로서 사용하는 경우, 물에 용출되기 쉽기 때문에, 재료나 바이오필름 표면에 머물게 하는 것이 곤란하다. 특히, 균이나 바이오필름이 번식하기 쉬운 물을 사용하는 곳 등, 사용 환경에 따라서는, ε-PL의 바이오필름 억제 및 제거 효과가 상실될 가능성이 있다.

상기한 바와 같이, 바이오필름의 형성을 억제하기 위해서는, 재료 표면의 미생물의 토대가 되는 부위에, 항균 효과를 유효 농도의 범위 내로 유지할 필요가 있다. 특허문헌 3에는, 양친매성 블록 공중합체와 항균제를 포함하는 미셀이 구강 내 바이오필름 형성을 억제하기 위한 약물 이송 시스템으로서, 치아와 결합성을 가짐으로써 표면에 잔류하여, 지속성을 높이는 내용이 기재되어 있다.

비특허문헌 1에는, 은 나노 입자의 항(抗)바이오필름에 관한 내용이 기재되어 있다. 은 나노 입자의 항바이오필름 효과는, 나노 사이즈의 은 입자가 바이오필름에 침투하여, 바이오필름 중의 세균류, 바이오필름을 파괴한다고 생각되고 있다. 그러나, 은 나노 입자는, 항균성, 항바이오필름성이 우수하지만, 입자가 응집하기 쉽고, 단백질, 염 등의 협잡물의 공존에 의해, 활성이 현저히 저하되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 2). 또한, 은 나노 입자는, 안전성이 높다고 여겨지고 있으나, 난분해성이며, 은피증의 발생이나 환경 오염 등의 우려가 있다.

선행기술을 감안하면, 바이오필름을 효과적으로 억제, 제거하는 제(劑)로서는, 고분자 미셀, 금속 나노 입자 등의 나노 재료를 들 수 있으나, 여전히, 수분산성, 재료 표면에의 잔류성, 물을 사용하는 곳 등의 환경하에서의 지속성, 안전성, 생분해성 등의 기술 과제가 많이 남겨져 있다.

특허문헌 1: 일본 특허 제5573111호 공보 특허문헌 2: 일본 특허 제5982088호 공보 특허문헌 3: 일본 특허 제5771143호 공보

비특허문헌 1: Nanoscale Research Letters, 2014, 9, 373. 비특허문헌 2: J. Antibact. Antifung. Agents, 2018, 46, 7, 277-284.

본 발명은 바이오필름의 형성을 억제 및/또는 제거하는 제로서, 물에 분산 가능하면서도, 물을 사용하는 곳 등의 환경하에서도 효과가 지속되고, 또한 안전성이 높으며, 저 환경 부하의 재료를 제공하는 것에 있다.

본 발명자는 예의 검토한 결과, 이하에 나타내는 수단에 의해 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명에 도달하였다.

즉, 본 발명은 이하의 구성을 포함한다.

(1) 폴리카르복실산 유도체와 약제로 이루어지는 복합체를 포함하는, 수분산성의 미립자.

(2) 상기 미립자는, 상기 복합체의 회합체인, (1)에 기재된 미립자.

(3) 상기 약제는, 항미생물 펩티드를 포함하는, (1) 또는 (2)에 기재된 미립자.

(4) 상기 약제는, ε-폴리-L-리신을 포함하는, (1)∼(3) 중 어느 하나에 기재된 미립자.

(5) 상기 폴리카르복실산 유도체는, 폴리카르복실산과 하기 일반식 (1)의 프로파르길아미노산이 축합한 화합물인, (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 미립자.

(식 중의 R은, 수소 원자 또는, 탄소수 1∼8의 탄화수소기를 나타낸다. 또한, 상기 탄화수소기에 있어서, 복수의 수소 원자가 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자로 치환된 것이어도 좋다. 또한, 식 중의 n은, 1∼3의 정수를 나타낸다.)

(6) 상기 폴리카르복실산은, 폴리글루타민산, 폴리아크릴산, 알긴산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인, (1)∼(5) 중 어느 하나에 기재된 미립자.

(7) 평균 입자 직경은, 0.05 ㎛∼0.7 ㎛인, (1)∼(6) 중 어느 하나에 기재된 미립자.

(8) 상기 약제와 상기 폴리카르복실산 유도체의 프로파르길아미노기의 몰비는, 0.1∼0.75인, (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 미립자.

(9) (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 미립자를 함유하는, 항미생물제 및/또는 바이오필름 제거제.

본 발명의 미립자는, 수분산성과 바이오필름의 제거성이 우수하고, 또한, 바이오필름 형성을 억제하는 코트제로서도 사용할 수 있어, 균이 번식하기 쉬운 물 환경하여도, 지속적으로 바이오필름의 형성을 억제할 수 있다. 또한, 천연물 유래의 원료를 이용하기 때문에, 환경에의 부하가 작다.

도 1은 미립자의 형성 과정을 도시한 모식도이다.
도 2는 수중에서의 미립자의 분산 상태를 도시한 광학 현미경 사진이다.
도 3은 본 발명의 미립자의 IR 스펙트럼 차트이다.
도 4는 약제 부착량과 바이오필름 억제율의 관계를 도시한 그래프이다.
도 5는 바이오필름에 대한 약제 접촉 시간과 바이오필름 제거율의 관계를 도시한 그래프이다.
도 6은 바이오필름에 대한 약제 접촉 시간과 바이오필름 억제율의 관계를 도시한 그래프이다.
도 7은 바이오필름에 대한 약제 접촉 시간과 바이오필름 중의 생균수의 관계를 도시한 그래프이다.

본 발명은 폴리카르복실산 유도체와 약제로 이루어지는 복합체를 포함하는, 수분산성의 폴리머 미립자이다. 또한, 상기 폴리카르복실산 유도체는, 폴리카르복실산에 대해, 상기 약제와 상호 작용을 갖는 치환기를 도입한 그라프트 폴리머이다. 그리고, 폴리카르복실산 유도체와 약제가 수소 결합 또는 공유 결합 등의 강한 결합을 형성함으로써, 분산성이 우수한 미립자를 형성할 수 있다. 또한, 미립자를 재료나 바이오필름 표면에 장기간 머물게 할 수 있을 뿐만 아니라, 바이오필름 내에의 침투성이 향상되기 때문에, 함유하는 약제의 잔류성 및 효과의 지속성을 기대할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약제는, 바이오필름 생산에 관여하는 미생물에 대해, 항미생물, 살미생물(殺微生物), 소독 또는 제미생물(除微生物) 작용을 갖는 약제가 바람직하다. 구체적으로는, 항미생물(균) 펩티드, 제4차 암모늄염, 비구아니드 화합물, 티아졸린 화합물, 이미다졸 화합물, 글리세리드 화합물, 카바메이트 화합물, 술파미드 화합물, 피리딘 화합물, 페놀 화합물, 할로겐계 화합물의 유기계 항미생물(균)제를 들 수 있다. 그 중에서도, 저 환경 부하와 고안전성의 관점에서, 항미생물(균) 펩티드가 바람직하다. 항미생물(균) 펩티드의 좋은 예로서는, ε-폴리-L-리신(ε-PL), 프로타민, 리소자임, 니신, 디펜신, 콜리스틴, 인돌리시딘, 멜리틴 등을 들 수 있으나, 원료의 입수성과 범용성의 관점에서 ε-PL이 보다 바람직하다. 상기 ε-PL은, 필수 아미노산의 일종인 L-리신의 ε 위치의 아미노기와 카르복실기가 펩티드 결합한, 대략 25∼35의 리신이 직쇄상으로 연결된 아미노산 호모폴리머이다. 이러한 폴리리신은, 예컨대 토론토 리서치 케미컬즈사 제조의 것이 입수 가능하다.

본 발명에 있어서, 폴리카르복실산 유도체는, 분자 내에 2개 이상의 카르복실기를 갖는 카르복실산에 대해, 적어도 1개 이상의 프로파르길아미노산을 수식한 유도체이다. 분자 내에 2개 이상의 카르복실기를 갖는 카르복실산으로서는, 말론산, 숙신산, 글루타르산, 아디프산, 시트르산, 타르타르산 등의 저분자형 카르복실산, 폴리아크릴산, 폴리메타아크릴산 등의 고분자형 합성 폴리머, 펙틴, 알긴산, 히알루론산, 카르복시메틸셀룰로오스 등의 천연물형 다당류, 폴리-γ-글루타민산, 폴리-α-글루타민산, 폴리아스파라긴산 등의 폴리펩티드를 들 수 있다. 이들 중에서, 분자 내에 복수의 가교점을 갖고, 안전성이 높은 점에서, 폴리-γ-글루타민산, 폴리아크릴산, 알긴산 및 이들의 염이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 프로파르길아미노산이란, 일반식 (1)로 표시되는 아미노산 유도체이다. 식 중의 R은, 수소 원자 또는 탄소수 1∼8의 탄화수소기이다. 또한, 상기 탄화수소기에 있어서, 복수의 수소 원자가 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자로 치환된 것이어도 좋다. 또한, 식 중의 R은, 각각 동일한 것이어도 상이한 것이어도 좋다. 또한, 식 중의 n은, 1∼3의 정수를 나타낸다.

상기 일반식 (1)의 프로파르길아미노산을 구성하는 아미노산은, 어느 것을 사용해도 제한은 없고, 시판되어 있는 것이 있으면 그것을 이용하면 되지만, 안전성의 관점에서 생체 단백질을 구성하는 아미노산을 이용하는 것이 바람직하다. 생체의 단백질을 구성하는 아미노산으로서는, 아스파라긴, 아스파라긴산, 알라닌, 아르기닌, 시스테인·시스틴, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 프롤린, 세린, 티로신, 이소류신, 류신, 발린, 히스티딘, 리신(lysin), 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌(threonin), 트립토판을 들 수 있고, 모두 L체를 이용하는 것이 바람직하다. 이들 중에서도, 입수가 용이하고, 안전성이 높으며, 가장 구조가 단순한 재료인 글리신을 이용하는 것이 바람직하다.

상기 일반식 (1)의 프로파르길아미노산은, 하기 반응식 (2)에 나타나는 바와 같이 상기 아미노산과 프로파르길알코올 또는 프로파르길할로겐화물 등을 축합하여 얻을 수 있다. 보다 구체적으로는, 아미노산과 프로파르길알코올 등을 혼합 용해하고, 염화티오닐 등의 축합제를 첨가하여 반응시킴으로써, 프로파르길아미노산을 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 식 중의 X는, 수산기 또는 할로겐기를 나타낸다. 또한, 식 중의 R은, 수소 원자 또는, 탄소수 1∼8의 탄화수소기를 나타낸다. 또한, 상기 탄화수소기에 있어서, 복수의 수소 원자가 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자로 치환된 것이어도 좋다. 또한, 식 중의 R은, 각각 동일한 것이어도 상이한 것이어도 좋다. 또한, 식 중의 n은, 1∼3의 정수를 나타낸다.

본 발명에 있어서, 폴리카르복실산 유도체는, 하기 반응식 (3)에 나타나는 바와 같이 상기 폴리카르복실산의 카르복실기에, 일반식 (1)의 프로파르길아미노산을 축합하여 얻을 수 있다. 상기 폴리카르복실산과 프로파르길아미노산을 축합하는 방법으로서는, 폴리카르복실산과 프로파르길아미노산을, 실온(1∼30℃), 탈수 축합제 존재하에서 반응시킴으로써 조제할 수 있다. 보다 구체적으로는, 폴리카르복실산을 용매에 용해한 후, 상기 조제한 프로파르길아미노산을 첨가하고, 축합제, 필요에 따라 반응 촉진제를 첨가하여 반응시킴으로써 조제할 수 있다. 이때, 카르복실산 활성기인 프로파르길아미노산은, 폴리카르복실산을 구성하는 카르복실산 단위에 대해 0.25∼1.0 당량으로 하는 것이 바람직하다. 상기 카르복실산 단위에 대해 프로파르길아미노산의 몰비가 지나치게 작으면, 반응이 부족하여, 수식율이 저하되는 경우가 있다. 한편, 상기 카르복실산 단위에 대해 프로파르길아미노산의 몰비가 지나치게 크면, 미반응 원료 및 부생성물의 양이 많아지는 경우가 있다.

본 발명에 있어서, 탈수 축합제는, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(WSC), O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄헥사플루오로인산(HBTU) 등을 들 수 있다. 상기 탈수 축합제는, 폴리카르복실산을 구성하는 카르복실산 단위에 대해 0.25∼1.0 당량 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 축합 반응의 반응 용매는, 폴리카르복실산을 용해하는 용매이면 특별히 제한되지 않고, 예컨대, 물, 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸술폭시드(DMSO), 테트라히드로푸란(THF) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 축합 반응을 촉진하는 경우에는, 반응 촉진제로서, 염기, 촉매, 활성 에스테르체를 반응액에 첨가하는 것이 바람직하다. 염기는, 트리에틸아민(Et₃N), N,N-디이소프로필에틸아민 등의 아민, 탄산나트륨, 탄산수소나트륨 등의 탄산염 등을 들 수 있다. 또한, 촉매는, N,N-디메틸-4-아미노피리딘(DMAP) 등을 들 수 있다. 또한, 활성 에스테르체는, 반응 중간체의 에스테르로서, 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt), N-히드록시숙신이미드(NHS)를 들 수 있다. 염기를 첨가하는 경우에는, 폴리카르복실산을 구성하는 카르복실산 단위에 대해, 0.5∼1.5 당량 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 활성 에스테르체를 첨가하는 경우에는, 폴리카르복실산을 구성하는 카르복실산 단위에 대해 0.25∼1.0 당량 첨가하는 것이 바람직하다.

상기 축합 반응에 있어서, 프로파르길아미노산 및 탈수 축합제 등의 각 원료의 투입량을 변경함으로써, 폴리카르복실산에 대한 프로파르길아미노산의 수식율을 변경할 수 있다. 폴리카르복실산을 이용하는 경우, 프로파르길아미노산의 수식율은, 카르복실산 단위당 1∼55%가 바람직하고, 5∼50%가 보다 바람직하며, 10∼50%가 더욱 바람직하다. 55%를 초과하면, 용매에 대한 용해성이 나빠진다. 폴리카르복실산에 대한 프로파르길아미노산의 수식율을 상기 범위로 조정함으로써, 약제를 내포시켰을 때의 미립자의 사이즈를 조정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 반응 후의 폴리카르복실산 유도체를 회수하기 위해서는, 반응액에 대해, 폴리카르복실산 유도체가 불용인 유기 용매(빈(貧)용매)를 첨가하여 침전시킨다. 빈용매는, 폴리카르복실산 유도체가 불용이며 분산성이 좋은 용매이면 특별히 제한은 없고, 예컨대, 아세톤, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 아세트산에스테르 등을 들 수 있다. 빈용매는, 반응 용매에 대해 3∼10배량이 바람직하다. 빈용매의 첨가량이 지나치게 적으면, 폴리카르복실산 유도체가 충분히 석출되지 않는 경우가 있다. 또한, 빈용매의 첨가량이 지나치게 많으면, 세정의 비용이 증대된다.

본 발명에 있어서, 폴리카르복실산 유도체를 회수한 후, 불순물의 제거를 행하는 경우, 폴리카르복실산 유도체를 물 등의 양용매에 용해한 후, 실온에서 교반하면서 빈용매를 첨가하여 상기 폴리카르복실산 유도체를 재침전시키는, 이른바 용해 재침전법을 이용하여 정제하는 방법을 들 수 있다. 이것을 필요에 따라 1∼3회 반복하면, 불순물을 검출 한계 이하로까지 저감할 수 있다. 또한, 양용매는, 폴리카르복실산 유도체가 용해되는 용매이면, 특별히 제한은 없으나, 안전성과 환경에 대한 영향의 면에서는 물이 바람직하다. 또한, 빈용매는, 폴리카르복실산 유도체가 녹기 어려운 것이면 특별히 제한은 없고, 좋은 예로서, 아세톤, 메탄올, 에탄올 등을 들 수 있다.

상기 양용매의 양은, 폴리카르복실산 유도체의 용해성에 따라 조정할 수 있으나, 공업 생산성의 면에서는 고농도가 바람직하다. 예컨대, 양용매의 양은, 10∼60 wt%의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 10∼30 wt%의 범위이다.

상기 빈용매의 양은, 폴리카르복실산 유도체의 용해성에 따라 조정할 수 있으나, 폴리카르복실산 유도체가 석출되는 양의 최소량이어도 좋다. 예컨대, 빈용매는, 양용매에 대해, 2배량∼12배량이 바람직하다.

상기 정제를 반복함으로써, 한층 더한 불순물의 저감이 가능하다. 제조 비용의 면에서는, 1∼2회 행하면 된다.

얻어진 폴리카르복실산 유도체는, 폴리카르복실산의 카르복실기에 프로파르길아미노산이 축합한 화합물이며, 카르복실기의 친수성 부위와 프로파르길아미노기의 소수성 부위로 구성되는 양친매성 분자이다.

본 발명에 있어서, 폴리카르복실산 유도체와 상기 약제를 상용 가능한 용매 중(반응액 중)에 공존시킴으로써, 폴리카르복실산 유도체의 프로파르길아미노산 부위에 약제가 결합하여 복합체를 형성하고, 또한 상기 복합체가 자기 조직화하여 미립자를 형성할 수 있다(도 1). 상기 미립자는, 폴리카르복실산 유도체의 카르복실기에 대한 프로파르길아미노산의 수식율과 약제의 농도에 의해, 미립자의 입자 직경을 조정할 수 있다. 미립자의 평균 입자 직경은, 특별한 제한은 없으나, 0.05 ㎛∼0.7 ㎛의 범위가 바람직하다. 입자 직경이 지나치게 크면, 바이오필름 내부에 침투할 수 없다.

본 발명에 있어서, 미립자를 조제할 때의 반응액 중의 폴리카르복실산 유도체에 대한 약제의 첨가량은, 폴리카르복실산 유도체의 프로파르길아미노기에 대한 약제의 몰비가 0.1∼0.75의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.15∼0.65의 범위이다. 몰비가 지나치게 크면, 미립자가 응집하기 쉬워져, 액 중에서의 재분산성이 나빠지는 경우가 있다. 몰비가 지나치게 작으면, 항바이오필름에 유효한 미립자가 얻어지지 않는 경우가 있다.

본 발명에 있어서, 미립자를 조제할 때의 용제는, 폴리카르복실산 유도체와 약제의 양 성분이 용해되는 용제이면, 특별히 제한은 없으나, 환경, 안전성의 관점에서, 물이 바람직하다. 필요에 따라, 분산제, 계면 활성제, 가용화제 등의 첨가제를 사용해도 좋다.

본 발명에 있어서, 미립자를 조제할 때의 반응액 중의 약제의 농도는, 항미생물(균)제를 사용하는 경우, 최소 발육 저지 농도(MIC) 및 최소 살균 농도(MBC)의 값을 참고로 하여 결정해도 좋다. 예컨대, ε-PL을 사용하는 경우, 0.01∼1 wt%의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.02∼0.1 wt%의 범위이다. 1 wt%를 초과하면, 원료 비용의 면에서 불리해지는 경우가 있고, 0.01 wt% 미만에서는, 항바이오필름성이 저하되는 경우가 있다.

본 발명에 있어서, 미립자를 조제할 때의 반응액 중의 폴리카르복실산 유도체의 농도는, 상기한 약제의 유효 농도와 몰비의 밸런스에 따라 결정할 수 있다. 예컨대, 0.1∼1 wt%의 범위가 바람직하고, 보다 바람직하게는, 0.5∼1 wt%의 범위이다. 1 wt%를 초과하면, 원료 비용의 면에서 불리해지는 경우가 있다. 0.1 wt% 미만에서는, 미립자 중의 약제 농도가 저하되기 때문에, 항바이오필름성이 저하되는 경우가 있다.

얻어진 미립자는, 반응 용제로서 물을 이용하는 경우에는, 그대로 미립자 분산액으로서 항미생물, 살미생물, 소독 및 제미생물 등의 용도 및 바이오필름 제거에 이용할 수 있다. 여기서, 미립자 분산액이란, 도 2에 도시된 바와 같이 미립자가 응집 덩어리를 형성하지 않고, 미립자가 분산액 중에 균일하게 존재하는 것을 가리킨다. 상기 미립자 분산액은, 이미 형성된 바이오필름에 대해서는, 필요에 따라 희석 또는 농축하여 살포 또는 분무하는 방법을 들 수 있다. 상기 분산액을 바이오필름에 살포 또는 분무한 후, 상온에서 적어도 1분간 이상 방치하는 것이 좋다. 또한, 필요에 따라 계면 활성제, 단백질 분해 효소, 다당 분해 효소, DNA 분해 효소, 표백제 등을 첨가 또는 병용해도 좋다.

본 발명에 있어서, 미립자는, 이미 형성된 바이오필름에 살포 또는 분무하여 이용하는 것 이외에, 바이오필름이 형성되어 있지 않은 재료 표면에 미리 코트해 둠으로써, 재료 표면에의 미생물의 정착이나 바이오필름의 형성을 억제할 수 있다(항바이오필름 코트). 상기 코트 피막은, 미립자 표면의 카르복실산기와 기재 표면의 상호 작용, 또는 미립자가 기재 표면에 물리 흡착됨으로써, 입자가 기재 표면에 고정화되기 때문에, 물에 의해 용이하게 유출되지 않고, 항미생물성이 유지되어, 바이오필름의 형성을 장기간에 걸쳐 억제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 미립자를 항바이오필름 코트로서 사용하는 경우, 재료 표면에 미립자를 통해 부착되는 약제의 부착량은 0.04∼0.12 ㎍/㎠의 범위로 하는 것이 바람직하다. 약제의 부착량이 지나치게 적으면, 바이오필름의 형성 억제가 충분히 발휘되지 않는 경우가 있다. 또한, 약제의 부착량이 지나치게 많으면, 비용 대비 효과의 면에서 불리해진다.

상기 재료 표면에 항바이오필름 코트 처리하는 경우, 도포할 수 있는 기재로서, 세라믹스, 금속, 금속 산화물, 플라스틱, 고무류, 광석류, 목재 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 미립자는, 생태계에 대해 안전성이 높은 재료를 이용하고 있고, 또한 물에 분산할 수 있기 때문에, 일반 가정뿐만이 아니라, 병원, 개호 현장 등의 의료 현장에서의 바이오필름 대책으로서, 키친, 화장실, 욕조 등의 물을 사용하는 곳 등, 많은 산업 용도에 적용할 수 있다.

실시예

이하에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 실시예에 한정되는 것이 아니다.

(글리신, 2-프로핀-1-일, 에스테르(GPE)의 조제)

글리신(나카라이테스크) 2.1 g과 2-프로핀-1-올(나카라이테스크) 30 mL의 혼합액을 조제하고, 실온에서 염화티오닐(나카라이테스크) 2.4 mL를 첨가하였다. 반응액을 실온에서 2시간 교반하고, 또한 50℃에서 2시간 교반하였다. 반응액을 5℃까지 냉각하고, 아세트산에틸 90 mL를 첨가함으로써, 침전물을 얻었다. 침전물을 여과에 의해 분리하고, 또한 아세트산에틸 30 mL로 3회 세정하며, 건조(50℃, 12시간)함으로써, 글리신, 2-프로핀-1-일, 에스테르(아미노에탄산 2-프로피닐, GPE)를 얻었다.

(프로파르길아미노산 수식율의 측정)

폴리카르복실산 유도체를 구성하는 카르복실기에 대한 프로파르길아미노산의 수식율은, D₂O 중의 ¹H-NMR 스펙트럼(BRUKER, MR400)을 측정함으로써 결정하였다. 수식율의 산출은, 프로파르길아미노산이 수식된 카르복실기와 수식되어 있지 않은 카르복실기의 α 수소의 적분 강도비를 측정하여, 하기의 식에 의해 구하였다.

수식율(%)=[수식된 카르복실기의 α 수소]/[(미수식의 카르복실기의 α 수소)+(수식된 카르복실기의 α 수소)]×100

(입자 직경의 측정)

미립자 분산액 0.1 mL를 회분 셀에 넣은 순수(純水) 중에 첨가하고, 상기 희석액을 교반하면서, 나노 입자 직경 분포 측정 장치(시마즈 세이사쿠쇼, SALD-7500nano)의 레이저광을 조사하여, 측정 가능한 굴절률로 분산액 중의 미립자의 평균 입자 직경을 측정하였다.

(IR 스펙트럼의 측정)

미립자 분산액을 원심 분리(4000 rpm)하여 침전시킨 후, 2 mL의 순수로 3회 수세(水洗)하고, 실온에서 24시간 진공 건조하며, 적외 분광계(퍼킨엘머 제조 FT-IR 장치, 형식 번호: SpectrumOne/MultiScope)에 의한 IR 스펙트럼을 측정하였다.

(바이오필름량의 측정)

배양 후, 테스트피스를 취출하여, 생리 식염수로 세정하고, 테스트피스 표면에 부착된 바이오필름량을 측정하였다. 바이오필름 측정 방법은, CV(크리스탈 바이올렛) 염색법에 의해 실시하였다. 즉, 0.1 wt% CV 수용액에 테스트피스를 30분간 침지한 후, 과잉의 CV를 물로 세정하고, 1 mL의 98% 에탄올로 염색 부위를 추출하여, 500 ㎚의 흡광도를 측정하였다.

(생균수의 측정)

바이오필름 중의 생균수는, 바이오필름 부착 표면 재료에 생리 식염수 1 mL를 첨가하고, 초음파 세정기로 바이오필름을 파괴하여, 용출액을 채취하며, 생리 식염수로 10²∼10⁸까지 희석하고, 3M 제조 페트리필름^TM 배지에 접종하여, 30℃에서 1주간 배양하며, 콜로니를 카운트하여, 생균수를 측정하였다.

(제조예 1) GPE화 γ-PGA(40)의 제조

도요보 제조 폴리글루타민산나트륨(γ-PGA) 0.5 g과 물 6 mL를 넣어, 실온에서 교반하였다. 상기 용액에, γ-PGA를 구성하는 카르복실산 단위에 대해, 0.75 당량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(WSC) 및 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt)을 첨가하고, 실온에서 24시간 반응시켰다. 반응 후, 아세톤 35 mL를 첨가하여, 폴리머를 석출시켰다. 얻어진 폴리머를 아세톤으로 세정하고, 건조시켰다. 건조 후, 미정제 폴리머를 물 5.5 mL에 용해하고, 아세톤 60 mL를 첨가하여, 다시 침전시키며, 여과에 의해 분취하였다. 60℃에서 12시간 진공 건조하여, 목적의 GPE화 γ-PGA를 얻었다. ¹H-NMR(D₂O)로부터, γ-PGA의 카르복실산 단위에 대한 GPE의 수식율은, 40%인 것을 확인하였다. 얻어진 폴리카르복실산 유도체를 GPE화 γ-PGA(40)로 하였다.

(제조예 2) GPE화 γ-PGA(25)의 제조

원료의 투입량으로서, 0.5 당량의 GPE 및 WSC, HOBt를 이용한 것 이외에는, 제조예 1에 기재된 방법에 의해 폴리카르복실산 유도체의 제조를 행하였다. ¹H-NMR(D₂O)로부터, γ-PGA의 카르복실산 단위에 대한 GPE의 수식율은, 25%인 것을 확인하였다. 얻어진 폴리카르복실산 유도체를 GPE화 γ-PGA(25)로 하였다.

(제조예 3) GPE화 γ-PGA(15)의 제조

원료의 투입량으로서, 0.25 당량의 GPE 및 WSC, HOBt를 이용한 것 이외에는, 제조예 1에 기재된 방법에 의해 폴리카르복실산 유도체의 제조를 행하였다. ¹H-NMR(D₂O)로부터, γ-PGA의 카르복실산 단위에 대한 GPE의 수식율은, 15%인 것을 확인하였다. 얻어진 폴리카르복실산 유도체를 GPE화 γ-PGA(15)로 하였다.

(제조예 4) GPE화 PAC(19)의 제조

원료로서, 닛폰 쇼쿠바이 제조 폴리아크릴산나트륨 수용액(PAC), 투입량으로서, 0.5 당량의 GPE 및 WSC, HOBt를 이용한 것 이외에는, 제조예 1에 기재된 방법에 의해 폴리카르복실산 유도체의 제조를 행하였다. ¹H-NMR(D₂O)로부터, PAC의 카르복실산 단위에 대한 GPE의 수식율은, 19%인 것을 확인하였다. 얻어진 폴리카르복실산 유도체를 GPE화 PAC(19)로 하였다.

(제조예 5) GPE화 ALG(22)의 제조

원료로서, 나카라이테스크사 제조 알긴산나트륨(ALG)을 이용한 것 이외에는, 제조예 1에 기재된 방법에 의해 폴리카르복실산 유도체의 제조를 행하였다. ¹H-NMR(D₂O)로부터, ALG의 카르복실산 단위에 대한 GPE의 수식율은, 22%인 것을 확인하였다. 얻어진 폴리카르복실산 유도체를 GPE화 ALG(22)로 하였다.

(GPE화 γ-PGA/ε-PL의 미립자 분산액의 제작)

제조예 1∼3에서 얻어진 GPE화 γ-PGA 0.005 g에 물 0.5 mL를 첨가하여, 실온에서 용해하고, 상기 용액에 0.02∼0.18 wt%의 토론토 리서치 케미컬즈사 제조 ε-PL(염산염) 수용액 0.5 mL를 첨가하며, 실온에서 1분간 교반하여, 미립자 분산액을 얻었다. 얻어진 분산액을 이용하여 측정한 미립자의 평균 입자 직경을 표 1에 나타낸다. 폴리머의 GPE기에 대한 ε-PL의 몰비가 0.16∼0.63의 범위에 있어서, 평균 입자 직경 0.064 ㎛∼0.624 ㎛의 미립자가 얻어진 것을 확인하였다. 몰비가 0.75를 초과하면, 입자가 응집하여, 분산성이 악화되는 경향이었다. GPE화되어 있지 않은 γ-PGA와 ε-PL의 혼합액을 제작하면, 즉시 응집물이 보여지고, 상기한 바와 같은 미립자는 얻어지지 않았다. 또한, 실시예 1에서 얻어진 미립자의 조성을 분석하기 위해서, 미립자를 원심 분리기로 원침(遠沈)시키고, 수세, 건조하여 적외 분광계(시마즈 세이사쿠쇼)에 의한 IR 스펙트럼을 측정하였다. 원침된 미립자의 IR 스펙트럼을 도 3에 도시한다. 얻어진 미립자는, GPE화 γ-PGA와 ε-PL 유래의 흡수 피크가 관측되고 있어, 양 성분을 포함하는 조성물인 것이 확인되었다.

(시험예 1) P.Fluorescens 균액의 조제

항바이오필름성 평가로서, 바이오필름 생산성이 높은 그램 음성 간균인 P.Fluorescens를 이용하였다. P.Fluorescens 건조 표품은, NBRC No.14160으로부터 입수하고, 하기의 방법에 의해 복원하였다. 와코 쥰야쿠 고교사 제조의 다이고 802 배지 8.4 g과 정제수 300 mL를 비이커에 칭량하고, 실온에서 약 30분간 교반하여, 현탁시켰다. 오토클레이브에서 복원액을 멸균한 후, 마이크로피펫으로 0.2 mL 취하여, P.Fluorescens 건조 표품 앰플에 넣어, 교반하였다. 별도로 조제한 와코 쥰야쿠 고교사 제조 SCD 배지(Soybean-Casein Digest Broth) 25 mL를 플라스크에 넣고, 계속해서, 상기한 현탁시킨 P.Fluorescens 균액 100 μL를 넣으며, 항온 진탕 배양기에서, 온도 30℃, 24시간, 속도 150 rpm으로 설정하여, 배양하였다. 배양 후, 80% 글리세롤에 넣고, 균액을 -80℃에서 보존하였다.

(시험예 2) 미립자 분산액을 이용한 항바이오필름 코트 시험

항바이오필름 코트의 시험액으로서, 제조예 1∼5의 GPE화 폴리카르복실산을 이용하여, ε-PL과의 미립자 분산액을 조제하였다. 미립자 분산액은, 분산액 중의 GPE화 폴리카르복실산의 농도가 0.5 wt%, ε-PL의 농도가 0.045 wt%가 되도록, 양 수용액을 혼합하여 조제하였다. 비교로서, ε-PL 단체(單體) 수용액, 와코 쥰야쿠 고교사 제조 IPMP(4-이소프로필-3-메틸페놀) 에탄올 용액, 은 나노 입자의 수분산액(니혼 이온사 제조)을 이용하여, 액 중의 농도가 0.045 wt%가 되도록, 각각 조제하였다. 각 시험액의 코트량으로서, 각 항균 성분의 부착량이 0.04∼0.12 ㎍/㎠가 되도록 테스트피스(염화비닐 제조, 1 ㎠)에 코트하고, 30℃에서 12시간 진공 건조시켰다. 각 약제를 코트한 테스트피스에 대해, 물을 사용하는 곳을 상정한 환경으로 하여, 수세 조건(25℃, 350 rpm, 1분간 교반)에 붙였다. 수세 후의 테스트피스를 시험예 1에서 제작한 균액을 포함하는 배지(P.Fluorescens 균액을 SCD 배지에서 10⁶ cfu/mL로 조제)에 침지하고, 30℃에서 48시간 배양하여 바이오필름을 형성시켰다. 배양 후, 테스트피스를 취출하고, 생리 식염수로 세정하며, 테스트피스 표면에 부착된 바이오필름량을 측정하였다. 바이오필름의 억제율은, 하기의 식에 의해 계산하였다.

바이오필름 억제율(%)=(미처리의 테스트피스의 측정값-시험용 액 코트의 테스트피스의 측정값)/(미처리의 테스트피스의 측정값)×100

각 코트제의 부착량과 바이오필름 억제율의 결과를 표 2, 도 4에 도시한다. GPE화 폴리카르복실산/ε-PL 미립자 코트는, 미처리 테스트피스에 대해, 최대로 85% 정도의 바이오필름이 억제되고 있는 것을 확인하였다. 한편, ε-PL 단체, 은 나노 입자 코트는, 수세 조건을 부가하면, 바이오필름 억제율이 저하, 즉 바이오필름 부착 억제성이 저하되었다. 이것은, 코트층에 포함되는 약제가 수세에 의해 용이하게 제거되었기 때문이라고 추정된다. 또한, 은 나노 입자 코트는, 부착량이 많을수록, 바이오필름 부착량이 높아지는 경향이 있고, 제품 유래의 불활성 성분이 바이오필름, 세균 세포의 정착을 촉진하는 토대가 되고 있다고 추측된다. 한편, GPE화 폴리카르복실산/ε-PL 코트는, 수세 조건을 부가해도, 바이오필름 억제 효과가 유지되어 있고, ε-PL 단체 및 은 나노 입자에는 달성되지 않는 지속 효과가 확인되었다.

(시험예 3) 약제 침지 후의 바이오필름 제거성 시험

48웰 마이크로플레이트(스미토모 베이클라이트사 제조)에, 시험예 1의 균액(P.Fluorescens, 10⁶ cfu/mL)을 포함하는 SCD 배지를 넣어, 30℃에서 1주간 배양하여, 플레이트 내에 바이오필름을 형성시키고, 상청의 균액을 제거하며, 멸균이 완료된 생리 식염수로 린스하고, 건조시켰다. 시험액은, 시험예 2와 동일한 방법으로 제작하였다. 즉, 분산액에 대해, GPE화 폴리카르복실산의 농도가 0.5 wt%, ε-PL의 농도가 0.04 wt%가 되도록, 미립자 분산액을 제작하였다. 바이오필름을 형성시킨 마이크로플레이트 내에 각 시험 약제 1 mL를 넣어, 1분, 10분, 30분, 60분간 침지하고, 각 침지(접촉) 시간마다 바이오필름 제거성을 조사하였다. 침지(접촉) 시간 경과 후, 시험 약제를 제거하고, 즉시, 생리 식염수 1 mL로 2회 세정하고 건조 후, 시험예 2에 기재된 CV 염색법에 의한 바이오필름량의 측정을 행하였다. 바이오필름의 제거율은, 하기의 식에 의해 계산하였다.

바이오필름 제거율(%)=(미처리의 측정값-시험액 침지 후의 측정값)/(미처리의 측정값)×100

각 시험 약제의 바이오필름에의 접촉(침지) 시간과 바이오필름 제거율의 관계를 표 3, 도 5에 도시한다. ε-PL 수용액은, 가장 바이오필름 제거성이 높으나, GPE화 폴리카르복실산/ε-PL은, 7할의 바이오필름 제거성을 나타내었다. 또한, 바이오필름 제거성은, 바이오필름 살균제로서 알려진 IPMP와 동등하며, 은 나노 입자보다 높았다. 은 나노 입자는, 접촉 시간을 연장하면 바이오필름 제거성이 저하되는 결과가 되었다. 이것은, 은 나노 입자가, 바이오필름 유래의 단백질, 배지의 염 등의 불순물에 의해 응집했기 때문이라고 추측된다.

(시험예 4) 약제 침지(접촉) 후의 바이오필름 억제성 시험

시험예 3의 바이오필름을 형성시킨 마이크로플레이트 내에 각 시험 약제 1 mL를 넣어, 1분, 10분, 30분, 60분간 침지하고, 접촉 시간 경과 후, 시험 약제를 제거하며, 즉시, 생리 식염수 1 mL로 2회 세정하였다. 여기서, 마이크로플레이트 내에 SCD 배지 1 mL를 넣어, 30℃에서 24시간 배양하여, 다시 바이오필름을 형성시키고, 바이오필름의 재억제성을 평가하였다. 배양 후, 바이오필름량의 측정을 행하였다. 바이오필름의 양은, 시험예 2에 기재된 CV 염색법에 의한 바이오필름량의 측정을 행하였다. 바이오필름의 억제율은, 하기의 식에 의해 계산하였다.

바이오필름 억제율(%)=(미처리의 측정값-시험액 침지 후의 측정값)/(미처리의 측정값)×100

각 시험 약제와 억제율의 관계를 표 3, 도 6에 도시한다. GPE화 폴리카르복실산/ε-PL 중, 폴리카르복실산으로서 PAC의 계가 가장 바이오필름의 억제 효과가 높은 것을 확인하였다. GPE화 폴리카르복실산/ε-PL은, 바이오필름 표면에 접착하여, 배지 중, 바이오필름이 형성되기 쉬운 환경하여도, 바이오필름의 억제 효과가 유지되는 것을 알 수 있었다.

(시험예 5) 바이오필름 살균성 시험

바이오필름에 대한 시험 약제 접촉 후, 바이오필름 중의 균의 살균성을 시험하였다. 시험예 3의 바이오필름을 형성시킨 마이크로플레이트 내에 각 시험 약제 1 mL를 넣어, 1분, 10분, 30분, 60분간 침지하고, 접촉 시간 경과 후, 시험 약제를 제거하며, 즉시, 생리 식염수 1 mL로 2회 세정하였다. 마이크로플레이트에, 생리 식염수 1 mL를 넣고, 초음파 세정기에 의해 1분간 처리하며, 바이오필름을 파괴하여 생리 식염수 중에 균을 용출시켰다. 용출액을 멸균이 완료된 생리 식염수로 10²∼10⁸까지 희석하고, 3M 제조 페트리필름^TM 배지에 접종하여, 30℃에서 1주간 배양하며, 콜로니를 카운트하여, 생균수를 측정하였다. 약제 접촉 시간과 생균수의 관계를 표 4, 도 7에 도시한다. 실시예 37-39에 있어서, 미처리의 생균수가 40000 cfu/well에 대해, 생균수가 저하되어 있어, 미립자 분산액에의 침지에 의해, 바이오필름 중의 균수가 저하된 것을 확인하였다.

본 발명의 미립자는, 물에 분산시키거나 하여, 코팅 혹은 침지에 의해, 효과적으로 바이오필름의 형성을 억제하거나, 또는 제거할 수 있기 때문에 적용 범위가 넓고, 또한 생체, 환경에 대한 안전성이 높은 재료를 이용하고 있으며, 또한 기재 접착성을 갖기 때문에, 바이오필름 대책으로서 이용 가능하다.

Claims

폴리카르복실산 유도체와 약제로 이루어지는 복합체를 포함하는, 수분산성의 미립자.
제1항에 있어서, 상기 미립자는, 상기 복합체의 회합체인 미립자.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 약제는, 항미생물 펩티드를 포함하는 미립자.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제는, ε-폴리-L-리신을 포함하는 미립자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리카르복실산 유도체는, 폴리카르복실산과 하기 일반식 (1)의 프로파르길아미노산이 축합한 화합물인 미립자.

(식 중의 R은, 수소 원자 또는, 탄소수 1∼8의 탄화수소기를 나타낸다. 또한, 상기 탄화수소기에 있어서, 복수의 수소 원자가 질소 원자, 산소 원자 또는 황 원자로 치환된 것이어도 좋다. 또한, 식 중의 n은, 1∼3의 정수를 나타낸다.)
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리카르복실산은, 폴리글루타민산, 폴리아크릴산, 알긴산 및 이들의 염으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 미립자.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 평균 입자 직경은, 0.05 ㎛∼0.7 ㎛인 미립자.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제와 상기 폴리카르복실산 유도체의 프로파르길아미노기의 몰비는, 0.1∼0.75인 미립자.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 미립자를 함유하는, 항미생물제 및/또는 바이오필름 제거제.