KR20210060909A - 혈액성분 분리용 다중필터 및 그를 이용한 질병 진단키트 - Google Patents

혈액성분 분리용 다중필터 및 그를 이용한 질병 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈액성분 분리용 다중필터 및 그를 이용한 질병 진단키트에 관한 것이다.
본 발명의 혈액성분 분리용 다중필터는 전혈 시료로부터 혈구세포를 분리하는 제1필터부, 혈소판, 엑소좀을 포함하는 세포조각을 분리하는 제2필터부 및 단백질을 분리하는 제3필터부를 포함하되, 상기 전혈 시료가 다양한 기공 사이즈별로 구배된 각 필터부를 통해 혈액성분별로 분리함으로써, 별도의 기계없이 혈액의 개별성분을 효율적으로 분리할 수 있다. 또한, 필터링 이후 다중필터를 분해하여 필터에 잔류된 성분별로 수집하여 진단에 활용할 수 있다.

Description

혈액성분 분리용 다중필터 및 그를 이용한 질병 진단키트{MULTI-LAYERED FILTER FOR SEPARATING BLOOD COMPONENTS AND DISEASE DIAGNOSIS KIT USING THE SAME}
본 발명은 혈액성분 분리용 다중필터 및 그를 이용한 질병 진단키트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 전혈 시료로부터 혈구세포를 분리하는 제1필터부, 혈소판, 엑소좀을 포함하는 세포조각을 분리하는 제2필터부 및 단백질을 분리하는 제3필터부를 포함하되, 상기 전혈 시료가 다양한 기공 사이즈별로 구배된 각 필터부를 통해 혈액성분별로 분리되고, 필터링 이후 다중필터를 분해하여 필터에 잔류된 성분별로 수집하여 진단에 활용할 수 있는, 혈액성분 분리용 다중필터 및 그를 이용한 질병 진단키트에 관한 것이다.
혈액은 백혈구 및 적혈구와 같은 세포, 혈소판 및 엑소좀(exosome)과 같은 세포에서 유래한 작은 파티클, 혈장 단백질과 지질, 핵산 조각이나 대사체 등을 포함하는 미량의 분자들로 구성되어 있다.
혈액의 개별 성분을 측정하면, 건강상태 및 질병 유무를 진단할 수 있기 때문에 혈액은 진단을 위한 유용한 생체 시료로 활용되고 있다.
진단을 위해 사용되는 측정법은 혈액을 직접 사용하기에는 어려움이 있기 때문에 혈액의 성분들을 분리하는 처리 절차를 먼저 거친 후 순수하게 분리된 개별 성분을 측정하는 기술을 적용하고 있다.
그러나 현재 혈액으로부터 개별 성분으로 분리하기 위해 사용되는 방법들은 복합한 절차를 거쳐야 하고, 각 절차를 수행하기 위해서는 다양한 기기와 시약이 요구되기 때문에 시설이 잘 갖춰진 실험실에서만 수행할 수 있다는 단점이 있다.
특허문헌 1에는 상부기판과 하부기판으로 되고 혈액유입구와 혈장유출구를 갖는 혈장 분리칩에 있어서, 상기 기판 중 하나에는 모세관력을 이용하여 혈장을 이동시키는 혈장이동채널이 구비되고, 백혈구를 걸러내는 제1필터부와 적혈구를 걸러내는 제2필터부가 혈장의 이동 경로를 따라 순차적으로 포함되는 것이 특징인 방사형 필터 구조를 갖는 혈장 분리칩을 개시하고 있으며, 별도의 구동수단 없이도 혈액으로부터 혈장을 신속하고 효율적으로 분리한다고 보고하고 있다. 그러나, 상기 발명은 혈액에서 혈액 중에서 혈장만을 분리해 내는 것으로 한정되어 있다.
또한, 특허문헌 2는 수혈용 전혈 제제, 적혈구 제제, 혈소판 제제, 혈장 제제 등으로부터 수혈 부작용의 원인이 되는 미소 응집물이나 백혈구를 제거하기 위한 백혈구 제거 필터 장치 및 백혈구 제거 방법에 관한 것이고, 특히 실온 여과와 냉장 여과의 두 사용 조건에 있어서 우수한 여과 성능을 발휘하는 백혈구 제거 필터 장치 및 백혈구 제거 방법을 제시하고 있다. 그러나 상기 발명 역시 혈액에 특정 성분을 분리하기 위한 방법이고 실험실 실시로 한정되어 현장적용성이 떨어진다.
이에, 본 발명자들은 종래 혈액의 개별성분을 분리하기 위한 다양한 기기 및 시약 사용 등의 복잡한 절차를 간소화하기 위하여 노력한 결과, 혈액을 구성하는 각 성분들의 종류별로 다른 크기와 물리화학적 특성을 가지고 있다는 점을 이용하여, 전혈 시료가 다양한 기공 사이즈별로 구배된 각 필터부를 통해 혈액성분별로 분리되도록 다중필터를 제공하여, 별도의 기계없이 혈액의 개별성분을 효율적으로 분리하고, 필터링 이후 다중필터를 분해하여 필터에 잔류된 성분별로 수집하여 진단에 활용할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국특허 제1190035호 (2012.10.12 공고) 대한민국특허 제0876819호 (2009.01.07 공고)
본 발명의 목적은 전혈로부터 혈액성분별로 분리가능한 다중필터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 다중필터를 이용한 질병 진단키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전혈 시료로부터 혈구세포를 분리하는 제1필터부, 혈소판, 엑소좀을 포함하는 세포 조각을 분리하는 제2필터부 및 단백질을 분리하는 제3필터부를 포함하되, 상기 전혈 시료가 기공 사이즈별로 구배된 각 필터부를 통과하여 혈액성분별로 분리되는 다중필터를 제공한다.
본 발명의 다중필터에 있어서, 상기 제3필터부가 단백질의 크기별 추가 필터부가 더 포함될 수 있다.
본 발명의 다중필터는 상기 제3필터부를 통과하는 소형단백질이나 핵산성분의 분리를 위한 제4필터부가 더 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 다중필터는 각 필터부가 순차 조합되고, 필터링 이후 조합된 필터부가 분해되어 각 성분별로 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 다중필터는 각 필터부가 각 필터부가 밀착 조합되되, 필터부간 공간이 이격된 구조로 설계된다.
본 발명의 다중필터는 전혈 시료가 20 내지 100㎕가 투입되어 혈액성분 분리가 가능하고 의료현장에서 즉시 실시할 수 있다.
나아가 본 발명은 상기 다중필터를 이용하여 질병 진단키트를 제공할 수 있으며, 본 발명의 실시예에서는 혈중 P-셀렉틴 측정이 가능한 뇌졸증 진단키트를 제공한다.
본 발명의 혈액성분 분리용 다중필터에 따르면, 현장에서 즉석으로 특별한 장비의 도움 없이 간편하게 혈액의 개별 성분으로 추출하고 분리하여 진단에 사용할 수 있다.
또한, 일반적으로 혈액의 개별 성분을 분리하기 위해서 다양한 기기 및 시약이 많이 사용되는 반면, 본 발명은 별도의 기계없이 다중필터 사용으로 혈액의 개별 성분을 효과적으로 분리할 수 있다.
본 발명의 혈액성분 분리용 다중필터는 혈액으로부터 개별 성분으로 분리하기 위한 절차가 간소화되므로, 많은 장비나 시설이 갖춰지지 않은 의료 현장에서도 혈액을 이용한 검사를 수행할 수 있어 현장 적용성을 확보할 수 있다.
나아가, 본 발명의 다중필터는 각 필터부가 순차 조합되고, 필터링 이후 조합된 필터부가 분해되어 각 성분별로 진단할 수 있어, 질병 진단키트로서 적용 가능하다.
도 1은 본 발명의 제1실시형태의 혈액성분 분리용 다중필터의 단면도이고,
도 2는 본 발명의 제2실시형태의 혈액성분 분리용 다중필터의 단면도이고,
도 3은 본 발명의 실시예 1의 다중필터를 이용한 혈액성분 분리실험결과이고,
도 4는 본 발명의 실시예 2의 다중필터를 이용한 혈액성분 분리실험결과이고,
도 5는 본 발명의 실시예 2의 다중필터를 이용한 혈액성분 분리실험결과에서, 제3필터부에서 혈장성분 잔류여부를 실험한 결과이고,
도 6은 본 발명의 실시예 2의 다중필터를 이용한 혈액성분 분리실험결과에서, 제3필터부의 기공 사이즈에 따른 혈장성분 분리여부를 실험한 결과이고,
도 7은 본 발명의 실시예 2의 다중필터를 이용한 혈액성분 분리실험결과에서, 제4필터부에서 핵산 잔류여부를 실험한 결과이고,
도 8은 본 발명의 비교예 1의 다중필터 제작 및 그를 이용한 혈액분리 결과이고,
도 9는 본 발명의 비교예 2의 다중필터 제작 및 그를 이용한 혈액분리 결과이고,
도 10은 본 발명의 비교예 3의 다중필터 제작 및 그를 이용한 혈액분리 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 혈액의 모든 성분을 포함하고 있는 전혈(whole blood)이 종류별로 다른 크기와 물리화학적 특성을 가지고 있다는 점을 이용하여, 본 발명의 다중필터는 분리하고 획득하고자 하는 각 성분에 적합하도록 기공 사이즈 및 재질의 조건을 가진 복수개의 필터부를 조합한 것으로, 모세관 현상을 이용하여 필터부를 통과하는 과정에서 각 필터부에 각기 다른 성분들이 잔류하거나 통과하게 된다.
도 1은 본 발명의 제1실시형태의 혈액성분 분리용 다중필터의 단면도의 일례로서, 전혈 시료에서부터 각 성분별 분리할 수 있도록, 각 단계에서 해당하는 성분을 통과시킬 수 없는 기공크기(pore size)와 기공구조 등 물리적인 특성을 다르게 설계한다.
구체적으로, 본 발명은 전혈 시료로부터 혈구세포를 분리하는 제1필터부, 혈소판, 엑소좀을 포함하는 세포 조각을 분리하는 제2필터부 및 단백질을 분리하는 제3필터부를 포함하되, 상기 전혈 시료가 기공 사이즈별로 구배된 각 필터부를 통과하여 혈액성분별로 분리되는 다중필터를 제공한다.
또한, 다중필터에서 상기 제3필터부는 분리하고자 하는 단백질의 크기별에 따라 추가 필터부가 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 제3필터부를 통과하는 소형단백질이나 핵산성분은 별도의 필터부(제4필터부)로 분리할 수 있다.
도 2는 본 발명의 제2실시형태의 혈액성분 분리용 다중필터의 단면도로서, 상기 제3필터부를 통과하는 소형단백질이나 핵산성분의 분리를 위한 제4필터부가 더 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 다중필터는 각 필터부가 순차 조합되고, 필터링 이후 다중필터를 분해하여 각 필터부가 잔류된 성분별로 진단 또는 실험재료로 활용될 수 있다.
1. 제1필터부(Filter1)
투여된 전혈 시료에서 혈구세포를 분리할 목적으로 사용하며, 혈구세포를 통과시킬 수 없는 기공 사이즈와 구조를 가지고 있어야 하며 동시에 그 외의 성분들은 잘 통과할 수 있도록 흡착이 되지 않는 재질로 구성되어야 한다. 구체적으로, 천연 섬유군에서 선택 사용할 수 있으며, 필터의 기공 사이즈를 크게 만들 수 있는 재질이라면 바람직하다.
또한, 혈구세포를 손상 없이 분리하기 위하여 필터의 규격요건이 충족되어야 하는데, 바람직하게는 기공 사이즈 5∼15㎛, 두께 500∼1500㎛, 무게 100∼400 gram/m2, 마이크론 등급(micron rating) 2∼5㎛, 홀드-업-볼륨 20∼100㎕이다.
본 발명의 실시예에서 채용한 가장 바람직한 필터 규격은 기공 사이즈 10㎛, 두께 1000㎛, 무게 250 gram/m2, 마이크론 등급(micron rating) 3㎛, 홀드-업-볼륨 50㎕인 필터를 구비한다.
본 발명의 다중필터는 제1필터부에 혈구세포가 잔류하며, 제1필터부를 통해 분리하여 잔류된 혈구세포를 실험 시료로 활용할 수 있다.
2. 제2필터부(Filter2)
제2필터부(Filter2)는 혈구세포를 제외한 기타 입자를 크기에 따라 분리하는 목적으로 사용된다.
즉, 혈소판, 세포 조각, 엑소좀(exosome) 등의 세포 보다 작은 크기의 조각들을 분리할 목적으로 사용하는 제2필터부는 세포 조각을 통과시킬 수 없는 기공 사이즈 와 구조를 가지고 있어야 하며 동시에 그 외의 성분, 예를 들면 혈장 단백질 등은 필터를 잘 통과할 수 있도록 하고 필터에 흡착되지 않는 재질로 구성한다.
바람직한 필터 규격은 기공 사이즈 0.05∼1㎛, 두께 100∼1000㎛, 무게 100∼300 gram/m2, 마이크론 등급 1∼5㎛, 홀드-업-볼륨 2∼10㎕ 범위이며, 더욱 바람직하게는 기공 사이즈 0.1㎛, 두께 300㎛, 무게 200 gram/m2, 마이크론 등급(micron rating) 2㎛, 홀드-업-볼륨 5㎕의 필터 규격 요건을 충족한다.
제2필터부(Filter2)를 통해, 세포 조각 성분들이 잔류하게 되며, 상기 제2필터부(Filter2)를 통해 분리하여 잔류된 혈소판, 세포 조각, 엑소좀 등을 실험 시료로 활용할 수 있다.
3. 제3필터부(Filter3)
제3필터부(Filter3)는 단백질을 분리할 목적으로 사용하는 필터로서 단백질을 통과시킬 수 없는 기공 사이즈와 구조를 가지고 있어야 하며 동시에 핵산이나 단백질에 대한 친화성 및 흡착성이 아주 낮은 재질을 사용한다.
도 1에서 제시된 제2필터부(Filter2)와 제3필터부(Filter3) 외에 중소형 단백질 또는 혈액에 존재하는 기타 입자들은 실험자가 원하는 크기나 특성에 따라 필터 규격(pore size, 구조, 필터의 수 등)을 조절하여 더 세부적으로 분리할 수 있는 필터의 추가할 수 있다.
따라서 제3필터부(Filter3)의 경우, 2개 이상의 필터를 이용하여 다양한 크기의 혈액에 존재하는 단백질을 포함한 다양한 입자 성분들을 각의 필터부에 잔류시켜 성분별로 분획 처리할 수 있다.
제3필터부(Filter3)를 통해, 단백질 성분들이 잔류하며, 상기 제3필터부(Filter3)를 통해 분리하여 잔류된 단백질을 실험 시료로 활용할 수 있다.
4. 제4필터부(Filter4)
상기 제3필터부(Filter3)을 통과한 액상 시료 중에서 핵산 조각만 별도로 분리시킬 필요성이 있는 경우에는 제4필터부(Filter4)를 추가할 수 있다.
제4필터부(Filter4)는 핵산 흡착이 잘 되는 재질을 사용할 수 있다. 핵산은 filter4에 잔류하게 되고 잔류하는 핵산 성분들은 실험 시료로 사용할 수 있다.
또한, 상기 제3필터부(Filter3) 통과한 액상 시료 중에는 아미노산, 염기, 각종 대사체 등 아주 작은 크기의 입자 또는 액체에 녹아 있는 성분 등이 존재하므로 이를 진단 등의 실험에 이용할 수 있다.
이때, 시료는 제3필터부(Filter3)을 통과한 액상 상태 그대로 바로 사용할 수도 있고 보존이나 운반 등의 목적으로 제43필터부(Filter4)에 잔류시켜 사용할 수도 있다. 필요에 따라서 제4필터부(Filter4)에 잔류된 상태에서 건조, 동결 등 다른 시료 보존 방법을 추가하여 활용할 수도 있다.
바람직한 제4필터부(Filter4)의 재질은 핵산의 흡착을 돕기 위해서 실리카 재질을 사용하는 것이며 시중에 판매되고 있는 핵산 분리용 실리카 재질의 필터재를 사용할 수 있다.
이상의 본 발명의 다중필터는 각 필터부가 밀착 조합되되, 필터부간 공간이 이격된 구조로 설계된다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제작된 다중필터를 이용한 혈액분리 결과이고, 도 4는 본 발명의 실시예 2에서 제작된 다중필터를 이용한 혈액분리 결과를 나타낸 것으로, 각 필터부가 밀착 조합되되, 필터부간 공간이 이격된 구조로 제작된 다중필터의 경우, 제1필터부에서 혈구세포 분리 흡수되고, 제3필터부를 통과하여 제4필터부에서 순수한 혈장 성분만이 통과해 분리된 결과를 확인할 수 있다.
도 5 및 도 6은 상기 다중필터를 이용한 혈액성분 분리실험결과에서, 제3필터부에서 혈장성분 잔류여부를 실험한 결과로서, 단백질의 선택적 분리가 가능함을 확인할 수 있고, 제3필터부(Filter3)의 기공 사이즈별로 혈장성분 분리여부를 확인한 결과, 제3필터부(Filter3)의 기공 사이즈가 0.03㎛일 경우를 제외하고는, 기공 사이즈 0.003㎛, 0.005㎛ 및 0.01㎛의 경우에는 혈액 단백질들이 제3필터부(Filter3)를 통과하지 못하고 제3필터부(Filter3)에 거의 잔류한 것을 확인할 수 있다.
도 7은 본 발명의 상기 다중필터를 이용한 혈액성분 분리실험결과에서, 제4필터부에서 핵산 잔류여부를 실험한 결과로서, 사람의 GAPDH 프라이머로 PCR을 확인하였을 때 제2필터부(Filter2) 및 제3필터부(Filter3)에서는 밴드가 관찰되지 않았으나, 제4필터부(Filter4)에서만 밴드가 관찰됨으로써, 핵산 잔류를 확인할 수 있다.
반면에, 도 8 내지 도 10은 본 발명의 비교예 1 내지 비교예 3의 다중필터 제작 및 그를 이용한 혈액분리 결과를 나타낸 것으로, 종래 주사위를 사용한 압력과 각 필터부를 O-링 같은 수단으로 압착하여 제작된 경우, 특정 부위로 혈액의 이동이 집중되어 분리가 제대로 일어나지 않는다. 즉, 제1필터부에서 혈구세포가 완전히 분리되지 않고 제3필터부 및 제4필터부에 부분적으로 이동된 결과를 보인다.
이상으로부터, 본 발명의 다중필터의 구조는 각 필터부간의 사이는 최대한 밀착을 하되 필터의 기본적인 구조를 손상하는 외부 압력 등의 물리적인 간섭이 없어야 한다.
또한, 본 발명의 다중필터를 사용함에 있어, 전혈을 다중필터에 주입할 경우에 혈구세포의 손상이 일어나는 것을 최소화시켜야 한다.
이때, 혈구세포의 손상은 세포 구성물이 혈장 성분을 오염시켜서 잘못된 분석 결과를 도출할 뿐만 아니라 전혈 성분의 분리를 방해하게 된다.
본 발명의 다중필터는 전혈 시료가 20 내지 100㎕가 투입되어 혈액성분 분리가 가능함으로써, 병원이나 실험실뿐만 아니라, 가정에서 혈당계를 이용하여 채취용 침으로 손가락 등에서 혈액을 채취하여 즉시 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다중필터는 특별한 장비의 도움 없이 간편하게 개별 성분으로 추출하고 분리하여 진단에 사용할 수 있다.
나아가 본 발명은 상기의 다중필터를 이용하여 질병 진단키트를 제공할 수 있다.
바람직한 일례로서, 본 발명은 상기의 다중필터를 이용하여 혈중 P-셀렉틴 측정이 가능한 뇌졸증 진단키트를 제공한다.
P-셀렉틴(P-selectin)은 활성화된 내피세포의 표면에서 발현하는 단백질로서 혈소판에서 활성화되어 기능을 발현한다. 일반적인 상황에서는 상기 P-셀렉틴이 내피세포와 혈소판의 표면에 위치하고 있으나 뇌졸중과 같은 질병에 노출된 상황에서는 sP-selectin(Soluble platelet selectin)으로 바뀌게 된다.
즉, 질병에 의해 용해가능한 형태로 바뀌게 된 sP- 셀렉틴은 혈장으로 누출된다. 따라서 혈장에 누출된 sP- 셀렉틴을 측정하는 것은 질병 진단에 활용될 수 있다.
본 발명의 다중필터에 전혈을 통과시키면, 제1필터부(Filter1)에서는 혈구세포를 분리하게 되고 제2필터부(Filter2-1)의 혈소판을 분리할 수 있게 되어 일차적으로 혈소판에 비활성화 상태의 P- 셀렉틴을 확인할 수 있다.
상기 제2필터부(Filter2-1)보다 작은 기공 사이즈인 제2필터부(Filter2-2)에서는 혈장에 있는 단백질들을 분리할 수 있는데 뇌졸중 환자의 혈액에서 분리할 경우에는 sP- 셀렉틴과 같은 활성화 형태를 확인할 수 있다.
또 다른 경우, P-셀렉틴은 염증반응에 의해 상승하는 경우가 있는데 뇌졸중과 관련해서도 상승할 수 있어서 두 가지의 경우를 구별하여 판별하기 위해 유전자와 단백질 발현 레벨을 함께 확인하여 좀 더 명확한 진단을 할 수 있다. 즉, 염증에서는 염증관련 단백질의 유전자 발현이 p-셀렉틴과 함께 증가하지만 뇌졸중의 경우 p-셀렉틴 단백질만 증가한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 다중필터 제작
아크릴판 상에 제4필터부, 제3필터부, 제2필터부 및 제1필터부를 순차 적층하여 다중필터를 제작하였다. 각 필터부간 서로 밀착되도록 조합하되, 약간의 공간을 두고 분리된 상태로 고정하였다.
상기 제1필터부는 기공 사이즈 10㎛, 두께 1000㎛, 무게 250gram/m2, 마이크론 등급(micron rating) 3㎛, 홀드-업-볼륨 50㎕의 필터 규격으로 제작되었으며, 천연섬유재질을 이용하여 혈구세포가 손상없이 분리되도록 하였다. 또한, 상기 제2필터부가 기공 사이즈 0.1㎛, 두께 300㎛, 무게 200gram/m2, 마이크론 등급 2㎛, 홀드-업-볼륨 5㎕의 필터 규격으로 제작하였다. 각 필터부의 직경은 13mm인 원형이고, 상기 제1필터부 상에 전혈 100㎕를 흡수시켰으며, 2분 경과 후 캐필러리 또는 팁의 끝부분을 사용하여 혈액이 통과했는지 확인하고, 각 필터부를 분해하여 앞, 뒤를 확인하였다.
도 3에 도시된 바와 같이, 제1필터부(Filter1)에 혈구세포가 분리되어 이후 제3필터부(Filter3) 및 제4필터부(Filter4)에 혈구세포가 통과되지 않고, 완전하게 혈장이 분리된 결과를 확인하였다.
<실시예 2> 다중필터 제작
상기 실시예 1에서 사용된 전혈의 양을 20㎕로 변경한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일하게 수행하여 다중필터를 제작하였다. 이때, 혈액량의 변경에 따라 다중필터에 사용하는 모든 필터들의 크기를 4mm로 축소 조절하였다.
상기 전혈의 투입량은 병원에서 주사기를 이용하여 혈관에서 채취하는 방식이 아닌 개인이 가정에서 혈당계를 이용하여 채취용 침으로 손가락 등에서 혈액을 채취하였을 경우 얻어지는 양으로 결정되었다.
그 결과, 도 4에 도시된 바와 같이, 제1필터부(Filter1)에서 혈구세포들을 분리하여 흡수하고 제3필터부(Filter3)를 통과하여 제4필터부(Filter4)에서 순수한 혈장 성분만이 통과해 분리되어 필터 변경도 가능함을 확인하였다.
<비교예 1> 압력을 가하는 방식의 다중필터 제작
1㎖ 주사기에 직경 13mm의 원모양으로 제작된 제1필터부(Filter1)를 주사기안에 삽입하였고, 제3필터부(Filter3)는 주사기 필터(syringe filter) 형태로 결합하고, 그 하방 위치에 제4필터부(Filter4)를 연결한 후, 전혈 100㎕을 주입하여 주사기의 피스톤을 이용하여 압력을 가하면서 필터를 통과시켜 분리하였다.
그 결과, 도 8에 도시된 바와 같이, 다층의 필터부를 모두 통과한 후 전체적으로 붉은 색을 확인하였다. 따라서, 상기 압력이 가해졌을 때 적혈구가 깨어지는 현상이 발생하였고 제1필터부에서 혈구세포를 분리가 제대로 이루어지지 않았다. 따라서, 압력을 가할 경우 시간을 단축시킬 수는 있지만 혈구세포의 파괴 등으로 인하여 혈액성분을 온전하게 분리할 수 없으므로, 다중필터 제작 시, 압력을 가하는 방법을 배제한다.
<비교예 2> 압력을 배제한 방식의 다중필터 제작
아크릴판 2장과 2개의 O-링을 결합하고 O-링 사이에 다중필터를 설치하고 밀착시키는 다중필터를 제작하였다. 상기 다중필터는 압력이 없는 상태에서도 액체가 모세관력에 의해 이동되도록 설계하였다. 상기 다중필터는 직경 13mm의 원모양으로 제작된 제1필터부(Filter1), 제3필터부(Filter3), 제4필터부(Filter4)가 순차 적층되었으며, 이때, 시료 주입구를 통해 100㎕의 전혈이 모세관력으로 이동된다. 혈액 100㎕을 주입하고 2분 후 다중필터를 분해하여 각 필터부의 상태를 확인하였다.
그 결과, 도 9에 제시된 바와 같이, 혈액을 통과시키는 과정에서 직접적인 압력을 가하지 않았지만 여전히 혈구세포가 제1필터부(Filter1)에 의해 완전히 분리되지 않고 제3필터부(Filter3) 및 제4필터부(Filter4)에도 부분적으로 이동되었음을 확인하였다.
<비교예 3> 다중필터 제작
상기 비교예 2에서 제작된 다중필터에서 필터자체의 용량을 동일하게 실시한 경우, O-링에 의해 발생되는 공간용량과 투여하는 전혈의 용량을 조절하여 다중필터의 혈액분리 실험을 수행하였다.
구체적으로 다중필터는 직경 13mm의 원모양으로 제작되고, O-링의 내부직경은 그보다 작은 10mm로 고정하고 두께를 1.5mm, 1 mm 및 0.6mm로 변경하였고, 이때, 전혈의 용량은 채취용 침으로 손가락 등에서 혈액을 채취하였을 경우 혈액의 양인 20㎕를 투여하였다. 투여하고 2분 경과 후 각 필터부를 분해하여 앞, 뒤를 확인하였다.
도 10에 그 결과를 도시하였는 바, 여전히 제1필터부(Filter1)를 통한 혈구세포 분리가 제대로 이루어지지 않았으며 다만, 혈액은 투입구 정중앙에 주입하였음에도 불구하고 제3필터부(Filter3) 및 제4필터부(Filter4)에는 O-ring과 접하는 위치에서 혈액이 관찰되었다.
따라서, 아크릴 앞, 뒤에 위치하는 O-링이 서로 맞물려 있는 부분의 압력에 의해 혈액이 필터와 O-링의 접합부위로 흡수되어 혈구세포는 분리하지 못하고 그대로 통과하게 되는 것으로 예상된다. 이에, 필터부와 O-링 사이의 압력으로 인한 필터부의 구조 변형으로 인한 결과를 확인하였다.
<실험예 1> 분리성능평가 1
상기 실시예 2에서 제작된 다중필터를 이용한 실험결과에서 제1필터부(Filter1)에 혈구세포가 확실하게 분리되었음을 확인하였다.
다음 단계로 제4필터부(Filter4)에 잔류하는 액상 시료에서, 혈장 단백질이 존재하는지 여부를 확인하기 위하여, 혈장 단백질들을 웨스턴 블랏 또는 도트 블랏 방법을 이용하여 확인하였다. 항원 항체 반응이 종료이후에 푸른색으로 발색하는 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB) 염료를 사용하여 색상 변화를 유도하여 육안으로 관찰하였다.
혈장 단백질 중에서 크기가 가장 큰 종류인 항체인 IgM를 검출할 수 있는 항체를 사용하여 제4필터부(Filter4)에 잔류한 혈액 성분과 반응시키고 블랏 검사법으로 확인하였다. 필터 성능을 테스트하기 위해 3가지의 시료를 사용하여 비교하였는데 혈액에서 원심분리법으로 분리한 ① 세럼(serum), ② 제1필터부(Filter1)를 바로 통과한 성분 및 ③ 제1필터부(Filter1)와 제3필터부(Filter3)를 통과해서 제4필터부(Filter4)에서 분리한 성분을 사용하였다.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이, 3가지 실험 조건에서 모두 IgM이 나타나는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 다중필터로 단백질의 선택적 분리가 가능함을 확인하였다.
<실험예 2> 분리성능평가 2
상기 실시예 2에서 제작된 다중필터를 이용한 실험결과에서 혈액이 다중필터를 통과하였을 때 제3필터부(Filter3)의 기공 사이즈에 따른 통과 가능한 단백질들의 변화를 확인하고자 실험하였다.
실험에 사용한 제3필터부(Filter3)의 기공 사이즈는 0.003㎛, 0.005㎛, 0.01㎛, 0.03㎛ 크기별로 실험을 수행하였다. 상기 제3필터부(Filter3)를 통과한 이후 제4필터부(Filter4)에 잔류한 단백질과 통과하지 못한 각각의 단백질들을 함께 확인하기 위해서 SDS-Page 젤에 전기영동하여 쿠마시 블루 염색 방법을 사용하였다.
혈액의 단백질들이 제3필터부(Filter3)를 통과하였는지 통과하지 못하고 잔류해 남아 있는지를 비교하여 확인하기 위하여 전기영동 실험을 실시하였다.
1번: 제1필터부(Filter1)만을 통과한 단백질
2번: 0.003㎛의 제3필터부(Filter3)를 통과하지 못하고 잔류한 단백질
3번: 0.003㎛의 제3필터부(Filter3)를 통과하고 제4필터부(Filter4)에 잔류한 단백질
4번: 0.005㎛의 제3필터부(Filter3)를 통과하지 못하고 잔류한 단백질
5번: 0.005㎛의 제3필터부(Filter3)를 통과하고 제4필터부(Filter4)에 잔류한 단백질
6번: 0.01㎛의 제3필터부(Filter3)를 통과하지 못하고 잔류한 단백질
7번: 0.01㎛의 제3필터부(Filter3)를 통과하고 제4필터부(Filter4)에 잔류한 단백질
8번: 0.03㎛의 제3필터부(Filter3)를 통과하지 못하고 잔류한 단백질
9번: 0.03㎛의 제3필터부(Filter3)를 통과하고 제4필터부(Filter4)에 잔류한 단백질
그 결과, 도 6에 도시된 바와 같이, 제3필터부(Filter3)의 기공 사이즈가 0.003㎛, 0.005㎛ 및 0.01㎛에서는 혈액 단백질들이 제3필터부(Filter3)를 통과하지 못하고 제3필터부(Filter3)에 거의 대부분 잔류한 것을 알 수 있었다.
반면에, 제3필터부(Filter3)의 기공 사이즈가 0.03㎛일 경우에는 단백질의 일부가 통과하여 제4필터부(Filter4)로 넘어오는 것으로 확인하였다. 따라서 제3필터부(Filter3)를 이용하여 분리할 경우에 기공 사이즈를 0.03㎛ 내외로 조절하면 크기에 따른 분리범위 조절이 가능하다.
<실험예 3> 분리성능평가 3
상기 실시예 2에서 제작된 다중필터를 이용한 실험결과에서 제1필터부가 혈구세포를 확실하게 분리하였음을 확인하였다. 이어서, 제1필터부(Filter1) 및 제3필터부(Filter3)를 통과하여, 제4필터부(Filter4)에 핵산 잔류여부를 확인하기 위하여, 제4필터부(Filter4)에 잔류한 핵산에서 DNA를 추출하여 사람의 GAPDH 프라이머로 PCR을 진행하여 유전자의 발현을 확인하였다.
도 7에서 ①, ②번은 제4필터부(Filter4)의 결과이며, ③번은 제2필터부(Filter2) 및 ④번은 및 제3필터부(Filter3)에서 각각 유전자를 추출하여 PCR을 통해 유전자 발현을 확인하였다.
그 결과, 제4필터부(Filter4)에서는 사람의 GAPDH 프라이머로 PCR을 확인하였을 때 밴드를 확인하여 핵산이 통과하여 분리되었음을 확인하였고, 제2필터부(Filter2) 및 제3필터부(Filter3)에서는 밴드가 확인되지 않으므로, 핵산이 모두 통과하여 잔류하지 않음을 확인하였다.
이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims (7)

  1. 전혈 시료로부터 혈구세포를 분리하는 제1필터부,
    혈소판 또는 엑소좀을 포함하는 세포 조각을 분리하는 제2필터부 및
    단백질을 분리하는 제3필터부를 포함하되,
    상기 전혈 시료가 기공 사이즈별로 구배된 각 필터부를 통과하여 혈액성분별로 분리되는 다중필터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제3필터부가 단백질의 크기별 추가 필터부가 더 포함되는 것을 특징으로 하는 다중필터.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제3필터부를 통과하는 소형단백질이나 핵산성분의 분리를 위한 제4필터부가 더 포함되는 것을 특징으로 하는 다중필터.
  4. 제1항에 있어서, 상기 각 필터부가 순차 조합되고, 필터링 이후 조합된 필터부가 분해되어 각 성분별로 진단하는 것을 특징으로 하는 다중필터.
  5. 제1항에 있어서, 상기 다중필터가 각 필터부간 밀착 조합되되, 필터부간 공간이 이격된 구조인 것을 특징으로 하는 다중필터.
  6. 제1항에 있어서, 상기 전혈 시료가 20 내지 100㎕가 투입된 것을 특징으로 하는 다중필터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 다중필터를 이용하여, 혈중 P-셀렉틴 측정을 통한 질병 진단키트.
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