KR20210058724A - 면역 질환 치료제로서의 smile의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 SMILE 과발현에 따른 면역질환의 예방 및 치료 효과에 관한 것으로, 본 발명에 따른 SMILE을 과발현하는 벡터는 염증 반응을 감소시키며, 이와 관련된 관절염 및 염증성 대장 질환을 완화시키는 효과가 있고, SMILE의 발현을 향상시키는 작용제인 커큐민 및 메트포민 또한 면역을 향상시키고 류마티스 관절염을 완화시키는 효과가 있으므로, 이들을 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 SMILE 과발현에 따른 면역질환의 예방 및 치료 효과에 관한 것이다.
면역체계는 크게 선천성 면역(innate immunity)과 후천성 면역(acquired immunity)으로 나눌 수 있다. 후천성 면역은 척추동물에만 존재하는 면역체계로 여러 세포들이 네트워크처럼 얽혀 있으며, 항원제시세포, B세포, T세포 등이 관여한다. 효과기 세포(Effector cell)로는 B세포, T세포가 있는데, B세포는 항체를 분비하는 체액성면역(humoral immunity)에 관여하고, T세포는 주로 세포성면역(cellular immunity)을 담당하여 세포독성 T세포(cytotoxic T cell)와 조력 T세포(helper T cell)로 분류된다. 면역계는 정상상태에서는 자가항원에 대한 특이적 면역반응을 제어하고 있으며, 외부항원에 대한 면역반응도 억제하고 있는 경우가 있는데, 예컨대 임산부의 태아에 대한 반응 및 만성감염상태에 있는 미생물에 대한 면역반응을 들 수 있다. 이러한 현상들은 항원 특이적 면역관용이 유도될 수 있는 기전으로 클론 제거(clonal deletion), 클론 무반응(anergy) 및 면역 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)에 의한 능동적 통제에 의해 유도되는 것으로 알려져 있다. 이식항원에 대한 면역관용이 우연히 획득된 일부 환자나 실험적으로 면역관용을 유도한 동물모델을 조사해 보면 위의 세 가지 기전 모두 이식면역관용에 관여한다는 사실이 확인되고 있고, 특히 최근에는 면역조절 T림프구가 이식면역반응 뿐만 아니라 자가면역, 종양면역, 감염면역반응 등 생체의 거의 모든 면역반응을 통제하는데 관여하는 중요한 세포로 주목받고 있다.
각종 병원체에 대한 생체 방어 시스템으로 면역계에서 중심적 역할을 담당하는 세포군의 하나로 T 세포가 있다. T 세포는 인체의 흉선에서 생성되며 일련의 분화 과정을 거치면서 고유의 특성을 지닌 T 세포로 분화하게 되는데, 분화를 완료한 T 세포는 그 기능에 따라 크게 1형 보조 세포(Th1)와 2형 보조 세포(Th2)로 구분된다. 이 중에서 Th1 세포의 주된 기능은 세포 매개성 면역에 관여하고, Th2 세포는 체액성 면역에 관여하며, 면역계에서 이러한 두 세포 집단은 서로 과 활성화되지 않도록 서로 견제를 통해 면역계의 균형을 유지하고 있다. 따라서 면역질환의 대부분은 이러한 두 가지 면역 세포간의 불균형에 기인하는 것으로 볼 수 있는데, 예를 들어 Th1 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 자가면역질환이 발생할 수 있고, Th2 세포의 활성이 비정상적으로 증가하는 경우 과민반응에 의한 면역질환이 발생하는 것으로 알려져 있다.
세포독성 T세포는 감염된 세포를 직접 죽임으로써 숙주를 보호하고, 여러 종류의 세포들을 움직이게 하고 조절하여 숙주 방어에 참여하고, 조력 T세포는 다른 임파구, 선천성 면역에 관여하는 세포 및 비면역세포인 상피세포에도 작용하여 숙주를 방어한다. 후천성 면역의 중요한 개념 중의 하나가 다양성이다. 각각의 T세포는 항원에 특이한 항원수용체 (T cell receptor, TCR)를 가지고 있어 다양한 병원균에 특이적으로 반응한다. 조력 T세포가 분화하기 위해서는 항원제공세포인 수지상 세포(dendritic cell)가 병원균을 찾아 임파선으로 이동하여 병원균을 만나야 한다. 수지상 세포가 항원을 제시하면 분화되지 않은 조력 T세포(naive T cell)는 수차례 분할하여 병원체에 대응할 정도의 충분한 수가 된다. 병원균 자체도 다양한 생활 방식과 면역 회피 기전을 가지고 있기 때문에 수지상 세포는 여러 기전으로 T세포에게 병원균의 양상과 위치에 관하여 정보를 제공하여, 병원체가 세포 내에 있는지 세포 외에 있는지 또는 박테리아인지 바이러스인지 아니면 진핵생물인지, 어떤 조직에 침범하고 있는지 등에 관해 알 수 있게 한다. 따라서 병원체에 특이한 T세포는 제거하고자 하는 병원균의 생활 주기에 맞추어 유전자의 발현을 하며 분비되는 사이토카인의 종류에 따라 어떤 조력 T세포를 더 많이 생성할지 또 어떤 세포들을 동원(recruitment)할지 결정한다. 조력 T세포의 분화에 가장 중요한 신호(signal)는 사이토카인이다. T 세포 분화에서 사이토카인은 Th1 또는 Th2 세포로의 분화에 필수적인 전사인자뿐만 아니라 성장인자(growth factor)를 유도 또는 억제하며, 분화된 조력 T세포 자체에서도 분비되어 다른 면역세포의 성장 및 분화를 일으키는 매개체 역할도 한다. Th1 세포에 의해 분비되는 대표적인 사이토카인이 인터페론-γ(interferon-γ)이고, Th2 세포에 의해 분비되는 대표적인 사이토카인은 IL-4, IL-5, IL-13이다. IL-17은 최근에 발견된 조력 T세포의 일종인 Th17세포의 대표적 사이토카인이다. 각각의 조력 T세포에 의해 분비되는 사이토카인은 해당 조력세포의 분화를 촉진하며 또 다른 조력 T세포의 분화를 억제한다.
한편, Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, 최근 그 존재가 밝혀진 Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg), 즉, 면역조절 T 림프구(Treg)는 크게 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포로 나눌 수 있으며, 자연성 Treg인 CD4+ CD25+ T 세포는 이 세포가 흉선에서 새로이 만들어질 때부터 면역억제기능을 부여받게 되며, 정상개체의 말초 CD4+ T 림프구 중 5 ~ 10%의 빈도로 존재한다. 아직까지 이 세포의 면역억제 기전은 정확히 파악되지 못하고 있지만, Foxp3라는 유전자의 발현 제어인자가 이 세포의 분화와 활성에 중요한 역할을 수행한다는 사실이 최근에 밝혀졌다. 또한, 말초 자연성 T 세포는 특정 환경하에서 자가 또는 외부항원의 자극을 받으면 면역억제효과를 나타내는 세포로 분화될 수 있는데, 이를 적응성(adaptive) 또는 유도성(inducible) Treg로 부르며, IL-10을 분비하는 Tr1, TGF-β를 분비하는 Th3 및 CD8 Ts등이 여기에 해당한다. Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료하고자 하는 연구들이 많이 진행되고 있다. 또한, Treg 세포 이 외에 T 세포의 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만, Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다. Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다.
현재 사용되고 있는 면역질환치료제로는 T 세포에서의 신호변환 경로를 차단하는 면역 억제제가 가장 많이 사용되고 있는데, 이러한 면역억제제들은 독성, 감염, 임파종, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용이 발생하는 문제점이 있다. 또한, T 세포의 활성화를 억제하는 방법을 통해 면역질환을 치료하는 방법 이외에도 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인의 양을 조절하는 치료법 및 면역 세포로부터 분비되는 사이토카인을 표적으로 하는 항체를 이용한 치료법이 개발 중에 있다. 그러나 이러한 방법은 실제적으로 임상실험을 거쳐 환자들에게 적용하기까지 많은 시간이 소요되어야 하고, 항체를 이용하는 방법은 항체 제작 과정에서 너무 많은 비용이 든다는 문제점이 있다.
따라서 부작용이 없고 저렴하면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제 및 치료방법의 개발이 시급하다.
본 발명의 목적은 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SMILE 작용제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 및 치료에 있어서, 형질 B 세포 및 B17 세포를 감소시키고, Treg 세포를 증가시키기 위한 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, SMILE의 발현이 감소된 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 SMILE 작용제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 및 치료에 있어서, 형질 B 세포 및 B17 세포를 감소시키고, Treg 세포를 증가시키기 위한 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, SMILE의 발현이 감소된 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 SMILE을 과발현하는 벡터는 염증 반응을 감소시키며, 이와 관련된 관절염 및 염증성 대장 질환을 완화시키는 효과가 있고, SMILE의 발현을 향상시키는 작용제인 커큐민 및 메트포민 또한 면역을 향상시키고 류마티스 관절염 및 염증성 대장 질환을 완화시키는 효과가 있으므로, 이들을 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물 또는 면역 억제제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 SMILE 과발현 벡터맵 및 이의 SMILE 과발현 검증 데이터를 나타낸 도이다.
도 2는 SMILE 벡터 주입에 따른 CIA 모델에서의 관절염 치료 효과를 확인한 도이다.
도 3은 SMILE 과발현에 의한 관절염 완화 효과를 확인한 도이다.
도 4는 SMILE 과발현에 의한 관절염 완화 효과를 확인한 도이다.
도 5는 SMILE 벡터 주입에 따른 CIA 모델에서의 연골 보호 효과를 확인한 도이다.
도 6은 SMILE 벡터 주입에 의한 SMILE 발현 증가를 확인한 도이다.
도 7은 SMILE 벡터 주입에 의한 BAFF 수용체 감소 효과를 확인한 도이다.
도 8은 SMILE 벡터 주입에 의한 비장세포에서의 Breg 및 MZB 세포 증가 및 FOB(Follicular B) 세포 감소 효과를 확인한 도이다.
도 9는 SMILE 과발현에 의한 Treg 및 Breg 증가를 확인한 도이다.
도 10은 SMILE 과발현에 의한 IBD 질환 완화 효과를 확인한 도이다.
도 11은 SMILE 과발현에 의한 IBD에서의 장 길이 보호 효과를 확인한 도이다.
도 12는 SMILE 벡터 주입에 의한 염증성 장질환 조직에서 SMILE 발현 증가를 확인한 도이다.
도 13은 SMILE 과발현에 의한 IBD 질환에서의 염증 반응 억제 및 Th17/Treg 조절 효과를 확인한 도이다.
도 14는 SMILE 벡터 주입에 의한 비장세포에서의 Breg 조절 효과를 확인한 도이다.
도 15는 SMILE 벡터 주입에 의한 염증성 장질환 조직에서 장 보호 효과 및 염증성 신호전달 억제 효과를 확인한 도이다.
도 16은 SMILE 벡터 주입에 의한 염증성 장질환 조직에서의 염증 마커 및 섬유화 마커의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 17은 SMILE Tg (과발현) 마우스에서 SMILE의 과발현 및 염증성 장질환 치료 효과를 확인한 도이다.
도 18은 SMILE Tg (과발현) 마우스에서 염증성 장질환 유도 후 장 길이 보호 효과를 확인한 도이다.
도 19는 SMILE Tg (과발현) 마우스에서 염증성 장질환 유도 후 면역세포 조절 효과를 확인한 도이다.
도 20은 SMILE Tg (과발현) 마우스에서 염증성 장질환 유도 후 장 조직에서의 장 보호 효과 및 염증성 신호전달 억제 효과를 확인한 도이다.
도 21은 SMILE의 작용제(agonist)인 커큐민의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 22는 SMILE의 작용제인 커큐민의 SMILE 발현 촉진 효과를 확인한 도이다.
도 23은 SMILE의 억제제인 컴파운드 C가 커큐민에 의한 효과를 상쇄하는 것을 확인한 도이다.
도 24는 정상 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 Plasma B 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 25는 정상 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 배중심 B 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 26은 정상 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 B17 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 27은 정상 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 BAFF-R 발현 제어 효과를 확인한 도이다.
도 28은 류마티스 관절염 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 Plasma B 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 29는 류마티스 관절염 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 배중심 B 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 30은 류마티스 관절염 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 B17 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 31은 류마티스 관절염 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 BAFF-R 발현 제어 효과를 확인한 도이다.
도 32는 정상 마우스 (위) 및 류마티스 관절염 마우스 (아래)의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 B10 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 33은 SMILE의 작용제인 메트포민 처리에 의한 Pstat3 억제 및 SMILE 발현 증가를 확인한 도이다.
도 34는 SMILE의 작용제인 메트포민 처리에 의한 IBD 치료 효과를 확인한 도이다.
도 35는 SMILE의 작용제인 메트포민 처리에 의한 장 보호 효과 및 염증성 신호전달 억제 효과를 확인한 도이다.
도 36은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)환자의 질환의 활성도에 따른 Mayo score 분석 후 각 조직의 면역화학조직염색법으로 mTOR, AMPKa, SMILE의 발현을 확인한 도이다.
도 37은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 환자에서 Mayo score가 높은 환자와 낮은 환자의 말초단핵구 에서의 SMILE 및 Foxp3의 mRNA 수준의 발현 정도를 비교한 도이다.
도 38은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 환자의 말초단핵구 세포에 메트포민을 처리(48시간)하여 SMILE, Prkaa(protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2), Foxp3의 발현을 real time PCR로 분석한 도이다.
도 39는 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 환자의 말초단핵구 세포에 메트포민을 처리(72시간)하여, Th17 세포와 Treg 세포의 발현을 유세포 분석을 통해 분석한 도이다.
도 2는 SMILE 벡터 주입에 따른 CIA 모델에서의 관절염 치료 효과를 확인한 도이다.
도 3은 SMILE 과발현에 의한 관절염 완화 효과를 확인한 도이다.
도 4는 SMILE 과발현에 의한 관절염 완화 효과를 확인한 도이다.
도 5는 SMILE 벡터 주입에 따른 CIA 모델에서의 연골 보호 효과를 확인한 도이다.
도 6은 SMILE 벡터 주입에 의한 SMILE 발현 증가를 확인한 도이다.
도 7은 SMILE 벡터 주입에 의한 BAFF 수용체 감소 효과를 확인한 도이다.
도 8은 SMILE 벡터 주입에 의한 비장세포에서의 Breg 및 MZB 세포 증가 및 FOB(Follicular B) 세포 감소 효과를 확인한 도이다.
도 9는 SMILE 과발현에 의한 Treg 및 Breg 증가를 확인한 도이다.
도 10은 SMILE 과발현에 의한 IBD 질환 완화 효과를 확인한 도이다.
도 11은 SMILE 과발현에 의한 IBD에서의 장 길이 보호 효과를 확인한 도이다.
도 12는 SMILE 벡터 주입에 의한 염증성 장질환 조직에서 SMILE 발현 증가를 확인한 도이다.
도 13은 SMILE 과발현에 의한 IBD 질환에서의 염증 반응 억제 및 Th17/Treg 조절 효과를 확인한 도이다.
도 14는 SMILE 벡터 주입에 의한 비장세포에서의 Breg 조절 효과를 확인한 도이다.
도 15는 SMILE 벡터 주입에 의한 염증성 장질환 조직에서 장 보호 효과 및 염증성 신호전달 억제 효과를 확인한 도이다.
도 16은 SMILE 벡터 주입에 의한 염증성 장질환 조직에서의 염증 마커 및 섬유화 마커의 발현 변화를 확인한 도이다.
도 17은 SMILE Tg (과발현) 마우스에서 SMILE의 과발현 및 염증성 장질환 치료 효과를 확인한 도이다.
도 18은 SMILE Tg (과발현) 마우스에서 염증성 장질환 유도 후 장 길이 보호 효과를 확인한 도이다.
도 19는 SMILE Tg (과발현) 마우스에서 염증성 장질환 유도 후 면역세포 조절 효과를 확인한 도이다.
도 20은 SMILE Tg (과발현) 마우스에서 염증성 장질환 유도 후 장 조직에서의 장 보호 효과 및 염증성 신호전달 억제 효과를 확인한 도이다.
도 21은 SMILE의 작용제(agonist)인 커큐민의 세포 독성을 확인한 도이다.
도 22는 SMILE의 작용제인 커큐민의 SMILE 발현 촉진 효과를 확인한 도이다.
도 23은 SMILE의 억제제인 컴파운드 C가 커큐민에 의한 효과를 상쇄하는 것을 확인한 도이다.
도 24는 정상 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 Plasma B 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 25는 정상 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 배중심 B 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 26은 정상 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 B17 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 27은 정상 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 BAFF-R 발현 제어 효과를 확인한 도이다.
도 28은 류마티스 관절염 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 Plasma B 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 29는 류마티스 관절염 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 배중심 B 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 30은 류마티스 관절염 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 B17 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 31은 류마티스 관절염 마우스의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 BAFF-R 발현 제어 효과를 확인한 도이다.
도 32는 정상 마우스 (위) 및 류마티스 관절염 마우스 (아래)의 B 세포에서 SMILE의 작용제인 커큐민에 의한 B10 세포 발달 제어 효과를 확인한 도이다.
도 33은 SMILE의 작용제인 메트포민 처리에 의한 Pstat3 억제 및 SMILE 발현 증가를 확인한 도이다.
도 34는 SMILE의 작용제인 메트포민 처리에 의한 IBD 치료 효과를 확인한 도이다.
도 35는 SMILE의 작용제인 메트포민 처리에 의한 장 보호 효과 및 염증성 신호전달 억제 효과를 확인한 도이다.
도 36은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC)환자의 질환의 활성도에 따른 Mayo score 분석 후 각 조직의 면역화학조직염색법으로 mTOR, AMPKa, SMILE의 발현을 확인한 도이다.
도 37은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 환자에서 Mayo score가 높은 환자와 낮은 환자의 말초단핵구 에서의 SMILE 및 Foxp3의 mRNA 수준의 발현 정도를 비교한 도이다.
도 38은 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 환자의 말초단핵구 세포에 메트포민을 처리(48시간)하여 SMILE, Prkaa(protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2), Foxp3의 발현을 real time PCR로 분석한 도이다.
도 39는 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 환자의 말초단핵구 세포에 메트포민을 처리(72시간)하여, Th17 세포와 Treg 세포의 발현을 유세포 분석을 통해 분석한 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
일 측면에서, 본 발명은 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, SMILE은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다.
일 구현예에서, 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부 질환으로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있으며, 골관절염, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염, 염증성 대장 질환 및 비만 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있고, 류마티스 관절염 또는 염증성 대장 질환인 것이 더욱 바람직하다.
일 구현예에서, 면역질환은 IFNγ, IL-4 및 IL-17에 의하여 매개되며; B 세포 활성화인자 수용체(B-cell activating factor receptor, BAFF-R) 양성 B 세포의 발현이 증가되고; 배중심(Germinal center) B 세포의 발달이 증가되며; 형질 B 세포 및 B17 세포가 활성화되고; 및 Treg 세포수가 감소된 질환일 수 있다.
일 구현예에서, SMILE 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 체액성 면역조절 세포의 분화를 촉진할 수 있다.
일 구현예에서, SMILE 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 면역질환의 예방 및 치료용 조성물은 SMILE 작용제를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 SMILE 작용제는 커큐민 또는 메트포민일 수 있다.
Foxp3는 흉선(thymus)으로부터 유래하는 면역조절 T 세포(Regulatory T cell)에 주로 존재하고, CD4+ CD25+ 표지 항원을 가진 세포에 존재하는 전사 조절 인자 (transcriptional factor)로서, 그 기능은 Foxp3를 발현하는 T 세포에 대한 항원 인지시 항원에 대해 저반응성을 가짐과 동시에 흉선으로부터 분화되어 나온 Foxp3를 발현하지 않는 CD4+ CD25- T 세포 중 잠재적으로 자가 면역증을 유발할 수 있는 T 세포들에 대하여 IL-2의 생성과 세포분열 현상을 억제하는 억제자 T 세포 (suppressor T cell)로서의 역할을 가지고 있다. 또한, Foxp3는 Foxp3를 발현하는 조절 T 세포 및 이와 세포-세포간 접촉(cell-cell contact)을 통해 CD25- T 세포에 대하여서는 IL-2 뿐만이 아니라 전사인자인 NFAT의 영향을 받는 IL-4, IFN-감마 등의 전사 조절을 억제하는 기능을 하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서 상기와 같은 작용을 하는 Foxp3를 발현하고 있는 T 세포의 경우, 면역반응을 억제 또는 조절하는 작용을 통해 면역질환을 치료하는데 응용되고 있고, 또한, 인간에 존재하는 Foxp3를 발현하는 CD4 T 세포의 자가 항원 특이적인 T 세포(self-antigen specific T cell clone)를 고농도의 IL-2 사이토카인 처리 및 항-CD3, 항-CD28 항체와의 조합처리를 통해서 그 수를 증가시켜 세포 치료방법으로 응용하고자 하는 시도들이 있어왔다. 따라서 Foxp3의 발현 확인은 Treg 세포의 활성 또는 증폭을 측정할 수 있는 지표가 된다.
일 구현예에서, SMILE 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 조절 B 세포 (Regulatory B Cell, Breg)의 수를 증가시킬 수 있다.
B 세포는 주로 자가항체의 분비 기능을 가지고 있기 때문에 자가면역 질환과 관련하여 병인세포로 인식되어 왔으나, 최근 마우스에서 면역 반응을 억제하는 B 세포의 발견과 이들 B 세포를 제거하였을 때 자가면역 반응이 악화되는 것이 확인되었으며, 이들 B 세포에는 CD19+CD1d+CD5+ B 세포 또는 가장자리 구역 B 세포(marginal zone B cell) 등이 있는 것으로 보고되고 있다.
본 발명에서 상기 “활성(activation)”이란 생체 내에서 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg), 즉, 자연성(natural) Treg 와 적응성(adaptive) Treg 세포를 모두 포함하는 Treg 세포가 가지는 모든 기작이 촉진 또는 증진되는 것을 말하며, 생체 내의 면역반응이 정상상태를 유지하도록 면역조절작용, 예컨대 면역억제반응이 촉진 또는 증진되는 것을 말한다.
또한, 상기 “증폭(expansion)”이란 미분화 T 세포가 조절 T 세포로 분화 및 증식되는 것을 말하는 것으로서, '분화(differentiation)'는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말하며, '증식(proliferation)' 은 세포가 분열되어 동질의 것이 불어나는 것으로서 보통 다세포생물의 체내에서 세포수가 증가되어 가는 것을 말한다.
본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 염증성질환; 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부(transplantation rejection)질환 등을 모두 포함할 수 있다.
또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 "자가면역질환"이라고 한다.
또한, "염증성 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증 유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치료"는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나의 여부를 포함한다.
또한, "치료"는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 "완화(Palliating)"하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
상기 치료란, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미하며, 본원에서 사용된 상기 치료란 용어는 치료하는이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다. 따라서 포유동물에 있어서 면역질환의 치료 또는 치료요법은 하기의 하나 이상을 포함할 수 있다:
(1) 면역질환의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,
(2) 면역질환의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,
(3) 면역질환을 경감시킴.
(4) 면역질환의 재발을 예방함, 및
(5) 면역질환의 증상을 완화함(palliating).
만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
본 명세서에서 사용되는 "유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 촉진제의 유효량은 관련 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다.
일 측면에서, 본 발명은 SMILE 또는 이의 단편, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 또는 상기 벡터를 포함하는 세포를 유효 성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "벡터"는 숙주 세포에 삽입되어 숙주 세포 게놈과 재조합되고 이에 삽입되거나, 또는 에피좀으로서 자발적으로 복제하는 컴피턴트 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산을 의미한다. 이러한 벡터로는 선형 핵산, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, RNA 벡터, 바이러스 벡터 등이 있다.
본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여에 의해 면역질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.
본 발명의 약학조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 약학 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 조성물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 단백질을 0.0001 내지 10 중량 %로, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량 %를 포함한다.
본 발명의 약학조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다.
일 측면에서, 본 발명은 SMILE 작용제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
일 구현예에서, SMILE 작용제는 커큐민 또는 메트포민일 수 있으며, 커큐민 또는 메트포민은 SMILE의 발현을 증가시킬 수 있다.
일 구현예에서, SMILE 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 SMILE 작용제인 커큐민 또는 메트포민을 병용 투여될 수 있으며, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 SMILE 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 면역 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
일 측면에서, 본 발명은 SMILE 작용제인 커큐민 또는 메트포민을 포함하는 면역 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 관절염 또는 골다공증 치료제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 추출물 또는 이의 분획물을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 조성물을 하나 이상의 단위 투여 형태로 포함하는 키트에 관한 것이다.
일 구현예에서, 본 발명에서 기술되는 투여 형태는 투여 형태의 사용에 대한 설명서와 함께 블리스터 팩으로서 또는 병에 포장될 수 있다. 예를 들어, 설명서는 패키지 삽입물로서 제공되거나 블리스터 팩, 병에 부착된 표지물 상 또는 블리스터 팩 또는 병이 사람 피험자에게 제공되었던 이차적인 포장재 상에 직접적으로 제공될 수 있다. 설명서는, 예를 들어, 투약 횟수, 음식과 함께 또는 음식 없이 투여되는 투여 형태의 투여, 투여 형태를 구성하는 활성 성분 및 투여 형태의 투여로부터 이익을 얻는 심혈관 병태 또는 장애를 포함할 수 있다.
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. SMILE 과발현 벡터 제작
pcDNA3 벡터의 EcoRⅠ 및 XhoⅠ 제한효소 위치에 SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 유전자 (서열번호 1)를 클로닝하여 SMILE을 과발현하는 벡터를 제작하였다 (도 1). 상기 벡터를 HSK293 세포에 트랜스펙션한 뒤 제작한 벡터가 SMILE 과발현하는지를 웨스턴 블롯 분석으로 확인한 결과, SMILE의 과발현이 확인되었다 (도 1).
실시예 2. 자가면역 관절염 동물 모델에서의 SMILE 과발현에 의한 관절염 질환 완화 효과 확인
2-1. 류마티스 관절염 동물 모델 제작
류마티스 관절염 마우스 모델을 제조하기 위해, 7주생 수컷 DBA1/J 정상 마우스(평균 체중: 20g)군에 타입 II 콜라겐 100 μg을 CFA(Complete Freud's adjuvant)와 혼합하여 꼬리 표피에 주입(first immunization)하였고, 이로부터 2주뒤 동일한 타입 II 콜라겐을 동량의 IFA(incomplete Freud's adjuvant)와 혼합한 후 꼬리에 주입하여 류마티스 관절염 동물모델을 제작하였다.
2-2. SMILE 과발현에 의한 류마티스 관절염 동물 모델의 관절 및 연골 보호 효과 확인
SMILE 과발현에 따른 in vivo 영향을 평가하고자 정상 DBA1/J 마우스에 관절염을 유도하고 상기 실시예 1의 DNA 벡터를 주입하여 관절염 억제 효력을 평가하였다. 대조군으로 mock 벡터를 주입하였다. E. coli로 배양한 벡터를 prep하여 사용하였으며 endotoxin에 대한 효과를 없애기 위하여 endotoxin-free kit을 사용하였다. 구체적으로, 마우스에게 관절염을 유도하고 1주일 후부터 실험이 종료되는 시점까지 주 1회, 회당 100 ㎍의 벡터를 주입하였다. 첫 번째 벡터 주입은 마우스 꼬리의 정맥투여 (IV:intravenous)로 벡터 100 ㎍을 투여하였으며, 두 번째 벡터 주입은 마우스 뒷다리 (오른쪽)의 근육 부위의 털을 제거한 후 인슐린 주사기로 벡터 100 ㎍을 근육투여 (IM:intramuscular)한 뒤 전기천공기(electroporator)로 트랜스퍼(transfer)하였다. 세 번째 벡터 주입은 두 번째 벡터 주입방법과 동일하며 전 주에 벡터가 주입된 마우스 뒷다리 오른쪽의 반대쪽 다리에 주입하였다. 첫 번째부터 세 번째 벡터 주입 방법까지 1세트로 3주간 실험이 진행되며 동물실험이 종료되기 전까지 위의 방법을 반복하였다.
실험 종료 후 DBA1/J 마우스의 염증 점수는 다음과 같은 기준으로 산정하였다.
0점
뒷발 : 홍반이 없으며 육안적으로 정상마우스 발과 차이가 없을 때 외관을 봐도 뼈의 모양이 깨끗하게 정상적으로 확인됨.
앞발 : 홍반이 없고, 정상 마우스 발과 차이가 없음
1점
뒷발 : 발가락 하나가 부었을 때 / 혹은 발바닥에 붓기 없이 확연한 홍반이 있을 경우/혹은 발등이나 발바닥 혹은 발뒤꿈치가 경미하게 부었을 경우.
앞발 : 발가락 하나가 부었을 때 / 혹은 발바닥에 붓기 없이 확연한 홍반이 있을 경우.
2점
뒷발 : (홍반동반) 발가락 두 개가 부었을 때 / 발가락 1~2개가 부었거나 발등이나 발바닥 혹은 발뒤꿈치가 살짝 둥글게 부었을 경우.
앞발 : (홍반동반) 발가락이 두 개가 부었을 때 / 발가락 1~2개가 부었거나 발목이 부었을 경우.
3점
뒷발 : (홍반동반) 발가락이 1~4개가 부었거나 발등이나 발바닥 혹은 발뒤꿈치가 전체적으로 부었을 때 / 종골의 모양이 거의 드러나지 않고 발등 발바닥 발뒤꿈치 발목까지 모두 부어서 염증성 부종으로 살짝 통통해 보임.
앞발 : (홍반동반) 발가락이 1~4개가 부었거나 발목부위에 염증성 조직의 증가로 발목이 두꺼워져 있음.
4점
뒷발 : 홍반이 거의 발전체 / 발가락 3개 이상 부었고 발이 전체적으로 부었고 홍반과 부종이 굉장히 심해지고 전체적으로 통통해짐.
앞발 : 홍반이 거의 발전체 / 발가락이 3개 이상 부었고 발목과 발이 전체적으로 부어서 움직임이 부자연스러워짐.
Incidence 평가는 마우스의 한발이 부었을 경우 25%로 네발이 모두 부었을 경우 100%로 평가하였다. 한 군당 최소 5마리의 마우스를 평가하여 평균을 냈다. 그 결과, 대조군에 비해 관절염 억제 효과가 우수하고 관절염 발병율 또한 감소되었음을 확인할 수 있었다 (도 2).
또한, SMILE 과발현 벡터 처리에 따른 연골 보호 효과를 조직학적으로 분석하기 위하여, 마우스의 대퇴골(Femur) 및 경골(Tibia)을 채취한 후 분리한 관절을 10% 포르말린에 고정시키고 뼈에서 석회질을 제거한 뒤 파라핀으로 블럭을 제조하였고 이로부터 관절 절편 (7um)를 얻어 헤마톡실린 (Hematoxylin)과 에오신 (Eosin) (H&E)으로 관절절편을 염색하였으며, 연골의 파괴 정도를 알 수 있는 염색법인 사프라닌 O(Safranin O) 염색을 수행하여 연골의 형태를 관찰하고, 연골(cartilage) 손상 및 골 손상을 점수화하였다.
그 결과, SMILE의 과발현으로 인해, 관절 및 연골 파괴가 현저히 억제되는 것을 확인할 수 있었다 (도 3 내지 5).
2-3. SMILE 과발현 벡터 주입에 의한 류마티스 관절염 동물 모델에서의 SMILE 발현 증가 및 BAFF 수용체 감소 확인
SMILE 벡터 주입 후 CIA 모델에서 SMILE이 과발현되는지 확인하기 위해 면역조직화학 염색을 수행한 결과, SMILE 벡터 주입에 의해 CIA 모델에서 SMILE 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 6). 또한, 정상 마우스 및 CIA(류마티스 관절염) 유도 마우스의 각각의 비장세포에 LPS 100ng/ml로 처리하여 B 세포를 활성화시킨 뒤, SMILE 벡터를 주입하고 4일 뒤 B 세포 활성화인자 수용체(B-cell activating factor receptor, BAFF-R) 양성 B 세포의 %를 조직화학 염색으로 확인한 결과, SMILE 벡터 주입에 의해 BAFF-R (BAFF-R의 발현이 있는 세포에서 궁극적으로 pathogen한 plasma B 세포로의 development가 가능함)가 감소하는 것으로 나타나 (도 7), B 세포의 plasma B 세포로의 분화 발달 단계가 제어 가능함을 확인할 수 있다. 아울러, 실험 종료 시점의 마우스를 희생하여 비장세포를 얻어 유세포 분석을 수행한 결과, CD5+CD1dHigh B reg가 증가하고, Marginal zone B 세포가 증가 (IL-10을 분비하는 Breg의 기능이 보고됨)하였으며, 항체 분비세포인 소포성 B 세포(Follicular B cell)가 감소하는 것으로 나타났다 (도 8).
2-4. SMILE 과발현에 의한 류마티스 관절염 동물 모델의 면역조절 세포 분화 촉진 확인
SMILE 과발현에 의해, 조절 T 세포(Treg)가 조절되는 활성, 및 면역조절 B 세포 (Breg)의 분화 및 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 관찰 종료 시점의 마우스를 희생하여 비장세포를 얻어 유세포 분석을 수행 하였다.
그 결과, SMILE 과발현에 의해 CD4+CD25+Foxp3+ Treg 세포의 증가가 관찰되어, 면역 조절능이 향상됨을 확인하였으며, 면역조절 B세포인 CD19+CD25+Foxp3+ Breg 세포 또한 활성화되고 세포수가 증가된 것으로 나타났다 (도 9).
실시예 3. SMILE 과발현에 의한 염증성 장질환(IBD) 완화 효과 확인
3-1. 염증성 장 질환 유도 동물모델 제작
염증성 장 질환 유도 동물모델(IBD 마우스 모델)을 제작하였다. 시험동물은 C57BL/6(H-2kb) 마우스를 사용하였으며, 염증성 장질환 유도 동물모델을 제조하기 위해, 마우스에 2.5% 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, DSS) 물을 1주일간 음용하게 하여 염증성 장 질환 유도 동물 모델을 제작하였다.
3-2. SMILE 과발현에 의한 염증성 장 질환 동물 모델의 체중 및 대장 길이 관찰
염증성 장 질환 유도 동물 모델인 IBD 마우스 모델을 별도의 투여 조치를 하지 않은 대조군 및 SMILE 과발현군 (SMILE 과발현 벡터 주입군)으로 나누고, 질환 유도 3일 후부터 대조군에는 PBS만을, SMILE 과발현군은 주 1회, 회당 100 ㎍의 벡터를 상기 실시예 2에서와 같이 주입하였다. 이후 매일 세 그룹의 동물 모델에 대해 체중을 측정해 본 결과, 대조군의 체중은 투여 8일 이후 급격히 감소하는 것으로 나타났고, SMILE 과발현군의 체중은 대조군에 비하여 적게 감소하는 경향을 나타내 SMILE의 과발현이 염증성 장 질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다 (도 10). 또한, 실험 종료 후 마우스를 희생시켜 장 길이를 측정한 결과, 대장의 두께와 길이가 회복되어진 것으로 나타났고, 장길이의 단축 현상이 정상과 유사하게 회복되는 것으로 확인되었다 (도 11).
3-3. SMILE 벡터 주입에 의한 염증성 장질환 조직에서의 SMILE 발현 증가 확인
염증성 장 질환 유도 동물 모델인 IBD 마우스 모델에 별도의 투여 조치를 하지 않은 대조군 및 SMILE 과발현군 (SMILE 과발현 벡터 주입군)으로 나누고 상기 실시예에서와 같이 주입한 뒤, 조직화학 염색으로 SMILE의 발현을 확인한 결과, SMILE 벡터 주입에 의해 SMILE 발현이 증가한 것을 확인하였다 (도 12).
3-4. SMILE 과발현에 의한 염증 반응 억제 효과 및 Th17/Treg 조절 효과
SMILE의 과발현이 염증성 장 질환 동물 모델에서 사이토카인 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 염증성 장 질환 동물 모델의 비장세포에 SMILE 과발현 벡터를 처리하였다. 처리 3일 후 수집한 배양액으로부터 IFNγ, IL-4 및 IL-17을 ELISA 기법을 이용하여 측정하였다. 그 결과, SMILE 과발현 벡터에 의한 SMILE 과발현이 IFNγ, IL-4 및 IL-17의 발현을 모두 억제하는 효과가 있었으며, Treg 세포는 세포수가 증가하는 것으로 나타나 (도 13), SMILE 과발현이 염증 반응을 억제하며 Th17 억제 및 Treg 증가를 통한 Th17/Treg 조절 효과를 가지는 것을 알 수 있다.
3-5. SMILE 과발현에 의한 IL-17 및 Breg 조절 효과
각 마우스 군으로부터 비장세포를 분리한 후, 비장세포에서 Breg 세포 수준을 유세포기(FACs caliber)를 이용하여 CD19+ 세포에서의 IL-17 및 Breg 세포 수준을 분석한 결과, IL-17가 감소하고, Breg 세포가 증가하는 것으로 나타났다 (도 14).
3-6. SMILE 과발현에 의한 장 보호 효과 및 염증성 신호전달 억제 확인
SMILE 벡터 주입에 의한 염증성 장질환의 장 조직에서의 장 보호 효과를 확인하고 염증성 신호전달의 억제 효과를 확인하기 위해, 조직화학 염색을 수행한 결과, SMILE 벡터 주입에 의해, 염증성 장질환의 장 조직이 보호되는 것을 확인하였으며, 염증관련 STAT3 및 mTOR의 활성이 현저히 억제되었으며, AMPK가 증가됨을 확인하였다 (도 15).
3-7. SMILE 과발현에 의한 장조직에서의 염증 마커 및 섬유화 마커 억제 확인
SMILE 벡터 주입에 의한 염증성 장질환의 장 조직에서의 염증 마커인 IL-1β, IL-6 및 IL-17와 섬유증 마커인 α-SMA(α-smooth muscle actin) 및 Col-I(Type I collagen)의 별현 변화를 조직화학 염색 분석으로 확인한 결과, SMILE 벡터 주입에 의해 염증 마커 및 섬유증 마커 모두 발현이 현저히 감소한 것으로 나타났다 (도 16).
실시예 4. SMILE 과발현 마우스에서의 염증성 장질환 치료 효과 확인
4-1. SMILE Tg 마우스의 염증성 장질환 치료 효과 확인
SMILE을 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 제작하고, SMILE의 과발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 뒤 (도 17A), 일반 마우스와 상기 SMILE Tg 마우스에 2.5% 덱스트란 설페이트 소듐(dextran sulfate sodium, DSS) 물을 1주일간 음용하게 하여 염증성 장 질환을 유도하였다. 그 결과, SMILE 과발현 Tg 마우스의 체중은 대조군에 비하여 적게 감소하는 경향을 나타내 SMILE의 과발현이 염증성 장 질환의 예방 및 치료에 효과가 있음을 알 수 있었다 (도 17B). 또한, 실험 종료 후 마우스를 희생시켜 장 길이를 측정한 결과, SMILE Tg 마우스 군에서 대장의 두께와 길이가 회복된 것으로 나타났다 (도 18).
6-2. SMILE Tg 마우스의 면역세포 조절 효과 확인
상기 실시예 6-1에서와 같이 일반 마우스 및 SMILE Tg 마우스에 염증성 장 질환을 유도하고 이에 따른 면역세포 조절 효과를 확인한 결과, SMILE 과발현 마우스에서 Th17가 억제되었으며 TREG가 증가하였고, CD19+IL-17+ 세포가 감소하는 것으로 나타났다 (도 19).
4-2. SMILE Tg 마우스의 장 보호 효과 및 염증성 신호전달 억제 확인
SMILE Tg 마우스에서의 장 조직에서의 장 보호 효과를 확인하고 염증성 신호전달의 억제 효과를 확인하기 위해, 조직화학 염색을 수행한 결과, SMILE Tg 마우스에서 염증성 장질환 유도 후 장 조직이 보호되는 것을 확인하였으며, 염증관련 STAT3 및 mTOR의 활성이 현저히 억제되고, AMPK가 증가하는 것을 확인하였다 (도 20).
실시예 5. SMILE 작용제 커큐민에 의한 면역 조절 효과 확인
5-1. 커큐민의 세포 독성 확인
SMILE 작용제인 커큐민의 세포 독성을 확인하기 위해, MTT 분석을 수행하였다. 구체적으로, 사람의 단핵구 세포를 페니실린(100IU/㎖), 스트렙토마이신 (100㎍/㎖), 10% FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 DMEM(Dulbecos Modified Eagles Medium) 배지에 넣고 , 5% CO2 조건에서 37℃로 배양하였다. MTT 분석을 위해, 상기 사람단핵구 세포는 96웰 플레이트(96 well plate)에각 웰당 2×105개로 맞추어 분주하고 커큐민을 농도별 처리 (10uM, 25uM 및 50uM)하여 72시간 동안 배양한 다음, 이 후, MTT 용액(0.5% 3-4,5- dimethyl thiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide)을 첨가하여 4시간 배양한 후 ELISA(enzyme -linked immunospecific assay) 측정기로 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 커큐민은 세포 독성이 없는 것으로 나타났다 (도 21).
5-2. 커큐민에 의한 SMILE 발현 증가 효과 확인
LPS 100ng/ml을 DBA/1J 마우스 비장 세포에 처리하여 B세포 활성 및 염증 반응을 유발한 후, 2시간 약물 전처리 뒤 단백질을 얻어 SMILE 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 그 결과, 커큐민 처리로 인해 SMILE의 발현이 증가하여 커큐민이 SMILE의 작용제임을 확인하였다 (도 22).
5-3. SMILE 억제제에 의한 BAFF-R 회복 확인
SMILE의 억제제인 컴파운드 C (compound C)의 처리에 의한 커큐민의 SMILE 발현 향상 효과가 상쇄되는지 확인하기 위하여, B 세포 활성화인자 수용체(B-cell activating factor receptor, BAFF-R) 양성 B 세포의 %를 확인하였다. 구체적으로, 정상 마우스 및 CIA(류마티스 관절염) 유도 마우스의 각각의 비장세포에 LPS 100ng/ml로 처리하여 B 세포를 활성화시킨 뒤, SMILE 작용제인 커큐민(Curcumin)을 10uM 또는 50uM로 처리하였다. 이 때, SMILE 억제제인 컴파운드 C를 처리 하고 4일 동안 배양하였다. 배양 종료 후 유세포 분석을 통해 B 세포의 활성 마커인 BAFF-R의 발현을 비교하였다.
그 결과, SMILE 작용제인 커큐민을 처리시 BAFF-R (BAFF-R의 발현이 있는 세포에서 궁극적으로 pathogen한 plasma B 세포로의 development가 가능함) 농도 의존적으로 CD19+BAFF-R+ 세포의 발현이 억제 되다가 SMILE 억제제인 컴파운드 C에 의해 BAFF-R+ 세포가 다시 회복되는 것으로 나타나 (도 23), SMILE 작용제에 의해 B 세포의 발현이 조절되는 것을 알 수 있다.
5-4. 커큐민의 plasma B 세포 발달 제어 효과 확인
정상 마우스의 B 세포에서 커큐민에 의해 체액성 면역반응과 관련된 형질(plasma) B 세포의 발달이 조절되는지 확인하기 위해, 유세포 분석기로 확인하였다. 구체적으로, 정상 마우스의 비장세포에 LPS 100ng/ml를 처리하여 B 세포를 활성화시킨 뒤 SMILE 작용제인 커큐민을 10uM 또는 50uM로 처리하고 4일간 배양하였다. 배양 종료 후 유세포 분석으로 B220-CD138+ 마커를 분석하여 형질 B 세포의 활성을 분석하였다.
그 결과, 커큐민에 의해 Plasma B 세포가 효과적으로 억제되고 있는 것으로 나타났다 (도 24).
5-5.
커큐민의
배중심
(
Germinal
center
) B 세포 발달 제어 효과 확인
정상 마우스의 B 세포에서 커큐민에 의해 체액성 면역반응과 관련된 배중심(Germinal center) B 세포의 발달이 조절되는지 확인한 결과, 커큐민에 의해 배중심 B 세포의 발달이 농도 의존적으로 감소되는 것으로 나타났다 (도 25).
5-6. 커큐민의 B17 세포 발달 제어 효과 확인
정상 마우스의 B 세포에서 커큐민에 의해 B17 세포의 발달이 제어되는지 확인하기 위해, 정상 마우스의 B 세포에서 커큐민에 의해 체액성 면역반응과 관련된 형질(plasma) B 세포의 발달이 조절되는지 확인하기 위해, 유세포 분석기로 확인하였다. 구체적으로, 정상 마우스의 비장세포에 LPS 100ng/ml를 처리하여 B 세포를 활성화시킨 뒤 SMILE 작용제인 커큐민을 10uM 또는 50uM로 처리하고 4일간 배양하였다. 배양 종료 후 유세포 분석으로 CD19+IL-17+ 마커를 분석하여 B17 세포의 활성을 분석하였다.
그 결과, 커큐민에 의해 병원성인(Pathogenic) B17 세포가 효과적으로 억제되고 있는 것으로 나타났다 (도 26).
5-7. 커큐민의 BAFF-R 발현 제어 효과 확인
정상 마우스의 B 세포에서 커큐민에 의해 B 세포 활성화인자 수용체 양성 세포의 발현이 감소되는지 확인한 결과, 커큐민의 농도 의존적으로 B 세포 활성화인자 수용체 양성 세포의 발현이 감소하는 것으로 나타났다 (도 27).
실시예 6. 커큐민에 의한 류마티스 관절염 완화 효과 확인
6-1. 형질세포 발달 제어 효과 확인
상기 실시예 2에서 제조된 류마티스 관절염 동물 모델에 커큐민을 주 6회, 총 5주 동안 경구 투여한 뒤, 관찰 종료 시점의 마우스를 희생하여 비장세포를 얻어 유세포 분석을 수행하였다. 유세포 분석으로 B220-CD138+ 마커를 분석하여 형질 B 세포의 활성을 분석한 결과, 커큐민에 의해 형질 B 세포가 효과적으로 억제되고 있음을 확인하였다 (도 28).
6-2. 배중심 B 세포 발달 제어 효과 확인
류마티스 관절염 동물 모델에 커큐민을 주 6회, 총 5주 동안 경구 투여한 뒤, 배중심 B 세포의 발달을 확인한 결과, 커큐민 처리에 의해 농도 의존적으로 배중심 B 세포의 발달이 감소한 것으로 나타났다 (도 29).
6-3. B17 세포 발달 제어 효과 확인
류마티스 관절염 동물 모델에 커큐민을 주 6회, 총 5주 동안 경구 투여한 뒤, 커큐민에 의해 B17 세포의 발달이 제어되는지 확인한 결과, 커큐민 처리에 의해 농도 의존적으로 B17 세포의 발달이 억제된 것으로 나타났다 (도 30).
6-4. BAFF-R 발현 제어 효과 확인
류마티스 관절염 동물 모델에 커큐민을 주 6회, 총 5주 동안 경구 투여한 뒤, 커큐민에 의해 B 세포 활성화인자 수용체 양성 세포의 발현이 감소되는지 확인한 결과, 커큐민의 농도 의존적으로 B 세포 활성화인자 수용체 양성 세포의 발현이 감소하는 것으로 나타났다 (도 31).
6-5. B10 세포 활성 영향 확인
커큐민 처리에 의한 정상 마우스와 류마티스 관절염 마우스에서의 B10 세포의 증가을 확인한 결과, 류마티스 관절염 동물모델에서 얻은 비장세포에 커큐민을 처리한 경우에는 항염증 기능을 가진 CD19+IL-10+ 세포의 증가 경향이 관찰되었으나, 정상 마우스에서 얻은 비장세포에서는 감소 경향이 확인되어, 커큐민이 류마티스 관절염 마우스에 대해 항염 효과를 가지는 것을 확인할 수 있다 (도 32).
실시예 7. SMILE 작용제 메트포민에 의한 염증성 장질환(IBD) 완화 효과 확인
7-1. 메트포민에 의한 SMILE 발현 증가 효과 확인
LPS 100ng/ml을 DBA/1J 마우스 비장 세포에 처리하여 B세포 활성 및 염증 반응을 유발한 후, 2시간 약물 전처리 뒤 단백질을 얻어 SMILE 발현 정도를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 그 결과, 메트포민 처리로 인해 SMILE의 발현이 증가하여 메트포민이 SMILE의 작용제임을 확인하였다 (도 33).
7-2. 메트포민에 의한 IBD 치료 효과 확인
상기 실시예 3-2의 방법으로 메트포민 처리에 의한 염증성 장 질환 동물 모델의 체중 및 대장 길이를 확인한 결과, 메트포민 처리에 의해, 염증성 장 질환의 치료 효과가 나타났으며, 장 길이 보호 효과가 있는 것으로 확인되었다 (도 34).
7-3. 메트포민에 의한 장 보호 효과 및 염증성 신호전달 억제 효과 확인
메트포민에 의한 염증성 장질환의 장 조직에서의 장 보호 효과를 확인하고 염증성 신호전달의 억제 효과를 확인하기 위해, 조직화학 염색을 수행한 결과, 메트포민에 의해, 염증성 장질환의 장 조직이 보호되는 것을 확인하였으며, 염증관련 STAT3 및 mTOR의 활성이 현저히 억제되었으며, AMPK가 증가됨을 확인하였다 (도 35).
7-4. 궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 환자의 장조직에서 질환의 활성도에 따른 mTOR, AMPKa, SMILE의 발현 조사
궤양성 대장염(Ulcerative colitis, UC) 환자의 질환의 활성도에 따라 Mayo score로 분석을 한후 각 조직에서 면역화학조직염색법을 이용하여 mTOR, AMPKa, SMILE의 발현을 확인 하였다. Mayo score는 하기 표 1에 타나내었다.
그 결과, 도 36에 나타낸 바와 같이, Mayo score가 high인 질환의 활성도가 높은 환자의 조직에서 mTOR 발현의 증가 경향이 확인이 되었고, AMPKa, SMILE의 발현이 현저하게 감소되어 있음을 확인 하였다. 이와 같은 결과는 UC에서 mTOR의 증가와 AMPK, SMILE 발현의 저하가 질환과 직접적으로 관련있음을 시사한다.
또한, UC 환자에서 Mayo score가 높은 환자와 낮은 환자의 말초단핵구 세포에서 RNA를 얻어 SMILE 의 발현을 조사하였다. Mayo score가 높은 환자들에서 SMILE의 발현이 감소되어 있었으며, 또한 Treg의 마커인 Foxp3도 유의미하게 감소되어있음을 확인 하였으며, SMILE의 발현과 Foxp3의 발현이 positive correlation 하고 있음을 mRNA 수준을 통해 확인 하였다(도 37).
또한, UC 환자의 말초단핵구 세포에 SMILE의 발현을 유도하는 메트포민(48시간)을 처리하여 SMILE, Prkaa (protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2), Foxp3의 발현의 변화를 real time PCR 기법을 이용해 분석 하였다.
그 결과, 도 38에 나타낸 바와 같이, SMILE의 발현을 유도하는 메트포민을 48시간 처리하면, SMILE, Prkaa (protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha 2), Foxp3의 발현이 회복되는 것을 확인하였다.
또한, UC 환자의 말초단핵구 세포에 메트포민(72시간)을 처리하여 Th17 세포와 Treg의 발현을 유세포 분석을 통해서 분석 하였다. 이때 Th17 활성 조건으로 72시간 배양하였다. 배양후에 유세포 분석을 통해 Th17 세포는 감소되는 경향을 Treg은 증가되는 경향을 확인 하였다(도 39).
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<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
gcgatactct ggctggagcg aagcgcgttt ttgtgggcgg ggtgggcaga gagtaacttc 60
cggccaggcc gctgtctggg tggcgcggcc gagtcctccc ccgggcctcg ccgcttcgcg 120
cttccactgc cttccccccg cctcgtgcgg ggggttgggc ggccgccgga ggccactcgg 180
accttgcccc gcgcctgcgg tcggcccggc gccgtggctc tgcgcgctgg gggcccgggg 240
tcggagtggc tgcggcctac ccgggcccgc cgctcagccc catgaggcac agcctgacca 300
agctgctggc agcctcgggc cgcgacttcc cgagccgccg cgacagccgg gagccgcccg 360
ccacgcgcgc gccgccccgg gagccgagcg gggcagccgc gggggcggag accccgaggc 420
ccggatcgcc tgaccgcgag caacctcacg gggacgggga cgggggcgag ccggaggccc 480
ggagcgggag ccgcggcagc gtggccgtgc gcgcgcccgc gccctcgccc ctgaagatgg 540
aggaggagga ggaggacgcg atcgccatgg tccccaagga agagccggag gacatggact 600
ttctctccgg gctggagctg gccgatctgc tggaccctcg gcaaccggac tggcacctgg 660
agcccgggct cagctcgccc gggcccctgt cctcgtccgg cggaggctcg gagagcggcg 720
gcctgttgag gggggacgac gacgacgaca ccgcggccgc cgagatgcag cgcttctccg 780
acttgctgca gaggctgttg aacggcatcg gaggctgcag cagcggcggt gaccgcggcg 840
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accacgacta cgccctgccg gtggggaagc agccgccgga gccgcgggaa gaggacgacg 1260
cggcgggagg agtgtgtctc catgtggaca aggataaggt gtcggtggag ttctgctcgg 1320
cgtgcgctcg gaaggcgtcg tcgtctctta aaatgtaggg tcaagtaatc tgctctttat 1380
ccgcgtttac ccctttctcc tcccttacac catgtcaaac accttagtgg gacatcgtca 1440
ccggacgcat ttcagaggcg gaaaaaaaag taatattaaa tcttttaagt gtttagctaa 1500
aagcatgaat gtgacactgt aaccaactcc taatgataac ctgtgactat taaatctctc 1560
tgacagtttc ttttttaggt gatttccttc ctgccaggct ccgttgtagg ggttacagag 1620
cagtcgttcc cgcctcacaa cctggtaagg atccatctct tcccgtaacg ctcatgctcg 1680
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tctgtttgtt tttctttttg aaaggtggtg ggaggggaat cttaatttgg gccttgtcca 1800
ccctggaaac agacttgtgc tggtcattaa tgtacttaag ttgcttctgg ttgaaatagc 1860
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acatggcctt ggatgacatc ggttccaact gtacacagaa acctgctaat agagatacag 1980
tttggagaca gtcaaacagg tgaagttgaa tggaagttcc gagttgtaca aggtgcaaat 2040
tggaattcca attgtagagc aacttttcag aggttgacaa taagtattga ggcatgcgca 2100
aatgtggtat ttttctggag atgacaagtc tcctaaaata cttaatgaat gccttatagt 2160
tttcagtaga aaatgcagaa atacagtcta tttaaagacc ctaatagttc accacttgag 2220
aagttggaaa ttaacatacc catcagattt ctgtgtttta attagaagac gataaatgaa 2280
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agtatttatt tttgttgtat taaaatttag gctaaatttc tgtatgatta gatattgaag 2400
gttgtgaaat gtgaatgaaa acatgtaaag tgaggcttca caaagaatct tttctccata 2460
tttctaaaac ttttgtccta tttaaaaata cttgtttaaa ttaatgaaat gatcgatact 2520
gtttttccaa agacggaaaa gtctttcctt aaaatactgt ttttttgtcc acttgtctta 2580
agtgtgtgtt ctgatgctct gaaatgcaag agacattaaa ttctttgtga aacatcactg 2640
tttgataaag gatatacgta tttagcatcc ttgtttttct ttgtgctaaa gtggatacag 2700
ctgttggggc agaagagacg ggaccagctg ctggccacat ttcctgcttt attttaaaag 2760
gtagtataag aaataaggaa acagaggtaa tatcagggct tctgctgtct tttattttta 2820
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atgttttatt ttgttacttg gttatggaaa tggaatcttg ttcttgcaca actgtaaatg 2940
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atggatgaaa ataggaaaaa tggttgttaa tatagactta atcgaaaggt tctggaagta 3420
gtaagtttgt tttcctaaaa actataccat ttctgtggaa tattttctta acctcagtgc 3480
ttttcctgca tttgaagtgt gggcttgggg aaaattagtt tctgaattgg gatgttttga 3540
aattccaagt acagagtctt aggctgtcat ttcataaatg gcagtttgga gaattaggaa 3600
ttctcaacag tggaagatca gagtgtcctg tttttaaagc tgctttctta ggttccttat 3660
gtcttattaa ctgtgttttt gtttccattt cattgttttt ttctagtttt ggtgacagtg 3720
atttttgtca ttttttttgc atcaactcat ggtcttgttt ttacatggta actgcatgta 3780
tgtaggatct atcaggggct ttaaataaat tttgctcata tttatgtgta agcacatttt 3840
actgtaaatg tttgggttta atttacagca gttgtttatt tcagtgtgta gtaaacagta 3900
tctagagtgt tctgttcact acttgttaat taaaaaagtt atgattaata taaaactgtt 3960
gtcttactat ttttagaaaa cttttgtgaa taattagtat tttgatagag agttctgaaa 4020
tacaaaatag attgctttga aaatttcagg tttgggtgta tttactgtga tgttgagaac 4080
aatttagtat ttggggaact gtttcaggtt ttattcttga tttgtacctg tgtaaaaatg 4140
atagaaaacc ttaaaatgta gcttttaaat acctgtcttc ctatggtagt taatattcat 4200
acattaattg actaacacat attggcatag tatttctatc atagtagctt aagtttttgt 4260
ccttttttta accatactta aaagtatgtt tgttaaaaaa tgtagtcaca cctctgatat 4320
atccaacaaa gtattcaaaa tattttaaat atctgtacat ttcatactcg ctaaattaat 4380
ctctttctct tctctttaaa cagcttagca gtatctgcaa aaacgaatct tttcctacaa 4440
cctgttaact gactggactg atggtaacag taattgtggg agccatgtcg gtcaaaaatt 4500
tggcatctgc tgaaagacat gaatgccatt tccaaggtcc caaattactt ctatactgat 4560
tacactttcc agaaatggag atatgaaaag attctctgga atgcttgaaa gacttaatag 4620
aaacccatga gactaagtta attttggaac aaaattacac ctcttttttt tcattcatgg 4680
caattaacac taaatttatc gtatacttta aaaaatggta accattggag aagagaattc 4740
tagagtttca tcaagaaaca ttaggtttta cacaatcaag gacactttgt ggaattagac 4800
ttagtgggtt agaatgacac aagtgagcta gcagtgatca caaacctcat gagtttgtat 4860
tctgggatgg aaagagctgc tttggaagac agacacgttg ctgagtagaa taaagtcctt 4920
aactaaaaga ttagtgtctt aaaatagatg cattgattgt gtgttttgaa aaggtgattc 4980
tgataacgtg tgggtgctaa ttcagggcat catgagcgtg tgagcaatcc tggggtttgg 5040
tatcttcagt gttcttagta cttggtcttt ttgaatgtgt tgaggtttct gatgaatgat 5100
atagtttctg ttgttctatg ttaaaatttc tgtggtattc tgtaaggatc tttatattct 5160
ggatgataag ggctaattcc ataagtaaac acttagaacc cattcattta tcatctggaa 5220
tatgctaatg caccttcctt ctggtctaga ttgagttatt ttatgttttg gttcacttag 5280
gaaatagata gaagagggag atggtaggaa gcagttaatt tactcaaaat tcattcaggt 5340
tgctcttttc cttgtattgg tctgtatgct cagtgcccgt aaagggaatt tctacaggct 5400
ttaaagtgat tgatgctctt atagtacaga ccttgactac aactcttgac agaacacagt 5460
gcggataatt cactaatatg tattataata atatgtagtt acctggttaa ggcattttga 5520
agatagagat tacgagctca caaatataat catttttctt aactaaataa atggttcttc 5580
aacattgaa 5589
Claims (18)
- SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서, SMILE은 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 면역질환은 자가면역질환, 염증성질환 및 세포, 조직 또는 기관의 이식거부 질환인, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 면역질환은 골관절염, 베체트병, 다발성 근육염/피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 전신 홍반성 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 궤양성 대장염, 염증성 대장 질환 및 비만으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 면역질환은 염증성 대장 질환인, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서, 면역질환은
1) IFNγ, IL-4 및 IL-17에 의하여 매개되며;
2) B 세포 활성화인자 수용체(B-cell activating factor receptor, BAFF-R) 양성 B 세포의 발현이 증가되고;
3) 배중심(Germinal center) B 세포의 발달이 증가되며;
4) 형질 B 세포 및 B17 세포가 활성화되고; 및
5) Treg 세포수가 감소된, 조건을 갖는 것인, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물. - 제 1항에 있어서, SMILE 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 체액성 면역조절 세포의 분화를 촉진시키는, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서, SMILE 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 조절 T 세포(Regulatory T cell: Treg)의 활성 또는 증폭을 촉진 또는 증가시키는, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서, SMILE 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 조절 B 세포 (Regulatory B Cell, Breg)의 수를 증가시키는, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 1항에 있어서, SMILE 작용제를 추가로 포함하는, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 10항에 있어서, SMILE 작용제는 커큐민(Curcumin) 또는 메트포민(Metformin)인, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- SMILE 작용제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 12항에 있어서, SMILE 작용제는 커큐민 또는 메트포민인, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- 제 12항에 있어서, SMILE 작용제는 SMILE의 발현을 증가시키는, 면역질환의 예방 및 치료용 조성물.
- SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 및 치료에 있어서, 형질 B 세포 및 B17 세포를 감소시키고, Treg 세포를 증가시키기 위한 약학 조성물.
- SMILE(small heterodimer partner-interacting leucine zipper protein) 또는 이의 단편, 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 유효성분으로 포함하는, SMILE의 발현이 감소된 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제 16항에 있어서, 상기 면역질환은 염증성 장질환인 조성물.
- 제 17항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 중증 염증성 장질환으로, 환자의 조직 내에 SMILE이 감소되고, mTOR의 발현이 증가하였고, AMPK의 발현이 감소된 염증성 장질환인 것인, 조성물.
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- 2020-11-13 KR KR1020200151833A patent/KR20210058724A/ko not_active Application Discontinuation
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