KR20210058586A

KR20210058586A - 실데나필 및 rock 저해제를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20210058586A
Application number: KR1020190146217A
Authority: KR
Inventors: 오재상; 김덕수; 이만열; 강주현
Original assignee: 순천향대학교 산학협력단
Priority date: 2019-11-14
Filing date: 2019-11-14
Publication date: 2021-05-24
Also published as: KR102303154B1

Abstract

본 발명은 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor) 및 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 실데나필 및 GSK429286A를 포함하는, 뇌졸중으로 인한 뇌 손상을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명자들은 뇌졸중 치료와 관련된 임상적 지식을 바탕으로 뇌졸중의 치료에 실데나필과 ROCK 저해제를 병용하기 위해 연구한 결과, 실데나필과 ROCK 저해제를 병용 투여한 경우, 실데나필과 ROCK 저해제를 각각 단독 투여한 경우에 비해 뇌졸중으로 인한 뇌 손상의 크기가 유의적으로 감소함을 최초로 확인하였는바, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 뇌졸중의 치료 뿐만 아니라 허혈성 뇌졸중을 포함하는 다양한 허혈성 뇌혈관 질환의 연구에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

Description

실데나필 및 ROCK 저해제를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물{A pharmaceutical composition for treating stroke containing sildenafil and Rho-associasted kinase inhibitor}

본 발명은 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor) 및 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)를 포함하는 뇌졸중 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 실데나필 및 GSK429286A를 포함하는, 뇌졸중으로 인한 뇌 손상을 치료하기 위한 약학적 조성물에 관한 것이다.

뇌졸중은 뇌에 혈액을 공급하는 혈관이 막히거나 터져 그 부분의 뇌 조직이 손상되어 나타나는 신경학적 증상으로서, 크게 허혈성 뇌졸중 (ischemic stroke)과 출혈성 뇌졸중 (hemorrhagic stroke)의 두 가지로 구분된다. 이 중 허혈성 뇌졸중은 뇌 조직으로 가는 혈액 공급의 감소 또는 차단으로 뇌 조직이 허혈 상태가 될 때 발생하며, 출혈성 뇌졸중은 혈관이 터지는 경우 출혈로 인해 발생하며, 전체 뇌졸중 환자의 약 80 % 정도를 허혈성 뇌졸중 환자가 차지하는 것으로 보고되며, 허혈성 뇌졸중이 발병하면 혈액의 흐름이 일시적으로 끊어짐으로써 세포가 산소와 영양분을 얻을 수 없게 되나, 수술이나 혈전용해제를 사용하여 혈관흐름을 재개통시켜 주는 조치인 재관류 (reperfusion)를 통해 재산소화 (reoxygenation)가 가능하다. 재관류는 세포에 산소와 영양분을 공급한다는 점에서 회복과정에 필수적이기는 하나, 뇌혈류장벽이 망가진 상태에서 재개통이 이루어지면 과도한 산소 화합물, 즉 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)가 생성되고 또한 염증반응이 수반되면서 뇌부종이 심해지거나, 뇌출혈로 변환되기도 한다. 뇌세포는 한번 혈관이 막히게 되면 분당 수백 만개의 세포가 사멸하기 때문에 뇌경색 치료에서 제일 중요한 것은 시간이다. 하지만 최근 연구 결과에 따르면, 환자마다 같은 부위가 막혀도 예후가 다른 것을 알 수 있다. 예후가 좋은 환자들을 분석결과, 그 환자들의 뇌는 뇌혈관이 막히면 자기 보호 기능으로 주변의 뇌혈관들이 확장함과 동시에 막힌 부위의 혈류를 도와주게 된다고 보고하였다. 따라서 뇌경색의 발병 시 주변 혈관의 확장 기능이 환자의 예후를 다르게 함을 알 수 있다.

또한 뇌졸중은 심각한 후유증을 남기는 질환이고, 뇌신경 세포 손상으로 인해 운동기능의 손실, 감각 이상, 인지, 언어장애, 의식 소실, 삼킴 기능의 장애 등 출혈 및 폐쇄 부위에 따라 다양한 신경학적 증상을 일으키며, 뇌졸중으로 발생하는 뇌신경 세포 손상의 원인으로는 과도한 흥분성 신경전달물질의 유리, 자유 라디칼의 생성, 단백질 합성의 저해, 유전자 발현 이상 및 면역반응의 활성화 등을 들 수 있으며, 뇌신경 세포 손상 기전의 복잡성 때문에 아직까지 뇌 신경세포의 손상을 보호해 줄 수 있는 치료제가 개발되어 있지 않다.

한편, 실데나필 (sildenafil)은 발기부전과 폐동맥 고혈압 치료에 사용되는 약물로서, 해당 장기에 분포되어 있는 평활근을 이완시켜 혈액 공급을 원활하게 하여 발기부전 개선과 폐동맥 압력을 개선하는 효과를 나타내며, 20　mg　정제는 폐동맥 고혈압 치료에 사용되고, 25　mg,　50　mg,　100　mg　정제는 발기부전 치료에 사용되는 것으로 알려져 있다.

또한 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)는 세포사멸 (apoptosis)을 억제하는 기능을 하는 물질로서, 신경돌기의 재생, 미오신 인산화 및 평활근 수축에 있어서 작용-유도성 Ca²⁺ 증감 (agonist-induced Ca²⁺ sensitization)의 억제 등의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로, ROCK 저해제는 고혈압과 천식을 일으키는 근육 세포의 비정상적 구조를 경감시켜주며 시신경 유두의 혈액 흐름을 증가시키고 안압을 지속적으로 감소시키는 기능이 있는 것으로 보고된다.

다만, ROCK 저해제의 염증성 질환 치료용도에 관한 연구 (한국등록특허공보 제10-1794009호) 및 실데나필의 골격근 재생 및 증진용도에 관한 연구 (한국등록특허공보 제10-1852358호)는 존재하나, 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 및 ROCK 저해제를 포함하는 약학적 조성물의 뇌졸중 치료용도에 관한 연구는 전무한 실정이다.

본 발명자들은 뇌졸중 치료와 관련된 임상적 지식을 바탕으로 뇌졸중의 치료에 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제와 ROCK 저해제를 병용하기 위해 연구한 결과, 실데나필과 ROCK 저해제를 각각 단독 투여한 경우와 대비해 실데나필 및 ROCK 저해제를 병용 투여한 경우 뇌졸중으로 인한 뇌 손상의 크기가 유의적으로 감소함을 최초로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor); 및

ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)를 포함하는, 허혈성 뇌혈관 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor); 및

ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)를 포함하는, 허혈성 뇌혈관 질환의 예후 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor); 및

ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)를 포함하는, 허혈성 뇌혈관 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 허혈성 뇌혈관 질환은 허혈성 뇌졸중 (뇌경색), 혈전증, 색전증, 일과성 허혈발작, 백질이상증 및 소경색으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제는 미로데나필 (mirodenafil), 실데나필 (sildenafil), 바르데나필 (vardenafil), 타달라필 (tadalafil), 유데나필 (udenafil), 다산타필 (dasantafil), 아바나필 (avanafil) 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 수화물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 ROCK 저해제는 파수딜 (Fasudil), 리파수딜 (Ripasudil), RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, Y-30141 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 수화물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 뇌혈관 폐색 후 재관류 전, 재관류와 동시 또는 재관류 후에 투여하기 위한 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌혈관 질환의 치료방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 약학적 조성물의 허혈성 뇌혈관 질환의 치료용도를 제공한다.

ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)를 포함하는, 허혈성 뇌혈관 질환의 예후 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 허혈성 뇌혈관 질환의 예후 개선방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 약학적 조성물의 허혈성 뇌혈관 질환의 예후 개선용도를 제공한다.

본 발명자들은 뇌졸중 치료와 관련된 임상적 지식을 바탕으로 뇌졸중의 치료에 실데나필과 ROCK 저해제를 병용하기 위해 연구한 결과, 실데나필과 ROCK 저해제를 병용 투여한 경우, 실데나필과 ROCK 저해제를 각각 단독 투여한 경우에 비해 뇌졸중으로 인한 뇌 손상의 크기가 유의적으로 감소함을 최초로 확인하였는바, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 뇌졸중의 치료 뿐만 아니라 허혈성 뇌졸중을 포함하는 다양한 허혈성 뇌혈관 질환의 연구에 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 대조군, 뇌졸중 (뇌경색) 동물모델, 약물 단독 처리군 및 약물 병용 처리군의 뇌졸중으로 인한 직접적인 뇌 손상의 크기를 확인한 결과를 뇌 절편 (brain slice) 이미지로 나타낸 것이다. 여기서, MCAo30는 뇌졸중 (뇌경색) 동물모델을 나타낸 것이고, SIL은 실데나필 (sildenafil) 단독 처리군을, ROCK-I는 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor) 단독 처리군을 나타낸 것이며, SR은 실데나필 (sildenafil) 및 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)의 병용 처리군을 나타낸 것이고, pre는 중대뇌동맥 폐색 후 재관류 전 투여군을 나타낸 것이며, post는 중대뇌동맥 폐색 후 재관류 후 투여군을 나타낸 것이다.
도 2는 대조군, 뇌졸중 (뇌경색) 동물모델, 약물 단독 처리군 및 약물 병용 처리군의 뇌졸중으로 인한 직접적인 뇌 손상 (infarction volume)의 감소 수준을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다. 여기서, MCAo30는 뇌졸중 (뇌경색) 동물모델을 나타낸 것이고, SIL은 실데나필 (sildenafil) 단독 처리군을, ROCK-I는 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor) 단독 처리군을 나타낸 것이며, SR은 실데나필 (sildenafil) 및 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)의 병용 처리군을 나타낸 것이고, pre는 중대뇌동맥 폐색 후 재관류 전 투여군을 나타낸 것이며, post는 중대뇌동맥 폐색 후 재관류 후 투여군을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 뇌졸중 치료와 관련된 임상적 지식을 바탕으로 뇌졸중의 치료에 실데나필과 ROCK 저해제를 병용하기 위해 연구한 결과, 실데나필과 ROCK 저해제를 각각 단독 투여한 경우와 대비해 실데나필 및 ROCK 저해제를 병용 투여한 경우 뇌졸중으로 인한 뇌 손상의 크기가 유의적으로 감소함을 최초로 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor); 및 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)를 포함하는, 허혈성 뇌혈관 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 대상으로 하는 질환인 “허혈성 뇌혈관 질환”은, 뇌의 혈관이 어떠한 이유로 막혀 뇌에 필요한 혈액이 공급되지 않아 발생하는 질환을 총칭하는 용어를 의미하고, 뇌허혈 질환이라고도 하며, 상기 허혈성 뇌혈관 질환은 뇌의 혈류가 감소되어 산소와 포도당의 공급이 정상적으로 이루어지지 않아, 뇌세포 중 뇌허혈에 민감하다고 알려져 있는 조직의 신경세포의 사멸이 유발되어 발생되는 질환을 말하며, 예시로는 허혈성 뇌혈관 질환은 허혈성 뇌졸중 (뇌경색), 혈전증, 색전증, 일과성 허혈발작, 백질이상증 및 소경색 등이 있으며, 바람직하게는 허혈성 뇌졸중일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor, PDE 억제제)”는 다양한 조직 (tissue)에서 발견된 효소이다. 상기 PDE 억제제들은 비선택적 억제제들로부터 발생하는 부작용 없이 선택된 동종효소들의 강력한 억제를 제공하고, PDE-5 억제제들은 원발성 폐 고혈압 (primary pulmonary hypertension)과 발기 부전 (electile dysfunction)의 치료에 사용되는 것으로 알려져 있고, 예시로는 미로데나필 (mirodenafil), 실데나필 (sildenafil), 바르데나필 (vardenafil), 타달라필 (tadalafil), 유데나필 (udenafil), 다산타필 (dasantafil), 아바나필 (avanafil) 등이 있으며, 바람직하게는 실데나필 (sildenafil)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, “ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)”는, 세포사멸 (apoptosis)을 억제하는 기능을 하는 물질로서, 신경돌기의 재생, 미오신 인산화 및 평활근 수축에 있어 작용-유도성 Ca²⁺ 증감 (agonist-induced Ca²⁺ sensitization)의 억제 등의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 보다 구체적으로, ROCK 저해제는 고혈압과 천식을 일으키는 근육 세포의 비정상적 구조를 경감시켜주며 시신경 유두의 혈액 흐름을 증가시키고 안압을 지속적으로 감소시키는 기능이 있는 것으로 보고되고, 예시로는 파수딜 (Fasudil), 리파수딜 (Ripasudil), RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, Y-30141 등이 있으며, 바람직하게는 하기의 화학식 1로 표시되는 GSK429286A (N-(6-Fluoro-1H-indazol-5-yl)-6-methyl-2-oxo-4-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-3,4-dihydro-1H-pyridine-5-carboxamide)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

[화학식 1]

또한 상기 약학적 조성물은 뇌혈관 폐색 후 재관류 전, 재관류와 동시 또는 재관류 후에 투여하기 위한 것일 수 있으며, 바람직하게는 중대뇌동맥 폐색 후 재관류 전, 재관류와 동시 또는 재관류 후에 투여하기 위한 것일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 본 발명에 있어서, “재관류 (reperfusion)”는 장기나 조직에서 혈액의 흐름이 일시적으로 끊어짐으로써 세포가 산소와 영양분의 공급이 끊어진 경우 수술이나 혈전용해제를 사용하여 혈관흐름을 재개시켜 주는 조치를 말한다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에서 급성 뇌졸중 (뇌경색) 동물모델에서 발생한 뇌 손상을 치료하기 위해 실데나필 (포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제) 및 GSK429286A (ROCK 저해제)를 병용 투여한 경우, 뇌졸중으로 인한 직접적인 뇌 손상 (infarction volume)이 상기 실데나필 또는 GSK429286A를 상기 동물모델에 각각 단독 투여한 경우에 비해 유의적으로 감소함을 확인하였다 (실시예 2 참조).

상기 실시예의 결과는 실데나필 또는 GSK429286A를 각각 단독 투여한 경우에 비해 실데나필 (포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제) 및 GSK429286A (ROCK 저해제)의 병용 투여 시 뇌졸중으로 인해 발생한 뇌 손상을 효과적으로 감소시키는 효과를 나타내는 것으로서, 본 발명에 따른 실데나필 및 GSK429286A를 포함하는 약학적 조성물이 뇌졸중의 치료제로써 유용하게 이용될 수 있음을 시사한다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor); 및 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)를 유효성분으로 포함하며, 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제, 또는 경구 섭취제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비 경구투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 피부, 비강, 기도에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있으며, 본 발명에 따른 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 0.001 내지 150 mg, 바람직하게는 0.01 내지 100 mg을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 허혈성 뇌혈관 질환, 바람직하게는 허혈성 뇌졸중의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

한편, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 허혈성 뇌혈관 질환, 바람직하게는 허혈성 뇌졸중의 조절 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 허혈성 뇌혈관 질환, 바람직하게는 허혈성 뇌졸중에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 "개체"란, 질병의 조절 또는 치료방법을 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험재료 및 실험방법

1-1. 실험 동물 (Experimental animals)

수컷 랫트, Sprague-Dawley, 8주령 및 260-280 g의 실험 동물을 사용하였으며, 상기 실험 동물은 순천향대학교 실험 동물 센터 (천안)에서 얻었다. 모든 실험 동물은 특정 온도, 습도 및 조명 조건 하에서 시판 사료 및 물을 임의로 제공하였다 (명암 주기 12:12, 22 ± 2 ℃, 55 ± 5 %). 모든 동물 프로토콜은 순천향대학교 실험실 동물 관리에 대한 행정 패널에 의해 승인되었다 (허가 번호 SCH16-0024). 본 발명과 관련된 실험을 수행함에 있어서, 상기 실험 동물의 고통을 피하고 실험에 사용되는 실험 동물의 수를 최소화하고자 하였다.

1-2. 중대뇌동맥 결찰 (폐색) 모델 생성 방법 (Induction of Middle Cerebral Artery occlusion (MCAo))

랫트는 2 % 이소플루란으로 마취되었고 (2 % isoflurane in mixed gas of oxygen and nitrous oxide, 0.3 : 0.7), 수술 중 가열패드를 사용하여 체온을 37 ℃로 유지하였다.

모든 마이크로 폴셉 (micro-forceps)은 소독하였다. 4-0 모노필라멘트 (Nylon suture, Medtronic plc.)의 팁은 치과용 실리콘으로 0.37±0.02 mm의 두께로 코팅하고 필라멘트 조각은 0.01 % (w/v) 폴리-L-라이신 (Sigma, USA)으로 코팅하였다.

상기 모노필라멘트를 좌측 총경동맥 (common carotid artery, CCA)에 삽입하고 18mm 지점에서 내부 경동맥 (internal carotid artery, ICA)을 향해 진행하여 중대뇌동맥 (Middle Cerebral Artery MCA)의 기시부를 막았다.

　그 다음으로, 레이저 도플러 프로브 (laser Doppler probe, Millwey, Axminste, UK)를 정수리 뼈에 고정시켜 수술 중 중대뇌동맥에 의해 공급된 국소 피질 혈류를 측정하였으며, 기준 국소 피질 혈류에서 20 % 감소한 경우 폐색이 성공된 것으로 간주하였다.

그 다음으로, 좌측 중대뇌동맥 폐색에 의해 30분 동안 일시적인 국소 허혈이 유도되었다. 허혈이 발생하고 30분 경과 후, 랫트는 마취로부터 회복되었고, 중대뇌동맥은 일시적 허혈로부터 재관류되었다.

중대뇌동맥 결찰 (폐색)의 유도를 검증하기 위해, 수술 후 모든 랫트는 하기의 행동이 가능한지 확인하였다:

① 반대쪽 앞다리를 뻗을 수 없음

② 신경학적 결손 후 경색이 발생한 쪽의 반대 방향으로 도는 행동 (circling toward contralateral to infarct)을 할 수 없음

상기 중대뇌동맥 결찰 (폐색)의 유도모델에 본 발명에 따른 약학적 조성물을 적용하고, 지정된 시간 코스에서 여러 행동 테스트 (behavior test), 전기 생리학 (electrophysiology), 면역 조직 화학 (immunohisto- chemistry) 실험을 하는데 에 사용하였다.

상기 행동 테스트 등에 대한 경험이 없는 중대뇌동맥 결찰 (폐색)의 유도모델 및 주령이 일치하는 정상 랫트를 대조군으로 사용하였다.

1-3. 실험 약물 처리 (Drug treatment)

본 발명자들은 ⅰ) Sildenafil citrate, ⅱ) GSK429286A 및 ⅲ) Sildenafil citrate 및 GSK429286A를 각각 실험 동물에 적용하여 경미한 허혈성 뇌졸중으로 발생한 직접적인 뇌손상 또는 다양한 표현형 후유증에 대해 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor) 및/또는 ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)이 미치는 영향을 평가하였다.

보다 구체적으로, 중대뇌동맥 폐색 후 재관류 30분 전 및 중대뇌동맥 폐색 후 재관류 30분 후에 하기의 실험 약물을 각각 복강 내 투여하였다.

ⅰ) Sildenafil citrate (20mg/kg/saline, Hanmi Parm. Co., Republic of Korea)

ⅱ) GSK429286A (10mg/kg/DMSO, Sigma, USA)

ⅲ) Sildenafil citrate (20mg/kg/saline) 및 GSK429286A (10mg/kg/DMSO)

1-4. Infarction volume 측정

경증 허혈성 뇌졸중 발병 후 뇌경색 크기를 측정하기 위해, 실험 동물의 머리를 자르고 뇌를 꺼내어 4 ℃에서 냉각시켜 조직을 경화시켰다.

또한 후각 전구로부터 소뇌 (olfactory bulb to cerebellum)까지 6개 또는 7개의 관상면 (coronal section), 2mm의 뇌 절편 (brain slice)을 만들었다.

그 다음으로, 상기 각 관상 섹션 뇌 절편을 실온에서 2 % TTC 용액에 20분 동안 침지시켰다.

마지막으로, TTC 염색된 관상 섹션 뇌 절편은 모델 DP72 디지털 카메라 및 DP2-BSW 현미경 디지털 카메라 소프트웨어 (Olympus, Japan)를 사용하여 이미지를 생성하였고, 이미지 분석 소프트웨어 (ImageJ, NIH, USA)를 사용하여 각 뇌 절편의 허혈성 뇌 손상의 면적을 측정하였다. TTC 염색은 뇌경색 구역의 코어 영역을 구분하는데, 분홍색의 손상된 뇌 조직은 허혈 반음 (penumbra)으로 구분되며 이는 경색 코어 영역의 주변부에 위치하고, 붉은 색은 손상되지 않은 정상 뇌 조직으로 구분된다.

총 뇌경색 부피는 코어와 허혈 반음의 합이며, 손상된 부피는 반구 부피의 평균 백분율로 계산하고 이전 연구 결과를 참조해 부종 부피를 조정하였다. 실험 결과는 상이한 동물 그룹에 대한 평균 SEM으로 제공하였으며, Bonferroni의 시험 (Bonferroni's test)에 의해 p-값 <0.01 또는 <0.05가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

실시예 2. 실데나필 및 ROCK 저해제의 병용 투여 시 뇌졸중 후 뇌 조직의 손상 정도의 확인

급성기 뇌졸중 (뇌경색) 모델인 MCAo30을 사용하여, ⅰ) 실데나필 또는 ROCK 저해제 단독 투여, ⅱ) 실데나필 및 ROCK 저해제를 병용 투여한 경우에서 뇌졸중 발병으로 인한 직접적인 뇌 조직의 손상 정도를 확인하는 실험을 수행하였다. 상기 실험은 1-4에 기재된 방법에 기초하여 수행하였다.

그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 급성기 뇌졸중 (뇌경색) 모델인 MCAo30 (뇌졸중 범위 100% 기준)과 비교해 실데나필 단독 투여군은 뇌졸중 발병 후 뇌 조직의 손상이 26.71 %로 감소하였으며, ROCK 저해제 단독 투여군은 뇌졸중 발병 후 뇌 조직의 손상이 21.28 %로 감소함을 확인하였다.

또한 실데나필 및 ROCK 저해제의 병용 투여군은 중대뇌동맥 폐색 후 재관류 전/후 투여군 모두에서, 상기 각 단독 투여군과 대비 시 뇌졸중으로 인한 뇌 조직의 손상 크기가 크게 감소함을 확인하였다 (4.5%).

상기 실험 결과를 수치로 대비하면, 실데나필 및 ROCK 저해제의 병용 요법의 중대뇌동맥 폐색 후 재관류 전 투여군은, 뇌졸중으로 인한 뇌 조직의 손상 크기에 있어서 실데나필 단독 투여군에 비해 6배 정도 우수한 『뇌 조직 손상의 감소 효과』를 나타내고, ROCK 저해제 단독 투여군에 비해 4.8배 정도 우수한 『뇌 조직 손상의 감소 효과』를 나타냄을 확인할 수 있다.

또한 상기 실험결과를 종합할 때, 뇌졸중 발병 후 실데나필 및 ROCK 저해제의 병용 요법을 시행하는 경우 뇌졸중으로 인한 직접적인 뇌 조직 손상의 감소 효과가 극대화될 뿐만 아니라 실데나필 또는 ROCK 저해제 각각의 단독 요법과 대비 시 뇌 조직 손상의 감소에 있어서 시너지 효과가 나타남을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제 (phosphodiesterase type 5 inhibitor); 및
ROCK 저해제 (Rho-associasted kinase inhibitor)를 포함하는, 허혈성 뇌혈관 질환의 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 허혈성 뇌혈관 질환은 허혈성 뇌졸중 (뇌경색), 혈전증, 색전증, 일과성 허혈발작, 백질이상증 및 소경색으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 포스포디에스테라제 타입 5 활성 저해제는 미로데나필 (mirodenafil), 실데나필 (sildenafil), 바르데나필 (vardenafil), 타달라필 (tadalafil), 유데나필 (udenafil), 다산타필 (dasantafil), 아바나필 (avanafil) 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 수화물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ROCK 저해제는 파수딜 (Fasudil), 리파수딜 (Ripasudil), RKI-1447, Y-27632, GSK429286A, Y-30141 및 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 용매화물 및 수화물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 뇌혈관 폐색 후 재관류 전, 재관류와 동시 또는 재관류 후에 투여하기 위한 것인, 약학적 조성물.