KR20210057704A - Epac 억제제로서의 티에노[2,3-b]피리딘 유도체 및 이들의 약학적 용도 - Google Patents

Epac 억제제로서의 티에노[2,3-b]피리딘 유도체 및 이들의 약학적 용도 Download PDF

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안토니오 콜루챠
마히옹 라우데뜨
프랭크 르저알크
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유니베르시떼 파리-싸끌레
사피엔자 유니버시타 디 로마
위니베르씨떼 뽈 싸바띠에 뚤루즈 3
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Abstract

본 발명은 염증, 암, 혈관 질병, 신장 질병, 인지 장애, 통증, 감염, 비만 및 심장 질병으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 티에노[2,3-b]피리딘 유도체에 관한 것이다. 실제로, 본 발명자들은 본 발명의 티에노[2,3-b]피리딘 유도체가 Epac 단백질의 억제제이고, 따라서 Epac 단백질이 관련된 질병의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있음을 발견하였다. 특히, 본 발명자들은 본 발명의 티에노[2,3-b]피리딘 유도체가 Epac의 강력하고 비-경쟁적인 억제제임을 보여주며, 세포에서 Rap1과 같은 Epac 다운스트림 효과기의 활성화도 억제함을 입증하였다.

Description

EPAC 억제제로서의 티에노[2,3-B]피리딘 유도체 및 이들의 약학적 용도
본 발명은 Epac 억제제로서 유용한 티에노[2,3-b]피리딘 유도체 및 이들의 약학적 용도에 관한 것이다.
2차 메신저 사이클릭 AMP(cAMP)는 세포 성장, 투과성 및 염증을 포함한 다양한 생리학적 과정을 조절한다. cAMP의 주요 세포내 기능은 단백질 키나아제 A(PKA)에 의해 및 최근에 확인된 cAMP-결합 단백질인 cAMP에 의해 직접 활성화된 교환 단백질(Exchange Proteins directly Activated by cAMP)(이하 Epac으로 명명됨)에 의해 형질도입된다.
단백질 Epac의 두 개의 동형 단백질, 즉 Epac1 및 Epac2가 있다. 두 단백질 모두 저분자량 G 단백질인 Rap1 및 Rap2에 대한 구아닌-뉴클레오타이드 교환 인자(GEF)로서 작용하며, PKA-독립적인 방식으로 기능한다. Epac의 두 동형 단백질은 Epac1이 단일 사이클릭 뉴클레오타이드-결합(CNB, cyclic nucleotide-binding) 도메인을 가지고 있는 반면, Epac2에는 DEP 도메인(Dishevelled, Egl-10 및 Pleckstrin 도메인)의 양 측면 상에 위치된, CNB-A 및 CNB-B라 불리는 두 개의 CNB 도메인을 가진다는 점에서 다르다.
Epac은 염증, 암, 혈관 질환, 신장 질환, 인지 장애, 통증, 감염, 비만 및 심장 질환과 같은 질병과 연관된 다양한 생리적 과정을 조절한다.
따라서, 신규한 Epac 억제제를 제공할 필요가 있다. 특히, 더 강력하고/거나 더 선택적인 Epac 억제제에 대한 필요가 있다. 또한 염증, 암, 혈관 질환, 신장 질환, 인지 장애, 통증, 감염, 비만 및 심장 질환과 같은 Epac이 관여된 질병의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있는 Epac 억제제를 제공할 필요가 있다.
본 발명의 목적은 신규한 Epac 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 화합물 CE3F4 또는 8-CPT-N6-페닐-cAMP(8-CPT-N6 또는 8-(4-클로로페닐티오)-N6-페닐아데노신-3',5'-사이클릭 모노포스페이트)와 같은 Epac 억제제인, 시험관 내에서(in vitro) 알려진 것보다 생체 내에서(in vivo) 더 강력한, 신규한 Epac 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Epac 다운스트림 효과기(effector)의 활성화, 특히 Epac1-유도 Rap1 활성화를 방지하는 신규한 Epac 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 선택성이 Epac1 촉매 활성을 억제하는 신규한 Epac 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 염증, 암, 혈관 질환, 신장 질환, 인지 장애, 통증, 감염, 비만 및 심장 질환의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있는 신규한 Epac 억제제를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식 (I)을 갖는 화합물에 관한 것이고:
Figure pct00001
상기 식에서,
R1은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
- H;
- (C2-C20)알킬;
- (C3-C10)사이클로알킬;
- 3-10원 헤테로사이클로알킬;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴 기는 선택적으로 치환되고;
R2는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
- H;
- (C1-C20)알킬;
- (C3-C10)사이클로알킬;
- 3-10원 헤테로사이클로알킬;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되고;
R3은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
- H;
- (C3-C10)사이클로알킬;
- 3-10원 헤테로사이클로알킬;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
여기서, 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되고; 및
R4는 H,-OH,-NRxRy 및-C(O)ORz로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고;
Rx, Ry 및 Rz는 서로 독립적으로 H 또는 (C1-C10)알킬이고;
또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 수화된 염 또는 그의 다형성 결정 구조, 라세미체, 부분입체 이성질체 또는 거울상 이성질체에 관한 것이고,
Epac 단백질이 포함되는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
본 명세서에 기재되어 있음.
도 1: BRET 분석. AM-001, (R)-CE3F4(20μM) 또는 비히클은 cAMP(100μM)를 첨가하기 전에 세포 추출물에 첨가되었으며, BRET 비율(3개 웰의 평균±SEM)이 측정되고 비-억제제 대조군 값에 대한 BRET 비율에서 퍼센트 변이로 그래프에 표시되었다.
도 2 및 3: BRET 비율은 증가하는 농도의 AM-001 또는 cAMP 존재하에 3회 측정되었다. 데이터는 cAMP(도 2) 또는 AM-001(도 3) 농도의 함수로 그래프에 표시되었다. 각 조건에서 얻은 곡선은 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)을 사용하여 분석되어 최대 BRET 비율 반응을 산출하였다(비-억제제 대조군 값에 대한 BRET 비율의 퍼센트 변이로 표현됨). 보고된 값은 평균±S.E.M이다(3회, 일부 오류 막대는 기호로 마스킹된다. ****p<0.0001 대 비히클).
도 2에서, 곡선 a는 AM-001의 부재에 해당하고, 곡선 b는 2μM의 AM-001 농도에 해당하고, 곡선 c는 5μM의 AM-001 농도에 해당하고, 곡선 d는 10μM의 AM-001에 해당하고, 곡선 e는 20μM의 AM-001 농도에 해당하고, 곡선 f는 30μM의 AM-001 농도에 해당하고, 곡선 g는 60μM의 AM-001 농도에 해당한다.
도 3에서, 곡선 a는 1,000μM의 cAMP 농도에 해당하고, 곡선 b는 300μM의 cAMP 농도에 해당하고, 곡선 c는 100μM의 cAMP 농도에 해당하고, 곡선 d는 30μM의 cAMP 농도에 해당하고, 곡선 e는 10μM의 cAMP 농도에 해당하고, 곡선 f는 3μM의 cAMP 농도에 해당하고 곡선 g는 1μM의 cAMP 농도에 해당한다.
도 4-8. Epac1(도 4) 및 Epac2(도 6) 활성은 부재(■) 또는 30μM Sp-8-CPT의 존재에서 단독(●) 또는 20μM (R)-CE3F4(△) 또는 20μM AM-001(◇)와 함께 측정되었다. RFU(상대 형광 단위)의 변이는 시간의 함수로 연구되고 단일 지수에 정합하였다. 보고된 값은 평균±SEM이다(3회, 일부 오류 막대는 기호로 가려짐)(도 5 및 7). 결과는 억제제가 없는 상태에서 측정된 대조군 값에 대한 Epac-촉매화된 GDP 교환의 초기 속도로 표현되었고, 이는 100%로 설정되었다(도 8). Epac1(●) 및 Epac2B(□)에 의해 유도된 뉴클레오타이드 교환의 초기 속도는 포화 농도의 Sp-8-CPT(50μM) 및 증가하는 농도의 AM-001의 존재하에서 3회 측정되었다. 결과는 시간 코스 연구에서 AM-001이 없을 때 측정된 GDP 교환의 초기 속도의 %로 표시되며 평균±SEM으로 표시된다(일부 오류 막대는 기호로 가려짐). **p<0.01, ****p<0.0001 대 대조군 값 또는 표시된 값.
도 9-13. Rap1-GTP의 양(각 그룹에서 n=5, 평균±S.E.M)은 Epac1(도 9-11), Epac2A(도 12) 또는 Epac2B(도 13)로 형질감염된 HEK293 세포에서 결정되었다. 세포는 AM-001(도 9, 12 및 13), AM-002(도 10) 또는 AM-003(도 11)(20μM, 30분)으로 사전배양되거나 그렇지 않았고, 이어서 10분 동안 8-CPT-AM(Epac1 활성화를 위한 10μM 및 Epac2A 활성화를 위한 20μM) 또는 S-220(Epac2B 활성화를 위한 50μM)로 처리되거나 그렇지 않았다. ESI-05는 Epac2A 억제의 양성 대조군으로 사용되었다. 대표적인 면역블롯이 표시된다. *p<0.01, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001, 대 표시된 값, 일방향 ANOVA, 본페로니(Bonferroni) 비교 테스트.
도 14: 단리된 성인 심근세포는 AM-001(20μM, 30분)으로 사전처리되거나 되지 않고, 8-CPT-AM(10μM, 30분)으로 자극되거나 되지 않고, 정상산소증(NX) 또는 저산소증-재산소화(HX+R) 처리를 실시하였다. 세포 생존력은 NX 또는 HX+R 조건(n=6)에서 락테이트 탈수소효소(LDH) 방출에 의해 결정되었다.
도 15-16: 좌심실 크기의 백분율로 표시되는 위험 영역(AAR) 및 AAR의 백분율로 표시되는 경색 크기의 정량화. AM-001(도 15) 또는 R-CE3F4(도 16)로 사전처리되거나 되지 않은 마우스의 에반스 블루 및 TTC로 염색된 대표적인 단면이 도시된다. 통계적 유의성은 양방향 ANOVA에 이어 본페로니(Bonferroni) 사후 테스트 또는 t-테스트에 의해 결정되었다. *p<0.01, **p<0.01, ***p<0.001, 대 표시된 값.
도 17: 지시된 조건 하에서 처리된 마우스의 혈청에서 AST 및 ALT 활성(왼쪽 패널)(그룹당 n=7). AM-001의 존재 또는 부재하에 1일과 14일 사이에 동물에서 FS의 비교(오른쪽 패널)(그룹당 n=12).
도 18: 비히클 또는 AM-001로 처리한 14일 후 마우스의 LVW/TL 비율.
도 19: 막대 그래프는 섬유증의 정량화를 보여준다(그룹당 n=6-8).
도 20: AM-001의 존재 또는 부재하에서 1일과 14일 사이에 ISO 처리된 동물에서 FS, LVIDs 및 LVIDd의 비교(그룹당 n=18-20).
도 21: Epac1, GRK2 및 GRK5의 대표적인 면역블롯. 통계적 유의성은 양방향 ANOVA에 이어 본페로니(Bonferroni) 사후 테스트에 의해 결정되었다. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 vs 표시된 값. ns, 유의하지 않다(not significant).
본 발명자들은 놀랍게도 티에노[2,3-b]피리딘 유도체가 Epac 단백질을 억제한다는 것을 발견하였다. 이 억제는 Epac-유도된 Rap1 활성화의 억제를 야기한다. 본 발명자들은 또한 놀랍게도 티에노[2,3-b]피리딘 유도체가 cAMP 및 Epac 작용제의 비-경쟁적 억제제임을 발견하였다.
한 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 선택적 Epac 억제제이다. 선택적 Epac 억제제는 Epac 단백질에 대한 억제 효과를 나타내고 다른 단백질에 대해 온건한 억제 효과를 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않는 화합물일 수 있다. 한 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 비-경쟁적 억제제이다. 한 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 단백질 키나아제 A(PKA라고도 함)를 억제하지 않는다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물에 의한 Epac의 억제는 상기 화합물의 농도-의존적이다.
한 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 Epac1 억제제이다. 또 다른 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 Epac1 선택적 억제제이다. 한 실시양태에서, Epac1 선택적 억제제는 Epac1 동형 단백질에 대해 억제 효과를 나타내는 화합물이다. 보다 구체적으로, 이들은 일반적으로 Epac1에 대한 억제 효과를 나타내고 Epac2 동형 단백질에 대한 온건한 억제 효과를 나타내거나 또는 전혀 나타내지 않는다. 용어 "선택적 Epac1 억제제"는 다른 동형 단백질인 Epac2보다 우선적으로 특정 Epac1 동형 단백질에 영향을 미치는 Epac1 억제제의 능력으로 이해될 수 있다. Epac1 선택적 억제제는 두 Epac 동형 단백질을 구별하는 능력을 가질 수 있고, 본질적으로 Epac1 동형 단백질에 영향을 미친다.
용어 "CE3F4"는 다음 화학식을 갖는 화합물을 의미한다:
Figure pct00002
또는
Figure pct00003
.
용어 "(C1-C20)알킬" 또는 "(C2-C20)알킬"은 사슬에 각각 1 내지 20개의 탄소 원자 또는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가진 직쇄형 또는 분지형일 수 있는 포화 또는 불포화 지방족 탄화수소기를 의미한다. 바람직한 알킬기는 사슬에 1 내지 5개의 탄소 원자를 가지며, 바람직한 알킬기는 특히 메틸기 또는 에틸기이다. 용어 "분지형"은 선형 알킬 사슬에 메틸, 에틸 또는 프로필과 같은 하나의 알킬기 또는 저급 알킬기가 부착되어 있음을 의미한다. 알킬기는 치환될 수 있다.
용어 "(C3-C10)사이클로알킬"은 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 포화 탄화수소기를 의미하며, 여기서, 치환 가능한 임의의 탄소 원자는 치환기로 치환 될 수 있다. 특히 사이클로알킬기는 사이클로프로필 또는 사이클로헥실기이다.
용어 "3-10원 헤테로사이클로알킬"은 3 내지 10개의 탄소 원자를 갖는 사이클릭 포화 탄화수소기를 의미하며, 여기서, 하나 이상의 탄소 원자는 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자; 예를 들어, 1개 또는 2개의 질소 원자, 1개 또는 2개의 산소 원자, 1개 또는 2개의 황 원자 또는 1개의 질소 원자 및 1개의 산소 원자와 같은 상이한 헤테로 원자의 조합과 같은 하나 이상의 헤테로 원자로 대체된다. 치환 가능한 고리 원자는 치환기로 치환될 수 있다. 바람직한 3-10원 헤테로사이클로알킬은 퓨란, 티오펜, 피롤 또는 피라졸과 같은 질소 고리 또는 플루오로페닐 고리이다.
용어 "(C6-C10)아릴"은 방향족 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트라이사이클릭 탄화수소 고리 시스템을 지칭하고, 여기서, 치환 가능한 임의의 고리 원자가 치환기에 의해 치환될 수 있다. 아릴 모이어티의 예는 페닐을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "5-10원 헤테로아릴"은 방향족 모노사이클릭, 바이사이클릭 또는 트라이사이클릭 탄화수소 고리 시스템을 지칭하며, 여기서, 치환 가능한 임의의 고리 원자는 치환기로 치환될 수 있으며, 및 여기서, 하나 이상의 탄소 원자는 질소 원자, 산소 원자 및 황 원자와 같은 하나 이상의 헤테로 원자; 예를 들어, 1개 또는 2개의 질소 원자, 1개 또는 2개의 산소 원자, 1개 또는 2개의 황 원자 또는 1개의 질소 원자 및 1개의 산소 원자와 같은 상이한 헤테로 원자의 조합에 의해 대체된다. 바람직한 헤테로아릴기는 티에닐, 피리딜, 피리미딜 및 옥사질기이고, 보다 바람직하게는 티에닐기이다.
용어 "할로겐"은 주기율표의 17족 원자를 지칭하고, 특히 불소, 염소, 브롬 및 요오드 원자, 더욱 바람직하게는 불소, 염소 및 브롬 원자, 예를 들어 불소를 포함한다.
용어 "선택적으로 치환된"이란, 본 발명의 화합물의 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기가 -OH, 할로겐 원자, -C(O)OH, -(C1-C10)알킬, -(C1-C10)알콕시, 및 -NR7R8 기(여기서, R7 및 R8은 서로 독립적으로 (C1-C10) 또는 H에서 선택됨)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환되는 것을 의미할 수 있다.
바람직하게는, 상기 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해, 더욱 바람직하게는 불소 원자에 의해 선택적으로 치환된다.
용어 "티에노[2,3-b]피리딘 유도체"는 다음 화학 구조로부터 유래된 화합물을 지칭한다:
Figure pct00004
.
본 명세서에 기재된 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있다. 비대칭으로 치환된 원자를 함유하는 본 발명의 화합물은 광학 활성 형태 또는 라세미체 형태로 단리될 수 있다. 예컨대 라세미체 형태의 분리(resoulution)에 의해 또는 광학 활성 출발 물질로부터 합성에 의해, 광학 활성 형태를 제조하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 입체화학 또는 이성질체 형태가 구체적으로 지시되지 않는 한, 화합물의 모든 키랄, 부분입체 이성질체, 라세미체 형태 및 모든 기하학적 이성질체 형태가 의도된다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않지 않은 염을 지칭한다. 약학적으로 허용가능한 산 부가 염은 무기 및 유기 산으로 제조될 수 있는 반면, 약학적으로 허용가능한 염기 부가 염은 무기 및 유기 염기로 제조될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염에 대한 검토는 Berge 등의 논문 [(1977) J. Pharm. Sd, vol. 66, 1]을 참고한다. 예를 들어, 염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 설팜산, 인산, 질산 등과 같은 무기 산으로 유도된 것뿐만 아니라 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 젖산, 말산, 타르타르산, 구연산, 아스코르브산, 팜산, 말레산, 하이드록시말레산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 설파닐산, 푸마르산, 메탄설폰산 및 톨루엔설폰산 등과 같은 유기 산으로 제조된 염을 포함한다.
용어 "Epac 단백질이 관여되는 질병"은 Epac 단백질이 발현되거나 과다-발현되고/거나 돌연변이되는 질병을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 상태의 진행, 또는 이러한 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상을 역전, 완화, 억제하는 것을 의미한다.
본 발명의 맥락에서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는" 또는 "예방"은 이러한 용어가 적용되는 장애 또는 상태의 출현 또는 진행, 또는 이러한 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상을 피하는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 하기 화학식 (I)을 갖는 화합물에 관한 것이고:
Figure pct00005
상기 식에서,
R1은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
- (C2-C20)알킬;
- (C3-C10)사이클로알킬;
- 3-10원 헤테로사이클로알킬;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되고;
R2는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
- H;
- (C1-C20)알킬;
- (C3-C10)사이클로알킬;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되고;
R3은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
- H;
- (C3-C10)사이클로알킬;
- 3-10원 헤테로사이클로알킬;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
여기서, 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되고; 및
R4는 H, -OH, -NRxRy 및 -C(O)ORz로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고;
Rx, Ry 및 Rz는 서로 독립적으로 H 또는 (C1-C10)알킬이고;
또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 수화된 염 또는 그의 다형성 결정 구조, 라세미체, 부분입체 이성질체 또는 거울상 이성질체에 관한 것이고,
심장 비대, 심장 부정맥, 판막병증, 확장기 기능장애, 만성 심부전, 허혈성 심부전, 심근 허혈, 재관류 손상, 심근염, 비대성 및 확장성 심근병증으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 심장 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이다.
한 실시양태에 따르면, R3은 다음으로 이루어지는 그룹에서 선택된다:
- (C3-C10)사이클로알킬;
- 3-10원 헤테로사이클로알킬;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
여기서, 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환된다.
일반적인 화학식 (I)의 화합물
한 실시양태에 따르면, R3은 다음으로 이루어지는 그룹에서 선택된다:
- (C3-C10)사이클로알킬;
- 3-10원 헤테로사이클로알킬;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
여기서, 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환된다.
한 특정 실시양태에서, R3은, 하나 이상의 치환기에 의해, 바람직하게는 (C1-C10)알킬 및 할로겐 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 (C6-C10)아릴이다. 한 실시양태에서, R3은 H, 또는 (C1-C10)알킬 및 할로겐 원자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된 (C6-C10)아릴이다. 한 특정 실시양태에서, R3은 H, 또는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 선택적으로 치환된 페닐이다. 한 특정 실시양태에서, R3은 바람직하게 하나 이상의 할로겐 원자에 의해 선택적으로 치환된 페닐이다.
또 다른 실시양태에서, R1은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다:
- H;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
여기서, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 (C1-C10)알킬, 할로겐 원자 및 -NR7R8 기로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환되고; 여기서, R7 및 R8은 서로 독립적으로 (C1-C10)알킬 또는 H로부터 선택된다.
바람직하게, R1은 H, 또는 하나 이상의 치환기에 의해, 예를 들어, (C1-C10)알킬, 할로겐 원자 및 -NR7R8 기로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 치환기에 의해 선택적으로 치환된 (C6-C10)아릴이고, 여기서, R7 및 R8은 서로 독립적으로 (C1-C10)알킬 또는 H로부터 선택된다. 한 특정 실시양태에서, R1은 H, 또는 하나 이상의 할로겐 원자에 의해, 예를 들어, 바람직하게 파라 위치인 하나의 불소 원자에 의해 선택적으로 치환된 페닐이다.
또 다른 실시양태에서, R1은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다:
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
여기서, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 (C1-C10)알킬, 할로겐 원자 및 -NR7R8기로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환되고; 여기서, R7 및 R8은 서로 독립적으로 (C1-C10)알킬 또는 H로부터 선택된다.
바람직하게는, R1은 하나 이상의 치환기에 의해, 예를 들어 (C1-C10)알킬, 할로겐 원자 및 -NR7R8기로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 치환기에 의해, 선택적으로 치환된 (C6-C10)아릴이고; 여기서, R7 및 R8은 서로 독립적으로 (C1-C10)알킬 또는 H로부터 선택된다. 한 특정 실시양태에서, R1은 하나 이상의 할로겐 원자에 의해, 예를 들어, 바람직하게 파라 위치인, 하나의 불소 원자에 의해 선택적으로 치환된 페닐이다.
한 실시양태에서, R2는 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다:
- H;
- (C1-C20)알킬;
- (C6-C10)아릴; 및
- 5-10원 헤테로아릴;
또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 (C1-C10)알킬 및 할로겐 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된다.
한 특정 실시양태에서, R2는 (C1-C10)알킬, 및 5-6원 헤테로아릴기로 이루어지는 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C6)사이클로알킬기를 형성하고; 여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 및 헤테로아릴기는 바람직하게 (C1-C10)알킬 및 할로겐 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된다.
한 특정 실시양태에서, R2는 5-6원 헤테로아릴기로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고, 상기 헤테로아릴기는 바람직하게는 (C1-C10)알킬 및 할로겐 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기에 의해 선택적으로 치환된다. 특정 실시양태에서, R2는 티에닐기이다.
한 특정 실시양태에서, R2는 (C1-C10)알킬 및 티에닐 고리로 이루어지는 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 사이클로헥실기와 같은 (C5-C6)사이클로알킬기를 형성한다.
한 실시양태에서, R4는 H, -OH, -NH2 및 -C(O)OH로 이루어지는 그룹으로부터 선택되거나, 또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성한다. 한 실시양태에서, R4는 H이거나, 또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C5-C6)사이클로알킬기를 형성한다. 바람직하게, R4는 H이다.
특정 실시양태에서, R1은 페닐기이고/거나, R2는 티에닐기이고, 상기 페닐 및 티에닐기는 선택적으로 치환된다. 한 실시양태에서, R1 및 R2 중 적어도 하나는 (C6-C10)아릴기 또는 5-10원 헤테로아릴기이다.
바람직하게, 상기 화학식 (I)에서, R1은 (C2-C20)알킬; (C3-C10)사이클로알킬; 3-10원 헤테로사이클로알킬; (C6-C10)아릴; 및 5-10원 헤테로아릴로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고; 여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되고; 및
R2는 H; (C1-C20)알킬; (C3-C10)사이클로알킬; (C6-C10)아릴; 및 5-10원 헤테로아릴로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고;
또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환된다.
한 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 (II)를 특징으로 한다:
Figure pct00006
상기 식에서, Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rx, Ry 및 Rz는 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다:
H, -OH, 할로겐 원자, -C(O)OH, (C1-C10)알킬, (C1-C10)알콕시 및 -NR5R6,
여기서, R5 및 R6은 서로 독립적으로 (C1-C10)알킬 또는 H로부터 선택되고;
R4는 H, -OH, -NH2 및 -C(O)OH로 이루어지는 그룹으로부터 선택되며; 및
R3은 위에 정의된 것과 같다.
한 특정 실시양태에서, Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rx, Ry 및 Rz는 H, 할로겐 원자 또는 (C1-C10)알킬 중에서 선택된다. 한 실시양태에서, Rx, Ry 및 Rz는 H이고/거나, Ra, Rb, Rd 및 Re는 H이다. 바람직하게, Rc는 H 또는 할로겐 원자, 예를 들어 불소 원자이다.
한 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 다음 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure pct00007
바람직하게, 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00008
본 발명은 또한 이러한 화학식 (I)의 화합물에 관한 것이다.
약학적 조성물 및 용도
본 발명은 또한 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 상기 정의된 바와 같은 용도를 위한 화학식 (I)을 갖는 화합물을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 용도를 위한 화학식 (I)을 갖는 화합물을 포함하는 약물에 관한 것이다.
화학식 (I)을 갖는 화합물은 단독으로 투여되는 것이 가능하지만, 이를 약학적 조성물로 제시하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라 유용한 수의 및 인간 사용을 위한 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체 및 가능하게는 다른 치료 성분과 함께, 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)을 갖는 하나 이상의 화합물을 포함한다.
특정 바람직한 실시양태에서, 병용 요법에 필요한 활성 성분은 동시 투여를 위해 단일 약학적 조성물로 조합될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용되는" 및 그의 문법적 변형은, 조성물, 담체, 희석제 및 시약을 지칭할 때, 상호교환적으로 사용되며 물질이 메스꺼움, 현기증, 위장 장애 등과 같은 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생성 없이 포유동물에게 또는 포유동물상에 투여될 수 있음을 나타낸다.
그 내부에 용해 또는 분산된 활성 성분을 함유하는 약학적 조성물의 제조는 당업계에 잘 알려져 있으며 제형에 기반하여 제한될 필요는 없다. 전형적으로 그러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 형태로 제조되지만, 사용 전에 액체에서 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 특히, 약학적 조성물은 고체 투여 형태, 예를 들어 캡슐, 정제, 환약, 분말, 당의정 또는 과립으로 제형화될 수 있다.
비히클의 선택 및 비히클에서 활성 물질의 함량은 일반적으로 활성 화합물의 용해도 및 화학적 특성, 특정 투여 방식 및 약학적 관행에서 관찰되는 규정에 따라 결정된다. 예를 들어, 락토스, 시트르산 나트륨, 탄산 칼슘, 인산 이칼슘과 같은 부형제, 및 전분, 알긴산 및 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 라우릴 설페이트 및 활석과 같은 윤활제와 결합된 특정 복합 규산염과 같은 붕해제가 정제를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 캡슐을 제조하기 위해, 유당과 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이 유리하다. 수성 현탁액이 사용되는 경우, 이는 유화제 또는 현탁액을 촉진하는 시약을 포함할 수 있다. 수크로스, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 클로로포름 또는 이들의 혼합물과 같은 희석제가 또한 사용될 수 있다.
약학적 조성물은 경구, 직장, 비강, 협측, 안구, 설하, 경피, 직장, 국소, 질, 비경구(피하, 동맥내, 근육내, 정맥내, 피부내, 척수강내 및 경막외를 포함함), 갑골내 및 복강내를 포함하는, 국소적 또는 전신 투여에 의해 인간 또는 동물에게 적합한 제형으로 투여될 수 있다. 바람직한 경로는 예를 들어 수령인의 상태에 따라 달라질 수 있음이 이해될 것이다.
제형은 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 단위 투여 형태로 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 성분을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로 제형은 활성 성분을 액체 담체 또는 미분 고체 담체 또는 둘 모두와 균일하고 밀접하게 결합시킨 다음, 필요한 경우 제품을 성형함으로써 제조된다.
본 발명은 염증, 암(흑색종, 유방암, 난소암, 자궁 경부암, 결장암, 폐암, 췌장암 및 위암 및 섬유육종), 혈관 질환, 신장 질환, 인지 장애, 만성 통증, 세균 및 바이러스 감염, 비만, 폐(COPD, 기도 섬유증) 및 심장 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 상기 정의된 화학식 (I)을 갖는 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 염증, 암, 혈관 질환, 신장 질환, 인지 장애, 통증, 감염, 비만 및 심장 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조를 위한 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)을 갖는 화합물의 용도에 관한 것이다.
한 실시양태에서, 심장 질환은 심장 비대, 심장 부정맥, 판막병증, 확장기 기능장애, 만성 심부전, 허혈성 심부전, 심근 허혈, 재관류 손상, 심근염, 비대성, 확장성 및 당뇨병성 심근병증으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 한 특정 실시양태에서, 상기 심장 질환은 비대, 심근 허혈 및 재관류 손상으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 한 특정 실시양태에서, 상기 심장 질환은 비대, 심근 허혈 및 재관류 손상으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다.
용어 "염증"은 인체가 공격성에 대해 스스로를 방어하고 피부의 통증, 부기, 열 또는 발적과 같은 다양한 증상으로 나타날 수 있는 현상을 의미한다.
용어 "암"은 고형 종양 및/또는 파종성 혈액암 및/또는 이들의 전이를 의미한다. 용어 "전이" 또는 "전이성 질환"은 다른 국소화로 이동한 1차 종양의 세포에 의해 형성되는 2차 종양을 지칭한다. 용어 "혈액암"은 혈액, 골수 및 림프절에 영향을 미치는 골수종, 림프종 또는 백혈병과 같은 암 유형을 의미한다. 특히, 용어 "암"은 유방암, 난소암, 자궁 경부암, 결장암, 폐암, 췌장암, 위암 및 췌장암, 흑색종 및 섬유육종을 지칭한다.
용어 "혈관 질환"은 죽종형성, 죽상동맥경화증 및 혈관성형후 재협착을 의미할 수 있다.
용어 "신장 질환"은 다낭성 신장 질환뿐만 아니라 당뇨병성 신병증과 같은 신세뇨관 간질의 병리를 의미할 수 있다.
인지 장애는 주로 학습, 기억, 지각 및 문제 해결에 영향을 미치는 정신 건강 장애의 범주이며, 기억상실, 치매 및 섬망을 포함한다. 인지 장애 중 알츠하이머병이 언급될 수 있다.
용어 "통증"은 질병, 상해 또는 생물학적 과정, 예를 들어 염증성 통증으로 인한 신체적 괴로움 또는 고통을 의미한다. 통증은 급성 또는 만성일 수 있으며, 바람직하게는 만성 염증성 통증일 수 있다.
용어 "감염"은 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균 감염을 의미한다.
비만은 과도한 체지방이 특징인 병리이다. 용어 "비만의(obese)"는 30kg/m2 이상의 체질량지수(BMI)(즉, 사람의 체중(kg)을 사람의 신장(미터)의 제곱으로 나누어 수득된 측정)를 갖는 환자를 의미할 수 있다.
심장 질환은 보다 구체적으로 심장 비대, 심장 부정맥, 판막병증, 확장기 기능장애, 만성 심부전, 허혈성 심부전, 심근 허혈, 재관류 손상, 심근염, 비대성 및 확장성 심근병증을 가리킨다. Rap1 외에도, Epac1은 주요 심근세포를 포함한 다양한 세포 유형에서 작은 GTPase H-Ras를 활성화하는 것으로 나타났다는 것이 주목되어야 한다(Kreiper et al., 2004; Metrich et al., 2008; Metrich et al., 2010a, 2010b; Schmidt et al., 2001).
본 명세서에서 사용되는 용어 "심장 부정맥"은 일반적으로 심장 박동수 또는 심장 리듬의 이상으로 나타나는 심장의 전기적 활동의 방해로 정의된다. 부정맥은 가장 흔하게 심혈관 질환, 특히 허혈성 심장 질환과 관련이 있다. 상기 용어는 부비동 부정맥, 조기 박동, 심장 차단, 심방 세동, 심방 조동, 심실 빈맥, 심실 세동, 맥박 알터난 및 발작성 빈맥을 포함한다.
본 발명은 또한 Epac 단백질이 관여되는 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 양의 상기 정의된 화학식 (I)의 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
바람직하게, 본 발명은 염증, 암, 혈관 질환, 신장 질환, 인지 장애, 통증, 감염, 비만 및 심장 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 양의 상기 정의된 화학식 (I)의 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
보다 구체적으로, 본 발명은 심장 비대, 심장 부정맥, 판막병증, 확장기 기능장애, 만성 심부전, 허혈성 심부전, 심근 허혈, 재관류 손상, 심근염, 비대성 및 확장성 심근병증의 예방 및/또는 치료 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 양의 상기 정의된 화학식(I)의 화합물을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
실시예
A. 재료 및 방법
시약 및 항체
AM-001 및 구조적 유사체(AM-002, AM-003, AM-004, AM-005, AM-006, AM-007, AM-008, AM-009, AM-010)는 다음 참조번호로 Ambinter에서 구입하였다: Amb1781597(AM-001), Amb21993172(AM-002), Amb2654874(AM-003), Amb2675718(AM-004), Amb1858954(AM-005), Amb695840(AM-006), Amb5842163(AM-007), Amb3443920(AM-008), Amb2823810(AM-009) 및 Amb6326948(AM-010).
AM-001, AM-004, AM-005, AM-006, AM-007, AM-008 및 AM-009는 위에 기술된 바와 같으며 본 발명에 따른 화학식 (I)의 화합물인 반면, AM-002, AM-003 및 AM-010은 본 발명에 따른 화합물이 아니다:
Figure pct00009
Figure pct00010
Epac1 억제제 CE3F4는 이전에 발표된 방법에 따라 합성되었다(Courilleau D, Bisserier M, Jullian JC, Lucas A, Bouyssou P, Fischmeister R, Blondeau JP, Lezoualc'h F (2012)) Identification of a tetrahydroquinoline analog as a pharmacological inhibitor of the cAMP-binding protein Epac(cAMP-결합 단백질 Epac의 약학적 억제제로서의 테트라하이드로퀴놀린 유사체의 확인). J Biol Chem 287: 44192-44202).
cAMP, 8-CPT-N6-페닐-cAMP(8-CPT-N6), 8-(4-클로로페닐티오)-2'-O-메틸아데노신-3',5'-사이클릭 모노포스페이트, 아세톡시메틸 에스테르(8-CPT-AM) 및 Sp-8-CPT(Sp-8-pCPT-2'-O-Me-cAMPS(Sp-8-CPT: 8-(4-클로로페닐티오)-2'-O-메틸아데노신-3',5'-사이클릭 모노포스포로티오에이트, Sp-이성질체)는 BioLog(독일 브레멘)에서 구입하였다.
구아노신 5'-디포스페이트, BODIPY FL 2'-(또는-3')-O-(N-(2-아미노에틸)우레탄), 비스(트라이에틸암모늄)염(bGDP)은 Invitrogen에서 입수하였다.
항체와 그 공급자는 다음과 같다: Cell Signaling로부터의 항-GAPDH, 항-Rap1, 항-Epac1, 항-Epac2 및 항-GRK2(1/1000); Sigma-Aldrich의 항-튜불린(1/5000); Santa Cruz로부터 입수된 항-GRK5(1/1000), 겨자무 퍼옥시다아제-접합된 2차 항체(Santa Cruz).
세포 배양
모든 절차는 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 따라 수행되었으며, 수의학 위원회는 사용된 심장 근세포 단리 프로토콜에 대한 정보를 받았다.
신생아 쥐 심실 근세포(NRVM) 단리: 1-2일령의 신생아 쥐를 단두술로 안락사시켰다. 심장을 절제하고 심방을 제거하였다. NRVM의 1차 배양은 이전에 설명한대로 이후에 수행되었다(Morel E, Marcantoni A, Gastineau M, Birkedal R, Rochais F, Garnier A, Lompre AM, Vandecasteele G, Lezoualc'h F (2005) cAMP-binding protein Epac induces cardiomyocyte hypertrophy(cAMP-결합 단백질 Epac은 심근 세포 비대를 유도한다). Circ Res 97: 1296-1304).
성인 쥐 심근세포 단리: 펜토바르비탈(300mg/kg)과 헤파린(150 단위)의 복강내 주사 후, WT 및 Epac1-/-으로부터 심장을 빠르게 단리하여 얼음으로 차갑게 한 타이로드(Tyrode) 칼슘이 없는 완충액(130mmol/L NaCl, 5.4mmol/L KCl, 1.4 mmol/L MgCl2, 0.4mmol/L NaH2PO4, 4.2mmol/L HEPES, 10mmol/L 포도당, 20mmol/L 타우린 및 10mmol/L 크레아틴 일수화물, pH 7.2)에 넣었다. 성인 쥐 심근세포의 1차 배양은 이전에 설명한대로 이후에 수행되었다(Fazal L, Laudette M, Paula-Gomes S, Pons S, Conte C, Tortosa F, Sicard P, Sainte-Marie Y, Bisserier M, Lairez O, Lucas A, Roy J, Ghaleh B, Fauconnier J, Mialet-Perez J, Lezoualc'h F (2017) Multifunctional Mitochondrial Epac1 Controls Myocardial Cell Death(다기능 미토콘드리아 Epac1은 심근세포 사멸을 조절한다). Circ Res 120 (4): 645-657).
인간 배아 신장 세포주(HEK293): HEK293 세포는 FBS(10%) 및 페니실린-스트렙토마이신(1%)과 함께 최소 필수 배지에서 유지되었다. 세포 배양에 사용된 모든 배지, 혈청 및 항생제는 Invitrogen에서 구입되었다.
플라스미드 구축물 및 형질감염
Epac1-BRET 센서 CAMYEL은 앞서 설명한대로 pQE30-CAMYEL 원핵세포 발현 벡터(Dr L. I. Jiang의 선물)로 구성되었다(Courilleau D, Bisserier M, Jullian JC, Lucas A, Bouyssou P, Fischmeister R, Blondeau JP, Lezoualc 'h F(2012) Identification of a tetrahydroquinoline analog as a pharmacological inhibitor of the cAMP-binding protein Epac(cAMP-결합 단백질 Epac의 약학적 억제제로서 테트라하이드로퀴놀린 유사체의 확인). J Biol Chem 287: 44192-44202). 인간 Epac1/Epac2 발현 벡터는 Dr J. L. Bos.으로부터의 선물이었다. 세포는 제조업체의 지침에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 형질감염되었다. HEK293 세포는 FBS(Foetal Bovine Serum, 우태 혈청; 10%) 및 페니실린-스트렙토마이신(1%)과 함께 MEM에서 유지되었다. 세포 배양에 사용된 모든 배지, 혈청 및 항생제는 Invitrogen(프랑스 세르지 퐁투와즈)에서 구입하였다. 일시적인 형질감염 실험은 제조업체의 지침에 따라 다양한 양의 플라스미드 구축물의 존재하에 Lipofectamine 2000(Invitrogen Life Technologies)으로 수행되었다.
동물
모든 동물 절차는 동물 실험에 관한 기관 지침과 프랑스 농림부 허가증에 따라 수행되었다. 더욱이, 이 조사는 유럽 의회의 지침 2010/63/EU에 의해 발표된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 준수하였다. 마우스는 병원체가 없는 시설에 보관되었으며 모든 동물 실험은 툴루즈 대학교의 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았다.
생체내에서 심근 I/R, 위험 영역 및 경색 크기의 평가
마우스는 복강내 케타민(60mg/kg) 및 자일라진(6mg/kg)으로 마취되고, 삽관되고 기계로 환기되었다. 마취는 1.5% 이소플루레인을 사용하여 외과술 절차 내내 유지되었다. 체온은 37℃로 유지되었다. 왼쪽 개흉술은 45분 동안 왼쪽 관상 동맥 주위에 배치된 후 24시간 동안 재관류하여 7-0 프롤렌(Prolene) 실로 관상 동맥 폐색을 가능하게 하기 위해 수행되었다. 마우스는 관상 동맥에 정맥 주사에 의해 재관류하기 5분 전에 AM-001(10mg/kg)의 볼루스 또는 멸균 식염수 용액으로 처리되었다. 심근 허혈은 국소 청색증의 존재에 의해 확인되었다. 재관류는 충혈 반응의 시각화로 확인되었다. 이 시점에서 가슴은 층으로 닫혔다. 재관류 24 시간 후, 마우스는 다시 마취되고, 관상 동맥은 이전 부위에서 재폐색되고, 에반스 블루(Evans blue) 관류 후 심장은 절제되었다. 위험 영역과 경색 영역은 각각 에반스 블루(Evans blue) 및 2,3,5-트라이페닐테트라졸리움 클로라이드(TTC) 염색으로 결정되었다. 위험 영역은 파란색이 아닌 영역으로 확인되고 좌심실 무게의 백분율로 표시된다. 경색 영역은 TTC 음성 영역으로 확인되고 위험 영역의 백분율로 표시된다.
만성 ISO 주입
삼투압 미니 펌프(Alzet)는 이소플루레인(1%)으로 마취된 마우스에 피하로 이식되었다. 펌프는 ISO 또는 멸균 식염수로 충전되고 심장 비대를 유도하기 위해 14일 동안 하루에 60mg/kg으로 ISO를 전달하도록 설정되었다. AM-001 처리(10% DMSO/20% Kolliphor/70% 멸균 식염수에 희석된 10mg/kg/d)는 ISO 주입 3일째부터 제공된다. 마우스는 이후에 바르비투르산염 과다복용(펜토바르비탈, 150mg/kg, i.p.)으로 안락사되고, 미니 펌프는 완전한 확산을 입증하기 위해 무게가 측정되었다.
심초음파 검사
심초음파 검사는 가열 패드 위에 놓인 가볍게 마취된 (공기 중 1% 이소플루레인) 마우스에서 수행되었다. 좌심실 치수는 Vevo2100 ivid7 심초음파 및 4014MHz 트랜스듀서(M550i13L, VisualsonicsGE Healthcare)를 사용하여 유두근의 중심실 수준에서 복장옆(parasternal) 단-축 보기에서 TimeMouvement 모드 획득 중에 수득되었다. 이미지는 Vevolab 소프트웨어 EchoPAC(GE Healthcare)을 사용하여 오프라인으로 전송 및 분석되었다. 조작자는 마우스의 처리군 유전자형에 대해 가려졌다.
섬유증의 결정
심장은 10μM 두께로 가로로 절단되고, 4% 파라포름알데하이드로 고정되고 시리우스 레드(Sirius Red)로 염색되었다. 슬라이드는 NanoZoomer(Hamamatsu v1.2)로 스캔되고 섬유증을 시리우스 레드(Sirius Red)로 양성 염색된 영역으로 측정되고 ImageJ 소프트웨어(RSB)를 사용하여 전체 영역의 백분율로 표시되었다.
헤마톡실린 및 에오신 염색
심장은 수집되고, 4% 파라포름알데하이드에서 고정되고, 탈수되고, OCT 조직 포매 화합물(Tissue Tek, EMS)에 포매되었다. 세로 절편은 10μM 두께로 수행되고 조직학적 검사를 위해 헤마톡실린과 에오신으로 염색되었다.
간독성 분석
아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST) 및 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT)는 제조업체의 지침에 따라 사이언스셀 조사 연구실(ScienCell Research Laboratories)에서 구입된 특정 키트를 사용하여 세포독성을 결정하기 위해 혈청에서 측정되었다.
데이터 분석
데이터는 평균±S.E.M으로 표현된다. 정량적 변수의 차이는 일방향 또는 양방향 분산 분석에 이어 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)을 사용하여 본페로니(Bonferroni) 보정을 사용한 사후(post hoc) 테스트로 조사되었다. 통계적 유의성은 p<0.05로 설정되었다. EC50 및 IC50 값은 3 매개변수 용량-반응 모델에 따라 계산되고 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)을 사용하여 추가 제곱합 F 테스트를 기반으로 비교되었다.
B. 결과
1. cAMP를 위한 Epac1-기반 BRET 센서의 억제
Epac1-BRET(bioluminescence resonance energy transfer, 생체발광 공명 에너지 전달) 센서(Jiang LI, Collins J, Davis R, Lin KM, DeCamp D, Roach T, Hsueh R, Rebres RA, Ross EM, Taussig R, Fraser I, Sternweis PC(2007) Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway(스핑고신 1-포스페이트/G13 경로에 의해 cAMP의 신규한 조절을 특성화하기 위한 cAMP BRET 센서의 용도). J Biol Chem 282 (14): 10576-10584)를 기반으로 확립된 시험관 내(in vitro) 분석 시스템인, CAMYEL이 사용되어 다양한 인하우스 화학물질 수집을 스크리닝하였다. CAMYEL 프로브는 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase)와 시트린(citrine) 사이에 삽입된 Epac1로 구성되며, Epac1 활성화를 평가하기 위한 수단으로 cAMP의 결합시 유도되는 Epac1에서 형태적 변화를 이용한다. cAMP의 결합시 Epac1은 시트린에서 멀어지는 루시퍼라아제로 인해 에너지 전달의 감소를 야기하는 형태적 변화를 겪는다.
AM-001이라고도 하는 화합물 1은 3-아미노-N-(4-플루오로페닐)-4-페닐-6-(티오펜-2-일)티에노[2,3-b]피리딘-2-카르복사미드)이고, 그리고 그것은 cAMP-유도된 CAMYEL 형태적 변화의 새로운 억제제로 확인되었다. AM-001(20μM)은 이전 실험에서 표준으로 사용된 Epac1 비경쟁 억제제인 (R)-CE3F4(20μM)와 동일한 규모인 100μM cAMP(약 50% 감소)에 의해 유도된 BRET 변이를 억제하였다(도 1). AM-001은 농도 의존적 방식으로 BRET 최대 반응을 감소시켰지만, 최대 반응의 절반을 제공한 cAMP의 유효 농도(EC50=30.7±1.0μM)는 감소시키지 않았다(도 2). 더욱이, cAMP의 증가하는 농도는 AM-001의 최대 억제 농도의 절반(IC50)(53.7±1.0μM)을 변경하지 않았으며, 이는 AM-001이 Epac1의 비-경쟁적 억제제로 작용함을 시사한다(도 3).
2. AM-001은 시험관 내에서 Epac1 촉매 활성을 억제하지만 Epac2 촉매 활성을 억제하지 않는다.
다음으로, AM-001의 효과는, Epac GEF 활성 분석을 사용하여 시험관 내에서 Epac1 및 Epac2 촉매 활성에 대해 조사되었다(Courilleau D, Bisserier M, Jullian JC, Lucas A, Bouyssou P, Fischmeister R, Blondeau JP, Lezoualc'h F(2012) Identification of a tetrahydroquinoline analog as a pharmacological inhibitor of the cAMP-binding protein Epac(cAMP-결합 단백질 Epac의 약학적 억제제로서 테트라하이드로퀴놀린 유사체의 확인). J Biol Chem 287: 44192-44202). 이 방법은 과량의 비-형광 GDP의 존재 하에서 재조합 Rap1로부터 형광 b-GDP의 Epac-자극된 해리를 기반으로 한다. 형광에서 붕괴의 초기 속도는 교환 활성을 반영한다. 먼저, 본 발명자들은 AM-001 물리-화학적 특성이 Epac GEF 분석과 호환되는지 분석하였다. 우리는 AM-001 흡광도와 농도 사이의 선형 상관관계를 발견하였고, 이는 AM-001이 교환 반응 버퍼에서 최대 60μM까지 용해될 수 있었음을 나타내었다. 게다가, AM-001의 UV 스펙트럼은 다른 농도에서 이 화합물이 bGDP의 형광 여기/방출 창에 흡수하지 않았음을 보여주었다. 중요하게도, bGDP의 방출 형광 강도는, AM-001이 최대 60μM 농도에서 사용될 때, 영향을 받지 않았다. 종합해보면, 이들 데이터는 AM-001 물리-화학적 특성은 Epac GEF 분석과 호환된다는 것을 보여주었다.
강력한 PDE-저항성 막-투과성 Epac 작용제인, 다양한 농도의 Sp-8-CPT(8-(4-클로로페닐티오)-2'-O-메틸아데노신-3',5'-사이클릭 모노포스포로티오에이트, Sp-이성질체)에서 초기 교환 속도의 측정은 Epac1 및 Epac2에 대해 각각 7.5±1.1μM 및 5.6±1.1μM의 EC50 값을 제공하였다. 또한, cAMP EC50 값은 Epac1 및 Epac2에 대해 각각 13.1±1.1μM 및 2.8±1.1μM이었다. 결과적으로, Epac1의 겉보기 친화성은 cAMP에 대해서보다 Sp-8-CPT에 대해 1.7배 더 높았고 Sp-8-CPT-활성화된 Epac1의 Vmax는 cAMP-활성화된 Epac1의 Vmax보다 2.5배 더 높았다. 대조적으로, Epac2의 겉보기 친화성은 Sp-8-CPT에 대해서보다 cAMP에 대해 2배 더 높았으며, cAMP-활성화된 Epac2의 Vmax는 Sp-8-CPT-활성화된 Epac2의 Vmax보다 1.3배 더 컸다. 따라서, Sp-8-CPT의 포화 농도(30μM)가 후속 억제 실험을 위해 선택되었다. 두 Epac 이성질체는 모두 30μM의 Sp-8-CPT의 존재 하에서 형광의 급격한 감소를 유도하였다(도 4 및 6). 이전에 보고된 바와 같이, 작용제(30μM Sp-8-CPT)에 의해 유도된 Epac1의 교환 활성은 (R)-CE3F4(20μM)에 의해 감소되었다(도 4 및 5). AM-001은 Epac1 GEF 활성을 막았지만(도 4, 5, 8), Epac2 GEF 활성에 대한 억제 효과는 없었다(도 6, 7, 8). 포화 농도의 Sp-8-CPT의 존재 하에서, AM-001 IC50 값은 Epac1에 대해 48.5±1.0μM 이었지만 Epac2에 대해서는 정량화될 수 없었으며(IC50>>1000μM), 이는 AM-001이 Epac2 GEF 활성 억제에 효과적이지 않음을 나타낸다(도 7). 유사한 결과(AM-001 Epac1의 경우 IC50=47.8±1.1μM 대 Epac2의 경우 IC50>>1000μM)가 각 Epac 동형 단백질에 대한 EC50에 해당하는 Sp-8-CPT의 농도를 사용하여 수득되었다. AM-001에 의한 Epac1의 억제의 IC50이 작용제 농도와 무관하다는 사실은 AM-001의 비-경쟁적 거동을 확인하였다. 또한 AM-001은 농도 의존 방식으로 최대 Epac1 GEF 활성을 감소시켰지만, Sp-8-CPT의 EC50을 감소시키지 않았다. 이러한 결과는, BRET 센서 실험에서 이미 제안한 바와 같이, AM-001이 Epac1 비경쟁 억제제로 작용하였음을 확인하였다(도 2 및 3).
본 발명자들은 또한 AM-001(30μM)이 10μM cAMP의 존재 및 부재하에 I형 및 II형 PKA 홀로엔자임(holoenzyme) 활성화에 영향을 미치지 않아, Epac1에 대한 이 화합물의 특이성을 더욱 강화한다는 것을 발견하였다. 마지막으로, 단백질 변성의 모니터링을 허용하는 열 이동 분석(thermal shift assay)을 사용하여, AM-001의 첨가는, 작용제 Sp-8-CPT의 존재 여부에 관계없이, AM-001의 증가하는 농도의 존재하에 Epac1의 용융 온도 Tm(열 전개(thermo-unfolding)의 중간점으로 정의됨)을 변경하지 않고, 따라서 AM-001의 비-특이적 단백질 변성 작용을 배제하는 것이 관찰되었다.
3. Epac1 활성화에 대한 AM-001 유도체의 특이성
이어서, AM-001의 여러 상업적으로 입수가능한 유사체 또는 유도체는, CAMYEL 분석 시스템을 사용하여 Epac1 활성화에 대한 억제 작용에 대해 연구되었다.
화학식 (I)의 화합물에 대한 결과는 하기 표 1에 도시된다.
이름 BRET 비율 변이
(100μM cAMP 단독의 %)
AM-001 46.7+/-0.8%
AM-002(비교예) 93.6+/-0.9%
AM-003(비교예) 100.4+/-2.1%
AM-004 47.0+/-0.7%
AM-005 46.9+/-1.3%
AM-006 74.0+/-2.8%
AM-007 80.5+/-3.9%
AM-008 82.2+/-5.5%
AM-009 82.4+/-1.8%
AM-010(비교예) 101.3+/-2.8%
표 1에 대해, 20μM의 테스트 화합물은 cAMP(100μM)의 주입 전에 HEK 세포 추출물에 첨가되고, BRET 비율(3개 웰의 평균 +/-SEM)이 측정되고 비-억제제 대조군 값에 대한 BRET 비율의 퍼센트 변이로 그래프에 표시되었다.
N-페닐기에로부터 불소 원자를 4-페닐기로 교체하는 것(AM-005)뿐만 아니라 이러한 페닐기 상에 임의의 불소 원자가 없는 것(AM-004)은, 화합물의 억제 효능에 큰 영향을 미치지 않았다. 4-페닐기가 결여되거나(AM-009) 또는 N-페닐기가 결여된 화합물(AM-006)의 억제 활성은 감소되었지만 사라지지 않았다. 그러나, N-페닐기를 N-아이소프로필기(AM-003)로 치환하면 억제 효과가 사라졌다. AM-010의 낮은 활성은 억제 활성에 대한 6-티에닐기의 존재의 중요성을 나타낸다. 마지막으로, 2-카르복사미드 결합이 자유롭게 회전할 수 없고 AM-001의 1차 아미노기가 추가 티에노[3,2-d]피리 미딘 스캐폴드에 관여되는 화합물인 AM-002에서는 유의한 억제 활성이 관찰되지 않았다. 이 예비 구조-활성 연구는 페닐기와 6-티에닐기가 AM-001이 억제 활성을 발휘하는데 필수적이라는 것을 보여주었다. 따라서, 우리의 데이터는 cAMP-유도된 Epac1 형태상 변화를 줄이는 능력에서 이 화합물의 계열 내에서 화학적 특이성이 있음을 나타냈다.
4. AM-001은 배양된 세포에서 Epac1 신호전달을 억제한다.
AM-001은 신생아 쥐 심실 근세포를 포함한 다양한 유형의 배양된 세포에서 명백한 세포 독성을 나타내지 않았다. AM-001이 배양된 세포에서 효율적인 Epac1 동형 단백질-특이적 길항제임을 확인하기 위해, 본 발명자들은 HEK293 세포에서 Epac 다운스트림 효과기인 Rap1의 활성화를 차단하는 능력을 추가로 테스트하였다(도 9-13). 이 세포주는 일반적으로 이소성으로 발현된 Epac1 및 Epac2 동형 단백질의 세포 신호전달에 대한 Epac 약학적 조절자의 평가에 사용된다. 막 투과성이 높고 대사적으로 활성화가능한 Epac 작용제인 8-CPT-AM(8-(4-클로로페닐티오)-2'-O-메틸아데노신-3',5'-사이클릭 모노포스페이트, 아세톡시메틸 에스터)은 Epac1을 과발현하는 세포에서 Rap1의 강력한 활성화를 유도하였다. Epac1 BRET 센서 및 Epac1 교환 반응을 사용하여 시험관 내(in vitro)에서 얻은 데이터와 일치하여, 비활성 유사체 AM-002 및 AM-003과는 일치하지 않지만, AM-001은 Epac1-유도된 Rap1 활성화를 방지하였다(도 9-11). 다음으로, 본 발명자들은 2개의 Epac2 스플라이스 변이체인 Epac2A 및 Epac2B에 대한 8-CPT-AM의 효과를 조사하였다(도 12-13). ESI-05와는 달리, 이전에 특성화된 특정 Epac2 억제제(Tsalkova T, Mei FC, Cheng X(2012) A Fluorescence-Based High-Throughput Assay for the Discovery for Exchange Protein Directly Activated by Cyclic AMP(EPAC) Antagonists(사이클릭 AMP(EPAC) 길항제에 의해 직접 활성화된 교환 단백질을 위한 발견을 위한 형광-기반 고-처리량 분석). PLoS One 7 (1): e30441)인, AM-001은 Epac2A-유도된 Rap1 활성화를 억제하는 것에 실패하였다(도 12). 더욱이, AM-001은 Epac2B로 형질감염된 세포에서 S-220에 의해 유도된 Rap1-GTP 양의 증가를 방해하는 데 효과적이지 않았다. 전체적으로, 이들 데이터는 AM-001이 배양된 세포에서 Epac1-유도된 Rap1 활성화를 예방하는데 효율적이고 특이적임을 보여주었다.
5. AM-001은 허혈-재관류(I/R) 손상에 대항하여 보호한다
다음으로, 본 발명자들은 AM-001이 생리학적으로 관련된 시스템에서 Epac1의 활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하였다. 이전에 Epac1의 유전적 절제가 허혈 상태 동안 심근세포 사멸을 예방하는 것을 보여주었고(Fazal L, Laudette M, Paula-Gomes S, Pons S, Conte C, Tortosa F, Sicard P, Sainte-Marie Y, Bisserier M, Lairez O, Lucas A, Roy J, Ghaleh B, Fauconnier J, Mialet-Perez J, Lezoualc'h F (2017) Multifunctional Mitochondrial Epac1 Controls Myocardial Cell Death(다기능 미토콘드리아 Epac1은 심근세포 사멸을 제어한다). Circ Res 120 (4): 645-657), 본 발명자들은 저산소-재산소화(HX+R) 손상에 대항한 AM-001의 잠재적인 보호 효과를 테스트하였다. 대조군 세포와 비교하여, AM-001은 HX+R 조건에서 LDH 방출에 의해 분석된 바와 같이 심근세포 생존을 유의하게 증가시켰다(도 14). 또한 AM-001은 심근세포 사멸 및 비대에 대한 막 투과성 Epac1-특이적 작용제인 8-pCPT-2'-O-MecAMP-AM(8-CPT-AM)의 효과를 억제하여(도 14), AM-001이 Epac1 유해한 영향을 대응하는 능력을 강조한다.
그 후, 급성 심근 I/R 손상의 마우스 모델에서 AM-001의 급성 투여의 치료 효능이 조사되었다. AM-001(8mg/kg) 또는 비히클의 단일 볼루스가 재관류 5분 전에 정맥내로 주사되었다. 비히클 처리된 마우스(50±3%)와 비교할 때 AM-001 처리된 동물(36±3%)에서 경색 크기 대 위험 영역의 비율이 유의하게 감소하였다(도 15). 흥미롭게도, (R)-CE3F4는 BRET 센서 분석에서 AM-001보다 더 낮은 IC50을 가지고, 다양한 세포 모델에서 시험관 내(in vitro)에서 Epac1-의존적 생물학적 작용을 효율적이고 선택적으로 억제하는 것으로 나타났음에도 불구하고, 이 억제제(8mg/kg body)는 경색 크기를 줄이는데 실패하여, CE3F4가 AM-001에 비해 생체 내에서(in vivo) 열악한 생물학적가용능(biodisponibility)을 가질 수 있음을 시사한다(도 16). 전체적으로, 이들 결과는 AM-001의 급성 주사가 심근 재관류 손상을 예방하는데 효율적임을 증명한다.
6. AM-001은 만성 β-AR 활성화 동안 심장 기능을 개선하였다
본 발명가들은 다음으로 AM-001이 만성 β-AR 활성화 동안 심장 기능 및 리모델링의 개선을 제공할 수 있는지 여부를 결정하려고 하였다. 이를 위해, 야생형 C57BL/6 마우스는 AM-001(3일부터 14일까지 10mg/kg i.p.) 또는 그의 비히클의 존재하에서 14일 동안, 비-선택적 β-AR 작용제인 이소프로테레놀(ISO)(하루 60mg/kg), 또는 비히클 중의 하나로 처리되었다. AM-001 처리된 마우스로부터 간 및 신장 조직 샘플은 헤마톡실린 및 에오신(H & E) 염색으로 밝혀진 바와 같이 명백한 조직학적 변화를 나타내지 않았다. 또한 간독성을 나타내는 알라닌 아미노트랜스퍼라아제(ALT)와 아스파테이트 아미노트랜스퍼라아제(AST)의 혈장 수준은 각 그룹에서 동등하였다(도 17). 그러나, 부분 단축(FS) 및 좌심실 중량(LVW) 대 경골 길이(LVW/TL) 및 심박수의 비율은 비히클 및 AM-001 처리된 마우스의 기준선에서 유사하였다(도 18). 따라서, AM-001의 만성 주사는 동물에게 독성 효과가 없었으며 사용된 실험 조건에서 기저 심장 기능을 변경하지 않았다.
ISO의 만성적 주입은 대조군 비히클에 비해 LVW/TL 비율에서 유의한 증가를 야기하였다(도 18). 반대로 아드레날린 스트레스가 시작된 지 3일 후 AM-001을 주입하면 이 매개변수를 더 감소시켰다(도 18). 또한, 섬유증은 AM-001-처리된 마우스에서 크게 감소하였다(1.1±0.5% 대 비히클+ISO 처리된 마우스에서 3.0±1.1%)(도 19). 중요하게도, ISO 주입 14일 후 AM-001의 효과는 비히클 처리된 마우스보다 AM-001 처리된 마우스에서 더 높은 FS로 입증된 바와 같이 향상된 심장 기능과 관련이 있었다(도 20, 상단 패널). 일치하게, ISO 치료 중 AM-001의 존재 하에서 관찰된 이 더 나은 수축성은 좌심실 수축기말 내경(LVIDs) 및 좌심실 이완기말 내경(LVIDd)의 감소와 상관관계가 있었다(도 20, 하단 패널). 마지막으로, 본 발명자들은 AM-001이 G-단백질 수용체 키나아제 2(GRK2) 및 GRK5의 발현 수준을 변경할 수 있는지 조사하였다. 실제로, 이 두 GRK는 β-AR을 둔감하게 하고 심장 스트레스 조건에서 상향조절은 불리한 리모델링과 수축 기능장애에 참여한다(24). 예상대로, ISO 처리는 GRK2 및 GRK5 발현을 증가시켰다(도 21). 흥미롭게도, GRK2가 아닌 GRK5의 상향조절은 AM-001 처리된 동물에서 현저하게 감소하였다.
이들 데이터는 AM-001이 β-AR의 만성적 활성화에 대한 반응으로 심장 비대 및 섬유증을 약화시키고 아마도 β-AR 반응성의 회복을 통해 심장 기능을 개선한다는 것을 보여준다.
요약하면, 이들 결과는 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 모두에서 기능하는 Epac1의 특정 약학적 억제제로서 신규한 티에노[2,3-b]피리딘 유사체의 확인에 관한 것이다. 그들은 이 화합물이 Epac1에 의해 규제되는 신호전달 경로와 관련된 생리학적 및 병리학적 과정을 탐구하는 귀중한 약학적 도구일뿐만 아니라 관련 인간 질병에 대한 신규한 분자 치료제로 개발될 가능성이 크다는 것을 나타낸다.

Claims (13)

  1. 화학식 (I)의 화합물:
    Figure pct00011

    상기 식에서,
    R1은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
    - H;
    - (C2-C20)알킬;
    - (C3-C10)사이클로알킬;
    - 3-10원 헤테로사이클로알킬;
    - (C6-C10)아릴; 및
    - 5-10원 헤테로아릴;
    여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴 기는 선택적으로 치환되고;
    R2는 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
    - H;
    - (C1-C20)알킬;
    - (C3-C10)사이클로알킬;
    - 3-10원 헤테로사이클로알킬;
    - (C6-C10)아릴; 및
    - 5-10원 헤테로아릴;
    또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
    여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되고;
    R3은 다음으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고:
    - H;
    - (C3-C10)사이클로알킬;
    - 3-10원 헤테로사이클로알킬;
    - (C6-C10)아릴; 및
    - 5-10원 헤테로아릴;
    여기서, 상기 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되고; 및
    R4는 H, -OH, -NRxRy 및 -C(O)ORz로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고;
    Rx, Ry 및 Rz는 서로 독립적으로 H 또는 (C1-C10)알킬이고;
    또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
    또는 그의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물 또는 수화된 염 또는 그의 다형성 결정 구조, 라세미체, 부분입체 이성질체 또는 거울상 이성질체이고,
    Epac 단백질이 관여된 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 것이고,
    상기 질병은 심장 비대, 심장 부정맥, 판막병증, 확장기 기능장애, 만성 심부전, 허혈성 심부전, 심근 허혈, 재관류 손상, 심근염, 비대성 및 확장성 심근병증으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 심장 질환인 것인 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    R3은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고:
    - (C3-C10)사이클로알킬;
    - 3-10원 헤테로사이클로알킬;
    - (C6-C10)아릴; 및
    - 5-10원 헤테로아릴;
    상기 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되는 것인 화합물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    R1은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고:
    - H;
    - (C6-C10)아릴; 및
    - 5-10원 헤테로아릴;
    여기서, 상기 아릴 및 헤테로아릴기는 -NR7R8, (C1-C10)알킬 및 할로겐 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되고; 여기서, R7 및 R8은 서로 독립적으로 (C1-C10)알킬 또는 H로부터 선택되는 것인 화합물.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R2는 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고:
    - H;
    - (C1-C20)알킬;
    - (C6-C10)아릴; 및
    - 5-10원 헤테로아릴;
    또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
    여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 (C1-C10)알킬 및 할로겐 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환되는 것인 화합물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R3은 바람직하게 (C1-C10)알킬 및 할로겐 원자로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된 (C6-C10)아릴인 것인 화합물.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R4는 H이거나, 또는 R2 및 R4는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C5-C6)사이클로알킬기를 형성하는 것인 화합물.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    R1 은 페닐기이고/거나, R2는 티에닐기이고, 상기 페닐 및 티에닐기는 선택적으로 치환되는 것인 화합물.
  8. 제 1 항에 있어서,
    R1 은 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고:
    - (C2-C20)알킬;
    - (C3-C10)사이클로알킬;
    - 3-10원 헤테로사이클로알킬;
    - (C6-C10)아릴; 및
    - 5-10원 헤테로아릴;
    여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되고; 및
    R2 는 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되고:
    - H;
    - (C1-C20)알킬;
    - (C3-C10)사이클로알킬;
    - (C6-C10)아릴; 및
    - 5-10원 헤테로아릴;
    또는 R2 및 R4 는 그들을 운반하는 탄소 원자와 함께 (C3-C10)사이클로알킬기를 형성하고;
    여기서, 상기 알킬, 사이클로알킬, 아릴 및 헤테로아릴기는 선택적으로 치환되는 것인 화합물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    화학식 (I)의 화합물은 화학식 (II)에 의해 특징지어지고:
    Figure pct00012

    상기 식에서, Ra, Rb, Rc, Rd, Re, Rx, Ry 및 Rz는 다음으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다:
    H, -OH, 할로겐 원자, -C(O)OH, (C1-C10)알킬, (C1-C10)알콕시, 및 -NR5R6,
    여기서, R5 및 R6은 서로 독립적으로 (C1-C10)알킬 또는 H로부터 선택되고;
    R4는 H, -OH, -NH2 및 -C(O)OH로 이루어지는 그룹으로부터 선택되며; 및
    R3은 제 1 항에 정의된 것과 같은 것인 화합물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식 중의 하나를 가지는 것인 화합물:
    Figure pct00013
  11. 제 1 항에 있어서,
    화학식 (I)의 화합물은 하기의 화학식을 가지는 것인 화합물:
    Figure pct00014
  12. 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께, 제 1 항 내지 11 항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같이, 그의 용도를 위한 화학식 (I)을 가지는 화합물을 포함하는 약학적 조성물.
  13. Epac 단백질이 관여된 질병의 예방 및/또는 치료 방법으로, 상기 방법은 필요한 환자에게 제 1 항에 정의된 화학식 (I)의 화합물의 약학적으로 허용가능한 양의 투여를 포함하고, 상기 질병은 심장 비대, 심장 부정맥, 판막병증, 확장기 기능장애, 만성 심부전, 허혈성 심부전, 심근 허혈, 재관류 손상, 심근염, 비대성 및 확장성 심근병증으로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 심장 질환인 것인 방법.
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