KR20210050577A - 근육 특이적 pck1 과발현 형질전환 개 생산 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 근육 특이적으로 PCK1을 과발현하는 형질전환 개 및 이의 제조방법, 그리고 이의 이용에 관한 것으로, 특히 근육 조직에서 특이적으로 PCK1 단백질을 과발현하도록 형질전환된 개를 근육량, 근력, 근섬유, 미토콘드리아 생합성, 에너지 대사의 변화 등의 연구를 위한 동물 모델로 이용하는 것에 관한 것이다.
Description
본 발명은 에너지 대사 및 운동능을 향상시킨 동물 생산 연구를 위한 형질전환 개 및 이의 제조 방법, 그리고 이의 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 PCK1을 과발현시킨 형질전환 개 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
경제사회문화적 교류 증가로 국내외의 물품 교역량이 증대되고 있는 추세를 따라 다양한 통로로 국가재난형 해외 악성 전염병인 구제역 (FMD), 고병원성 조류 인플루엔자 (AI) 등의 발생 빈도수가 증가하고 있어 해외유입 전염원 차단이 필요하고, 마약탐지, 인명구조 등 사람이나 기계가 할 수 없는 분야가 존재한다. 이를 해결하기 위하여, 사람이나 기계를 대체할 수 있는 운동능이 뛰어난 동물이 필요한 실정이다.
일반적으로 대사 산물로부터 포도당을 합성하는 능력은 대부분의 유기 생명체에 있어서 매우 중요하다. 우리의 신체는 하루에 공급되는 포도당보다 더 많은 양의 새로운 포도당을 생산해야만 한다. 이와 같은 활동을 위한 과정이 바로 새로운 포도당의 생산이라는 의미의 포도당신생합성(Gluconeogenesis)이다.
동물에서 거의 모든 포도당신생합성은 간과 신장에서 일어난다. 포도당신생합성이 일어나는 주된 장소는 각각 글리코겐 합성활성의 약 90%와 10%를 책임지는 간과 신장으로, 간과 신장에서 포도당신생합성에 의해 생성된 포도당은 혈액으로 방출되고 계속해서 대사에 필요를 충족시키기 위해 뇌, 심장, 근육 및 적혈구에 의해 흡수된다. 이들 조직에서 생산된 피루브산과 락트산은 포도당신생합성의 기질로 이용되기 위해 간과 신장으로 되돌아간다.
현재까지 에너지 대사 및 운동능을 향상시킨 동물 생산 연구는 주로 랫드와 마우스에서 에너지 대사나 성장에 관여하는 다양한 유전자들을 과발현시킨 모델을 개발하였고 형질전환 설치류에서 대조군 대비 근육량, 근력, 근섬유, 미토콘드리아 생합성, 에너지 대사의 변화 등이 비교 분석되어지고 있을 뿐이다.
그러므로 에너지 대사 및 운동능이 향상된 중대형 동물 필요한 실정이다. 중대형 동물 중 유전학적, 형태기능학적, 행동학적인 측면을 고려할 때, 에너지대사 및 운동능을 향상시킨 형질전환 개가 유용할 것으로 보인다.
또한, 미국, 캐나다, 영국, 호주 등 해외에서는 오래 전부터 우수견을 확보양성하기 위해 국립탐지견센터를 운영하며 많은 전문가의 도움으로 효율적인 훈련 프로그램을 체계화하여 다양한 품종의 견을 다수 확보양성하고 있다. 그러나 능력이 우수견이 발굴되어도 후대로 그 능력이 그대로 전해지지 못하는 문제점을 지니고 있어, 우수견의 양성을 위해 지속적인 고비용과 훈련이 필요한 문제점이 있다. 그러므로 동일한 형질이 쉽게 유지되고 수명이 긴 형질전환 개가 필요한 실정이다.
한편, PCK1 (=PEPCK-C, cytosolic form of phosphoenolpyruvate carboxykinase)는 포유류의 미토콘드리아에서 포도당신생과정의 전구물질로써, 생체 에너지 대사, 활력 등을 향상시키는 역할을 한다. PCK1은 포도당신생합성의 비가역적인 단계를 촉매한다. 포도당신생합성의 중요한 인자이며, 생체 에너지 대사 및 활력 향상에 관여하는 PCK1은 에너지 대사 및 운동능을 향상시킨 동물 생산 연구를 위한 주요한 표적 유전자가 될 수 있다.
특히 대부분의 포도당을 소비하고 에너지 대사 및 운동능에 중요한 근육에서의 PCK1의 과발현은 에너지 대사 및 운동능을 향상시킨 동물 생산 연구에 유용할 것으로 사료된다.
사람이나 기계가 수행하기 힘든 분야에서 이를 대신하여 일을 수행할 수 있는 중대형 동물이 필요하다. 본 발명은 에너지 대사 및 운동능이 향샹되고 수명이 긴 중대형 동물을 제공함을 일목적으로 한다.
또한, 본 발명은근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 PCK1이 과발현되는 개 및 이의 제조방법을 제공함을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 PCK1이 과발현된 개의 제조방법 및 이에 필요한 근육 특이적 발현 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 근육 특이적 발현 시스템으로 형질전환된 세포 및 핵 이식란을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 근육 특이적 PCK1 과발현 개의 다양한 용도를 제공하는 것이다.
이에, 본 발명자들은 에너지 대사 및 운동능을 향상시킨 동물 생산 연구를 위해, 포도당신생합성 및 생체 에너지 대사, 활력 향상에 중요한 인자로 여겨지는 PCK1이 과발현 되도록 형질전환시킨 체세포의 핵을 이식하는 기술을 적용함으로써, 근육 특이적으로 PCK1 과발현된 개를 제작할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 근육 특이적 PCK1 과발현 개 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 일 구체예로서,
근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 발현하는 알파-스켈레탈 근육 액틴 프로모터(α-skeletal muscle actin promoter, ACTA 프로모터)와 PCK1를 암호화하는 염기서열이 작동가능하게 연결된 것을 넉인(Knock In, KI) 하여 PCK1가 과발현된 형질전환 개를 제공한다.
근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 발현하는 알파-스켈레탈 근육 액틴 프로모터(α-skeletal muscle actin promoter, ACTA 프로모터)와 인간 유래의 PCK1를 암호화하는 염기서열이 작동가능하게 연결된 것을 넉인(Knock In, KI) 하여 PCK1가 과발현된 형질전환 개를 제공한다.
본 발명은 일 구체예로서 근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 발현하는 ACTA 프로모터 및 PCK1을 암호화하는 염기서열을 포함하는 근육 특이적 PCK1 과발현 동물 제작용 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 일 구체예로서 근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 발현하는 ACTA 프로모터 및 인간 유래의 PCK1을 암호화하는 염기서열을 포함하는 근육 특이적 PCK1 과발현 동물 제작용 재조합 벡터를 제공한다.
이때, 상기 벡터는 하나 이상의 전이인자를 포함하는 벡터일 수 있다.
상기 전이인자는 piggyBac 전이인자 또는 Sleeping Beauty 전이인자일 수 있다.
상기 전이인자는 양 말단에 역말단반복서열(inverted terminal repeat sequence, ITR) 및/또는 동향반복서열(direct repeat, DR)을 포함할 수 있다.
상기 전이인자는 전위를 매개하는 효소는 piggyBac 전이효소(transposase) 또는 Sleeping Beauty 전이효소(transposase)를 포함할 수 있다.
이때, 상기 벡터는 piggyBac 벡터 또는 Sleeping Beauty 벡터일 수 있다.
이때, 상기 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 사용할 수 있으며, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 벡터일 수 있다.
상기의 벡터를 이용하여 근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 발현하는 ACTA 프로모터 및 PCK1 유전자를 함유하는 근육 특이적 PCK1 과발현 형질전환 세포를 제공할 수 있다.
상기의 형질전환 세포를 이용하여 이식란을 제조한 뒤, 체세포 핵이식 기술(somatic cell nuclear transfer, SCNT)에 의해 상기의 형질전환 개를 제공할 수 있다.
상기 근육 특이적 PCK1 과발현 개는 포도당신생합성, 생체 에너지 대사, 활력 및 운동능이 향상된 개인 것을 특징으로 한다.
그러므로, 본 발명은 상기 설명한 재조합벡터가 도입된 핵 공여 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 산자를 생산하는 것을 특징으로 하는, 근육 특이적 PCK1 과발현 개의 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 핵 공여 세포는 개의 배아세포, 체세포 또는 줄기세포일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 개의 성체 섬유아세포(fibroblast) 또는 지방줄기세포를 이용할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 근육 특이적 PCK1 과발현 개의 제조방법은 보다 구체적인 예로 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다.
(a) 개로부터 분리한 체세포 또는 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 핵 공여 세포 제조함;
(b) ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화하는 염기서열을 포함하는 재조합벡터를 상기 핵 공여 세포에 도입함;
(c) 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조함;
(d) 상기 탈핵 난자에 핵 공여 세포를 미세주입하고 융합함;
(e) 상기 융합된 난자를 활성화 함; 및
(f) 상기 활성화된 난자를 대리모 개의 난관에 이식함.
본 발명은 상기 근육 특이적 PCK1 과발현 개의 제조방법의 과정에서 수득될 수 있는 근육 특이적 PCK1 과발현 개 제작에 필요한 형질전환 벡터, 세포 및 핵 이식란 등을 모두 포함한다.
즉, 본 발명은 또 다른 구체예로서,
ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화하는 염기서열을포함하는 재조합 벡터가 도입된, 근육 특이적 PCK1 과발현 동물 제작용 형질전환 세포를 제공할 수 있고,
ACTA 프로모터 및 PCK1 를 암호화하는 염기서열을포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 개 유래 체세포 또는 줄기세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식 또는 융합하여 형성된 개의 핵 이식란도 제공할 수 있다.
본 발명의 근육 특이적 PCK1 과발현 개는, 근육 특이적으로 과발현된 PCK1에 의해 근육량, 근력, 근지구력, 근섬유, 미토콘드리아 생합성 및 활성, 에너지 대사포도당신생합성 등이 증가된 개로서, 에너지 대사 관련 연구, 운동능/근력 향상 연구 등에 다양하게 활용될 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 상기 근육 특이적 PCK1 과발현 개의 다양한 용도를 제공한다.
일 예로써, 다음을 포함하는, 에너지 대사 향상을 위한 약제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
또 다른 일 예로써, 다음을 포함하는, 운동능 향상을 위한 약제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
이처럼, 본 발명은 에너지 대사, 활력 및 운동능을 향상시킨 근육 특이적 PCK1 과발현 동물모델 및 이의 다양한 용도를 제공한다.
도 1은 근육 특이적 PCK1 과발현 개의 생산을 위한 재조합 벡터의 일 구체예로서의 모식도이다.
도 2는 pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector가 도입된 성체섬유아세포와 지방줄기세포의 RT-PCR 분석 결과이다.
도 3은 pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector가 도입된 성체섬유아세포와 지방줄기세포의 표지유전자인 적색 형광 단백질 발현 양상 확인한 결과이다.
도 4는 pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector가 도입된 지방줄기세포의 RT-PCR 분석 결과이다.
도 5는 pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector가 도입된 지방줄기세포의 표지유전자인 적색 형광 단백질 발현 양상 확인한 결과이다.
도 6은 근육특이적 PCK1 발현 형질전환세포를 이용해 생산한 개 체세포 핵이식 복제란에서 mRuby 유전자가 발현하는 모습을 확인한 결과이다.
도 7은 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 개의 genomic DNA PCR 결과로, N은 음성 대조군(negative control), S는 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 개를 나타낸다.
도 8은 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 비글의 Southern blot 결과로, N은 음성 대조군(negative control), S는 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 개를 나타낸다.
도 9는 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 개(PCK1)와 대조군(Control)에서 1, 2, 4, 6개월령의 혈청화학 분석 결과이다(ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; BUN, blood urea nitrogen; CREA, creatinine; TC, total cholesterol; GLU, glucose; ALB, albumin; TP, total protein; TG, triglyceride).
도 10은 대조군 1의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타 자료이다.
도 11은 대조군 2의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 12는 대조군 3의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 13은 대조군 4의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 14는 대조군 5의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 15는 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 16은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 흉부 방사선 촬영결과 자료이다.
도 17은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 복부 방사선 촬영결과 자료이다.
도 18은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 두개골 방사선 촬영결과 자료이다.
도 19는 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 요추 방사선 촬영결과 자료이다.
도 20은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 골반 방사선 사진이다.
도 21은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 CT 촬영 영상으로, 후두골 및 경추의 정상성을 VR하여 가시화한 자료이다.
도 2는 pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector가 도입된 성체섬유아세포와 지방줄기세포의 RT-PCR 분석 결과이다.
도 3은 pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector가 도입된 성체섬유아세포와 지방줄기세포의 표지유전자인 적색 형광 단백질 발현 양상 확인한 결과이다.
도 4는 pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector가 도입된 지방줄기세포의 RT-PCR 분석 결과이다.
도 5는 pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector가 도입된 지방줄기세포의 표지유전자인 적색 형광 단백질 발현 양상 확인한 결과이다.
도 6은 근육특이적 PCK1 발현 형질전환세포를 이용해 생산한 개 체세포 핵이식 복제란에서 mRuby 유전자가 발현하는 모습을 확인한 결과이다.
도 7은 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 개의 genomic DNA PCR 결과로, N은 음성 대조군(negative control), S는 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 개를 나타낸다.
도 8은 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 비글의 Southern blot 결과로, N은 음성 대조군(negative control), S는 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 개를 나타낸다.
도 9는 근육 특이적 PCK1 발현 형질전환 복제 개(PCK1)와 대조군(Control)에서 1, 2, 4, 6개월령의 혈청화학 분석 결과이다(ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; BUN, blood urea nitrogen; CREA, creatinine; TC, total cholesterol; GLU, glucose; ALB, albumin; TP, total protein; TG, triglyceride).
도 10은 대조군 1의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타 자료이다.
도 11은 대조군 2의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 12는 대조군 3의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 13은 대조군 4의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 14는 대조군 5의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 15는 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 MRS 촬영 결과 스펙트럼을 나타낸 자료이다.
도 16은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 흉부 방사선 촬영결과 자료이다.
도 17은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 복부 방사선 촬영결과 자료이다.
도 18은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 두개골 방사선 촬영결과 자료이다.
도 19는 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 요추 방사선 촬영결과 자료이다.
도 20은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 골반 방사선 사진이다.
도 21은 근육특이적 PCK1 과발현 복제견의 CT 촬영 영상으로, 후두골 및 경추의 정상성을 VR하여 가시화한 자료이다.
발명의 실시를 위한 최선의 형태
본 발명에서 사용되는 대표적인 용어에 대한 정의는 이하와 같다.
"근육 특이적 발현 시스템"은 임의의 유전자 또는 단백질이 근육 조직 또는 근육 조직을 이루는 세포에서 발현되도록 하는 시스템을 통칭하는 용어이다. 상기 근육 특이적 발현 시스템은 근육 조직 또는 근육 조직을 이루는 세포에서 특이적으로 임의의 유전자 또는 단백질의 발현을 조절할 수 있는 조절 인자(regulatory element), 예를 들면, 프로모터(promoter), 인핸서(enhancer) 등을 포함할 수 있으며, 상기 발현 시스템은 임의의 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 시스템, 바이러스 시스템 등이 대표적이나, 임의의 유전자 또는 단백질을 세포 내에서 발현시킬 수 있는 모든 시스템도 포함한다.
"벡터" 또는 "발현 벡터"는 구조유전자를 암호화하는 핵산이 삽입될 수 있고, 숙주 세포 내에서 상기 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 전이인자(Transposable element) 포함 벡터, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체를 의미한다. 바람직하게는 전이인자 포함 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
"재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.
"발현 조절 서열(expression control sequence)" 또는 "조절 인자(regulatory element)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 본 발명에서 조절 인자는 프로모터, 인핸서 등일 수 있다.
"프로모터"는 특정 서열과 연결된 경우 특정 뉴클레오티드 서열이 mRNA로 전사되는 것을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 통상적으로, 프로모터는 모든 경우에 적용되는 것은 아니나 mRNA로 전사될 목적하는 뉴클레오티드 서열의 5'(즉, 상류)에 존재하고 RNA 폴리머라제 및 기타 전사 개시를 위한 전사 인자가 특이적으로 결합하는 부위를 제공한다. 본 발명의 프로모터는 구성적 프로모터이다. 프로모터와 관련하여 사용되는 용어 "구성적"은 프로모터가 자극(예, 열 쇼크, 화학물질 등) 없이도 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 지시할 수 있다는 것을 의미한다. 본 발명의 프로모터는 바람직하게는 알파-스켈레탈 근육 액틴 프로모터(α-skeletal muscle actin promoter, ACTA 프로모터)일 수 있다. ACTA 프로모터는 프로모터에 연결된 특정 서열이 근육 특이적으로 전사되도록 조절할 수 있다.상기 ACTA 프로모터는 개 유래의 것일 수 있다.
"작동 가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적인 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
"형질전환"이란 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질을 변화시키는 것을 의미한다. 형질전환시키는 방법으로는 종래 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 미세주입법(microinjection), 전기 천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 정자를 이용하는 방법(sperm-mediated gene transfer), 바이러스 감염법(viral infection), 직접근육주입법(direct muscle injection), 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존(trnasposon)을 이용한 기법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 인간 PCK1을 포함하는 발현 벡터를 개 태아 섬유아세포에 바이러스 감염법을 통해 형질전환시킬 수 있다.
""동물" 또는 "실험동물"은 인간 이외의 임의의 포유류 동물을 의미한다. 상기 동물은 배아, 태아, 신생아 및 성인을 포함하는 모든 연령의 동물을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 동물들은, 예를 들어, 상업용 소스로부터 이용할 수 있다. 이런 동물들은 실험용 동물 또는 다른 동물, 토끼, 설치류(예를 들어, 생쥐, 쥐, 햄스터, 게르빌루스 및 기니피그), 소, 양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 새(예를 들어, 닭, 칠면조, 오리, 거위), 영장류(예를 들어, 침팬지, 원숭이, 붉은털원숭이)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 바람직한 동물은 개이다.
"과발현(overexpression)"은 임의의 유전자 또는 단백질이 정상적인 수준 이상으로 발현되는 것으로 의미한다. 본 발명에서 PCK1 단백질의 발현이 정상세포의 발현양 이상으로 발현하는 것을 의미하며, 특히 근육조직 또는 근육조직을 이루는 세포에서 특이적으로 발현이 정상적인 수준 이상으로 발현하는 것일 수 있다. 과발현 형질전환체는 PCK1 단백질이 정상수준 이상으로 발현되는 형질전환 세포, 형질전환 조직 또는 형질전환 동물일 수 있다. 예를 들어, 근육 특이적 발현 시스템을 포함하는 물질에 해당 세포, 조직 또는 동물을 노출시키거나, 해당 물질을 도입함으로써 생성된 과발현 형질전환체일 수 있다.
"핵 이식"은 탈핵 된 난자에 다른 세포 또는 핵을 인공적으로 결합시켜 동일한 형질을 갖도록 하는 유전자 조작기술을 말한다. "핵 이식란"은 핵 공여 세포가 도입 또는 융합된 난자를 말한다.
"복제"는 한 개체와 동일한 유전자 세트를 가진 새로운 개체를 만드는 유전자 조작기술로서 특히 본 발명에서는 개의 체세포, 배아 세포, 태아 유래 세포 및/또는 성체 유래 세포가 다른 세포의 핵 DNA 서열과 실질적으로 동일한 핵 DNA 서열을 갖는 것을 말한다. 본 발명은 핵 이식 기술을 이용하여 개를 복제하는 기술을 이용한다. 특히, 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
"핵 공여 세포"는 핵 수용체인 수핵 난자로 핵을 전달하는 세포 또는 세포의 핵을 말한다. "난자"는 바람직하게는 제2차 감수분열 중기까지 도달한 성숙난자를 말한다. 본 발명에서 상기 핵 공여 세포로는 개의 체세포 또는 줄기세포를 사용할 수 있다.
"비만 저항성"은 지방산 산화, 에너지 소비 등 비만을 저해하는 메커니즘 또는 인자들을 증가 또는 활성화시켜 비만을 야기할 수 있는 요인 및 환경을 억제 또는 저해함으로써 비만의 발생이 억제되거나 감소된 상태를 의미한다.
및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
"약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "함유하다" 및 "포함하다"란 말은 제시된 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 원소, 또는 단계 또는 원소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열이 넉인(Knock in, KI)되어 에너지 대사 및 운동능이 향상된 형질전환 개, 이의 제조 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
보다 구체적으로 개 유래의 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열이 KI되어 에너지 대사 및 운동능이 향상된 형질전환 개, 이의 제조 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
에너지 대사나 성장에 관여하는 다양한 유전자들을 과발현시킨 모델이 개발되고 있으나, 현재까지는 에너지 대사 및 운동능을 향상시킨 동물 생산 연구는 주로 랫드와 마우스에서 이뤄졌을 뿐이다.
또한 사람이나 기계가 할 수 없는 분야를 대신할 수 있는 운동능이 향상된 중대형 동물의 필요성이 증가되고 있다. 이에 따라 유전학적, 형태기능학적, 행동학적인 측면에 비추어볼 때, 에너지대사 및 운동능을 향상시킨 형질전환 동물로서 개가 유용할 것으로 보인다. 따라서, 보다 구체적으로는 에너지 대사 및 운동능이 향상된 형질전환 개가 필요한 실정이다.
상기 중대형 동물의 운동능을 향상시키기 위해서 에너지 대사나 성장에 관여하는 다양한 유전자들을 과발현시킬 수 있다. 보다 구체적으로 그 유전자는 PCK일 수 있다.
PCK (Phosphoenolpyruvate carboxykinase)는 PEPCK로도 불리며 위치에 따라 2가지 isoform이 존재한다. 세포질에 존재하는 cytosolic isoform (PCK1)과 미토콘드리아에 존재하는 mitochondrial isoform (PCK2) 이다. 이 중, PCK1은 gluconeogenesis, glyceroneogenesis 과정 중 세포질에서 oxaloacetate (OAA)를 phosphoenolpyruvate (PEP)로 전환시켜주는 효소에 해당한다.
발명의 일 태양은, 근육조직 또는 근육세포 특이적으로 PCK1 과발현 된 형질전환 개 일 수 있다.상기 형질전환 개의 임의의 세포는 PCK1를 암호화하는 내재된 염기서열 외에 PCK1를 암호화하는 외래의 염기서열을 더 포함할 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포는 PCK1를 암호화하는 내재된 염기서열 외에 PCK1를 암호화하는 외래의 염기서열을 더 포함할 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포는 PCK1을 암호화하는 염기서열을 2 이상 포함할 수 있다.
상기 형질전환 개의 임의의 세포의 PCK1 발현량은 야생형 개의 임의의 세포의 PCK1 발현량보다 높을 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포의 PCK1 발현량은 야생형 개의 근육조직 또는 근육세포의 PCK1 발현량보다 높을 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포의 PCK1 발현량은 야생형 개의 근육조직 또는 근육세포에서의 PCK1 발현량보다 현저하게 높을 수 있다.
상기 형질전환된 개의 혈중 라이페이스(Lipase) 농도값은 야생형 개의 혈중 라이페이스 농도값의 약 0.5배, 약 0.4배, 약 0.3배, 약 0.2배 또는 약 0.1배의 값 또는 그 이하의 값을 가질 수 있다.
또 다른 태양으로, 상기 형질전환된 개를 생산하기 위하여 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열이 KI된 형질전환 세포를 제공할 수 있다.
상기 형질전환된 개를 생산하기 위하여 개 유래의 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열이 KI된 형질전환 세포 및 그 세포의 제조방법을 제공할 수 있다.
또 다른 태양으로, 상기 형질전환 세포를 제조하기 위하여 개 유래의 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터가 제공될 수 있다.
[근육 특이적 PCK1 발현 시스템]
PCK1
체내에서 PCK1 관련된 기전을 살펴보면 하기와 같다.
운동 등으로 에너지가 필요하게 되면, 혈중 glucose와 fatty acid가 근육 조직 내로 이동한다. Glucose는 glycolysis 과정을 통해 pyruvate를 생산한다. pyruvate가 미토콘드리아 내로 이동하여 acetyl CoA가 된 뒤, TCA cycle에서 ATP를 생산한다.
Fatty acid는 bate oxidation 을 통해 acetyl CoA를 생산한 뒤, 이 acetyl CoA가 TCA cycle에 들어가면서 ATP를 생산한다.
혈중 glucose가 일정 수준 이하로 고갈되면, TCA cycle 중 생성되는 malate가 미토콘드리아 밖으로 나온 뒤, OAA가 되고 PCK1에 의해 PEP을 생산한다. 또한, 세포질에 있던 lactate, alanine 등으로부터 pyruvate가 합성되고, OAA를 생산한 뒤 PCK1에 의해 PEP을 생산한다(glyceroneogenesis).
PEP으로부터 triglyceride가 생산되고, triglyceride로부터 fatty acid와 glycerol이 생산되면서 이들이 TCA cycle을 통한 에너지 생산에 이용된다.
따라서 PCK1 이 근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 과발현되는 경우에는 에너지 대사 및 운동능이 향상된 동물을 생산할 수 있다.
그러므로 본 발명은 PCK1 을 암호화 하는 염기서열을 인위적으로 특정 세포의 게놈에 삽입하여 PCK1 발현량이 증가된 형질전환 동물의 제조를 목적으로 한다.
본 발명은 개 유래의 PCK1을 암호화 하는 염기서열 또는 개 유래의 PCK1 유전자와 기능적 동등한 물질을 암호화하는 염기서열을 이용할 수 있다.
본 발명은 인간 유래의 PCK1을 암호화 하는 염기서열 또는 인간 유래의 PCK1 유전자와 기능적 동등한 물질을 암호화하는 염기서열을 이용할 수 있다.
근육 특이적 PCK1 발현 재조합 벡터
본 발명은 프로모터 및 임의의 물질을 암호화 하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 프로모터 및 임의의 물질을 암호화 하는 염기서열을 포함하며 임의의 세포의 염기서열을 변형할 수 있는 재조합 벡터를 제공한다.
일 실시예로, 상기 프로모터 및 상기 염기서열을 서로 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 상기 프로모터 및 상기 염기서열은 서로 작동 가능하게 연결되지 않을 수 도 있다.
일 실시예로, ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
일 실시예로, 임의의 동물 유래의 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
일 실시예로, 개 유래의 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열을 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
일 실시예로, 상기 ACTA 프로모터 및 PCK1 유전자는 작동 가능하게 연결되어 있을 수 있다. 상기 ACTA 프로모터 및 PCK1 유전자는 작동 가능하게 연결되지 않을 수 있다. 특정 구체예에서, 이때, 상기 벡터는 하나 이상의 전이인자를 더 포함하는 벡터일 수 있다.
상기 전이인자는 piggyBac 전이인자 또는 Sleeping Beauty 전이인자일 수 있다. 상기 전이인자는 전위를 매개하는 효소는 piggyBac 전위효소(transposase) 또는 Sleeping Beauty 전위효소(transposase)를 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 전이인자의 양 말단에 역말단반복서열(inverted terminal repeat sequence, ITR) 및/또는 direct repeat(DR)을 더 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 벡터는 piggyBac 벡터 또는 Sleeping Beauty 벡터일 수 있다.
일 실시예로, ACTA 프로모터, PCK1을 암호화하는 염기서열, 전이인자, 반복서열(ITR 및/또는 DR), 선택마커를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
일 실시예로, 도 1에 개시된 도면과 같은 순서로 배치된 ACTA 프로모터, PCK1을 암호화하는 염기서열, 전이인자, 반복서열(ITR 및/또는 DR), 선택마커를 포함하는 재조합 벡터를 제공할 수 있다.
상기 재조합 벡터는 임의의 세포의 게놈에 프로모터 및 임의의 물질을 암호화 하는 염기서열을 넉인(Knock in, KI)하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
이때, 상기 넉인(KI)은 특정 외래 유전자가 발현될 수 있도록 숙주의 게놈상에 도입되는 것을 의미한다.
상기 재조합 벡터는 근육 조직 또는 근육세포의 게놈에 프로모터 및 임의의 물질을 암호화 하는 염기서열을 넉인하기 위한 용도로 사용될 수 있다.
상기 PCK1을 암호화하는 염기서열은 당업계에 공지된, 비제한적인 PCK1을 암호화하는 염기서열을 가지는 서열로부터 당업자가 적절히 이용할 수 있다.
상기 PCK1을 암호화하는 염기서열은 당업계에 공지된 유전자 재조합 방법에 의하여 제조될 수 있다. 예컨대, 게놈으로부터 핵산을 증폭시키기 위한 PCR 증폭, 화학적 합성법 또는 cDNA 서열을 제조하는 기술, Fmoc 기술 등이 있다.
또한, 상기 염기서열은 PCK1의 각 기능적 동등물을 암호화하는 염기서열을 가질 수 있다.
상기 기능적 동등물이란, 아미노산 부가, 치환 또는 결실의 결과, 야생형(wildtype)의 아미노산 서열과 약70%, 약 71%, 약 72%, 약 73%, 약 74%, 약 75%, 약 76%, 약 77%, 약 78%, 약 79%, 약 80%, 약 81%, 약 82%, 약 83%, 약 84%, 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99% 또는 약 100%이상의 상동성을 갖는 서열을 포함하는 염기서열을 의미하는 것으로서 명세서에 개시되는 PCK1과 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 폴리펩타이드를 말한다. 상기 "동등한 생리활성"이란 미토콘드리아의 포도당신생합성, 생체 에너지 대사, 글루코스 항상성 또는 운동능 등을 조절하는 활성을 의미한다.
이때, 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 관련되지 않은 영역에 위치할 수 있다.
이때, 아미노산의 결실 또는 치환은 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드의 생리활성에 관련된 영역에 위치할 수 있다.
본 발명의 근육 특이적 PCK1 발현 재조합 벡터는 근육 조직 또는 근육 조직을 구성하는 세포에서 특이적으로 PCK1 유전자를 암호화하는 핵산을 발현할 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 전이인자 포함 벡터, 바이러스 벡터 또는 기타 매개체로서, 바람직하게는 전이인자 포함 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다.
상기 바이러스 벡터는, 이에 제한되지는 않으나, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 허피스 바이러스 벡터, 아비폭스바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터 등이 일 수 있다.
한편, 상기 재조합 벡터는 선택 마커를 더 포함할 수 있다. 상기 선택 마커는 카나마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자와 같은 항생제 저항성 유전자 또는 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질과 같은 형광 단백질 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, PCK1 단백질이 과발현되었는지 확인하기 위하여, 본 발명의 벡터 내에는 단백질 분리 정제 또는 확인용 태그 서열을 더 포함할 수 있다. 상기 태그 서열은 GFP, mRuby, GST (Glutathione S-transferase)-tag, HA, His-tag, Myc-tag, 또는 T7-tag 등 일 수 있으나, 있으나, 상기 예들에 의해 본 발명의 태그 서열이 제한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 상기 태그서열은 GFP 또는 mRuby를 사용하여 발현 유무 및 발현량을 확인할 수 있다.
명세서에 개시된 재조합 벡터를 이용하여 형질전환 세포를 제공할 수 있고,
상기 형질전환 세포를 이용하여 형질전환된 개를 제공할 수 있다.
즉, 명세서에 개시된 재조합 벡터를 이용하여 근육 자체에서 포도당신생합성 반응이 활성화 된 형질전환 개가 제공될 수 있다.
명세서에 개시된 재조합 벡터를 이용하여 근육 자체에서 포도당의 생성이 증가되어 에너지 대사 및 운동능이 향상된 형질전환 개가 제공될 수 있다.
형질전환 세포
본 발명은 프로모터 및 특정 물질을 암호화하는 염기서열이 넉인된 형질전환 세포를 제공한다.
본 발명은 ACTA 프로모터 및 PCK1을 암호화하는 염기서열이 넉인 된 형질전환 세포를 제공한다.
상기 ACTA 프로모터 및 PCK1을 암호화하는 염기서열은 당업자에게 자명한 공지의 방법을 통하여 넉인 될 수 있다. 상기 형질전환세포는 상기 재조합 벡터를 핵 공여 세포로 도입하여 생산될 수 있다.
본 발명은 상기 형질전환세포의 생산방법 및 상기 재조합 벡터가 도입된 세포를 제공한다.
상기 재조합 벡터는 당업자에게 자명한 임의의 방법에 의하여핵 공여 세포로 도입될 수 있다..
일 실시예로, 상기 핵 공여 세포는 개의 배아세포, 체세포 또는 줄기세포일 수 있다.
상기 핵 공여세포는, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 난구세포, 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌 세포, 연골세포, 마크로파지, 단구세포, 근육세포, B 림프구, T 림프구, 배아 줄기세포, 배아 생식세포, 태아 유래 세포, 태좌세포 및 배아세포 등이 있다. 또한, 다양한 기원 조직으로부터 유래된 성체 줄기세포, 예를 들어, 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈 또는 피부(상피) 등의 조직 유래 줄기세포 일 수 있다.
또한, 상기 핵 공여세포는, 비-인간 숙주 배아일 수 있으며, 일반적으로 2-세포 단계, 4-세포 단계, 8-세포 단계, 16-세포 단계, 32-세포 단계, 64-세포 단계, 상실배, 또는 배반포를 포함하는 배아일 수 있다.
또한, 상기 핵 공여세포는 태아 유래 세포 및 성체 섬유아세포, 지방 줄기세포일 수 있다.
또한, 상기 핵 공여세포는 개의 지방 줄기세포 또는 성체 섬유아세포 일 수 있다. 상기 세포의 특징은 초기 분리시 다수의 세포를 얻을 수 있고, 세포 배양도 비교적 쉬우며 체외에서 배양 및 조작이 용이하다는 장점을 지니고 있다.
일 실시예로서, 핵 공여 세포로서 제공되는 상기 배아세포, 체세포 또는 줄기세포는 당업계에 공지되어 있는 통상적인 방법을 사용하여 외과용 표본 또는 생체검사용 표본을 제조하는 방법으로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법으로 세포 내에 도입할 수 있다.
예를 들어, 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAEDextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 형질전환 동물 제작을 위한 세포 내로 도입될 수 있다.
한편, 상기 재조합 벡터를 이용하여 형질전환 세포의 게놈에 특정 유전자를 KI 할 수 있다. 근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 PCK1을 과발현 하기 위하여 세포 게놈 내 특정 영역을 이용할 수 있다.
일 예로, 이식유전자는 간 세포의 게놈 내 세이프 하버 영역(safe harbor site)에 삽입할 수 있다.
상기 세이프 하버 영역(safe harbor site)'는 외래 유전자가 삽입되어도 심각한 부작용, 예를 들어 암이 유발되지 않는 게놈 내 특정 영역이며, 상기 특정 영역 내 삽입된 외래 유전자는 영구적이고 안전하게 높은 수준의 발현이 가능하다.
일 실시예로, 상기 형질전환된 개를 생산하기 위하여 개 유래의 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열이 KI된 형질전환 세포를 제공할 수 있다.
상기 형질전환 세포는 PCK1를 암호화하는 내재된 염기서열 외에 PCK1를 암호화하는 외래의 염기서열을 더 포함할 수 있다.
상기 형질전환 세포는 PCK1를 암호화하는 내재된 염기서열 외에 PCK1를 암호화하는 외래의 염기서열을 더 포함할 수 있다.
상기 형질전환 세포는 PCK1을 암호화하는 염기서열을 2 이상 포함할 수 있다.
상기 형질전환 세포를 이용하여 상기 형질전환 개를 생산할 수 있다.
한편, 상기 형질전환 세포는 당업계에 공지된 방법에 따라 증식 또는 배양될 수 있다.
상기 형질전환 세포는 배지내에서 증식 또는 배양될 수 있다. 상기 배지는 배지는 동물 세포, 포유동물 세포의 배양을 위해 개발되거나, 또는 동물 세포 성장에 필요한 적절한 성분, 예컨대 동화성 탄소, 질소 및/또는 미량 영양소와 함께 실험실 내에서 제조될 수 있는 임의의 배지를 사용할 수 있다.
상기 배지는 동물 세포 성장에 적절한 임의의 기본 배지, 비제한적인 예로서, MEM(Minimal Essential Medium), DMEM(Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI(Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM(Keratinocyte Serum Free Medium), α-MEM 배지(GIBCO), K-SFM 배지, DMEM배지(Welgene), MCDB 131배지(Welgene), IMEM배지(GIBCO), DMEM/F12 배지, PCM 배지, M199/F12(mixture)(GIBCO), 및 MSC 확장배지(Chemicon) 등 일 수 있다. 이 외에도 당해 업계에서 이용되는 배지라면 제한없이 사용할 수 있다. 상기 배지에 탄소, 질소 및 미량 영양소의 동화성 공급원, 혈청 공급원, 성장 인자, 아미노산, 항생제, 비타민, 환원제, 및/또는 당 공급원 등이 더 첨가될 수 있다.
당업계에서 통상의 지식을 가진 자가 적합한 배지를 선택 또는 조합하여 공지의 방법으로 적절히 배양할 수 있다. 또한, 이 분야의 통상의 지식에 기초하여 적합한 배양 환경, 시간, 온도 등의 조건을 조절하면서 배양할 수 있다.
상기 형질전환 세포를 이용하여 형질전환 개를 생산할 수 있다.
그 방법으로서 체세포 핵이식 방법(somatic cell nuclear transfer, SCNT)을 이용할 수 있다.
상기 형질전환 세포의 핵을 동물의 수정란에 이식시키고, 핵이 이식된 수정란을 착상시켜 프로모터 및 특정 물질을 암호화하는 염기서열이 넉인된 형질전환 개체를 생산할 수 있다.상기 형질전환 세포의 핵을 동물의 수정란에 이식시키고, 핵이 이식된 수정란을 착상시켜 ACTA 프로모터 및 PCK1을 암호화하는 염기서열이 넉인된 형질전환 개체를 생산할 수 있다.
[형질전환 동물]
본 발명은 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열이 넉인(Knock in, KI)되어 에너지 대사 및 운동능이 향상된 형질전환 개, 이의 제조 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
보다 구체적으로 개 유래의 ACTA 프로모터 및 PCK1를 암호화 하는 염기서열이 KI되어 에너지 대사 및 운동능이 향상된 형질전환 개, 이의 제조 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
보다 구체적으로 개 유래의 ACTA 프로모터 및 인간 유래의 PCK1를 암호화 하는 염기서열이 KI되어 에너지 대사 및 운동능이 향상된 형질전환 개, 이의 제조 방법 및 이의 이용에 관한 것이다.
상기 형질전환 개의 임의의 세포는 PCK1를 암호화하는 내재된 염기서열 외에 PCK1를 암호화하는 외래의 염기서열을 더 포함할 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포는 PCK1를 암호화하는 내재된 염기서열 외에 PCK1를 암호화하는 외래의 염기서열을 더 포함할 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포는 PCK1을 암호화하는 염기서열을 2 이상 포함할 수 있다.
상기 형질전환 개의 임의의 세포의 PCK1 발현량은 야생형 개의 임의의 세포의 PCK1 발현량보다 높을 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포의 PCK1 발현량은 야생형 개의 근육조직 또는 근육세포의 PCK1 발현량보다 높을 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포의 PCK1 발현량은 야생형 개의 근육조직 또는 근육세포의 PCK1 발현량보다 약 1배, 약 1.1배, 약 1.2배, 약 1.3배. 약 1.4배. 약 1.5배. 약 1.6배, 약 1.7배, 약 1.8배, 약 1.9배, 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 약 9배, 약 10배, 또는 그 이상의 임의의 배수만큼 높을 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포에서의 PCK1 발현량은 야생형 개의 근육조직 또는 근육세포에서의 PCK1 발현량보다 높을 수 있다.
상기 형질전환 개의 근육조직 또는 근육세포에서의 PCK1 발현량은 야생형 개의 근육조직 또는 근육세포에서의 PCK1 발현량보다 현저하게 높을 수 있다.
상기 형질전환된 개의 혈중 라이페이스(Lipase) 농도값은 야생형 개의 혈중 라이페이스 농도값의 약 0.5배, 약 0.4배, 약 0.3배, 약 0.2배 또는 약 0.1배의 값 또는 그 이하의 값을 가질 수 있다.
상기 형질전환된 개의 혈중 라이페이스(Lipase) 농도값은 야생형 개의 혈중 라이페이스 농도값의 약 2배, 약 3배, 약 4배, 약 5배 또는 약 6배의 값 또는 그 이상의 값을 가질 수 있다.
상기 형질전환된 개의 혈중 라이페이스(Lipase) 농도값은 야생형 개의 혈중 라이페이스 농도값의 0.25배 이하 또는 4배 이상의 값을 가질 수 있다.
상기 형질전환된 개를 생산하기 위하여 상기 형질전환 세포를 이용할 수 있다. 일 실시예로,상기 형질전환세포를 적합한 조건하에서 착상시켜 임신을 유도할 수 있다.
그 방법으로, 예를 들어, 형질전환된 세포를 체세포핵 이식법(SCNT)을 통해 임신을 유도할 수 있다.
일 실시예로, 본 발명은, 개 유래의 ACTA 프로모터 및 PCK1을 암호화하는 염기서열을 넉인 시킨 형질전환 세포주를 이용하여 체세포 핵이식 방법(somatic cell nuclear transfer, SCNT)으로 본 발명의 형질전환된 동물을 생산할 수 있다.
상기 형질전환된 동물은 PCK1 과발현된 개 일 수 있다.
상기 형질전환된 동물은 근육조직 또는 근육세포에서 PCK1 과발현된 개 일 수 있다.
특정 구체예로, 본 발명의 형질전환된 개 생산방법은,
(a) 개로부터 분리한 체세포 또는 줄기세포를 배양하는 것을 포함하는 핵 공여 세포 제조함;
(b) ACTA 프로모터와 PCK1을 암호화 하는 염기서열을 포함하는 재조합벡터를 상기 핵 공여 세포에 도입함;
(c) 개의 난자로부터 핵을 제거하여 탈핵 난자를 제조함;
(d) 상기 탈핵 난자에 핵 공여 세포를 미세주입하고 융합함;
(e) 상기 융합된 난자를 활성화함; 및
(f) 상기 활성화된 난자를 대리모 개의 난관에 이식함을 포함할 수 있다.
각 단계에 관한 통상적 기술 내용은 당업계에 공지되어 있는 종래의 체세포 핵이식 기술을 이용한 복제 동물의 제조방법 등을 참조하여 이용될 수 있다.
일 구체예로서상기 형질전환된 세포의 핵을 탈핵된 난자에 이식하여 형성된 개의 핵 이식란 제조방법 및 이에 의해 제조된 핵 이식란을 제공할 수 있다.
일 실시예로서, 상기 핵 이식란을 대리모의 난관에 이식하여 산자를 생산함을 포함하는 ACTA 프로모터 및 PCK1을 암호화하는 염기서열이 넉인된 PCK1 과발현 형질전환 개의 제조방법 또는 이에 의해 제조된 ACTA 프로모터 및 PCK1을 암호화하는 염기서열이 넉인된 것을 특징으로 하는 PCK1 과발현 개를 제공한다.
일 실시예로서, 본 형질전환 동물의 생산방법을 제공할 수 있다.,
상기 형질전환은 뉴클레아제(nuclease)를 이용할 수 있다.
상기 방법은 배아 또는 세포를 재조합 벡터(예를 들면, PCK1을 함유하는 재조합 벡터)에 노출시킴,
대리모내 세포를 클로닝하거나, 대리모내 배아들을 이식함을 포함할 수 있다.
상기 뉴클레아제(nuclease)는 배아 또는 세포내 표적 염색체 부위에 특이적으로 결합하여 세포 염색체의 염기서열 변화를 일으킬 수 있다.
[용도]
본 발명의 일 구체예는 PCK1 유전자가 넉인된, 근육 특이적으로 PCK1 단백질이 과발현된 개의 용도를 제공한다.
본 발명의 따른 PCK1 유전자 넉인된 근육 특이적 PCK1 과발현 형질전환 개는 교배를 통해 생산이 가능하며, 후대로 상기 외부 유전자의 전달이 가능하다.
그러므로, 본 발명의 PCK1 유전자가 넉인된 것과 상기 넉인된 PCK1 유전자가 근육에서 특이적으로 단백질로 발현하는 것을 특징으로 하는 개는 용이한 재형 가능성을 장점으로 가지고 있는바, 근육 특이적으로 PCK1 단백질을 발현하여 생체 에너지 대사 및 운동능이 향상된 동물 모델 및/또는 대사성 질환, 예를 들면, 당뇨 등과 같은 질환에 저항성을 가지는 동물 모델로서 유용할 수 있다.
즉, 본 발명의 근육 특이적 PCK1 과발현 개는 향상된 운동능을 필요로하는 검역견으로 이용되거나 또는 대사성 질환을 유발 또는 치료하는데 관여하는 메커니즘 연구, PCK1의 역할, 근육량, 근력, 근섬유, 미토콘드리아 생합성, 에너지 대사의 변화등을 연구하기 위한 모델 등 다양한 활용이 가능할 것이다.
그러므로, 본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 근육 특이적 PCK1 과발현 개의 다양한 용도를 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 동물모델은 에너지 대사 향상을 위한 약제를 스크리닝하는 방법으로 사용될 수 있다.
일 구체예로서, 본 발명의 상기 스크리닝 방법은
1) 근육 특이적 PCK1 과발현 개에 근 지구력을 유지하거나 증가시키길 수 있는 후보물질을 투여함;
2) 후보물질 투여 후, 상기 개의 근육 조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 분석함을 포함할 수 있다.
이때, 에너지 대사는 미토콘드리아 생합성, 미토콘드리아 활성, 포도당신생합성 등을 의미할 수 있다.
상기 후보물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물,세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.다만, 이에 한정되지 않는다. 상기 화합물은 신규 화합물 일 수 있고,, 널리 알려진 화합물 일 수 있다.. 이러한 후보 물질은 염을 형성하고 할 수 있다..
상기와 같은 후보 물질을 투여하는 방법으로는 예를 들면, 경구투여, 정맥주사, 피하투여, 피내투여 또는 복강 투여 등의 방법일 수 있다. 대상 동물의 증상, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한, 후보 물질의 투여량은 투여 방법 또는 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.
예를 들어, 본 발명에 따른 동물모델은 운동능 향상을 위한 약제를 스크리닝하는 방법으로 사용될 수 있다.
일 구체예로서, 본 발명의 상기 스크리닝 방법은
1) 근육 특이적 PCK1 과발현 개에 비만 저항성을 유지하거나 증가시키길 수 있는 후보물질을 투여함;
2) 후보물질 투여 후, 상기 개의 조직을 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 분석함을 포함할 수 있다.
이때, 운동능은 대조군 대비 근육량, 근력, 근지구력 등일 수 있다.
상기 후보물질은 펩티드, 단백질, 비펩티드성 화합물, 합성 화합물, 발효 생산물,세포 추출액, 식물 추출액, 동물 조직 추출액 및 혈장으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다.다만, 이에 한정되지 않는다. 상기 화합물은 신규 화합물일 수 있고,, 널리 알려진 화합물 일 수 있다.. 이러한 후보 물질은 염을 형성할 수 있다. 상기와 같은 후보 물질을 투여하는 방법으로는 예를 들면, 경구투여, 정맥주사, 피하투여, 피내투여 또는 복강 투여 등 일 수 있고, 대상 동물의 증상, 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다. 또한, 후보 물질의 투여량은 투여 방법 또는 후보 물질의 성질 등에 맞추어 적당히 선택할 수 있다.
비만 및 대사성 질환
본 발명에서 비만은 일반적으로 체내에 지방 조직이 과다한 상태인 것을 의미하며, 음식물로 섭취한 에너지가 신체활동 등으로 소비한 에너지와 균형을 이루지 못하여 잉여의 에너지가 체지방으로 축적되는 현상을 의미한다. 오랜 시간에 걸쳐 에너지 불균형에 의해 체지방이 비정상적으로 많아지면 당뇨병, 고지혈증, 심장병, 뇌졸증, 동맥경화증, 지방간 등의 각종 대사성 질환과 성인병이 유발될 수 있다.
상기 비만은 형태학적으로 볼 때 체내 지방 세포의 크기 증가(hypertrophy) 또는 수의 증가(hyperplasia)에 의해 초래될 수 있다.
비만은 내분비적인 요인, 유전적인 요인, 사회 환경적 요인 등에 의해 대사 과정의 불균형이 발생하는 경우, 체내에 과잉된 에너지가 지방으로 축적됨으로써 야기되는 피하지방 조직의 이상 비대화에 기인한다. 지방조직의 비대화는 지방세포의 크기가 커지거나(지방세포의 비대화) 그 수가 증가하는(지방세포 과형성) 현상으로, 이는 국소 정맥-림프 체계의 정체에도 영향을 미쳐 진피-피하 조직의 혈관조직 질환도 유발할 수 있다.
비만환자에게 과도하게 축적된 중성지방은 지방조직뿐 아니라, 간이나 근육에 저장되어 인슐린 저항성을 유도할 수 있다. 따라서, 과도하게 저장된 중성지방의 소모가 근본적인 비만과 이에 따른 대사질환의 예방 및 치료가 될 수 있다.
상기 비만 및 대사성 질환을 치료 또는 완화하기 위해서 상기 재조합 벡터를 이용할 수 있다.
상기 재조합 벡터를 이용하여 생체의 특정 부위에 투여하는 경우 비만 및 대사성 질환이 치료 또는 완화될 수 있다.
상기 재조합 벡터를 이용하여 생체의 특정 부위에 투여하는 경우 지방조직 또는 지방세포 등의 양이 감소할 수 있다.
상기 비만 또는 대사성 질환은, 이에 제한되는 것은 아니나, 대사증후군, 고트리글리세라이드혈증, 고밀도 지질 혈증, 저밀도 지질 혈증, 협심증, 심근경색, 성기능부전증, 수면무호흡증, 월경전 증후군, 스트레스성 뇨실금을 포함하는 뇨실금, 과행동장애, 만성 피로 증후군, 골관절염, 체중 증가와 관련된 암, 기립성 저혈압, 폐고혈압, 월경장애, 당뇨병, 고혈압, 손상된 내당력, 관상동맥혈전증, 졸증, 우울증, 불안증, 정신병, 지연성 운동장애, 약물중독, 약물 남용, 인지장애, 알츠하이머병, 뇌허혈, 강박성 행동, 공황발작, 사회공포증, 대식증, 아테롬성동맥경화증, 담석증과 같은 담낭 질병, 식욕부진, 다낭성 난소 질환과 같은 생식장애,감염, 정맥류성 정맥, 표피증식 및 습진과 같은 피부병, 인슐린 저항성, 만성 동맥폐색증, 정형외과적 상해, 혈전색전증, 심장질환, 비뇨기질환, 지질증후군, 과혈당증 및 스트레스로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 비만 관련 질환일 수 있다.
본 발명의 근육 특이적 PCK1 과발현 모델용 개는 PCK1 단백질이 근육 조직에서 과발현됨에 따라 PCK1의 활성이 인위적으로 증가하여 근육 자체에서 포도당신생합성 반응이 활성화시켜 포도당의 생성이 증가를 유도하고, 또한 에너지 대사 및 운동능의 향상을 유도하므로, 이에 따라 에너지 대사 및 운동능이 향상된 비만 저항성을 가진 동물모델로 제공될 수 있다.
더불어, 본 발명의 근육 특이적 PCK1 과발현 개는 PCK1 단백질이 근육 조직에서 과발현됨에 따라 PCK1의 활성이 인위적으로 증가하여 근육 자체에서 포도당신생합성 반응이 활성화시켜 포도당의 생성이 증가를 유도하고, 또한 에너지 대사 및 운동능의 향상을 유도하므로, 이에 따라 에너지 대사/운동능 향상 연구를 위한 동물모델로 제공될 수 있다.
본 발명은 근육 특이적 PCK1 과발현 개 및 이의 다양한 용도를 제공함으로써, 근육 특이적으로 과발현된 PCK1에 의해 포도당신생합성 반응이 활성화시켜 포도당의 생성이 증가, 에너지 대사 및 운동능의 향상된 개를 이용한 비만 등과 같은 대사성 질환 관련 연구(비만 저항성 연구 등), 에너지 대사/운동능 향상 연구 등에 다양하게 활용될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
발명의 실시를 위한 형태
실시예 1. 근육 특이적 PCK1 과발현 개의 생산을 위한 벡터 구축
PCK1 유전자는 간, 신장, 지방세포, 소장, 폐, 근육, 뇌 등 다양한 조직에서 발현된다. PCK1이 광범위한 조직에서 발현되므로 부작용을 줄이기 위해서는 특정 조직에 한정하여 발현을 증가시킬 수 있는 프로모터 선정이 중요하다. 본 연구에서는 근육세포에 특이적으로 PCK1을 발현하는 개를 생산하기 위하여 근육 특이적 promoter인 α-skeletal muscle actin promoter (2,372 bp)와 인간 유래의 PCK1 유전자(1,896 bp)를 합성한 뒤, 근육 특이적 promoter의 조절 하에 PCK1 유전자를 도입한 PiggyBac vector cloning를 합성하였다. 표지 유전자로서는 mRuby 유전자를 사용하였다(도 1). ACTA promoter의 염기서열은 서열번호 1, PCK1의 염기서열은 서열번호 2, 및 본 실험에서 구축한 벡터의 염기서열은 서열번호 3, 5' PB termunal repeat 및 3' PB termunal repeat은 각각 서열번호 4 및 5로 표시하였다.
실시예 2. 세포에서의 벡터 도입 확인
pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector를 보유하고 있는 일반 비글 성체섬유아세포(fibroblast)와 지방줄기세포(Adipose-derived stem cell, ASC)에 도입한 후 분자생물학적 분석 실시한 결과, RT-PCR에서 vector가 genome 내로 도입되었음이 확인되었으며 표지 유전자인 mRuby의 발현을 형광 현미경 하에서 확인하였다(도 2, 도 3).
두 세포 중에서 지방줄기세포에서 적색 형광 단백질의 발현이 확인되는 세포 수가 더 많은 것으로 나타났다. 따라서 형질전환 복제견 생산에 사용할 세포주로는 성체섬유아세포보다 지방줄기세포가 적합한 것으로 판단하였다.
실시예 3. 체세포 핵 이식
복제하고자 하는 탐지견 비글의 지방줄기세포에 pPB-ACTAp-PCK1-Red/Puro vector를 도입하여 세포주를 구축한 후 분자생물학적 검정을 실시하였으며, vector의 전이 및 발현이 확인된 세포주를 체세포 핵이식에 사용하였다(도 4, 도 5).
체세포 핵이식을 실시 및 체외 배양 후 복제 배아에서 표지 유전자인 mRuby의 발현을 확인하였다(도 6).
체세포 핵이식 복제란을 대리모에 이식 후 총 1마리의 근육 특이 PCK1 발현 형질전환 복제 비글을 생산하였다. 생산된 개체의 혈액 샘플을 이용하여 genomic DNA PCR과 Southern blot을 실시하여 유전체 내에 안정적으로 삽입된 것을 검증하였다(도 7, 도 8).
실시예 4. 형질전환 복제견의 혈청화학 및 Phenotype 분석 결과
형질전환 복제견과 대조군에서 1, 2, 4, 6개월령일 때 혈청화학검사를 실시한 결과, 비록 형질전환 복제견이 1두 뿐이라 통계학적으로 비교할 수는 없었으나 혈중 triglyceride 농도가 대조군의 증가 추세보다 더 급격하게 증하는 것을 확인하였다(도 9). 이는 포도당신생과정이 증가함에 따라 그 산물인 triglyceride의 농도가 증가하는 것을 입증하는 것이다.
또한, 혈중 lipase 농도가 대조군에서는 증가하는 추세를 보였던 반면, 형질전환 개체에서는 1개월령에 대조군보다 약 20배 가량 높았다가 점차 감소하였다. 이는 형질전환 개체에서 자율적인 움직임이 어려운 유견일 때는 과형성된 triglyceride를 분해하기 위해 lipase의 농도가 높았으나 자율적인 움직임이 가능해지는 자견 때부터는 운동을 통해 에너지를 발산하고 지방조직의 축적이 적어지면서 분해해야 하는 triglyceride의 농도가 적어졌기 때문인 것으로 해석된다.
또한 PCK1 과발현 형질전환 개체는 Glyceroneogenesis의 증가로 인하여 하기와 같은 Phenotype을 보였다. 근육 내 PCK1 생산량, 케이지 내 활동량, 운동능, 근육 내 미토콘드리아 수, 사료섭취량이 증가하였음을 확인하였다. 근육 내 미토콘드리아 수가 증가함으로써 과량 생산된 triglyceride가 소모가능하여 조직 내 lactate 농도가 대조군에 비야하 낮게 관찰됨을 확인하였다.
수명연장, 번식 수명 연장됨을 확인하였다.
그리고 MRI 확인 결과 지방조직 부피가 감소하였음을 확인하였다. 혈액 내 leptin, MCP-1, insulin의 농도 감소로 식욕이 증가하는 모습을 보임을 확인하였다.
실시예 5. 형질전환 복제견의 대퇴근육의 MRS 촬영결과
복제탐지견 대퇴근육의 MRS(magnetic resonance spectrography) 촬영을 진행하였다. MRS 촬영 영상은 TARQUIN(version 4.3.10. Birmingham, UK) 소프트웨어를 사용하여 분석되었고, MRS criteria에 따라서 평가되었다.
복제 탐지견의 모음근(Adductor muscle)의 근육 성상 스펙트럼의 결과는 하단의 표 1 및 도 10 내지 도 15에 나타내었다. 도 10 내지 도 14는 대조군 1 내지 대조군 5에 대한 결과이며, 대조군 1 내지 3과 대조군 4 및 5의 스펙트럼은 Lipid13b물질을 제외하고는 비슷한 양상을 나타내었다.
PCK1 과발현 복제견 '우주'의 스펙트럼과 일반 복제견인 대조군 1 내지 5의 스펙트럼을 비교하면, 전반적으로 PCK1 과발현 복제견에서 metabolite 물질들의 절대적인 농도 수치들이 높게 검출되었다.
근육 내 metabolite 값을 Creatinine(Cr) 물질로 나눈 상대적인 값(metabolite/Cr)을 비교한 것은 아래 표 1로 나타내었으며, 일부의 metabolite/Cr 값들만이 PCK1 과발현 복제견에서 높게 확인되었다.
| 대조군 1 | 대조군 2 | 대조군 3 | 대조군 4 | 대조군 5 | PCK1 | |
| Ala:Cr | 0.590654 | 2.440945 | 2.852113 | 2.53463 | 1.61 | 2.28 |
| Asp:Cr | 3.439252 | 2.952756 | 1.725352 | 0.765811 | 1.61 | 1.87 |
| Cr:Cr | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| GABA:Cr | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| GPC:Cr | 0.842991 | 0.850394 | 0.739437 | 0.583113 | 0.63 | 0.24 |
| Glc:Cr | 0.623364 | 0.373228 | 0.493662 | 0.551045 | 0.872 | 0.264 |
| Gln:Cr | 0.86729 | 0.714173 | 0.264085 | 1.000515 | 0.84 | 0.141 |
| Glth:Cr | 0.324299 | 0.338583 | 0.371127 | 0.251672 | 0 | 0.356 |
| Glu:Cr | 0.373832 | 0.565354 | 0.760563 | 3.064577 | 0.731 | 0.369 |
| Ins:Cr | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Lac:Cr | 0.7486 | 1.16535 | 1.76056 | 0.93318 | 0 | 2.3 |
| Lip09:Cr | 2.570093 | 2.094488 | 1.598592 | 17.74347 | 22.3 | 13.4 |
| Lip20:Cr | 1.33645 | 1.33858 | 1.46479 | 2.58341 | 2.65 | 2.72 |
| MM09:Cr | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MM17:Cr | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MM20:Cr | 0.134579 | 0.262992 | 0.66831 | 8.132649 | 0.43 | 0.929 |
| NAA:Cr | 0.069252 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| NAAG:Cr | 0.091402 | 0.024961 | 0 | 0 | 0.0654 | 0 |
| PCh:Cr | 0.12523 | 0 | 0.06169 | 0 | 0.128 | 0.273 |
| PCr:Cr | 1.130841 | 0.765354 | 0.838028 | 1.075382 | 0.762 | 0.404 |
| Scyllo:Cr | 0.041402 | 0 | 0 | 0 | 0.0282 | 0.00477 |
| Tau:Cr | 1.719626 | 1.291339 | 0.978873 | 1.047401 | 0.641 | 0.458 |
| TNAA:Cr | 0.160748 | 0.024961 | 0 | 0 | 0.0654 | 0 |
| TCho:Cr | 0.971963 | 0.850394 | 0.802817 | 0.583113 | 0.757 | 0.513 |
| TCr:Cr | 2.130841 | 1.771654 | 1.84507 | 2.075382 | 1.76 | 1.4 |
| Glx:Cr | 1.242991 | 1.275591 | 1.021127 | 4.065093 | 1.57 | 0.51 |
| TLM09:Cr | 2.570093 | 2.094488 | 1.598592 | 3.953779 | 3.01 | 2.44 |
| TLM13:Cr | 23.5514 | 18.97638 | 18.87324 | 17.74347 | 33.1 | 30.5 |
| TLM20:Cr | 1.476636 | 1.598425 | 2.133803 | 10.71606 | 3.08 | 3.65 |
실시예 6. 근육특이적 PCK1 과발현 복제개에서 X-ray를 이용한 해부학적 정상성 평가
흉복부 및 두개골, 요추, 골반의 방사선 촬영 결과 대조군 4 및 5, 그리고 PCK1 과발현 복제견에서 이상 소견이 관찰되지 않음을 확인하였다(도 16 내지 도 20).
Growth and hematologic characteristics of cloned dogs derived from adult somatic cell nuclear transfer(Park JE et al., 2010) 논문을 참고하여 두개골, 요추, 골반의 측정결과 모두 정상 결과값으로 판단되었다.
PCK1 과발현 복제견과 일반 복제견(대조군 1내지 5) 사이의 측정값에는 차이가 없는 것으로 판단되었다.
실시예 7. 근육특이적 PCK1 과발현 복제개에서 심장초음파를 이용한 정상성 평가
Right parasternal long axis 5 chamber view의 M-mode에서 Teichholz 측정 결과 대조군 4, 대조군5, 및 PCK1 과발현 복제견의 데이터 값은 모두 정상범위 안에 있는 것으로 판단되었다(표 2).
| Teichholz | 대조군4 | 대조군5 | PCK1 |
| IVSd(mm) | 10 | 7 | 8 |
| LVIDd(mm) | 27 | 26 | 26 |
| LVPWd(mm) | 10 | 8 | 11 |
| IVSs(mm) | 13 | 10 | 13 |
| LVIDs(mm) | 17 | 15 | 14 |
| LVPWs(mm) | 13 | 14 | 12 |
| EDV(ml) | 26 | 24 | 26 |
| ESV(ml) | 8 | 6.2 | 4.7 |
| EF(%) | 75.6 | 79.6 | 81.6 |
| FS(%) | 37.6 | 41.2 | 48.4 |
PCK1 과발현 복제견과 일반 복제견 사이의 심장기능 비교 결과 차이가 없는 것으로 판단되었다.
Right parasternal long axis 5 chamber view에서 LA/AO ratio 측정 결과 대조군 4, 대조군 5, 및 PCK1 과발현 복제견의 데이터 값은 모두 정상범위 안에 있는 것으로 판단되었다(표 3).
| 대조군4 | 대조군5 | PCK1 | |
| LA/AO | 1.13 | 1.01 | 1.02 |
Right parasternal long axis 5 chamber view에서 RVTO flow 측정 결과 대조군 4, 대조군 5, 및 PCK1 과현 복제견의 데이터 값은 모두 정상범위 안에 있는 것으로 판단되었다(표 4).
| 대조군4 | 대조군5 | PCK1 | |
| pV | 96.1 | 147.6 | 108.2 |
| AT/ET | 0.41 | 0.39 | 0.46 |
Left apical 4 chamber view에서 mitral flow, TDI 측정결과 대조군4, 대조군 5, PCK1 과발현 복제견의 데이터 값은 모두 정상범위 안에 있는 것으로 판단되었다(표 5).
| 대조군4 | 대조군5 | PCK1 | |
| Mitral flow | |||
| E/A | 1.61 | 1.83 | 1.67 |
| TDI | |||
| E/E' | 8.92 | 11.87 | 8.89 |
심장의 2D 평가상 선천성 심질환 및 구조적 이상소견, Color Doppler 검사상 심장 혈류의 역류현상, 및 심장의 수축기/이완기 기능 검사상 대조군4, 대조군 5, PCK1 과발현 복제견 모두에서 관찰되지 않았음을 확인하였다.
결국 대조군4, 대조군 5, PCK1 과발현 복제견의 심장은 모두 정상인 것으로 판단되었다.
실시예 8. 근육특이적 PCK1 과발현 복제개에서 CT를 이용한 해부학적 정상성 평가
근육 특이적 PCK1 과발현 복제개의 해부학적 정상성을 평가하기 위해 CT 촬영을 진행하였다. 간담도계의 기형 및 후두부-경추 기형은 대조군4, 대조군 5, PCK1 과발현 복제견 모두에서 발생하지 않은 것으로 판단되었다(도 21)
20191031_OPP19-079-PCT_서열목록.app
<110> Seoul National University Industry Foundation
<120> Production of transgenic dogs that overexpress PCK1 in a muscle
specific manner
<130> OPP19-079-PCT
<150> KR 10-2018-0131498
<151> 2018-10-31
<160> 5
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 2372
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ACTA (alpha-skeletal muscle actin) promoter
<400> 1
aagctttctg taaggaaagg taagagttga actgagcaag agttttgaaa aatagtgaca 60
atcccattct cctttggaat gcgcacaaat attgaggtat ccagtgaacg gcagcaaatt 120
tcctaccttc aaggcccaaa tgtaagctag tccccttacg ttacatgcag ctcatttgct 180
aagtggtttt tttctagtat ctccactact cgctgacaca ggaggacaca ggatgttaaa 240
aaggaaatac agttctgtca attattcact tactctccaa aatacttgga agaactaaat 300
atggaaccat aggagacttt atcctcaccg catagtccct atactagtca aactccttat 360
tttttaattg atcattttta ggaaggtagc attttattca ctagaacatt tttgttaata 420
cttgtttatt tttgggatga actgccatga tgtgggctac agaggagggt cgcatatgct 480
tccatccccc ttttagagaa tccacacctg tcccagttgc tgggttccac taccaaaagt 540
gaattgcaac tattttagga gcacttaagc acatccgaaa aatgagtgat tctgttctgg 600
cccacaccac atcactgatg taccccctta aagcatgtcc ctgagttcat cacagaagac 660
tgctcctcct gtgccctcca caaggttaga actgtccttg tcttagggaa aaaggagaga 720
gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagggaca ggcaccaact 780
gggtaacctc tgctgacccc cactctactt taccataagt agctccaaat ccttctagaa 840
aatctgaaag gcatagcccc atatatcagt gatataaata gaacctgcag caggctctgg 900
taaatgatga ctacaaggtg gactgggagg cagcccggcc ttggcaggca tcatcctcta 960
aatataaaga tgagtttgtt cagcctttgc agaaggaaaa actgccaccc atcctagagt 1020
gccgcgtcct tgtcccccca ccccctccaa tttattggga ggaaggacca gctaagcctc 1080
atctaggaag agcccctcac ccatctccac ctccactcca ggtctagcca gtcctgggtt 1140
gtgacccttg tctttcagcc ccaggagagg gacacacata gtgccaccaa agaggctggg 1200
ggagggcctc agcccaccaa aacctggggc cagtgcgtcc tacaggaggg gaaccctcac 1260
cccttcaatc cctttaggag acccaagggc gctgcgcgtc cctgaggcgg acagctccgt 1320
gtgctcaggc tttgcgcctg acaggcctat ccccgggagc ccccgcgcct cctccccggc 1380
gctccgccct cgcctccccc cgccagttgt ctatcctgcg acagctgcgc gccctccggc 1440
cgccggtggc cctctgtgcg gtgggggaag gggtcgacgt ggctcagctt tttggattca 1500
gggagctcgg gggtgggaag agagaaatgg agttccaggg gcgtaaagga gagggagttc 1560
gccttccttc ccttcctgag actcaggagt gactgcttct ccaatcctcc caagcccacc 1620
actccacacg actccctctt cccggtagtc gcaagtggga gtttggggat ctgagcaaag 1680
aacccgaaga ggagttgaaa tattggaagt cagcagtcag gcaccttccc gagcgcccag 1740
ggcgctcaga gtggacatgg ttggggaggc ctttgggaca ggtgcggttc ccggagcgca 1800
ggcgcacaca tgcacccacc ggcgaacgcg gtgaccctcg ccccacccca tcccctccgg 1860
cgggcaactg ggtcgggtca ggaggggcaa acccgctagg gagacactcc atatacggcc 1920
cggcccgcgt tacctgggac cgggccaacc cgctccttct ttggtcaacg caggggaccc 1980
gggcgggggc ccaggccgcg aaccggccga gggagggggc tctagtgccc aacacccaaa 2040
tatggctcga gaagggcagc gacattcctg cggggtggcg cggagggaat gcccgcgggc 2100
tatataaaac ctgagcagag ggacaagcgg ccaccgcagc ggacagcgcc aagtgaagcc 2160
tcgcttcccc tccgcggcga ccagggcccg agccgagagt agcagttgta gctacccgcc 2220
caggtagggc aggagttggg aggggacagg gggacagggc actaccgagg ggaacctgaa 2280
ggactccggg gcagaaccca gtcggttcac ctggtcagcc ccaggcctgc gccctgagcg 2340
ctgtgcctcg tctccggagc cacacgcgct tt 2372
<210> 2
<211> 1869
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCK1
<400> 2
atgcctcctc agctgcaaaa cggcctgaac ctctcggcca aagttgtcca gggaagcctg 60
gacagcctac cccaggcagt gagggagttt ctcgagaata acgctgagct gtgtcagcct 120
gatcacatcc acatctgtga cggctctgag gaggagaatg ggcggcttct gggccagatg 180
gaggaagagg gcatcctcag gcggctgaag aagtatgaca actgctggtt ggctctcact 240
gaccccaggg atgtggccag gatcgaaagc aagacggtta tcgtcaccca agagcaaaga 300
gacacagtgc ccatccccaa aacaggcctc agccagctcg gtcgctggat gtcagaggag 360
gattttgaga aagcgttcaa tgccaggttc ccagggtgca tgaaaggtcg caccatgtac 420
gtcatcccat tcagcatggg gccgctgggc tcgcctctgt caaagatcgg catcgagctg 480
acggattcac cctacgtggt ggccagcatg cggatcatga cgcggatggg cacgcccgtc 540
ctggaagcag tgggcgatgg ggagtttgtc aaatgcctcc attctgtggg gtgccctctg 600
cctttacaaa agcctttggt caacaactgg ccctgcaacc cggagctgac gctcatcgcc 660
cacctgcctg accgcagaga gatcatctcc tttggcagtg ggtacggcgg gaactcgctg 720
ctcgggaaga agtgctttgc tctcaggatg gccagccggc tggccaagga ggaagggtgg 780
ctggcagagc acatgctgat tctgggtata accaaccctg agggtgagaa gaagtacctg 840
gcggccgcat ttcccagcgc ctgcgggaag accaacctgg ccatgatgaa ccccagcctc 900
cccgggtgga aggttgagtg cgtcggggat gacattgcct ggatgaagtt tgacgcacaa 960
ggtcatttaa gggccatcaa cccagaaaat ggctttttcg gtgtcgctcc tgggacttca 1020
gtgaagacca accccaatgc catcaagacc atccagaaga acacaatctt taccaatgtg 1080
gccgagacca gcgacggggg cgtttactgg gaaggcattg atgagccgct agcttcaggt 1140
gtcaccatca cgtcctggaa gaataaggag tggagctcag aggatgggga accttgtgcc 1200
caccccaact cgaggttctg cacccctgcc agccagtgcc ccatcattga tgctgcctgg 1260
gagtctccgg aaggtgttcc cattgaaggc attatctttg gaggccgtag acctgctggt 1320
gtccctctag tctatgaagc tctcagctgg caacatggag tctttgtggg ggcggccatg 1380
agatcagagg ccacagcggc tgcagaacat aaaggcaaaa tcatcatgca tgaccccttt 1440
gccatgcggc ccttctttgg ctacaacttc ggcaaatacc tggcccactg gcttagcatg 1500
gcccagcacc cagcagccaa actgcccaag atcttccatg tcaactggtt ccggaaggac 1560
aaggaaggca aattcctctg gccaggcttt ggagagaact ccagggtgct ggagtggatg 1620
ttcaaccgga tcgatggaaa agccagcacc aagctcacgc ccataggcta catccccaag 1680
gaggatgccc tgaacctgaa aggcctgggg cacatcaaca tgatggagct tttcagcatc 1740
tccaaggaat tctgggagaa ggaggtggaa gacatcgaga agtatctgga ggatcaagtc 1800
aatgccgacc tcccctgtga aatcgagaga gagatccttg ccttgaagca aagaataagc 1860
cagatgtaa 1869
<210> 3
<211> 11410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Vector
<400> 3
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 60
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 120
agtgccacct aaattgtaag cgttaatatt ttgttaaaat tcgcgttaaa tttttgttaa 180
atcagctcat tttttaacca ataggccgaa atcggcaaaa tcccttataa atcaaaagaa 240
tagaccgaga tagggttgag tgttgttcca gtttggaaca agagtccact attaaagaac 300
gtggactcca acgtcaaagg gcgaaaaacc gtctatcagg gcgatggccc actacgtgaa 360
ccatcaccct aatcaagttt tttggggtcg aggtgccgta aagcactaaa tcggaaccct 420
aaagggagcc cccgatttag agcttgacgg ggaaagccgg cgaacgtggc gagaaaggaa 480
gggaagaaag cgaaaggagc gggcgctagg gcgctggcaa gtgtagcggt cacgctgcgc 540
gtaaccacca cacccgccgc gcttaatgcg ccgctacagg gcgcgtccca ttcgccattc 600
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 660
gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 720
cgacgttgta aaacgacggc cagtgagcgc gcctcgttca ttcacgtttt tgaacccgtg 780
gaggacgggc agactcgcgg tgcaaatgtg ttttacagcg tgatggagca gatgaagatg 840
ctcgacacgc tgcagaacac gcagctagat taaccctaga aagataatca tattgtgacg 900
tacgttaaag ataatcatgc gtaaaattga cgcatgtgtt ttatcggtct gtatatcgag 960
gtttatttat taatttgaat agatattaag ttttattata tttacactta catactaata 1020
ataaattcaa caaacaattt atttatgttt atttatttat taaaaaaaaa caaaaactca 1080
aaatttcttc tataaagtaa caaaactttt atgagggaca gccccccccc aaagccccca 1140
gggatgtaat tacgtccctc ccccgctagg gggcagcagc gagccgcccg gggctccgct 1200
ccggtccggc gctccccccg catccccgag ccggcagcgt gcggggacag cccgggcacg 1260
gggaaggtgg cacgggatcg ctttcctctg aacgcttctc gctgctcttt gagcctgcag 1320
acacctgggg ggatacgggg aaaaggcctc cacggccact agtggcgcgc cataccggta 1380
agctttctgt aaggaaaggt aagagttgaa ctgagcaaga gttttgaaaa atagtgacaa 1440
tcccattctc ctttggaatg cgcacaaata ttgaggtatc cagtgaacgg cagcaaattt 1500
cctaccttca aggcccaaat gtaagctagt ccccttacgt tacatgcagc tcatttgcta 1560
agtggttttt ttctagtatc tccactactc gctgacacag gaggacacag gatgttaaaa 1620
aggaaataca gttctgtcaa ttattcactt actctccaaa atacttggaa gaactaaata 1680
tggaaccata ggagacttta tcctcaccgc atagtcccta tactagtcaa actccttatt 1740
ttttaattga tcatttttag gaaggtagca ttttattcac tagaacattt ttgttaatac 1800
ttgtttattt ttgggatgaa ctgccatgat gtgggctaca gaggagggtc gcatatgctt 1860
ccatccccct tttagagaat ccacacctgt cccagttgct gggttccact accaaaagtg 1920
aattgcaact attttaggag cacttaagca catccgaaaa atgagtgatt ctgttctggc 1980
ccacaccaca tcactgatgt acccccttaa agcatgtccc tgagttcatc acagaagact 2040
gctcctcctg tgccctccac aaggttagaa ctgtccttgt cttagggaaa aaggagagag 2100
agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagggacag gcaccaactg 2160
ggtaacctct gctgaccccc actctacttt accataagta gctccaaatc cttctagaaa 2220
atctgaaagg catagcccca tatatcagtg atataaatag aacctgcagc aggctctggt 2280
aaatgatgac tacaaggtgg actgggaggc agcccggcct tggcaggcat catcctctaa 2340
atataaagat gagtttgttc agcctttgca gaaggaaaaa ctgccaccca tcctagagtg 2400
ccgcgtcctt gtccccccac cccctccaat ttattgggag gaaggaccag ctaagcctca 2460
tctaggaaga gcccctcacc catctccacc tccactccag gtctagccag tcctgggttg 2520
tgacccttgt ctttcagccc caggagaggg acacacatag tgccaccaaa gaggctgggg 2580
gagggcctca gcccaccaaa acctggggcc agtgcgtcct acaggagggg aaccctcacc 2640
ccttcaatcc ctttaggaga cccaagggcg ctgcgcgtcc ctgaggcgga cagctccgtg 2700
tgctcaggct ttgcgcctga caggcctatc cccgggagcc cccgcgcctc ctccccggcg 2760
ctccgccctc gcctcccccc gccagttgtc tatcctgcga cagctgcgcg ccctccggcc 2820
gccggtggcc ctctgtgcgg tgggggaagg ggtcgacgtg gctcagcttt ttggattcag 2880
ggagctcggg ggtgggaaga gagaaatgga gttccagggg cgtaaaggag agggagttcg 2940
ccttccttcc cttcctgaga ctcaggagtg actgcttctc caatcctccc aagcccacca 3000
ctccacacga ctccctcttc ccggtagtcg caagtgggag tttggggatc tgagcaaaga 3060
acccgaagag gagttgaaat attggaagtc agcagtcagg caccttcccg agcgcccagg 3120
gcgctcagag tggacatggt tggggaggcc tttgggacag gtgcggttcc cggagcgcag 3180
gcgcacacat gcacccaccg gcgaacgcgg tgaccctcgc cccaccccat cccctccggc 3240
gggcaactgg gtcgggtcag gaggggcaaa cccgctaggg agacactcca tatacggccc 3300
ggcccgcgtt acctgggacc gggccaaccc gctccttctt tggtcaacgc aggggacccg 3360
ggcgggggcc caggccgcga accggccgag ggagggggct ctagtgccca acacccaaat 3420
atggctcgag aagggcagcg acattcctgc ggggtggcgc ggagggaatg cccgcgggct 3480
atataaaacc tgagcagagg gacaagcggc caccgcagcg gacagcgcca agtgaagcct 3540
cgcttcccct ccgcggcgac cagggcccga gccgagagta gcagttgtag ctacccgccc 3600
aggtagggca ggagttggga ggggacaggg ggacagggca ctaccgaggg gaacctgaag 3660
gactccgggg cagaacccag tcggttcacc tggtcagccc caggcctgcg ccctgagcgc 3720
tgtgcctcgt ctccggagcc acacgcgctt tggatccagt gtacagccac catgcctcct 3780
cagctgcaaa acggcctgaa cctctcggcc aaagttgtcc agggaagcct ggacagccta 3840
ccccaggcag tgagggagtt tctcgagaat aacgctgagc tgtgtcagcc tgatcacatc 3900
cacatctgtg acggctctga ggaggagaat gggcggcttc tgggccagat ggaggaagag 3960
ggcatcctca ggcggctgaa gaagtatgac aactgctggt tggctctcac tgaccccagg 4020
gatgtggcca ggatcgaaag caagacggtt atcgtcaccc aagagcaaag agacacagtg 4080
cccatcccca aaacaggcct cagccagctc ggtcgctgga tgtcagagga ggattttgag 4140
aaagcgttca atgccaggtt cccagggtgc atgaaaggtc gcaccatgta cgtcatccca 4200
ttcagcatgg ggccgctggg ctcgcctctg tcaaagatcg gcatcgagct gacggattca 4260
ccctacgtgg tggccagcat gcggatcatg acgcggatgg gcacgcccgt cctggaagca 4320
gtgggcgatg gggagtttgt caaatgcctc cattctgtgg ggtgccctct gcctttacaa 4380
aagcctttgg tcaacaactg gccctgcaac ccggagctga cgctcatcgc ccacctgcct 4440
gaccgcagag agatcatctc ctttggcagt gggtacggcg ggaactcgct gctcgggaag 4500
aagtgctttg ctctcaggat ggccagccgg ctggccaagg aggaagggtg gctggcagag 4560
cacatgctga ttctgggtat aaccaaccct gagggtgaga agaagtacct ggcggccgca 4620
tttcccagcg cctgcgggaa gaccaacctg gccatgatga accccagcct ccccgggtgg 4680
aaggttgagt gcgtcgggga tgacattgcc tggatgaagt ttgacgcaca aggtcattta 4740
agggccatca acccagaaaa tggctttttc ggtgtcgctc ctgggacttc agtgaagacc 4800
aaccccaatg ccatcaagac catccagaag aacacaatct ttaccaatgt ggccgagacc 4860
agcgacgggg gcgtttactg ggaaggcatt gatgagccgc tagcttcagg tgtcaccatc 4920
acgtcctgga agaataagga gtggagctca gaggatgggg aaccttgtgc ccaccccaac 4980
tcgaggttct gcacccctgc cagccagtgc cccatcattg atgctgcctg ggagtctccg 5040
gaaggtgttc ccattgaagg cattatcttt ggaggccgta gacctgctgg tgtccctcta 5100
gtctatgaag ctctcagctg gcaacatgga gtctttgtgg gggcggccat gagatcagag 5160
gccacagcgg ctgcagaaca taaaggcaaa atcatcatgc atgacccctt tgccatgcgg 5220
cccttctttg gctacaactt cggcaaatac ctggcccact ggcttagcat ggcccagcac 5280
ccagcagcca aactgcccaa gatcttccat gtcaactggt tccggaagga caaggaaggc 5340
aaattcctct ggccaggctt tggagagaac tccagggtgc tggagtggat gttcaaccgg 5400
atcgatggaa aagccagcac caagctcacg cccataggct acatccccaa ggaggatgcc 5460
ctgaacctga aaggcctggg gcacatcaac atgatggagc ttttcagcat ctccaaggaa 5520
ttctgggaga aggaggtgga agacatcgag aagtatctgg aggatcaagt caatgccgac 5580
ctcccctgtg aaatcgagag agagatcctt gccttgaagc aaagaataag ccagatgtaa 5640
acgcgtcagg taccaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 5700
ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatc 5760
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 5820
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 5880
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 5940
ggaagagaat agcaggcatg ctggggagcg gccgcaagga tctgcgatcg ctccggtgcc 6000
cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc 6060
aattgaacgg gtgcctagag aaggtggcgc ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac 6120
tggctccgcc tttttcccga gggtggggga gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg 6180
aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc agaacacagc tgaagcttcg aggggctcgc 6240
atctctcctt cacgcgcccg ccgccctacc tgaggccgcc atccacgccg gttgagtcgc 6300
gttctgccgc ctcccgcctg tggtgcctcc tgaactgcgt ccgccgtcta ggtaagttta 6360
aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc tagactcagc 6420
cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct acgtctttgt ttcgttttct 6480
gttctgcgcc gttacagatc caagctgtga ccggcgccta cgatatcgcc accatggcca 6540
gctccgagga tgtcatcaaa gagtttatga gatttaaggt caagatggag ggaagcgtca 6600
acggacacga gttcgagatt gagggagaag gagaaggccg gccttacgag ggcacacaaa 6660
ccgctaagct caaggtcaca aaaggaggac ccctcccctt ctcctgggat attctgagcc 6720
ctcagttcca gtacggaagc aaagcctatg ttaaacaccc tgccgacatc cctgactatc 6780
tgaagctctc cttccctgaa ggcttcaagt gggagagatt catgaacttc gaggacggag 6840
gcgtggtgac agtcacacaa gatagcaccc tccaggacgg agagtttatt tataaggtga 6900
aactcagagg aaccaacttc ccctccgatg gccctgtcat gcaaaaaaaa acaatgggat 6960
gggaagcctc caccgagaga atgtatcctg aggatggcgc tctgaaaggc gaaattaaaa 7020
tgagactgaa actcaaagac ggaggacact acgatgccga ggtcaaaaca acctacaagg 7080
ccaagaaaca agtgcagctg cctggcgcct acatgactga tattaaactc gacattatca 7140
gccataatgg ggactacacc atcgtggaac aatatgagag agctgagggc agacatagca 7200
caggcgctgg agagggcaga ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg 7260
gccctatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtccccaggg 7320
ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgatc 7380
cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc 7440
tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc 7500
cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga 7560
gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca 7620
aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc 7680
tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct 7740
tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca 7800
ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg 7860
cctgaaatca acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg 7920
ttgctccttt tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gcgttaacta 7980
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 8040
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 8100
tatcatgtct ggaattgact caaatgatgt caattagtct atcagaagct atctggtctc 8160
ccttccgggg gacaagacat ccctgtttaa tatttaaaca gcagtgttcc caaactgggt 8220
tcttatatcc cttgctctgg tcaaccaggt tgcagggttt cctgtcctca caggaacgaa 8280
gtccctaaag aaacagtggc agccaggttt agccccggaa ttgactggat tcctttttta 8340
gggcccattg gtatggcttt ttccccgtat ccccccaggt gtctgcaggc tcaaagagca 8400
gcgagaagcg ttcagaggaa agcgatcccg tgccaccttc cccgtgcccg ggctgtcccc 8460
gcacgctgcc ggctcgggga tgcgggggga gcgccggacc ggagcggagc cccgggcggc 8520
tcgctgctgc cccctagcgg gggagggacg taattacatc cctgggggct ttgggggggg 8580
gctgtccctg atatctataa caagaaaata tatatataat aagttatcac gtaagtagaa 8640
catgaaataa caatataatt atcgtatgag ttaaatctta aaagtcacgt aaaagataat 8700
catgcgtcat tttgactcac gcggtcgtta tagttcaaaa tcagtgacac ttaccgcatt 8760
gacaagcacg cctcacggga gctccaagcg gcgactgaga tgtcctaaat gcacagcgac 8820
ggattcgcgc tatttagaaa gagagagcaa tatttcaaga atgcatgcgt caattttacg 8880
cagactatct ttctagggtt aatctagctg catcaggatc atatcgtcgg gtcttttttc 8940
cggctcagtc atcgcccaag ctggcgctat ctgggcatcg gggaggaaga agcccgtgcc 9000
ttttcccgcg aggttgaagc ggcatggaaa gagtttgccg aggatgactg ctgctgcatt 9060
gacgttgagc gaaaacgcac gtttaccatg atgattcggg aaggtgtggc catgcacgcc 9120
tttaacggtg aactgttcgt tcaggccacc tgggatacca gttcgtcgcg gcttttccgg 9180
acacagttcc ggatggtcag cccgaagcgc atcagcaacc cgaacaatac cggcgacagc 9240
cggaactgcc gtgccggtgt gcagattaat gacagcggtg cggcgctggg atattacgtc 9300
agcgaggacg ggtatcctgg ctggatgccg cagaaatgga catggatacc ccgtgagtta 9360
cccggcgggc gcgcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 9420
cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 9480
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 9540
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 9600
ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 9660
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 9720
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 9780
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 9840
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 9900
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 9960
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 10020
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 10080
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 10140
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 10200
agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga 10260
agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 10320
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 10380
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 10440
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 10500
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 10560
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 10620
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 10680
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 10740
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 10800
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 10860
ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 10920
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 10980
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 11040
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 11100
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 11160
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 11220
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 11280
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 11340
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 11400
gaatactcat 11410
<210> 4
<211> 241
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' PB termunal repeat
<400> 4
ttaaccctag aaagataatc atattgtgac gtacgttaaa gataatcatg cgtaaaattg 60
acgcatgtgt tttatcggtc tgtatatcga ggtttattta ttaatttgaa tagatattaa 120
gttttattat atttacactt acatactaat aataaattca acaaacaatt tatttatgtt 180
tatttattta ttaaaaaaaa acaaaaactc aaaatttctt ctataaagta acaaaacttt 240
t 241
<210> 5
<211> 255
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' PB terminal repeat
<400> 5
gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga acatgaaata 60
acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa tcatgcgtca 120
ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat tgacaagcac 180
gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga cggattcgcg 240
ctatttagaa agaga 255
Claims (11)
- 근육세포 특이적 PCK1 과발현된 형질전환 개로서,
-이 때, 상기 형질전환 개는 근육조직 또는 근육세포를 포함하고,
이 때, 상기 근육조직 또는 근육세포의 게놈에는 PCK1을 암호화하는 내재된 염기서열; 및
개 유래의 ACTA 프로모터 및 개 또는 인간 유래의 PCK1을 암호화 하는 외래의 염기서열이 작동 가능하게 연결된 서열을 하나 이상 포함하고
이 때, 상기 ACTA 프로모터는 근육세포에서 특이적으로 작동(working)함 -;
을 특징으로 하는,
근육세포 특이적 PCK1 과발현된 형질전환 개. - 제1 항에 있어서,
상기 형질전환된 개의 혈중 라이페이스(Lipase) 농도값은 야생형 개의 혈중 라이페이스 농도값보다 0 초과 0.25배 이하 의 값을 갖는 것을 특징으로 하는,
근육세포 특이적 PCK1 과발현 된 형질전환 개. - 제1 항에 있어서,
상기 ACTA 프로모터는 서열번호 1에 해당하고,
상기 PCK1을 암호화하는 외래의 염기서열은 서열번호 2에 해당하는 것을 특징으로 하는,
근육세포 특이적 PCK1 과발현된 형질전환 개. - 하나 이상의 전이인자;
하나 이상의 역말단 반복서열((inverted terminal repeat sequence) 또는 동향반복서열(direct repeat); 및
하나 이상의 개 유래의 ACTA 프로모터 및 개 또는 인간 유래의 PCK1을 암호화하는 외래의 염기서열이 작동가능하게 연결된 염기서열을 포함하는
근육세포 특이적 PCK1 과발현 동물 제작용 재조합 벡터. - 제4 항에 있어서,
상기 전이인자는 전위효소(transposase)를 더 포함하고,
- 이 때, 상기 전위효소는 piggyBac 전이효소 또는 Sleeping Beauty 전이효소임 -;
상기 전이인자의 양 말단에 역말단 반복서열 또는 동향반복서열이 위치하는 것을 특징으로 하는,
근육세포 특이적 PCK1 과발현 동물 제작용 재조합 벡터. - 제5 항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 플라스미드 또는 바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는,
근육세포 특이적 PCK1 과발현 동물 제작용 재조합 벡터. - 제4 항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 서열번호 3에 해당하는 것을 특징으로 하는,
근육세포 특이적 PCK1 과발현 동물 제작용 재조합 벡터. - 형질전환된 세포로서,
- 이 때, 상기 형질전환된 세포의 게놈 내에는 개 유래의 ACTA 프로모터 및 개 또는 인간 유래의 PCK1를 암호화하는 염기서열이 하나 이상 넉인(Knock in)되고,
이 때, 상기 ACTA 프로모터는 근육세포에서 특이적으로 작동(working)하고,
이 때, 상기 형질전환된 세포를 통하여 태어난 산자는 근육조직 또는 근육세포에서 특이적으로 PCK1을 과발현 함을 특징으로 함 -;
을 특징으로 하는, 형질전환된 세포. - 제8 항에 있어서,
상기 형질전환된 세포는 성체 섬유아세포(fibroblast) 또는 지방줄기세포인 것을 특징으로 하는,
형질전환된 세포. - 제8 항에 있어서,
상기 ACTA 프로모터는 서열번호 1에 해당하고,
상기 PCK1을 암호화하는 외래의 염기서열은 서열번호 2에 해당하는 것을 특징으로 하는,
형질전환된 세포. - 제4항 내지 제7항 중 어느 하나의 재조합벡터 및 핵공여세포를 준비함,
-이 때, 핵공여세포는 개 유래의 체세포 또는 줄기세포임-;
상기 재조합 벡터를 상기 핵공여세포에 도입하여 제1 세포를 유도함;
상기 제1 세포의 핵을 탈핵난자에 도입하여 제2 세포를 유도함을 포함하는 것을 특징으로 하는,
근육세포 특이적 PCK1 과발현 형질전환세포 제조방법.
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