KR20210049892A - 섬유아세포의 제조 방법 및 g-csf 양성 섬유아세포 집단 - Google Patents

섬유아세포의 제조 방법 및 g-csf 양성 섬유아세포 집단 Download PDF

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토모유키 오스기
마사야 스즈키
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Abstract

CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 제조하는 방법을 제공한다. 또한, G-CSF 양성 섬유아세포 집단을 제공한다. CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 제조하는 방법으로서, 섬유아세포를 TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 존재 하에서 배양하여, CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 증가시키는 스텝을 포함하는, 방법.

Description

섬유아세포의 제조 방법 및 G-CSF 양성 섬유아세포 집단
본 발명은 주로 CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포의 제조 방법에 관한 것이며, 나아가, 상기 섬유아세포를 포함하는 심장 질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 또한, G-CSF 양성 섬유아세포를 포함하는 세포 집단에 관한 것이다.
섬유아세포는 생체의 각종 장기에 존재 하는 간질 세포의 1종이다. 장기·조직의 염증·상해에 따라, 증식 인자나 사이토카인의 분비, 세포 외 매트릭스의 산생과 분해를 실시하여, 다양한 세포간 상호 작용을 통해 장기·조직의 기능을 조절하고, 미소 환경의 항상성을 유지하는 역할을 담당하고 있다. 한편, 섬유증이나 암 등의 질환에 있어서도, 섬유아세포는 병적 미소 환경을 유지하고, 병을 진행시키는 측면도 갖는다. 일반적으로, 섬유아세포는 세포질 돌기를 다수 보유한 방추형 세포로서 알려져 있지만, 그 국재하는 장기마다 섬유아세포가 발현되는 유전자·단백질은 크게 다르다는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1 참조).
섬유아세포에 관하여서는, 본 발명자들은 먼저, Vascular　cell　adhesion molecule-1(VCAM-1, CD106) 양성인 섬유아세포를 이용하여, 기능적인 심장 세포 시트를 얻을 수 있다는 것을 찾아냈다(특허문헌 1 참조).
국제공개 제2016/006262호 국제공개 제2018/155651호
Chang, H. Y. et al. Diversity, topographic differentiation, and positional memory in human fibroblasts.　Proc.　Natl. Acad.　Sci.　99,　12877-12882　(2002)
특허문헌 1에서는, 충분한 세포수의 CD106 양성 섬유아세포를 얻기 위해, CD106를 마커로 한 세포 선별 등의 수법을 이용하고 있다. 그렇지만, 섬유아세포에 따라서는, CD106 양성 섬유아세포의 양(세포수)이 매우 적다는 문제가 있었다.
한편, 본 발명자들은 심장 질환을 치료하기 위한 주사제를 개발하여, 특허 출원을 하였다(특허문헌 2 참조). 이 때, 주사제로서 유효한 섬유아세포는 CD106 양성인 것과 더불어, CD90 양성인 것이 바람직하다는 것을 찾아냈다.
본 발명은 CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 제조하는 새로운 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하도록 검토를 진행하여, 종양에 대하여 출혈성 괴사를 유발시키는 인자로서 알려져 있는 TNF-α(Tumor　Necrosis　Factor-α) 및 알레르기 야기 작용 등이 알려져 있는 IL-4(Interleukin-4)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 존재 하에, 섬유아세포를 배양함으로써, CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포가 증가하는 것을 찾아내서, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은 이하의 제1 측면(발명 A)을 포함한다.
(A1) CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 제조하는 방법으로서,
섬유아세포를 TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 존재 하에서 배양하여, CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 증가시키는 스텝,
을 포함하는 방법.
(A2) 배양되는 섬유아세포가 성체로부터 얻어진 섬유아세포인, (A1)에 기재된 방법.
(A3) 상기 CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포가 CD106 양성 및 CD90 양성인, (A1) 또는 (A2)에 기재된 방법.
(A4) CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 농축하는 스텝을 추가로 포함하는, (A1)∼(A3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(A5) 상기 농축이 항CD106 항체 및/또는 항CD90 항체를 이용하여 이루어지는, (A4)의 어느 하나에 기재된 방법.
또한, 본 발명은 이하의 제2 측면(발명 B)을 포함한다.
(B1) CD106 양성 성체 섬유아세포를 포함하는, 섬유아세포를 포함하는 세포 집단.
(B2) 섬유아세포에 대한 CD106 양성 성체 섬유아세포의 비율(세포수)이 3.36% 이상이고, 바람직하게는 5% 이상이고, 더욱 바람직하게는 상기 섬유아세포의 7% 이상이 CD90 양성, CD106 양성, 그리고 G-CSF 양성인, (B1)에 기재된 세포 집단.
(B3) 상기 성체 섬유아세포가 CD106 양성 그리고 CD90 양성인, (B1) 또는 (B2)에 기재된 세포 집단.
(B4) 상기 성체 섬유아세포가 TNF-α 및/또는 IL-4에 의해 자극된 성체 섬유아세포인, (B1)∼(B3) 중 어느 하나에 기재된 세포 집단.
(B5) (B1)∼(B4) 중 어느 하나에 기재된 세포 집단과 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
(B6) 허혈성 심질환 치료약인, (B5)에 기재된 의약 조성물.
(B7) 성체 섬유아세포가 유래하는 장기에 투여하기 위한, (B5) 또는 (B6)에 기재된 의약 조성물.
본 발명은 이하의 제3 측면(발명 C)을 포함한다.
(C1) G-CSF 양성 섬유아세포를 제조하는 방법으로서,
섬유아세포를 TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 존재 하에서 배양하여, G-CSF의 발현량을 향상시키고, G-CSF 양성 섬유아세포를 증가시키는 스텝,
을 포함하는, 방법.
(C2) 배양되는 섬유아세포가 성체로부터 얻어진 섬유아세포인, (C1)에 기재된 방법.
(C3) 상기 배양 후에, G-CSF 양성 섬유아세포를 농축하는 스텝을 추가로 포함하는, (C1) 또는 (C2)에 기재된 방법.
(C4) 상기 농축이 항CD106 항체 및/또는 항CD90 항체로 선별하는 스텝을 포함하는, (C1) 내지 (C3) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(C5) 단리된 CD106 양성 및 G-CSF 양성인 섬유아세포를 포함하는, 세포 집단.
(C6) 섬유아세포에 대한 G-CSF 양성 섬유아세포의 비율(세포수)이 6.75% 이상인, (C5)에 기재된 세포 집단.
본 발명은 추가로 이하의 측면(발명 D)을 포함한다.
(D1) G-CSF 양성 섬유아세포를 포함하는, 심장 질환을 치료하기 위한 주사용 조성물.
(D2) 상기 주사용 조성물 중, 섬유아세포에 대한 G-CSF 양성 섬유아세포의 비율(세포수)이 6.75% 이상인, (D1)에 기재된 주사용 조성물.
(D3) G-CSF 양성 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포 집단을 준비하는 스텝,
상기 섬유아세포 집단을, 괴사한 심장 조직 영역 내지는 그 주변에 주사 및/또는 관동맥 내에 주입하는 스텝을 포함하는 심장 질환을 치료하는 방법.
(D4) 상기 섬유아세포 집단 중, 섬유아세포에 대한 G-CSF 양성 섬유아세포의 비율(세포수)이 6.75% 이상인, (D3)에 기재된 방법.
본 발명에 의해, CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 제조하는 새로운 방법을 제공할 수 있다. 더욱이, G-CSF 양성 섬유아세포 집단을 제공할 수 있다.
도 1은 TNF-α 첨가에 있어서, 성체 심장 유래 섬유아세포의 유세포 분석기(flow cytometry) 해석도이다.
도 2의 (A)는 IL-4 첨가에 있어서, 성체 심장 유래 섬유아세포의 유세포 분석기 해석도이다. (B)는 IL-4 농도에 의한 성체 심장 유래 섬유아세포의 CD106 양성 세포의 비율(%)(N=3), (C)는 IL-4 농도에 의한 성체 심장 유래 섬유아세포의 CD90 양성 세포의 비율(%)(N=3), (D)는 IL-4 농도에 의한 성체 심장 유래 섬유아세포의 CD106 양성 및 CD90 양성 세포의 비율(%)(N=3)을 각각 나타내는 그래프이다.
도 3a의 (B)는 TNF-α 및 IL-4의 2제 첨가에 있어서, 성체 심장 유래 섬유아세포의 유세포 분석기 해석도이다. 또한, (A)는 컨트롤이며, 어느 것도 첨가되어 있지 않다.
도 3b는 TNF-α와 IL-4의 첨가 농도에 있어서, (A) CD106 양성 세포의 비율, (B) CD90 양성 세포의 비율, (C) 양 양성(DP: 더블 포지티브) 세포의 비율을 나타내는 그래프이다(N=3).
도 4a의 (A)는 TNF-α(50 ng/mL)와 IL-4(2 ng/mL)의 첨가에 따른 태아 심장 유래 섬유아세포(F-HCF) 및 iPS 심근 세포 조직 유래 섬유아세포(i-HCF)의 유세포 분석기 해석도이다. Control은 TNF-α(50 ng/mL)와 IL-4(2 ng/mL)를 첨가하고 있지 않은 F-HCF 및 i-HCF의 유세포 분석기 해석도를 나타낸다.
도 4b의 (B)는 TNF-α(50ng/mL)와 IL-4(2ng/mL)의 첨가에 따른 F-HCF의 CD106 및 CD90 양성 세포의 비율(%)을 나타낸다(N=1). Control은 TNF-α(50 ng/mL)와 IL-4(2 ng/mL)를 첨가하고 있지 않은 F-HCF의 CD106 및 CD90 양성 세포의 비율(%)을 나타낸다(N=1). (C)는 TNF-α(50 ng/mL)와 IL-4(2 ng/mL)의 첨가에 따른 i-HCF의 CD106 및 CD90 양성 세포의 비율(%)을 나타낸다(N=1). Control은 TNF-α(50 ng/mL)와 IL-4(2 ng/mL)를 첨가하고 있지 않은 i-HCF의 CD106 및 CD90 양성 세포의 비율(%)을 나타낸다(N=1).
도 5의 (A)는 태아 심장 유래 CD106 음성 섬유아세포(F-VNCF)의 유세포 분석기 해석도이다. (B)는 태아 심장 유래 CD106 양성 섬유아세포(F-VCF)의 유세포 분석기 해석도이다. (C)는 성체 심장 유래 섬유아세포(A-HCF)의 유세포 분석기 해석도이다. (D)는 TNF-α(50ng/mL)와 IL-4(2ng/mL)를 첨가하여 배양한 A-HCF(uA-HCF)의 유세포 분석기 해석도이다. (E)는 fluorescence-activated cell sorting(FACS)에 의해 회수한 CD106 및 CD90 양 양성의 uA-HCF 세포군(uA90·106-HCF)의 유세포 분석기 해석도이다. 도면 중 에워싼 게이트(P4)의 세포만을 FACS로 회수하였다. (F)는 각종 섬유아세포에서의 G-CSF 유전자 발현량(β-actin의 FPKM으로 표준화한 G-CSF의 FPKM)을 나타내는 그래프이다(F-VCF와 F-VNCF는 N=3, 기타 N=2). (G) 각종 섬유아세포에서의 G-CSF 유전자 발현량(β-actin의 FPKM으로 표준화한 G-CSF의 FPKM　fold　increase. F-VCF의 값을 1로 하였다.)을 나타내는 그래프이다(F-VCF와 F-VNCF는 N=3, 기타 N=2).
도 6은 각종 심장 섬유아세포와 공배양한 iPS 유래 심근 세포(iPS-CM)의 Ki67·cardiac　troponin　T(cTnT) 양 양성 세포수를 나타내는 그래프이다(Day10, ***P<0.01). uA90-HCF는 CD90을 지표로 세포 선별을 실시한 CD90 양성 uA-HCF 세포군을 가리키고, uA106-HCF는 CD106을 지표로 세포 선별을 실시한 CD106 양성의 uA-HCF 세포군을 가리킨다. 또한, A-HCF와 공배양한 iPS-CM의 Ki67·cTnT 양 양성 세포수를 1로 하였다(N=3).
도 7a의 (A)는 만성 심부전 모델 래트에게 투여한 섬유아세포의 유세포 분석기 해석도이다. (B)는 만성 심부전 모델 래트에게 투여한 섬유아세포의 CD106 양성 세포의 비율, CD90 양성 세포의 비율, 양 양성(DP: 더블 포지티브) 세포의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 7b는 래트 심장의 심장 초음파 검사 이미지(M모드)이다(도면 대용 사진).
도 7c의 (A)는 각종 심장 섬유아세포에 의한 래트 심장의 LVEF(%)의 변천을 나타내는 그래프이다. (B)는 각종 심장 섬유아세포 주사 후, 4주의 LVEF의 증감 비율을 나타내는 그래프이다(LVEF(4W)-LVEF(0W), **P<0.05, A-HCF와 uA-HCF 투여군은 N=4, uA90-HCF 투여군은 N=3으로 실시). (C)는 각종 심장 섬유아세포에 의한 래트 심장의 LVFS(%) 변천을 나타내는 그래프이다. (D)는 각종 심장 섬유아세포 주사 후, 4주의 LVFS의 증감 비율을 나타내는 그래프이다(LVFS(4W)-LVFS(0W), **P<0.05, A-HCF와 uA-HCF 투여군은 N=4, uA90-HCF 투여군은 N=3으로 실시).
도 8의 (A)는 각종 섬유아세포의 유세포 분석기 해석도이다. (B)는 각종 섬유아세포의 G-CSF 양성 세포의 비율(%)을 나타내는 그래프이다(***P<0.01, N=4). uA90·106-HCF는 fluorescence-activated cell sorting(FACS)에 의해 회수한 CD106 및 CD90 양 양성 uA-HCF 세포군이다. 도면 중 에워싼 게이트(P3)의 세포만을 FACS로 회수하였다.
도 9a은 각종 심장 섬유아세포를 투여한 래트 만성 심부전 모델의 심장 초음파 검사 화상(M모드)이다(사진 대용 도면).
도 9b의 (A)는 각종 심장 섬유아세포에 의한 만성 심부전 래트 모델의 LVEF(%) 변천을 나타내는 그래프이다(****P<0.01　vs.　A-HCF, ***P<0.05　vs. uA-HCF, **P<0.01　vs.　Control(배지(high-glucose　DMEM＋10% 신생 송아지 혈청(NBCS))만을 투여한 군), Sham(Control 및 세포 투여군과 동일한 개흉 수술을 실시하지만, 허혈-재관류 처치를 실시하지 않는 가짜 수술군)은 N=6, Control은 N=4, A-HCF 투여군은 N=7, uA-HCF 투여군은 N=8, uA90-HCF 투여군은 N=9로 실시). (B)는 각종 심장 섬유아세포 주사 후, 18주의 LVEF 증감차를 나타내는 그래프이다(LVEF(18W)-LVEF(0W), ****P<0.01　vs.　A-HCF, ***P<0.01　vs.　uA-HCF, **P<0.01　vs.　Control, *P<0.05　vs.　Control). (C)는 각종 심장 섬유아세포에 의한 만성 심부전 래트 모델의 LVFS(%) 변천을 나타내는 그래프이다(****P<0.01　vs.　A-HCF, ***P<0.05　vs.　uA-HCF, **P<0.01　vs. Control). (D)는 각종 심장 섬유아세포 주사 후, 18주의 LVFS 증감차를 나타내는 그래프이다(LVFS(18W)-LVFS(0W), ****P<0.01　vs.　A-HCF, ***P<0.05　vs.　uA-HCF, **P<0.01　vs.　Control).
이하, 본 발명에 대해서 구체적 실시형태를 이용하여 상세하게 설명하겠지만, 본 발명은 도시된 구체적 실시형태에만 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시형태는 CD106 양성(CD106＋로도 표기함) 및/또는 CD90 양성(CD90＋로도 표기함) 섬유아세포를 제조하는 방법으로서, 섬유아세포와 TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 존재 하에서 배양하여, CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 증가시키는 스텝을 포함한다. TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 존재 하에서 배양함으로써, CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포를 증가시킨 섬유아세포 집단을 제조할 수 있다.
본 명세서에서는, 「농축」이란, 총세포수에서 특정 세포수의 비가 증가하는 세포의 분리 조작을 의미한다. 단, 본 명세서 중에서 「배양」은 「농축」에는 포함되지 않는다. 본 명세서에서는, 「단리」란, 어느 성분을 조직으로부터 분리하는 것을 의미하고, 「정제」란, 어느 성분을 적어도 1 이상의 다른 성분으로부터 분리하는 것을 의미한다.
본 명세서에서는, 「양성」 또는 「포지티브」란, 세포가 검출 가능한 레벨의 마커를 발현하는 것을 의미한다.
본 명세서에서는, 「포함한다」란, 특정되어 있지 않은 제3 성분을 포함하고 있을 수 있는 것을 의미한다. 본 명세서에서는, 「으로 이루어진다」란, 특정되어 있지 않은 제3 성분을 본질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본질적으로 포함하지 않는다란, 제조 과정에서 혼입된 기술적으로 제거 불가능한 정도의 양의 제3 성분을 포함하는 것을 제외하지 않는 의미로 사용된다.
섬유아세포는 콜라겐 기타 세포 외 매트릭스를 산생하는 간질 세포의 일종이다. 섬유아세포는 체내에서는 결합 조직에 존재 하고, 그 주요 구성 성분으로 되어 있는 세포종이다. 섬유아세포는 간질 세포 마커인 비멘틴 및 DDR2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상이 양성일 수 있다. 어느 양태에서는, 섬유아세포는 심근 세포 특이적 마커인 심근 트로포닌 및 α액티닌에 대해서 양성인 세포는 아니다. 어느 양태에서는, 섬유아세포는 VE-카드헤린에 양성인 세포는 아니다. 예를 들면, 섬유아세포는 혈관 내피 세포는 아니다. 예를 들면, 섬유아세포는 혈관 평활근 세포는 아니다. 섬유아세포는 근섬유아세포일 수 있고, 혹은, 근섬유아세포가 아닐 수도 있다.
섬유아세포는 심장 조직에서 유래하는 섬유아세포일 수 있으며, 예를 들면, 심장 조직으로부터 단리된 섬유아세포일 수 있다. 섬유아세포는 심외막 또는 심내막으로부터 단리된 섬유아세포일 수 있다. 섬유아세포는 태아의 심외막 또는 심내막으로부터 단리된 섬유아세포일 수 있다. 섬유아세포는 성체의 심외막 또는 심내막으로부터 단리된 섬유아세포일 수 있다. 섬유아세포는 비멘틴 및 DDR2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상이 양성인 콜라겐 산생능을 갖는 세포일 수 있다. 섬유아세포는 본 발명의 모든 양태에 있어서, 바람직하게는, 심장 조직에서 유래하는 섬유아세포(이하, 「심장 섬유아세포」라 하는 경우가 있다)일 수 있으며, 예를 들면, 심외막 또는 심내막으로부터 단리된 섬유아세포일 수 있다.
본 발명의 실시형태에서는, 생체에 있어서 섬유아세포로 분화되는 모든 세포를 섬유아세포의 재료로서 이용할 수 있다.
본 발명의 실시형태에서는, 심장에 이식하는 목적으로 이용되는 섬유아세포는 바람직하게는, 심장 조직, 심외막 또는 심내막에서 유래하는 섬유아세포일 수 있다.
본 발명의 실시형태에서는, 섬유아세포는 농축, 단리 또는 정제된 섬유아세포일 수 있다.
섬유아세포의 유래에 제한은 없으며, 배아줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 간세포(iPS 세포) 및 Muse 세포 등의 다능성 간세포나, 간엽계 간세포 등의 성체(체성) 간세포를 분화시켜서 이용할 수 있다. 또한, 동물(사람을 포함함)로부터 채취한 프라이머리 세포를 이용할 수 있고, 주화 세포를 이용할 수 있다. 심외막 또는 심내막 유래의 섬유아세포를 이용하는 것이 바람직하고, 또한, 인간 성체의 심장으로부터 얻어진 섬유아세포인 것이 바람직하지만, 이들에 한정되지 않는다.
상기에서, 섬유아세포에 대해서 서술하였지만, 모든 양태에 있어서, 섬유아세포가 심장 조직에서 유래하는 섬유아세포 및 심외막 또는 심내막으로부터 단리된 섬유아세포에서도 동일하다. 이하 실시예에서는, 섬유아세포로서 심장 섬유아세포를 예시적으로 이용한 실험에 있어서 본 발명을 설명한다.
CD106은 VCAM-1(VCAM1)이라고도 부르며, 혈관 내피 세포 등에 발현되는 세포 접착 분자로서 기존의 단백질이다. CD90은 Thy-1(Thy1)이라고도 부르며, 당쇄가 풍부한 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 결합형 분자이며, 또한, 신경 조직, 결합 조직 등 각종 스트로마세포에 발현되지만, 심근 세포에는 발현되지 않는다. 그 때문에, CD90＋ 섬유아세포는 심근 세포를 포함하지 않는 것을 나타낸다. 또한, 여기서 말하는 「CD90＋ 섬유아세포는 심근 세포를 포함하지 않는다」란, 다소 포함되어 있는 것은 허용하는 개념이며, 전체 세포에 대하여 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 0.5% 이하, 0.1% 이하, 0.01% 이하일 수 있다.
CD106＋ 섬유아세포 중, CD90＋ 섬유아세포인 비율(세포수 기준)은 1% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있고, 98% 이상일 수 있고, 100%일 수 있다.
섬유아세포는 Connexin43 양성(Connexin43＋) 섬유아세포일 수 있다.
Connexin43은 혈관의 표면에서 동맥 경화성 플라크와 함께 발현되는 것이나, 심근 세포의 간극 결합으로서 인접하는 세포와 결합하여, 심장의 전기적 흥분을 전파한다고 알려져 있는 막 관통 단백질이다. Connexin43＋임으로써, 심장 조직 내의 전기적 시그널 교환이 가능해져, 심장 질환에 적용하였을 때에, 치료 효과를 개선시킨다고 본 발명자들은 생각하고 있다.
CD106＋ 섬유아세포 중, Connexin43＋ 섬유아세포의 비율(세포수 기준)은 1% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있고, 98% 이상일 수 있고, 100%일 수 있다.
섬유아세포와 TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자(이하, 간단히 인자라고도 함)와의 접촉 방법은 특별히 한정되지 않으며, 전형적으로는 섬유아세포를 포함하는 배지에 인자를 첨가하는 것이지만, 이것에 한정되지 않는다. 복수의 인자와 접촉시킬 경우에는, 각각 별개로 섬유아세포와 접촉시킬 수 있고, 동시에 접촉시킬 수 있다. 인자를 동시에 접촉시키는 방법으로서는, 한 번 복수 인자를 혼합한 후에 섬유아세포에 첨가할 수 있다.
본 실시형태에서는, 인자를 첨가한 배지에서 섬유아세포를 배양할 수 있기 때문에, 섬유아세포에서 CD106 및/또는 CD90의 발현 레벨을 유지한 채로 섬유아세포를 배양 가능하다. 그 때문에, 높은 CD106 및/또는 CD90 발현 레벨의 섬유아세포를 제조할 수 있다.
이들 인자를 배지(mL)에 첨가할 경우, TNF-α의 첨가량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.1ng/mL 이상이며, 0.5ng/mL 이상일 수 있고, 1ng/mL 이상일 수 있고, 10ng/mL 이상일 수 있다. 상한은 특별히 한정되지 않으며, 통상 500ng/mL 이하이며, 100ng/mL 이하일 수 있다.
또한, IL-4의 첨가량은 특별히 한정되지 않지만, 통상 0.1ng/mL 이상이며, 0.5ng/mL 이상일 수 있고, 1ng/mL 이상일 수 있다. 상한은 특별히 한정되지 않으며, 통상 10ng/mL 이하이며, 5ng/mL 이하일 수 있고, 1ng/mL 이하일 수 있다.
양 인자를 첨가할 경우에는, 첨가하는 TNF-α와 IL-4의 비(중량비)는 TNF-α:IL-4에서 통상 10000:1∼1:1이며, 50000:1∼10:1일 수 있다. 또한, 1:1∼1:10000이며, 1:10∼1:50000일 수 있다.
이들 인자와 접촉시킨 섬유아세포를 추가로 배양함으로써, CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포를 제조할 수 있다.
섬유아세포의 배양은 CD106＋ 및/또는 CD90＋가 될 수 있거나, 또는 그 배양에 적합한 조건 하라면 특별히 한정되지 않으며, 기지의 세포 배양 방법으로 실시할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 배양하는 세포의 종류 등에 따라 적절히 설정 가능하지만, 예를 들면, DMEM, α-MEM, RPMI-1640, HFDM-1(＋) 등이 사용 가능하다. 해당 배지에 FCS나 FBS 등의 영양 물질이나 증식 인자, 사이토카인, 항생 물질 등을 첨가할 수 있다. 더욱이, TNF-α 및/또는 IL-4를 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
배양 기간은 원하는 세포수가 될 때까지, 및/또는 원하는 기능이 갖추어질 때까지 등, 목적에 따라 일수를 적절히 설정 가능하다. 예를 들면, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 2주간, 1개월, 2개월, 3개월, 6개월 등의 기간을 들 수 있다.
배양 온도는 배양하는 세포의 종류에 맞추어 적절히 설정 가능하지만, 예를 들면 10℃ 이상, 15℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상일 수 있고, 또한, 60℃ 이하, 55℃ 이하, 50℃ 이하, 45℃ 이하, 40℃ 이하일 수 있다.
배양한 섬유아세포는 회수 스텝에 의해서 회수될 수 있다. 회수 스텝은 트립신 등의 프로테아제에 의해서 세포를 박리하여 회수할 수 있지만, 온도 응답성 배양 접시를 사용하여, 온도 변화에 따라 세포를 박리시켜서, 회수할 수 있다. 또한, 항CD90 항체 및/또는 항CD106 항체를 이용하여, 자동 자기 세포 분리 장치(예를 들면, autoMACS)로 회수 또는 농축할 수 있고, 자기 세포 분리 장치(예를 들면, MACS)로 회수 또는 농축할 수 있고, 폐쇄형 자기 세포 분리 장치(예를 들면, Prodigy)로 회수 또는 농축할 수 있고, 세포 선별기(예를 들면, FACS)로 회수 또는 농축할 수 있다. 또한, CD90 단백질 및/또는 CD106 단백질 코딩 유전자의 프로모터하에 약제 내성 유전자를 도입하여, 약제로 선택할 수 있다.
본 실시형태의 제조 방법에서는, 항CD90 항체를 이용하여 CD90＋ 섬유아세포를 선별하는 스텝을 포함할 수 있고, 항CD106 항체를 이용하여 CD106＋ 섬유아세포를 선별하는 스텝을 포함할 수 있고, 이들 두 스텝을 함께 포함할 수 있다. 선별하는 스텝은 어느 타이밍에서 실시해도 좋다. 상기 인자와의 접촉 전이어도 좋고, 인자와의 접촉 후, 배양 전이어도 좋고, 배양 후라도 좋다.
항CD90 항체 및 항CD106 항체는 기지의 것을 사용하는 것이 가능하며, 시판품을 입수하여 사용 가능하다. 항CD90 항체 및/또는 항CD106 항체를 이용하여 선별함으로써, 섬유아세포에서 CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포의 비율을 증가시켜서, 심장 질환 치료 효과가 높은 CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포를 얻을 수 있다.
본 실시형태의 CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포의 제조 방법에 의해, CD106 및/또는 CD90의 발현이 향상된 섬유아세포를 얻을 수 있으며, 상기 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포 집단이 본 발명의 다른 실시형태이다. 특히, CD106＋ 및/또는 CD90＋ 성체 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포의 세포 집단은 TNF-α 및/또는 IL-4에 의해서 자극됨으로써, CD106 및/또는 CD90의 발현이 향상되어 있어, 의약 조성물로서 적합하게 사용 가능하다.
세포 집단에 있어서, 전체 섬유아세포에 대한 CD106＋ 섬유아세포의 비율은 특별히 한정되지 않지만, 세포수 기준으로 3.36% 이상일 수 있고, 5% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있다.
세포 집단에 있어서, 전체 섬유아세포에 대한 CD90＋ 섬유아세포의 비율은 특별히 한정되지 않지만, 세포수 기준으로 5% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있다.
세포 집단에 있어서, 전체 섬유아세포에 대한 CD106＋ 및 CD90＋ 섬유아세포의 비율은 특별히 한정되지 않지만, 세포수 기준으로 5% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있다.
또한, 섬유아세포와 TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 인자와의 접촉에 의해, G-CSF 양성 섬유아세포를 제조 가능한 것도 본 발명자들은 찾아냈다.
G-CSF는 심부전에 따른 심근 세포사를 억제하여, 심근 리모델링 진행을 억제하는 것이 보고되어 있다(Harada, M. et al. G-CSF prevents cardiac remodeling after myocardial infarction by activating the Jak-Stat pathway in cardiomyocytes. Nat. Med. 11, 305-311(2005)). 또한, 심근 세포의 세포 증식을 재촉하는 것도 분명하다고 되어 있다(Shimoji, K. et al. G-CSF Promotes the Proliferation of Developing Cardiomyocytes InVivo and in Derivation from ESCs and iPSCs. Cell Stem Cell 6, 227-237(2010)).
따라서, 본 발명의 다른 형태로서는, 섬유아세포와, TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상을 접촉시키는 접촉 스텝 및 상기 접촉시킨 섬유아세포를 G-CSF의 발현을 향상시키는 조건 하에서 배양하는 배양 스텝을 포함하는, G-CSF 양성 섬유아세포를 제조하는 방법이다.
본 실시형태의 접촉 스텝 및 배양 스텝 등에 대해서는, 상기 CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포의 제조 방법에 관한 기재를 원용 가능하다. 제조된 G-CSF 양성 섬유아세포는 항CD90 항체 및/또는 항CD106 항체를 이용하여, 자동 자기 세포 분리 장치(예를 들면, autoMACS)에서 농축할 수 있고, 자기 세포 분리 장치(예를 들면, MACS)에서 농축할 수 있고, 폐쇄형 자기 세포 분리 장치(예를 들면, Prodigy)에서 농축할 수 있고, 셀 소터(예를 들면, FACS)에서 농축할 수 있다. 또한, G-CSF 단백질 코딩 유전자의 프로모터 하에 약제 내성 유전자를 도입하여, 약제로 선택할 수 있다.
본 실시형태의 G-CSF 양성 섬유아세포의 제조 방법에 의해, G-CSF 양성 섬유아세포를 얻을 수 있으며, 상기 G-CSF 양성 섬유아세포를 포함하는 섬유아세포 집단 또한 본 발명의 다른 실시형태로서, 의약 조성물로서 적합하게 사용 가능한 것 외에, 상기 G-CSF 양성 섬유아세포를 포함하는 세포 집단을 괴사한 심장 조직 영역 내지는 그 주변에 주사 및/또는 관동맥 내에 주입하는 스텝을 포함하는 심장 질환을 치료하는 방법에도 적용 가능하다.
섬유아세포를 포함하는 세포 집단에 있어서, 전체 섬유아세포에 대한 G-CSF 양성 섬유아세포의 비율은 특별히 한정되지 않지만, 세포수 기준으로 1% 이상일 수 있고, 5% 이상일 수 있고, 6.75% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있다.
또한, 섬유아세포에 있어서, G-CSF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량이 β-actin으로 표준화된 FPKM이 0.01 이상일 수 있고, 0.02 이상일 수 있고, 0.03 이상일 수 있고, 0.04 이상일 수 있고, 0.05 이상일 수 있고, 0.1 이상일 수 있다.
또한, 섬유아세포에 있어서, G-CSF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현량이 천연(생체) 섬유아세포의 발현 레벨과 비교하여, 1.1배 이상일 수 있고, 2배 이상일 수 있고, 5배 이상일 수 있고, 10배 이상일 수 있고, 20배 이상일 수 있고, 50배 이상일 수 있고, 100배 이상일 수 있고, 200배 이상일 수 있고, 500배 이상일 수 있다.
또한, G-CSF 양성 섬유아세포는 CD106 및/또는 CD90에 양성일 수 있고, 섬유아세포의 비율(세포수 기준)은 1% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있고, 98% 이상일 수 있고, 100%일 수 있다.
섬유아세포를 포함하는 세포 집단에 있어서, CD106 및/또는 CD90에 양성인 섬유아세포 중, G-CSF 양성인 섬유아세포의 비율(세포수 기준)은 1% 이상일 수 있고, 3% 이상일 수 있고, 5% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 25% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있다.
특히, G-CSF 양성, CD106 양성, 그리고 CD90 양성인 섬유아세포는 섬유아세포를 포함하는 세포 집단에 있어서, 세포수 기준으로 1% 이상일 수 있고, 5% 이상일 수 있고, 7% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있고, 98% 이상일 수 있고, 100%일 수 있다.
의약 조성물로서의 섬유아세포의 세포 집단은 섬유아세포의 세포 집단 이외에, 의약 조성물로서 생리학적으로 허용되는 타성분을 함유할 수 있다.
본 실시형태의 의약 조성물은 심장 질환 환자에게 적용함으로써, 그 심장의 기능을 개선할 수 있다. 본 실시형태에서 심장 질환은 심장 조직의 장해, 결손, 기능 부전 등에서 기인하는 질환이 포함되며, 심부전, 허혈성 심질환, 심근경색, 심근증, 심근염, 비대형 심근증, 확장형 심근증 등이 예시되지만, 이들에 한정되지 않는다. 즉, 본 발명에 따르면, CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포 혹은 G-CSF＋ 섬유아세포를 포함하는 의약 조성물로서, 심장 기능을 개선시키는 것에 이용하기 위한, 예를 들면, 인비보로 심근을 증식시키는 것에 이용하기 위한, 및/또는 심장의 구출율을 개선하는 것에 이용하기 위한 의약 조성물이 제공된다. 본 발명에 따르면 또한, CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포 혹은 G-CSF＋ 섬유아세포를 포함하는 의약 조성물로써, 심장 조직의 섬유화 진행을 억제하는 것에 이용하기 위한 의약 조성물이 제공된다.
CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포 혹은 G-CSF＋ 섬유아세포는 장기의 항상성 유지를 위해 사이토카인 등을 분비하여 염증 반응을 조정하여, 분비된 사이토카인·케모카인 등이 심근 조직 재생에 적합한 미소 환경을 형성하고, 심근 세포의 증식, 심근 세포의 박동 조정을 할 수 있다. 또한, CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포 혹은 G-CSF＋ 섬유아세포는 섬유증 진행을 억제할 수 있다.
심장 질환 환자에 대한 의약 조성물의 적용 방법의 일례는 주사이다.
의약 조성물을 주사제(주사용 조성물)로서 이용할 경우, 주사제로는 CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포 혹은 G-CSF＋ 섬유아세포 이외에, 타세포나 타성분을 포함할 수 있고, 타세포를 포함할 경우, 주사제에 포함되는 섬유아세포 전체량에 대하여, CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포 혹은 G-CSF＋ 섬유아세포의 비율은 세포수 기준으로 0.03% 이상일 수 있고, 0.1% 이상일 수 있고, 1% 이상일 수 있고, 2% 이상일 수 있고, 4% 이상일 수 있고, 5% 이상일 수 있고, 6.75% 이상일 수 있고, 10% 이상일 수 있고, 20% 이상일 수 있고, 30% 이상일 수 있고, 40% 이상일 수 있고, 50% 이상일 수 있고, 60% 이상일 수 있고, 70% 이상일 수 있고, 80% 이상일 수 있고, 90% 이상일 수 있고, 95% 이상일 수 있고, 98% 이상일 수 있고, 99% 이상일 수 있다.
또한, 주사제로 할 경우, 주사제 중에 포함되는 CD106＋ 및/또는 CD90＋ 그리고 G-CSF＋ 섬유아세포수가 1×106cell 이상일 수 있고, 5×106cell 이상일 수 있고, 1×107cell 이상일 수 있다.
주사용 조성물에 포함되는 CD106＋ 및/또는 CD90＋ 섬유아세포는 혹은 G-CSF＋ 섬유아세포는 타세포, 예를 들면, 심근 세포와 공배양한 세포일 수 있다.
주사제는 주사제로서 생리학적으로 허용되는 타성분을 함유할 수 있다. 이러한 타성분으로서는, 생리식염수, 인산 완충 생리식염수(PBS), 세포 보존액, 세포 배양액, 하이드로 겔, 세포 외 매트릭스, 동결 보존액 등을 들 수 있다.
주사제는 성체 섬유아세포가 심장 조직에 주사됨으로써, 예를 들면, 괴사된 심장 조직 영역 혹은 그 주변 및/또는 관동맥 내 혹은 정맥, 동맥, 림프절, 림프관에 주입함으로써, 심장 질환을 치료할 수 있다. 또한, 상기 성체 섬유아세포의 유래로서 심장 질환 환자 자신의 조직을 이용함으로써, 자가 이식을 실시할 수 있다.
또한, 섬유아세포 집단은 타세포의 배양 기반 재료로서 사용할 수 있고, 장기 또는 조직을 형성하는 것, 예를 들면, 평면 또는 입체 세포 조직을 구축하기 위해서 사용할 수 있다. 섬유아세포 집단은 타세포, 예를 들면, 심근 세포를 공배양한 후에 평면 또는 입체 조직으로 할 수 있지만, 공배양하지 않아도 평면 또는 입체 조직으로서 유효하게 기능한다. 평면 또는 입체 조직으로서는, 예를 들면 세포 시트나 셀 파이버, 3D 프린터로써 형성된 조직 등이 예시되지만, 이들에 한정되지 않는다.
이러한 평면 또는 입체 조직을 괴사된 심장 조직 영역에 적용함으로써, 또는 인공 장기로서 괴사된 심장 조직과 교환함으로써, 심장 질환을 치료할 수 있다.
[실시예]
이하에 실시예를 나타내며, 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 이로써 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
<동물과 세포와 시약>
본 연구에서 실시한 모든 동물 실험의 프로토콜은 LSI 메디엔스(도쿄, 일본)의 윤리심사위원회의 승인을 받았다. 또한, 모든 동물에게 고통 경감 조치를 실시하였다.
세포는 다음 메이커로부터 구입하였다: 인간 성체 심장 섬유아세포(Lonza, Basel,　Switzerland); 인간 태아 심장 섬유아세포(Cell　Applications,　San　Diego,　CA); 인간 iPS 세포 유래 심근 세포(iPS-CM, 마이오릿지, 교토, 일본). 또한, 인간 iPS 세포 유래 심장 섬유아세포는 iPS-CM으로부터 기재 표면에 대한 접착성 차이에 의해서 단리되었다.
다음의 항체는 면역 형광 염색, 유세포 분석기 해석에 사용하였다: BV421 마우스 항인간 CD106 항체(BD　Biosciences, San　Jose,　CA); BV421　마우스 IgG1; κ아이소 타입 컨트롤(BD　Biosciences); 인간 CD90-PE(Miltenyi　Biotec, Bergisch Gladbach,　Germany); REA 컨트롤(S)-PE(Miltenyi　Biotec); 마우스 모노크로널 항카디악 트로포닌 T(cTnT)(Thermo　Scientific, Waltham, MA); 토끼 폴리크로널 항Ki67(Abcam, Cambridge, UK); Hoechst33258 용액(도우닌 화학 연구소, 구마모토, 일본); Ms　mAb　to　G-CSF(Abcam); APC　Goat　anti-mouse IgG(BioLegend, San Diego, CA). 세포질에 국재하는 단백질의 해석에 관하여서는, 형광 현미경으로의 해석에서는, 세포를 0.1%　Triton-X(Sigma　Aldrich, St. Louis, MO)로 30분간(실온), 세포막 투과 처리를 실시하여, 면역 형광 염색하였다. 유세포 분석기 해석에 있어서는, 각종 섬유아세포를 0.1% 사포닌(나카라이테스크, 교토, 일본)으로 15분간(실온), 세포막 투과 처리를 실시하여, 면역 형광 염색하였다.
<세포 선별>
F-VNCF(CD106 음성 태아 심장 유래 섬유아세포), F-VCF(CD106 양성 태아 심장 유래 섬유아세포) 및 uA106-HCF(성체 심장 유래 섬유아세포에 TNF-α와 IL-4를 첨가하여, CD90과 CD106 양성 세포의 비율을 향상시킨 후에, CD106을 지표로 세포 선별한 CD106 양성 성체 심장 유래 섬유아세포)는 인간 CD106(VCAM-1)-비오틴(Miltenyi　Biotec)으로 1차 면역 염색을 실시하고, 항비오틴 마이크로 비즈(Miltenyi　Biotec)로 2차 면역 염색하였다. uA90-HCF(성체 심장 유래 섬유아세포에 TNF-α와 IL-4를 첨가하여, CD90과 CD106 양성 세포의 비율을 향상시킨 후에, CD90을 지표로 세포 선별한 CD90 양성 성체 심장 유래 섬유아세포)는 인간 CD90-비오틴(Miltenyi　Biotec)으로 1차 면역 염색을 실시하고, 항비오틴 마이크로 비즈(Miltenyi　Biotec)로 2차 면역 염색하였다. 염색한 세포는 autoMACS(Miltenyi Biotec)로 CD106 및 CD90 양성 세포를 회수하였다.
CD90과 CD106 양성 세포의 비율이 높은 성체 심장 섬유아세포(uA90·106-HCF)는 성체 심장 유래 섬유아세포에 TNF-α와 IL-4를 첨가하여, CD90과 CD106 양성 세포의 비율을 향상시킨 후에, BV421　마우스 항인간 CD106 항체(BD Biosciences, San　Jose,　CA); BV421　마우스 IgG1; κ아이소 타입 컨트롤(BD Biosciences); 인간 CD90-PE(Miltenyi　Biotec,　Bergisch　Gladbach,　Germany); REA 컨트롤(S)-PE(Miltenyi　Biotec)으로 면역 염색을 실시하고, BD　FACS ARIAIII(BD　Biosciences)로 세포 선별에 의해서 회수하였다.
<유세포 분석기>
면역 형광 염색한 세포는 1.0×106cells/trial의 농도로 조제하여, 유세포 분석기(MACSQuant　Analyzer　10, Miltenyi　Biotec)로 해석하였다. FSC-A 및 SSC-A로 세포 영역을 인식 후, 각종 마커 단백질에 대한 양성 세포의 비율(%, 세포수 환산)을 평가하였다.
<RNA 추출과 mRNA 시퀀싱>
각종 섬유아세포로부터 Qiagen　RNeasy　Mini　Kit(QIAGEN,　Valencia, CA)를 사용하여 RNA를 회수하였다. CD90과 CD106 양성 세포의 비율이 높은 성체 심장 섬유아세포(uA90·106-HCF)는 성체 심장 유래 섬유아세포에 TNF-α와 IL-4를 첨가하여, CD90과 CD106 양성 세포의 비율을 향상시킨 후에 BD　FACS　ARIAIII(BD Biosciences)로 세포 선별에 의해서 회수하였다. 회수한 RNA의 농도와 순도는 Agilent　2100 Bioanalyzer(Agilent　Technologies,　Palo　Alto,　CA)와 NanoDrop One(Thermo　Fisher　Scientific)으로 해석하였다. RIN치가 7 이상인 RNA 1㎍을 라이브러리 조제에 사용하였다. 차세대 시퀸서용 라이브러리 조제는 NEBNext Ultra RNA　Library　Prep　Kit　for　Illumina의 메이커 프로토콜을 따라 실시하였다.
poly(A) mRNA의 단리는 NEBNext　Poly(A) mRNA　Magnetic　Isolation Module(NEB)과 Ribo-Zer　rRNA　removal　Kit(Illumina)를 사용하였다. mRNA 단편화와 프라이밍은 NEBNext　First　Strand　Synthesis　Reaction　Buffer와 NEBNext Random　Primers를 사용하였다.
제1쇄 cDNA는 ProtoScript　II　Reverse　Transcriptase를 이용하여 합성하였다. 제2쇄 cDNA의 합성은 Second　Strand　Synthesis　Enzyme　Mix를 사용하였다. AxyPrep　Mag　PCR　Clean-up(Axygen, UnionCity, CA)으로 정제한 double-stranded　cDNA는 양단의 복원과 증폭 산물의 말단에 dA를 부가한 후 TA 클로닝을 실시하기 위해서 End　Prep　Enzyme　Mix로 처리하였다. Adaptor-ligated　DNA의 사이즈는 AxyPrep　Mag　PCR　Clean-up(Axygen)을 이용하여 360bp까지의 단편을 선택하였다. 각각의 샘플은 P5 및 P7 프라이머를 이용하여 PCR에서 11사이클 증폭시켰다. PCR 산물은 AxyPrep　Mag　PCR　Clean-up(Axygen)으로 세정하여, Agilent 2100　Bioanalyzer(Agilent Technologies)로 평가하였다. PCR 산물의 정량은 Qubit 2.0　Fluorometer(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하였다.
시퀀싱은 Illumina　HiSeq(Illumina)로 2×150bp　paired-end(PE) configuration의 조건에서 실시하였다. 이미지 해석과 베이스 콜은 HiSeq　Control Software(HCS)＋OLB＋GAPipeline-1.6(Illumina)을 사용하였다. 시퀀싱은 GENEWIZ(SouthPlainfield, NJ)로 실시하였다.
<발현 차이 해석>
발현 차이 해석은 DESeq　Bioconductor　package를 사용하였다. false discovery　rate(FDR)의 보정은 Benjamini　and　Hochberg's로 실시하여, P-value<0.05를 의미 있다고 간주하였다.
<심근 세포와 섬유아세포의 공배양>
세포 파종 전, 384 웰 플레이트(Thermo　Fisher　Scientific)를, high-glucose DMEM에서 1:30으로 희석한 마트리겔 기저막 매트릭스(Corning, Corning, NY) 100μL/well로 37℃,　1시간 코팅하였다. iPS-CM과 섬유아세포는, 8:2의 비율로 DMEM＋10% 신생 송아지 혈청(NBCS)으로 공배양하였다(심근 세포=16,000cells/well:섬유아세포=4,000cells/well).
공배양 개시 후, 10일에서 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시켜, 면역 형광 염색을 실시하였다. 염색 샘플은 In Cell Analyzer 2200(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 및 IN　Cell　Developer　Toolbox 1.92(GE　Healthcare)로 해석하였다.
<만성 심부전 모델 래트 제작과 심장 초음파 검사의 계측>
누드 래트(F344/N　Jcl-rnu/rnu, 8주령, 수컷)는, 일본 쿠레아(도쿄, 일본)로부터 구입하였다. 1주간의 순화 후, 동물은 실험 동물용 흡입 마취기(소프트랜더(신에츠 공업 주식회사, 사이타마, 일본)를 이용하여, 2% 아이소플루레인(마취 보조제; 이산화질소:산소=7:3)으로 흡입 마취하여, 털을 깍았다. 재빠르게 기관 삽관을 실시하고, 그대로 0.5-2% 아이소플루레인(마취 보조제; 이산화질소:산소=7:3) 흡입 마취 가스를 인공 호흡기에 접속해서, 마취를 유지하였다. 인공 호흡 관리하에, 앙와위로 고정시키고, 좌 제3 늑골부터 제5 늑골까지의 사이에서 2∼3개, 늑연골의 위치에서 세로 방향으로 절단하여 개흉하였다. 개창기에 의해, 수술 부위를 확대 후, 심낭막을 박리하여 심장을 노출시켰다. 좌심방을 들어올리고, 혈관용 실 부착 약만 환침(6-0: 네스코스처)을 사용하여 좌심실의 깊이 약 2㎜, 길이 4-5㎜로 실을 통과시켰다. 실의 양단을 맞추어서 폴리에틸렌 튜브로 제작한 올가미(snare)를 통해, 동맥 집게(Klemme)를 사용하여 실을 조여서(올가미법) 관동맥을 30분간 허혈하였다. 30분 후, 재관류시켜서 상태가 안정되면, 출혈이 없는 것을 확인하고, 흉강 드레나지를 실시하여, 근층 및 피부를 봉합하였다. 피부는 피내 봉합을 실시하지만, 통상 봉합을 실시한 경우에는, 수술 후 상태를 관찰하면서 실 뽑기를 실시하였다. 모델 제작 후, 1주간의 세포 투여일 전날에, 초음파 화상 진단 장치(Xario SSA-660A, 도시바 메디컬 시스템즈, 토치기, 일본)를 이용하여 심장 초음파 검사를 측정하였다. 좌실 구출율(LVEF=(LVIDd3-LVIDs3)/LVIDd3)이 55% 이하인 개체를 만성 심부전 모델로 간주하여, 섬유아세포의 투여 실험을 실시하였다.
<만성 심부전 모델 래트에 섬유아세포 투여>
투여 시험 당일에 동결 보존한 각종 섬유아세포를 해동하고, high-glucose DMEM＋10%NBCS로 희석하여, 생존 세포수로 하고, 각 개체에 대해서, 2.0×106cells/50μL의 세포 현탁액을 투여하였다. A-HCF와 uA-HCF 투여군은 N=4, uA90-HCF 투여군은 N=3으로 실시하였다. 동물은 모델 제작 시와 동일한 수법으로 마취를 유지하고, 인공 호흡 관리하에, 경색처의 2개소로 나누어서, 30G 바늘 부착 카테텔을 이용하여 세포 현탁액을 50μL 전량 투여하였다. 상태가 안정된 후에, 투여액의 누출 및 출혈이 없는 것을 확인하고, 흉강 드레나지를 실시하여, 근층 및 피부를 봉합하였다. 피부는 피내 봉합을 실시하지만, 통상 봉합을 실시한 경우에는, 수술 후 상태를 관찰하면서 실 뽑기를 실시하였다.
<심장 초음파 검사에 의한 만성 심부전 모델 래트의 심기능 평가>
섬유아세포 투여를 실시한 만성 심부전 모델 래트는 2주간마다 초음파 화상 진단 장치(Xario　SSA-660A)를 이용하여 심장 초음파 검사를 측정해서, 경과 관찰을 실시하였다. 구체적으로는, 동물의 흉부를 이발기로 털을 깍아서, 흉부에 프로브를 대고 M-mode로 좌실 구출율(LVEF=(LVIDd3-LVIDs3/LVIDd3), 좌실 내 지름 단축율(LVFS=(LVIDd―LVIDs)×100/LVIDd)을 측정하였다. 심 기능치는 소수점 이하 1자리수(소수점 이하 제2 자리수를 사사오입한다)로 나타낸다.
<통계 해석>
심기능 평가는 평균 ±SE(표준 오차)로 나타낸다. 기타 모든 데이터는 평균 ±SD(표준 편차)로 나타낸다. 2군 사이의 유의차는 student's　t-test로 산출하였다. 3군 이상의 변동차는 일원 배치 분산 분석에 의해서 산출하였다. 그 후, 3군 사이의 유의차는 Tukey-Kramer　Multiple　Comparison　Test로 산출하였다. 0.05보다 낮은 p치는 의미 있게 다르다고 간주하였다. 모든 통계 계산은 R소프트웨어를 이용하여 실시하였다.
이하, 실시한 실험 결과를 나타낸다.
<TNF-α와 IL-4에 의한 심장 섬유아세포의 CD106 및 CD90 발현율 향상>
성체 심장 유래 섬유아세포(A-HCF)에, TNF-α를 여러 가지 농도로 첨가하여, HFDM-1(＋) 배지에서 3일간 배양을 실시한 후, 유세포 분석기로 CD106 양성 세포의 비율(%) 및 CD90 양성 세포의 비율(%)을 평가하였다. 결과를 도 1에 나타낸다.
또한, 성체 심장 유래 섬유아세포(A-HCF)에, IL-4를 여러 가지 농도로 첨가하여, HFDM-1(＋) 배지에서 3일간 배양을 실시한 후, 유세포 분석기로 CD106 양성 세포의 비율(%) 및 CD90 양성 세포의 비율(%)을 평가하였다. 결과를 도 2에 나타낸다.
이러한 결과로부터, TNF-α 또는 IL-4 첨가에 의해, CD106 양성 세포의 비율(%) 및 CD90 양성 세포의 비율(%)이 향상하는 것이 이해된다.
다음으로, 성체 심장 유래 섬유아세포(A-HCF)에, TNF-α와 IL-4를 2제 혼합으로 첨가하여, HFDM-1(＋) 배지에서 3일간 배양을 실시한 후, 유세포 분석기로 CD106 양성 세포의 비율(%) 및 CD90 양성 세포의 비율(%)을 평가하였다. 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타낸다. 도 3a로부터는, A에 나타내는 컨트롤(무첨가)과 비교하여, B에 나타내는 TNF-α와 IL-4의 2제를 혼합 첨가하면, CD106 양성 세포의 비율(%) 및 CD90 양성 세포의 비율(%)이 크게 향상하는 것이 이해된다.
또한, 태아 심장 유래 섬유아세포(F-HCF)와 iPS 세포 유래 심장 섬유아세포(i-HCF)에 TNF-α(50ng/mL)와 IL-4(2ng/mL)를 2제 혼합으로 첨가하여, HFDM-1(＋) 배지에서 3일간 배양을 실시한 후, 유세포 분석기로 CD106 양성 세포의 비율(%) 및 CD90 양성 세포의 비율(%)을 평가하였다. 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타낸다.
도 4a 및 도 4b로부터는, 심장 섬유아세포의 유래가 달라도, TNF-α와 IL-4의 2제를 혼합 첨가하면, CD106 양성 세포의 비율(%) 및 CD90 양성 세포의 비율(%)이 크게 향상하는 것이 이해된다.
다음으로, F-HCF를 항CD106 항체로 세포 선별하여, CD106 및 CD90 양성 세포의 비율을 크게 향상시킨 섬유아세포(F-VCF)와, CD106 양성 세포의 비율을 크게 감소시킨 섬유아세포(F-VNCF)를 control에, A-HCF, A-HCF에 TNF-α(50ng/mL)와 IL-4(2ng/mL)를 2제 혼합으로 첨가하여, HFDM-1(＋) 배지에서 3일간 배양함으로써 CD106 및 CD90 양성 세포의 비율을 향상시킨 섬유아세포(uA-HCF), uA-HCF로부터 CD106 및 CD90 양 양성 세포만을 세포 선별에 의해 회수한 섬유아세포(uA90·106-HCF)의 유전자 발현 차이 해석을 실시하였다. 그 결과를 도 5에 나타낸다. 도 5로부터는, 각종 심장 섬유아세포에서 granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF) 단백질 코딩 유전자의 발현량이 크게 다르다는 것이 분명해졌다. F-VNCF와 F-VCF, A-HCF의 G-CSF 유전자 발현량(β-actin의 FPKM으로 표준화한 G-CSF의 FPKM)은 각각 0.000178, 0.000125, 0.000553이었던 것에 비하여, uA-HCF는 0.101496, uA90·106-HCF는 0.229072 발현되고 있는 것이 분명해졌다. F-VCF치를 1로 설정한 바, F-VNCF와 A-HCF의 G-CSF 유전자 발현량(β-actin의 FPKM으로 표준화한 G-CSF의 FPKM fold increase)은 각각 1.42, 4.41이었던 것에 비하여, uA-HCF는 810.21, uA90·106-HCF는 1828.61 발현되고 있는 것이 분명해졌다.
따라서, TNF-α와 IL-4의 2제를 A-HCF에 첨가하여, CD106 및 CD90 양성 세포의 비율을 향상시킴으로써, G-CSF는 그 발현량을 크게 향상시킬 수 있는 것이 분명해졌다. 또한, uA-HCF를 세포 선별하여, CD90 및 CD106 양성 세포의 비율을 높임으로써, G-CSF의 발현량을 더욱 향상시킬 수 있다는 것을 알았다. 선행 연구로부터, G-CSF는 심부전에 따른 심근 세포사를 억제하여, 심근 리모델링 진행을 억제하는 것이 보고되어 있고, 또한, 심근 세포의 세포 증식을 재촉하는 것도 분명해졌다. 본 결과로부터, TNF-α와 IL-4에 의해서 G-CSF의 발현량을 인위적으로 향상시킨 uA-HCF, uA90-HCF, uA106-HCF, uA90·106-HCF는 심근 세포 증식능과 심부전 치료 효과가 높다는 것이 시사된다.
<CD106 및 CD90의 발현 레벨이 향상된 심장 섬유아세포에 의한, 인간 iPS 세포 유래 심근 세포의 증식 효과>
TNF-α(50ng/mL)와 IL-4(2ng/mL)를 2제 혼합으로 첨가하여, HFDM-1(＋) 배지에서 3일간 배양함으로써 CD90 및 CD106 양성 세포의 비율을 향상시킨 심장 섬유아세포를 표 1에 기재한 대로 준비하였다. 또한, 컨트롤로서 TNF-α와 IL-4를 첨가하지 않고 배양한 심장 섬유아세포를 준비하였다.
준비한 CD90 및 CD106 양성 세포의 비율이 향상된 심장 섬유아세포를, 항CD90 항체 또는 CD106 항체로 세포 선별함으로써, CD90과 CD106 양 양성(DP: 더블 포지티브) 섬유아세포를 효율적으로 회수 가능하였다.
[표 1]
Figure pct00001
다음으로, 표 1에 기재한 각각의 심장 섬유아세포와 iPS 유래 심근 세포(iPS-CM)를 공배양하여, 심장 섬유아세포에 의한 심근 증식 효과의 평가를 실시하였다. iPS-CM은 심근 세포 특이적 마커인 카디악 트로포닌 T(cTnT)가 92.22% 양성인 세포를 사용하였다. 각종 섬유아세포와 iPS-CM을 10일간 공배양하여, Ki67과 카디악 트로포닌 T(cTnT) 양 양성의 증식 상태에 있는 심근 세포수를 계측하였다. 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6으로부터, A-HCF와 비교하여 TNF-α와 IL-4를 첨가한 uA-HCF의 공배양 조건에서 증식 상태에 있는 심근 세포수의 증가가 인정되고, uA90-HCF 및 uA106-HCF의 공배양 조건에서는 의미 있게 증식 상태에 있는 심근 세포수의 증가가 관찰되었다.
<CD90 및 CD106 양성 세포의 비율을 향상시킨 심장 섬유아세포에 의한 래트 만성 심부전의 장기 치료 효과>
상기 허혈-재관류에 의해 제작한 만성 심부전 모델 래트에게 표 1에 나타내는 A-HCF, uA-HCF, uA90-HCF를 주사기로 심근 내 투여하여, 각종 섬유아세포에 의한 래트 심부전의 치료 효과를 심장 초음파 검사로 평가하였다. Sham은 N=6, Control은 N=4, A-HCF 투여군은 N=7, uA-HCF 투여군은 N=8, uA90-HCF 투여군은 N=9로 실시하였다. 또한, 제작한 각종 섬유아세포 집단의 CD90 및 CD106 양성 세포의 비율을 유세포 분석기로 평가한 바, A-HCF는 CD90 및 CD106 양 양성 세포(DP)가 1.77%이었던 것에 비하여, uA-HCF의 DP는 21.36%, uA90-HCF의 DP는 61.25%였다. 결과를 도 7a, 도 7b 및 도 7c에 나타낸다.
도 7a, 도 7b 및 도 7c로부터, A-HCF 투여에서는 심부전 치료 효과를 인정할 수는 없었지만, uA-HCF와 uA90-HCF는 이식 후 4주에서 LVEF와 LVFS를 크게 개선 가능한 것이 이해된다.
또한, 각종 섬유아세포에 의한 LVEF와 LVFS의 증감 비율(Delta-LVEF, Delta-LVFS)을 비교 해석한 바, uA-HCF와 uA90-HCF는 Delta-LVEF와 Delta-LVFS를 세포 이식 전부터 향상시켜서, A-HCF와 비교하여 uA90-HCF는 Delta-LVEF와 Delta-LVFS를 의미 있게 개선 가능한 것이 이해된다.
<인간 섬유아세포의 G-CSF 양성 세포의 비율 및 TNF-α 및 IL-4 첨가에 따른 G-CSF 양성 세포의 비율 향상>
TNF-α(50ng/mL)와 IL-4(2ng/mL)를 2제 혼합으로 첨가하여, HFDM-1(＋) 배지에서 3일간 배양함으로써 CD90 및 CD106 양성 세포의 비율을 향상시킨 심장 섬유아세포(uA-HCF)를 표 2에 기재한 대로 준비하였다. 또한, 항CD90 항체와 항CD106 항체로 세포 선별한 심장 섬유아세포(uA90·106-HCF)를 준비하였다. 또한, 컨트롤로서, TNF-α와 IL-4를 첨가하지 않고 배양한 심장 섬유아세포(A-HCF), 태아 심장 유래 CD106 음성 섬유아세포(F-VNCF), 태아 심장 유래 CD106 양성 섬유아세포(F-VCF)를 준비하였다.
[표 2]
Figure pct00002
각종 섬유아세포의 G-CSF 양성 세포의 비율을 유세포 분석기로 평가한 바, F-VNCF는 G-CSF 양성 세포의 비율이 9.04%이었던 것에 비하여, F-VCF는 4.35%, A-HCF는 6.75%, uA-HCF는 24.70%, uA90·106-HCF는 92.50%였다(도 8). 본 결과로부터, 천연에 존재 하는 CD106 양성 세포(F-VCF)는 G-CSF 양성 세포의 비율이 낮아서, TNF-α와 IL-4에 접촉시켜서, 인공적으로 제조한 CD106 양성 및/또는 CD90 양성 심장 섬유아세포는 CD106 및/또는 CD90 양성 세포의 비율이 향상함에 따라, G-CSF 양성 세포의 비율이 향상하는 것이 분명해졌다.
<CD106 및 CD90 양성 세포의 비율을 향상시킨 심장 섬유아세포에 의한 래트 만성 심부전의 장기 치료 효과>
허혈-재관류에 의해서 제작한 만성 심부전 모델 래트에게, A-HCF, uA-HCF, uA90-HCF를 주사기로 심근 내 투여하여, 각종 섬유아세포에 의한 래트 심부전의 장기 치료 효과를 심장 초음파 검사로 평가하였다. 그 결과, A-HCF 투여에서는 심부전 치료 효과를 인정할 수는 없고, 이식 후 18주의 LVEF는 44.1±2.8%를 나타내고, LVFS는 17.8±1.4%를 나타냈다(도 9a 및 도 9b의 A 및 C). 또한, CD90 항원을 지표로 세포 선별을 실시한 uA90-HCF는 장기간(이식 후 12주 이후)에서 LVEF와 LVFS의 개선 효과가 인정되어, 이식 후 18주의 LVEF는 61.0±2.2%를 나타내고, LVFS는 27.2±1.4%를 나타냈다.
또한, 각종 섬유아세포 투여에 따른 LVEF와 LVFS의 증감 비율(Delta-LVEF, Delta-LVFS)을 비교 해석한 바, A-HCF 투여군은 이식 후 18주에서 -6.9±2.6%의 Delta-LVEF치를 나타내고, -3.5±1.3%의 Delta-LVFS치를 나타냈다(도 9b의 B 및 D). 한편, uA-HCF 투여군은 이식 후 18주에서 -1.8±3.4%의 Delta-LVEF치를 나타내고, -0.6±1.8%의 Delta-LVFS치를 나타냈다. 또한, uA90-HCF 투여군은 이식 후 18주에서 9.2±2.6%의 Delta-LVEF치를 나타내고, 5.6±1.6%의 Delta-LVFS치를 나타냈다. 따라서, uA90-HCF는 부전 심근 기능을 장기간에 걸쳐 의미 있게 개선 가능한 것이 이해된다. 또한, 주항목(LVEF, LVFS)의 내역과, 부차 항목(LVEDV, LVESV, LVIDd, LVIDs, LVAWd, LVPWTd, HR)의 내역은 표 3∼11에 나타냈다.
[표 3]
Figure pct00003
[표 4]
Figure pct00004
[표 5]
Figure pct00005
[표 6]
Figure pct00006
[표 7]
Figure pct00007
[표 8]
Figure pct00008
[표 9]
Figure pct00009
[표 10]
Figure pct00010
[표 11]
Figure pct00011

Claims (15)

  1. CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 제조하는 방법으로서,
    섬유아세포를, TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 존재 하에서 배양하여, CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 증가시키는 스텝,
    을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    배양되는 섬유아세포가, 성체로부터 얻어진 섬유아세포인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포가, CD106 양성 및 CD90 양성인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    CD106 양성 및/또는 CD90 양성 섬유아세포를 농축하는 스텝을 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 농축이, 항CD106 항체 및/또는 항CD90 항체를 이용하여 이루어지는, 방법.
  6. G-CSF 양성 섬유아세포를 제조하는 방법으로서,
    섬유아세포를 TNF-α 및 IL-4로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 존재 하에서 배양하여, G-CSF의 발현량을 향상시키고, G-CSF 양성 섬유아세포를 증가시키는 스텝,
    을 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    배양되는 섬유아세포가, 성체로부터 얻어진 섬유아세포인, 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서,
    상기 배양 후에, G-CSF 양성 섬유아세포를 농축하는 스텝을 추가로 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 농축이, 항CD106 항체 및/또는 항CD90 항체를 이용하여 이루어지는, 방법.
  10. 단리된 CD106 양성 및 G-CSF 양성인 섬유아세포를 포함하는, 세포 집단.
  11. 제10항에 있어서,
    섬유아세포에 대한 G-CSF 양성 섬유아세포의 비율(세포수)이 6.75% 이상인, 세포 집단.
  12. 성체로부터 얻어진 섬유아세포를 포함하는 세포 집단으로서, 상기 섬유아세포의 5% 이상이 CD106 양성인, 세포 집단.
  13. 성체로부터 얻어진 섬유아세포를 포함하는 세포 집단으로서, 상기 섬유아세포의 7% 이상이 CD90 양성, CD106 양성, 그리고 G-CSF 양성인, 세포 집단.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 기재된 세포 집단과 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는, 의약 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    심 기능을 개선하는 것에 사용하기 위한, 의약 조성물.
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