KR20210044471A - 연잎 유래 다당 분획물을 함유하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 골 관련 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물에 관한 것으로 효소로 처리하지 않은 연잎 유래 다당 분획물 또는 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유함으로써, 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있다.

Description

연잎 유래 다당 분획물을 함유하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물{A composition for improving, preventing and treating bone-related disease comprising polysaccharide fraction isolated from Nelumbo nucifera leaf}
본 발명은 효소로 처리하지 않은 연잎 유래 다당 분획물 또는 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유함으로써, 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
뼈(골, Bone)는 인체의 연한 조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸고 있어서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호하는 역할을 한다. 또한, 근육이나 장기를 구조적으로 지탱하며, 체내의 칼슘, 인 또는 마그네슘과 같은 다른 필수 무기질 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다.
성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈를 제거하고 제거된 오래된 뼈 대신 새로운 뼈를 대체하는 생성과 흡수 과정을 매우 역동적이며 지속적으로 반복재생 하면서 균형을 유지한다. 이를 골 재형성(Bone remodeling)이라고 하는데, 오래된 뼈를 제거하고 이를 새로운 뼈로 대체하는 뼈의 순환은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다. 상기 골의 재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있는데, 상기 두 종류의 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(Osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(Osteoclast)이다.
상기 조골세포는 RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)과 이것의 유도 수용체인 오스테오프로테제린(Osteoprotegerin, OPG)을 생성한다. 상기 RANKL이 파골 전구세포 표면에 있는 수용체인 RANK에 결합하면 파골세포의 전구세포가 파골세포로 성숙화되어 골 흡수가 일어난다. 그러나, 오스테오프로테제린(OPG)이 RANKL과 결합하면 RANKL과 RANK간 결합이 차단되어 파골세포의 형성이 억제되고 골 흡수가 일어나지 않게 된다.
골 관련 질환의 대표적인 질환인 골다공증(Osteoporosis)은 뼈의 양이 감소하고 질적인 변화로 인해 뼈의 강도가 약해져서 골절이 일어날 가능성이 높은 상태를 말한다. 낮은 골 질량(Mass) 상태로 정의되어 온 골다공증은 중요한 사회적 문제 중 하나로서, 미국의 경우 매년 약 26만 명의 여성들에게 유발되고 있으며 이중 약 12 내지 24% 정도는 사망에 이른다. 사회가 점점 더 노령화되고 여성들의 사회참여가 활발해 지고 있는 상황에서 노인들이나 폐경 후 여성들의 골다공증 및 골다공증으로 인한 골절은 심각한 문제를 야기한다.
낮은 골 밀도의 원인은 유전적 요인, 조기 폐경, 스테로이드 등의 약제, 동반 질환, 흡연 및 알코올 등이며, 골절의 원인은 낮은 골밀도, 저체중, 과거 골절력, 부모 또는 형제의 골절력, 흡연 및 알코올 등이다. 즉, 뼈를 구성하는 미네랄 (특히 칼슘)과 기질이 감소한 상태이며, 골 재형성의 균형이 깨져서 파골작용이 조골 작용보다 증가된 상태에서 발생한다. 정상적인 뼈 내부는 그물망처럼 치밀한 구조를 이루고 있으나, 골다공증의 경우에는 골 미세구조 사이의 간격이 넓어지고 미세구조가 얇아져 약해짐으로써 조그만 충격에도 뼈가 쉽게 골절될 위험이 증가하는 질환이다.
상기 골다공증은 노년층에서 골 취약성(Fragility)의 증가 및 결과적인 골절 위험의 증가를 초래하는 골 조직의 마이크로 구조상(Micro architectural)의 퇴보를 특징으로 하는 질환이다. 이와 같이 골다공증은 50세 이상 여성의 50%와 50세 이상 남성의 30% 보다 많은 인원이 영향을 받는 것으로 알려져 있으며, 여성에게는 폐경기 직후 또는 그 후 몇 년 동안 골 손실의 속도가 가속화된다. 대부분은 증상이 없지만 골절이 발생하면 통증이 생기고, 골절이 발생한 부위에 따라 다양한 증상이 나타날 수 있다. 모든 부위에서 골절이 일어날 수 있지만, 특히 손목뼈, 척추, 고관절(대퇴골)에서 골절이 자주 발생한다. 또한, 연령에 상관없이 질병이나 약물, 알코올, 흡연, 사고로 인해 발생하는 이차 골다공증으로 분류할 수 있다.
현재 골다공증의 치료 약제로 사용되고 있는 물질로는 전통적으로 폐경기 여성에게 많이 사용되는 여성호르몬 제제(Estrogen), 남성화 스테로이드 호르몬(Androgenic anagolic steroids), 비스포스포네이트(Bisphosphonate) 제제, 부갑상선호르몬, 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D3 등이 있다. 상기 여성호르몬은 골절 감소의 효과가 있지만 혈전증과 유방암의 위험을 높이기 때문에 주의해서 사용되어야 하며, 에스트로겐은 조골세포의 세포 사멸을 억제하여 세포의 생존 기간을 증가시키고 파골세포의 세포 사멸을 촉진하여 세포의 생존 기간을 감소시켜 폐경 증상의 치료와 골밀도 유지에 어느 정도 효과적인 방법이지만, 자궁내막 증식증 등을 유발하는 부작용이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(Selective estrogen receptor modulator, SERM)가 개발되었다. 이 계열의 약제로는 라록시펜(Raloxifene)이 있으며, 척추 골절 예방의 효과가 있을 뿐만 아니라 일부에서 유방암의 발생을 낮추었다는 보고가 있다. 또한, 상기 비스포스포네이트 제제는 가장 널리 사용되는 골다공증 치료제로서, 파골세포의 기능을 저하시키고 그 수를 줄여 뼈의 파괴를 막는다. 뿐만 아니라, 스트론튬(Strontium ranelate)은 먹는 골다공증 치료제로서 골 형성을 증가시키는 반면, 골 흡수가 억제되는 문제점이 있다.
한편, 연(蓮)(Nelumbo nucifera , Sacred lotus)은 수련과(Nymphaeaceae)에 속한 다년생 수생 식물로서 아시아 남부, 북호주가 원산지이다. 인도와 중국을 중심으로 열대, 온대의 동부아시아를 비롯한 한국, 일본 등에 널리 분포하고 있는 식물로 수심 2.5 m 이내의 범람지역, 호수, 습지, 늪, 호수 및 연못 등에서 서식하며 특히 불교에서는 예로부터 연을 신성시하여 관상용으로 많이 재배하였다. 국내에서 식용을 목적으로 연을 재배하기 시작한 것은 약 50년 전으로 알려져 있으며 최근에는 농가에서 수익성 작물로 연못이나 논에 연을 심어서 대량으로 인공재배하는 곳이 늘고 있다.
상기 연은 뿌리인 연근, 홍색 또는 백색의 연꽃, 열매인 연밥과 연잎으로 나뉜다. 즉, 연은 연잎(lotus leaf), 연자육(lotus seed), 연근(lotus root) 등의 부위에 따라 식용 및 약용으로 널리 사용되어 왔으며, 연꽃은 관상용과 차의 재료로 이용해 왔다. 아시아 지역에서는 잎으로 밥을 싸서 먹거나, 어린 잎 또는 어린 줄기를 다른 채소와 함께 샐러드나 피클로 만들어 먹기도 하며, 뿌리를 각종 요리의 재료로 다양하게 조리하여 스프(soup), 튀김 등으로 섭취해 왔다. 우리나라에서는 예전부터 반찬용으로 연근(땅속줄기)의 사용이 많았으며, 백련의 꽃과 잎을 건조시켜 연꽃차와 연잎차로 활용하며 당뇨병 및 간 기능 증진에 효과가 알려져 차(茶)로 음용하고 있다.
연잎은 nelumboside, nuciferine, coclaurine, roemerine 등과 같은 알칼로이드성분을 함유하고 있어 진정작용과 해열작용이 있으며, 당뇨 및 고지혈증에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 또한 gallic acid와 methyl gallate 등의 aromatic acid류 및 quercetin, isoquercitrin, hyperoside, rutin, kaempferol 등의 flavonoid류 등의 생리활성 성분을 함유하는 것으로 알려져 있다. 또한 주석산, 구연산, 사과산, 호박산, 탄닌 등의 성분에 대한 연구도 보고된 바 있다.
한편, 연잎의 일반성분 분석 결과에 의하면 연잎 분말은 수분함량 0-2.98%, 조지방 함량 0.93-1.0%, 조단백질 함량 16.9-23.9%, 조회분 함량 8.1-9.3%, 탄수화물 함량 63.8-65.2% 수준을 나타낸다고 보고되었다(Lee 등, 2008; Park 등, 2009; Park 등 2010). 즉, 당질(sugar) 성분은 건조된 연잎의 60% 이상으로 고함유되어 있는 주요한 성분이다. 그럼에도 불구하고 연잎의 당 성분의 효능에 대한 연구는 Zeng 등(2016)이 임신성 당뇨쥐에서 연잎 유래 셀레늄-다당체의 항당뇨 활성을 보였다고 보고하였을 뿐이다.
따라서, 골 관련 질환의 예방, 개선 및 치료할 수 있으며 부작용이 없는 천연물질로 제조된 조성물이 요구되고 있다.
대한민국 등록특허 제1854327호 대한민국 등록특허 제1700348호
본 발명의 목적은 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선 또는 예방할 수 있는 식품 조성물을 제공하는데 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 효소로 처리하지 않은 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 골 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 효소로 처리된 연잎을 이용한 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 60 내지 73 중량%, 산성 다당(uronic acid) 25 내지 35 중량%, KDO 유사 물질 0.1 내지 10 중량% 및 단백질 1.0 내지 3.0 중량%을 포함할 수 있다.
상기 중성 다당은 아라비오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose) 및 푸코스(fucose)를 포함할 수 있다.
상기 산성 다당은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것일 수 있다.
상기 KDO 유사 물질은 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)로 이루어진 것일 수 있다.
상기 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase) 및 펙티나아제(pectinase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 분자량이 8 KDa 이상의 다당이 함유된 것일 수 있다.
상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 (a) 연잎 분말에 효소를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 연잎 분말에서 다당 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것일 수 있다.
상기 골 관련 질환은 골다공증, 골관절염, 퇴행성 관절염, 무릎관절증, 고관절증, 전신 홍반루푸스(SLE), 척추관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장병성관절염, 류마티스 관절염, 신경병관절병증, 급성 류마티스 열, 통풍, 연골석회화증, 치조골 파괴에 의한 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수질환, 칼슘 수산화인회석 결정 침전 질환 및 라임 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
또한, 상기한 다른 목적을 달성하기 위한 본 발명의 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물은 효소로 처리하지 않은 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물은 효소로 처리된 연잎을 이용한 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유할 수 있다.
상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 60 내지 73 중량%, 산성 다당(uronic acid) 25 내지 35 중량%, KDO 유사 물질 0.1 내지 10 중량% 및 단백질 1.0 내지 3.0 중량%을 포함할 수 있다.
상기 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase) 및 펙티나아제(pectinase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 분자량이 8 KDa 이상의 다당이 함유된 것일 수 있다.
상기 골 관련 질환은 골다공증, 골관절염, 퇴행성 관절염, 무릎관절증, 고관절증, 전신 홍반루푸스(SLE), 척추관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장병성관절염, 류마티스 관절염, 신경병관절병증, 급성 류마티스 열, 통풍, 연골석회화증, 치조골 파괴에 의한 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수질환, 칼슘 수산화인회석 결정 침전 질환 및 라임 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 골 관련 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물은 파골세포 분화를 억제하고, 골밀도(BMD), 총부피(TV), 뼈부피(BV), 골소주 평균두께(Tb.Th), 단위길이 당 평균 개수(Tb.N)가 향상된다.
또한, 본 발명의 골 관련 질환의 예방, 개선 및 치료용 조성물은 골 관련 질환 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 독성이 없으므로 식품의 형태로 섭취할 수 있다.
도 1A는 본 발명의 대조군, 실시예 1 및 실시예 2의 파골세포 생존능 및 파골세포 분화 억제능을 나타낸 그래프이며, 도 1B는 본 발명의 대조군, 실시예 1 및 실시예 2의 파골세포 분화 억제능을 통계와 함께 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 대조군, 실시예 1 및 실시예 2에 의해 파골세포 분화를 억제하는 효과를 현미경으로 관찰한 이미지이다.
도 3은 1군 내지 4군으로 구분된 마우스의 대퇴골을 마이크로 컴퓨터단층촬영 시스템으로 촬영한 사진이다.
도 4A는 1군 내지 4군으로 구분된 마우스 대퇴골의 골체적(BV/TV)을 나타낸 그래프이고; 도 4B는 1군 내지 4군으로 구분된 마우스 대퇴골의 소주골 두께(Tb.Th)를 나타낸 그래프이며; 도 4C는 1군 내지 4군으로 구분된 마우스 대퇴골의 골밀도(BMD)를 나타낸 그래프이고; 도 4D는 1군 내지 4군으로 구분된 마우스 대퇴골의 소주골 개수(Tb.N)를 나타낸 그래프이다.
도 5A는 pullulan standard를 측정한 HPLC 그래프이며; 도 5B는 본 발명에서 대량 추출하여 제조된 실시예 1(LLEO)의 분자량 패턴을 측정한 HPLC 그래프이다.
본 발명은 효소로 처리하지 않은 연잎 유래 다당 분획물 또는 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유함으로써, 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 효소로 처리한 연잎으로부터 다당을 분획한 분획물이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 골 관련 질환에 의해 발생할 수 있는 질환을 개선, 예방 또는 치료할 수 있는 효소로 처리하지 않은 연잎 유래 다당 분획물 또는 효소처리 연잎 유래 다당 분획물의 원재료로 사용되는 연잎은 가능한 6월 초순부터 10월 중순에 채취하게 되는데 통상 연잎은 6월 초순에 나기 시작해서 10월 중순이 되면 연잎이 퇴색하기 때문에 가능한 그 전에 채취하여 사용하고, 크기는 지름 40 cm 정도의 반패모양과 유사하게 생겼다. 하엽(荷葉)이라 불리는 연잎은 주로 건조된 형태로써 사용되며 맛이 쓰고 성질은 유하며 예로부터 출혈성 위궤양이나 위염, 치질, 출혈, 설사, 두통과 어지럼증, 토혈, 산후 어혈치료, 야뇨증, 해독작용 등에 대한 민간치료제로 사용되어 왔다.
본 발명의 효소로 처리하지 않은 연잎 유래 다당 분획물은 연잎과 용매를 1 : 10-30의 중량비, 바람직하게는 1 : 15-25의 중량비로 혼합하여 80 내지 120 ℃에서 1 내지 10시간, 바람직하게는 3 내지 5시간 동안 추출한 후 원심분리한 다음 에탄올을 가하여 다당을 침전시킴으로써 수득된다. 상기 용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매를 들 수 있으며, 바람직하게는 물을 들 수 있다.
추출 시 연잎을 기준으로 용매의 함량이 상기 하한치 미만인 경우에는 유효성분이 추출되지 않을 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 재료비가 상승할 수 있다.
또한, 상기 추출 시 온도 및 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 유효성분이 적게 추출될 수 있으며, 상기 상한치 초과인 경우에는 독성물질이 발생할 수 있다.
또한, 본 발명의 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 (a) 연잎 분말에 효소를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 효소 처리된 연잎에서 다당 분획물을 수득하는 단계;를 포함하여 제조된다.
먼저, 상기 (a)단계에서는 연잎에 효소를 처리한다.
상기 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase) 및 펙티나아제(pectinase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 연잎 분말 중량 대비 1 내지 10 중량%로 첨가되며, 바람직하게는 1 내지 5 중량%로 첨가되고, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 중량%로 첨가될 수 있다.
본 발명에서 연잎은 건조되지 않은 것 또는 건조된 것을 사용할 수 있으며, 분쇄된 것 또는 분말화된 것을 사용할 수 있다. 바람직하게 효소를 처리하는 상기 연잎 분말은 증류수로 10배 내지 30배(w/v) 정도로 현탁하여 사용할 수 있다.
상기 효소 처리는 1 내지 5일 동안 처리하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 1 내지 3일 일 수 있다.
상기 (a) 단계는 효소 처리 후에 잔존 효소를 80 내지 110 ℃에서 10 내지 60분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 공정을 추가로 수행할 수 있다. 상기 가열로 인해 가용성 다당 성분의 용출을 증가시키며, 일부 불순물로 포함되어 있는 고분자 단백질을 변성 및 침전시킴으로써 원심분리에 의한 다당 추출물 획득 및 순도를 증진시킨다.
또한, 상기 (a) 단계는 효소 처리 전에 연잎 분말을 탈색하는 공정을 포함할 수 있다. 탈색하기 위한 용매로는 인체에 무해하여 그 사용이 허가된 탈색 용매라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 에탄올, 아황산칼륨, 아황산나트륨, 이산화황 및 과산화벤조로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 들 수 있으며, 바람직하게는 에탄올을 들 수 있다.
다음으로, 상기 (b)단계에서는 상기 효소처리된 연잎에서 원심분리, 용매분획 또는 여과 등의 방법으로 잔사를 제거하여 다당 추출물을 수득한 후 이를 분자량 8 KDa 이상의 고분자 다당 분획물을 회수한다.
상기 분획물을 수득하는 방법은 분자량을 기준으로 정제하는 방법이라면 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 한외여과, 용매분획 또는 겔 여과 크로마토그래피를 들 수 있고, 더욱 바람직하게는 한외여과를 들 수 있다. 또한, 최종 다당 분획물의 형태는 추출물, 농축물 또는 분말일 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 상기 효소로 처리하여 얻은 연잎 유래 분획물로서 상기와 같은 방법을 이용하여 상기 범위 미만의 저분자 분획물을 제거하여 고분자 다당 분획물을 수득하였다. 본 발명의 다당 분획물에는 소량의 저분자 분획물도 포함되어 있기는 하지만 8 KDa 이상의 고분자 다당 분획물이 95 중량% 이상으로 함유되어 있다.
또한, 상기 최종 다당 분획물에 50~100%의 탄소수 1 내지 4의 알코올을 첨가하여 저분자 물질 및 불순물을 제거하는 다당 정제 단계를 추가할 수 있다.
상기 수득된 효소처리 연잎 유래 다당 분획물의 주요성분 분석 및 HPAEC를 활용한 구성당 분석을 수행한 결과, 전체 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 60 내지 73 중량%, 산성 다당(uronic acid) 25 내지 35 중량%, KDO 유사 물질 0.1 내지 10 중량% 및 단백질 1.0 내지 3.0 중량%을 포함한다.
상기 중성 다당은 아라비오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose) 및 푸코스(fucose)를 포함하며, 상기 산성 다당은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진다.
또한, 상기 KDO 유사 물질은 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)로 이루어진다.
본 명세서에서 연잎을 언급하면서 사용되는 용어 '분획물'은 추출용매를 처리하여 얻은 분획물뿐만 아니라 효소처리 연잎으로부터 얻은 다당 분획물의 가공물도 포함한다. 예를 들어, 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 광의로는 연잎을 동물에게 투여할 수 있도록 제형화된 연잎 다당 가공물, 예컨대, 효소처리 연잎 다당 분말도 포함하는 의미를 갖는다. 비록 본 발명에서 효소처리 연잎 유래 다당 분획물로 실험을 진행하긴 하였으나, 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 가공물과 같은 형태로도 목적하는 효과를 달성할 수 있음은 당업자라면 예상가능할 것이다.
한편, 본 명세서에서 용어 '유효성분으로 함유하는'이란 효소처리 연잎 유래 다당 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다. 일예로, 상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 10 내지 1500 mg/kg, 바람직하게는 20 내지 500 mg/kg의 농도로 사용된다. 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 효소처리 연잎 유래 다당 분획물의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-10 g/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 알코올 음료류, 과자류, 다이어트바, 유제품, 육류, 초코렛, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류, 비타민 복합제, 건강보조식품류 등이 있다.
본 발명의 식품 조성물은 유효성분으로서 효소처리 연잎 유래 다당 분획물뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명은 상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 포함하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 건강기능식품이란, 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다. 이와 같이 하여 얻어지는 본 발명의 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 효소처리 연잎 유래 다당 분획물의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 환제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량% 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다. 한 구체예에서, 본 발명의 건강기능식품은 환제, 정제, 캡슐제 또는 음료의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명은 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 효소처리 연잎 유래 다당 분획물의 용도를 제공한다. 상기한 바와 같이 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 용도로 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포유동물에게 유효량의 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 투여하는 것을 포함하는 골 관련 질환의 개선, 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.
여기에서 사용된 용어 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 해당 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 유효량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 수 있다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 예방, 치료 또는 개선 방법에 있어서, 성인의 경우, 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 0.001 g/kg 내지 10 g/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 치료방법에서 효소처리 연잎 유래 다당 분획물을 유효 성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
실시예 1. 효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLEO)
연잎은 서울 경동시장(Korea)에서 구입하여 조분쇄 후 시료로 사용하였다.
건조 연잎분말(5 kg)에 20배(w/v)의 증류수를 가수한 후 pH를 4-5 수준으로 조정하여 현탁한 다음 pectinase(PlantaseMAXTM)를 건조 연잎분말 원료당 3 중량%로 첨가한 후 50 ℃ 순환 또는 교반반응기에서 3일간 효소 처리하였다. 그 후 상기 효소 처리 반응액을 85 ℃에서 30분간 가열처리하여 잔존 효소를 불활성화시킨 다음 상온에서 냉각하였다. 상기 효소 처리를 마친 상기 시료를 4 ℃에서 6,000Xg로 20분 동안 원심분리를 수행하여 잔사를 제거하고, 분리된 추출 상등액은 최종 농도가 75%가 되도록 cold ethanol을 가하여 4 ℃에서 하룻밤동안 정치하면서 다당을 침전시켰다. 이때 발생한 침전물은 15,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후 회수하여 소량의 증류수에 재용해하여 투석막(6,000-8,000 Da Molecular cut-off 투석막 사용한 투석)을 이용하여 3일간 투석함으로써 고분자 분획물을 회수한 다음 동결건조함으로써 효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLEO)을 얻었다.
실시예 2. 연잎 유래 다당 분획물(LLWO)_비효소처리(열수추출)
연잎 건조분말은 상기 실시예 1의 것과 동일한 것을 사용하였다. 상기 건조분말을 증류수(20배(w/v))에 현탁하여 90 ℃에서 4시간 동안 가열처리하여 열수 추출물을 수득하였다. 상기 열수 추출물을 4 ℃에서 6,000Xg으로 20분 동안 원심분리한 후 상등액을 분리한 후 최종 농도가 75%가 되도록 cold ethanol을 가하여 4 ℃에서 하룻밤동안 정치함으로써 다당을 침전시켰다. 상기 침전된 다당을 3일 동안 투석(분자량 cut-off : 6,000~8,000 Da) 후 동결건조시켜 열수추출 다당 분획물(LLWO)을 수득하였다.
<시험예>
시험예 1. 파골세포 실험
세포 배양
파골세포 분화에 대한 분획물의 효과를 알아보기 위하여, 골수세포 유래 대식세포를 수득하여 파골세포 전구세포로 사용하여 실시예 1 및 2에서 제조된 각 분획물의 처리 농도에 따른 파골세포 수와 TRAP 활성(Tartrate-resistant acid phosphatase)을 분석하였다. 마우스의 골수 세포를 대식세포증식자극인자(Macrophage Colony Stimulating Factor, M-CSF)(60 ng/㎖)와 10% FBS를 함유한 α-MEM 배지에 3일 동안 배양하여 골수세포 유래 대식세포(Bone Marrow Macrophage, BMM)를 수득하였으며, 이를 파골세포 전구세포로 사용하였다.
대조군으로는 시판되고 있는 다당제품인 Cold-FX로서, 상기 Cold-FX는 Panax quinquefolius(북미 인삼)의 뿌리에서 수성 방법으로 추출한 다당제품이다.
시험예 1-1. 파골세포 생존능 측정
상기 수득한 BMM을 M-CSF(60 ng/㎖)를 포함하는 배지에 2일 동안 실시예 1 및 2의 분획물을 다양한 농도(0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100, 300 ㎍/㎖)로 첨가하여 배양하였다. 세포 계수 키트-8(Cell counting Kit-8, CCK-8, Dojindo Inc.)을 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율(Cell viability, %)을 확인하였고, 데이터는 평균 표준오차로 나타내었다.
[수학식 1]
Figure pat00001
도 1A는 실시예 1, 실시예 2, 대조군의 파골세포 생존능 및 파골세포 분화 억제능을 나타낸 그래프이며, 도 1B는 실시예 1, 실시예 2, 대조군의 파골세포 분화 억제능을 도식화하여 나타낸 그래프이다.
도 1A 및 도 1B에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 분획물, 실시예 2의 분획물 및 대조군 모두 모든 농도에서 세포 생존율이 100% 이상으로 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
시험예 1-2. 파골세포 분화 억제 효능
파골세포는 골 흡수에 관여하는 세포이며, M-CSF와 RANKL은 파골세포 전구체의 증식과 분화, 생존 유지, 성숙한 파골세포의 세포 사멸과 같은 파골 세포 형성에 중요한 역할을 한다. 파골세포 분화에 있어서 2개의 필수 사이토카인, M-CSF 및 RANKL의 존재하에, 골수유래 대식세포(Bone marrow macrophage, BMM)를 포함하는 단구 대식세포 계통의 파골 세포 전구 세포가 분화되고 융합되어 TRAP- 양성 다핵 거대 세포를 형성하는 과정을 거쳐 파골세포로 분화되는 시스템을 활용하여 효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLE0)이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하였다.
상기 수득한 BMM 세포를 M-CSF(60 ng/) 및 RANKL(receptor activator of nuclear factor κB (NF-κB) ligand; R&D Systems Inc., MN, USA) (100 ng/㎖)를 함유하는 배지에 4일 동안 배양하였고, 같은 배양조건에서 BMM 세포에 다양한 농도의 효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLE0) 시료를 처리하였다. 세포를 10% 포르말린으로 10분, 그리고 에탄올/아세톤(1:1)으로 1분 동안 각각 고정한 후 Leukocyte Acid Phosphatase Kit 387-A (Sigma, MO, USA)을 사용하여 TRAP(tartrate resistant acid phosphate) 염색을 하였다. TRAP 활성 측정을 위해서 세포를 고정시킨 후, 50 mM citrate buffer(pH4.6, 10 mM sodium tartrate, 5 mM p-nitrophenylphosphate)와 1시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 새로운 plate에 효소 믹스처를 옮긴 후 동일한 양의 0.1 N NaOH와 섞고 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이 결과는 도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 다당 분획물은 파골세포 분화 50% 억제 효능을 보이는 농도인 IC50 경우 13.15 ㎍/mL 수준으로 나타나 매우 우수한 파골세포 억제 약리 효능을 나타내는 것을 확인하였다. 이때 대조군의 IC50 농도는 116.1 ㎍/mL 수준이며, 실시예 2의 IC50 농도는 29.92 ㎍/mL 수준인 것을 확인하였다. 이때, 3.0 ㎍/mL 이상의 농도에서 파골세포 분화 억제 효능은 실시예 1에서 실시예 2와 대조군보다 유의적으로 높았다(실시예 1 > 실시예 2 > 대조군) (도 1B).
또한, 도 2에 도시된 바와 같이 파골세포 분화를 억제하는 효과를 현미경으로 관찰한 결과에서도 실시예 1의 3.0 ㎍/mL 이상의 농도에서 두드러지게 파골세포 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 이때 실시예 2의 경우 30 ㎍/mL 이상의 농도에서, 대조군의 경우 100 ㎍/mL 이상의 농도에서 두드러진 파골세포 분화 억제 효과를 보였다.
시험예 2. 동물실험
실험동물
28 내지 30 g의 12주된 암컷 Crl:CD1(ICR) 마우스(Orient Bio Inc., Seoul, Korea)를 실험에 사용하였다. 실험 전 마우스는 7일간의 순화과정을 거쳐 실험에 사용하였으며, 순화과정 동안 22±1 ℃ 온도 및 55±10% 습도가 조절된 사육실에서 자유식이로 사육하였으며, 명암 주기는 12시간 주기로 조절하였다. 그 후 sham-operate(Sham, n=10) 또는 난소 절제술(OVX, n=50)을 실시하였다. 동물실험은 한국한의학연구원 동물실험운영규정에 준하여 취급하였다.
상기 난소 절제(OVX) 마우스는 수술 일주일 후 각 10마리씩 나누고, 7주 동안 실시예 1 및 실시예 2의 분획물을 두 농도(30 mg/kg 및 100 mg/kg)로 경구 투여하였다. 이때 시험군은 난소적출된 양성대조군(OVX)과 난소적출을 하지 않은 음성대조군(Sham)을 설정하였고, 실시예 1 및 실시예 2의 분획물은 증류수에 희석하여 30 mg/kg/day 및 100 mg/kg/day 농도로 매일 주간 경구 투여하였다.
-4개 군의 마우스-
1군(Sham, 대조군): 다당 분획물 대신 식수 투여
2군(OVX): OVX 후 다당 분획물 대신 식수 투여
3군(LLEO 30): OVX 후 효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLEO) 30 mg/kg/day 투여
4군(LLEO 100): OVX 후 효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLEO) 100 mg/kg/day 투여
시험예 2-1. Mitro -computed tomography (Micro-CT) 분석
Micro-CT를 활용한 골밀도 및 골 구조의 형태학적 관찰은 항 골다공증 제제의 개발에 유용한 정보를 제공할 수 있다. 다양한 골다공증 동물 모델에서 형태학적 변화가 해면골 및 피질골에서 발생하는 것으로 잘 알려져 있다. 본 연구에서는 실시예 1 분획물의 골다공증 효과를 확인하기 위해 micro-CT를 활용한 골밀도 및 골 구조의 형태학적 관찰을 수행하였다.
3D 골격 구조 분석을 위하여 마이크로 컴퓨터단층촬영 시스템(Quantum GX, PerkinElmer, USA)으로 촬영하였다. X-ray 촬영조건은 90 kV, 88 ㎂, 10 mm 시야각범위(복셀사이즈 90 ㎛; 스캔타임 14분)로 설정하였다. 컴퓨터단층촬영 3차원 이미지는 Quantum GX의 내장 소프트웨어인 3D Viewer로 최대 해상도 4.5 ㎛로 이미지화하였다. 마우스 소주골의 미세구조 분석은 Analyze 12.0 분석프로그램(AnalyzeDirect, Overland Park, KS, USA)을 이용하여 분석하였으며; 마우스 대퇴골의 골밀도는 hydroxyapatite(HA) 팬텀(QRM-MicroCT-HA, Quality Assurance in Radiology and Medicine GmbH, Germany)을 사용하여 측정하였다. 또한, 골밀도(BMD), 총부피(TV), 뼈부피(BV), 뼈표면적(BS), 골표면적비(BS/TV), 골소주 평균두께(Tb.Th), 단위길이 당 평균 개수(Tb.N) 등의 구조적 파라미터를 관심영역 안에서 측정하였다.
모든 실험결과는 평균 ± 표준오차로 나타내었으며, 대퇴골에서 스캐너 영역은 초기의 해면상의 proximal tip으로부터 약 1.4 mm 확장한 말초 골간단에 한정하였으며, 그룹간 비교는 Duncan 분석으로 수행하였다.
도 3은 1군 내지 4군으로 구분된 마우스의 대퇴골을 마이크로 컴퓨터단층촬영 시스템으로 촬영한 사진이다.
도 3에 도시된 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLEO)을 저농도(LLEO 30) 및 고농도(LLEO 100)로 처리한 군은 마우스 대퇴골의 골밀도가 다른 군에 비하여 우수한 것을 확인하였다.
도 4A는 1군 내지 4군으로 구분된 마우스 대퇴골의 골체적(BV/TV)을 나타낸 그래프이고; 도 4B는 1군 내지 4군으로 구분된 마우스 대퇴골의 소주골 두께(Tb.Th)를 나타낸 그래프이며; 도 4C는 1군 내지 4군으로 구분된 마우스 대퇴골의 골밀도(BMD)를 나타낸 그래프이고; 도 4D는 1군 내지 4군으로 구분된 마우스 대퇴골의 소주골 개수(Tb.N)를 나타낸 그래프이다.
도 4에 도시된 바와 같이, Sham 군에 비하여 OVX군은 골 체적(percent bone volume, BV/TV), 소주골 두께(Trabecular Thinckness, Tb.Th), 소주골 개수(Trabecular number, Tb.N) 및 골밀도(bone mineral density, BMD)가 모두 감소한 것을 확인하였다.
이와 같이 난소적출 후 유발된 골 손실은 실시예 1에 따라 제조된 효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLEO)을 저농도(LLEO 30) 및 고농도(LLEO 100)로 처리 시 골 체적, 소주골 두께, 소주골 개수 및 골밀도에서 모두 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 난소적출 후 Sham 군에 비해 감소된 골밀도에 있어서도 효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLEO)을 경구 투여 시 저농도(LLEO 30) 및 고농도(LLEO 100)에서 모두 정상군인 sham 그룹보다 더 우수한 수준의 골밀도를 유지할 수 있는 것을 확인하였다.
시험예 3. 효소처리 연잎 유래 다당 분획물의 특성 규명
3.1 분자량 측정
효소처리 연잎 유래 다당 분획물(LLE0)의 분자량 측정은 HPLC-RI를 이용하여 수행하였다. LLE0 시료를 20 mg/mL의 농도로 증류수에 희석하여 0.45 ㎛ membrane filter(Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Tokyo, Japan)를 통해 여과한 후, 50 mM 포름산 암모늄(ammonium formate) (pH 5.5)으로 평형화된 Asahi-Pak GS-520+GS-320 packed column(각각 0.76 X 30 cm, Showa denco Co., Tokyo, Japan)이 장착된 고속액체크로마토그래피(HPLC)(Agilent Technologies Co., Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
분자량 측정은 표준물질 pullulan series(0.342, 1.32, 6, 10, 21.7, 48.8, 113, 366, 805 K)를 이용하여 retention time을 구한 후, 각 분자량에 대한 Kav값을 산출하여 작성한 표준곡선으로부터 환산하여 결정하였다.
도 5A는 pullulan standard를 측정한 HPLC 그래프이며; 도 5B는 실시예 1에 따라 제조된 다당 분획물(LLE0)을 측정한 HPLC 그래프이다.
도 5에 도시된 바와 같이, 실시예 1에 따라 제조된 다당 분획물(LLEO)은 46.32 kDa 및 15.43 kDa의 평균분자량을 보이는 다당분획을 주요로 함유하고 있는 것을 확인하였다.
3.2 성분 및 구성당 분석
중성당 함량은 글루코스(glucose)를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid법(Dubois 등, 1956)으로, 산성당 함량은 갈락투론산(galacturonic acid)을 표준물질로 하여 m-하이드록시비페닐(m-hydroxybiphenyl)법(Blumenkrantz & Asboe-Hansen, 1973)으로, 단백질 함량은 표준물질로 소혈청알부민(bovine serum albumin)을 사용하여 Bradford법(Bradford MM, 1976)으로, TBA-positive material의 함량은 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid(KDO)를 표준물질로하여 thiobarbituric acid 비색정량법(Karkhanis 등, 1978)을 실험실 여건에 맞게 변형하여 사용하였다.
또한, 구성당 분석은 산가수분해 전처리 방법을 진행한 후 전류도 검출기가 장착된 HPAEC(High Performance Anion-Exchange Chromatography, ICS-5000, Dionex co., USA)를 사용하여 분석하였다. 고정상으로는 CarboPac PA-1(250 x 4 mm, Dionex co., USA)을 컬럼으로 사용하였고, 이동상은 18 mM 수산화나트륨(NaOH) 용액을 사용하였다. 이때 flow rate은 1.0 mL/min, 컬럼온도는 25 ℃로 설정하였다. 한편, galacturonic acid 및 glucuronic acid을 위한 분석의 경우 기기조건 및 컬럼 조건은 동일하며, 이동상은 100 mM NaOH에 100 mM NaOAc를 포함하는 용매조건에서 분석하였다.
구분 실시예 1
(LLE0)
Chemical composition (%)
Neutral sugar 63.4±4.38
Uronic acid 32.2±4.74
Protein 2.20±0.13
KDO-liked material 2.21±0.32
Component sugar (mol%)
Fucose 2.07±0.26
Rhamnose 9.78±1.08
Arabinose 16.10±2.06
Galactose 30.40±3.00
Glucose 5.94±1.21
Mannose 3.27±0.27
Xylose 2.01±0.24
Galacturonic acid 26.04±1.41
Glucoronic acid 4.39±0.27
위 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 실시예 1에 따라 제조된 다당 분획물(LLEO)은 중성당, 산성당, 단백질 및 KDO의 함량이 각각 63.4%, 32.2%, 2.20%, 2.21%의 수준을 나타내었다. 구성당 성분 분석 결과 galactose (30.40 mol%), galacturonic acid (26.04 mol%), arabinose (16.10 mol%), rhamnose (9.78 mol%)를 주요로 함유하고 있으며, 소량의 xylose를 포함하고 있어 pectin류 RG- 및 RG-의 존재 가능성을 강하게 추론해 볼 수 있다.
하기에 본 발명의 분말을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
실시예 1에서 얻은 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 500 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
실시예 1에서 얻은 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 300 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
실시예 1에서 얻은 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 200 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 1에서 얻은 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 600 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO4 ,12H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
실시예 1에서 얻은 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 4 g
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100g으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 과립제의 제조
실시예 1에서 얻은 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 1,000 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2
비타민 C 10 mg
비오틴 10
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 과립제에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 과립제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 기능성 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 효소처리 연잎 유래 다당 분획물 1,000 mg
구연산 1,000 mg
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 mL
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (17)

  1. 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 연잎 유래 다당 분획물은 효소로 처리된 연잎을 이용한 효소처리 연잎 유래 다당 분획물인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 연잎 유래 다당 분획물은 연잎을 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제2항에 있어서, 상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 60 내지 73 중량%, 산성 다당(uronic acid) 25 내지 35 중량%, KDO 유사 물질 0.1 내지 10 중량% 및 단백질 1.0 내지 3.0 중량%을 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 중성 다당은 아라비오스(arabinose), 람노오스(rhamnose), 갈락토오스(galactose), 자일로스(xylose), 글루코스(glucose), 만노스(mannose) 및 푸코스(fucose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 산성 다당은 갈락투로닉산(galacturonic acid) 및 글루쿠로닉산(glucuronic acid)으로 이루어진 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 KDO 유사 물질은 DHA(3-deoxy-D-lyxo-2-heptulosaric acid) 및 KDO(3-deoxy-D-manno-2-octulosonic acid)로 이루어진 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제2항에 있어서, 상기 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase) 및 펙티나아제(pectinase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 분자량이 8 KDa 이상의 다당이 함유된 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  10. 제2항에 있어서, 상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 (a) 연잎 분말에 효소를 처리하는 단계; 및
    (b) 상기 효소 처리된 연잎 분말에서 분획물을 수득하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 골 관련 질환은 골다공증, 골관절염, 퇴행성 관절염, 무릎관절증, 고관절증, 전신 홍반루푸스(SLE), 척추관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장병성관절염, 류마티스 관절염, 신경병관절병증, 급성 류마티스 열, 통풍, 연골석회화증, 치조골 파괴에 의한 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수질환, 칼슘 수산화인회석 결정 침전 질환 및 라임 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  12. 연잎 유래 다당 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 연잎 유래 다당 분획물은 효소로 처리된 연잎을 이용한 효소처리 연잎 유래 다당 분획물인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 전체 다당 분획물 대비 중성 다당(neutral sugar) 60 내지 73 중량%, 산성 다당(uronic acid) 25 내지 35 중량%, KDO 유사 물질 0.1 내지 10 중량% 및 단백질 1.0 내지 3.0 중량%을 포함하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase) 및 펙티나아제(pectinase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 효소처리 연잎 유래 다당 분획물은 분자량이 8 KDa 이상의 다당이 함유된 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  17. 제12항에 있어서, 상기 골 관련 질환은 골다공증, 골관절염, 퇴행성 관절염, 무릎관절증, 고관절증, 전신 홍반루푸스(SLE), 척추관절염, 류마티스성 다발성 근육통, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장병성관절염, 류마티스 관절염, 신경병관절병증, 급성 류마티스 열, 통풍, 연골석회화증, 치조골 파괴에 의한 치주질환, 염증성 치조골 흡수질환, 염증성 뼈 흡수질환, 칼슘 수산화인회석 결정 침전 질환 및 라임 질환으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 골 관련 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
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