KR20210043519A - 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 및 그 제조방법 - Google Patents
장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물의 제조방법에 있어서, (a) MRS 액체 배지에 유산균을 접종하고 배양하는 전배양 단계; (b) 혼합배지에 전배양액을 접종하고 배양하는 본배양 단계; (c) 본배양액을 원심분리하여 유산균을 획득하는 단계; (d) 원심분리된 유산균을 막분리하는 단계; (e) 막분리된 유산균에 동결부형제를 혼합하는 단계; (f) 혼합물을 동결건조시키는 단계 및 (g) 동결건조된 혼합물을 분쇄하여 분말화하는 단계를 포함하는 면역력 향상 기능성 첨가물 제조방법을 제공할 수 있다.
이에 따라 제조된 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물을 제공할 수 있다.
이에 따라 제조된 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물을 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 섭취 및 영양장애 없이 장내세균총에 유익한 유산균을 증가시키고, 장내 안착능이 우수한 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)를 활용하여 장내 세균총을 유익하게 조성하여 면역력을 향상 시키는 기능성 첨가물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스는 숙주의 장내 미생물 균형을 유지시킴으로써 유익한 작용을 하는 살아있는 미생물로 Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus와 같은 유산균이 많이 사용되고 있다.
이들 유산균은 장내 세균총의 안정화, 유해세균의 정착억제에 따른 부패산물 생성 감소 및 질병예방, 면역활성화 작용, 항암작용, 콜레스테롤 저하, 유당불내증의 경감, 변비억제 등의 다양한 효과를 가진다고 알려져 있다.
상기와 같은 유산균의 장내환경 개선에 따른 다양한 질병억제 등 효과로, 최근 다양한 식품업체에서 유산균을 직접 첨가한 제품 개발이 이루어지고 있으며, 한국식품연구원에서는 유산균을 다양한 식품의 원료로 첨가하기 위해 초미립자 열처리를 통해 가공하는 유산균의 상용화 단계까지 연구가 진행되었다.
이처럼, 다양한 기능성을 보유한 유산균이 식품원료로 활용된다면, 국민건강 및 삶의 질 증진에 기여할 수 있는 새로운 유형의 기능성 식품 시장을 개척할 수 있을 것으로 기대된다.
하지만, 유산균은 고유의 염도, 색도, 풍미를 가지고 있어 식품 첨가물로서 식품에 직접 사용하기가 우려되는 단점이 있어, 아직은 제조공정에서의 개선이 필요하다.
또한, 프로바이오틱스는 일반적으로 발효, 정제, 보관, 섭취 단계를 거쳐 인체 내에 들어오게 되는데, 산도, 산소, 열 등 주변 환경에 매우 민감하기 때문에 안정성이 보장된 유산균제제는 프로바이오틱스 제품 상용화에 있어 매우 중요한 요소이다.
따라서, 장내 유익균 정착에 도움을 주며 장내개선 효과가 우수하고, 안정성이 보장되며, 고유의 염도, 색도 및 풍미가 없어 자유롭게 식품 첨가물로 사용할 수 있는 유산균 제제의 개발이 필요한 실정이다.
상기와 같은 문제를 해결하고자, 본 발명은 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)를 활용하여 장내 세균총에 유익한 효능을 가지고 면역력 향상 기능을 나타내며, 유산균 고유의 염도, 색도 및 풍미가 제거된 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 및 그 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 실시예에 따른 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 제조방법은, 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물의 제조방법에 있어서, (a) MRS 액체 배지에 유산균을 접종하고 배양하는 전배양 단계; (b) 혼합배지에 전배양액을 접종하고 배양하는 본배양 단계; (c) 본배양액을 원심분리하여 유산균을 획득하는 단계; (d) 원심분리된 유산균을 막분리하는 단계; (e) 막분리된 유산균에 동결부형제를 혼합하는 단계; (f) 혼합물을 동결건조시키는 단계 및 (g) 동결건조된 혼합물을 분쇄하여 분말화하는 단계를 포함하는 면역력 향상 기능성 첨가물 제조방법을 제공할 수 있다.
여기서, 상기 유산균은 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (a) 단계는 상기 MRS 액체 배지에 유산균 1 내지 2%를 접종한 후 30 내지 37℃에서 23 내지 25시간 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 혼합배지는 글루코스, 효모 추출액, 카세인, 초산 나트륨, 인산 암모늄, 시트르산 칼륨, 황산 마그네슘, 황산 망간, 비이온 계면활성제 및 정제수를 포함할 수 있다.
또한, 상기 혼합배지는 상기 글루코스 1.5 내지 3.5중량%, 효모 추출액 1.5 내지 3.5중량%, 카세인 0.3 내지 0.7중량%, 초산 나트륨 0.3 내지 0.7중량%, 인산 암모늄 0.05 내지 0.25중량%, 시트르산 칼륨 0.15 내지 0.35중량%, 황산 마그네슘 0.01 내지 0.03중량%, 황산 망간 0.005 내지 0.015중량%, 비이온 계면활성제 0.01 내지 0.03중량% 및 정제수 92.45 내지 94.45중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 (b) 단계는 상기 혼합배지에 전배양액 2 내지 3%를 접종하고 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 동결부형제는 탈지분유, 트레할로오스, 말토덱스트린 및 정제수를 포함할 수 있다.
또한, 상기 동결부형제는 상기 탈지분유 12 내지 16중량%, 트레할로오스 5 내지 10중량%, 말토덱스트린 1 내지 3중량% 및 정제수 70 내지 80중량%를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 제조방법을 통해 제조된 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물을 제공할 수 있다.
상기와 같은 본 발명의 실시예에 따른 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 및 그 제조방법은 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)를 활용하여 장내 세균총에 유익한 효능을 가지고 장내환경이 개선되어 면역력 향상 기능을 나타낼 수 있다.
또한, 제조방법을 통해 유산균 고유의 염도, 색도 및 풍미가 제거되어 자유롭게 식품 첨가물로 사용할 수 있다.
또한, 동결건조를 통해 분말화하여 생존율을 확보하여 안정성이 보장될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 제조방법을 개략적으로 도시한 흐름도.
도 2는 CTL(정상대조군), POS(비교예) 및 KCTC18679P(실시예)를 4주간 투여한 후 장내 안착능을 확인한 SEM 사진.
도 2는 CTL(정상대조군), POS(비교예) 및 KCTC18679P(실시예)를 4주간 투여한 후 장내 안착능을 확인한 SEM 사진.
이하, 도면을 참조한 본 발명의 설명은 특정한 실시 형태에 대해 한정되지 않으며, 다양한 변환을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있다. 또한, 이하에서 설명하는 내용은 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
이하의 설명에서 제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용되는 용어로서, 그 자체에 의미가 한정되지 아니하며, 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다.
본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 동일한 참조번호는 동일한 구성요소를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 또한, 이하에서 기재되는 "포함하다", "구비하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것으로 해석되어야 하며, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "조성물"은 특정 성분을 포함하는 산물뿐만 아니라, 특정 성분의 배합에 의해 직접 또는 간접적으로 만들어지는 임의의 산물을 포함하는 것으로 간주된다.
이하, 본 발명의 실시 예를 첨부한 도 1 및 도 2를 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 제조방법을 개략적으로 도시한 흐름도이다.
본 발명은 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용하여 탈염, 탈색, 탈취 공정으로 면역력 향상 기능성 첨가물을 제조함으로써, 장내 세균총에 유익한 효능을 가지고 면역력 향상 기능을 나타내며 식품 첨가물로써 활용도가 향상된 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 및 그 제조방법을 제공할 수 있다.
여기서 유산균은 장내 세균총 및 안정성에 유익한 효능을 가지며 장내 안착능이 우수한 것으로, 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)가 바람직하다.
락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)는 갈색거저리 유충의 장으로부터 분리 및 동정한 신규한 균주로, 내산성, 내담즙성 및 프로테아제 효소활성이 우수하고, 장내 유산균은 향상시키고 대장균은 감소시켜 장내 세균총에 유익한 효능을 가지며 장내 안착능이 우수하다.
이와 같은 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)를 사용함으로써, 본 발명의 첨가물은 면역력 향상 기능을 가질 수 있다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 제조방법은 전배양 단계(S10), 본배양 단계(S20), 원심분리하여 유산균을 획득하는 단계(S30), 유산균을 막분리하는 단계(S40), 유산균에 동결부형제를 혼합하는 단계(S50), 동결건조시키는 단계(S60) 및 분말화하는 단계(S70)을 포함할 수 있다.
먼저, 전배양 단계(S10)는 MRS 액체 배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 유산균을 접종하고 배양하는 단계로, MRS 액체 배지에 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P) 1 내지 2%를 접종한 후 30 내지 37℃에서 23 내지 25시간 배양할 수 있으며, MRS 액체 배지에 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P) 1중량%를 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하는 것이 바람직하다.
이때, 배양 시 배양온도 범위를 벗어날 경우 유산균의 번식력이 급격히 약해질 수 있어 상기 범위의 온도로 배양되는 것이 바람직하며, 23시간 미만 배양될 경우 충분히 배양이 이루어지지 않을 수 있고 25시간을 초과할 경우 비효율적이다.
본배양 단계(S20)는 혼합배지에 S10 단계에서 배양된 전배양액을 접종하고 배양하는 단계로, 혼합배지를 이용하여 유산균의 활성을 촉진시켜 유산균을 대량 발효시킬 수 있다.
여기서 혼합배지는 글루코스, 효모 추출액, 카세인, 초산 나트륨, 인산 암모늄, 시트르산 칼륨, 황산 마그네슘, 황산 망간, 비이온 계면활성제 및 정제수를 포함할 수 있다.
글루코스, 효모 추출액은 유산균의 먹이가 되어 유산균의 발효가 이루어질 수 있고 카세인, 초산 나트륨, 인산 암모늄, 시트르산 칼륨, 황산 마그네슘, 황산 망간은 촉매제 역할로 유산균의 발효를 촉진시킬 수 있다.
구체적으로, 혼합배지는 글루코스 1.5 내지 3.5중량%, 효모 추출액 1.5 내지 3.5중량%, 카세인 0.3 내지 0.7중량%, 초산 나트륨 0.3 내지 0.7중량%, 인산 암모늄 0.05 내지 0.25중량%, 시트르산 칼륨 0.15 내지 0.35중량%, 황산 마그네슘 0.01 내지 0.03중량%, 황산 망간 0.005 내지 0.015중량%, 비이온 계면활성제 0.01 내지 0.03중량% 및 정제수 92.45 내지 94.45중량%를 포함할 수 있으며, 글루코스 2.50중량%, 효모 추출액 2.50중량%, 카세인 0.50중량%, 초산 나트륨 0.50중량%, 인산 암모늄 0.15중량%, 시트르산 칼륨 0.25중량%, 황산 마그네슘 0.02중량%, 황산 망간 0.01중량%, 비이온 계면활성제 0.02중량% 및 정제수 93.45중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
이때, 각 조성물의 함량이 상기 범위를 벗어날 경우 제 역할을 제대로 하지 못하여 발효 향상 효과가 미미하고 발효 효율이 저하될 수 있다.
또한, S20 단계는 혼합배지에 전배양액 2 내지 3%를 접종한 후 30 내지 37℃에서 8 내지 10 시간 배양할 수 있으며, 혼합배지에 전배양액 2.5%를 접종한 후 37℃에서 8 시간 배양하는 것이 바람직하다.
이 경우에도 배양 시 배양온도 범위를 벗어날 경우 유산균의 번식력이 급격히 약해질 수 있어 상기 범위의 온도로 배양되는 것이 바람직하고, 8시간 미만 배양될 경우 충분히 배양이 이루어지지 않을 수 있고 10시간을 초과할 경우 비효율적이다.
원심분리하여 유산균을 획득하는 단계(S30)는 S20단계에서 배양된 본배양액을 원심분리하여 유산균을 획득하는 단계로, 원심분리를 통해 본배양액에서 유산균을 포함하는 침전물을 회수할 수 있다.
유산균을 막분리하는 단계(S40)은 S30 단계에서 원심분리를 통해 회수된 유산균을 막분리하는 단계로, 막분리 공정을 통해 유산균을 포함하는 침전물에서 사이즈가 큰 것을 걸러내어 최종적인 유산균을 얻을 수 있다. 이에 색도를 흰색에 가깝게 하여 얻어지는 첨가물의 색을 제거할 수 있다.
또한, 상기 S40 단계를 통해 탈염, 탈취되어 유산균이 가지는 고유의 염도 및 풍미가 제거될 수 있다.
유산균에 동결부형제를 혼합하는 단계(S50)는 S40 단계에서 막분리된 유산균에 동결부형제를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계로, 동결부형제는 유산균에 첨가되어 S60 단계에서 유산균을 동결건조하는데 있어 유산균을 보호하여 생존율이 최대한 향상되도록 할 수 있다.
이러한 동결부형제는 탈지분유(skim milk), 트레할로오스(trehalose), 말토덱스트린(maltodextrin) 및 정제수를 포함할 수 있다.
탈지분유는 유산균 동결건조시 유산균을 효과적으로 보호하여 생존율을 확보할 수 있도록 하는 것으로, 12 내지 16중량%를 포함할 수 있으며, 14.89중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
이때, 탈지분유가 12중량% 미만일 경우 유산균 보호 효과가 미미하고, 16중량%를 초과할 경우 중량 대비 효과는 낮고 원가상승에 따라 비경제적이다.
트레할로오스 및 말토덱스트린도 급냉시 유산균을 보호하는 것으로, 각각 5 내지 10중량% 및 1 내지 3중량%를 포함할 수 있으며, 8.51중량% 및 2.13중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
이때, 트레할로오스 및 말토덱스트린이 각각 상기 범위를 벗어날 경우 급냉시 유산균 보호 효과가 저하될 수 있다.
정제수는 유산균과 동결부형제의 혼합이 용이하게 이루어지도록 하며, 70 내지 80중량%를 포함할 수 있고 74.47중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
이때, 정제수가 70중량% 미만일 경우 각 조성물의 혼합이 저하되며, 80중량%를 초과할 경우 동결건조시 공정시간이 길어질 수 있다.
즉, 동결부형제는 탈지분유 12 내지 16중량%, 트레할로오스 5 내지 10중량%, 말토덱스트린 1 내지 3중량% 및 정제수 70 내지 80중량%를 포함할 수 있고, 탈지분유 14.89중량%, 트레할로오스 8.51중량%, 말토덱스트린 2.13중량% 및 정제수 74.47중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
이와 같은 동결부형제를 S60 단계 전에 유산균 100중량%에 10 내지 20중량%를 혼합함으로써, 유산균의 생존율을 확보할 수 있다.
이때, 동결부형제 함량이 유산균 대비 10중량% 미만일 경우 유산균 보호 효과가 저하되어 생존율이 저하될 수 있으며, 20중량%를 초과할 경우 첨가물의 염도가 높아지고, 색, 맛 등이 나타날 수 있다.
동결건조시키는 단계(S60)는 S50 단계에서 유산균과 동결부형제가 혼합된 혼합물을 동결건조시킬 수 있다.
분말화하는 단계(S70)는 S60 단계에서 동결건조된 혼합물을 분쇄하는 단계로, 분쇄하여 분말형태의 유산균 제제인 면역력 향상 기능성 첨가물을 최종적으로 제조할 수 있다.
이와 같이 유산균을 동결건조시키고 분말화함으로써, 유산균의 생존율 및 생존수가 확보되어 장기보존이 가능하고 유통 과정에서 보관이 편리할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 제조방법은 S50 단계 후에, 혼합물에 보조조절제를 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다.
혼합물에 보조조절제를 혼합하는 단계는 혼합물에 보조조절제 2 내지 4중량%를 혼합하는 단계로, 혼합물에 보조조절제를 혼합하여 제조되는 첨가물의 염도 및 산도를 더 낮춰줄 수 있다. 이에 첨가물이 섭취하기에 인체에 적합한 상태로도 될 수 있다.
이때, 보조조절제가 2중량% 미만일 경우 염도 및 산도 저하효과가 미미하고, 4중량%를 초과할 경우 오히려 나타내고자 하는 바람직한 효과를 나타낼 수 없다.
보조조절제는 정제수, 락티톨, 쌀눈, 초산나트륨, 염화칼륨 및 탄산칼륨을 포함할 수 있다.
구체적으로, 보조조절제는 정제수 60 내지 73중량%, 락티톨 12 내지 18중량%, 쌀눈 5 내지 10중량%, 초산나트륨 1.5 내지 3중량%, 염화칼륨 2.5 내지 8중량% 및 탄산칼륨 6 내지 12중량%를 포함할 수 있고, 정제수 70중량%, 락티톨 10중량%, 쌀눈 10중량%, 초산나트륨 1 중량%, 염화칼륨 2 중량% 및 탄산칼륨 7중량%를 포함하는 것이 바람직하다.
이때 보조조절제의 각 조성물이 상기 범위를 벗어날 경우 염도 및 산도 제거 효과가 바람직하게 나타나지 못할 수 있다.
상기와 같은 제조방법을 통해 본 발명의 실시예에 따른 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물을 제조할 수 있다.
이러한 면역력 향상 기능성 첨가물은 고유의 염도, 색도 및 풍미가 제거되어 한정되지 않고 자유롭게 식품에 첨가될 수 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 실시예에 따른 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물 및 그 제조방법은 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)를 활용하여 장내 세균총에 유익한 효능을 가지고 장내환경이 개선되어 면역력 향상 기능을 나타낼 수 있다.
또한, 제조방법을 통해 유산균 고유의 염도, 색도 및 풍미가 제거되어 자유롭게 식품 첨가물로 사용할 수 있다.
또한, 동결건조를 통해 분말화하여 생존율을 확보하여 안정성이 보장될 수 있다.
이하, 본 발명의 유산균 선발, 흑삼 유산균 발효 조성물, 그 제조방법에 대하여 실시예, 비교예, 실험예를 통해 구체적으로 설명한다.
이하, 실시되는 실험 예들은 이해를 돕기 위하여 제시되는 것으로서, 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 하기 실험 예들에 한정되는 것은 아니다.
[실험예 1] 유산균 평가
상기 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)를 평가하기 위해, 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)를 MRS 액체 배지에 1% 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하여 하기와 같이 실험하였다.
생후 7주된 specific pathogen free(SPF) male BALB/c 마우스(샘타코, 한국)를 구입하여 온도 22±2℃, 습도 50±5℃, 12시간 간격으로 주야간이 조절된 마우스 방에서 멸균된 물과 사료를 자유 급이하며 7일간 순화시켰다. Cage 당 5마리의 마우스를 사육하였다. 모든 마우스시험은 생후 8주부터 시작하여, 4주간 경구 투여로 진행하였다.
동일 시간에 시판용 프로바이오틱스(듀오락골드), 유산균을 100㎕씩 경구 투여하였다. 실험군은 하기 표 1과 같다.
실험기간 동안 주 1회씩 체중, 음수, 식이 측정을 실시하였다.
모든 동물실험은 실험동물에 관한 법률에 의하여 동물실험의 윤리성, 안전성 및 신뢰성을 확보하고 실험동물 윤리위원회의 윤리적 기준에 의거하여 시행하였다.
1) 동물의 체중변화, 사료섭취량 및 음수섭취량
매주 체중변화, 사료섭취량, 음수섭취량을 확인한 결과는 표 2와 같다.
표 2를 보면 알 수 있듯이, 모든 군에서 유의적인 차이가 확인되지 않았다.
2) 장내 총세균, 유산균 및 대장균 측정
장내 일반세균 및 유산균을 확인하기 위해, 실험 최종일에 모든 실험동물의 소장 이후 부분부터 대장까지 부위의 양쪽을 결찰 한 다음 적출하였다. 그다음 일부를 먼저 10배의 PBS로 장기를 수세하고 장내 일반세균 및 유산균을 확인하였고, 나머지는 2주 후 장내 미생물의 생존능을 확인하기 위해 동일하게 수세하여 장내 일반세균 및 유산균을 확인하였다. 그 결과는 하기 표 3과 4와 같다.
표 3을 보면 알 수 있듯이, KCTC18679P(실시예)를 투여한 결과 POS(비교예)보다 총세균수가 감소된 것을 확인할 수 있었고, 유산균은 POS(비교예)보다 다소 수가 적었으나 CTL(정상대조군)보다 유산균이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 여기서, 대장균은 유의적 차이를 보이지 않았다.
또한, 상기 표 4를 보면 알 수 있듯이, 2주 후에는 KCTC18679P(실시예)를 투여한 결과 CTL(정상대조군) 및 POS(비교예)보다 총 세균 수가 감소된 것을 확인할 수 있었고, CTL(정상대조군) 및 POS(비교예)보다 유산균 수가 높고 2주전보다 오히려 유산균수가 증가하여 유산균의 생존능이 높은 것을 확인할 수 있었다.
또한, POS(비교예)는 대장균이 CTL(정상대조군)과 비교하여 증가하였으나, KCTC18679P(실시예)는 CTL(정상대조군)과 비교하여 감소한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, KCTC18679P(실시예)는 장내세균총에 유익한 효능을 가진 유산균으로 사용 가능하며, 면역 등의 기능성을 가진다고 볼 수 있다고 판단된다.
3) 장내 안착능 평가
장내 안착능을 평가하기 위하여, 실험최종일에 소장을 적출하여 4% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde), 1% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 넣어 2시간 조직을 고정하여, PBS로 세척하였다. 조직 고정 후, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%알코올에 각 30분씩 탈수하고, 알코올(alcohol) : 초산아이소아밀(isoamyl acetate)을 2:1, 1:1, 1:2, 초산아이소아밀(isoamyl acetate)을 100%비율로 각각 30분씩 처리한 후, CPD(critical point dryer, HCP-2, Hitachi, japan)로 45℃에서 20분, 20℃에서 5분 건조하여, ion supper(H-1010, Hitachi, japan)을 이용하여 30초 동안 코팅한 다음, analytical high resolution scanning electron microscope(Supra55VP, Carl Zeiss, germany)를 이용하여 관찰하였다.
그 결과는 도 2와 같다.
도 2를 보면 알 수 있듯이, 장내에 KCTC18679P(실시예)가 안착되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 2] 부형제 선발
부형제를 선별하기 위해, 유산균에 부형제(탈지분유 10%, 전지분유 10% 및 콩가루 5%)를 각각 처리하여 시료를 제조한 후, 시료를 동결건조하여 생존수 측정법으로 부형제에 따른 유산균 생존율을 측정하였다.
각각의 시료 10g을 멸균 식염수 90ml로 혼합하여 10배 희석법으로 희석하였고, 희석액 100㎕를 MRS 평판배지에 도말한 후 30℃에서 48시간 배양 뒤 형성된 집락수를 계수하여 log CFU/g으로 나타내었다.
그 결과는 표 5와 같고, 여기서, SM: 탈지분유 10%, WM: 전지분유 10%, SP: 콩가루 5%이다.
상기 표 5를 보면 알 수 있듯이, 초기 생균수는 SM, WM 및 SP 모두 109의 생균수를 나타내었고, 1달 후에도 모두 109의 생균수로 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
2달 후에는 SM 및 WM은 109의 생균수를 나타내었으나, SP는 108의 생균수로 생균수가 감소된 것을 확인할 수 있었다.
3달 후에는 SM은 109의 생균수가 나타나 유지되었고, SP는 108의 생균수로 지난달과 비교하여 유지되었으나, WM는 107의 생균수로 생균수가 감소된 것을 확인할 수 있었다.
마지막으로, 4달 후에는 SM은 109의 생균수가 나타났고, WM는 107의 생균수로 나타났으며, SP는 107의 생균수로 생균수가 감소된 것을 확인할 수 있었다.
따라서, SM만 4달 동안 생균수가 109의 생균수로 유지되었으므로, 최적의 부형제로 탈지분유를 선발하였다.
[실험예 3] 유산균 제형 선택
안정성을 위한 유산균의 제형을 선택하기 위하여, 유산균을 정제, 캡슐 및 분말로 제형화하고 각각 생균수 측정법으로 생존율을 측정하였다.
그 결과는 하기 표 6과 같고, 여기서 T type: 정제, C type: 캡슐, P type: 분말이다.
상기 표 6을 보면 알 수 있듯이, 유산균은 분말(P type) 형태로 될 경우 생존율이 가장 우수한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 유산균 제제인 면역력 향상 기능성 첨가물의 제형을 분말화 하는 것으로 설계하였다.
[실시예] 면역력 향상 기능성 첨가물 제조
MRS 액체 배지에 락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P) 1%를 접종한 후 37℃에서 24시간 배양하고(전배양액), 혼합배지에 전배양액 2.5%를 접종하고 37℃에서 8 시간 배양하고(본배양액), 본배양액을 원심분리 및 막분리하여 유산균을 회수한 다음, 유산균 100 중량%에 동결부형제 15 중량%를 첨가한 후 동결건조시키고 분쇄하여 제조하였다.
혼합배지는 글루코스 2.50중량%, 효모 추출액 2.50중량%, 카세인 0.50중량%, 초산 나트륨 0.50중량%, 인산 암모늄 0.15중량%, 시트르산 칼륨 0.25중량%, 황산 마그네슘 0.02중량%, 황산 망간 0.01중량%, 비이온 계면활성제 0.02중량% 및 정제수 93.45중량%를 포함한다.
동결부형제는 탈지분유 14.89중량%, 트레할로오스 8.51중량%, 말토덱스트린 2.13중량% 및 정제수 74.47중량%를 포함한다.
[비교예]
실시예에서 본 배양단계를 하지 않고 유산균 회수 시 원심분리만을 한 것을 제외하고 실시예와 동일하게 제조하였다.
[실험예 4] 품질 평가
실시예와 비교예의 품질을 평가하기 위하여, 실시예 및 비교예의 염도, 색도, 산도 및 생균수를 측정하였다.
그 결과는 하기 표 7과 같다.
상기 표 7을 보면 알 수 있듯이, 비교예보다 실시예의 염도 및 산도가 낮은 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예의 색이 비교예보다 탈색되어 나타나는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 실시예의 생균수가 비교예보다 다소 높으나 유의적인 차이는 나타나지 않은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 실시예는 염도, 산도가 낮고 색이 제거되어 다양한 식품의 첨가물로 사용되기 적합하다고 판단된다.
이상으로 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고 다른 구체적인 형태로 실시할 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 따라서 이상에서 기술한 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것이다.
Claims (2)
- 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물의 제조방법에 있어서,
(a) MRS 액체 배지에 유산균 1 내지 2%를 접종한 후 30 내지 37℃에서 23 내지 25시간 배양하는 전배양 단계;
(b) 혼합배지에 전배양액 2 내지 3%를 접종하고 배양하는 본배양 단계;
(c) 본배양액을 원심분리하여 유산균을 획득하는 단계;
(d) 원심분리된 유산균을 막분리하는 단계;
(e) 막분리된 유산균 100중량%에 동결부형제 10 내지 20중량%를 혼합하는 단계;
(f) 혼합물을 동결건조시키는 단계 및
(g) 동결건조된 혼합물을 분쇄하여 분말화하는 단계를 포함하고,
상기 유산균은,
락토바실러스 커바투스(Lactobacillus curvatus JIF001, KCTC18679P)이고,
상기 혼합배지는,
글루코스 1.5 내지 3.5중량%, 효모 추출액 1.5 내지 3.5중량%, 카세인 0.3 내지 0.7중량%, 초산 나트륨 0.3 내지 0.7중량%, 인산 암모늄 0.05 내지 0.25중량%, 시트르산 칼륨 0.15 내지 0.35중량%, 황산 마그네슘 0.01 내지 0.03중량%, 황산 망간 0.005 내지 0.015중량%, 비이온 계면활성제 0.01 내지 0.03중량% 및 정제수 92.45 내지 94.45중량%를 포함하며,
상기 동결부형제는,
탈지분유 12 내지 16중량%, 트레할로오스 5 내지 10중량%, 말토덱스트린 1 내지 3중량% 및 정제수 70 내지 80중량%를 포함하고,
상기 (e) 단계 후,
혼합물에 보조조절제 2 내지 4중량%를 혼합하는 단계를 더 포함하며,
상기 보조조절제는,
정제수, 락티톨, 쌀눈, 초산나트륨, 염화칼륨 및 탄산칼륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역력 향상 기능성 첨가물 제조방법.
- 제1항의 제조방법을 통해 제조된 장내 세균총에 유익한 효능을 가진 유산균을 활용한 면역력 향상 기능성 첨가물.
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