KR20210042123A - 유전자 발현의 선택적 스플라이싱 조절 및 치료 방법 - Google Patents

유전자 발현의 선택적 스플라이싱 조절 및 치료 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210042123A
KR20210042123A KR1020217006348A KR20217006348A KR20210042123A KR 20210042123 A KR20210042123 A KR 20210042123A KR 1020217006348 A KR1020217006348 A KR 1020217006348A KR 20217006348 A KR20217006348 A KR 20217006348A KR 20210042123 A KR20210042123 A KR 20210042123A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
expression
rna
aav
pyridazin
Prior art date
Application number
KR1020217006348A
Other languages
English (en)
Inventor
비벌리 엘. 데이비드슨
알레한드로 마스 몬테이스
아미엘 알 헌들리
폴 티. 랜엄
Original Assignee
더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아 filed Critical 더 칠드런스 호스피탈 오브 필라델피아
Publication of KR20210042123A publication Critical patent/KR20210042123A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/357—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having two or more oxygen atoms in the same ring, e.g. crown ethers, guanadrel
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/501—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/465—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. lipases, ribonucleases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/31—Combination therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)

Abstract

본원에서 제공된 것은 키메라 트랜스활성화 미니유전자이고, 미니유전자의 선택적 스플라이싱은 트랜스활성화인자가 발현되는지를 결정한다. 트랜스활성화인자의 발현은, 디자이너 프로모터 서열의 조절하에 있는 표적 유전자의 전사를 초래한다. 또는, 본원에서 제공된 것은 키메라 표적 유전자 미니유전자이고, 미니유전자의 선택적 스플라이싱은 표적 유전자가 발현되는지를 직접 결정한다. 표적 유전자를 억제성 RNA, CRISPR-Cas9 단백질 또는 치료 단백질을 코딩할 수 있다.

Description

유전자 발현의 선택적 스플라이싱 조절 및 치료 방법
관련 출원에 대한 참조
본 출원은, 2019년 7월 10일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/872,417호, 2019년 4월 24일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/838,223호, 2019년 4월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/837,701호 및 2018년 8월 7일에 출원된 미국 가출원 번호 제62/715,756호의 우선권을 주장하고, 각각의 내용 전체가 참조에 의해 본원에 도입된다.
1. 분야
본 개시는, 일반적으로, 분자 생물학 및 의학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이는, 예를 들면, 억제성 RNA, 치료 단백질(therapeutic protein) 또는 CRISPR/Cas9 시스템의 일부를 코딩하는 표적 유전자의 발현을 조절하기 위해 선택적 스플라이싱 조절을 사용하는 방법에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
헌팅턴병(HD)은 상 염색체 우성 신경퇴행성 질환이고, 주로 성인, 및 보다 드물게는 어린이에게 영향을 미친다. HD는, 특정 유전자의 트리플렛 CAG 반복의 확장으로 인해 발생하는 적어도 9개의 상이한 신경퇴행성 질환을 포함하는 폴리글루타민(polyQ) 장애 패밀리의 일부이다1,2. HTT 단백질은 편재적으로 발현되지만, 가장 영향을 받는 조직은 뇌이고, 선조체와 운동 피질은 조기에 영향을 받는다. HD 환자는 진행성의 신경퇴행성을 갖고, 발병후 10 내지 20년에서 사망한다2. HD의 치료법은 없으며, 현재 치료법은 증후성이다3. HD 동물 모델을 사용한 흥미로운 초기 연구는, 질병 발병 후에 개시된 경우에도, 돌연변이형 HTT의 발현이 감소하면, 질환이 개선되었음을 입증했다4,5.
HTT 수준을 저하시키기 위해 몇몇 방법이 사용되어 왔고6-10, 이들 중에는 RNA 간섭(RNAi)8,9,11-14가 있다. RNAi는, 소분자 RNA 분자가 번역 억제 또는 mRNA 분해에 의해 특정 유전자의 발현을 조절하는 생물학적 프로세스이다15,16. 과학자들은, 세포 내에 RNAi 트리거를 전달하기 위해 상이한 방법을 설계했다. 이들은, 소분자 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 또는 인공 miRNA(amiRNA)를 포함한다(도 1). 이들 모두는, RNA 경로에 관여한 후의 표적 유전자의 발현을 효율적으로 감소시키기 위해 사용되어 왔다. 보고에 의하면, RNAi로 독성 polyQ 단백질의 수준을 저하시키면, 폴리글루타민-반복 질환의 몇몇 모델을 사용하여 질환의 표현형이 개선된다8,11,12. 이들 연구는 HD를 포함하는 신경퇴행성 질환의 RNAi 기반 치료가 가능하다는 증거를 제공한다. 비인간 영장류(NPH)의 단기(6주) 테이터 및 NPH의 기타 장기(6개월) 데이터는, 지속적 RNAi 요법이 안전하다는 것을 시사한다17,18.
그러나, 환자에 대한 RNAi 요법의 반복적 또는 생애에 걸친 적용은, 의도하지 않는 유전자의 사일런싱 및 세포성 RNAi 경로의 지속적 채용이, 경시적으로 독성을 유발할 수 있다는 것을 고려할 필요가 있다. 오프-표적 사일런싱은, RNAi 서열과, 완전 또는 부분적으로 상보성인 의도하지 않는 mRNA 전사물(transcript)과의 상호작용으로부터 발생한다19-21. 표준 검색 알고리즘은 완전히 상보성인 오프-서열 사일런싱의 가능성을 감소시킬 수 있지만, 발현된 RNAi 모이어티와 별개 서열과의 부분적 상보성이 있어 miRNA-유사 억제를 유발하는 경우에 발생하는 의도하지 않는 사일런싱을 회피하는 것은 곤란하다19,22. 오프-표적 사일런싱에 추가하여, RNAi 경로의 채용은, 세포의 RNAi 기구를 포화시키고, 내인성 miRNA 조절을 방해하여 독성을 유발할 수 있다23. 이 독성은, 트리거가 shRNA보다 효율적으로 처리되는 인공 miRNA 서열로서 전달되는 경우에 최소화될 수 있다24,25. 이들 트리거는, 초기 드로샤/DGCR8 처리 단계의 전에 RNAi 경로에 도입된다15. 보다 약한 프로모터(H1 또는 ApoE/hAAT 프로모터)의 사용도, 이 유형의 독성을 감소시킬 수 있다26. 이들 접근법은 세포 또는 마우스에서 시험된 경우에 유망하지만, 이들 프로모터로부터 지속적 발현이 수십년에 걸쳐 인간에서 안전하다는 것을 예측하는 것은 곤란하다. 이와 같이, 세포내에서 외인성 RNAi 서열이 발현되는 시기와 양을 조절(control)할 수 있는 RNAi 발현 시스템은, 구성적 발현 플랫폼보다 매우 바람직하다. 이러한 조절된 시스템은, 개인의 생애에 걸쳐 유전자 사일런싱이 요구되는 인간 질환에 특히 관련되어 있다.
본 발명은, 유전자 발현을 조절하기 위한 메카니즘으로서 프레-mRNA의 선택적 스플라이싱의 잇점을 취한다. 프레-mRNA의 스플라이싱은, 인트론을 제거하고 단백질-코딩 엑손, 엑손의 일부 및 대체 5' 및 3' 비코딩 엑손을 선택적 포함 또는 제외하여 단백질의 다양성을 생성하는 전사후 조절 프로세스이다. 이 선택적 엑손 스플라이싱은, 특정 단백질의 생산을 억제하기 위한 조절 스위치, 예컨대, 비-코딩 RNA(예를 들면, siRNA) 또는 단백질 생산을 위한 상류의 디자이너 프로모터 서열에 결합하도록 설계된 포유동물 트랜스활성화인자(transactivator)로서 사용될 수 있다. 본 발명은, 포유동물 세포 및, 예를 들면, 헌팅톤병 및 척수소뇌 실조증 등의 신경퇴행성 질환을 갖는 인간, 및 트리펩티딜 펩티다제 1(TPP1)의 결핍 등의 유전적 결손을 갖는 인간 등의 대상체에서 비-코딩 RNA 및 단백질 발현을 조절하는 혁신적 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은, 포유동물 세포 및 대상체를 포함하는 대상체 뿐만 아니라, 세포에서 비-코딩 RNA 및 단백질의 발현을 조절하는(즉, 발현을 증가 또는 감소시키는 등의 발현을 조절하는) 방법을 제공한다.
한 가지 실시형태에서, 이 방법은, 세포에게 제1 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 키메라 유전자(chimeric gene)를 포함하는 제1 발현 카세트(expression cassette)를 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 유전자는 선택적 스플라이싱된 미니유전자(alternatively spliced minigene)를 포함하는 제1 부분, 및 단백질을 코딩(encoding)하는 RNA를 코딩하는 제2 부분을 포함하고, 상기 단백질의 발현은 제1 부분의 선택적 스플라이싱에 의해 조절되어, 단백질의 발현을 제공 및/또는 조절한다.
또 다른 실시형태에서, 단백질을 제공하는 방법은, 대상체에게 제1 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 키메라 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트를 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 유전자는 선택적 스플라이싱된 미니유전자를 포함하는 제1 부분, 및 단백질을 코딩하는 RNA를 코딩하는 제2 부분을 포함하고, 상기 단백질의 발현은 제1 부분의 선택적 스플라이싱에 의해 조절된다.
본 발명은 추가로, 신경퇴행성 질환, 유전자 결함에 의해 유발된 질환, 또는 유전자 발현의 결함(genetic defect)에 의해 유발된 질환 등의 질환 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
한 가지 실시형태에서, 포유동물의 질환을 치료하는 방법은, 포유동물에게 제1 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 키메라 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트를 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 유전자는 선택적 스플라이싱된 미니유전자를 포함하는 제1 부분, 및 단백질을 코딩하는 RNA를 코딩하는 제2 부분을 포함하고, 상기 단백질의 발현은 제1 부분의 선택적 스플라이싱에 의해 조절된다.
일부 실시형태에서, 단백질을 코딩하는 RNA를 코딩하는 제2 부분은, 번역 정지 코돈(translation stop codon)을 포함하거나, 개시 또는 출발 코돈을 제거하거나, 단백질을 생성하기 위한 개방 판독 프레임(open reading frame)이 아니거나, 단백질의 일부만을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 선택적 스플라이싱은 전사물을 변형시키고, 이에 의해 정지 코돈을 결실(deleting) 또는 무효화(nullifying)하거나, 개시 또는 출발 코돈을 도입하거나, 개방 판독 프레임을 회복하거나, 단백질의 결손 부분(missing portion)을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제1 부분은 제2 부분의 5'이다. 일부 실시형태에서, 제1 부분은 프레임 내의 번역 정지 코돈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 부분의 선택적 스플라이싱은 번역 정지 코돈을 제거한다.
일부 실시형태에서, 단백질은 트랜스활성화인자 단백질이다. 일부 실시형태에서, 단백질은 리포터 단백질이 아니다.
일부 실시형태에서, 방법은 세포에게 제1 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 키메라 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트(여기서, 상기 키메라 유전자는 선택적 스플라이싱된 미니유전자를 포함하는 제1 부분, 및 제2 발현 조절 요소에 결합하는 트랜스활성화인자 단백질을 코딩하는 제2 부분을 포함하고, 상기 트랜스활성화인자의 발현은 제1 부분의 선택적 스플라이싱에 의해 조절된다); 및 트랜스활성화인자 단백질이 결합하는 제2 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 투여하고, 이에 의해 포유동물 세포에서 RNA의 발현을 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, RNA 또는 단백질의 발현을 조절하는 방법은 대상체에게 제1 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 키메라 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트(여기서, 상기 키메라 유전자는 선택적 스플라이싱된 미니유전자를 포함하는 제1 부분, 및 제2 발현 조절 요소에 결합하는 트랜스활성화인자 단백질을 코딩하는 제2 부분을 포함하고, 상기 트랜스활성화인자의 발현은 제1 부분의 선택적 스플라이싱에 의해 조절된다); 및 트랜스활성화인자 단백질이 결합하는 제2 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 투여하고, 이에 의해 대상체에서 RNA의 발현을 증가시키는 것을 포함한다.
한 가지 실시형태에서, 포유동물에서 질환을 치료하는 방법은, 포유동물에게 제1 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 키메라 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트(여기서, 상기 키메라 유전자는 선택적 스플라이싱된 미니유전자를 포함하는 제1 부분, 및 제2 발현 조절 요소에 결합하는 트랜스활성화인자 단백질을 코딩하는 제2 부분을 포함하고, 상기 트랜스활성화인자의 발현은 제1 부분의 선택적 스플라이싱에 의해 조절된다); 또는 트랜스활성화인자 단백질이 결합하는 제2 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트를 투여하고, 이에 의해 포유동물에서 RNA의 발현을 증가시키고 질환을 치료하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, RNA는, 예를 들면, siRNA, shRNA 또는 miRNA 등의 억제성 RNA이다. 일부 실시형태에서, 억제성 RNA는 질환과 관련된 이상 또는 비정상 단백질의 발현을 억제 또는 감소시키고, 이에 의해 질환을 치료한다.
일부 실시형태에서, RNA는 치료 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 치료 단백질은 질환과 관련된 단백질 결핍을 수정하고, 이에 의해 질환을 치료한다.
일부 실시형태에서, RNA는 Cas9 단백질을 코딩한다. 일부 실시형태에서, 방법은 제3 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 제3 발현 조절 요소는 구성적 프로모터(constitutive promoter)이다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 발현은 유전 질환을 수정한다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 뉴클레아제 기능을 결핍시키고(lack), Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 발현은 유전자의 발현을 억제한다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 조절 요소는 구성적 프로모터, 세포형 특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터이다.
일부 실시형태에서, 제1 발현 카세트의 제1 부분 및 제1 발현 카세트의 제2 부분은 절단가능한 펩티드에 의해 분리되어 있다. 일부 실시형태에서, 절단가능한 펩티드는 자가-절단 펩티드(self-cleaving peptide), 약물-감수성 프로테아제(drug-sensitive protease) 또는 내인성 엔도프로테아제의 기질이다.
일부 실시형태에서, 선택적 스플라이싱된 미니유전자의 스플라이싱은 소분자 스플라이싱 변형인자(small molecular splicing modifier)에 의해 조절된다. 일부 실시형태에서, 선택적 스플라이싱된 미니유전자의 스플라이싱은 세포 내의 질환 상태에 의해 조절된다. 일부 실시형태에서, 선택적 스플라이싱된 미니유전자의 스플라이싱은 세포형 또는 조직형에 의해 조절된다.
일부 실시형태에서, 트랜스활성화인자 또는 단백질의 발현 증가는, 키메라 유전자의 제1 부분에서의 선택적 스플라이싱된 엑손의 포함에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 포함된 엑손은 번역 개시 조절 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 트랜스활성화인자 또는 단백질의 발현 증가는 SMN2 엑손 7 포함에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, SMN2 엑손 7의 포함은 소분자 스플라이싱 변형인자의 존재에 의해 유발된다. 일부 실시형태에서, 방법은 소분자 스플라이싱 변형인자를 세포 또는 대상체에게 투여하고, 이에 의해 RNA 또는 단백질의 발현을 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 소분자 스플라이싱 변형인자는
Figure pct00001
또는
Figure pct00002
또는
Figure pct00003
이다.
일부 실시형태에서, 트랜스활성화인자 또는 단백질의 발현 증가는 키메라 유전자의 제1 부분에서 선택적 스플라이싱된 엑손의 스키핑(skipping)에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, 스키핑된(skipped) 엑손은 정지 코돈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 트랜스활성화인자 또는 단백질의 발현 증가는 MDM2 엑손 4-11 스키핑에 의해 제공된다. 일부 실시형태에서, MDM2 엑손 4-11의 스키핑은 소분자 스플라이싱 변형인자의 존재에 의해 유발된다. 일부 실시형태에서, 소분자 스플라이싱 변형인자는 수데마이신(sudemycin)이다.
일부 실시형태에서, 트랜스활성화인자의 발현 증가는 트랜스활성화인자의 전사물로 엑손의 삽입에 의해 제공된다.
일부 실시형태에서, 트랜스활성화인자의 발현 증가는 트랜스활성화인자의 전사물에서 엑손의 스키핑에 의해 제공된다.
일부 실시형태에서, 엑손은 치료 단백질 등의 단백질의 전부 또는 일부를 코딩하는 전사물에 삽입된다.
일부 실시형태에서, 전사물에 삽입된 엑손은, 전사물에 도입될 때에, 엑손이 단백질을 코딩하는 서열을 회복하거나, 전사물 단백질 코딩 서열을 프레임 내로 되게 하는 서열을 포함한다. 따라서, 전사물 내로 엑손의 도입은, 완전한 단백질 서열이 전사물에 의해 코딩되는 것을 가능하게 하거나, 엑손이 전사물의 개방 판독 프레임을 제공 또는 회복하고, 이에 의해 단백질, 예를 들면, 치료 단백질을 번역하는 서열을 제공 또는 회복한다.
일부 실시형태에서, 전사물에 삽입된 엑손은, 전사물에 존재하지 않는 출발 또는 개시 코돈(예: ATG)를 포함한다. 엑손이 프레임 내에서 전사물에 도입되면, 이에 의해, 코딩된 단백질, 예를 들면, 치료 단백질의 번역이 가능해진다.
일부 실시형태에서, 전사물에 삽입된 엑손은, 전사물 중의 번역 정지 코돈을 결실 또는 무효화한다. 엑손이 전사물의 결실 또는 번역 정지 코돈의 무효화에 도입되면, 코딩된 단백질, 예를 들면, 치료 단백질의 번역이 가능해진다.
일부 실시형태에서, 제1 또는 제2 발현 카세트는 바이러스 벡터에 포함된다.
다양한 실시형태에서, 질환은 신경-퇴행성 질환(neuro-generative disease)이다. 다양한 실시형태에서, 신경-퇴행성 질환은 폴리-글루타민 반복 질환(poly-glutamine repeat disease)이다. 다양한 실시형태에서, 폴리-글루타민 반복 질환은 헌팅톤병(HD)을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 신경-퇴행성 질환은 척수소뇌 실조증(SCA)이다. 특정 국면에서, SCA는 SCA1, SCA2, SCA3, SCA4, SCA5, SCA6, SCA7, SCA8, SCA9, SCA10, SCA11, SCA12, SCA13, SCA14, SCA16, SCA17, SCA18, SCA19, SCA20, SCA 21, SCA22, SCA23, SCA24, SCA25, SCA26, SCA27, SCA28 또는 SCA29 중의 하나이다.
다양한 실시형태에서, 투여는 중추신경계(CNS)에 대한 것이다. 특정 국면에서, 투여는 뇌에 대한 것이다. 특정 국면에서, 투여는 뇌실(brain ventricle)에 대한 것이다.
다양한 실시형태에서, 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 또는 제2 발현 카세트 또는 발현 카세트는 바이러스 벡터를 포함한다. 특정 국면에서, 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택된다.
다양한 실시형태에서, AAV 벡터는, AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자를 포함하고, 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 또는 제2 발현 카세트 또는 발현 카세트는 한 쌍의 AAV 역방향 말단 반복체(inverted terminal repeat; ITR)의 사이에 삽입된다. 특정 국면에서, AAV 캡시드 단백질은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 및 AAV-2i8 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-Rh10, 또는 AAV-2i8 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질과 70% 이상 동일성(identity)을 갖는 캡시드 단백질로 이루어진 그룹으로부터 유래되거나 이로부터 선택된다. 특정 국면에서, ITR 쌍의 하나 이상은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 또는 AAV-2i8 ITR, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-Rh10 또는 AAV-2i8 ITR 서열과 70% 이상 동일성을 갖는 ITR로부터 유래되거나, 이를 포함하거나 이로 이루어진다.
다양한 실시형태에서, 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 또는 제2 발현 카세트 또는 발현 카세트는 프로모터를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 또는 제2 발현 카세트 또는 발현 카세트는 인핸서 요소(enhancer element)를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 또는 제2 발현 카세트 또는 발현 카세트는 CMV 인핸서 또는 치킨(chicken) 베타 액틴 프로모터를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 또는 제2 발현 카세트 또는 발현 카세트는 인트론, 필러(filler) 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 폴리 A 신호 또는 이의 조합 중의 하나 이상을 추가로 포함한다.
다양한 실시형태에서, 복수의 AAV 입자가 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 약 1×106 내지 약 1×1018 vg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 약 1×107-1×1017, 약 1×108-1×1016, 약 1×109-1×1015, 약 1×1010-1×1014, 약 1×1010-1×1013, 약 1×1010-1×1013, 약 1×1010-1×1011, 약 1×1011-1×1012, 약 1×1012-1×1013 또는 약 1×1013-1×1014 벡터 게놈/포유동물 kg(vg/kg)의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 입자는 약 0.5-4ml의 1×106-1×1016 vg/ml의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 방법은 복수의 AAV 공(empty) 캡시드를 투여하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 공 AAV 캡시드는 포유동물에게 투여된 AAV 입자로 제형화된다. 다양한 국면에서, AAV 공 캡시드는 1.0 내지 100배 과량의 AAV 벡터 입자와 함께 투여되거나 제형화된다. 다양한 국면에서, AAV 공 캡시드는 AAV 입자에 대해 약 1.0 내지 100배 과량의 AAV 공 캡시드와 함께 투여되거나 제형화된다.
일부 실시형태에서, 투여는 뇌실내 주사 및/또는 실질내(intraparenchymal) 주사이다.
일부 실시형태에서, 투여는 뇌실, 지주막하 공간 및/또는 척수강내 공간에 대한 것이다.
일부 실시형태에서, 투여는 상의(ependymal) 세포, 연막(pial) 세포, 내피 세포, 뇌실, 수막 세포, 글리아(glial) 세포 및/또는 뉴런 등의 신경 세포에 대한 것이다. 다양한 국면에서, 상의 세포, 연막 세포, 내피 세포, 뇌실, 수막, 글리아 세포 및/또는 뉴런은 RNAi를 발현한다.
다양한 실시형태에서, 투여는 이마측 심실(rostral lateral ventricle); 및/또는 꼬리측 심실(caudal lateral ventricle); 및/또는 우측 심실(right lateral ventricle); 및/또는 좌측 심실(left lateral ventricle); 및/또는 우동측 심실(right rostral lateral ventricle); 및/또는 좌동측 심실(left rostral lateral ventricle); 및/또는 우꼬리측 심실(right caudal lateral ventricle); 및/또는 좌꼬리측 심실(left caudal lateral ventricle)에 대한 것이다.
다양한 실시형태에서, 투여는 뇌 내의 단일 위치(single location)에서 수행된다.
다양한 실시형태에서, 투여는 뇌 내의 1 내지 5개 위치에서 수행된다.
다양한 실시형태에서, 투여는 포유동물의 대조(cisterna magna), 심실내 공간(intraventricular space), 뇌실, 지주막하 공간, 척수강내 공간 및/또는 뇌실막(ependyma) 중의 임의의 것에 대한 단일 또는 복수 용량이다.
다양한 실시형태에서, 방법은 헌팅톤병(HD) 또는 척수소뇌 실조증(SCA)의 유해 증상(adverse symptom)을 감소시킨다. 다양한 국면에서, 유해 증상은 초기 단계 또는 후기 단계 증상; 거동, 성격 또는 언어 증상; 운동 기능 증상; 및/또는 인지 증상을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 포유동물의 기억 장애, 기억 결함 또는 인지 기능을 증가, 개선, 보존, 회복 또는 구제한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 조정력 상실, 느린 움직임 또는 신체 경직의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 경련 또는 안절부절 움직임의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 우울증 또는 과민성(irritability)의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 물건 낙하, 넘어짐, 균형 상실, 말하기 곤란 또는 연하 곤란(difficulty swallowing)의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 조직화하는 능력의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 운동실조(ataxia) 또는 반사 감소(diminished reflex)의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지한다.
다양한 실시형태에서, 방법은 발작 또는 진전(tremor) 발작 또는 진전의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지한다.
다양한 실시형태에서, 포유동물은 비-설치류 포유동물이다. 다양한 국면에서, 비-설치류 포유동물은 영장류이다. 다양한 국면에서, 영장류는 인간이다. 다양한 국면에서, 인간은 50세 이상이다. 다양한 국면에서, 인간은 어린이이다, 다양한 국면에서 어린이는 약 1 내지 8세이다.
다양한 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 면역억제제를 투여하는 것을 포함한다. 다양한 국면에서, 면역억제제는 벡터의 투여 전에 또는 이와 동시에 투여된다. 다양한 국면에서, 면역억제제는 항염증제이다.
본원에 사용된 바와 같이, 특정 성분과 관련하여 "본질적으로 없는"은, 특정 성분 중 어느 것도 의도적으로 조성물로 배합되지 않았고/거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재하는 것을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 조성물의 의도하지 않은 오염으로 기인하는 특정 성분의 총량은, 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 가장 바람직한 것은, 특정 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이다.
본원 명세서에 사용된 바와 같이, 단수형("a" 또는 "an")은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 단어와 함께 사용되는 경우, 단수형("a" 또는 "an")은 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
특허청구범위에서 용어 "또는"의 사용은, 대체물만을 지칭하는 것으로 명시적으로 표시되지 않는 한, 또는 대체물이 상호 배타적인 경우를 제외하고, "및/또는"을 의미하는 것으로 사용되지만, 본 개시는 대체물 단독 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "또 다른"은 적어도 2번째 이상을 의미할 수 있다.
본 출원을 통해, 용어 "약(about)"은, 값이 장치에 대한 고유의 오차 변동, 값을 결정하는데 사용되는 방법, 또는 연구 대상 사이에 존재하는 변동을 포함하는 것을 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 본 발명의 정신 및 범위 내의 다양한 변경 및 수정이 이러한 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내면서, 단지 예시로서만 제공되는 것을 이해해야 한다.
본 발명은, 일반적으로, 다수의 실시형태 및 국면을 설명하기 위해 긍정적(affirmative) 언어를 사용하여 본원에 개시된다. 본 발명은 또한, 물질 또는 재료, 방법 단계 및 조건, 프로토콜, 또는 절차 등, 특정 주제가 완전히 또는 부분적으로 제외되는 실시형태도 구체적으로 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 특정 실시형태 또는 국면에서, 재료 및/또는 방법 단계는 제외된다. 따라서, 본 발명이 본원에서 일반적으로 규정하지 않는 경우에도, 본 발명이 본 발명에서 명시적으로 배제되지 않는 국면을 포함하지 않는 것과 관련해서는, 그럼에도 불구하고 본 명세서에 개시된다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 발명의 특정 국면을 추가로 실증하기 위해 포함되어 있다. 본 발명은, 본원에 제시된 특정 실시형태의 상세한 설명과 조합하여 이들 도면의 하나 이상을 참조함으로써 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 포유동물 세포에서 발현을 사일런싱하기 위해 RNAi 경로를 채용하는 것을 나타낸다.
도 2는, 조절된 프로모터 시스템의 작용을 나타낸다. SMN2의 Exon7의 포함은, e6/7/8:트랜스활성화인자의 번역을 가능하게 하는 LMI070에 의해 유도된다.
도 3a-b는, 최적화된 프로모터 작제물이 트랜스활성화인자에 반응하는 것을 나타낸다. 도 3a는, RNAip에 대한 트랜스활성화인자의 결합이 루시퍼라제의 발현을 유도하는 것을 나타낸다. 도 3b는, 시험된 프로모터 변이체(TA, TF2, TF4 및 TF5)의 발현이 최소이고, 공 프로모터 플라스미드(NO)로 형질감염된 대조군 세포와 유사하며, HEK293 세포의 형질감염 후에 루시퍼라제 활성에 의해 24시간 동안 측정된 바와 같이, 트랜스활성화에 반응하여 완전히 활성화되는 것을 나타낸다.
도 4a-c는, 변형된 SMN2/트랜스활성화인자 미니유전자가, 최적화된 RNAi 프로모터의 배경 발현에 영향을 미치는, 엑손 7을 구성적으로 배제(CSI3)하거나 포함(CSI5)하도록 스플라이싱된 RNA 전사물 이소형을 발현하는 것을 나타낸다. 도 4a는, 트랜스활성화인자가 자가 절단 2A 펩티드 및 엑손 6-7 및 엑손 8의 5' 말단을 포함하는 SMN2 미니유전자, 추가로 SMN2 스플라이싱을 재현하는데 필요한 최소 인트론 개입 서열의 하류에 클로닝되었음을 나타낸다. SMN2/트랜스활성화인자 미니유전자의 3' 및 5' 엑손7 스플라이싱 부위는, 엑손 7을 구성적으로 배제(CSI3, 3' 변형)하거나 포함(CSI5, 5' 변형)하도록 변형되었다. 도 4b는, CSI의 경우, 전사물의 10%가 엑손 7을 포함하고, CSI3 및 CSI5의 경우, 엑손 7이 포함되거나 배제되는 것을 나타낸다. 도 4c는, 엑손 7을 구성적으로 배제하기 위한 변형(CSI3, 3' 변형)이 RNAi 프로모터 배경 활성화를 최소화했음을 나타낸다.
도 5a-b는, LIM070에 반응하여 CSI 및 CSI3 미니유전자의 스플라이싱 및 활성을 나타낸다. 도 5a는, Exon7 포함이 LMI070 처리후 20시간에서 반정량적 RT-PCR에 의해 HEK293 세포에서 결정되었음을 나타낸다. 도 5b는, LMI070에 반응하여 TF5 RNAi 프로모터의 활성화가 SMN2 미니유전자 및 TF5 RNAi 프로모터 플라스미드로 공-형질감염된 HEK293 세포에서 루시퍼라제 활성 20h 처리에 의해 결정되었음을 나타낸다.
도 6a-b는, 형질감염 후 HEK293에서 mi2.4vl, miHDSlv6a 및 이들의 시드 정합 miRNA 대조군에 의한 HTT 사일런싱의 정량적 평가를 나타낸다. 도 6a는, Q-PCR(24h)을 나타내고, 도 6b는 웨스턴 블롯(48h)을 나타낸다.
도 7은 LMI070-조절된 RNAi의 모델을 나타낸다. LMI070 투여는 miRNA 발현 및 mHTT 녹다운을 유도한다(흑색, LM1070의 단일 투여에 의한 RNAi 효과). RNAi 발현은, LMI070 투여 후 24-48시간에서 피크에 도달하고, 그 후 인공 miRNA는 배경 수준까지 저하된다. LMI070의 단일(적색) 또는 2회(청색 점선) 투여 후 1주에 걸쳐 예측된 RNAi 발현이 제시되어 있다.
도 8은, LMI070에 반응하는 HTT 드 노보 스플라이싱을 나타낸다. DMSO(CTL) 또는 LMI070(25nM)으로 처리된 HEK293 세포의 RNAseq 데이터. 사시미(Sashimi) 플롯은, RNA-seq에 의해 동정된 새로운 미니유전자(처리된 샘플의 원 내측)를 나타낸다.
도 9는, LMI070에 반응하는 베클린 1(BECN1) 드 노보 스플라이싱을 나타낸다. DMSO(CTL) 또는 LMI070(25nM)으로 처리된 HEK293 세포의 RNAseq 데이터. 사시미 플롯은, RNA seq에 의해 동정된 새로운 미니유전자(처리된 샘플의 원 내측)를 나타낸다.
도 10은, LMI070에 반응하는 염색체 12 개방 판독 프레임 4(Cl2orf4) 드 노보 스플라이싱을 나타낸다. DMSO(CTL) 또는 LMI070(25nM)으로 처리된 HEK293 세포의 RNAseq 데이터. 사시미 플롯은, RNA-seq에 의해 동정된 새로운 미니유전자(처리된 샘플의 원 내측)를 나타낸다.
도 11은, LMI070에 반응하는 5'-3' 엑소리보뉴클레아제 2(XRN2) 드 노보 스플라이싱을 나타낸다. DMSO(CTL) 또는 LMI070(25nM)으로 처리된 HEK293 세포의 RNAseq 데이터. 사시미 플롯은, RNA-seq에 의해 동정된 새로운 미니유전자(처리된 샘플의 원 내측)를 나타낸다.
도 12는, LMI070에 반응하는 스플라이싱 인자 3b 아단위 3(SF3B3) 드 노보 스플라이싱을 나타낸다. DMSO(CTL) 또는 LMI070(25nM)으로 처리된 HEK293 세포의 RNAseq 데이터. 사시미 플롯은, RNA-seq에 의해 동정된 새로운 미니유전자(처리된 샘플의 원 내측)를 나타낸다.
도 13은, LMI070에 반응하는 포르민 상동성 2 도메인 함유 3(FHOD3) 드 노보 스플라이싱을 나타낸다. DMSO(CTL) 또는 LMI070(25nM)으로 처리된 HEK293 세포의 RNAseq 데이터. 사시미 플롯은 RNA-seq에 의해 동정된 새로운 미니유전자(처리된 샘플의 원 내측)를 나타낸다.
도 14는, LMI070에 반응하는 글루코시드 크실로실 트랜스페라제 1(GXYLT1) 드 노보 스플라이싱을 나타낸다. DMSO(CTL) 또는 LMI070(25nM)으로 처리된 HEK293 세포의 RNAseq 데이터. 사시미 플롯은, RNA-seq에 의해 동정된 새로운 미니유전자(처리된 샘플의 원 내측)를 나타낸다.
도 15는, LMI070에 대한 반응으로 피리독살 의존성 데카복실라제 도메인 함유 1(PDXDC1) 및 핵 기공 복합체-상호작용 단백질(PDXDC2P-NPIPB14P), 비-코딩 RNA 드 노보 스플라이싱을 나타낸다. DMSO(CTL) 또는 LMI070(25nM)으로 처리된 HEK293 세포의 RNAseq 데이터. 사시미 플롯은 RNA-seq로 동정된 새로운 미니유전자(처리된 샘플의 원 내측)를 나타낸다.
도 16은, HEK293 세포에서 LMI070(25nM)에 의해 유도된 드 노보 엑손 스플라이싱을 나타낸다. PCR은, LMI070 처리(RNA-seq로 확인됨)에 반응하여 새로운 엑손이 포함되어 있음을 확인한다.
도 17은, 유전자 발현을 조절하기 위해 사용된 XonSwitch 전략 1을 나타낸다. 스플라이스 변형인자가 없는 경우, 새로운 엑손이 제외되고, 하류의 단백질이 프레임 외에 존재한다. 따라서, 이 경우, 단백질은 생성되지 않는다. 스플라이스 변형인자로 처리한 후, 개방 판독 프레임이 복원되고, 하류 단백질이 생성된다.
도 18은, 유전자 발현을 조절하기 위해 사용된 XonSwitch 전략 2를 나타낸다. 상류 ATG 번역 개시 코돈이 제거되고, 새로운 의사 엑손 내에 삽입되었다. 스플라이스 변형인자가 없는 경우, 전사물에는 ATG 번역 개시 코돈이 존재하지 않고, 비-단백질 코딩 RNA만이 생성되기 때문에, 번역은 발생하지 않는다. 스플라이스 변형인자가 부가되면, ATG 개시 코돈은 단백질을 발현하기 위해 번역되는 의사 엑손을 통해 전사물에 포함된다. 이에 의해, 단백질 발현이 엄격히 조절된다.
도 19는, 스플라이스 변형인자 RG7800에 반응하는 SMN2 미니유전자 스플라이싱을 나타낸다. 상이한 용량(10nM, 100nM, 1μM 및 10μM)에서 스플라이스 변형인자(RG7800) 처리에 반응하여 SMN2 미니유전자에 엑손 7이 포함됨으로써 유도된 것을 나타내는 PCR 스플라이싱 검정.
도 20은, 스플라이스 변형인자(RG7800) 처리에 반응하여 조절된 Cas9 발현에 의한 유도성 CRISPR 후성적 사일런싱을 나타낸다. RG7800이 없는 경우, Cas9 단백질은 프레임 외에 존재하고, 발현되지 않는다. RG7800에 의한 처리는, Exon7 포함을 유도하고, Cas9의 발현을 회복한다. RG7800에 반응하는 Cas9 발현의 결과로서, HTT 프로모터에 결합하여 돌연변이형 HTT 대립유전자의 후성적 사일런싱을 유도하는 특정 Cas9/sgRNA/RBP-Krab 복합체가 형성된다.
도 21은, mHTT 대립유전자의 조절된 편집을 나타낸다. 웨스턴 블롯은, 스플라이스 변형인자(RG7800)에 반응하여 SMN2_CRISPRi 조절 시스템에 의해 유도된 HTT 후성적 사일런싱을 나타낸다. HTT 및 Cas9 단백질 수준은, RG7800(1μM) 처리 후에 SMN2_CRISPRi 시스템으로 형질감염된 HEK293 세포에서 나타난다. 제시된 바와 같이, Cas9 단백질 수준은 RG7800에 반응하여 증가하고, HTT 발현 수준은 Cas9 매개 후성적 사일런싱의 결과로서 약 45% 감소한다.
본 명세서에는 키메라 트랜스활성화인자 미니유전자가 개시되며, 여기서 미니유전자의 선택적 스플라이싱은, 하류 트랜스활성화인자가 발현되는지 여부를 결정한다. 트랜스활성화인자의 발현은, 디자이너 프로모터 서열의 조절하에 있는 표적 유전자의 전사를 초래한다. 표적 유전자는, 억제성 RNA, CRISPR-Cas9 단백질 또는 치료 단백질을 코딩할 수 있다.
한 예에서, 미니유전자는 3개의 엑손, 엑손 1-3을 포함하고, 엑손 2는 기저 상태에서 스키핑된다. 엑손 2를 스키핑하면, 엑손 3의 판독 프레임이 이동하여 엑손 3에서 넌센스 돌연변이가 생성된다. 따라서, 코딩된 단백질의 번역은 엑손 3에서 중지되고, 하류에서는 어느 것도 번역되지 않는다. 트랜스활성화인자의 코딩 서열은 미니유전자의 하류에 위치하기 때문에, 트랜스활성화인자는 기저 상태에서는 발현되지 않는다. 또는, 번역 개시 조절 서열은 엑손 2에 위치하므로, 엑손 2를 스키핑하면, 번역은 발생하지 않는다.
트랜스활성화인자의 발현을 온으로 하기 위해, 스키핑된 엑손의 포함이 유도되어야 한다. 이는, 소분자 스플라이싱 변형인자의 존재의 결과로서 발생할 수 있다. 예를 들면, 미니유전자는, SMN2 유전자의 엑손 6-8을 포함할 수 있으며, 이 경우, 엑손 7은 기저 상태에서 스키핑된다. 그러나, 엑손 7은, 특정 스플라이싱 변형인자 소분자(예: LMI070)의 존재하에 포함된다(도 2 참조)31. 따라서, 하류 트랜스활성화인자는, LMI070의 존재하에 발현되지만, 그 부재하에서는 발현되지 않는다.
또는, 스키핑된 엑손의 포함은, 하나의 세포형에서 유도될 수 있지만, 다른 유형에서는 유도되지 않을 수 있다. 예를 들면, FGFR2의 엑손 8과 9는 상호 배타적이며, 엑손 9는 중간엽 조직에만 포함된다[참조: Takeuchi et al., 2010]. 이와 같이, 미니유전자는, 중간엽 세포에서만 트랜스활성화인자의 발현을 가능하게 하기 위해, FGFR2 유전자의 엑손 7,8,9,10을 포함할 수 있다. 이 경우, 정지 코돈은, 비-중간엽 세포에서의 트랜스활성화인자 발현을 방지하기 위해, 미니유전자의 엑손 8로 조작된다.
본 개시의 발현 조절 시스템에서 사용될 수 있는 세포형 특이적 선택적 스플라이싱 이벤트의 추가 예는 Eps8 Exon18B(chrl2:15,792,360-15,792,395) 및 Eps8 Exonl8C(chrl2:15,787,673-15,787,696)를 포함하며, 이는 청각 유모 세포에 특이적이다.
또 다른 대안으로서, 스키핑된 엑손의 포함은, 특정 질환 상태에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, 헌팅턴병은, 선택적 스플라이싱에 의해 생성된 전사물 이소형의 생성을 초래한다32. 이와 같이, 미니유전자는, 헌팅턴병에서 스플라이싱이 변경된 유전자로부터의 엑손을 포함할 수 있고, 즉, 돌연변이형 HTT가 발현되는 경우, 건강한 세포에서는 정상적으로 스키핑되는 엑손이 대신에 포함된다(예: PCDH1(5:141869432 - 141878222). 필요에 따라, 정지 코돈을 선택적으로 스플라이싱된 엑손의 하류 엑손에 조작하여 비-발병 세포에서 트랜스활성화인자가 생성되지 않도록 할 수 있다. 결과적으로, 트랜스활성화인자는 돌연변이형 HTT가 존재하는 경우에만 발현된다. 이 예에서, 표적 유전자는 돌연변이형 HTT의 발현을 녹다운시키는 억제성 RNA를 코딩하여, 자가조절 피드백 루프(feedback loop)를 생성할 수 있고, 돌연변이형 HTT의 존재는, 돌연변이형 HTT를 표적화하는 억제성 RNA의 발현을 유도할 것이고, 이에 의해 돌연변이형 HTT 수준을 미니유전자의 스플라이싱이 비-발병 상태로 복귀하게 하는 수준으로 감소시시키고, 이에 의해 억제성 RNA의 발현을 차단하고, 돌연변이형 HTT의 발현을 가능하게 하고, 이는 억제성 RNA의 발현 등을 유도하는 수준에 도달할 것이다. 또는, 표적 유전자는, HTT 유전자의 전사를 억제하는 CRISPR-Cas9 시스템을 코딩할 수 있다.
다른 예에서, 미니유전자는 3개의 엑손, 엑손 1-3을 포함하고, 엑손 2는 기저 상태에 포함된다. 엑손 2를 포함하면, 엑손 3에서 번역이 중지되도록 하류 프레임 시프트가 발생하거나, 엑손 2가 정지 코돈을 포함하도록 조작될 수 있다. 이와 같이, 엑손 2가 포함되어 있는 경우, 즉 기저 상태에 있는 경우, 트랜스활성화인자는 발현되지 않는다.
트랜스활성화인자의 발현을 온으로 하기 위해(turn on), 엑손 2의 스키핑을 유도해야 한다. 이는, 소분자 스플라이싱 변형인자의 존재의 결과로서 발생할 수 있다. 예를 들면, 미니유전자는, MDM2 유전자의 엑손 3,4,10,11,12를 포함할 수 있으며[참조: Singh et al, 2009], 이는 모두 기저 상태에 포함된다. 그러나, 엑손 4,10,11은, 특정 스플라이싱 변형인자 소분자(예: 수데마이신)의 존재하에서 스키핑된다[참조: Shi et al., 2015]. 따라서, 하류 트랜스활성화인자는 수데마이신의 존재하에 발현되지만, 그 부재하에서는 발현되지 않는다. 이 경우, 정지 코돈을 미니유전자의 엑손 4로 조작하여 수데마이신의 부재하에 단백질이 생성되지 않도록 할 수 있다.
또는, 선택적으로 포함된 엑손의 스키핑은, 하나의 세포형에서는 유도될 수 있지만, 다른 유형에서는 유도되지 않을 수 있다. Nin의 엑손 18은, 뉴런에서는 스키핑된다[참조: Zhang et al, 2016]. 이와 같이, 미니유전자는, 뉴런에서만 트랜스활성화인자의 발현을 가능하게 하기 위해, Nin 유전자의 엑손 17,18,19를 포함할 수 있다. 이 경우, 정지 코돈은, 엑손 18이 포함된 비-신경 세포에서 트랜스활성화인자 발현을 방지하기 위해, 미니유전자의 엑손 18로 조작되어 있다.
다른 대안으로서, 선택적으로 포함된 엑손의 스키핑은, 특정 질환 상태에 의해 유도될 수 있다. 예를 들면, 헌팅턴병은, 선택적 스플라이싱에 의해 생성된 전사물 이소형의 생성을 초래한다32. 이와 같이, 미니유전자는, 헌팅턴병에서 스플라이싱이 변경된 유전자로부터의 엑손을 포함할 수 있고, 즉, 돌연변이형 HTT가 발현되면, 통상은 건강한 세포에 포함되는 엑손이 대신에 스키핑될 수 있다. 정지 코돈은, 비-발병 세포에서 트랜스활성화인자가 생성되지 않는 것을 확실히 하기 위해, 선택적 스플라이싱된 엑손으로 조작할 수 있다. 그 결과, 트랜스활성화인자는, 돌연변이형 HTT가 존재할 경우에만 발현된다. 이 예에서, 표적 유전자는 돌연변이형 HTT의 발현을 녹다운시키는 억제성 RNA를 코딩하여, 자가조절 피드백 루프를 생성할 수 있고, 돌연변이형 HTT의 존재는, 돌연변이형 HTT를 표적화하는 억제성 RNA의 발현을 유도하여, 돌연변이형 HTT 수준을, 미니유전자의 스플라이싱을 비-발병 상태로 복귀하게 하는 수준으로 감소시키고, 이에 의해 억제성 RNA의 발현을 오프로 하고, 돌연변이형 HTT의 발현을 가능하게 하고, 이는 억제성 RNA의 발현 등을 유도하는 수준에 도달할 것이다. 또는, 표적 유전자는 HTT 유전자의 전사를 억제하는 CRISPR-Cas9 시스템을 코딩할 수 있다.
키메라 트랜스활성화인자 미니유전자의 발현은, 원하는 발현 패턴에 따라, 다양한 유형의 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, 프로모터는, 하우스 키핑 유전자(예를 들면, ACTB)의 프로모터 등의 보편적으로 구성되는 프로모터일 수 있다. 또 다른 예로서, 프로모터는, 뉴런 발현을 위한 시냅신(synapsin)의 프로모터 등의 세포형 특이적 프로모터일 수 있다. 또 다른 예로서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다.
키메라 트랜스활성화인자 미니유전자는, 미니유전자와 트랜스활성화인자 사이에 위치하는 절단가능한 펩티드를 가질 수 있다. 일부 경우에, 절단가능한 펩티드는, 예를 들면, 2A 펩티드 등의 자가 절단가능한 펩티드일 수 있다. 2A 펩티드는, T2A 펩티드, P2A 펩티드, E2A 펩티드 또는 F2A 펩티드일 수 있다. 이 펩티드의 존재는, 번역 후의 트랜스활성화인자 단백질로부터 미니유전자 코딩된 펩티드의 분리를 제공한다. 일부 경우에, 절단가능한 펩티드는, 예를 들면, 퓨린(furin), 프로-호르몬 전환효소 7(PC7), 쌍을 이룬 염기성 아미노산 절단 효소 4(PACE4) 또는 서브틸리신 케신 이소자임 2(SKI-1) 등의 광범위하게 발현된 내인성 엔도프로테아제에 대한 절단 부위일 수 있다. 일부 경우에, 절단가능한 펩티드는, 조직 특이적 또는 세포 특이적 엔도프로테아제(예를 들면, 프로-호르몬 전환효소 2(PC2; 주로 내분비 조직 및 뇌에서 발현됨), 프로-호르몬 전환효소 1/3(PC1/3; 주로 내분비 조직 및 뇌에서 발현됨), 프로-호르몬 전환효소 4(PC4; 주로 정소 및 난소에서 발현됨) 및 프로단백질 전환효소 서브틸리신 케신 9(PSCK9, 주로 폐 및 간에서 발현됨))에 대한 절단 부위일 수 있다.
또한, 본원에는 키메라 트랜스활성화인자 미니유전자가 개시되며, 여기서 미니유전자는 트랜스활성화인자의 코딩 서열에 삽입되고, 미니유전자의 선택적 스플라이싱은 트랜스활성화인자가 발현되는지 여부를 결정한다. 예를 들면, 엑손 4,10,11을 포함하는 MDM2 미니유전자는, 트랜스활성화인자의 코딩 서열에 삽입될 수 있다[참조: Shi et al, 2015]. 기저 상태에서는, 미니유전자의 엑손이 포함되어 있고, 이에 의해 트랜스활성화인자의 코딩 서열이 파괴된다. 미니유전자 엑손이 포함될 때에 유해한(deletrious) 단백질이 생성되지 않도록 하기 위해, 키메라 트랜스활성화인자 미니유전자는, 미니유전자 부분이 트랜스활성화인자 코딩 서열의 5' 말단 또는 그 부근에 위치하도록 조작될 수 있고, 정지 코돈이 미니유전자의 엑손 4로 조작될 수 있다. 트랜스활성화인자의 발현을 유도하기 위해, 스플라이싱 변형 분자(예: 수데마이신)를 사용하여, MDM2 미니유전자의 엑손 4,10,11의 스키핑을 유도한다. 마찬가지로, 세포형 특이적 또는 질환 상태 선택적 스플라이싱 이벤트를, 트랜스활성화인자의 코딩 서열에 삽입되는 미니유전자로서 사용할 수 있다.
또한, 본원에는 키메라 표적 유전자 미니유전자가 개시되고, 여기서 미니유전자는 표적 유전자의 코딩 서열에 삽입되고, 미니유전자의 선택적 스플라이싱은 표적 유전자의 발현 여부를 결정한다. 표적 유전자는, 억제성 RNA, CRISPR-Cas9 단백질 또는 치료 단백질을 코딩할 수 있다. 예를 들면, 엑손 4,10,11을 포함하는 MDM2 미니유전자는, 표적 유전자의 코딩 서열에 삽입될 수 있다[참조: Shi et al, 2015]. 기저 상태에서는, 미니유전자의 엑손이 포함되어 있고, 이에 의해 표적 유전자 코딩 서열이 파괴된다. 미니유전자 엑손이 포함될 때에 유해한 단백질이 생성되지 않도록 하기 위해, 키메라 표적 유전자 미니유전자는, 미니유전자 부분이 표적 유전자 코딩 서열의 5' 말단 또는 그 부근에 위치하도록 조작될 수 있고, 정지 코돈은 미니유전자의 엑손 4로 조작될 수 있다. 표적 유전자의 발현을 유도하기 위해, 스플라이싱 변형 분자(예: 수데마이신)를 사용하여, MDM2 미니유전자의 엑손 4,10,11의 스키핑을 유도한다. 마찬가지로, 세포형 특이적 또는 질환 상태 선택적 스플라이싱 이벤트를, 표적 유전자의 코딩 서열에 삽입되는 미니유전자로서 사용할 수 있다.
키메라 트랜스활성화인자 미니유전자 또는 키메라 표적 유전자 미니유전자가 트랜스활성화인자 코딩 서열 또는 표적 유전자 코딩 서열의 5' 말단에 삽입된 미니유전자를 갖는 경우, 선택적으로 포함된 엑손은, 필요한 번역 개시 조절 서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이, 절단가능한 펩티드는, 미니유전자 서열과 트랜스활성화인자 또는 표적 유전자 사이에 위치할 수 있다.
다른 유형의 선택적 스플라이싱 이벤트가 제안된 시스템에서도 또한 사용될 수 있다는 점에 유의한다. 예를 들면, 숙련된 기술자는 선택적 3' 스플라이스 부위 또는 선택적 5' 스플라이스 부위를, 선택적으로 스키핑되거나 포함된 엑손과 동일한 목적을 제공하도록 조작할 수 있음을 인식할 것이다. 마찬가지로, 유지된 인트론 스플라이싱 이벤트도 또한 그에 따라 조작될 수 있다.
I. 선택적 스플라이싱 조절을 위한 표적 유전자
A. 억제성 RNA
"RNA 간섭(RNAi)"은, siRNA에 의해 개시되는 서열-특이적, 전사후 유전자 사일런싱의 프로세스이다. RNAi의 동안, siRNA는 표적 mRNA의 분해를 유도하고, 그 결과, 유전자 발현이 서열 특이적으로 억제된다. 본 개시의 발현 시스템을 사용하여 발현을 억제할 수 있는 유전자의 예로는, HTT(헌팅턴병의 경우), SCA(척수소뇌 운동 실조증(1형, 2형, 3형, 6형, 7형)의 경우), FXTAS(취약 X 운동실조 증후군의 경우) 및 FMRP(취약 X의 경우)가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다.
"억제성 RNA", "RNAi", "작은 간섭 RNA" 또는 "짧은 간섭 RNA" 또는 "siRNA" 분자, "짧은 헤어핀 RNA" 또는 "shRNA" 분자, 또는 "miRNA"는, 목적의 핵산 서열로 표적화되는 뉴클레오티드의 RNA 이중쇄이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "siRNA"는 shRNA 및 miRNA의 서브세트를 포함하는 일반 용어이다. "RNA 이중쇄"는, RNA 분자의 2개 영역 사이의 상보적 쌍에 의해 형성된 구조를 지칭한다. siRNA는, siRNA의 이중쇄 부분의 뉴클레오티드 서열이 표적화된 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적이라는 점에서, 유전자에 "표적화"되어 있다. 특정 실시형태에서, siRNA는, 헌팅틴을 코딩하는 서열에 표적화된다. 일부 실시형태에서, siRNA의 이중쇄의 길이는 30개 염기쌍 미만이다. 일부 실시형태에서, 이중쇄는 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개의 염기쌍 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이중쇄의 길이는, 19 내지 25개의 염기쌍 길이이다. 특정 실시형태에서, 이중쇄의 길이는 19 또는 21개 염기쌍 길이이다. siRNA의 RNA 이중쇄 부분은 헤어핀 구조의 일부일 수 있다. 이중쇄 부분에 추가하여, 헤어핀 구조는 이중쇄를 형성하는 2개의 서열 사이에 위치하는 루프 부분을 포함할 수 있다. 루프의 길이는 상이할 수 있다. 일부 실시형태에서, 루프는 길이가 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 뉴클레오티드이다. 특정 실시형태에서, 루프는 길이가 18개 뉴클레오티드이다. 헤어핀 구조는 또한, 3' 및/또는 5' 오버행 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 오버행은 길이가 3' 및/또는 5' 오버행 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드이다.
shRNA는, 5' 인접 영역, siRNA 영역 세그먼트, 루프 영역, 3' siRNA 영역 및 3' 인접 영역을 포함하도록 설계된 스템-루프(stem-loop) 구조로 구성된다. 대부분의 RNAi 발현 전략은, 강력한 polIII 기반 프로모터에 의해 구동되는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)를 이용했다. 다수의 shRNA는, 시험관내 및 생체내에서 표적 서열의 효과적 녹다운을 입증했지만, 표적 유전자의 효과적 녹다운을 입증한 일부 shRNA는, 생체내에서 독성을 갖는 것도 밝혀졌다.
miRNA는, 전구체 스템 루프 전사물로부터 처리되는 작은 세포 RNA(~ 22nt)이다. 공지된 miRNA 스템 루프는 목적 유전자에 특이적인 RNAi 서열을 포함하도록 변형될 수 있다. miRNA는 내생적으로 발현되기 때문에, miRNA 분자가 shRNA 분자보다 더 바람직할 수 있다. 따라서, miRNA 분자는 dsRNA 반응성 인터페론 경로를 유도할 가능성이 낮고, shRNA보다 더 효율적으로 처리되며, 80% 더 효과적으로 사일런싱하는 것으로 밝혀졌다.
최근에 발견된 대안적 접근법은, RNAi 벡터로서 인공 miRNA(siRNA 서열을 셔플하는 pri-miRNA 스캐폴드)를 사용하는 것이다. 인공 miRNA는, 자연적으로 내인성 RNAi 기질과 유사하며, Pol-II 전사(예: RNAi의 조직 특이적 발현을 가능하게 함) 및 폴리시스트론 전략(예: 다중 siRNA 서열의 전달을 가능하게 함)에 더 잘 적용된다. 참조에 의해 도입된 미국 특허 제10,093,927호 참조.
"shRNA"의 전사 단위는, 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 루프에 의해 연결된 센스 및 안티센스 서열로 구성된다. shRNA는 Exportin-5에 의해 핵으로부터 수송되고, 세포질에 도입되면, 다이서(Dicer)에 의해 처리되어 기능적 siRNA를 생성한다. "miRNA" 스템 루프는, pre-miRNA로서 공지되어 있는 중간체를 생성하는 Drosha-DGCR8 복합체에 의해 소화되는, 보다 큰 일차 전사물(pri-miRNA)의 일부로서 통상 발현되는, 쌍을 이루지 않은 뉴클레오티드의 루프에 의해 연결된 센스 및 안티센스 서열로 구성되고, 이어서 Exportin-5에 의해 핵으로부터 전송되고, 세포질에 도입되면, 다이서(Dicer)에 의해 처리되어 기능적 siRNA를 생성한다. 본원에서 상호 교환적으로 사용되는 바와 같이, "인공 miRNA" 또는 "인공 miRNA 셔틀 벡터"는, 효과적 드로샤(Drosha) 프로세싱에 필요한 스템 루프 내에 구조적 요소를 유지하면서 표적 유전자의 siRNA 서열로 대체된 드로샤 및 다이서 처리를 통해 절제된 이중 스템 루프의 영역(최소 약 9-20개 뉴클레오티드)를 갖는 일차 miRNA 전사물을 지칭한다. 용어 "인공"은 인접 서열(상류 ~ 35개 뉴클레오티드 및 하류 ~ 40개 뉴클레오티드)이 siRNA의 다중 클로닝 부위 내의 제한 효소 부위로부터 발생한다는 사실에서 발생한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "miRNA"는, 자연에 존재하는 miRNA 서열과 인공적으로 생성된 miRNA 셔틀 벡터 둘 다를 포함한다.
siRNA는, 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있고, 핵산 서열은 또한 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 또한, 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리아데닐화 신호는 합성 최소 폴리아데닐화 신호 또는 6개의 T의 서열이다.
RNAi를 설계할 때, siRNA의 특성, 사일런싱 효과의 지속성, 및 전달 시스템의 선택 등, 고려해야 할 몇 가지 요인이 존재한다. RNAi 효과를 생성하기 위해, 생물에 도입되는 siRNA는 통상 엑손 서열을 포함한다. 또한, RNAi 프로세스는 상동성에 의존적이므로, 유전자 특이성 서열이 아닌 상동성 서열 간의 상호 간섭 가능성을 최소화하면서, 유전자 특이성을 극대화하도록 서열을 신중하게 선택해야 한다. 바람직하게는, siRNA는, siRNA의 서열과 억제될 유전자 사이에서 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 심지어 100% 이상의 동일성을 나타낸다. 표적 유전자와 약 80% 미만 동일한 서열은 실질적으로 덜 효과적이다. 그러므로, siRNA와 억제될 유전자 사이의 상동성이 높으면, 무관한 유전자의 발현이 영향을 받을 가능성이 낮아진다.
또한, siRNA의 크기는 중요한 고려 사항이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은, 적어도 약 19-25개의 뉴클레오티드를 포함하고, 유전자 발현을 조절할 수 있는 siRNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, siRNA는, 바람직하게는, 길이가 500, 200, 100, 50 또는 25개 뉴클레오티드 미만이다. 더 바람직하게는, siRNA는 길이가 약 19개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드이다.
siRNA 표적은, 일반적으로, 폴리펩티드를 코딩하는 영역, 또는 폴리펩티드의 발현에 중요한 복제, 전사 또는 번역 또는 다른 프로세스를 조절하는 폴리뉴클레오티드 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 영역 및 발현을 조절하는 이에 작동적으로 연결된 영역 둘 다를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 세포에서 발현되는 임의의 유전자를 표적화할 수 있다. 바람직하게는, 표적 유전자는, 질환에 중요하거나 연구 대상으로서 특히 관심이 있는 세포 활동의 진행에 관여하거나 이와 관련된 유전자이다.
B. CRISPR 시스템
유전자 편집은, 살아있는 세포 내에서 표적 유전자의 변형을 가능하게 하는 기술이다. 최근, CRISPR의 세균 면역 시스템을 이용하여 주문형 유전자 편집을 수행하는 것은, 과학자들이 게놈 편집에 접근하는 방식에 혁명을 일으켰다. RNA 가이드 DNA 엔도뉴클레아제인 CRISPR 시스템의 Cas9 단백질은, 가이드 RNA 서열을 변경하여, 비교적 간단하게 새로운 부위를 표적화하도록 조작될 수 있다. 이 발견은 서열 특이적 유전자 편집을 기능적으로 효과적으로 되게 했다.
일반적으로, "CRISPR 시스템"은 Cas 유전자, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예: tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열("직접 반복" 및 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 tracrRNA-처리된 부분적 직접 반복을 포함), 가이드 서열(또한 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로서 지칭됨) 및/또는 CRISPR 유전자좌로부터의 다른 서열 및 전사물)을 코딩하는 서열을 포함하여, CRISPR-연관("Cas") 유전자의 발현 또는 활성을 지시하는 것에 관여하는 전사물 및 기타 요소를 총칭한다. 본 개시의 CRISPR 발현 시스템을 사용하여 발현이 억제될 수 있거나 서열이 편집될 수 있는 유전자의 예는 HTT(헌팅턴병의 경우), SCA(척수소뇌 실조증(1형, 2형, 3형, 6형, 7형), FXTAS(취약 X 운동실조 중후군의 경우), 및 FMRP(취약 X의 경우)를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은, DNA에 서열 특이적으로 결합하는 비-코딩 RNA 분자(가이드) RNA 및 뉴클레아제 기능성(예를 들면, 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질(예를 들면, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는, 예를 들면, I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템, 예를 들면, 스트렙토콕쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 등의 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 생물로부터 유래할 수 있다.
CRISPR 시스템은, 표적 부위에서 이본쇄 절단(DSB)을 유도하고, 이어서 본원에서 논의된 바와 같이 파괴될 수 있다. 다른 실시형태에서, "닉카제"로 간주되는 Cas9 변이체를 사용하여, 표적 부위에서 일본쇄에 닉(nick)을 도입한다. 쌍을 이룬 닉카제를 사용하여, 예를 들면, 특이성을 개선시킬 수 있고, 각각이, 닉을 동시에 도입하면, 5' 오버행이 도입되도록, 서열을 표적화하는 한 쌍의 상이한 gRNA에 의해 지시된다. 다른 실시형태에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9는, 유전자 발현에 영향을 미치기 위해, 전사 억제인자(예를 들면, KRAB) 또는 활성화인자 등의 이종 이펙터 도메인에 융합된다. 또는, 촉매적으로 불활성화된 Cas9를 갖는 CRISPR 시스템은, 리보솜 결합 단백질에 융합시킨 전사 억제인자 또는 활성화인자를 추가로 포함한다.
일부 국면에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA(표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합을 포함)가 세포에 도입된다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단의 표적 부위는, 상보적 염기 쌍을 사용하여, Cas 뉴클레아제를 표적 부위, 예를 들면, 유전자로 표적화한다. 표적 부위는, 전형적으로 NGG 또는 NAG 등의 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 즉시 5' 위치에 기초하여 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는, 가이드 RNA의 최초 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 또는 10개 뉴클레오티드를 표적 DNA 서열에 대응하도록 변형함으로써 원하는 서열을 표적화한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은, 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. 전형적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 사이의 하이브리드화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 하이브리드화를 유발하고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면, 완전한 상보성은 반드시 필요한 것은 아니다.
표적 서열은, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드 등의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 서열은, 세포의 소기관 등, 세포의 핵 또는 세포질에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적 유전자좌로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오티드" 또는 "편집 서열"로 지칭된다. 일부 국면에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오티드는 편집 주형으로 지칭될 수 있다. 일부 국면에서, 재조합은 상동성 재조합이다.
전형적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체의 형성(표적 서열에 하이브리드화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함)은 하나 또는 둘 다의 가닥을 표적 서열 내 또는 근처(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50 또는 그 이상의 염기 쌍 이내)에서 절단한다. 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있는 tracr 서열(예를 들면, 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 이상 뉴클레오티드의 야생형 tracr 서열)은 또한, 예를 들면, tracr 서열의 적어도 일부를 따라 가이드 서열에 작동적으로 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부에 하이브리드화함으로써 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수도 있다. tracr 서열은, tracr 메이트 서열에 대한 충분한 상보성, 최적으로 정렬될 때에 tracr 메이트 서열 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 갖고, 하이브리드화하여 CRISPR 복합체의 형성에 관여한다.
CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터는, CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하도록 세포 내로 도입될 수 있다. 성분은 또한, 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들면, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각, 별도의 벡터상의 개별 조절 요소에 작동적으로 연결될 수 있다. Cas 효소는, 본원에 개시된 바와 같이, 키메라 표적 유전자 미니유전자로서 또는 키메라 미니유전자 트랜스활성화인자에 대한 표적 유전자로서, 조절된 선택적 스플라이싱 이벤트의 조절하에 표적 유전자일 수 있다. gRNA는 구성적 프로모터의 조절하에 있을 수 있다.
또는, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 2개 이상의 요소를 단일 벡터에 조합시켜, 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 구성요소를 제공하는 하나 이상의 추가 벡터를 이용할 수도 있다. 벡터는, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열("클로닝 부위"라고도 지칭됨) 등의 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 삽입 부위는, 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 복수의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물을 사용하여, 세포 내의 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화할 수 있다.
벡터는, Cas 단백질 등의 CRISPR 효소를 코딩하는 효소 코딩 서열에 작동적으로 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적 예는 Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csnl 및 Csxl2로도 공지됨), CaslO, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, CsxlO, Csx3, CsxlO, Csx6, CsaX, Csf2, Csf3, Csf4, 이들의 상동체, 또는 이들의 변형된 버전을 포함한다. 이러한 효소는 공지되어 있다. 예를 들면, 에스. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2로 스위스프롯(SwissProt) 데이터베이스에서 발견할 수 있다.
CRISPR 효소는 Cas9(예: 에스 피오게네스(S. pyogenes) 또는 에스. 뉴모니아(S. pneumonia))일 수 있다. CRISPR 효소는, 표적 서열내 및/또는 표적 서열의 보체(complement)내 등의 표적 서열의 위치에서 한쪽 또는 양쪽 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 벡터는, 상응하는 야생형 효소와 관련하여 돌연변이된 CRISPR 효소를 코딩할 수 있고, 그 결과 돌연변이된 CRISPR 효소는 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽 가닥을 절단하는 능력을 결여한다. 예를 들면, 에스. 피오게네스(S. pyogenes)에서 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인의 아스파르테이트-알라닌 치환(D10A)은, Cas9를 양쪽 가닥을 절단하는 뉴클레아제로부터 닉카제로 전환한다(일본쇄 절단). 일부 실시형태에서, Cas9 닉카제는, 가이드 서열(들), 예를 들면, 2개의 가이드 서열과 조합하여 사용될 수 있고, 이는 각각 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 표적화한다. 이 조합은, 양쪽 가닥에 닉을 도입하여, NHEJ 또는 HDR을 유도하기 위해 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, CRISPR 효소를 코딩하는 효소 코딩 서열은, 진핵 세포 등의 특정 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 래트, 래빗, 개 또는 비인간 영장류를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 포유동물 등의 특정 생물의 세포이거나 그로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는, 천연 서열의 적어도 하나의 코돈을, 천연 아미노산 서열을 유지하면서 해당 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번히 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 치환하여 목적 숙주 세포에서 발현을 증강하기 위해 핵산 서열을 변형시키는 프로세스를 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 바이어스를 나타내고, 코돈 바이어스(생물간의 코돈 사용빈도의 차이)는 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율성과 관련이 있으며, 이는, 그 중에서도, 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전사 RNA(tRNA) 분자의 이용가능성에 의존하는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영하고 있다. 따라서, 유전자는, 코돈 최적화를 기반으로, 소정 생물에서 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.
일반적으로, 가이드 서열은, 표적 서열과 하이브리드화하고, 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하기에 충분한 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시형태에서, 가이드 서열과 그에 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는, 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬시키는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상이다.
최적 정렬은, 서열을 정렬하기 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있으며, 이의 비제한적 예에는 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들맨-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 부로우스-휠러(Burrows-Wheeler) 변환에 기반한 알고리즘(예: Burrows Wheeler Aligner), 클루스탈 더블유(Clustal W), 클루스탈 엑스(Clustal X), BLAT, 노보얼라인(Novoalign)(Novocraft Technologies), ELAND(Illumina, San Diego, Calif.), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능) 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능)를 포함한다.
CRISPR 효소는, 하나 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은, 임의의 추가 단백질 서열 및 임의로 임의의 2개 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는, 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열 및 하기 활성 중의 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적 예에는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 혈구응집소(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그가 포함된다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-5-트랜스페라제(GST), 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제(CAT) 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)를 포함한 자가형광 단백질을 포함한다. CRISPR 효소는, 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합물, GAL4A DNA 결합 도메인 융합물 및 단순 헤르페스 바이러스(HSV) BP 16 단백질 융합물을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 DNA 분자에 결합하거나 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성하는 추가 도메인은, 본원에 참조로서 도입되는 US 제20110059502호에 기재되어 있다.
C. 치료 단백질
일부 실시형태는 재조합 단백질 및 폴리펩티드의 발현에 관한 것이다. 본 개시의 발현 시스템을 사용하여 발현될 수 있는 단백질의 예는, 이들로 한정되지 않지만, STXBP1(Muncl8-1로도 공지됨; STXBP1 결핍의 경우, 신생아 간질의 형태, 발달 지연의 형태), SCNla(유전적 간질성 뇌증으로도 공지되고, 중증 유아기 근간 대성 간질(SMEI)로도 공지되어 있는 드라벳 증후군의 경우; Nav1.1의 돌연변이); SCNlb(Nav1 베타 아단위의 돌연변이); SCN2b(가족성 심방 세동의 경우, 유형 II 전위 의존성 나트륨 채널의 베타 2 아단위); KCNA1(우세 유전성 일시적 운동실조증, 운동실조의 유무에 관계없이 경직을 수반하는 근육 경련); KCNQ2(KCNQ2 관련 간질); GABRB3(초기 발병 간질; GABAA 수용체의 β3 아단위); CACNA1A(가족성 운동실조 및 편마비성 편두통의 경우, P/Q형 전위 의존성 칼슘 채널의 막관통 기공 형성 아단위); CHRNA2(상 염색체 우성 야행성 전두엽 간질의 경우, 뉴런 니코틴성 콜린작용성 수용체(nAChR)의 알파 아단위); KCNT1(상 염색체 우성 야간 전두엽 간질(ADNFLE) 및 유아기의 악성 이동성 부분 발작(MMPSI); 나트륨 활성화 칼륨 채널); SCN8A(간질 및 신경발달 장애의 경우, Navl.6 결핍, 전위 의존성 나트륨 채널); CHRNA4-알파 아단위(상 염색체 우성 야행성 전두엽 간질의 경우, 니코틴성 아세틸콜린 수용체의 알파 아단위의 돌연변이); CHRNB2-b2 아단위(상 염색체 우성 야행성 전두엽 간질의 경우, 니코틴성 아세틸콜린 수용체의 알파 아단위의 돌연변이); ARX(오토하라 증후군의 경우, ARX 유전자의 polyAla 확장); MECP1(레트(Rett) 증후군의 경우); FMRP(취약 X의 경우); 및 CLN3(CLN-질환의 경우, 청소년 형태의 바텐 질환(Batten's disease)로도 공지되고, JNCL로도 공지됨)를 포함한다. 본 개시의 발현 시스템을 사용하여 발현될 수 있는 단백질의 다른 예는 문헌[참조: Lindy et al.(2018) 및 Heyne et al.(2018)]에서 발견할 수 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 도입된다.
일부 국면에서, 단백질 또는 폴리펩티드는, 혈청 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 본 출원이 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드"의 기능 또는 활성을 언급하는 경우, 당업자는 이것이, 예를 들면, 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드와 비교하여 추가 이점을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다는 것을 이해할 것이다. "변형된 단백질"에 관한 실시형태는 "변형된 폴리펩티드"와 관련하여 실시될 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다는 것이 구체적으로 고려된다.
재조합 단백질은, 아미노산의 결실 및/또는 치환을 가질 수 있으며; 따라서, 결실된 단백질, 치환된 단백질, 결실 및 치환된 단백질은 변형된 단백질이다. 일부 실시형태에서, 이들 단백질은, 예를 들면, 융합 단백질 또는 링커를 갖는 단백질 등을 사용하여 삽입 또는 부가된 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은, 천연 단백질의 하나 이상의 잔기가 결여되어 있지만, 천연 단백질의 특이성 및/또는 활성을 가질 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 또한, 감소된 면역원성 또는 항원성을 가질 수 있다. 변형된 결실 단백질의 예는, 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 변형된 단백질이 투여될 수 있는 생물 유형 등의 특정 생물에서 항원성으로 결정된 단백질의 영역으로부터 결실된 아미노산 잔기를 갖는 단백질이다.
치환 또는 대체 변이체는, 전형적으로, 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 한 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 교환을 포함하고, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 특히 이펙터 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수도 있고, 그렇지 않을 수도 있고, 즉 하나의 아미노산이 유사한 형상 및 전하의 것으로 치환되어 있다. 보존적 치환은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들면, 알라닌에서 세린으로; 아르기닌에서 라이신으로; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘으로; 아스파르테이트에서 글루타메이트로; 시스테인에서 세린으로; 글루타민에서 아스파라긴으로; 글루타메이트에서 아스파르테이트로; 글리신에서 프롤린으로; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민으로; 이소류신에서 류신 또는 발린으로; 류신에서 발린 또는 이소류신으로; 라이신에서 아르기닌으로; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신으로; 페닐알라닌에서 티로신, 류신 또는 메티오닌으로; 세린에서 트레오닌으로; 트레오닌에서 세린으로; 트립토판에서 티로신으로; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌으로; 및 발린에서 이소류신 또는 류신으로의 변화를 포함한다.
결실 또는 치환에 추가하여, 변형된 단백질은 전형적으로 잔기의 삽입을 가질 수 있고, 이는 전형적으로 폴리펩티드에 적어도 하나의 잔기의 부가를 포함한다. 여기에는, 표적화 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단순히 단일 잔기의 삽입이 포함될 수 있다. 융합 단백질이라고 불리우는 말단 부가는 아래에서 설명한다.
용어 "생물학적 기능적 등가물"은 당업계에서 충분히 이해되고, 본원에서 추가로 상세하게 정의된다. 따라서, 단백질의 생물학적 활성이 유지되는 한, 대조군 폴리펩티드의 아미노산과 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산의 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%, 또는 심지어 약 91% 내지 약 99%를 갖는 서열이 포함된다. 재조합 단백질은, 특정 국면에서 천연 대응물과 생물학적으로 기능적으로 동등할 수 있다.
또한, 아미노산 및 핵산 서열은, 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열 등의 추가 잔기를 포함할 수 있지만, 여전히 단백질 발현과 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하여, 서열이 상기에 제시된 기준을 충족하는 한, 본원에 개시된 서열 중의 하나에 기재된 것과 본질적으로 같다는 것을 이해할 것이다. 말단 서열의 추가는, 예를 들면, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분 중의 어느 하나에 인접하는 다양한 비-코딩 서열을 포함할 수 있거나, 다양한 내부 서열, 즉, 유전자 내에서 발생하는 것으로 공지된 인트론을 포함할 수 있는 핵산 서열에 특히 적용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 펩티드는 일반적으로 약 200개 이상의 아미노산, 최대 유전자로부터 번역된 전장 서열로 구성된 단백질; 약 100개 이상의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개 아미노산의 펩티드를 지칭하지만, 이들로 한정되지 않는다. 편의상, 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는, 임의의 천연 존재 아미노산, 임의의 아미노산 유도체 또는 당업계에 공지된 임의의 아미노산 모방체를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기는 아미노산 잔기의 서열을 중단하는 임의의 비-아미노산 없이 연속적이다. 다른 실시형태에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다.
따라서, 용어 "단백질 또는 펩티드"는 천연 존재 단백질에서 발견되는 20개의 공통 아미노산 중의 적어도 하나, 또는 적어도 하나의 변형된 또는 비정상적 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 특정 실시형태는 융합 단백질에 관한 것이다. 이들 분자는 N- 또는 C-말단에서 이종 도메인에 연결된 치료 단백질을 가질 수 있다. 예를 들면, 융합은 또한, 다른 종의 리더 서열(leader sequence)을 사용하여, 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 가능하게 할 수 있다. 또 다른 유용한 융합은, 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해, 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개의 히스티딘 잔기 등의 단백질 친화성 태그, 또는 항체 에피토프 등의 면역학적 활성 도메인(바람직하게는 절단가능한)의 추가를 포함한다. 비제한적 친화성 태그에는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 글루타티온-S-트랜스페라제(GST)가 포함된다.
융합 단백질을 생성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 단백질은, 예를 들면, 완전한 융합 단백질의 드 노보 합성에 의해, 또는 이종 도메인을 코딩하는 DNA 서열의 부착, 이어서 무손상 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다.
모 단백질의 기능적 활성을 회복하는 융합 단백질의 생산은, 탠덤으로 연결된 폴리펩티드 사이에 스플라이싱되는 펩티드 링커를 코딩하는 브릿징 DNA 세그먼트와 유전자를 연결함으로써 촉진될 수 있다. 링커는, 생성된 융합 단백질의 적절한 폴딩을 가능하게 하기에 충분한 길이일 것이다.
II. 스플라이싱 변형인자
대표적인 스플라이스 변형인자는, 혈액 뇌 장벽을 관통할 수 있는, 하기 구조를 갖는 LMI070(Spinraza ™, Novartis,31)이다:
Figure pct00004
신규 엑손이 LMI070의 존재하에서만 포함되고, 본 개시의 시스템에서 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있는 선택적 스플라이싱 이벤트의 예에는 이하가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다: SF3B3(chr16:70,526,657-70,529,199), BENC1(chr17:42,810,759-42,811,797), GXYLT1(chr12:42,087,786-42,097,614), SKP1(chr5:134,173,809-134,177,053), C12orf4(chr12:4,536,017-4,538,508), SSBP1(chr7:141,739,167-141,742,229), RARS(chr5:168,517,815-168,519,190), PDXDC2P(chr16:70,030,988-70,031,968), STRADB(chr2:201,469,953-201,473,076), WNK1(chr12:894,562-896,732), WDR27(chr6:169,660,663-169,662,424), CIP2A(chr3:108,565,355-108,566,638), IFT57(chr3:108,191,521-108,206,696), WDR27(chr6:169,660,649-169,662,458), HTT(chr4:3,212,555-3,214,145), SKA2(chr17:59,112,228-59,119,514), EVC(chr4:5,733,318-5,741,822), DYRK1A(chr21:37,420,144-37,473,056), GNAQ(chr9:77,814,652-77,923,557), ZMYM6(chr1:35,019,257-35,020,472), CYB5B(chr16:69,448,031-69,459,160), MMS22L(chr6:97,186,342-97,229,533), MEMO1(chr2:31,883,262-31,892,301) 및 PNISR(chr6:99,416,278-99,425,413). 신규 엑손의 포함이 LMI1070의 존재에 의해 증강되고, 본 개시의 시스템에서 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있는 선택적 스플라이싱 이벤트의 예에는 이하가 포함되지만, 이들로 한정되지 않는다: CACNA2D1(chr7:82,066,406-82,084,958), SSBP1(chr7:141,739,083-141,742,248), DDX42(chr17:63,805,048-63,806,672), ASAP1(chr8:130,159,817-130,167,688), DUXAP10(chr14:19,294,564-19,307,199), AVL9(chr7:32,558,783-32,570,372), DYRK1A(chr21:37,419,920-37,472,960), FAM3A(chrX:154,512,311-154,512,939), FHOD3(chr18:36,740,620-36,742,886), TBCA(chr5:77,707,994-77,777,000), MZT1(chr13:72,718,939-72,727,611), LINC01296(chr14:19,092,877-19,096,652), SF3B3(chr16:70,541,627-70,544,553), SAFB(chr19:5,654,060-5,654,457), GCFC2(chr2:75,702,163-75,706,652), MRPL45(chr17:38,306,450-38,319,088), SPIDR(chr8:47,260,788-47,280,196), DUXAP8(chr22:15,815,315-15,828,713), PDXDC1(chr16:15,008,772-15,009,763), MAN1A2(chr1:117,442,104-117,461,030), RAF1(chr3:12,600,376-12,604,350) 및 ERGIC3(chr20:35,548,787-35,554,452). 상기 목록의 경우, 각 게놈 위치에는 상류와 하류의 엑손, 및 LMI070에 의해 표적화된 개재 인트론 서열이 포함된다.
사용될 수 있는 LMI070 등의 스플라이스 변형인자의 유사체, 예를 들면, 6-(나프탈렌-2-일)-N-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 6-(벤조[b]티오-펜-2-일)-N-메틸-N-(2,2,6,6-테트라-메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 2-(6-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일아미노)-피리다진-3-일)페놀; 2-(6-(메틸-(2,2,6,6-테트라-메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)벤조[b]-티오펜-5-카보니트릴; 6-(퀴놀린-3-일)-N-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 3-(벤조[b]-티오펜-2-일)-6-(2,2,6,6-테트라-메틸피페리딘-4-일옥시)피리다진e; 2-(6-(메틸-(2,2,6,6-테트라-메틸피페리딘-4-일)아미노)-피리다진-3-일)페놀; 6-(6-(메틸-(2,2,6,6-테트라-메틸피페리딘-4-일)아미노)-피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 6-(벤조[b]-티오펜-2-일)-N-(2,2,6,6-테트라-메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 7-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)이소퀴놀린; 6-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)이소퀴놀린; N-메틸-6-(퀴놀린-7-일)-N-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; N-메틸-6-(퀴놀린-6-일)-N-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 6-(이소퀴놀린-7-일)-N-메틸-N-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 6-(이소퀴놀린-6-일)-N-메틸-N-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 6-(이미다조[1,2-a]피리딘-6-일-피리다진-3-일)-메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아민; 메틸-[6-(6-페닐-피리딘-3-일)-피리다진-3-일]-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아민; 메틸-[6-(6-피롤-1-일-피리딘-3-일)-피리다진-3-일]-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아민; 메틸-[6-(6-피라졸-1-일-피리딘-3-일)-피리다진-3-일]-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아민; 메틸-(6-퀴녹살린-2-일-피리다진-3-일)-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아민; 메틸-(6-퀴놀린-3-일-피리다진-3-일)-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아민; N-메틸-6-(프탈아진-6-일)-N-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 6-(벤조[c][1,2,5]옥사-디아졸-5-일)-N-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 6-(벤조[d]티아졸-5-일)-N-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 6-(2-메틸벤조-[d]옥사졸-6-일)-N-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 5-클로로-2-(6-(메틸(1,2,2,6,6-펜타메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 3-(6-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 5-클로로-2-(6-(1,2,2,6,6-펜타메틸피페리딘-4-일아미노)피리다진-3-일)페놀; 4-하이드록시-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)벤조니트릴; 3-[6-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일옥시)-피리다진-3-일]-나프탈렌-2-올; 2-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]-피리다진-3-일}-4-트리플루오로메틸-페놀; 2-플루오로-6-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]-피리다진-3-일}-페놀; 3,5-디메톡시-2-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]-피리다진-3-일}-페놀; 4,5-디메톡시-2-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]-피리다진-3-일}-페놀; 5-메톡시-2-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]피리다진-3-일}-페놀; 4,5-디플루오로-2-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]-피리다진-3-일}-페놀; 5-플루오로-2-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]-피리다진-3-일}-페놀; 3-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)벤조니트릴; 1-알릴-6-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 6-(벤조[b]티오펜-2-일)-N-(1,2,2,6,6-펜타메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; N-알릴-3-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)벤즈아미드; 2-(6-(메틸 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; 5-(5-메틸-옥사졸-2-일)-2-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]피리다진-3-일}-페놀; 5-(4-하이드록시메틸)-1H-피라졸-1-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(1H-이미다졸e-1-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(4-아미노-1H-피라졸-1-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(4-아미노-1H-피라졸-1-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(3-아미노-피라졸-1-일)-2-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]피리다진-3-일}-페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1-(2-모르폴리노-에틸)-1H-피라졸-4-일)페놀; 2-(6-(메틸 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)페놀; 5-(5-아미노-1H-피라졸-1-일)-2-(6-(메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 2-(6-(메틸 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-4-(1H-피라졸-1-일)페놀; 2-{6-[(2-하이드록시-에틸)-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]피리다진-3-일}-5-피라졸-1-일-페놀; 2-(6-(피페리딘-4-일옥시)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; 2-(6-(((2S,4R,6R)-2,6-디메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; 2-(6-((-2,6-디메틸 피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; 2-(6-((-2,6-디메틸 피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; 5-(1H-피라졸-1-일)-2-(6-(피롤리딘-3-일옥시)피리다진-3-일)페놀; 2-(6-((-2-메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; (S)-5-(1H-피라졸-1-일)-2-(6-(피롤리딘-3-일메톡시)피리다진-3-일)페놀; (R)-5-(1H-피라졸-1-일)-2-(6-(피롤리딘-3-일메톡시)피리다진-3-일)페놀; 2-(6-((3-플루오로피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)-페놀; 2-[6-(1,2,2,6,6-펜타메틸-피페리딘-4-일옥시)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 5-피라졸-1-일-2-[6-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일옥시)-피리다진-3-일]-페놀; 5-(1H-피라졸-4-일)-2-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)페놀; 2-(6-피페라진-1-일-피리다진-3-일)-5-피라졸-1-일-페놀; 3-[6-(아제티딘-3-일아미노)-피리다진-3-일]-나프탈렌-2-올; 2-[6-(아제티딘-3-일아미노)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(3,5-디메틸-피페라진-1-일)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(7-메틸-2,7-디아자-스피로[4.4]논-2-일)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-(6-[1,4]디아제판-1-일-피리다진-3-일)-5-피라졸-1-일-페놀; 2-{6-[4-(2-하이드록시-에틸)-피페라진-1-일]-피리다진-3-일}-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(3,6-디아자-바이사이클로[3.2.1]옥트-3-일)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(2,7-디아자-스피로[3.5]논-7-일)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(3-하이드록시-메틸-피페라진-1-일)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(1,7-디아자-스피로[4.4]논-7-일)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(4-아미노-4-메틸-피페리딘-1-일)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(3-디메틸-아미노-피페리딘-1-일)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(1,2,2,6,6-펜타메틸-피페리딘-4-일아미노)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-[6-(3,3-디메틸-피페라진-1-일)-피리다진-3-일]-5-피라졸-1-일-페놀; 2-(6-(7-(2-하이드록시에틸)-2,7-디아자스피로[4.4]-노난-2-일)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; 2-(6-((3aR,6aS)-헥사하이드로피롤로[3,4-c]피롤-2(1H)-일)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; 3-(6-(피페라진-1-일)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; 5-피라졸-1-일-2-[6-(1,2,3,6-테트라하이드로-피리딘-4-일)-피리다진-3-일]-페놀; 2-(6-피페리딘-4-일-피리다진-3-일)-5-피라졸-1-일-페놀; 3-(6-(1,2,3,6-테트라-하이드로피리딘-4-일)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 3-(6-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; 3-(6-(2,2,6,6-테트라메틸-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; 3-(6-(1-메틸-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; 3-(6-(피페리딘-4-일)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; 3-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; 3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; 3-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; [3-(7-하이드록시-6-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]-피리다진-3-일}-나프탈렌-2-일옥시)-프로필]-카밤산 3급-부틸 에스테르; 7-(3-아미노-프로폭시)-3-{6-[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]-피리다진-3-일}-나프탈렌-2-올; N-[3-(7-하이드록시-6-{6[메틸-(2,2,6,6-테트라메틸-피페리딘-4-일)-아미노]-피리다진-3-일}-나프탈렌-2-일옥시)-프로필]-아세트아미드; 7-(3-하이드록시프로폭시)-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 7-(3-메톡시프로폭시)-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 7-(2-모르폴리노에톡시)-3-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 3-(6-(피페리딘-4-일메틸)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 5-(1H-피라졸-1-일)-2-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)메틸)피리다진-3-일)페놀; 3-메톡시-2-(6-(메틸 (2,2,6-트리메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(5-메틸옥사졸-2-일)페놀; 2-(6-((6S)-6-((S)-1-하이드록시에틸)-2,2-디메틸피페리딘-4-일옥시)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; 7-하이드록시-6-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-2-나프토니트릴; 3-(6-(메틸 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-7-(피페리딘-1-일메틸)나프탈렌-2-올; 3-(6-(메틸 (2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-7-(피롤리딘-1-일메틸)나프탈렌-2-올; 1-브로모-6-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; 1-클로로-6-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2,7-디올; 7-메톡시-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 7-메톡시-3-(6-(메틸(1,2,2,6,6-펜타메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 7-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-7-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)나프탈렌-2-올; 7-(디플루오로메틸)-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 7-((4-하이드록시-2-메틸부탄-2-일)옥시)-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 7-(3-하이드록시-3-메틸부톡시)-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)나프탈렌-2-올; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)벤젠-1,3-디올; 3-메톡시-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)페놀; 5-(1H-피라졸-4-일)-2-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-3-(트리플루오로메톡시)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)-3-(트리플루오로메톡시)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)-3-(트리플루오로메톡시)페놀; 4-(3-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(트리플루오로메톡시)페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온; 3-메톡시-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)페놀; 3-메톡시-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피리딘-3-일)페놀; 3-메톡시-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(피리딘-3-일)페놀; 5-(1-사이클로펜틸-1H-피라졸-4-일)-3-메톡시-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 3',5-디메톡시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-[1,1'-비페닐]-3-올; 3-(벤질옥시)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(5-메틸옥사졸-2-일)페놀; 3-에톡시-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(5-메틸옥사졸-2-일)페놀; 3-(사이클로프로필메톡시)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)-피리다진-3-일)-5-(5-메틸옥사졸-2-일)페놀; 2-메틸-5-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-1H-벤조[d]이미다졸-6-올; 5-클로로-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(1H-피라졸-1-일)-2-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 3-하이드록시-4-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)벤조니트릴; 2-(6-((2,2-디메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-1-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-4-(1H-피라졸-4-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-4-(4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피리딘-3-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-4-(4,5,6,7-테트라하이드로피라졸로[1,5-a]피라진-3-일)페놀; 4-(1H-인돌-2-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 4-(사이클로펜트-1-엔-1-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-4-(1H-피라졸-3-일)페놀; 4-(4-하이드록시-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)피리딘-2-올; 4-(4-하이드록시-3-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온; 4-(4-하이드록시-3-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)페닐)피리딘-2-올; 5-(1H-인다졸-7-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 4-클로로-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)페놀; 4-플루오로-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)페놀; 5-플루오로-4-(1H-이미다졸-4-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-플루오로-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-4-(1H-피라졸-4-일)페놀; 5-플루오로-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-4-(1H-피라졸-5-일)페놀; 6-하이드록시-5-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온; 6-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-1,4-디하이드로인데노[1,2-c]피라졸-7-올; 6-하이드록시-5-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온 옥심 하이드로클로라이드 염; 5-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-2,3-디하이드로-1H-인덴-1,6-디올; 2-아미노-6-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-8H-인데노[1,2-d]티아졸-5-올 하이드로클로라이드 염; 9-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5,6-디하이드로이미다조[5,1-a]이소퀴놀린-8-올 하이드로클로라이드 염; 4-하이드록시-3-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-N-((1-메틸-1H-피라졸-4-일)메틸)벤즈아미드; 4-(4-(하이드록시메틸)-1H-피라졸-1-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(1H-피라졸-4-일)-2-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)메틸)피리다진-3-일)페놀; 6-(3-(벤질옥시)이소퀴놀린-6-일)-N-메틸-N-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 6-(1-(벤질옥시)이소퀴놀린-7-일)-N-메틸-N-(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)피리다진-3-아민; 3-플루오로-5-(2-메톡시피리딘-4-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀 하이드로클로라이드 염; 4-(3-플루오로-5-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)피리딘-2(1H)-온 하이드로클로라이드 염; 4-(3-플루오로-5-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온 하이드로클로라이드 염; 5-(3-플루오로-5-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온 하이드로클로라이드 염; 3-플루오로-5-(1H-피라졸-4-일)-2-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)페놀 하이드로클로라이드 염; 5-클로로-3-플루오로-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀 하이드로클로라이드 염; 3-플루오로-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)페놀 하이드로클로라이드 염; 3-플루오로-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)페놀 하이드로클로라이드 염; 5-(5-메톡시피리딘-3-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(3-하이드록시-4-(6-메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)피리딘-2-올; 4-(3-하이드록시-4-(6-메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)피리딘-2-올; 5-(6-메톡시피리딘-3-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(3-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)-3-(트리플루오로메틸)피리딘-2-올; 5-(3-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온; 4-(3-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온; 5-(2-메톡시피리딘-4-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 4-(3-하이드록시-4-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)페닐)피리딘-2-올; 5-(6-(디메틸아미노)피리딘-3-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 4-(3-하이드록시-4-(6-((2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)옥시)피리다진-3-일)페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(피리미딘-5-일)페놀; 5-(3-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)피리딘-3-올; 1-사이클로프로필-4-(3-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)피리딘-2(1H)-온; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1,2,3,6-테트라하이드로피리딘-4-일)페놀; 5-(사이클로펜트-1-엔-1-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(3,6-디하이드로-2H-피란-4-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(이미다조[1,5-a]피리딘-7-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(이미다조[1,2-a]피리딘-7-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(2-메틸피리딘-4-일)페놀; 5-(1H-이미다졸-2-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(1H-이미다졸-4-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 5-(이미다조[1,2-a]피라진-3-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(5,6,7,8-테트라하이드로이미다조[1,2-a]피라진-3-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1-메틸-1H-이미다졸-4-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(1-메틸-1H-이미다졸-5-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(4-니트로-1H-이미다졸-2-일)페놀; 2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)-5-(2-메틸-1H-이미다졸-4-일)페놀; 5-(1,2-디메틸-1H-이미다졸-4-일)-2-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페놀; 1-(3-하이드록시-4-(6-(메틸(2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-4-일)아미노)피리다진-3-일)페닐)-1H-피라졸-4-카복스아미드; 2-(6-((3aR,6aS)-5-(2-하이드록시에틸)헥사하이드로피롤로[3,4-c]피롤-2(1H)-일)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)페놀; 2-(6-((3aR,6aS)-헥사하이드로피롤로[3,4-c]피롤-2(1H)-일)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)페놀; 2-(6-((3aR,6aS)-5-메틸헥사하이드로피롤로[3,4-c]피롤-2(1H)-일)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)페놀; 4-(3-하이드록시-4-(6-(5-메틸헥사하이드로피롤로[3,4-c]피롤-2(1H)-일)피리다진-3-일)페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온; 4-(3-하이드록시-4-(6-((3aR,6aR)-1-메틸헥사하이드로피롤로[3,4-b]피롤-5(1H)-일)피리다진-3-일)페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온; 2-(6-(2,7-디아자스피로[4.5]데칸-2-일)피리다진-3-일)-5-(1H-피라졸-4-일)페놀; 및 4-(4-(6-(2,7-디아자스피로[4.5]데칸-2-일)피리다진-3-일)-3-하이드록시페닐)-1-메틸피리딘-2(1H)-온도 또한 포함된다.
추가의 대표적 스플라이스 변형인자는 하기 구조를 갖는 RG7916 (Roche/PTC/SMAF,35 7-(4,7-디아자스피로[2.5]옥탄-7-일)-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-4H-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온)이다:
Figure pct00005
추가의 대표적 스플라이스 변형인자는 하기 구조를 갖는 RG7800(Roche)이다:
Figure pct00006
사용될 수 있는 RG7916 및 RG7800 등의 스플라이스 변형인자의 유사체, 예를 들면, 2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-(4-메틸피페라진-1-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-헥사하이드로-1H-피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-헥사하이드로-1H-피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-헥사하이드로-1H-피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aS)-8a-메틸-1,3,4,6,7,8-헥사하이드로피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aR)-8a-메틸-1,3,4,6,7,8-헥사하이드로피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3S,5R)-3,5-디메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3S)-3-메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3R)-3-메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-(1,4-디아제판-1-일)-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3S)-3-메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3R)-3-메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-(1,4-디아제판-1-일)-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(3R,5S)-3,5-디메틸피페라진-1-일]-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-헥사하이드로-1H-피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aS)-8a-메틸-1,3,4,6,7,8-헥사하이드로피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aR)-8a-메틸-1,3,4,6,7,8-헥사하이드로피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3R)-3-피롤리딘-1-일피롤리딘-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-(4,7-디아자스피로[2.5]옥탄-7-일)-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-(4,7-디아자스피로[2.5]옥탄-7-일)-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3R)-3-피롤리딘-1-일피롤리딘-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-(3,3-디메틸피페라진-1-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-(3,3-디메틸피페라진-1-일)-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-9-메틸-7-[(3S)-3-메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-9-메틸-7-[(3R)-3-메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3R,5S)-3,5-디메틸피페라진-1-일]-9-메틸-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-(3,3-디메틸피페라진-1-일)-9-메틸-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-(4,7-디아자스피로[2.5]옥탄-7-일)-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-9-메틸-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3S,5S)-3,5-디메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3S)-3-피롤리딘-1-일피롤리딘-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3S)-3-피롤리딘-1-일피롤리딘-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(3S,5S)-3,5-디메틸피페라진-1-일]-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 9-메틸-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3S)-3-메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 9-메틸-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3R)-3-메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(3R,5S)-3,5-디메틸피페라진-1-일]-9-메틸-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-(3,3-디메틸피페라진-1-일)-9-메틸-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-(4,7-디아자스피로[2.5]옥탄-7-일)-9-메틸-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(3S,5S)-3,5-디메틸피페라진-1-일]-9-메틸-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 및 7-[(3R)-3-에틸피페라진-1-일]-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-헥사하이드로-1H-피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aR)-3,4,6,7,8,8a-헥사하이드로-1H-피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-[(3S,5R)-3,5-디메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(3R,5S)-3,5-디메틸피페라진-1-일]-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-[(8aS)-3,4,6,7,8,8a-헥사하이드로-1H-피롤로[1,2-a]피라진-2-일]-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-9-메틸-7-[(3S)-3-메틸피페라진-1-일]피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-플루오로-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-플루오로-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 7-플루오로-9-메틸-2-(2-메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 2-(2,8-디메틸이미다조[1,2-b]피리다진-6-일)-7-플루오로-9-메틸-피리도[1,2-a]피리미딘-4-온; 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염도 또한 포함된다.
스플라이스 변형인자의 또 다른 대표적 패밀리는 미국 특허 제9,682,993호에 개시된 화합물(수데마이신)이고, (5',Z)-5-(((lR,4R)-4-((2JE',4JE)-5-((3R,55')-7,7-디메틸-1,6-디옥사스피로[2.5]옥탄-5-일)-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 메틸카바메이트 및 (5',Z)-5-(((1R,4R)-4-((2JE',4JE)-5-((3R,55')-7,7-디메틸-1,6-디옥사스피로[2.5]옥탄-5-일)-3-메틸펜타-2,4-디엔-1-일)사이클로헥실)아미노)-5-옥소펜트-3-엔-2-일 디메틸카바메이트를 포함한다.
스플라이스 변형인자의 또 다른 대표적 패밀리는 하기 특허 출원에 개시된 것들을 포함하여 플라디에놀리드 화합물이다: WO 2002/060890; WO 2004/01 1459; WO 2004/01 1661; WO 2004/050890; WO 2005/052152; WO 2006/009276; WO 2008/126918; 및 WO 2015/175594, 이들 각각은 참조에 의해 본원에 도입된다. 플라디에놀리드의 일례는 (8E, 12E, 14E)-7-((4-사이클로헵틸피페라진-1-일)카보닐)옥시-3,6,16,21-테트라하이드록시-6,10,12,16,20-펜타메틸-18,19-에폭시트리코사-8,12,14-트리엔-11-올리드이고, E7107로도 공지되어 있으며, 이는 천연 생성물 플라디에놀리드 D의 반합성 유도체이다.
III. 투여 방법
임의의 적합한 세포 또는 포유동물은, 본원에 기재된 방법 또는 용도에 의해 투여되거나 치료될 수 있다. 전형적으로, 포유동물은, 질환 상태와 관련된 비정상 또는 이상 단백질을 갖거나 발현하는 것으로 의심되는 본원에 기재된 방법을 필요로 한다.
포유동물의 비제한적 예는 인간, 비인간 영장류(예: 유인원, 긴팔원숭이, 침팬지, 오랑우탄, 원숭이, 마카크 등), 가축(예: 개 및 고양이), 농장 동물(예: 말, 소, 염소, 양, 돼지) 및 실험 동물(예: 마우스, 랫트, 래빗, 기니 피그)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 특정 실시형태에서, 포유동물은 비-설치류 포유동물(예를 들면, 인간, 돼지, 염소, 양, 말, 개 등)이다. 특정 실시형태에서, 비-설치류 포유동물은 인간이다. 포유동물은 모든 연령 또는 발달 단계(예: 성인, 10대, 어린이, 유아 또는 자궁내 포유동물)일 수 있다. 포유동물은 수컷 또는 암컷일 수 있다. 특정 실시형태에서, 포유동물은 동물 질병 모델, 예를 들면, 질환 상태와 관련되는 비정상 또는 이상 단백질을 갖거나 발현하는 동물 모델, 또는 질환 상태를 유발하는 단백질의 발현이 불충분한 동물 모델일 수 있다.
본원에 기재된 방법 또는 조성물에 의해 치료되는 포유동물(대상체)는 성인(18세 이상) 및 어린이(18세 미만)를 포함한다. 성인에는 노인이 포함된다. 대표적 성인은 50세 이상이다. 어린이의 연령은 1-2세 또는 2-4세, 4-6세, 6-18세, 8-10세, 10-12세, 12-15세 및 15-18세이다. 어린이는 유아도 포함한다. 유아는 일반적으로 1 내지 12개월의 범위이다.
특정 실시형태에서, 방법은, 본원에 기재된 바와 같이 포유동물에게 복수의 바이러스 입자 또는 나노입자를 투여하는 것을 포함하고, 여기서 신경퇴행성 질환 등의 질환 상태의 하나 이상의 증상의 중증도, 빈도, 진행 또는 발증 시간은 저하, 감소, 예방, 억제 또는 지연된다. 특정 실시형태에서, 방법은, 복수의 바이러스 입자 또는 나노입자를 포유동물에게 투여하여 신경퇴행성 질환 등의 질환 상태의 유해 증상을 치료하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 방법은, 복수의 바이러스 입자 또는 나노입자를 포유동물에게 투여하여, 신경퇴행성 질환 등의 질환 상태의 악화, 또는 진행, 또는 역전 및 유해 증상을 안정화, 지연 또는 예방하는 것을 포함한다.
특정 실시형태에서, 방법은, 본원에 기재된 바와 같이, 포유동물의 중추신경계 또는 이의 일부에 복수의 바이러스 입자 또는 나노입자를 투여하는 것을 포함하고, 신경퇴행성 질환 등의 질환 상태의 하나 이상의 증상의 중증도, 빈도, 진행 또는 발병 시간이 적어도 약 5 내지 약 10일, 약 10 내지 약 25일, 약 25 내지 약 50일 또는 약 50 내지 약 100일까지 저하, 감소, 예방, 억제 또는 지연된다.
특정 실시형태에서, 증상 또는 부작용은, 초기 단계, 중기 또는 후기 증상; 행동, 성격 또는 언어 증상; 연하, 운동, 발작, 진전 또는 안절부절 증상; 운동실조; 및/또는 기억, 조직화 능력 등의 인지 증상을 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 및 비-바이러스 기반 유전자 전달 방법을 사용하여, 포유동물 세포 또는 표적 조직에 핵산을 도입할 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 억제성 RNA, 치료 단백질 또는 CRISPR 시스템의 구성요소를 코딩하는 핵산을 배양중의 세포 또는 숙주 생물에 투여할 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA(예를 들면, 본원에 기재된 벡터의 전사물), 네이키드 핵산, 및 리포좀 등의 전달 비히클(vehicle)과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템에는, 세포로 전달된 후에 에피좀 또는 통합 게놈을 갖는 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다. 유전자 치료 절차에 대한 검토는 문헌[참조: Anderson, 1992; Nabel & Feigner, 1993; Mitani & Caskey, 1993; Dillon, 1993; Miller, 1992; Van Brunt, 1988; Vigne, 1995; Kremer & Perricaudet, 1995; Haddada et al., 1995; 및 Yu et al, 1994]을 참조한다.
핵산의 비-바이러스 전달 방법은 엑소좀, 리포펙션, 뉴클레오펙션, 미세주입, 바이오리스틱, 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, 폴리양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온 및 약제-증강 DNA 흡수를 포함한다. 리포펙션은 (예를 들면, 미국 특허 제5,049,386호, 제4,946,787호; 및 제4,897,355호)에 기재되어 있고, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다(예: Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 효율적 수용체 인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 페이그너(Feigner), WO 제91117424호; WO 제91116024호의 것들을 포함한다. 전달은 세포(예: 시험관내 또는 생체외 투여) 또는 표적 조직(예: 생체내 투여)에 대한 것일 수 있다.
일부 실시형태에서, 전달은 핵산 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스 기반 시스템의 사용을 통해 이루어진다. 일부 국면에서 바이러스 벡터는, 환자에게 직접 투여될 수 있거나(생체내), 또는 시험관내 또는 생체외에서 세포를 치료하기 위해 사용될 수 있고, 이어서 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서 바이러스 기반 시스템은 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 및 단순 헤르페스 바이러스 벡터를 포함한다.
A. 바이러스 벡터
용어 "벡터"는, 작은 담체 핵산 분자, 플라스미드, 바이러스(예를 들면, AAV 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터), 또는 핵산의 삽입 또는 도입에 의해 조작될 수 있는 기타 비히클을 지칭한다. 바이러스 벡터 등의 벡터를 사용하여, 핵산 서열을 세포 내로 도입/전달할 수 있고, 이에 따라 그 중의 핵산 서열이 전사되고, 단백질을 코딩하는 경우, 세포에 의해 후속적으로 번역된다.
"발현 벡터"는, 숙주 세포에서의 발현에 필요한 필수 조절 영역을 갖는 유전자 또는 핵산 서열을 포함하는 특수한 벡터이다. 발현 벡터는, 적어도 세포 내에서 증식을 위한 복제 기점, 및 임의로, 이종 핵산 서열, 발현 조절 요소(예: 프로모터, 인핸서), 인트론, ITR(들) 및 폴리아데닐화 신호 등의 추가 요소를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터는, 바이러스 게놈을 구성하는 하나 이상의 핵산 요소로부터 유래되거나, 그에 기초한다. 예시적 바이러스 벡터는 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
재조합 바이러스, 예를 들면, 렌티- 또는 파보-바이러스(예를 들면, AAV) 벡터 등의 벡터의 변형인자, 뿐만 아니라 재조합 핵산 서열 및 폴리펩티드 등의 서열의 변형인자로서의 용어 "재조합"은 조성물이, 일반적으로 자연에서 발생하지 않는 방식으로 조작(manipulated)(즉, 조작(engineered))되었음을 의미한다. AAV, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 등의 재조합 벡터의 특정 예는, 야생형 바이러스 게놈에는 통상 존재하지 않는 핵산 서열이 바이러스 게놈 내에 삽입되는 경우이다. 재조합 핵산 서열의 예는 핵산(예: 유전자)이, 유전자가 바이러스 게놈 내에서 통상 회합되는 5', 3' 및/또는 인트론 영역의 존재 또는 부재하에, 벡터로 클로닝된 억제성 RNA를 코딩하는 경우이다. 용어 "재조합"은, 바이러스 벡터 등의 벡터, 게다가 폴리뉴클레오티드 등의 서열과 관련하여 본원에서 항상 사용되는 것은 아니지만, 핵산 서열, 폴리뉴클레오티드, 도입유전자 등을 포함하는 "재조합" 형태는, 임의의 이러한 생략에도 불구하고, 명시적으로 포함된다.
재조합 바이러스 "벡터"는, 분자적 방법을 사용하여 바이러스로부터 야생형 게놈을 제거하고 핵산 서열 등의 비-천연 핵산으로 치환함으로써, AAV, 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 등의 바이러스의 야생형 게놈으로부터 유래한다. 전형적으로, 예를 들면, AAV의 경우, AAV 게놈의 한쪽 또는 양쪽 역방향 말단 반복(ITR) 서열은 재조합 AAV 벡터에 유지된다. "재조합" 바이러스 벡터(예를 들면, rAAV)는, 바이러스 게놈의 전부 또는 일부가, 트랜스활성화인자를 코딩하는 핵산 또는 억제성 RNA를 코딩하는 핵산 또는 치료 단백질을 코딩하는 핵산 등의 바이러스 게놈 핵산과 관련하여 비-천연 서열로 대체되었기 때문에, 바이러스(예를 들면, AAV) 게놈과 구별된다. 따라서, 이러한 비-천연 핵산 서열의 도입은 바이러스 벡터를 "재조합" 벡터로 정의하고, 이는, AAV의 경우, "rAAV 벡터"로 지칭될 수 있다.
1. 아데노-관련 바이러스
아데노-관련 바이러스(AAV)는, 파르보바이러스과의 작은 비병원성 바이러스이다. 현재까지, 혈청학적으로 상이한 다수의 AAV가 동정되었고, 인간 또는 영장류에서 12개 이상이 단리되었다. AAV는, 복제를 위해 헬퍼 바이러스(helper virus)에 의존한다는 점에서, 이 패밀리의 다른 구성원과는 상이하다.
AAV 게놈은, 숙주 세포 게놈으로 통합되지 않고서 염색체외 상태로 존재할 수 있고; 광범위한 숙주 범위를 보유하고; 시험관내 및 생체내에서 분열 세포 및 비분열 세포 둘 다를 형질도입하고, 형질도입된 유전자의 높은 수준의 발현을 유지한다. AAV 바이러스 입자는 열 안정성이 있고; 용매, 세제, pH 및 온도 변화에 대한 내성이 있고; 컬럼 정제 및/또는 CsCl 구배 또는 기타 수단에 의해 농축될 수 있다. AAV 게놈은, 양성 또는 음성 감지된 일본쇄 데옥시리보핵산(ssDNA)을 포함한다. AAV의 약 5kb 게놈은, 플러스 또는 마이너스 극성의 일본쇄 DNA의 1개 세그먼트로 구성된다. 게놈의 말단은, 헤어핀 구조로 폴딩하고 바이러스 DNA 복제의 기점으로 기능하는 짧은 역방향 말단 반복(ITR)이다.
AAV "게놈"은, AAV 입자를 형성하기 위해 최종적으로 팩키징(packaged)되거나 캡슐화(encapsulated)되는 재조합 핵산 서열을 지칭한다. AAV 입자는 종종 AAV 캡시드 단백질로 팩키징된 AAV 게놈을 포함한다. 재조합 플라스미드를 사용하여 재조합 벡터를 구축하거나 제조하는 경우, AAV 벡터 게놈은, 재조합 플라스미드의 벡터 게놈 서열에 대응하지 않는 "플라스미드" 부분을 포함하지 않는다. 재조합 플라스미드의 이러한 비-벡터 게놈 부분은, 플라스미드의 클로닝 및 증폭에 중요한 "플라스미드 백본"으로 지칭되고, 이 프로세스는, 증식 및 재조합 바이러스 생산에 필요하지만, 자체적으로 바이러스 입자로 팩키징화 또는 캡슐화되지는 않는다. 따라서, AAV 벡터 "게놈"은, AAV 캡시드 단백질에 의해 팩키징 또는 캡슐화되는 핵산을 지칭한다.
AAV 비리온(입자)은, 직경 약 25nm의 외피를 갖지 않는 이십면체 입자이다. AAV 입자는, 3개의 관련 캡시드 단백질, VP1, VP2 및 VP3으로 구성된 정이십면체 대칭을 포함하고, 이들은 함께 상호작용하여 캡시드를 형성한다. 우측 ORF는 종종 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3을 코딩한다. 이러한 단백질은, 종종 각각 1:1:10의 비율로 발견되지만, 다양한 비율일 수 있고, 모두 우측 ORF에서 유래한다. VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질은, 선택적 스플라이싱 및 비정상적인 개시 코돈을 사용하여 서로 상이하다. 결실 분석은, 선택적 스플라이싱된 메시지에서 번역된 VP1의 제거 또는 변경이 감염성 입자의 수율 감소를 초래하는 것을 나타냈다. VP3 코딩 영역 내의 돌연변이는, 임의의 일본쇄 자손 DNA 또는 감염성 입자의 생성에 실패한다.
AAV 입자는, AAV 캡시드를 포함하는 바이러스 입자이다. 특정 실시형태에서, AAV 입자의 게놈은 1개, 2개 또는 모든 VP1, VP2 및 VP3 폴리펩티드를 코딩한다.
대부분의 천연 AAV의 게놈은 종종 2개의 개방 판독 프레임(ORF)을 포함하고, 이는 좌측 ORF 및 우측 ORF으로 지칭된다. 좌측 ORF는 종종 비-구조적 Rep 단백질, Rep 40, Rep 52, Rep 68 및 Rep 78을 코딩하고, 이는 일본쇄 자손 게놈의 생산에 추가하여 복제 및 전사의 조절에 관여한다. Rep 단백질 중의 2개는, AAV 게놈을 인간 염색체 19의 q 암(q arm) 영역으로 우선적으로 통합하는 것과 관련되어 있다. Rep68/78은, NTP 결합 활성과 DNA 및 RNA 헬리카제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 일부 Rep 단백질은, 핵 국재화 신호(nuclear localization signal)와 몇몇 잠재적 포스포릴화 부위를 갖고 있다. 특정 실시형태에서, AAV(예를 들면, rAAV)의 게놈은 일부 또는 모든 Rep 단백질을 코딩한다. 특정 실시형태에서, AAV(예를 들면, rAAV)의 게놈은, Rep 단백질을 코딩하지 않는다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 Rep 단백질은 트랜스로 전달될 수 있고, 따라서 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 AAV 입자에 포함되지 않는다.
AAV 게놈의 말단은, 바이러스 DNA 복제의 기점으로 기능하는 T자형 헤어핀 구조로 폴딩(fold)될 가능성이 있는 짧은 역방향 말단 반복(ITR)을 포함한다. 따라서, AAV의 게놈은, 일본쇄 바이러스 DNA 게놈에 인접하는 하나 이상의(예를 들면, 한 쌍의) ITR 서열을 포함한다. ITR 서열은 종종, 각각 약 145 염기의 길이를 갖는다. ITR 영역 내에서는, ITR의 기능의 중심에 있는 것으로 생각되는 2개 요소, GAGC 반복 모티프 및 터미널 분석 부위(trs)가 설명되어 있다. 반복 모티프는, ITR이 선형 또는 헤어핀 형태인 경우에 Rep에 결합하는 것으로 나타났다. 이 결합은, 부위- 및 쇄-특이적 방식으로 발생하는 trs에서의 절단을 위해 Rep68/78을 배치하는 것으로 생각된다. 복제에서 이들의 역할에 추가하여, 이들 2개 요소는 바이러스 통합의 중심이 되는 것으로 보이다. 염색체 19 통합 유전자좌 내에 포함된 것은 인접한 trs과의 Rep 결합 부위이다. 이러한 요소는 기능적이며, 유전자좌 특이적 통합에 필요한 것으로 나타났다.
특정 실시형태에서, AAV(예를 들면, rAAV)는 2개의 ITR을 포함한다. 특정 실시형태에서, AAV(예를 들면, rAAV)는 한 쌍의 ITR을 포함한다. 특정 실시형태에서, AAV(예를 들면, rAAV)는 적어도 기능 또는 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열의 인접하는(즉, 각각의 5' 및 3' 말단에 있음) ITR의 쌍을 포함한다.
AAV 벡터(예를 들면, rAAV 벡터)는 팩키징될 수 있고, 본원에서는 생체외, 시험관내 또는 생체내에서 세포의 후속 감염(형질도입)을 위한 "AAV 입자"로서 지칭된다. 재조합 AAV 벡터가 AAV 입자로 캡슐화되거나 팩키징되는 경우, 그 입자는 "rAAV 입자"로서 지칭될 수 있다. 특정 실시형태에서, AAV 입자는 rAAV 입자이다. rAAV 입자는 종종 rAAV 벡터 또는 이의 일부를 포함한다. rAAV 입자는 하나 이상의 rAAV 입자(예를 들면, 복수의 AAV 입자)일 수 있다. rAAV 입자는 통상 rAAV 벡터 게놈(예: 캡시드 단백질)을 캡슐화하거나 팩키징하는 단백질을 포함한다. rAAV 벡터에 대한 참조는 또한 rAAV 입자를 참조하기 위해 사용될 수 있음에 유의한다.
임의의 적합한 AAV 입자(예를 들면, rAAV 입자)를 본원에서 방법 또는 용도에 사용할 수 있다. rAAV 입자 및/또는 그 안에 포함된 게놈은, AAV의 임의의 적합한 혈청형 또는 균주로부터 유래될 수 있다. rAAV 입자 및/또는 그 안에 포함된 게놈은 AAV의 2개 이상의 혈청형 또는 균주로부터 유래될 수 있다. 따라서, rAAV는 AAV의 임의의 혈청형 또는 균주의 단백질 및/또는 핵산, 또는 이의 일부를 포함할 수 있으며, 여기서 AAV 입자는 포유동물 세포의 감염 및/또는 형질도입에 적합하다. AAV 혈청형의 비제한적 예는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rhlO 및 AAV-2i8을 포함한다.
특정 실시형태에서, 복수의 rAAV 입자는 동일한 균주 또는 혈청형(또는 하위그룹 또는 변이체)의 입자를 포함하거나, 이로부터 유래된 입자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 복수의 rAAV 입자는 2개 이상의 상이한 rAAV 입자(예를 들면, 상이한 혈청형 및/또는 균주)의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "혈청형"은 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 상이한 캡시드를 갖는 AAV를 지칭하기 위해 사용되는 구별이다. 혈청학적 특징은, 또 다른 AAV와 비교하여, 하나의 AAV에 대한 항체 사이의 교차 반응성의 결여에 기초하여 결정된다. 이러한 교차-반응성 차이는 통상 캡시드 단백질 서열/항원 결정인자의 차이로 인한 것이다(예를 들면, AAV 혈청형의 VP1, VP2 및/또는 VP3 서열 차이에 기인). 캡시드 변이체를 포함하는 AAV 변이체는 참조 AAV 또는 다른 AAV 혈청형과 혈청학적으로 구별되지 않을 가능성이 있음에도 불구하고, 이들은 참조 또는 다른 AAV 혈청형과 비교하여 적어도 하나의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기가 상이하다.
특정 실시형태에서, rAAV 입자는 특정 혈청형을 제외한다. 한 가지 실시형태에서, rAAV 입자는 AAV4 입자가 아니다. 특정 실시형태에서, rAAV 입자는 항원적 또는 면역학적으로 AAV4와 상이하다. 식별성은 표준 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들면, ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용하여, 바이러스 입자가 AAV4와 항원적 또는 면역학적으로 상이한지 여부를 결정할 수 있다. 추가로, 특정 실시형태에서, rAAV2 입자는 AAV4와 상이한 조직 향성을 보유한다.
특정 실시형태에서, 제1 혈청형 게놈에 기초한 rAAV 벡터는, 벡터를 팩키징하는 하나 이상의 캡시드 단백질의 혈청형에 대응한다. 예를 들면, AAV 벡터 게놈을 포함하는 하나 이상의 AAV 핵산(예를 들면, ITR)의 혈청형은 rAAV 입자를 포함하는 캡시드의 혈청형에 대응한다.
특정 실시형태에서, rAAV 벡터 게놈은 벡터를 팩키징하는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 혈청형과 상이한 AAV(예를 들면, AAV2) 혈청형 게놈에 기초할 수 있다. 예를 들면, rAAV 벡터 게놈은 AAV2 유래 핵산(예를 들면, ITR)을 포함할 수 있는 반면, 3개의 캡시드 단백질 중의 적어도 하나 이상은 상이한 혈청형, 예를 들면, AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, RhlO, Rh74 또는 AAV-2i8 혈청형 또는 이의 변이체로부터 유래한다.
특정 실시형태에서, 참조 혈청형과 관련된 rAAV 입자 또는 이의 벡터 게놈은, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, RhlO, Rh74 또는 AAV-2i8 입자의 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 서브서열과 적어도 60% 이상(예를 들면, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등) 동일한 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 이의 서브서열을 갖는다. 특정 실시형태에서, 참조 혈청형과 관련된 rAAV 입자 또는 이의 벡터 게놈은, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, RhlO, Rh74 또는 AAV-2i8 혈청형의 캡시드 또는 ITR 서열과 적어도 60% 이상(예를 들면, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등) 동일한 서열을 포함하거나 이들로 이루어진 캡시드 또는 ITR 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 본원의 방법은 rAAV1, rAAV2, rAAV3, rAAV4, rAAV5, rAAV6, rAAV7, rAAV8, rAAV9, rAAV10, rAAVl1, rAAV12, rRhlO, rRh74 또는 rAAV-2i8 입자의 사용, 투여 또는 전달을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본원의 방법은, rAAV2 입자의 사용, 투여 또는 전달을 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV2 입자는 AAV2 캡시드를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV2 입자는, 천연 또는 야생형 AAV2 입자의 상응하는 캡시드 단백질과 적어도 60%, 65%, 70%, 75% 또는 그 이상 동일한, 예를 들면, 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 최대 100% 동일한 하나 이상의 캡시드 단백질(예를 들면, VP1, VP2 및/또는 VP3)을 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV2 입자는, 천연 또는 야생형 AAV2 입자의 상응하는 캡시드 단백질과 적어도 75% 이상 동일한, 예를 들면, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 최대 100% 동일한 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV2 입자는 천연 또는 야생형 AAV2 입자의 변이체이다. 일부 국면에서, AAV2 변이체의 하나 이상의 캡시드 단백질은, 천연 또는 야생형 AAV2 입자의 캡시드 단백질(들)과 비교하여, 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-15, 15-20개 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시형태에서, rAAV9 입자는 AAV9 캡시드를 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV9 입자는, 천연 또는 야생형 AAV9 입자의 상응하는 캡시드 단백질과 적어도 60%, 65%, 70%, 75% 또는 그 이상 동일한, 예를 들면, 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 최대 100% 동일한 하나 이상의 캡시드 단백질(예를 들면, VP1, VP2 및/또는 VP3)을 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV9 입자는, 천연 또는 야생형 AAV9 입자의 상응하는 캡시드 단백질과 적어도 75% 또는 그 이상 동일한, 예를 들면, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 최대 100% 동일한 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV9 입자는 천연 또는 야생형 AAV9 입자의 변이체이다. 일부 국면에서, AAV9 변이체의 하나 이상의 캡시드 단백질은 천연 또는 야생형 AAV9 입자의 캡시드 단백질(들)과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-15, 15-20개 이상의 아미노산 치환을 갖는다.
특정 실시형태에서, rAAV 입자는, 하나 이상의 원하는 ITR 기능(예: DNA 복제를 가능하게 하는 헤어핀을 형성하는 능력; 숙주 세포 게놈에 AAV DNA의 통합; 및/또는 필요에 따라 팩키징)을 보유하는 한, 천연 또는 야생형 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rhlO 또는 AAV-2i8의 상응하는 ITR과 적어도 75% 또는 그 이상 동일한, 예를 들면, 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 최대 100% 동일한 1개 또는 2개의 ITR(예: 한 쌍의 ITR)을 포함한다.
특정 실시형태에서, rAAV2 입자는, 하나 이상의 원하는 ITR 기능(예: DNA 복제를 가능하게 하는 헤어핀을 형성하는 능력; 숙주 세포 게놈에 AAV DNA의 통합; 및/또는 필요에 따라 팩키징)을 보유하는 한, 천연 또는 야생형 AAV2 입자의 상응하는 ITR과 적어도 75% 또는 그 이상 동일한, 예를 들면, 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 최대 100% 동일한 1 또는 2개의 ITR(예: 한 쌍의 ITR)을 포함한다.
특정 실시형태에서, rAAV9 입자는, 하나 이상의 원하는 ITR 기능(예: DNA 복제를 가능하게 하는 헤어핀을 형성하는 능력; 숙주 세포 게놈에 AAV DNA의 통합; 및/또는 필요에 따라 팩키징)을 보유하는 한, 천연 또는 야생형 AAV2 입자의 상응하는 ITR과 적어도 75% 또는 그 이상 동일한, 예를 들면, 80%, 85%, 85%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5% 등, 최대 100% 동일한 1 또는 2개의 ITR(예: 한 쌍의 ITR)을 포함한다.
rAAV 입자는, 임의의 적합한 수의 "GAGC" 반복을 갖는 ITR을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, AAV2 입자의 ITR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 이상의 "GAGC" 반복을 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV2 입자는 3개의 "GAGC" 반복을 포함하는 ITR을 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV2 입자는 4개 미만의 "GAGC" 반복을 갖는 ITR을 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV2 입자는 4개 초과의 "GAGC" 반복을 갖는 ITR을 포함한다. 특정 실시형태에서, rAAV2 입자의 ITR은 Rep 결합 부위를 포함하고, 여기서 최초 2개의 "GAGC" 반복에서 제4 뉴클레오티드는 T가 아니라 C이다.
예시적 적합한 길이의 DNA를, rAAV 입자로의 팩키징/캡슐화를 위해 rAAV 벡터에 도입할 수 있고, 약 5킬로베이스(kb) 이하로 할 수 있다. 특정 실시형태에서, DNA의 길이는 약 5kb 미만, 약 4.5kb 미만, 약 4kb 미만, 약 3.5kb 미만, 약 3kb 미만 또는 약 2.5kb 미만이다.
RNAi 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 핵산 서열을 포함하는 rAAV 벡터는, 당업계에 공지된 적합한 재조합 기술을 사용하여 생성될 수 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al, 1989]. 재조합 AAV 벡터는 통상, 형질도입 적격 AAV 입자로 팩키징되고 AAV 바이러스 팩키징 시스템을 사용하여 전파된다. 형질도입 적격 AAV 입자는, 포유동물 세포에 결합하여 침입하고, 이어서 핵산 카고(cargo)(예를 들면, 이종 유전자)를 세포의 핵에 전달할 수 있다. 따라서, 형질도입-적격인 무손상 rAAV 입자는, 포유동물 세포를 형질도입하도록 구성된다. 포유동물 세포를 형질도입하도록 구성된 rAAV 입자는, 종종 복제 적격이 아니고, 자가 복제를 위해 추가 단백질 기구가 필요하다. 그러므로, 포유동물 세포를 형질도입하도록 구성된 rAAV 입자는, 포유동물 세포에 결합하여 침입하고, 핵산을 세포에 전달하도록 조작되고, 전달을 위한 핵산은 종종 rAAV 게놈 내의 한 쌍의 AAV ITR의 사이에 배치된다.
형질도입-적격 AAV 입자를 생산하기 위한 적합한 숙주 세포는, 이종 rAAV 벡터의 수용자일 수 있거나 사용되어 왔던 미생물, 효모 세포, 곤충 세포 및 포유동물 세포를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 안정한 인간 세포주, HEK293(예를 들면, 수탁 번호 ATCC CRL1573하에 American Type Culture Collection을 통해 용이하게 입수가능)로부터의 세포를 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 아데노 바이러스 5형 DNA 단편으로 형질전환되고 아데노바이러스 Ela 및 Elb 유전자를 발현하는 변형된 인간 배아 신장 세포주(예: HEK293)를 사용하여, 재조합 AAV 입자를 생성한다. 변형된 HEK293 세포주는 용이하게 형질감염되고, rAAV 입자를 생산할 수 있는 특히 편리한 플랫폼을 제공한다. 포유동물 세포를 형질도입할 수 있는 고역가의 AAV 입자를 생성하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들면, AAV 입자는 문헌[참조: Wright, 2008 and Wright, 2009]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.
특정 실시형태에서, AAV 헬퍼(helper) 기능은, AAV 발현 벡터의 형질감염 전에 또는 동시에 AAV 헬퍼 작제물로 숙주 세포를 형질감염시킴으로써 숙주 세포로 도입된다. 따라서, AAV 헬퍼 작제물은, 생산적 AAV 형질도입에 필요한 누락된 AAV 기능을 보완하기 위해, AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적 발현을 제공하기 위해 종종 사용된다. AAV 헬퍼 작제물은 종종 AAV ITR을 결여하고 있고, 자체적으로 복제하거나 팩키징할 수 없다. 이러한 작제물은, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 또는 비리온의 형태일 수 있다. Rep 및 Cap 발현 생성물 둘 다를 코딩하는 일반적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45 등의 다수의 AAV 헬퍼 작제물이 기재되었다. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 코딩하는 다수의 다른 벡터가 공지되어 있다.
2. 레트로바이러스
본원의 방법, 조성물 및 용도에서 전달된 약제로서 사용하기 위한 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터를 포함한다[참조: 예를 들면, Miller(1992) Nature, 357:455-460]. 레트로바이러스 벡터는, 재배열되지 않은 단일 카피 유전자를 다양한 설치류, 영장류 및 인간 체세포에 전달할 수 있기 때문에, 핵산을 세포로 전달하는 데 매우 적합하다. 레트로바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 다른 바이러스 벡터와 달리, 이들은 분열하는 세포만 감염시킨다.
레트로바이러스는, 바이러스 게놈이 RNA인 RNA 바이러스이다. 숙주 세포가 레트로바이러스에 감염되면, 게놈 RNA는 DNA 중간체로 역전사되어, 감염된 세포의 염색체 DNA에 매우 효율적으로 통합된다. 이 통합된 DNA 중간체는 프로바이러스로 지칭된다. 프로바이러스의 전사 및 감염성 바이러스로의 어셈블리는, 적절한 헬퍼 바이러스의 존재하에 또는 오염 헬퍼 바이러스의 동시 생성 없이 캡슐화를 가능하게 하는 적절한 서열을 포함하는 세포주에서 발생한다. 캡슐화를 위한 서열이 적절한 벡터와의 공-형질감염에 의해 제공되는 경우, 헬퍼 바이러스는 재조합 레트로바이러스의 생산에 필요하지 않다.
레트로바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는, 3개의 유전자, 즉 gag, pol 및 env를 갖고, 이들은 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열에 인접한다. gag 유전자는 내부 구조(매트릭스, 캡시드 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 코딩하고, env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 코딩한다. pol 유전자는, 바이러스 RNA를 이본쇄 DNA로 전사하는 RNA 지향성 DNA 폴리머라제 역전사 효소, 역전사 효소에 의해 생성된 DNA를 숙주 염색체 DNA로 통합하는 인테그라제(integrase), 코딩된 gag 및 pol 유전자를 처리하는 역할을 하는 프로테아제를 포함하는 생성물을 코딩한다. 5' 및 3' LTR은, 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진하는 역할을 한다. LTR은, 바이러스 복제에 필요한 다른 모든 시스-작용 서열을 포함한다.
레트로바이러스 벡터는 문헌[참조: Coffin et al, Retroviruses, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1997)]에 의해 기재되어 있다. 레트로바이러스의 예는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 또는 뮤린 줄기 세포 바이러스(MSCV)이다. 레트로바이러스 벡터는, 복제 적격이거나 복제 결함일 수 있다. 통상, 레트로바이러스 벡터는 복제 결함이고, 추가 라운드의 비리온 복제 및 팩키징에 필요한 유전자의 코딩 영역이 결실되거나 다른 유전자로 대체된다. 결과적으로, 초기 표적 세포가 감염되면, 바이러스는 통상의 용해 경로를 계속할 수 없다. 이러한 레트로바이러스 벡터 및 이러한 바이러스를 생산하는 데 필요한 약제(예: 팩키징 세포주)는 상업적으로 입수가능한다[예를 들면, 클론테크(Clontech)에서 입수할 수 있는 레트로바이러스 벡터 및 시스템, 예를 들면, 카탈로그 번호 634401, 631503, 631501 등, Clontech, Mountain View, Calif.],
이러한 레트로바이러스 벡터는, 복제에 필요한 바이러스 유전자를 전달될 핵산 분자로 치환함으로써 전달 약제로서 생산될 수 있다. 생성된 게놈은, 각 말단에 LTR을 포함하고, 그 사이에 원하는 유전자 또는 유전자가 포함된다. 레트로바이러스를 생산하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다(예를 들면, PCT 공개번호 WO1995/026411 참조). 레트로바이러스 벡터는, 헬퍼 플라스미드 또는 플라스미드를 포함하는 팩키징 세포주에서 생산될 수 있다. 팩키징 세포주는, 캡시드 생산 및 벡터의 비리온 성숙에 필요한 바이러스 단백질(예: gag, pol 및 env 유전자)을 제공한다. 통상, 벡터 플라스미드 사이의 재조합이 발생하지 않도록, 적어도 2개의 개별 헬퍼 플라스미드(gag 및 pol 유전자; 및 env 유전자를 별도로 포함)가 사용된다. 예를 들면, 레트로바이러스 벡터는, 인산칼슘 매개 형질감염 등의 표준 형질감염 방법을 사용하여, 팩키징 세포주로 전달될 수 있다. 팩키징 세포주는 당업자에게 공지되어 있고, 시판되고 있다. 예시적 팩키징 세포주는 GP2-293 팩키징 세포주(카탈로그 번호 631505, 631507, 631512, Clontech)이다. 비리온 생성물을 위한 충분한 시간 후, 바이러스가 수확된다. 필요에 따라, 수확된 바이러스를 사용하여, 제2 팩키징 세포주를 감염시키고, 예를 들면, 다양한 숙주 지향성을 갖는 바이러스를 생산할 수 있다. 최종 결과는, 목적 핵산을 포함하지만, 숙주 세포에서 새로운 바이러스를 형성할 수 없도록 다른 구조적 유전자를 결여하는, 복제 부적격 재조합 레트로바이러스이다.
유전자 요법에서 레트로바이러스 벡터의 사용을 설명하는 참고 문헌은 다음을 포함한다: Clowes et al,(1994) J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem et al, (1994) Blood 83: 1467-1473; Salmons and Gunzberg (1993) Human Gene Therapy 4: 129-141; Grossman and Wilson(1993) Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114; Sheridan(2011) Nature Biotechnology, 29: 121; Cassani et al. (2009) Blood, 114: 3546-3556.
3. 렌티바이러스
렌티바이러스는 복잡한 레트로바이러스이고, 일반적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env에 추가하여, 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 포함한다. 복잡성이 높으면, 잠복 감염의 과정에서와 같이, 바이러스가 이의 라이프 사이클을 조절할 수 있다. 렌티바이러스의 몇 가지 예는 인간 면역결핍 바이러스: HIV-1, HIV-2 및 유인원 면역결핍 바이러스: SIV를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는, HIV 병원성 유전자를 다중으로 약독화시킴으로써 생성되었고, 예를 들면, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실되어, 벡터가 생물학적으로 안전해진다. 렌티바이러스 벡터는 당해 기술분야에 공지되어 있다(예를 들면, 미국 특허 제6,013,516호 및 제5,994,136호 참조).
재조합 렌티바이러스 벡터는, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고, 생체내 및 생체외 유전자 전달 및 핵산 서열의 발현 둘 다에 사용될 수 있다. 예를 들면, 비-분열 세포를 감염시킬 수 있는 재조합 렌티바이러스(여기서, 적합한 숙주 세포는 팩키징 기능, 즉 gag, pol 및 env 뿐만 아니라 rev 및 tat를 포함하는 2개 이상의 벡터로 형질감염됨)는 미국 특허 제5,994,136호에 기재되어 있고, 이는 참조에 의해 본원에 도입된다.
렌티바이러스 게놈 및 프로바이러스 DNA는, 레트로바이러스에서 발견되는 3개의 유전자: gag, pol 및 env를 갖고, 이들은 2개의 긴 말단 반복(LTR) 서열에 인접하고 있다. gag 유전자는, 내부 구조(매트릭스, 캡시드 및 뉴클레오캡시드) 단백질을 코딩한다. pol 유전자는 RNA 지향성 DNA 폴리머라제(역전사효소), 프로테아제 및 인테그라제를 코딩하고; env 유전자는 바이러스 외피 당단백질을 코딩한다. 5' 및 3' LTR은, 비리온 RNA의 전사 및 폴리아데닐화를 촉진하는 역할을 한다. LTR은, 바이러스 복제에 필요한 다른 모든 시스-작용 서열을 포함한다. 렌티바이러스는, vif, vpr, tat, rev, vpu, nef 및 vpx를 포함한 추가 유전자를 갖는다.
5' LTR에 인접하는 것은, 게놈의 역전사(tRNA 프라이머 결합 부위), 및 바이러스 RNA의 입자로의 효율적 캡슐화(Psi 부위)에 필요한 서열이다. 캡슐화(또는 레트로바이러스 RNA의 감염성 비리온으로의 팩키징)에 필요한 서열이 바이러스 게놈에서 누락된(missing) 경우, 시스 결함은 게놈 RNA의 캡슐화를 방지한다. 그러나, 생성된 돌연변이는 모든 비리온 단백질의 합성을 지시할 수 있다.
4. 기타 바이러스 벡터
유전자 전달을 위한 바이러스 벡터의 개발 및 유용성은 지속적으로 개선되고 진화하고 있다. 폭스바이러스 등의 기타 바이러스 벡터; 예를 들면, 백시니아 바이러스[참조: Gnant el al, 1999; Gnant et al, 1999], 알파 바이러스; 예를 들면, 신드비스 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스[참조: Lundstrom, 1999], 레오바이러스[참조: Coffey et al., 1998] 및 인플루엔자 A 바이러스[참조: Neumann et al., 1999]는 본 개시에 사용되는 것으로 고려되고, 표적 시스템의 필요한 특성에 따라 선택될 수 있다.
5. 키메라 바이러스 벡터
키메라 또는 하이브리드 바이러스 벡터는 치료적 유전자 전달에 사용하기 위해 개발되고 있고, 본 개시에서 사용하기 위해 고려된다. 키메라 폭스바이러스/레트로바이러스 벡터[참조: Holzer et al, 1999], 아데노바이러스/레트로바이러스 벡터[참조: Feng el al, 1997; Bilbao et al, 1997; Caplen et al, 2000] 및 아데노 바이러스/아데노-관련 바이러스 벡터[참조: Fisher et al, 1996; 미국 특허 제5,871,982호]가 기재되어 있다. 이러한 "키메라" 바이러스 유전자 전달 시스템은 2개 이상의 모 바이러스 종의 유리한 특징을 이용할 수 있다. 예를 들면, 윌슨 등(Wilson et al.)은 아데노바이러스의 일부, AAV 5' 및 3' ITR 서열 및 선택된 도입유전자를 포함하는 키메라 벡터 작제물을 제공하며, 이는 하기에 기재된다(미국 특허 제5,871,983호, 구체적으로는 참조에 의해 본원에 도입됨).
B. 나노입자
1. 지질-기반 나노입자
일부 실시형태에서, 지질-기반 나노입자는, 리포좀, 엑소좀, 지질 조제물, 또는 지질-기반 소포(예를 들면, DOTAP: 콜레스테롤 소포) 등의 다른 지질-기반 나노입자이다. 지질-기반 나노입자는 양전하, 음전하 또는 중성으로 하전될 수 있다.
a. 리포좀
"리포좀"은, 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층 지질 비히클을 포괄하는 일반적 용어이다. 리포좀은, 일반적으로 인지질을 포함하는 이중층 막 및 일반적으로 수성 조성물을 포함하는 내부 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것으로 특성화될 수 있다. 본원에서 제공되는 리포좀은 단층 리포좀, 다층 리포좀 및 다소포 리포좀을 포함한다. 본원에 제공된 리포좀은 양전하, 음전하 또는 중성으로 하전될 수 있다. 특정 실시형태에서, 리포좀은 전하가 중성이다.
다층 리포좀은, 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이러한 리포좀은, 인지질을 포함하는 지질이 과량의 수용액에 현탁될 때에 자발적으로 형성된다. 지질 성분은, 폐쇄 구조를 형성하기 전에 자가 재배열되고, 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다. 친유성 분자 또는 친유성 영역을 갖는 분자도 또한 지질 이중층에 용해되거나 결합될 수 있다.
특정 국면에서, 폴리펩티드, 핵산 또는 소분자 약물은, 예를 들면, 리포좀의 수성 내부에 캡슐화되고, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되어 있고, 리포좀 및 폴리펩티드/핵산 둘 다와 회합되는 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되고, 리포좀에 포획되거나, 리포좀 등과 복합체화될 수 있다.
본 실시형태에 따라 사용되는 리포좀은, 당업자에게 공지된 바와 같이, 상이한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들면, 인지질, 예를 들면, 중성 인지질 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)은 3급-부탄올에 용해된다. 이어서, 지질(들)은 폴리펩티드, 핵산 및/또는 다른 성분(들)과 혼합된다. 트윈 20은, 트윈 20이 조성물 중량의 약 5%가 되도록 지질 혼합물에 첨가된다. 3급-부탄올의 용적이 95% 이상으로 되도록 과량의 3급-부탄올을 이 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 와동시키고, 드라이 아이스/아세톤 욕에서 냉동시키고, 밤새 동결 건조시킨다. 동결 건조된 조제물은 -20℃에 보관되고, 최대 3개월까지 사용할 수 있다. 필요한 경우, 동결 건조된 리포좀은 0.9% 생리식염수로 재구성된다.
또는, 리포좀은, 용기, 예를 들면, 유리, 배-형상 플라스크에서 용매에 지질을 혼합하여 제조할 수 있다. 용기는, 리포좀의 예상되는 현탁액의 용적보다 10배 큰 용적를 가져야 한다. 회전 증발기를 사용하여, 용매를 약 40℃에서 음압하에 제거한다. 용매는 통상, 리포좀의 원하는 용적에 따라, 약 5분에서 2시간 이내에 제거된다. 조성물은, 진공하에 데시케이터(desiccator)에서 추가로 건조될 수 있다. 건조된 지질은, 시간의 경과와 함께 열화되는 경향이 있기 때문에, 통상 약 1주 후에 폐기된다.
건조된 지질은, 모든 지질 필름이 재현탁될 때까지 진탕시킴으로써 무균 발열원-비함유 물에서 약 25-50mM 인지질로 수화시킬 수 있다. 이어서, 수성 리포좀을 분취액으로 분리하고, 각각을 바이알에 넣고, 동결 건조시키고, 진공하에 밀봉시킨다.
상기와 같이 제조된 건조된 지질 또는 동결건조된 리포좀은, 탈수 및 단백질 또는 펩티드의 용액에서 재구성될 수 있고, 적절한 용매, 예를 들면, DPBS에서 적절한 농도로 희석시킬 수 있다. 이어서, 혼합물을 와동 믹서에서 격렬하게 진탕시킨다. 호르몬, 약물, 핵산 작제물 등을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 약제 등의 캡슐화되지 않은 추가 물질을, 29,000×g에서 원심분리에 의해 제거하고, 리포좀 펠렛을 세척한다. 세척된 리포좀은, 적절한 총 인지질 농도, 예를 들면, 약 50-200mM로 재현탁시킨다. 캡슐화된 추가 물질 또는 활성제의 양은, 표준 방법에 따라 결정될 수 있다. 리포좀 조제물에 캡슐화된 추가 물질 또는 활성제의 양을 결정한 후, 리포좀을 적절한 농도로 희석하고, 사용할 때까지 4℃에서 보관할 수 있다. 리포좀을 포함하는 약제학적 조성물은 통상, 물 또는 생리식염수 등의 멸균된 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함한다.
본 실시형태에 유용할 수 있는 추가 리포좀은, 예를 들면, WO02/100435A1, 미국 특허 제5,962,016호, 미국 출원 제2004/0208921호, W003/015757A1, WO04029213A2, 미국 특허 제5,030,453호 및 미국 특허 제6,680,068호에 기재된 바와 같은 양이온성 리포좀을 포함하고, 이들 모두는 면책 조항 없이 그 전체가 본원에 참조로 도입된다.
이러한 리포좀을 제조할 때에, 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 프로토콜을 사용할 수 있다. 리포좀을 제조하는 추가의 비제한적 예는 미국 특허 제4,728,578호, 제4,728,575호, 제4,737,323호, 제4,533,254호, 제4,162,282호, 제4,310,505호 및 제4,921,706호; 국제 출원 PCT/US85/01161 및 PCT/US89/05040에 기재되어 있고, 각각은 참조에 의해 본원에 도입된다.
특정 실시형태에서, 지질-기반 나노입자는 중성 리포좀(예: DOPC 리포좀)이다. 본원에 사용된 "중성 리포좀" 또는 "비-하전 리포좀"은, 본질적으로 중성의 순 전하(실질적으로 비하전)를 제공하는 하나 이상의 지질 성분을 갖는 리포좀으로 정의된다. "본질적으로 중성" 또는 "본질적으로 비하전"이란, 경우에 따라, 주어진 모집단(예를 들면, 리포좀 모집단) 내의 몇몇 지질 성분이, 다른 성분의 반대 전하에 의해 취소되지 않는 전하를 포함하는 것을 의미한다(즉, 10% 미만, 보다 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만의 성분은 취소되지 않는 전하를 포함한다). 특정 실시형태에서, 중성 리포좀은 생리학적 조건하(즉, 약 pH 7에서)에서 중성인 지질 및/또는 인지질을 주로 포함할 수 있다.
본 실시형태의 리포좀 및/또는 지질-기반 나노입자는 인지질을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단일 종류의 인지질을 리포좀의 생성에 사용할 수 있다(예를 들면, DOPC 등의 중성 인지질을 사용하여, 중성 리포좀을 생성할 수 있다). 다른 실시형태에서, 2종 이상의 인지질을 사용하여 리포좀을 생성할 수 있다. 인지질은 천연 또는 합성 공급원일 수 있다. 인지질은, 예를 들면, 포스파티딜콜린, 포스파티딜 글리세롤 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하고; 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜 콜린은 생리학적 조건하(즉, 약 pH 7에서)에서 하전되지 않기 때문에, 이들 화합물은 중성 리포좀 생성에 특히 유용할 수 있다. 특정 실시형태에서, 인지질 DOPC는 하전되지 않은 리포좀을 생성하기 위해 사용된다. 특정 실시형태에서, 인지질이 아닌 지질(예를 들면, 콜레스테롤)을 사용할 수 있다.
인지질은 글리세로인지질 및 특정 스핑고지질을 포함한다. 인지질은 디올레오일포스파티딜콜린("DOPC"), 난(egg) 포스파티딜콜린("EPC"), 디라우릴로일포스파티딜콜린("DLPC"), 디미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"), 디팔미토일포스파티딜콜린("DPPC"), 디스테아로일포스파티딜콜린("DSPC"), 1-미리스토일-2-팔미토일포스파티딜콜린("MPPC"), 1-팔미토일-2-미리스토일포스파티딜콜린("PMPC"), 1-팔미토일-2-스테아로일포스파티딜콜린("PSPC"), 1-스테아로일-2-팔미토일포스파티딜콜린("SPPC"), 디라우릴로일포스파티딜 글리세롤("DLPG"), 디미리스토일포스파티딜 글리세롤("DMPG"), 다팔미토일포스파티딜글리세롤("DPPG"), 디스테아로일포스파티딜글리세롤("DSPG"), 디스테아로일 스핑고미엘린("DSSP"), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민("DSPE"), 디올레오일포스파티딜글리세롤("DOPG"), 디미리스토일 포스파티딕 애씨드("DMPA"), 디팔미토일 포스파티딕 애씨드("DPPA"), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민("DMPE"), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민("DPPE"), 디미리스토일 포스파티딜세린("DMPS"), 디팔미토일 포스파티딜세린("DPPS"), 브레인 포스파티딜세린("BPS"), 브레인 스핑고미엘린("BSP"), 디팔미토일 스핑고미엘린("DPSP"), 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DAPC"), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DBPC"), 1,2-디이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DEPC"), 디올레오일포스파티딜에탄올아민("DOPE"), 팔미토일로에오일 포스파티딜콜린("POPC"), 팔미토일로에오일포스파티딜에탄올아민("POPE"), 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민 및 딜리놀레오 일포스파티딜콜린을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다.
b. 엑소좀
"세포외 소포" 및 "EV"는 세포 유래 및 세포 분비 마이크로소포이고, 이는 클래스로서, 엑소좀, 엑소좀-유사 소포, 엑소좀(원형질 막으로부터 직접 소포가 발아하는 것으로부터 발생), 마이크로입자, 마이크로소포, 탈락 마이크로소포(SMV), 나노입자 및 심지어 (거대) 아폽토시스 수포 또는 신체(세포 사멸에 기인) 또는 막 입자를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "마이크로소포" 및 "엑소좀"은, 직경(또는 입자가 회전타원체가 아닌 가장 큰 치수)이 약 10nm 내지 약 5000nm, 보다 전형적으로 30nm 내지 1000nm, 가장 일반적으로 약 50nm 내지 750nm인 막 입자를 지칭하고, 여기서 엑소좀의 막의 적어도 일부는 세포로부터 직접 수득된다. 가장 일반적으로, 엑소좀은 공여체 세포 크기의 최대 5% 크기(평균 직경)를 갖는다. 따라서, 특히 고려되는 엑소좀은 세포로부터 탈락(shed)하는 것을 포함한다.
엑소좀은, 예를 들면, 체액 등의 임의의 적합한 샘플 유형에서 검출되거나 단리될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단리된"은 자연 환경으로부터의 분리를 지칭하고, 적어도 부분적 정제를 포함하는 것을 의미하고, 실질적 정제를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "샘플"은 본 발명에 의해 제공되는 방법에 적합한 임의의 샘플을 지칭한다. 샘플은, 검출 또는 단리에 적합한 엑소좀을 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 샘플 공급원에는 혈액, 골수, 흉막액, 복막액, 뇌척수액, 뇨, 타액, 양수, 악성 복수, 기관지 폐포 세척액, 활액, 모유, 땀, 눈물, 관절액 및 기관지 세척액이 포함된다. 한 가지 국면에서, 샘플은, 예를 들면, 전혈 또는 이의 임의의 분획 또는 성분을 포함하는 혈액 샘플이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 혈액 샘플은 정맥, 동맥, 말초, 조직, 탯줄 등의 혈액 세포 또는 이의 구성요소를 포함하는 공지된 임의의 공급원으로부터 추출할 수 있다. 예를 들면, 샘플은, 공지된 일상적 임상 방법(예: 전혈 채취 및 처리 절차)을 사용하여 샘플을 수득하고 처리할 수 있다. 한 가지 국면에서, 예시적인 샘플은 암을 갖는 대상체로부터 채취한 말초 혈액일 수 있다.
엑소좀은 또한, 외과적 샘플, 생검 샘플, 조직, 대변 및 배양된 세포 등의 조직 샘플로부터 단리될 수 있다. 조직 공급원에서 엑소좀을 단리하는 경우, 단일 세포 현탁액을 수득하기 위해 조직을 균질화하고, 이어서 세포를 용해하여 엑소좀을 방출하는 것이 필요할 수 있다. 조직 샘플에서 엑소좀을 분리하는 경우, 엑소좀의 파괴를 초래하지 않는 균질화 및 용해 절차를 선택하는 것이 중요한다. 본원에서 고려되는 엑소좀은, 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 용액, 예를 들면, 완충 생리식염수, 성장 배지, 다양한 수성 배지 등에서 체액으로부터 단리된다.
엑소좀은, 새로 수집된 샘플 또는 냉동 또는 냉장 보관된 샘플에서 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 엑소좀은 세포 배양 배지로부터 단리될 수 있다. 필요하지는 않지만, 샘플에서 파편을 제거하기 위해, 용적-제외 폴리머로 침전시키기 전에 유체 시료를 정화하면, 더 높은 순도의 엑소좀을 수득할 수 있다. 정화 방법에는 원심분리, 초원심분리, 여과 또는 한외여과가 포함된다. 가장 전형적으로, 엑소좀은 당해 기술분야에 공지된 다수의 방법에 의해 단리될 수 있다. 한 가지 바람직한 방법은 체액 또는 세포 배양 상청액으로부터의 차등 원심분리이다. 엑소좀 분리를 위한 예시적인 방법은 문헌[참조: Losche et al., 2004; Mesri and Altieri, 1998; Morel el al., 2004]에 기재되어 있다. 또는, 엑소좀은 또한 문헌[참조: Combes et al., 1997]에 기재된 바와 같이 유세포 분석을 통해 단리할 수 있다.
엑소좀의 단리를 위한 한 가지 허용된 프로토콜은, 종종 비교적 저밀도 엑소좀을 부유시키기 위해 수크로스 밀도 구배 또는 수크로스 쿠션과 조합된 초원심분리를 포함한다. 연속 차등 원심분리에 의한 엑소좀의 단리는, 다른 마이크로소포 또는 거대분자 복합체와 크기 분포가 중복될 가능성이 있기 때문에 복잡하다. 또한, 연속 원심분리는 이들의 크기에 따라 소포를 분리하는 데 불충분한 수단을 제공할 수 있다. 그러나, 연속 원심분리는, 수크로즈 구배 초원심분리와 조합하면, 엑소좀의 높은 농축을 제공할 수 있다.
초원심분리 경로에 대한 대안을 사용하여, 크기를 기준으로 하여 엑소좀을 단리하는 것은 또 다른 옵션이다. 초원심분리보다 시간이 덜 걸리고 특수 장비를 사용할 필요가 없는 한외여과 절차를 사용하여 엑소좀을 성공적으로 정제하는 것이 보고되었다. 마찬가지로, 상용 키트(EXOMIR™, Bioo Scientific)를 사용할 수 있고, 이는 하나의 마이크로필터에서 세포, 혈소판 및 세포 파편을 제거하고, 양압을 사용하여 유체를 구동하는 제2 마이크로필터에서 30nm보다 큰 소포를 포획할 수 있다. 그러나, 이 프로세스에서, 엑소좀은 회수되지 않고, RNA 함량은, 제2 마이크로필터에서 포획된 물질로부터 직접 추출하여 PCR 분석에 사용할 수 있다. HPLC 기반의 프로토콜은 잠재적으로 매우 순수한 엑소좀을 수득할 수 있다. 이러한 프로세스에는 전용 장비가 필요하고, 확장하기가 곤란하다. 중요한 문제는, 혈액 및 세포 배양 배지 모두에, 엑소좀과 동일한 크기 범위의 나노입자(일부 비소포성)가 다수 포함되어 있다는 것이다. 예를 들면, 일부 miRNA는, 엑소좀이 아닌 세포외 단백질 복합체 내에 포함될 수 있다. 그러나, 프로테아제(예를 들면, 프로테이나제 K)에 의한 처리를 수행하여, "엑스트라엑소좀" 단백질에 의한 오염 가능성을 제거할 수 있다.
다른 실시형태에서, 엑소좀은 면역 특이적 상호작용(예를 들면, 면역자기 포획)을 수반하는 것 등, 엑소좀의 샘플을 풍부하게 하기 위해 일반적으로 사용되는 기술에 의해 포획될 수 있다. 면역자기 세포 분리로도 공지된 면역자기 포획은, 일반적으로 특정 세포형에서 발견되는 단백질에 대한 항체를 작은 상자성 비드(paramagnetic bead)에 부착시키는 것을 포함한다. 항체-코팅된 비드가 혈액 등의 샘플과 혼합되면, 특정 세포에 부착되어 이를 둘러싼다. 이어서, 샘플을 강한 자기장에 배치하여, 비드를 편측으로 펠렛화한다. 혈액을 제거한 후, 포획된 세포는 비드와 함께 유지된다. 이러한 일반적 방법의 다수의 변형은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 엑소좀을 단리하는 데 사용하기에 적합하다. 한 가지 예에서, 엑소좀은 자기 비드(예: 알데히드/설페이트 비드)에 부착시키고, 이어서 항체를 혼합물에 첨가하여, 비드에 부착되어 있는 엑소좀의 표면 상의 에피토프를 인식할 수 있다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 카고를 로딩하기 전 또는 후에, 엑소좀은, 카고의 전달을 위한 비히클로서 이의 유용성을 증강시키기 위해 표적화 모이어 티를 포함시킴으로써 추가로 변경될 수 있다. 이와 관련하여, 엑소좀은, 특정 세포를 조직형으로 특이적으로 표적화하는 개체를 도입하도록 조작될 수 있다. 이 표적-특이적 실체, 예를 들면, 표적 세포 또는 조직상의 수용체 또는 리간드에 대한 친화성을 갖는 펩티드는, 예를 들면, 당해 기술분야에 충분히 확립된 방법을 사용하여 엑소좀 막 마커에 융합시킴으로써, 엑소좀 막 내에 통합될 수 있다.
2. 비지질 나노입자
구상 핵산(SNA™) 작제물 및 기타 나노입자(특히 금 나노입자)는 또한, 키메라 미니유전자를 의도된 표적 세포에 전달하는 수단으로 고려된다. 이들의 밀도가 높기 때문에, 대부분의 카고(예: DNA)는 세포 내의 작제물에 결합되어 있어, 핵산의 안정성과 효소 분해에 대한 내성을 부여한다. 연구된 모든 세포형(예: 뉴런, 종양 세포주 등)에 대해, 작제물은, 담체 또는 형질감염제를 필요로 하지 않고서, 99%의 형질감염 효율을 나타낸다. 작제물의 고유한 표적 결합 친화성 및 특이성은, 일치하는 표적 서열에 대한 절묘한 특이성을 가능하게 한다(즉, 제한된 표적외 효과). 이 작제물은, 기존의 주요 형질감염 시약(Lipofectamine 2000 및 Cytofectin)보다 성능이 크게 뛰어나다. 작제물은, 명백한 독성 없이, 다양한 배양 세포, 1차 세포 및 조직에 도입될 수 있다. 이 작제물은 전체 게놈 마이크로어레이 연구 및 사이토카인 특이적 단백질 검정에 의해 측정된 바와 같이, 글로벌 유전자 발현의 최소 변화를 유발한다. 작제물의 표면을 조정하기 위해, 임의 수의 단일 또는 조합 약제(예를 들면, 단백질, 펩티드, 소분자)를 사용할 수 있다. 예를 들면, 문헌[참조: Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ral52(2013)] 참조.
핵산 카고를 갖는 자가-조립 나노입자는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 원위 말단에 부착된 Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드 리간드로 PEG화된 폴리에틸렌이민(PEI)으로 구성될 수 있다. 나노플렉스는, 양이온성 폴리머와 핵산의 동일한 용적의 수용액을 혼합하여, 2 내지 6의 범위에 걸쳐 순 몰 과량의 이온성 질소(중합체) 내지 포스페이트(핵산)를 제공함으로써 제조할 수 있다. 양이온성 폴리머와 핵산 사이의 정전기적 상호작용은, 약 100nm의 평균 입자 크기 분포를 갖는 폴리플렉스의 형성을 초래하고, 따라서 본원에서는 나노플렉스로 지칭된다[참조: 예를 들면, Bartlett et al, PNAS, 104: 39, 2007].
C. 캡슐화된 세포 이식
본원의 키메라 미니유전자는, 생체외 세포로 전달될 수 있으며, 그 후, 표적 유전자를 환자에게 전달하기 위해, 캡슐화되고 이식된다. 예를 들면, 외인성 이종 핵산이 도입된 환자 또는 공여체로부터 단리된 세포는, 캡슐화된 세포의 이식에 의해 환자에게 직접 전달될 수 있다. 캡슐화된 세포 이식의 장점은, 세포에 대한 면역 반응이 캡슐화에 의해 감소된다는 것이다. 따라서, 본원에서 제공된 것은, 유전자 변형된 세포 또는 세포를 대상체에게 투여하는 방법이다. 전달되는 세포의 수는, 원하는 효과, 특정 핵산, 치료할 대상 및 기타 유사한 인자에 의존하고, 당업자에 의해 결정될 수 있다.
유전자 치료 목적으로 핵산을 도입할 수 있는 세포는, 원하는 임의의 이용 가능한 세포형을 포함하고, 상피 세포, 내피 세포, 각질세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; T 림프구, B 림프구, 단핵구, 대식세포, 호중구, 호산구, 거핵구, 과립구 등의 혈액 세포; 다양한 줄기 또는 전구 세포, 특히 조혈 줄기 또는 전구 세포, 예를 들면, 골수, 제대혈, 말초혈 또는 태아 간으로부터 수득된 세포를 포함하지만, 이들로 한정되지 않는다. 예를 들면, 유전적으로 변형된 세포는, 다능성 또는 전능성 줄기 세포(유도된 다능성 줄기 세포 포함)일 수 있거나, 배아, 태아성 또는 완전히 분화된 세포일 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 동일한 대상체의 세포일 수 있거나, 수용자 대상체와 동일하거나 상이한 종의 세포일 수 있다. 바람직한 예에서, 유전자 치료에 사용되는 세포는, 환자에게 자가 조직이다. 세포를 유전적으로 변형하고 세포를 이식하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
전형적으로, 핵산은, 생성된 재조합 세포의 생체내 투여 전에 세포 내로 도입된다. 이러한 도입은 형질감염, 전기천공, 미세주입, 핵산 서열을 포함하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터에 의한 감염, 세포 융합, 염색체 매개 유전자 전달, 마이크로셀 매개 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등을 포함하지만, 이들로 한정되지 않는, 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 외래 유전자를 세포에 도입하기 위한 다수의 기술이 당해 기술분야에 공지되어 있고[참조: 예를 들면, Loeffler and Behr, Meth. Enzymol.(1993) 217: 599-618; Cotten et al, Meth. Enzymol.(1993) 217: 618-644; Cline, Pharmac. Ther.(1985) 29: 69-92], 수용 세포의 필요한 발달 및 생리적 기능이 파괴되지 않는 조건에서 사용할 수 있다. 특정 예에서, 이 방법은, 핵산의 세포에 대한 안정한 이동을 가능하게 하는 것이고, 그 결과, 핵산은 세포에 의해 발현가능하고, 그의 세포 자손에 의해 유전가능 및 발현가능하다.
캡슐화는, 알기네이트/폴리라이신 복합체로 코팅된 알기네이트 마이크로캡슐을 사용하여 수행할 수 있다. 하이드로겔 마이크로캡슐은, 조직 공학 및 재생 의학을 위한 살아 있는 세포 또는 세포 응집체의 캡슐화에 대해 광범위하게 연구되어 있다[참조: Orive, et al. Nat. Medicine 2003, 9, 104; Paul, et al, Regen. Med. 2009, 4, 733; Read, et al. Biotechnol. 2001, 19, 29]. 일반적으로, 캡슐은, 세포에서 분비되는 치료 단백질을 방출하면서, 캡슐화된 세포로 산소와 영양소를 용이하게 확산시키고, 세포를 면역계에 의한 공격으로부터 보호하도록 설계되었다. 이들은, I형 당뇨병, 암 및 파킨슨병 등의 신경퇴행성 장애를 포함한 다양한 질환의 잠재적 치료제로서 개발되었다[참조: Wilson et al. Adv. Drug. Deliv. Rev. 2008, 60, 124; Joki, et al. Nat. Biotech. 2001, 19, 35; Kishima, et al. Neurobiol. Dis. 2004, 16, 428]. 가장 일반적 캡슐 제형 중의 하나는, 이온 가교를 통해 형성될 수 있는 알기네이트 하이드로겔을 기반으로 한다. 전형적 프로세스에서, 세포는 먼저 점성 알기네이트 용액과 혼합한다. 이어서, 세포 현탁액은 공기 전단, 음향 진동 또는 정전기 액적 형성 등의 다른 방법을 사용하여 미세 액적으로 처리된다[참조: Rabanel et al. Biotechnol. Prog. 2009, 25, 946]. 알기네이트 액적은 Ca2+ 또는 Ba2+ 등의 2가 이온 용액과 접촉하면 겔화된다.
포유동물 세포를 대상체에 이식하기 위한 캡슐이 개시되어 있다. 캡슐은, 이식될 세포를 캡슐화하는 생체적합성 하이드로겔 형성 폴리머로 형성된다. 캡슐의 과성장(섬유증)을 억제하기 위해, 캡슐의 구조는 세포 물질이 캡슐 표면에 위치하는 것을 방지한다. 또한, 캡슐의 구조는, 세포와 적절한 가스 교환이 발생하고 영양분이 그 안에 캡슐화된 세포에 의해 수용되는 것을 보장한다. 임의로, 캡슐은 또한 조절 방출을 위해 그 안에 캡슐화된 하나 이상의 항염증 약물을 포함한다.
개시된 조성물은, 이식될 세포를 캡슐화하는 생체적합성 하이드로겔 형성 중합체로부터 형성된다. 적합한 하이드로겔을 형성하기 위해 사용할 수 있는 물질의 예에는 알기네이트, 콜라겐, 키토산, 나트륨 셀룰로오즈 설페이트, 젤라틴 및 아가 로스 등의 다당류, 수용성 폴리아크릴레이트, 폴리포스파진, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 폴리(알킬렌옥사이드), 폴리(비닐아세테이트), 폴리비닐피롤리 돈(PVP) 및 각각의 공중합체 및 블렌드를 포함한다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,709,854호, 제6,129,761호, 제6,858,229호 및 제9,555,007호].
IV. 약제학적 조성물
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는"은, 생물학적으로 허용되는 조성물, 제형, 액체 또는 고체, 또는 이들의 혼합물을 의미하고, 이는 하나 이상의 투여 경로, 생체내 전달 또는 접촉에 적합하다. "약제학적으로 허용되는" 또는 "생리학적으로 허용되는" 조성물은, 생물학적으로 또는 달리 바람직한 물질이며, 예를 들면, 물질은 실질적으로 바람직하지 않은 생물학적 효과를 유발하지 않으면서 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 조성물, "약제학적으로 허용되는" 및 "생리학적으로 허용되는" 제형 및 조성물은 멸균될 수 있다. 이러한 약제학적 제형 및 조성물은, 예를 들면, 바이러스 입자 또는 나노입자를 대상체에게 투여하는데 사용될 수 있다.
이러한 제형 및 조성물은, 약제학적 투여 또는 생체내 접촉 또는 전달과 적합성이 있는, 용매(수성 또는 비수성), 용액(수성 또는 비수성), 에멀젼(예: 수중유 또는 유중수), 현탁액, 시럽, 엘릭시르, 분산액, 현탁 매질, 코팅, 등장성 및 흡수 촉진제 또는 지연제를 포함한다. 수성 및 비수성 용매, 용액 및 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 보충 활성 화합물(예: 방부제, 항균제, 항바이러스제 및 항진균제)이 또한 제형 및 조성물에 포함될 수 있다.
약제학적 조성물은, 전형적으로 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유한다. 이러한 부형제는, 그 자체가 조성물을 제공받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 자체적으로 유도하지 않고서, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 약제를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 부형제는 소르비톨, 트윈 80 및 물, 생리식염수, 글리세롤 및 에탄올 등의 액체를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들면, 염산염, 브롬화수소화물, 인산염, 황산염 등의 무기산염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등의 유기산의 염을 포함한다. 추가로, 계면활성제, 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등의 보조 물질이 이러한 비히클 중에 존재할 수 있다,
약제학적 조성물은 본원에 제시되거나 당업자에게 공지된 특정 투여 또는 전달 경로와 적합성이 있도록 제형화될 수 있다. 따라서, 약제학적 조성물은 다양한 경로에 의한 투여 또는 전달에 적합한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
바이러스 입자 또는 나노입자의 주사 또는 주입에 적합한 약제학적 형태는 임의로 리포좀에 캡슐화된, 멸균 주사가능 또는 주입가능한 용액 또는 분산액의 즉시 제조에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액을 포함할 수 있다. 모든 경우에, 최종적 형태는 멸균된 액체이고, 제조, 사용 및 보관 조건에서 안정적이어야 한다. 액체 담체 또는 비히클은, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 무독성 글리세릴 에스테르, 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 리포좀의 형성에 의해, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기를 유지하거나 계면활성제를 사용하여 유지될 수 있다. 등장화제, 예를 들면, 당, 완충제 또는 염(예: 염화나트륨)이 포함될 수 있다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물에서의 사용에 의해 야기될 수 있다.
바이러스 입자 또는 나노입자의 용액 또는 현탁액은, 경우에 따라, 다음 성분 중의 하나 이상을 포함할 수 있다: 주사용수 등의 멸균 희석제, 인산염 완충된 생리식염수(PBS) 등의 염수 용액, 인공 CSF, 계면활성제, 고정유, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 글리세린 또는 기타 합성 용매; 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산 등의 항균 및 항진균제; 아스코르브산 또는 중아황산나트륨 등의 항산화제; 에틸렌디아민테트라 아세트산 등의 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 등의 완충제 및 염화나트륨 또는 덱스트로스 등의 긴장성 조절용 제제.
본 발명의 조성물, 방법 및 용도에 적합한 약제학적 제형, 조성물 및 전달 시스템은 당해 기술분야에 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Remington: The Science and Practice of Pharmacy(2003) 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; Remington's Pharmaceutical Sciences(1990) l8th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index(1996) l2th ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms(1993), Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.; Ansel and Stoklosa, Pharmaceutical Calculations(2001) 11th ed., Lippincott Williams & Wilkins, Baltimore, MD; and Poznansky et al, Drug Delivery Systems(1980), RL Juliano, ed., Oxford, NY, pp. 253-315].
바이러스 입자, 나노입자 및 이들의 조성물은, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해, 투여 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에 사용된 투여 단위 형태는, 치료할 개체에 대한 단위 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 미리 결정된 양의 활성 화합물을 함유한다. 투여 단위 형태는 원하는 효과(들)를 생성하는 데 필요하다고 생각되는 바이러스 입자 또는 나노입자의 수에 따라 의존한다. 필요한 양은 단일 용량으로 제형화될 수 있거나 다중 용량 단위로 제형화될 수 있다. 용량은 적절한 바이러스 입자 또는 나노입자 농도로 조정될 수 있고, 임의로 항염증제와 조합되고 사용을 위해 포장될 수 있다.
한 가지 실시형태에서, 약제학적 조성물은 치료학적 유효량, 즉 문제의 질환 상태의 증상 또는 부작용을 감소 또는 개선하기에 충분한 양 또는 원하는 이점을 부여하기에 충분한 양을 제공하기에 충분한 유전 물질을 포함할 것이다. .
본원에 사용된 "단위 투여 형태"는 치료될 대상체에 대한 단위 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하고; 각 단위는 임의로 약제학적 담체(부형제, 희석제, 비히클 또는 충전제)와 연관되어 미리 결정된 양을 함유하고, 이는, 하나 이상의 용량으로 투여되면, 원하는 효과(예를 들면, 예방 또는 치료 효과)를 생성하도록 계산된다. 단위 투여 형태는, 예를 들면, 액체 조성물, 또는 동결 건조 또는 동결건조 상태의 조성물을 포함할 수 있는 앰플 및 바이알 내에 있을 수 있고; 예를 들면, 멸균 액체 담체는, 생체내 투여 또는 전달 전에 첨가될 수 있다. 개별 단위 투여 형태는, 다중 투여 키트 또는 용기에 포함될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 바이러스 입자, 나노입자 및 이의 약제학적 조성물은, 투여를 용이하게 하고 투여량을 균일하게 하기 위해, 단일 또는 복수 단위 투여 형태로 포장될 수 있다.
바이러스 입자 또는 나노입자를 함유하는 제형은, 전형적으로 유효량을 함유하고, 유효량은 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 바이러스 입자 또는 나노입자는, 통상, 조성물의 약 1% 내지 약 95%(w/w), 또는 적합한 경우에는 더 높은 범위일 수 있다. 투여되는 양은, 포유동물 또는 치료를 고려한 인간 대상체의 연령, 체중 및 신체 상태 등의 요인에 의존한다. 유효 용량은, 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적 시험을 통해 당업자에 의해 확립할 수 있다.
V. 정의
용어 "폴리뉴클레오티드", "핵산" 및 "도입유전자"는, 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA) 및 이의 중합체를 포함하는 모든 형태의 핵산, 올리고뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 폴리뉴클레오티드에는 게놈 DNA, cDNA 및 안티센스 DNA, 스플라이싱되거나 스플라이싱되지 않은 mRNA, rRNA, tRNA 및 억제 DNA 또는 RNA(RNAi, 예: 작거나 짧은 헤어핀(sh)RNA, microRNA(miRNA), 작거나 짧은 간섭(si) RNA, 트랜스-스플라이싱 RNA 또는 안티센스 RNA)이 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 천연 존재, 합성 및 의도적으로 변형되거나 변경된 폴리뉴클레오티드(예: 변이 핵산)를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 일본쇄, 이본쇄 또는 트리플렉스, 선형 또는 원형일 수 있고, 임의의 적절한 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대해 논의할 때에, 특정 폴리뉴클레오티드의 서열 또는 구조는, 5'으로부터 3' 방향으로 서열을 제공하는 관행에 따라 본원에 기재될 수 있다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산은, 종종, 폴리펩티드를 코딩하는 개방 판독 프레임을 포함한다. 달리 명시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한 축퇴성 코돈 치환을 포함한다.
핵산은, 개방 판독 프레임에 작동적으로 연결된 하나 이상의 발현 조절 또는 조절 요소를 포함할 수 있고, 여기서 하나 이상의 조절 요소는, 포유동물 세포에서 개방 판독 프레임에 의해 코딩된 폴리펩티드의 전사 및 번역을 지시하도록 구성된다. 발현 조절/조절 요소의 비제한적인 예는 전사 개시 서열(예를 들면, 프로모터, 인핸서, TATA 박스 등), 번역 개시 서열, mRNA 안정성 서열, 폴리 A 서열, 분비 서열 등을 포함한다. 발현 조절/조절 요소는 임의의 적합한 생물의 게놈에서 수득할 수 있다.
"프로모터"는, RNA 폴리머라제 및 적절한 전사에 필요한 다른 인자의 번역을 제공함으로써 코딩 서열의 발현을 지시 및/또는 조절하는, 통상은 코딩 서열의 상류(5')인 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. "프로모터"는, TATA-박스 및 임의로 발현 조절을 위해 조절 요소가 부가되는 전사 개시 부위를 특정하는 역할을 하는 다른 서열로 구성된 짧은 DNA 서열인 최소 프로모터를 포함한다.
"인핸서"는, 전사 활성을 자극할 수 있는 DNA 서열이고, 프로모터의 타고난 요소, 또는 발현 수준 또는 조직 특이성을 증강시키는 이종 요소일 수 있다. 이는 방향(5'→3' 또는 3'→5')으로 작동할 수 있고, 프로모터의 상류 또는 하류에 위치하는 경우에도 기능할 수 있다.
프로모터 및/또는 인핸서는, 이의 전체가 천연 유전자로부터 유래될 수 있거나, 자연계에서 발견되는 상이한 요소로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트로 구성될 수 있다. 프로모터 또는 인핸서는 자극, 생리학적 또는 발달적 조건에 대한 반응으로 전사 개시의 효과를 조절/제어하는 단백질 인자의 결합에 관여하는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
비제한적 예는, SV40 초기 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스 LTR 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 프로모터, CMV 즉시 초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, pol II 프로모터, pol III 프로모터, 합성 프로모터, 하이브리드 프로모터 등의 거대 세포 바이러스(CMV) 프로모터 등을 포함한다. 또한, 뮤린 메탈로티오네 인 유전자 등의 비-바이러스 유전자로부터 유래된 서열도 본원에서 사용될 것이다. 예시적 구성적 프로모터에는 특정 구성적 또는 "하우스키핑(housekeeping)" 기능을 코딩하는 다음 유전자의 프로모터가 포함된다: 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스페라제(HPRT), 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR), 아데노신 데아미나제, 포스포글리세롤 키나제(PGK), 피루베이트 키나제, 포스포글리세롤 뮤타제, 액틴 프로모터, 및 당업자에게 공지된 다른 구성적 프로모터. 또한, 다수의 바이러스 프로모터는 진핵세포에서 구성적으로 기능한다. 여기에는 SV40의 초기 및 후기 프로모터; 몰로니 백혈병 바이러스 및 기타 레트로바이러스의 긴 말단 반복(LTR); 및 다른 많은 것들 중에서, 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 포함한다. 따라서, 상기 언급된 구성적 프로모터 중의 임의의 것을 사용하여, 이종 유전자 삽입물의 전사를 조절할 수 있다.
"도입유전자"는, 세포 또는 생물로 의도되거나 도입된 핵산 서열/폴리뉴클레오티드를 편의상 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 도입유전자는, 억제성 RNA 또는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 등의 임의의 핵산을 포함하고, 일반적으로 천연 존재 AAV 게놈 서열에 대해 이종성이다.
용어 "형질도입"은, 벡터(예를 들면, 바이러스 입자)를 통해 핵산 서열을 세포 또는 숙주 생물로 도입하는 것을 지칭한다. 따라서, 바이러스 입자에 의한 세포 내로의 도입유전자의 도입은, 세포의 "형질도입"으로 지칭될 수 있다. 도입유전자는, 형질도입된 세포의 게놈 핵산에 통합되거나 통합되지 않을 수 있다. 도입된 도입유전자가 수용자 세포 또는 생물의 핵산(게놈 DNA)에 통합되면, 해당 세포 또는 생물에서 안정적으로 유지될 수 있고, 추가로 자손 세포 또는 수용자 세포 또는 생물로 전달되거나 유전될 수 있다. 마지막으로, 도입된 도입유전자는, 수용자 세포 또는 숙주 생물에 염색체 외로 또는 일시적으로만 존재할 수 있다. 따라서, "형질도입된 세포"는, 형질도입을 통해 도입유전자가 도입된 세포이다. 따라서, "형질도입된" 세포는, 도입유전자가 도입된 세포 또는 그의 자손이다. 형질도입된 세포는 증식되고, 도입유전자가 전사되고, 코딩된 억제성 RNA 또는 단백질이 발현될 수 있다. 유전자 치료 용도 및 방법의 경우, 형질도입된 세포는 포유동물에 존재할 수 있다.
유도성 프로모터의 조절하에 있는 도입유전자는, 유도제의 존재하에서만 또는 더 큰 정도로 발현된다(예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에서 전사는 특정 금속 이온의 존재하에서 크게 증가됨). 유도성 프로모터에는, 유도 인자가 결합될 때에 전사를 자극하는 반응 요소(RE)가 포함된다. 예를 들면, 혈청 인자, 스테로이드 호르몬, 레티노산 및 사이클릭 AMP에 대한 RE가 있다. 특정 RE를 포함하는 프로모터는, 유도성 반응을 수득하기 위해 선택될 수 있고, 경우에 따라 RE 자체를 상이한 프로모터에 부착시켜, 이에 의해 재조합 유전자에 유도성을 부여할 수 있다. 따라서, 적절한 프로모터(구성적 대 유도성, 강함 대 약함)를 선택함으로써, 유전적으로 변형된 세포에서 폴리펩티드의 존재와 발현 수준을 모두 조절할 수 있다. 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 유도성 프로모터의 조절하에 있는 경우, 인 사이투(in situ)에서 폴리펩티드의 전달은, 예를 들면, 약제의 전사를 조절하는 유도성 프로모터의 특정 유도물질의 복강내 주사에 의해, 폴리펩티드의 전사를 가능하게 하는 조건으로 인 사이투에서 유전적 변형 세포를 노출시킴으로써 유발된다. 예를 들면, 메탈로티오네인 프로모터의 조절하에 있는 유전자에 의해 코딩된 폴리펩티드의 유전자 변형 세포에 의한 인 사이투 발현은, 유전적 변형 세포를 적절한(즉, 유도하는) 금속 이온을 포함하는 용액과 접촉시킴으로써 증강된다.
핵산/도입유전자는, 그것이 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 위치할 때, "작동적으로 연결"된다. RNAi 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산/도입유전자, 또는 폴리펩티드의 발현을 지시하는 핵산은, 유도성 프로모터, 또는 코딩된 폴리펩티드의 전사를 조절하기 위한 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 핵산은 또한 발현 카세트로 지칭될 수 있다.
특정 실시형태에서, CNS-특이적 또는 유도성 프로모터, 인핸서 등이, 본원에 기재된 방법 및 용도에 사용된다. CNS-특이적 프로모터의 비제한적 예는, 미엘린 염기성 단백질(MBP), 글리아 섬유성 산 단백질(GFAP) 및 뉴런 특이적 에놀라 제(NSE)로부터의 유전자로부터 단리된 것들을 포함한다. 유도성 프로모터의 비제한적 예에는 엑디손, 테트라사이클린, 저산소증 및 IFN의 DNA 반응성 요소가 포함된다.
특정 실시형태에서, 발현 조절 요소는 CMV 인핸서를 포함한다. 특정 실시형태에서, 발현 조절 요소는 베타 액틴 프로모터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 발현 조절 요소는 치킨 베타 액틴 프로모터를 포함한다. 특정 실시형태에서, 발현 조절 요소는 CMV 인핸서 및 치킨 베타 액틴 프로모터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "변형" 또는 "변이체" 및 이의 문법적 변형은, 핵산, 폴리펩티드 또는 이의 부분서열이 참조 서열에서 벗어남을 의미한다. 따라서, 변형 및 변이체 서열은 참조 서열과 실질적으로 동일하거나, 더 크거나 더 적은 발현, 활성 또는 기능을 가질 수 있지만, 적어도 참조 서열의 부분적 활성 또는 기능을 유지한다. 특정 유형의 변이체는 돌연변이 단백질이고, 이는, 돌연변이, 예를 들면, 미스센스 또는 넌센스 돌연변이를 갖는 유전자에 의해 코딩된 단백질을 지칭한다.
"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 변이체는, 야생형과 비교하여 유전적으로 변경된 변형된 서열을 지칭한다. 서열은, 코딩된 단백질 서열을 변경하지 않고서 유전적으로 변형될 수 있다. 또는, 서열은 변이 단백질을 코딩하기 위해 유전적으로 변형될 수 있다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 변이체는 또한, 야생형 단백질 서열 등의 참조 서열에 대해 적어도 부분적 서열 동일성을 여전히 보유하는 단백질을 코딩하도록 코돈 변형되고, 또한 코돈-변형되어 변이체 단백질을 코딩하는, 조합 서열을 지칭할 수 있다. 예를 들면, 이러한 핵산 변이체의 일부 코돈은, 이에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산을 변경하지 않고서 변경되고, 핵산 변이체의 일부 코돈은, 이에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산이 변경할 것이다.
용어 "단백질" 및 "폴리펩티드"는, 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 본원에 개시된 "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "도입유전자"에 의해 코딩된 "폴리펩티드"는, 천연 존재 야생형 및 기능적 다형성 단백질, 이의 기능적 부분서열(단편), 및 이의 서열 변이체와 마찬가지로, 폴리펩티드가 어느 정도의 기능 또는 활성을 유지하는 한, 부분 또는 전장 천연 서열을 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법 및 용도에서, 핵산 서열에 의해 코딩된 이러한 폴리펩티드는, 결함이 있거나, 치료된 포유동물에서 이의 활성, 기능 또는 발현이 불충분하거나, 결핍되거나, 부재하는 내인성 단백질과 동일할 필요가 없다.
변형의 비제한적 예는, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 치환(예: 약 1 내지 약 3, 약 3 내지 약 5, 약 5 내지 약 10, 약 10 내지 약 15, 약 15 내지 약 20, 약 20 내지 약 25, 약 25 내지 약 30, 약 30 내지 약 40, 약 40 내지 약 50, 약 50 내지 약 100, 약 100 내지 약 150, 약 150 내지 약 200, 약 200 내지 약 250, 약 250 내지 약 500, 약 500 내지 약 750, 약 750 내지 약 1000 이상의 뉴클레오티드 또는 잔기)을 포함한다.
아미노산 변형의 예는, 보존적 아미노산 치환 또는 결실이다. 특정 실시형태에서, 변형 또는 변이체 서열은, 변형되지 않은 서열(예를 들면, 야생형 서열)의 기능 또는 활성의 적어도 일부를 보유한다.
아미노산 변형의 또 다른 예는, 바이러스 입자의 캡시드 단백질에 도입된 표적화 펩티드이다. 재조합 바이러스 벡터 또는 나노입자를, 혈관 내피 세포 등의 중추신경계에 표적화하는 펩티드가 동정되었다. 따라서, 예를 들면, 뇌 혈관 내피 세포는 변형된 재조합 바이러스 입자 또는 나노입자에 의해 표적화될 수 있다.
이렇게 변형된 재조합 바이러스는, 다른 유형의 조직(예: 간 조직)보다 한 유형의 조직(예: CNS 조직)에 우선적으로 결합할 수 있다. 특정 실시형태에서, 변형된 캡시드 단백질을 보유하는 재조합 바이러스는, 유사한 비변형 캡시드 단백질보다 높은 수준으로 결합함으로써, 뇌 혈관 상피 조직을 "표적화"할 수 있다. 예를 들면, 변형된 캡시드 단백질을 갖는 재조합 바이러스는, 변형되지 않은 재조합 바이러스보다 50% 내지 100% 높은 수준으로 뇌 혈관 상피 조직에 결합할 수 있다.
"핵산 단편"은 주어진 핵산 분자의 일부이다. 대부분의 생물에서 데옥시리보핵산(DNA)은 유전 물질이고, 리보핵산(RNA)은 DNA에 포함된 정보를 단백질로 전달하는 데 관여한다. 개시된 뉴클레오티드 서열 및 단백질의 단편 및 변이체, 또는 이에 의해 코딩되는 부분 길이 단백질도 본 발명에 포함된다. "단편" 또는 "부분"은 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열의 전체 길이 또는 전체 길이 미만을 의미한다. 특정 실시형태에서, 단편 또는 부분은 생물학적으로 기능적이다(즉, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60% , 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%의 야생형의 활성 또는 기능).
분자의 "변이체"는 천연 분자의 서열과 실질적으로 유사한 서열이다. 뉴클레오티드 서열의 경우, 변이체에는, 유전 코드의 축퇴성으로 인해, 천연 단백질의 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열이 포함된다. 이러한 천연 존재 대립유전자 변이체는, 예를 들면, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 및 하이브리드화 기술 등의 분자생물학 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 또한, 예를 들면, 천연 단백질을 코딩하는 부위 특이적 돌연변이유발을 사용하여 생성된 것 등의 합성적 유래 뉴클레오티드 서열, 뿐만 아니라 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체는, 천연(내인성) 뉴클레오티드과 적어도 40%, 50%, 60%, 내지 70%, 예를 들면, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 내지 79%, 일반적으로 적어도 80%, 예를 들면, 8l% 내지 84%, 적어도 85%, 예를 들면, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 내지 98% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 변이체는 생물학적으로 기능적이다(즉, 야생형의 활성 또는 기능의 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%).
특정 핵산 서열의 "보존적 변이"는, 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 이들의 핵산 서열을 지칭한다. 유전자 코드의 퇴행성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산이 임의의 주어진 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들면, 코돈 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 코딩한다. 따라서, 아르기닌이 코돈에 의해 지정되는 모든 위치에서, 코딩된 단백질을 변경하지 않고서, 코돈을 기재된 상응하는 임의의 코돈으로 변경할 수 있다. 이러한 핵산 변이체는 "사일런싱 변이"이고, 이는 "보존적으로 변형된 변이체"의 일종이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원에 기재된 모든 핵산 서열은, 달리 언급된 경우를 제외하고, 가능한 모든 사일런싱 변이체를 기재한다. 당업자는, 핵산 중의 각 코돈(보통, 메티오닌에 대한 유일한 코돈인 ATG 제외)이, 표준 기술에 의해 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 "사일런싱 변이"는 각각의 기재된 서열에 명시되어 있다.
폴리뉴클레오티드 서열의 "실질적인 동일성"이라는 용어는 폴리뉴클레오티드가, 표준 파라미터를 사용하여 기재된 정렬 프로그램 중의 하나를 사용하는 참조 서열과 비교하여, 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78% 또는 79%, 또는 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88% 또는 89%, 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%, 또는 심지어 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 당업자는, 이들 값을 적절하게 조정하여, 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치 등을 고려함으로써, 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 상응하는 동일성을 결정할 수 있음을 인식할 것이다. 이러한 목적을 위한 아미노산 서열의 실질적인 동일성은, 통상, 적어도 70%, 적어도 80%, 90%, 또는 심지어 적어도 95%의 서열 동일성을 의미한다.
폴리펩티드의 문맥에서 용어 "실질적 동일성"은 폴리펩티드가, 특정된 비교 윈도우에 걸쳐 참조 서열과 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 또는 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 또는 94%, 또는 심지어 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 2개의 폴리펩티드 서열이 동일하다는 징후는, 하나의 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 반응한다는 것이다. 따라서, 폴리펩티드는, 예를 들면, 2개 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 제2 폴리펩티드와 동일한다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 치료적 치료 및 예후적 또는 예방적 조치를 모두 지칭하며, 여기서 이 목적은 질환의 발달, 진행 또는 악화 등의 원치 않는 생리적 변화 또는 장애를 예방, 억제, 감소 또는 저하시키는 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 원하는 임상 결과에는, 검출 가능하든지 검출 불가능하든지, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 질환의 증상 또는 부작용의 안정화(즉, 악화되거나 진행되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선 또는 완화 및 관해(부분적이든 전체적이든)가 포함되지만 이들로 한정되지 않는다. "치료"는 또한, 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장하는 것을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 사람은, 이미 질환이나 장애가 있는 사람뿐만 아니라, 소인이 있는 사람(예: 유전자 검정에 의해 결정됨)을 포함한다.
용어 "포함하는(comprising)", "갖는(having)", "포함하는(including)" 및 "함유하는(containing)"은, 달리 언급되지 않는 한, 개방형 용어(즉, "포함하지만 이들로 한정되지 않는"을 의미한다)로서 해석되어야 한다.
본원에 설명된 모든 방법 및 사용은, 본원에서 달리 지시되거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 예 또는 예시적 언어(예: "예컨대" 또는 "예를 들면")의 사용은, 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것을 의도하고, 달리 청구되지 않는 한, 본 발명의 범위에 제한을 두지 않는다. 명세서의 어떤 문언도, 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실행에 필수적인 것을 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다.
본원에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 명세서에 개시된 각각의 특징은, 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대안적 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 특징(예: 변형된 핵산, 벡터, 플라스미드, 재조합 벡터 서열, 벡터 게놈 또는 바이러스 입자)은 동등하거나 유사한 특징의 속의 예이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 형태 "단수형(a)", "및(and)" 및 "그것(the)"은, 문맥상 달리 명백히 나타내지 않는 한, 단수형 및 복수형 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들면, "핵산"에 대한 언급은 복수의 이러한 핵산을 포함하고, "벡터"에 대한 언급은 복수의 이러한 벡터를 포함하고, "바이러스" 또는 "AAV 또는 rAAV 입자"에 대한 언급은 복수의 이러한 비리온/AAV 또는 rAAV 입자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약(about)"은, 참조 값의 10%(플러스 또는 마이너스) 이내의 값을 지칭한다.
본원에서 값의 범위를 인용하는 것은, 본원에서 달리 지시하지 않는 한, 범위 내에 있는 각각의 별개 값을 개별적으로 지칭하는 간략화된 방법으로서 역할을하는 것으로 의도되며, 각각의 개별 값은, 본원에 개별적으로 기재된 것과 같이 명세서에 포함된다. .
따라서, 모든 수치 또는 수치 범위는, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 이러한 범위 내의 정수 및 값의 분수 또는 범위 내의 정수를 포함한다. 따라서, 설명하기 위해, 80% 이상의 동일성에 대한 언급은 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 등, 및 81.1%, 81.2%, 81.3%, 81.4%, 81.5% 등, 82.1%, 82.2%, 82.3%, 82.4%, 82.5% 등을 포함한다.
이상(초과) 또는 미만의 정수에 대한 언급은 각각 참조 수치보다 크거나 작은 임의의 수를 포함한다. 따라서, 예를 들면, 100 미만에 대한 언급은 숫자 하나(1)씩 내려가는 99, 98, 97 등을 포함하고, 10 미만의 경우는, 숫자 하나(1)씩 내려가는 9, 8, 7 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 모든 수치 또는 범위는, 문맥이 달리 명시하지 않는 한, 이러한 범위 내의 수치 및 정수의 소수부 및 이러한 범위 내의 정수의 소수부를 포함한다. 따라서, 설명하기 위해, 1-10 등의 수치 범위에 대한 언급은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 뿐만 아니라 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등을 포함한다. 따라서, 1-50 범위에 대한 언급에는, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 등, 및 최대 50, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 등, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5 등을 포함한다.
일련의 범위에 대한 언급은, 일련의 범위 내의 상이한 범위의 경계 값을 조합하는 범위를 포함한다. 따라서, 일련의 범위에 대한 언급을 설명하기 위해, 예를 들면, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500-3,000, 3,000-3,500, 3,500-4,000, 4,000-4,500, 4,500-5,000, 5,500-6,000, 6,000-7,000, 7,000-8,000 또는 8,000-9,000의 범위는, 10-20, 10-50, 30-50, 50-100, 100-300, 100-1,000, 1,000-3,000, 2,000-4,000, 4,000-6,000 등의 범위를 포함한다.
VI. 키트
본 발명은 팩키징 재료 및 그 안에 하나 이상의 구성요소를 구비한 키트를 제공한다. 키트는, 전형적으로, 구성요소에 대한 설명 또는 그 안의 구성요소의 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 사용하기 위한 설명서를 포함하는 라벨 또는 팩키징 삽입물을 포함한다. 키트는, 이러한 성분의 콜렉션, 예를 들면, 핵산, 재조합 벡터, 바이러스 입자, 스플라이싱 변형인자 분자 및 임의로 다른 화합물, 약제, 약물 또는 조성물 등의 제2 활성제를 포함할 수 있다.
키트는, 키트의 하나 이상의 구성요소를 수용하는 물리적 구조를 지칭한다. 팩키징 재료는, 구성요소를 멸균 상태로 유지할 수 있고, 이러한 목적으로 일반적으로 사용되는 재료(예: 종이, 골판지 섬유, 유리, 플라스틱, 호일, 앰플, 바이알, 튜브 등)로 제작될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은, 그 안의 하나 이상의 성분의 식별 정보, 투여량, 작용 메카니즘을 포함하는 활성 성분(들)의 임상 약리학, 약동학 및 약력학을 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는, 제조업체, 로트 번호, 제조 장소 및 날짜, 만료 날짜를 식별하는 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는, 제조업체 정보, 로트 번호, 제조업체 장소 및 날짜를 식별하는 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는, 키트 구성요소가 사용될 수 있는 질환에 대한 정보가 포함될 수 있다. 라벨 또는 삽입물은, 방법, 사용 또는 치료 프로토콜 또는 치료 섭생에서 하나 이상의 키트 구성요소를 사용하기 위한 임상의 또는 대상체에 대한 지시를 포함할 수 있다. 지시에는 투여량, 빈도 또는 기간, 및 본원에 기재된 방법, 용도, 치료 프로토콜 또는 예방적 또는 치료적 섭생 중의 어느 하나를 실시하기 위한 지시가 포함될 수 있다.
라벨 또는 삽입물은, 예방적 또는 치료적 이익 등, 구성요소가 제공할 수 있는 임의의 이익에 대한 정보를 포함할 수 있다. 라벨 또는 삽입물에는, 특정 조성물을 사용하는 것이 적절하지 않은 상황에 대한 대상체 또는 임상의에 대한 경고 등, 잠재적 유해 부작용, 합병증 또는 반응에 대한 정보가 포함될 수 있다. 유해한 부작용 또는 합병증은 또한, 대상체가 조성물과 적합하지 않을 수 있는 하나 이상의 다른 약물을 갖고 있거나, 복용할 예정이거나, 현재 복용 중인 경우, 또는 대상체가 조성물과 적합하지 않을 수 있는 다른 치료 프로토콜 또는 치료 섭생을 받고 있거나, 받을 예정이거나, 현재 받고 있는 경우에 발생할 수 있고, 따라서 지시에는 이러한 비호환성에 대한 정보가 포함될 수 있다.
라벨 또는 삽입물에는, "인쇄물"(예: 종이 또는 판지)이 포함되거나, 또는 별개이거나, 구성요소, 키트 또는 팩키징 재료(예: 상자)에 부착되거나, 키트 구성요소를 포함하는 앰플, 튜브 또는 바이알에 부착되어 있다. 라벨 또는 삽입물에는, 바코드화된 인쇄 라벨 등의 컴퓨터 판독 가능 매체, 디스크, CD 또는 DVD-ROM/RAM DVD, MP3 등의 광학 디스크, RAM 및 ROM 등의 전기 기록 매체, 또는, 자기/광학 기록 매체, 플래시 메모리, 하이브리드 및 메모리 유형 카드 등의 이들의 하이브리드가 추가로 포함될 수 있다.
VII. 실시예
본 발명의 다수의 실시형태가 기재되어 있다. 그럼에도 불구하고, 당업자는, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않고서, 본 발명을 다양한 용도 및 조건에 적응하기 위해 본 발명의 다양한 변경 및 수정을 할 수 있다. 따라서,하기 실시예는 청구된 본 발명의 범위를 설명하는 것을 의도하지만, 한정하는 것을 의도하지 않는다.
실시예 1
척추성 근육 위축증(SMA)은, SMN1 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 상 염색체 열성 질환이다. 상동성 SMN2 유전자는, 대부분의 SMN2 전사물에서 엑손 7이 스키핑되어 불안정한 단백질 33을 생성하기 때문에, SMN1 돌연변이를 기능적으로 보상할 수 없다. SMN1이 부재하는 경우, SMN2 단백질의 10%만이 생성되고, 이는 exon7이 포함된 SMN2 전사물의 분획에 상응한다. SMN2 엑손7 스키핑을 수정함으로써 저기능 SMN2 "백업(back-up)" 유전자의 조절은, SMA를 치료하기 위한 가장 성공적 접근법 중의 하나이다.
최근, SMN2 엑손7 포함을 유도하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO)인 우시네르센(Nusinersen)(Ionis)이 SMA34를 치료하는 최초의 FDA 약물로 승인되었다. LMI070(Spinraza™, Novartis31) 및 RG7800(Roche/PTC/SMAF35) 등의 엑손 7 포함을 유도하는 소분자는 임상 개발 중이다.
LMI070(Spinraza ™, Novartis31)의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00007
RG7916(로슈/PTC/SMAF35)의 구조는 다음과 같다:
Figure pct00008
한 가지 실시형태에서, 약물-유도된 SMN2 선택적 스플라이싱은 유전자 발현 조절을 위해 사용된다. 한 국면에서, SMN2 미니유전자는, 엑손 7 포함 또는 배제가 트랜스활성화인자의 번역을 결정하는 포유동물 트랜스활성화인자를 코딩하는 cDNA에 융합된다. 작은 스플라이싱 변형인자 분자 LMI070은 트랜스활성화인자 발현에 대한 엑손 7 스키핑을 수정할 수 있고, 이는 최적화된 표적 유전자 발현 카세트로부터 전사를 유도한다.
실시예 2
트랜스활성화인자의 생산이 SMN2 엑손 7 포함에 의존하는 키메라 SMN2/트랜스활성화인자 미니유전자가 생성되었다. 수득된 트랜스활성화인자는, 최적화된 프로모터에 결합하고, 하류 인공 miRNA의 발현을 활성화한다(도 2). 이 시스템은, 1) 오프 상태에서 최소 miRNA 발현, 2) 트랜스활성화인자에 의한 miRNA 발현의 유의한 유도, 3) 트랜스활성화인자 수준, 이어서 miRNA 발현 수준의 조절, 4) 단일 재조합체 아데노-관련 바이러스(AAV)로 팩키징할 수 있는 크기를 갖는다. RNAi 발현 조절은, RNAi 경로의 지속적 채용(co-opting)을 회피하고, 오프-표적 유전자의 만성적 의도치 않은 사일런싱을 최소화한다.
포유동물 트랜스활성화인자에 대한 다중 DNA 결합 부위는, 최적화된 miRNA 프로모터의 상류에 클로닝되었다. 트랜스활성화인자는, 특정 DNA 결합 서열과 단순 헤르페스 바이러스의 Vpl6 도메인에 결합하도록 변형된 포유동물 징크 핑거 단백질의 융합 단백질이다36,37. 게놈에서 트랜스활성화인자 단백질의 오프-표적 결합의 결과로서 가능한 유전자 활성화를 최소화하기 위해, 보다 강력한 활성화제 도메인(예를 들면, Vp64) 대신에 Vpl6 도메인이 선택되었다는 점에 유의한다. miRNA 프로모터의 활성화는, 트랜스활성화인자, 반딧불 발현을 유도하는 miRNA 프로모터 및 레닐라 루시페라제 발현 카세트로 삼중 형질감염 후에 루시퍼라제 비율로 평가되었다(도 3a-b).
트랜스활성화인자 발현을 조절하기 위해, 트랜스활성화인자를, 자가 절단 2A 펩티드 및 엑손 6-7을 포함하는 SMN2 미니유전자 및 엑손 8의 5' 말단, 및 SMN2 스플라이싱을 재현하는데 필요한 최소 인트론 개재 서열의 하류에 클로닝되었다38(도 4a). 전사물의 10%는, 네이티브 SMN2 유전 상태와 유사한 엑손 7을 포함하고 있음에 유의한다. 전사물은, RNAi 발현 카세트를 부분적으로 활성화하는 트랜스활성화인자를 생성한다. 따라서, SMN2/트랜스활성화인자 미니유전자의 3', 5' 엑손7 스플라이싱 부위는, RNAi 프로모터 배경 활성화를 최소화하는 엑손 7을 제외(CSI3 3' 변형)하거나 포함(CSI5, 5' 변형)하도록 변형되었다39(도 4b-c). 중요한 것은, 엑손 7 포함이 LMI070 용량 반응성이라는 것이다(도 5a-b). 또한, 전체 카세트가 rAAV에 적합하다.
HTT 엑손 2(mi2.4v1) 또는 HTT 엑손 44(miHDSlv6A)를 표적화하는 비-대립유전자 특이적 인공 miRNA 서열이 생성되었다. 이러한 miRNA 서열은, 한정된 오프-타겟 프로파일로 siSPOTR40을 사용하여 설계되었다. 또한, 대조군으로 사용될 특정 시드-조절 miRNA 서열(mi2.4vlC 및 miHDSlv6a)이 설계되었다. 이들 miRNA 대조군은, HTT 발현을 사일런싱시키지 않지만, mi2.4vl 및 miHDSlv6a 오프-타겟 프로파일을 각각 일치시키기 위해 동일한 miRNA 시드(5' 뉴클레오티드 2-8)를 포함한다(도 6a-b).
실시예 3
시험관내 연구: 중간 가시 뉴런(MSN)은, 선조체의 뉴런 세포 집단의 95%를 나타내고, HD에서 가장 많은 영향을 받는 세포형이며, 이러한 연구의 주요 표적 세포이다. 따라서, 모든 시험관내 연구에서는 MSN을 사용했다. MSN 배양물은 정상 또는 HD 환자로부터 인간 섬유아세포의 직접 신경 변환에 의해 수득할 수 있다41,42.
MSN 배양물은, 마우스 뇌에서 생체내에서 및 MSN 배양물에서 시험관내에서 MSN 뉴런을 효과적으로 형질도입하는 AAV 혈청형인 rAAV2/1로 형질도입된다43. 이전 보고는, 마우스 뇌에서 HTT 발현을 50% 감소시키는 것이 질환의 표현형을 개선하는 데 충분하다는 것을 나타낸다8,11,12. 따라서, 50% 사일런싱은, 이 조절된 프로모터 시스템에 대해 초기 설정된 기준이다. MSN 배양물은, mi2.4vl을 발현하는 rAAV2/1 바이러스의 용량을 증가시키면서 형질도입되고, LMI070 처리(1μM) 후, HTT mRNA 수준은 Q-RTPCR에 의해 결정된다. 모의 처리된 비-형질도입 및 형질도입된 MSN 배양물은, 기본 HTT 발현 수준을 설정하기 위한 대조군으로 사용되고, mi2.4vl 배경 수준이 HTT를 감지가능하게 사일런싱시키지 않음을 확인한다. U6 프로모터의 조절하에 mi2.4vl을 발현하는 AAV2/1로 형질도입된 세포는, 양성 사일런싱 대조군으로 사용된다. 목표는, LMI070의 존재하에서만 HTT 발현이 50% 이상 감소되는 AAV 치료 윈도우를 정의하는 것이다. 유효 AAV 용량이 확립되면, LMI070에 대한 반응으로 RNAi 발현 시스템의 동역학은, 상이한 시간 간격 및 상이한 LMI070 농도에서 mi2.4vl 발현을 분석함으로써 결정된다.
상위 20개의 내인성 miRNA는, 인간 뇌에서 miRNA:mRNA 결합 부위의 75%에 관여하기 때문에44, 내인성 경로의 채용은 이들 20개의 상위 miRNA 및 이들의 표적 mRNA에 대해 mi2.4vl의 발현을 비교함으로써 조사된다. 총 RNA는, LMI070로 모의 처리된 형질도입 MSN 배양물로부터 추출되고, 성숙 miRNA 수준은, 이전에 수행된 바와 같이, 스템 루프 Q-PCR에 의해 결정된다45. LMI070이 없는 경우, mi2.4vl 발현은 내인성 RNAi 조절을 간섭하지 않을 것으로 예상되고, 이는 공지된 내인성 표적 mRNA의 발현을 분석하여 확인될 것이다44. mi2.4vl과 관련된 오프-표적 사일런싱은, LMI070 또는 모의 처리 후에 형질도입된 MSN 배양물에서 수득된 총 RNA 샘플을 사용하여 RNA-seq에 의해 결정된다. 또한, LMI070 또는 트랜스활성화인자 단독으로 유발된 전사물 변화를 조사한다. 이러한 경우, 전사물 변화는 LMI070으로 처리된 MSN 배양물, 및 트랜스활성화인자 단백질 단독을 발현하는 형질도입된 MSN 배양물에서 수득된 총 RNA 샘플을 사용하여 결정된다. 초기 데이터를 감안할 때, LMI070에 의해 조절된 miRNA 발현은, 최소 50% HTT 사일런싱을 제공할 것으로 예상된다46. 독성의 결여는 또한, 세포 miRNA 수준의 최소 변화 또는 표적 mRNA 발현의 변화와 상관할 수 있다.
실시예 4
생체내 조절: 조절된 프로모터 시스템(rAAV.RPmi2.4vl)의 조절하에 mi2.4vl을 발현하는 rAAV2/1 바이러스는, 충분히 확립된 HD 마우스 모델인 N171-82Q 유전자도입 마우스의 선조체에 주입되고, 이는 마우스 뇌에서 돌연변이 헌팅틴 단백질의 처음 171개 아미노산을 발현한다47. 먼저, rAAV.RPmi2.4vl 또는 rAAV.RPmi2.4vlC(시드 기반 대조군 RNAi 트리거)를 5E10, 2.5E10 및 5E9 vg/반구체(n=10마리 수컷 마우스/그룹)에서 제공하여, 시스템에 과부하가 걸리는 선량(배경 HTT 사일런싱이 너무 많음)이 존재하는지를 결정한다. 대조군으로서, 강력한 Pol3 구성적 프로모터인 U6 프로모터의 조절하에 mi2.4vl 또는 mi2.4vlC를 발현하는 rAAV 바이러스를 마우스에 주입한다. 목표는, mi2.4v1 펄스가 돌연변이 HTT 억제를 50% 이상 유도하는 AAV 및 LMI070 선량 및 억제 피크에 도달하는 시간을 결정하는 것이다. rAAV 용량이 결정되면, LMI070은 분만 3주 후에 1-30mg/kg의 강제 경구 투여에 의해 투여된다. 30㎎/㎏은, 마우스 뇌에 SMN2 엑손 7 포함을 증가시키는 것으로 보고되어 있는 최대 최대 용량이고, 1mg/kg은, SMN 마우스 모델에서 치료 효과인 최소 용량인 것에 주의한다31. 실험 대조군은, 조절된 프로모터하에 mi2.4vl 또는 mi2.4vlC를 발현하는 마우스, 및 마우스 U6 프로모터의 조절하에 mi2.4vl을 발현하는 마우스이고, 이들 모두에 제형 완충제만을 제공했다(모의 처리). 마우스(n=8마리 수컷 마우스/그룹)는, LMI070(또는 모의) 투여후 24, 48, 72, 96 및 120시간 후에 희생시킨다. Mi2.4vl 및 내인성 miRNA, 돌연변이형 HTT 발현 수준은 뇌 용해물에서 평가된다. 이 연구는, RNAi 펄스를 개시하는 LMI070의 유효성 및 생체내 시스템의 발현 동태에 관한 관련 데이터를 제공한다. LMI070을 3mg/Kg 용량으로 경구 투여한 마우스의 LMI070 약물동태는, 혈청에서 Cmax(최대 농도)가 86nM이고, Tmax(Cmax에 도달하는 시간)가 4.3h이고, 뇌에서 양호한 분포(1.4의 뇌:혈장 비율 농도)를 갖는다. 이 농도(뇌에서 120nM)에서, LMI070은 CSI 및 CSI3 미니유전자 중의 어느 하나를 사용하여 엑손 7 포함을 유도하는 것에 유의한다(도 5).
이어서, 재투여가 필요할 수 있는 시기에 대한 가이드로서 이전 연구의 데이터를 사용하여, 유사한 수준의 유효성을 위해 HTT-표적화 RNAi 트리거를 펄스하는 빈도가 결정된다. 마우스(n=15마리 수컷 마우스/그룹)는, 주입 전에 기준선 로타로드(rotarod) 테스트를 거켜 그룹을 정규화하고, 이어서 실험 또는 대조군 AAV 벡터±LMI070을 양측에 주입한다. 가속 로타로드는, HD 모델에서 운동 장애를 검출하기 위한 고감도 측정을 제공한다. AAV 주사 후, LMI070은, 매주 1 내지 2회 재투여에 이어서, 24 내지 48시간에 걸쳐 50% 이상의 사일런싱에 도달하도록, 이전에 확립된 용량으로 투여된다. 마우스는, 이전과 마찬가지로, 10주, 14주 및 18주에 추가 로타로드 시험을 받는다11. 그 후, 안락사시키고, RNA 분석, 생화학 연구 및 조직학을 위해 뇌를 처리한다.
LMI070-유도 RNAi 펄스는, 24-48시간 동안 지속되어, mHTT 수준을 50% 이상 또는 같게 감소시킬 것으로 예상된다. LMI070이 제거되면, mi2.4vl 수준은 감소하고, mHTT 수준은 더 이상 억제되지 않는다(도 7). 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자(ASO)를 사용한 이전 연구는, 일과성 ASO 주입후의 HTT 사일런싱보다 질환 표현형의 역전이 장기간 지속되는 것으로 복도했다48. 따라서, mHTT를 표적화하는 ASO에서 관찰된 것과 유사하게, RNAi의 펄스를 수일 또는 수주 동안 유지해야 할 수도 있다. SMN2 엑손7은 SMN2/트랜스활성화인자 전사물의 1%(CSI3) 및 10%(CSI)에 포함되어 있기 때문에, LMI070의 부재하에 RNAi 프로모터를 부분적으로 활성화시킬 수 있다. 인공 miRNA 수준이 가장 풍부한 miRNA의 전사 수준보다 높은 경우, 이는 문제가 될 수 있다. 이 문제는, 보다 약한 프로모터를 사용하여 트랜스활성화인자 발현을 조절함으로써 해결할 수 있다(예: pGK, mCMV). 이전 연구에 따르면, LMI070은, 마우스에 독성이 없을 것으로 예상되지만, 관찰된 경우, LMI070을 대체할 수 있는 SMN2 엑손 7 포함을 유도하도록 다른 소분자가 설계되었다. LMI070은 경구 투여가 가능하고, LMI070 및 일부 rAAV 혈청형은 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있기 때문에, 이 시스템은, 복수의 척수강내 투여를 필요로 하는 현재의 ASO 요법보다 낮은 침습성의 뇌 신경퇴행성 질환 치료를 개발할 가능성도 또한 제공한다.
실시예 5
HD 환자 및 마우스 모델의 조직 샘플을 사용한 이전 연구는, 전사물 조절 장애가 HD 뇌에서 발생하는 주요 이벤트이고, 초기 질환 단계에서 세포 손실이 관찰되기 전에 발생하는 것을 보고했다49-51. 최근, HD 전사의 변화는, 특정 유전자의 전체적 발현 수준에 한정되지 않을 뿐만 아니라, 또한 대체 스플라이싱에 의해 생성된 전사 이소형에도 한정되는 것으로 보고되었다32. 목표는, 돌연변이형 HTT 발현의 결과로 발생하고, 돌연변이형 HTT 억제에 대한 반응으로 수정되는 선택적 스플라이싱의 변화를 동정하는 것이다. 이것은, SMN2 엑손 조절 반응 요소의 자가-조절 대안을 제공하고, 약물-관련 조절의 필요성을 제거할 것이다. 돌연변이형 HTT 발현에 대한 반응으로 변화되는 선택적 스플라이싱 이벤트는, HD의 맥락에서 트랜스활성화인자의 생산을 조절하기 위한 조절 스위치로서 유망하다. 이 연구는, 다른 신경퇴행성 질환에서 발현을 조절하기 위해 유사한 접근법을 사용할 수 있는 기반을 제공할 수 있다.
실시예 6
돌연변이형 HTT 사일런싱으로 수정되는 선택적 스플라이싱 이벤트: HD 인간 환자 및 대조군으로부터의 MSN 배양물은, HTT 발현을 사일런싱시키기 위해 rAAV.U6mi2.4vl 또는 rAAV.U6miHDSlv6 및 시드 정합 대조군으로서 rAAV.U6mi2.4vlC 또는 rAAV.U6miHDSlv6aC로 형질도입된다(도 6). HTT 발현을 효과적으로 표적화하는 2가지 상이한 miRNA 서열과 이들의 시드 정합 miRNA 대조군을 사용함으로써, mHTT 사일런싱으로 인한 선택적 스플라이싱 이벤트 및 RNAi 오프-표적화로 인한 이벤트를 구별할 수 있음에 유의한다.
AAV 형질도입 1주 후, mHTT 발현이 50% 감소될 때, 세포를 수집하고, 총 RNA를 추출하여 선택적 스플라이싱 변화를 결정한다. RNA-seq 라이브러리는, TruSeq Stranded mRNA 샘플 prep 키트(Illumina)를 사용하여 제조하고, Illumina HiSeq 4000을 사용하여 서열분석용으로 전송된다. RNA-seq 판독은, 인간 게놈(hg38) 및 전사물(Ensemble, 릴리스 89)에 매핑시킨다. STAR 소프트웨어(2.5 이상)를 사용하면, 판독당 최대 3개의 부정합 및 25bp 시드당 최대 2bp의 부정합을 허용한다. 퍼프디프(Cuffdiff)는, FPKM 메트릭을 사용하여 RNA-seq 기반 유전자 발현을 계산하기 위해 사용된다52,53. rMATS는 5개 기본 유형의 선택적 스플라이싱 패턴 모두에 상응하는 샘플 그룹 사이의 차등 선택적 스플라이싱 이벤트를 동정하기 위해 사용된다54. 중요한 스플라이싱 변화는, FDR <5% 및 △PSI ≥5%를 사용하여 고려된다. 전사물 이소형 사이의 최대 불균형을 나타내고, mHTT 단백질의 사일런싱시에 수정되는, 상위 10개의 선택적 스플라이싱 이벤트는, 생물학적 확인을 위해 독립적으로 수득된 샘플에서 PCR에 의해 검증된다.
이어서, 인접 및 선택적 스플라이싱된 엑손으로 이루어지고, 개재된 최소 인트론 서열로 이루어진 키메라 eGFP 미니유전자를 생성하고, AAV 셔틀 벡터에서 eGFP cDNA의 상류에 클로닝시킨다. 이러한 미니유전자는, mHTT 단백질 억제가 스플라이싱 프로파일을 대조군 MSN 배양의 프로파일로 '정규화'한 후에 eGFP 발현이 감소되도록 설계된다. 시스템을 시험하기 위해, MSN 배양물은, 먼저 돌연변이형 HTT 또는 시드 정합 대조군을 표적화하는 rAAV2/1 발현 miRNA, 및 eGFP 미니유전자(또는 대조군으로서 비변형 eGFP)를 발현하는 rAAV로 형질도입된다. eGFP 발현의 동태는, 웨스턴 블롯 및 정량적 형광 기반 검정에 의해 결정된다. 이어서, mHTT 억제에 따라 반응하는 이들 미니유전자를 사용하여, SMN2 미니유전자를 대체고(도 2), Tg(N171-82Q) 및 zQ175 HD 마우스 모델에서 시험한다.
이 질환 조절된 발현 시스템은, mHTT 발현에 반응하여 발생하는 선택적 스플라이싱 변화를 이용함으로써, RNAi의 조절을 가능하게 할 것이다. HD 배양 및 대조군 MSN 배양의 사이에서, 상당한 수의 선택적 스플라이싱 변화가 확인될 것으로 예상된다. 선택적 스플라이싱 변화는 엑손 스키핑으로 제한되지 않을 뿐만 아니라, 다른 4종류의 선택적 스플라이싱 패턴에도 제한되는 것으로 예상된다. RNA 전사물 이소형 사이에서 2배 초과의 불균형을 수반하는 몇몇 이벤트가 동정될 것으로 예상되고, 이러한 비율은 mHTT 단백질의 사일런싱시에 변화될 것으로 예상된다. 2배 초과의 비율의 기준에 적합한 엑손 스키핑 스플라이싱 이벤트가 발견되지 않는 경우, 이는, SMN2 미니유전자에 대해 수행된 것과 유사하게, 유사하지만 그 비율을 초과하지 않는 인접 인트론/엑손 작제물에 특정 서열 변형을 도입하여 비율을 개선함으로써 해결할 수 있다. 이 연구의 종료시에, SMN2 미니유전자를 대체하기 위해 사용할 수 있는 일련의 질환-조절 미니유전자를 수득할 수 있다.
HD에서 시차 스플라이싱된 인트론의 예는 MIR4458HG(5 : 8457767 - 8459932), PCDH1(5 : 141869432 - 141878222), BMP8A(1 : 39523698 - 39523806), TLL1(4 : 166039442 - 166042026), KCNH1(1 : 210684139 - 210775347), FGFR1(8 : 38414035 - 38414151), MGST1(12 : 16606133 - 16607935), AC097515.1(4 : 16503132 - 16508540), ATP2B3(X : 153559943 - 153560675), RPL22(1 : 6197757 - 6199564), AC109439.2(5 : 136753973 - 136754359), SLCO5A1(8 : 69705230 - 69738039), AC025154.2(12 : 49962381 - 49963491), SART3(12 : 108539090 - 108542769), TRPM1(15 : 31067188 - 31067878), RAI1(17 : 17683704 - 17684064), EMC1(1 : 19233136 - 19234179), ACYP2(2 : 54115757 - 54135452), TLL1(4 : 165995179 - 166003390), HMGCS1(5 : 43298976 - 43313021), CASTOR3(7 : 100202591 - 100204020), TRPM1(15 : 31076985 - 31101656), ABCA8(17 : 68918186 - 68918426), DMD(X : 31507454 - 31627672), MACF1(1 : 39084439 - 39102702), HIPK1(1 : 113957185 - 113958065), CNTN2(1 : 205062002 - 205062439), ROBO2(3 : 77644896 - 77646053), EVC2(4 : 5685480 - 5689156), WWC1(5 : 168428142 - 168428706), ISPD(7 : 16258483 - 16258919), PDCL(9 : 122823083 - 122826615), CCDC91(12 : 28255663 - 28257201), CDK16(X : 47219106 - 47222272), ATP2B3(X : 153543169 - 153546087), TINAGL1(1 : 31585486 - 31585752), NBPF20(1 : 145401132 - 145402166), IFT122(3 : 129458678 - 129460853), MFAP5(12 : 8655448 - 8655785), MED21(12 : 27030273 - 27030733), COBLL1(2 : 164722523 - 164727105), MYRIP(3 : 40234054 - 40244445), ARHGAP24(4 : 85827976 - 85923647), NDST3(4 : 118105106 - 118114805), ZNF251(8 : 144754746 - 144755404), LIPM(10 : 88815225 - 88815356), GATD1(11 : 770399 - 770992), TMEM132C(12 : 128696104 - 128697223), RUBCNL(13 : 46378006 - 46387676), JDP2(14 : 75432337 - 75437897), NEDD4L(18 : 58046019 - 58165787), ST13(22 : 40844910 - 4085643), AL662884.4(6 : 32153637 - 32153998), C6orf118(6 : 165299503 - 165300363), BDNF-AS(11 : 27640006 - 27658237), ARHGEF7(13 : 111283400 - 111286146), MYBPC1(12 : 101663561 - 101667731), RAPSN(11 : 47438932 - 47441158), SMYD1(2 : 88096785 - 88103057), MRLN(10 : 59738563 - 59738997), KLHL40(3 : 42688718 - 42688868), TRDN-AS1(6 : 123497253 - 123503718), VGLL2(6 : 117271065 - 117272453), ITGA7(12 : 55686315 - 55687970), LMOD3(3 : 69109122 - 69118698), VGLL2(6 : 117268492 - 117270542), ZIM2(19 : 56822837 - 56823589), KLHL40(3 : 42688303 - 42688609), TRIM55(8 : 66150467 - 66152376), COBL(7 : 51073386 - 51085165), RYR1(19 : 38504361 - 38504747), MYOM1(18 : 3102631 - 3112297), PDE4DIP(1 : 149010596 - 149012590), NCAM1(11 : 113240834 - 113242804), TPM3(1 : 154167941 - 154169304), SMYD1(2 : 88091143 - 88093516), MYBPC2(19 : 50459007 - 50459110), TRDN(6 : 123218741 - 123221486), TRDN(6 : 123252436 - 123255080), MICU1(10 : 72508270 - 72524734), MEF2D(1 : 156480778 - 156482436), ZIM2(19 : 56817580 - 56817745), SRPK3(X : 153781146 - 153781215), COL25A1(4 : 109010376 - 109048167), STAC3(12 : 57248199 - 57250992), LMOD3(3 : 69120061 - 69122092), MAP4(3 : 47912422 - 47914816), TRIM72(16 : 31214298 - 31214731), TRIM63(1 : 26066441 - 26067335), ASB4(7 : 95536551 - 95537570), CHRND(2 : 232528657 - 232529938), MYPN(10 : 68197479 - 68199367), FBP2(9 : 94559133 - 94563341), ITGB1(10 : 32901636 - 32907062), IL17B(5 : 149377026 - 149379204), BVES-AS1(6 : 105162161 - 105179832), COL23A1(5 : 178239180 - 178240460), TRDN-AS1(6 : 123438123 - 123438943), IL17B(5 : 149374601 - 149376735), LINC01916(18 : 65424072 - 65441689), AC131025.3(5 : 149329831 - 149332694), FBP2(9 : 94563462 - 94567269), MFAP5(12 : 8648204 - 8649500), MEF2D(1 : 156479797 - 156480642), AL358473.2(1 : 201040375 - 201040621), INPP4B(4 : 142086257 - 142108092), RYR1(19 : 38448512 - 38448648), MACF1(1 : 39340718 - 39340803), ITGB1BP2(X : 71302334 - 71302410), DUSP13(10 : 75097886 - 75101866), SAMD8(10 : 75101962 - 75103893), LSP1(11 : 1884025 - 1884279), C1orf105(1 : 172465364 - 172468448), RYR2(1 : 237773649 - 237778665), TBX18(6 : 84748088 - 84756697), MYPN(10 : 68194513 - 68195449), TBX18(6 : 84744326 - 84747919), PYGM(11 : 64755559 - 64757778), MYLK4(6 : 2679409 - 2680220), LTK(15 : 41507291 - 41507561), DCAF6(1 : 168004794 - 168015780), LRRFIP2(3 : 37121537 - 37121634), MFAP5(12 : 8654482 - 8655414), FRMPD1(9 : 37729854 - 37730983), MYOM2(8 : 2057781 - 2059152), ADAMTS14(10 : 70674996 - 70702311), AFAP1L1(5 : 149306405 - 149307401), GFPT1(2 : 69350184 - 69354258), UBE4B(1 : 10105745 - 10106196), CCDC141(2 : 178869306 - 178871426), ITGA4(2 : 181480267 - 181481597), RGR(10 : 84254444 - 84254696), AL139317.5(14 : 52861035 - 52861586), ABI3BP(3 : 100838285 - 100838401), AC008429.3(5 : 172956029 - 172957153), AC004233.2(16 : 2998389 - 2998493), AC027045.2(17 : 9781595 - 9791130), ITGB1BP2(X : 71302557 - 71303261), EYA4(6 : 133448180 - 133456555), PRPF18(10 : 13597672 - 13600243), LINC00592(12 : 52180964 - 52185378), PPP1R27(17 : 81834654 - 81834763), MYLK4(6 : 2680292 - 2683020), MYF6(12 : 80708239 - 80708523), CLEC3B(3 : 45026472 - 45030826), VCL(10 : 74109157 - 74111908), COL25A1(4 : 108819330 - 108819811), PHYHD1(9 : 128940498 - 128940598), ANKRD29(18 : 23601310 - 23612091), HSPA12B(20 : 3748392 - 3749231), UBE4B(1 : 10107375 - 10117458), AGL(1 : 99850899 - 99850974), CCDC141(2 : 178853625 - 178855346), AGMO(7 : 15418654 - 15431004), SAMD8(10 : 75108210 - 75109008), TRPC6(11 : 101471387 - 101472136), KRT17P5(17 : 18423550 - 18423656), TMEM241(18 : 23237246 - 23252959), ENPP1(6 : 131868127 - 131869357), PHLDB1(11 : 118644692 - 118645355), MYF5(12 : 80717565 - 80718357), C12orf42(12 : 103368999 - 103401606), RBFOX1(16 : 7671600 - 7676773), CYP2J2(1 : 59916101 - 59926536), SYPL2(1 : 109478010 - 109479377), TTN(2 : 178799732 - 178799824), COL6A3(2 : 237395205 - 237396726), KLHL30(2 : 238148023 - 238149006), SYNJ2(6 : 158059354 - 158061991), FNDC1(6 : 159246970 - 159249038), AC100871.2(8 : 124040007 - 124045766), CYSLTR1(X : 78283541 - 78327304), HSPG2(1 : 21865810 - 21868884), MET(7 : 116775112 - 116777388), ISCU(12 : 108562737 - 108564059) 및 PXN(12 : 120216582 - 120216840)을 포함한다.
실시예 7
다음 방법을 사용하여, 도 8-15에 예시된 데이터를 수득했다. 간단히 말하면, Hek293 세포를, 25nM 농도의 LMI070으로 처리했다. 처리 12시간 후, 트리졸(Trizol)을 사용하여 RNA를 추출하고, 이어서 DNAsel 처리를 수행했다. 샘플은, 아길런트 바이오분석기에서 품질 관리에 대해 평가되고, 모든 샘플은 >9.8의 RIN 값을 갖고, 일루미나 리보제로 골드(Illumina RiboZero Gold) 총 RNA 라이브러리 준비 및 일루미나(Illumina) HiSeq4000을 사용한 서열분석을 위해 전송했다. 일루미나 서열분석으로부터 150bp 쌍 말단 서열분석 판독을 수득했다. 일루미나 플랫폼에서 수득한 Fastq 파일은, STAR 얼라이너를 사용하여 인간 게놈 GRCh38에 정렬시켰다. STAR에서 출력된 SAM 형식의 정렬 파일은 Samtools를 사용하여 분류하고, BAM 형식으로 변환하고, 인덱싱되었다. 정렬의 임의의 영역에서 스플라이싱을 시각화하기 위해, BAM 화일을 IGV에서 열고, 사시미 플롯 기능을 사용하여 시각화했다.
높은 수준의 선택적 스플라이싱을 포함하는 목적 영역을 동정하기 위해, 커스텀 R 프로그램을 생성했다. 이 커스텀 R 프로그램에 대한 입력은 STAR ".SJ.out.tab"에 의해 출력된 스플라이스 접합의 매트릭스였다. 이 파일에는, STAR에 의한 정렬 동안 계산된 각 스플라이싱 접합에서 수득된 생 계수가 포함되어 있다. 이 커스텀 R 프로그램은, 치료 그룹과 대조군 그룹 사이에서 매우 상이하게 스플라이싱된 위치를 동정하는 것을 목적으로 작성되었다. 하기 단계를 사용하여, 이들 영역을 종정했다. 1) 입력 파일을 R로 읽는다. 2) 데이터세트의 각 행(스플라이스 부위)에 대해 고유한 위치 ID를 작성한다. 3) 모든 샘플을 하나의 데이터 프레임으로 병합한다. 4) 각 스플라이스 부위 ID에 대한 평균 계수, 계수 합계 및 계수의 표준 편차를 계산한다. 4) NA(사용 불가) 값을 0으로 치환한다. 5) 대조군에서 합계=0인 모든 스플라이스 부위(행)를 추출한다. 6) 추출된 판독치를 평균 계수 값에 따라 최고 값에서 최저 값으로 분류한다. 이는, 대조군에서 0 계수의 합계와 함께 최고 수준의 차등 발현을 갖는 스플라이스 부위의 목록을 산출했다.
하기 방법을 사용하여, 도 16의 데이터를 수득했다. 상기 기재된 분석에서 동정된 가장 관련성이 높은 유전자는 PCR로 검증되었다. LMI070(25nM)으로 처리된 HEK293 세포에서 RNA를 추출했다. LMI070 처리에 의해 생성된 신규 엑손의 상류 및 하류에 결합하도록 설계된 PCR 프라이머를 사용했다. PCR에서 관찰된 바와 같이, 보다 큰 크기의 PCR 생성물은 LMI070으로 처리된 샘플에서 검출되었다(도 16). 이러한 PCR 생성물은 생거(Sanger) 서열분석을 사용하여 서열분석되어, 동정된 신규 엑손 서열의 포함을 보장한다.
실시예 8
하기 방법을 사용하여, 도 19에 도시된 데이터를 수득했다. HEK293 세포에 SMN2 미니유전자(0.3㎍)를 발현하는 플라스미드를 형질감염시키고, 4시간 후에 상이한 용량의 RG7800(10nM, 100nM, 1μM 및 10μM)으로 처리했다. 형질감염 24시간 후, RNA를 회수하고, DNAsel로 처리하고, RNA의 1㎍를 역전사하여, PCR을 사용하여 SMN2 미니유전자 스플라이싱을 평가했다. PCR 생성물을 3% 아가로즈 겔에서 분리하고, ChemiDoc 이미징 시스템(Bio-Rad) 및 Imagine Lab 분석 소프트웨어를 사용하여 엑손 7 생산을 정량화했다.
하기 방법을 사용하여, 도 21에 도시된 데이터를 수득했다. HEK293 세포에 CRISPRi 사일런싱 시스템을 코딩하는 플라스미드(dCas9, sgRNA 및 MCP-Krab 발현 카세트)를 형질감염시켰다. 중요한 것은, dCas9는, RG7800으로 dCas9 단백질 발현을 조절하기 위해, SMN2 스플라이스 조절 카세트하에 클로닝했다. 형질감염 24시간 후, Puromicin(3μM, 24h)을 사용하여 세포를 선택하고, 새로운 플레이트에 계대하고, RG7800(1μM)으로 처리했다. HEK293 세포는, 수동 용해 완충액(Promega, CA)을 사용하여 RG7800 처리 36시간 후에 용해시키고, 헌팅틴(Huntingtin)(HTT), Cas9 및 베타 카테닌(Beta Catenin)(Beta cat) 단백질 수준은 웨스턴 블롯에 의해 결정했다. 베타 카테닌 단백질 수준은 로딩 대조군으로 결정되었다. HTT, Cas9 및 Beta Cat 단백질 수준은 케미독 이미징 시스템(ChemiDoc Imaging System)(Bio-Rad) 및 이매진 랩(Imagine Lab) 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화했다.
***
본원에 개시되고 청구된 모든 방법은, 본 개시에 비추어 과도한 실험 없이 작성하고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은, 바람직한 실시형태의 관점에서 설명되었지만, 당업자에게는, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않고서, 본원에 기재된 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음이 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 제제가, 동일하거나 유사한 결과가 달성되면, 본원에 기재된 제제로 대체될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 수정은, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 정신, 범위 및 개념의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
참고 문헌
하기 참고문헌은 본원에 설명된 것들을 보충하는 예시적 절차 또는 기타 상세를 제공하는 범위에서, 참조에 의해 본원에 구체적으로 도입된다.
Heyne et al., "De novo variants in neurodevelopmental disorders with epilepsy," Nature, 50:1048-1053, 2018.
Lindy et al., "Diagnostic outcomes for genetic testing of 70 genes in 8565 patients with epilepsy and neurodevelopmental disorders," Epilepsia, 59:1062-1071, 2018.
Shi et al., "Pharmacodynamic assays to facilitate preclinical and clinical development of pre-mRNA splicing modulatory drug candidates," Pharmacol. Res. Perspect., 3:e00158, 2015.
Singh et al., "Conserved sequences in the final intron of MDM2 are essential for the regulation of alternative splicing of MDM2 in response to stress," Exp. Cell Res., 215:3419-3432, 2009.
Takeuchi et al., "Splicing Reporter Mice Revealed the Evolutionally Conserved Switching Mechanism of Tissue-Specific Alternative Exon Selection," PLoS ONE, 5:e10946, 2010.
Zhang et al., "Cell-Type-Specific Alternative Splicing Governs Cell Fate in the Developing Cerebral Cortex," Cell, 166:1147-1162, 2016.
1. The Huntington's Disease Collaborative Research Group, "A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes." Cell 72: 971-983, 1993.
2. Walker, FO (2007). Huntington's disease. Lancet 369: 218-228.
3. Zuccato, C, Valenza, M, and Cattaneo, E (2010). Molecular mechanisms and potential therapeutical targets in Huntington's disease. Physiological reviews 90: 905-981.
4. Yamamoto, A, Lucas, JJ, and Hen, R (2000). Reversal of neuropathology and motor dysfunction in a conditional model of Huntington's disease. Cell 101: 57-66.
5. Diaz-Hernandez, M, Torres-Peraza, J, Salvatori-Abarca, A, Moran, MA, Gomez-Ramos, P, Alberch, J, et al. (2005). Full motor recovery despite striatal neuron loss and formation of irreversible amyloid-like inclusions in a conditional mouse model of Huntington's disease. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 25: 9773-9781.
6. Garriga-Canut, M, Agustin-Pavon, C, Herrmann, F, Sanchez, A, Dierssen, M, Fillat, C, et al. (2012). Synthetic zinc finger repressors reduce mutant huntingtin expression in the brain of R6/2 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 109: E3136-3145.
7. Carroll, JB, Warby, SC, Southwell, AL, Doty, CN, Greenlee, S, Skotte, N, et al. (2011). Potent and selective antisense oligonucleotides targeting single-nucleotide polymorphisms in the Huntington disease gene / allele-specific silencing of mutant huntingtin. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 19: 2178-2185.
8. Harper, SQ, Staber, PD, He, X, Eliason, SL, Martins, IH, Mao, Q, et al. (2005). RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102: 5820-5825.
9. Yu, D, Pendergraff, H, Liu, J, Kordasiewicz, HB, Cleveland, DW, Swayze, EE, et al. (2012). Single-stranded RNAs use RNAi to potently and allele-selectively inhibit mutant huntingtin expression. Cell 150: 895-908.
10. Hu, J, Matsui, M, Gagnon, KT, Schwartz, JC, Gabillet, S, Arar, K, et al. (2009). Allele-specific silencing of mutant huntingtin and ataxin-3 genes by targeting expanded CAG repeats in mRNAs. Nature biotechnology 27: 478-484.
11. Boudreau, RL, McBride, JL, Martins, I, Shen, S, Xing, Y, Carter, BJ, et al. (2009). Nonallele-specific silencing of mutant and wild-type huntingtin demonstrates therapeutic efficacy in Huntington's disease mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 17: 1053-1063.
12. Drouet, V, Perrin, V, Hassig, R, Dufour, N, Auregan, G, Alves, S, et al. (2009). Sustained effects of nonallele-specific Huntingtin silencing. Annals of neurology 65: 276-285.
13. Monteys, AM, Spengler, RM, Dufour, BD, Wilson, MS, Oakley, CK, Sowada, MJ, et al. (2014). Single nucleotide seed modification restores in vivo tolerability of a toxic artificial miRNA sequence in the mouse brain. Nucleic acids research 42: 13315-13327.
14. Monteys, AM, Wilson, MJ, Boudreau, RL, Spengler, RM, and Davidson, BL (2015). Artificial miRNAs Targeting Mutant Huntingtin Show Preferential Silencing In Vitro and In Vivo. Molecular therapy Nucleic acids 4: e234.
15. Ha, M, and Kim, VN (2014). Regulation of microRNA biogenesis. Nature reviews Molecular cell biology.
16. Davidson, BL, and McCray, PB, Jr. (2011). Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature reviews Genetics 12: 329-340.
17. McBride, JL, Pitzer, MR, Boudreau, RL, Dufour, B, Hobbs, T, Ojeda, SR, et al. (2011). Preclinical safety of RNAi-mediated HTT suppression in the rhesus macaque as a potential therapy for Huntington's disease. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 19: 2152-2162.
18. Grondin, R, Kaytor, MD, Ai, Y, Nelson, PT, Thakker, DR, Heisel, J, et al. (2012). Six-month partial suppression of Huntingtin is well tolerated in the adult rhesus striatum. Brain : a journal of neurology 135: 1197-1209.
19. Birmingham, A, Anderson, EM, Reynolds, A, Ilsley-Tyree, D, Leake, D, Fedorov, Y, et al. (2006). 3' UTR seed matches, but not overall identity, are associated with RNAi off-targets. Nature methods 3: 199-204.
20. Friedman, RC, Farh, KK, Burge, CB, and Bartel, DP (2009). Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome research 19: 92-105.
21. Jackson, AL, and Linsley, PS (2010). Recognizing and avoiding siRNA off-target effects for target identification and therapeutic application. Nature reviews Drug discovery 9: 57-67.
22. Reyes-Herrera, PH, and Ficarra, E (2012). One decade of development and evolution of microRNA target prediction algorithms. Genomics, proteomics & bioinformatics 10: 254-263.
23. Grimm, D, Streetz, KL, Jopling, CL, Storm, TA, Pandey, K, Davis, CR, et al. (2006). Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways. Nature 441: 537-541.
24. Boudreau, RL, Martins, I, and Davidson, BL (2009). Artificial microRNAs as siRNA shuttles: improved safety as compared to shRNAs in vitro and in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 17: 169-175.
25. McBride, JL, Boudreau, RL, Harper, SQ, Staber, PD, Monteys, AM, Martins, I, et al. (2008). Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated toxicity in the brain: implications for the therapeutic development of RNAi. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105: 5868-5873.
26. Giering, JC, Grimm, D, Storm, TA, and Kay, MA (2008). Expression of shRNA from a tissue-specific pol II promoter is an effective and safe RNAi therapeutic. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy 16: 1630-1636.
27. Le Guiner, C, Stieger, K, Toromanoff, A, Guilbaud, M, Mendes-Madeira, A, Devaux, M, et al. (2014). Transgene regulation using the tetracycline-inducible TetR-KRAB system after AAV-mediated gene transfer in rodents and nonhuman primates. PloS one 9: e102538.
28. Lee, JH, Tecedor, L, Chen, YH, Monteys, AM, Sowada, MJ, Thompson, LM, et al. (2015). Reinstating aberrant mTORC1 activity in Huntington's disease mice improves disease phenotypes. Neuron 85: 303-315.
29. Stanley, SA, Sauer, J, Kane, RS, Dordick, JS, and Friedman, JM (2015). Remote regulation of glucose homeostasis in mice using genetically encoded nanoparticles. Nature medicine 21: 92-98.
30. Reis, SA, Ghosh, B, Hendricks, JA, Szantai-Kis, DM, Tork, L, Ross, KN, et al. (2016). Light-controlled modulation of gene expression by chemical optoepigenetic probes. Nature chemical biology 12: 317-323.
31. Palacino, J, Swalley, SE, Song, C, Cheung, AK, Shu, L, Zhang, X, et al. (2015). SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nature chemical biology 11: 511-517.
32. Lin, L, Park, JW, Ramachandran, S, Zhang, Y, Tseng, YT, Shen, S, et al. (2016). Transcriptome sequencing reveals aberrant alternative splicing in Huntington's disease. Human molecular genetics 25: 3454-3466.
33. Monani, UR, Lorson, CL, Parsons, DW, Prior, TW, Androphy, EJ, Burghes, AH, et al. (1999). A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Human molecular genetics 8: 1177-1183.
34. Scoto, M, Finkel, RS, Mercuri, E, and Muntoni, F (2017). Therapeutic approaches for spinal muscular atrophy (SMA). Gene therapy.
35. Naryshkin, NA, Weetall, M, Dakka, A, Narasimhan, J, Zhao, X, Feng, Z, et al. (2014). Motor neuron disease. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science 345: 688-693.
36. Maeder, ML, Thibodeau-Beganny, S, Osiak, A, Wright, DA, Anthony, RM, Eichtinger, M, et al. (2008). Rapid "open-source" engineering of customized zinc-finger nucleases for highly efficient gene modification. Molecular cell 31: 294-301.
37. Sadowski, I, Ma, J, Triezenberg, S, and Ptashne, M (1988). GAL4-VP16 is an unusually potent transcriptional activator. Nature 335: 563-564.
38. Zhang, ML, Lorson, CL, Androphy, EJ, and Zhou, J (2001). An in vivo reporter system for measuring increased inclusion of exon 7 in SMN2 mRNA: potential therapy of SMA. Gene therapy 8: 1532-1538.
39. Cho, S, Moon, H, Loh, TJ, Oh, HK, Kim, HR, Shin, MG, et al. (2014). 3' Splice site sequences of spinal muscular atrophy related SMN2 pre-mRNA include enhancers for nearby exons. TheScientificWorldJournal 2014: 617842.
40. Boudreau, RL, Spengler, RM, Hylock, RH, Kusenda, BJ, Davis, HA, Eichmann, DA, et al. (2013). siSPOTR: a tool for designing highly specific and potent siRNAs for human and mouse. Nucleic acids research 41: e9.
41. Richner, M, Victor, MB, Liu, Y, Abernathy, D, and Yoo, AS (2015). MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons. Nature protocols 10: 1543-1555.
42. Victor, MB, Richner, M, Hermanstyne, TO, Ransdell, JL, Sobieski, C, Deng, PY, et al. (2014). Generation of human striatal neurons by microRNA-dependent direct conversion of fibroblasts. Neuron 84: 311-323.
43. Taymans, JM, Vandenberghe, LH, Haute, CV, Thiry, I, Deroose, CM, Mortelmans, L, et al. (2007). Comparative analysis of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 7, and 8 in mouse brain. Human gene therapy 18: 195-206.
44. Boudreau, RL, Jiang, P, Gilmore, BL, Spengler, RM, Tirabassi, R, Nelson, JA, et al. (2014). Transcriptome-wide discovery of microRNA binding sites in human brain. Neuron 81: 294-305.
45. Monteys, AM, Spengler, RM, Wan, J, Tecedor, L, Lennox, KA, Xing, Y, et al. (2010). Structure and activity of putative intronic miRNA promoters. Rna 16: 495-505.
46. Consortium, HDi (2017). Developmental alterations in Huntington's disease neural cells and pharmacological rescue in cells and mice. Nature neuroscience 20: 648-660.
47. Schilling, G, Becher, MW, Sharp, AH, Jinnah, HA, Duan, K, Kotzuk, JA, et al. (1999). Intranuclear inclusions and neuritic aggregates in transgenic mice expressing a mutant N-terminal fragment of huntingtin. Human molecular genetics 8: 397-407.
48. Kordasiewicz, HB, Stanek, LM, Wancewicz, EV, Mazur, C, McAlonis, MM, Pytel, KA, et al. (2012). Sustained therapeutic reversal of Huntington's disease by transient repression of huntingtin synthesis. Neuron 74: 1031-1044.
49. Luthi-Carter, R, Strand, A, Peters, NL, Solano, SM, Hollingsworth, ZR, Menon, AS, et al. (2000). Decreased expression of striatal signaling genes in a mouse model of Huntington's disease. Human molecular genetics 9: 1259-1271.
50. Sipione, S, Rigamonti, D, Valenza, M, Zuccato, C, Conti, L, Pritchard, J, et al. (2002). Early transcriptional profiles in huntingtin-inducible striatal cells by microarray analyses. Human molecular genetics 11: 1953-1965.
51. Dunah, AW, Jeong, H, Griffin, A, Kim, YM, Standaert, DG, Hersch, SM, et al. (2002). Sp1 and TAFII130 transcriptional activity disrupted in early Huntington's disease. Science 296: 2238-2243.
52. Trapnell, C, Williams, BA, Pertea, G, Mortazavi, A, Kwan, G, van Baren, MJ, et al. (2010). Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nature biotechnology 28: 511-515.
53. Trapnell, C, Roberts, A, Goff, L, Pertea, G, Kim, D, Kelley, DR, et al. (2012). Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks. Nature protocols 7: 562-578.
54. Shen, S, Park, JW, Lu, ZX, Lin, L, Henry, MD, Wu, YN, et al. (2014). rMATS: robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111: E5593-5601.

Claims (93)

  1. 포유동물 세포에서 단백질의 발현을 제공 및/또는 조절(controlling)하는 방법으로서, 세포에게
    (a) 제1 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 키메라 유전자(chimeric gene)를 포함하는 제1 발현 카세트(expression cassette)로서, 키메라 유전자는 선택적 스플라이싱된 미니유전자(alternatively spliced minigene)를 포함하는 제1 부분, 및 단백질을 코딩하는(encoding) RNA를 코딩하는 제2 부분을 포함하고, 단백질의 발현은 제1 부분의 선택적 스플라이싱에 의해 조절되는, 제1 발현 카세트
    를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 대상체에게 단백질을 제공하는 방법으로서, 대상체에게
    (a) 제1 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 키메라 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트로서, 키메라 유전자는 선택적 스플라이싱된 미니유전자를 포함하는 제1 부분, 및 단백질을 코딩하는 RNA를 코딩하는 제2 부분을 포함하고, 단백질의 발현은 제1 부분의 선택적 스플라이싱에 의해 조절되는, 제1 발현 카세트
    를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 포유동물에서 질환을 치료하는 방법으로서, 포유동물에게
    (a) 제1 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 키메라 유전자를 포함하는 제1 발현 카세트로서, 상기 키메라 유전자는 선택적 스플라이싱된 미니유전자를 포함하는 제1 부분, 및 단백질을 코딩하는 RNA를 코딩하는 제2 부분을 포함하고, 단백질의 발현은 제1 부분의 선택적 스플라이싱에 의해 조절되는, 제1 발현 카세트
    를 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단백질을 코딩하는 RNA를 코딩하는 제2 부분이, 번역 정지 코돈(translated stop codon)을 포함하거나, 개시 또는 출발 코돈을 결여하거나, 단백질을 생성하기 위한 개방 판독 프레임(open reading frame)이 아니거나, 단백질의 일부만을 코딩하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제1 부분의 선택적 스플라이싱이 전사물(transcript)을 변형시키고, 이에 의해, 정지 코돈을 결실(deleting) 또는 무효화(nullifying)하거나, 개시 또는 출발 코돈을 도입하거나, 개방 판독 프레임을 회복하거나, 단백질의 결손 부분(missing portion)을 제공하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 부분이 제2 부분의 5'인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 부분이 프레임내(in-frame) 번역 정지 코돈을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 제1 부분의 선택적 스플라이싱이 번역 정지 코돈을 제거하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질이 트랜스활성화인자(transactivator) 단백질인, 방법.
  10. 제1항 및 제4항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질이 트랜스활성화인자 단백질이고, 방법이 포유동물 세포에서 RNA의 발현을 조절하는 방법이고, 방법이 세포에게
    (b) 트랜스활성화인자 단백질이 결합하는 제2 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트
    를 투여하고, 이에 의해 포유동물 세포에서 RNA의 발현을 증가시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제2항 및 제4항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질이 트랜스활성화인자 단백질이고, 방법이 대상체에서 RNA의 발현을 조절하는 방법이고, 방법이 대상체에게
    (b) 트랜스활성화인자 단백질이 결합하는 제2 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트
    를 투여하고, 이에 의해 대상체에서 RNA의 발현을 증가시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  12. 제3항 및 제4항 내지 제9항 중의 어느 한 항에 있어서, 단백질이 트랜스활성화인자 단백질이고, 방법이 포유동물에서 질환을 치료하는 방법이고, 방법이 포유동물에게
    (b) 트랜스활성화인자 단백질이 결합하는 제2 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 발현 카세트
    를 투여하고, 이에 의해 포유동물에서 RNA의 발현을 증가시키고 질환을 치료하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  13. 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, RNA가 억제성 RNA인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 억제성 RNA가 siRNA, shRNA 또는 miRNA인, 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 억제성 RNA가 질환과 연관된 이상 또는 비정상 단백질의 발현을 억제 또는 감소시키고, 이에 의해 질환을 치료하는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, RNA가 치료 단백질(therapeutic protein)을 코딩하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 치료 단백질이 질환과 관련된 단백질 결핍을 수정하고, 이에 의해 질환을 치료하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중의 어느 한 항에 있어서, RNA가 Cas9 단백질을 코딩하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 제3 발현 조절 요소에 작동적으로 연결된 가이드 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제3 발현 카세트를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 제3 발현 조절 요소가 구성적 프로모터(constitutive promoter)인, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 발현이 유전 질환을 수정하는, 방법.
  22. 제18항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 있어서, Cas9 단백질이 뉴클레아제 기능을 결여하고, Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 발현이 유전자의 발현을 억제하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 발현 조절 요소가 구성적 프로모터, 세포형 특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터인, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 발현 카세트의 제1 부분 및 제1 발현 카세트의 제2 부분이 절단가능한 펩티드에 의해 분리되어 있는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 절단가능한 펩티드가 자가-절단 펩티드(self-cleaving peptide), 약물-감수성 프로테아제(drug-sensitive protease) 또는 내인성 엔도프로테아제의 기질인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 선택적 스플라이싱된 미니유전자의 스플라이싱이 소분자 스플라이싱 변형인자(small molecular splicing modifier)에 의해 조절되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 선택적 스플라이싱된 미니유전자의 스플라이싱이 세포 내의 질환 상태에 의해 조절되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제25항 중의 어느 한 항에 있어서, 선택적 스플라이싱된 미니유전자의 스플라이싱이 세포형 또는 조직형에 의해 조절되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 트랜스활성화인자 또는 단백질의 발현 증가가, 키메라 유전자의 제1 부분에서의 선택적 스플라이싱된 엑손의 포함에 의해 제공되는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 포함된 엑손이 번역 개시 조절 서열을 포함하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중의 어느 한 항에 있어서, 트랜스활성화인자 또는 단백질의 발현 증가가 SMN2 엑손 7 포함에 의해 제공되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, SMN2 엑손 7의 포함이 소분자 스플라이싱 변형인자의 존재에 의해 유발되는, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 소분자 스플라이싱 변형인자를 세포 또는 대상체에게 투여하고, 이에 의해 RNA 또는 단백질의 발현을 증가시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 소분자 스플라이싱 변형인자가
    Figure pct00009
    또는
    Figure pct00010
    또는
    Figure pct00011
    인, 방법.
  35. 제1항 내지 제28항 중의 어느 한 항에 있어서, 트랜스활성화인자 또는 단백질의 발현 증가가 키메라 유전자의 제1 부분에서 선택적 스플라이싱된 엑손의 스키핑(skipping)에 의해 제공되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 스키핑된(skipped) 엑손이 정지 코돈을 포함하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중의 어느 한 항에 있어서, 트랜스활성화인자 또는 단백질의 발현 증가가 MDM2 엑손 4-11 스키핑에 의해 제공되는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, MDM2 엑손 4-11의 스키핑이 소분자 스플라이싱 변형인자의 존재에 의해 유발되는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 소분자 스플라이싱 변형인자가 수데마이신(sudemycin)인, 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 발현 카세트가 바이러스 벡터에 포함되는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터로부터 선택되는, 방법.
  42. 제3항 내지 제6항 및 제10항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 질환이 단백질 결핍에 의해 유발되는, 방법.
  43. 제3항 내지 제6항 및 제10항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 질환이 유전자 결함(genetic defect)에 의해 유발되는, 방법.
  44. 제3항 내지 제6항 및 제10항 내지 제41항 중의 어느 한 항에 있어서, 질환이 신경-퇴행성 질환(neuro-generative disease)인, 방법.
  45. 제44항에 있어서, 신경-퇴행성 질환이 폴리-글루타민 반복 질환(poly-glutamine repeat disease)을 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 폴리-글루타민 반복 질환이 헌팅톤병(HD)을 포함하는, 방법.
  47. 제44항에 있어서, 신경-퇴행성 질환이 척수소뇌 실조증(SCA), 임의로 임의의 SCA1-SCA29를 포함하는, 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 인간인, 방법.
  49. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제48항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여가 중추신경계에 대한 것인, 방법.
  50. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제49항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여가 뇌에 대한 것인, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 투여가 뇌실(brain ventricle)에 대한 것인, 방법.
  52. 제41항 내지 제51항 중의 어느 한 항에 있어서, AAV 벡터가 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자를 포함하고, 제1 또는 제2 발현 카세트가 한 쌍의 AAV 역방향 말단 반복체(inverted terminal repeat; ITR) 사이에 삽입되는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, AAV 캡시드 단백질이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 및 AAV-2i8 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-Rh10, 또는 AAV-2i8 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 단백질과 70% 이상 동일성(identity)을 갖는 캡시드 단백질로 이루어진 그룹으로부터 유래되거나 이로부터 선택되는, 방법.
  54. 제52항에 있어서, ITR 쌍의 하나 이상이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-rh10 또는 AAV-2i8 ITR, 또는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV-rh74, AAV-Rh10 또는 AAV-2i8 ITR 서열과 70% 이상 동일성을 갖는 ITR로부터 유래되거나, 이를 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
  55. 제1항 내지 제54항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 발현 카세트가 프로모터를 포함하는, 방법.
  56. 제1항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 발현 카세트가 인핸서 요소(enhancer element)를 포함하는, 방법.
  57. 제1항 내지 제55항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 발현 카세트가 CMV 인핸서 또는 치킨(chicken) 베타 액틴 프로모터를 포함하는, 방법.
  58. 제1항 내지 제57항 중의 어느 한 항에 있어서, 제1 또는 제2 발현 카세트가 인트론, 필러(filler) 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 폴리 A 신호 또는 이의 조합 중의 하나 이상을 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제41항 내지 제58항 중의 어느 한 항에 있어서, 복수의 바이러스 벡터가 투여되는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 바이러스 벡터가 킬로그램당 약 1×106 내지 약 1×1018 벡터 게놈(vg/kg)의 용량으로 투여되는, 방법.
  61. 제59항에 있어서, 바이러스 벡터가 약 1×107-1×1017, 약 1×108-1×1016, 약 1×109-1×1015, 약 1×1010-1×1014, 약 1×1010-1×1013, 약 1×1010-1×1013, 약 1×1010-1×1011, 약 1×1011-1×1012, 약 1×1012-1×1013 또는 약 1×1013-1×1014 vg/포유동물 kg의 용량으로 투여되는, 방법.
  62. 제59항에 있어서, 바이러스 벡터가 약 0.5-4ml의 1×106-1×1016 vg/ml의 용량으로 투여되는, 방법.
  63. 제41항 내지 제62항 중의 어느 한 항에 있어서, 복수의 공 바이러스 캡시드(empty viral capsid)를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 공 바이러스 캡시드가 포유동물에게 투여된 바이러스 입자로 제형화되는, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 공 바이러스 캡시드가 1.0 내지 100배 과량의 바이러스 벡터 입자 또는 공 바이러스 캡시드와 함께 투여되거나 제형화되는, 방법.
  66. 제63항 또는 제64항에 있어서, 공 바이러스 캡시드가 바이러스 벡터 입자에 대해 약 1.0 내지 100배 과량의 공 바이러스 캡시드와 함께 투여되거나 제형화되는, 방법.
  67. 제1항 내지 제66항 중의 어느 한 항에 있어서, 전달 또는 투여가 뇌실내 주사 및/또는 실질내(intraparenchymal) 주사를 포함하는, 방법.
  68. 제1항 내지 제68항 중의 어느 한 항에 있어서, 그것을 뇌실, 지주막하 공간 및/또는 척수강내 공간에 투여 또는 전달하는 것을 포함하는, 방법.
  69. 제1항 내지 제68항 중의 어느 한 항에 있어서, 세포가 상의(ependymal), 연막(pial), 내피, 뇌실, 수막, 글리아(glial) 세포 및/또는 뉴런을 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상의, 연막, 내피, 뇌실, 수막, 글리아 세포 및/또는 뉴런이 RNA 또는 단백질을 발현하는, 방법.
  71. 제3항 내지 제6항 및 제10항 내지 제70항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여가 뇌 내의 단일 위치(single location)에서 수행되는, 방법.
  72. 제3항 내지 제6항 및 제10항 내지 제70항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여가 뇌 내의 1 내지 5개 위치에서 수행되는, 방법.
  73. 제3항 내지 제6항 및 제10항 내지 제70항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여가 이마측 심실(rostral lateral ventricle); 및/또는 꼬리측 심실(caudal lateral ventricle); 및/또는 우측 심실(right lateral ventricle); 및/또는 좌측 심실(left lateral ventricle); 및/또는 우동측 심실(right rostral lateral ventricle); 및/또는 좌동측 심실(left rostral lateral ventricle); 및/또는 우꼬리측 심실(right caudal lateral ventricle); 및/또는 좌꼬리측 심실(left caudal lateral ventricle)에 대한 것인, 방법.
  74. 제3항 내지 제6항 및 제10항 내지 제70항 중의 어느 한 항에 있어서, 투여가 포유동물의 대조(cisterna magna), 심실내 공간(intraventricular space), 뇌실, 지주막하 공간, 척수강내 공간 및/또는 뇌실막(ependyma) 중의 임의의 것에 대한 단일 또는 복수 용량인, 방법.
  75. 제3항 내지 제6항 및 제10항 내지 제70항 중의 어느 한 항에 있어서, 방법이 헌팅톤병(HD) 또는 척수소뇌 실조증(SCA)의 유해 증상(adverse symptom)을 감소시키는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 유해 증상이 초기 단계 또는 후기 단계 증상; 거동, 성격 또는 언어 증상; 운동 기능 증상; 및/또는 인지 증상을 포함하는, 방법.
  77. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제76항 중의 어느 한 항에 있어서, 방법이 포유동물의 기억 장애, 기억 결함 또는 인지 기능을 증가, 개선, 보존, 회복 또는 구제하는, 방법.
  78. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제77항 중의 어느 한 항에 있어서, 방법이 조정력 상실, 느린 움직임 또는 신체 경직의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지하는, 방법.
  79. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제78항 중의 어느 한 항에 있어서, 방법이 경련 또는 안절부절 움직임의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지하는, 방법.
  80. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제79항 중의 어느 한 항에 있어서, 방법이 우울증 또는 과민성(irritability)의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지하는, 방법.
  81. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제80항 중의 어느 한 항에 있어서, 방법이 물건 낙하, 넘어짐, 균형 상실, 말하기 곤란 또는 연하 곤란(difficulty swallowing)의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지하는, 방법.
  82. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제81항 중의 어느 한 항에 있어서, 방법이 조직화하는 능력의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지하는, 방법.
  83. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제82항 중의 어느 한 항에 있어서, 방법이 운동실조(ataxia) 또는 반사 감소(diminished reflex)의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지하는, 방법.
  84. 제2항 내지 제6항 및 제8항 내지 제83항 중의 어느 한 항에 있어서, 방법이 발작 또는 진전(tremor) 발작 또는 진전의 악화를 개선 또는 억제 또는 감소 또는 방지하는, 방법.
  85. 제1항 내지 제84항 중의 어느 한 항에 있어서, 포유동물이 비-설치류 포유동물인, 방법.
  86. 제85항에 있어서, 비-설치류 포유동물이 영장류인, 방법.
  87. 제86항에 있어서, 영장류가 인간인, 방법.
  88. 제87항에 있어서, 인간이 50세 이상인, 방법.
  89. 제88항에 있어서, 인간이 어린이인, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 어린이가 약 1 내지 약 8세인, 방법.
  91. 제3항 내지 제6항 및 제10항 내지 제90항 중의 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 면역억제제를 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 면역억제제가 벡터의 투여 또는 전달 전에 또는 이와 동시에 투여되는, 방법.
  93. 제91항에 있어서, 면역억제제가 항염증제인, 방법.
KR1020217006348A 2018-08-07 2019-08-07 유전자 발현의 선택적 스플라이싱 조절 및 치료 방법 KR20210042123A (ko)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862715756P 2018-08-07 2018-08-07
US62/715,756 2018-08-07
US201962837701P 2019-04-23 2019-04-23
US62/837,701 2019-04-23
US201962838223P 2019-04-24 2019-04-24
US62/838,223 2019-04-24
US201962872417P 2019-07-10 2019-07-10
US62/872,417 2019-07-10
PCT/US2019/045401 WO2020033473A1 (en) 2018-08-07 2019-08-07 Alternative splicing regulation of gene expression and therapeutic methods

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210042123A true KR20210042123A (ko) 2021-04-16

Family

ID=69413338

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217006348A KR20210042123A (ko) 2018-08-07 2019-08-07 유전자 발현의 선택적 스플라이싱 조절 및 치료 방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20210355509A1 (ko)
EP (1) EP3833357A4 (ko)
JP (1) JP2021532812A (ko)
KR (1) KR20210042123A (ko)
CN (1) CN112805009A (ko)
AU (1) AU2019317573A1 (ko)
CA (1) CA3108293A1 (ko)
IL (1) IL280636A (ko)
WO (1) WO2020033473A1 (ko)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2022001984A (es) * 2019-08-15 2022-05-19 Childrens Hospital Philadelphia Terapia combinada transgénica y de miarn derivado de intrones para el tratamiento de ataxia espinocerebelosa 1 (sca1).
WO2021084495A1 (en) * 2019-11-01 2021-05-06 Novartis Ag The use of a splicing modulator for a treatment slowing progression of huntington's disease
IL295542A (en) * 2020-02-12 2022-10-01 Childrens Hospital Philadelphia Compositions and methods for inducible alternative splicing regulation of gene expression
TW202302854A (zh) * 2021-02-19 2023-01-16 美商佛羅里達大學研究基金會公司 藉由異源使用選擇性剪接匣以提供基因療法貨物調控的方法及組成物
WO2023070134A2 (en) * 2021-10-22 2023-04-27 Fred Hutchinson Cancer Center Synthetic introns for targeted gene expression
WO2023225160A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 The Children's Hospital Of Philadelphia Compositions and methods for inducible alternative splicing regulation of gene expression
WO2023230409A1 (en) * 2022-05-24 2023-11-30 Kate Therapeutics, Inc. Compositions for treating xlmtm
WO2024060205A1 (zh) * 2022-09-23 2024-03-28 北京基驭医疗科技有限公司 包含基于小分子药物的可变剪接调节元件的核酸分子
CN115747217B (zh) * 2022-10-26 2023-11-28 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） 长链非编码rna pdxdc1-as1及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2242234T3 (es) * 1996-09-12 2005-11-01 Syngenta Participations Ag Plantas transgenicas que expresan enzimas celuloliticas.
GB2404382B (en) * 2003-07-28 2008-01-30 Oxitec Ltd Pest control
US7838657B2 (en) * 2004-12-03 2010-11-23 University Of Massachusetts Spinal muscular atrophy (SMA) treatment via targeting of SMN2 splice site inhibitory sequences
US8633019B2 (en) * 2008-05-27 2014-01-21 Ptc Therapeutics, Inc. Methods for treating spinal muscular atrophy
WO2010120820A1 (en) * 2009-04-13 2010-10-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulation of smn2 splicing
SG10201609188WA (en) * 2012-02-10 2016-12-29 Ptc Therapeutics Inc Compounds for treating spinal muscular atrophy
US9856474B2 (en) * 2013-01-16 2018-01-02 Iowa State University Research Foundation, Inc. Deep intronic target for splicing correction on spinal muscular atrophy gene
WO2018098446A1 (en) * 2016-11-28 2018-05-31 Ptc Therapeutics, Inc Methods for modulating rna splicing
IL295542A (en) * 2020-02-12 2022-10-01 Childrens Hospital Philadelphia Compositions and methods for inducible alternative splicing regulation of gene expression

Also Published As

Publication number Publication date
US20210355509A1 (en) 2021-11-18
CN112805009A (zh) 2021-05-14
EP3833357A1 (en) 2021-06-16
IL280636A (en) 2021-03-25
EP3833357A4 (en) 2022-06-08
AU2019317573A1 (en) 2021-02-25
JP2021532812A (ja) 2021-12-02
WO2020033473A1 (en) 2020-02-13
CA3108293A1 (en) 2020-02-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210355509A1 (en) Alternative splicing regulation of gene expression and therapeutic methods
US20230295663A1 (en) Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als)
US11851690B2 (en) Systems and methods for the treatment of hemoglobinopathies
JP2021526792A (ja) 真核細胞における翻訳のための環状ｒｎａ
US11155817B2 (en) Therapeutic for treatment of diseases including the central nervous system
US20230340498A1 (en) Compositions and methods for inducible alternative splicing regulation of gene expression
JP2019519219A (ja) ハンチントン病治療組成物及び方法
US20230346981A1 (en) Adeno-associated viral vector variants
US20150079631A1 (en) Microvesicle-mediated delivery of therapeutic molecules
TW202217003A (zh) 經改造之肌肉靶向組合物
CA3129248A1 (en) Telomerase-containing exosomes for treatment of diseases associated with aging and age-related organ dysfunction
CA3131776A1 (en) Compositions and methods for treating laminopathies
CA3134544A1 (en) Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
JP2022545378A (ja) ＳＣＡ１の治療のための、導入遺伝子およびイントロン由来ｍｉＲＮＡを組み合わせた治療法
WO2023225160A1 (en) Compositions and methods for inducible alternative splicing regulation of gene expression
TW202339775A (zh) 工程化的 adar 募集 rna 及其使用方法
WO2024089663A1 (en) Modified cellular by-product, methods and uses thereof
CN118076743A (zh) 工程化肌肉靶向组合物
Woffindale RNA-based therapeutics for Alzheimer's disease
O'Loughlin Towards extracellular vesicle based gene therapy for Huntington's disease
Balaj Exosomes: The biological messengers