KR20210038918A - Il-17a 결합 펩티드 및 그의 의학적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 IL-17A와 수용체 IL-17RA의 상호작용의 억제제인 IL-17A 결합 펩티드, 및 생체접합체, 이량체, 제약 조성물 및 그의 의학적 용도에 관한 것이다.

Description

IL-17A 결합 펩티드 및 그의 의학적 용도
본 발명은 IL-17AR 수용체에 대한 IL-17A의 결합 및 이에 따른 복합체 IL-17A/IL-17RA/IL17RC의 형성의 억제제인 IL-17A 결합 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 목적은 또한 상기 펩티드를 포함하는 생체접합체 및 이량체, 상기 펩티드, 생체접합체 및 이량체의 제약 조성물 및 의학적 용도이다.
인터류킨 17 (IL-17)로서 불리기도 하는 인간 세포독성 T 림프구-연관 항원 8 (CTLA8)은 1993년에 처음 클로닝되었다. 인간 IL-17에 대해 기재된 첫 번째 생물학적 활성은 류마티스 관절염 활막 세포로부터의 인터류킨 6 (IL-6) 및 인터류킨 8 (IL-8)의 생산을 유도하는 것이었다. 이러한 발견은 IL-6을 통한 염증 및 IL-8을 통한 호중구 동원에 있어서의 IL-17의 역할을 시사하였다 (Xu S et al., Cell Mol Immunol. 2010, 164-74; Murcia RY et al., PLOS ONE 2016, 11(5): e0154755doi:10.1371/journal.pone.0154755).
나중에 IL-17A로 명명된 이러한 분자는 5개의 부가의 구성원, 즉 IL-17B 내지 F를 포함하는 더 큰 패밀리의 일부라는 것이 나중에 밝혀졌다. IL-17F는 처음 발견된 IL-17인 IL-17A과 가장 큰 상동성 (약 56%)을 공유하는 반면, IL-17E는 가장 낮은 서열 보존성 (약 16%)을 나타낸다. IL-17 패밀리의 구성원은 이종이량체로서 작용할 수도 있는 IL-17A 및 IL-17F를 제외하고는, 동종이량체의 형태로 자신의 수용체에 결합하는 기능을 발휘한다 (Goepfert A et al., Sci Rep. 2017, 7 (1), 8906).
이러한 패밀리 중 가장 광범위하게 조사된 시토카인인 IL-17A는 미생물 감염에 대항한 숙주 방어에 있어서 필수적인 역할을 하며, 다수의 염증성 및 자가면역 병태에 대한 주요 구동자로 간주된다. IL-17A의 병리학적 생산은 과도한 염증과 명백한 조직 손상을 초래한다.
특히, IL-17A는 시토카인, 케모카인, 급성기 단백질, 항미생물 펩티드, 뮤신 및 매트릭스 메탈로프로테이나제를 포함한 다양한 분자의 유도를 통해 호중구 동원, 염증 및 숙주 방어로 이어지는 일련의 이벤트를 증폭시킬 수 있다. IL-17A는 T 헬퍼 17 (Th17) 세포에 의해 생산되는 시그니처 시토카인이지만, IL-17A는 다른 IL-17 패밀리 시토카인과 마찬가지로, 면역 세포에서 비-면역 세포에 이르기까지 다수의 공급원을 갖고 있다.
IL-17B, IL-17C 및 IL-17D는 또한 염증유발성 시토카인으로 간주되지만, 그들의 역할은 완전히 공지되어 있지 않다. IL-25로서 공지되기도 한 IL-17E는 가장 낮은 상동성을 가지며 기생충 및 알레르기에 대항한 Th2 세포 반응에 관여한다. CCL20은 Th17 및 수지상 세포의 염증 부위에 대한 동원을 구동시킨다. 결국, Th17 세포가 활성화되어, 염증 매개인자를 생산하고 만성 염증을 유발한다.
IL-17 패밀리에 속하는 시토카인은 관련 수용체를 통해 시그널을 보내고 NFκB, MAPK 및 C/EBP를 포함하는 하류 경로를 활성화시켜 항미생물 펩티드, 시토카인 및 케모카인의 발현을 유도시킨다. 근위 어댑터 Act1은 모든 IL-17 시토카인의 시그널링 동안 공통 매개인자이며, IL-17 매개된 숙주 방어 및 IL-17 구동된 자가면역 병태에 관여한다.
IL-17 수용체 패밀리는 IL-17RA, RB, RC, RD 및 RE의 5가지 구성원으로 이루어지며, 이들 모두는 리간드와 마찬가지로 서열 상동성을 공유한다.
IL-17RA는 광범위한 조직 및 세포 유형에서 편재적으로 발현되며 IL-17-A, C, E 및 F에 결합한다. 수용체 시그널링은 공통 IL17-RA 서브유닛과, 리간드에 따라 달라지고 시그널링 특이성을 조절하는 제2 서브유닛으로 형성된 이종이량체성 수용체를 통해 발생한다. 리간드로 자극하면, IL-17RA는 IL-17RB (IL-17E의 경우), IL-17RC (IL-17A 및 IL-17F의 경우) 또는 IL-17RE (IL-17C의 경우)와 이종이량체성 수용체 복합체를 형성한다. 제1 IL-17RA 수용체 서브유닛에 대한 리간드의 결합은 제2 결합 이벤트를 촉진시키므로, 이종이량체성 수용체 복합체의 형성을 유도한다고 제안된다. 특히, IL-17A와 IL-17F의 시그널은 IL-17RA와 IL-17RC 간의 복합체에 의해 매개된다. IL-17F는 IL-17A보다 약 100배 내지 1000배 더 낮은 친화도로 IL-17RA에 결합하는 반면, IL-17RC에 대한 결합 친화도는 두 시토카인 간에 거의 동등한 수준이다 (Onishi RM et al., Immunology 2010, 129(3), 311-321; Gu C et al., Cytokine 2013, 64(2), 477-485).
인간에서의 IL-17A는 다양한 자가면역 및 염증성 병태, 예컨대 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 건선, 크론병, 전신 홍반성 루푸스, 천식, 베체트병, 및 고 IgE 증후군에서 중추적인 역할을 한다 (Fujino S et al. Gut, 2003, 52, 65-70; Shabgah AG et al., Postepy Dermatol Allergol 2014, 31 (4), 256-261). 더욱이, IL-17A 차단은 강직성 척추염 및 류마티스 관절염에서 전임상 및 임상 효능을 보여주었다 (Liu S et al., Nature-Scientific Reports 2016, doi:10.1038/srep26071; Lubberts E et al., Arthritis Rheum 2004, 50, 650-659).
또한, IL-17A는 안구 질환, 특히 안구 표면 및 각막 질환, 예컨대 안구 건조 질환 (DED), 바이러스성 및 박테리아성 각막염의 병인에 관여하는 것으로 나타났다. IL-17A를 중화시키기 위해 개발된 항체는 이들 질환의 중증도를 감소시키는 유망한 결과를 보여주었다 (Garbutcheon-Singh KB et al., Curr Eye Res, 2018, DOI:10.1080/02713683.2018.1519834).
DED는 눈물 시스템 및 안구 표면의 염증성 및 자가면역성 안과 질환으로, 불편함, 시각 장애 및 눈물 막 손상을 초래한다. DED는 성인 집단에서 후천성 시각 장애의 가장 흔한 원인 중 하나이다 (Stern ME et al., Mucosal Immunol 2010, 3(5), 425-442; Stevenson W et al., Arch Ophthalmol 2012, 130(1), 90-100, Parul Singh , Parul Singh 2012, Hah, Chung et al. 2017). 이러한 질환은 안구 표면에 영향을 미치는 면역 및 염증 프로세스를 수반하며, 중증의 경우에는 실명으로 이어질 수 있다. 현재 DED의 치료는 주로 증상성이며, 안구 윤활제 및 비특이적 항염증제, 예컨대 코르티코스테로이드, 시클로스포린 A 및 타크롤리무스로 구성된다.
IL-17A는 DED의 가장 시력을 위협하는 합병증인 각막 상피 장벽 기능의 손상과 연관이 있다. Th17 세포에 있어서의 증가는 안구 표면 상의 IL-6, TGF-β, IL-23 및 IL-17A 농도의 증가 뿐만 아니라 눈물 중의 IL-17 농도의 증가를 유도하고, 실험적 DED 모델의 안구 표면 상의 Th17 세포의 수의 증가를 유도하는 DED 환자 안구 조직에서 보고된다. 또한, IL-17A의 생체내 중화는 질환의 유도 및 중증도를 현저하게 약화시키는 결과를 초래하는 것으로 입증되었다 (De Paiva CS et al., Mucosal Immunol. 2009; 2(3): 243-253, Chauhan et al., Mucosal Immunol , 2009, 2(3), 243-253; Chauhan SK et al., Mucosal Immunol 2009, 2(4), 375-376; Chauhan, El Annan et al. 2009, De Paiva, Chotikavanich et al. 2009, de Paiva, Huang et al. 2014, Subbarayal, Chauhan et al. 2016).
IL-17A는 또한 건선과 관련이 있어 왔다. 건선은 만성 염증성 질환이다. 은빛 비늘로 덮인 건조하고 융기된 붉은 피부 병변 (플라크)으로서 그 징후가 나타난다. 수많은 임상 표현형 (즉, 플라크, 물방울, 농포성, 역위)이 존재하며, 질환 중증도는 몇 개의 흩어진 플라크에서 광범위한 신체 표면 침범에 이르기까지 다양하다. 건선이 있는 개개인은 다른 만성적이고 심각한 질환, 예컨대 건선성 관절염, 대사 증후군, 심혈관계 질환 및 우울증에 걸릴 위험이 증가한다. 건선의 병태 생리학에서의 IL-17A의 중심 역할이 입증되었다 (Zeichner JA et al. J Clin Aesthet Dermatol 2016, 9 (6 Suppl 1), S3-S6). 건선에서는, IL-17 mRNA의 발현이 비병변 피부와 비교해서 병변 피부에서 더 높다. 부가적으로, IL-17A 수준은 질환 중증도와 상당한 상관 관계가 있다 (Arican Oet al. Mediators Inflamm 2005, 2005, 273-279, Takahashi K et al. Clin Exp Dermatol 2010, 35, 645-649). IL-17A의 차단은 각질 세포 과다 증식, 진피 내로의 T-세포 침윤 및 주요 질환 전파 유전자의 mRNA 발현을 감소시키는 것으로 나타났다 (Krueger JG et al., J Allergy Clin Immunol 2012, 130, 145-154).
완전 인간 IgG1k 항-IL-17A mAb인 항-IL-17A 항체 세쿠키누맙(secukinumab) [AIN457, 컨센틱스(Consentyx)™], 및 인간화 IgG4 항체인 이세키주맙(ixekizumab) (LY2439821)이 건선 임상 시험에서 시험되었으며, 중등도 내지 중증의 건선 치료를 위해 승인되었다. 임상 시험 동안, 두 항체 모두 환자 집단의 80%에서 질환의 중증도를 적어도 75%만큼 (PASI75) 감소시킬 수 있었다. 더욱이, 현재의 진행된 임상 시험은 강직성 척추염 및 건선성 관절염의 치료에도 유망한 결과를 보여주었다. 다른 항체는 현재 동일한 적응증에 대한 임상 시험 중이다.
상기 증거는 IL-17A를 표적으로 할 수 있고 상기 병리의 치료를 위해 그의 시그널링을 억제할 수 있는 분자의 개발을 강력하게 지원한다. 최근까지도, IL-17A와 그의 수용체를 표적으로 하는 것은 항체의 영역으로 남아있었다. 항체를 선호하는 이유는 IL-17A로서의 시토카인이 지금까지도 풀리지 않는 것으로 간주되는, 표적화하기 어려운 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 표적을 구성하기 때문이다. 실제로, PPI 인터페이스는 일반적으로 평평하며, 통상적으로 작은 분자량 (SMW) 분자에 결합하는데 필요한 깊은 서브포켓과 홈이 결여된다. 그럼에도 불구하고 최근 몇 년 동안 새로운 연구에서, IL-17A와 결합할 수 있고, 이와 IL-17RA 수용체와의 상호작용을 방지하여, IL-17A 경로 활성화를 억제할 수 있는 몇 가지 SMW IL-17A 길항제가 확인되었다 (Espada A et al. J Med Chem 2016, 59(5), 2255-2260; Ting JP et al. PLoS One 2018, 13(1), e0190850; Liu S et al., Scientific reports, 6:26071, doi: 10.1038/srep26071). 이들 중에서, 높은 친화성 펩티드 (HAP)로 명명된 서열 IHVTIPADLWDWINK의 펩티드가 보고되었다 (Liu S et al., Scientific reports, 6:26071, doi: 10.1038/srep26071).
그러나, IL-17A/IL-17RA 축과 관련된 장애의 치료를 위한 새로운 치료 옵션의 개발을 위해, IL-17A와 높은 친화도로 결합할 수 있고 IL-17A 경로 활성화를 방지할 수 있는 새로운 분자를 확인하고 그의 특징을 규명할 필요가 여전히 있다.
본 발명자들은 놀랍게도, IL-17A의 N-말단 부분 상의 특이적 부위에 결합할 수 있고, 이에 의해 IL-17RA와의 상호작용 및 IL-17A/IL-17RA/IL17RC 복합체의 형성을 억제할 수 있는 펩티드를 발견하였다.
상기 상호작용의 억제는 IL-17A 시그널링 경로를 차단한다. 따라서 본 발명에 따른 펩티드는 TH17 관련 염증, 및 이들 세포 및 IL-17A가 중추적인 역할을 하는 염증성 및 자가면역 질환에서 관찰되는 후속 손상을 감소시킬 수 있다.
실험 섹션에서 제시된 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 안과 및 피부과 질환의 국소 치료에 특히 적합하게 하는 물리적-화학적 특성을 갖는다.
상기 펩티드는 IL-17A의 과도한 생산 또는 활성에 의존적인 질환의 혁신적이고 특이적 국소 치료를 설계하는데 유용하다.
본 발명의 목적은 IL-17RA에 대한 IL-17A 결합을 억제할 수 있는 펩티드, 이량체 및 생체접합체, 상기 펩티드, 이량체 또는 생체접합체를 포함하는 제약 조성물, 및 IL-17A에 의존적인 자가면역 및 염증성 질환의 예방 및/또는 치료에 있어서의 상기의 용도이다.
도 1은 본 발명에 따른 대표적인 IL-17A 결합 펩티드를 사용한 실시예 5에 기재된 IL-17RA-IL17RC 이량체화 검정에서 수득된 일부 용량-반응 곡선을 제시한다. 상이한 펩티드로 처리하여 수득된 IL-17A에 의해 유도된 IL-17RA/IL17RC 이량체화의 억제 백분율이 보고된다.
도 2는 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정된, 인간 분화되고 활성화된 TH17 세포에 의한 IL6, IL-17A 및 IL23의 분비에 대한 서열식별번호(SEQ ID N.): 18의 IL-17A 결합 펩티드의 활성을 제시한다. 서열식별번호: 18의 펩티드를 수반하거나 수반하지 않는 (대조군) TH17 세포의 상청액 중의 상이한 시토카인의 농도가 보고된다.
도 3은 실시예 6에 기재된 바와 같이 측정된, 인간 분화되고 활성화된 TH17 세포에 의한 메탈로프로테이나제 3의 분비에 대한 서열식별번호: 18의 IL-17A 결합 펩티드의 활성을 제시한다. 서열식별번호: 18의 펩티드를 수반하거나 수반하지 않는 (대조군) TH17 세포의 상청액 중의 메탈로프로테이나제 3의 농도가 보고된다.
도 4는 실시예 6에 기재된 바와 같이, 서열식별번호: 18의 펩티드의 존재 및 부재 (대조군) 하에 24시간 후 인간 TH17 세포의 생육성을 제시한다.
도 5는 본 발명에 따른 IL-17A 펩티드의 IL-17A 상의 결합 부위를 제시한다.
도 6은 서열식별번호: 2 (상부 패널) 또는 서열식별번호: 1 (하부 패널)의 펩티드를 사용한 실시예 9의 실험에서 수득된 센소그램을 제시한다.
도 7은 실시예 9의 실험에서 수득된, 서열식별번호: 2 (상부 패널) 또는 서열식별번호: 1 (하부 패널)의 펩티드의 상이한 농도에서의 친화성 상수 값을 제시한다.
도 8은 처리되지 않거나 (비히클) 또는 서열식별번호: 2의 펩티드 (패널 A) 또는 펩티드 HAP (서열식별번호: 1) (패널 B)로 처리된 HCEC 세포에서 실시예 10에 기재된 바와 같이 실시간 PCR에 의해 측정된 IL-8의 발현 수준을 제시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. T-검정은 통계 분석으로서 수행되었다. P-값 *<0.05, **<0.005, ***<0.0005.
도 9는 처리되지 않거나 (비히클) 또는 서열식별번호: 2의 펩티드 (패널 A) 또는 펩티드 HAP (서열식별번호: 1) (패널 B)로 처리된 HCEC 세포에서 실시예 10에 기재된 바와 같이 실시간 PCR에 의해 측정된 IL-6의 양을 제시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. T-검정은 통계 분석으로서 수행되었다. P-값 *<0.05, **<0.005, ***<0.0005.
도 10은 처리되지 않거나 (비히클) 또는 서열식별번호: 2의 펩티드 (패널 A) 또는 펩티드 HAP (서열식별번호: 1) (패널 B)로 처리된 HCEC 세포에서 실시예 10에 기재된 바와 같이 실시간 PCR에 의해 측정된 TNF-α의 양을 제시한다. 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다. T-검정은 통계 분석으로서 수행되었다. P-값 *<0.05, **<0.005, ***<0.0005.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 다른 과학적 전문 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해하는 의미를 갖는 것으로 의도된다. 일부 경우에서, 통상적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 즉시 참조하기 위해 본원에서 정의되므로; 본원에 그러한 정의를 포함하는 것은 관련 기술분야에서 일반적으로 이해되는 것에 비해 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되서는 안된다.
용어 "제약상 허용되는 부형제"는 안전성에 대해 적절하게 평가되었고 의도적으로 약물 전달 시스템에 포함되는 활성 제약 성분 (API) 이외의 물질을 지칭한다. 제약상 허용되는 부형제는 선행 기술에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Handbook of Pharmaceutical Excipients, seventh edition 2013]에 개시된다 (Rowe, Sheskey et al. 2012).
부형제는 정상적으로 최종 제약 조성물에서 갖는 기능에 따라 분류된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 적합한 부형제는, 예를 들어 희석제, 흡착제, 활택제, 결합제, 윤활제, 계면 활성제, 붕해제, 보존제, 항산화제 또는 그의 혼합물이다.
본원에서의 용어 "대략" 및 "약"은 측정에서 발생할 수 있는 실험 오차의 범위를 지칭한다.
용어 "포함하는", "갖는", "포함한" 및 "함유하는"은 개방형 용어 (즉, "포함하나 이에 제한되지는 않음"을 의미함)로 해석되어야 하며, 또한 용어에 대한 지원을 "본질적으로 이루어지는", "본질적으로 이루어진", "이루어지는" 또는 "이루어진"으로서 제공하는 것으로 간주되어야 한다.
용어 "본질적으로 이루어지는", "본질적으로 이루어진"은 반 폐쇄형 용어로서 해석되어야 하며, 이는 본 발명의 기본 및 신규 특징에 실질적으로 영향을 미치는 다른 성분이 포함되지 않는다는 것을 의미한다 (따라서 임의적 부형제가 포함될 수 있음).
용어 "이루어지는", "이루어진"은 폐쇄형 용어로서 해석되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생체접합체"는 상이한 분자, 바람직하게는 스페이서를 통해 임의로 연결된 두 분자 (이 중 적어도 하나는 생체분자임) 간의 안정한 공유 결합에 의해 형성된 접합체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "생체분자"는 생물학적 기원의 분자를 지칭한다. 이러한 용어는 거대 분자, 예컨대 탄수화물, 지질 및 단백질, 또는 작은 자연 산물을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해 "생체분자"는 바람직하게는, 아스코르브산, 카프르산, 카프론산, N-아세틸-글루코사민 (NAG로서 지칭되기도 함), N-아세틸무라민산 (NAM으로서 지칭되기도 함), 히알루론산, 알긴산, 키틴, (GalNAc)2, Gal-알파1,3-GalNAc 또는 트리갈락투론산으로부터 선택된다.
본원에서의 정의 "보존적 치환"은 주어진 아미노산을 유사한 생화학적 특성을 가진 상이한 아미노산으로 변화시키는 아미노산 교체인 보존적 교체 (보존적 돌연변이 또는 보존적 치환이라고도 함)을 지칭한다 (Simon French 1983).
발명의 설명
본 발명자들은 IL-17A와 높은 친화도로 결합할 수 있고 ILRA 수용체와의 상호작용을 억제할 수 있는 다수의 펩티드를 확인하였다. 이들 화합물은 IL-17A 시그널링의 억제제로서 작용한다.
따라서, 본 발명의 제1 목적은 ILRA에 대한 IL-17A 결합을 억제할 수 있으며, 하기 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다:
식 (I):
(I) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15
여기서, 서로 독립적으로:
X1은 I, V, D, K, W, A, G, L 또는 P이고;
X2는 H, M, K, N, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, H, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이거나 또는 부재하고;
X11은 D, E 또는 N이거나 또는 부재하고;
X12는 W, F, V, H 또는 Y이거나 또는 부재하고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이거나 또는 부재하고;
X14는 N, R, E, F, Q 또는 D이거나 또는 부재하고;
X15는 K, R, E, F, V, W, H 또는 D이거나 또는 부재하고;
단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1) 또는 그의 12 내지 14개 아미노산 길이의 C-말단 말단절단된 서열 IHVTIPADLWDWIN, IHVTIPADLWDWI 또는 IHVTIPADLWDW가 아님;
또는 식 (II):
(II) an-DLSAVCWAFPWDPECH-bn'
여기서, 서로 독립적으로:
a, b는 A, R, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V로부터 선택되고;
n = 0 내지 3의 정수이고;
n' = 0 내지 3의 정수임.
바람직하게는, 식 (II)에서 a 또는 b와 상이한 아미노산 각각은 보존적 치환으로 대체될 수 있다.
식 (II)의 바람직한 펩티드는 DLSAVCWAFPWDPECH (서열식별번호: 41)이다.
특히 바람직한 것은 식 (I)의 펩티드이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 식 (I)의 펩티드에서:
X1은 I, V, D, K 또는 W이고;
X2는 H, M, K 또는 N이고;
X3은 V 또는 F이고;
X4는 T, Q, H, V 또는 Y이고;
X5는 I 또는 F이고;
X6은 P 또는 G이고;
X7은 A 또는 Q이고;
X8은 D, E, N이고;
X9는 L, V, F 또는 W이고;
X10은 W, Y, F이거나 또는 부재하고;
X11은 D, E, N이거나 또는 부재하고;
X12는 W, F, V이거나 또는 부재하고;
X13은 I, V, F이거나 또는 부재하고;
X14는 N, R, E, F이거나 또는 부재하고;
X15는 K, R, E, F, V, W이거나 또는 부재하고;
단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1) 또는 그의 12 내지 14개 아미노산 길이의 C-말단 말단절단된 서열 IHVTIPADLWDWIN, IHVTIPADLWDWI 또는 IHVTIPADLWDW가 아니다.
대안적인 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 식 (I)의 펩티드에서:
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이거나 또는 부재하고;
X11은 D, E 또는 N이거나 또는 부재하고;
X12는 W, F, H 또는 Y이거나 또는 부재하고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이거나 또는 부재하고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이거나 또는 부재하고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나 또는 부재하고;
단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1) 또는 그의 12 내지 14개 아미노산 길이의 C-말단 말단절단된 서열 IHVTIPADLWDWIN, IHVTIPADLWDWI 또는 IHVTIPADLWDW가 아니다.
바람직하게는, 상기 식 (I)의 펩티드에서 모든 아미노산 X1 내지 X15가 존재하고, 상기 언급된 식 (I)의 펩티드는 15개의 아미노산 서열을 갖는다. 바람직하게는, 15개 미만의 아미노산 서열을 갖는 식 (I)의 펩티드에서, 하나의 아미노산이 부재하면, 상기 아미노산의 N 말단에서의 모든 아미노산이 또한 부재한다. 예를 들어, 아미노산 X10이 부재한 경우, 또한 아미노산 X11 내지 X15가 부재한다.
식 (I)의 특히 바람직한 펩티드는 X1이 V인 것이다.
X1을 V로서 갖는 특히 바람직한 펩티드는 서열식별번호: 2의 펩티드이다.
실험 섹션에서 입증되는 바와 같이, 본 발명자들은 서열식별번호: 1의 펩티드 HAP 내의 제1 아미노산 이소류신을 발린으로 대체한 서열식별번호: 2의 펩티드가 놀랍게도, HAP와 비교해서 현저하게 상이한 기능적 및 화학적-물리적 특성 뿐만 아니라 개선된 내약성을 나타낸다는 것을 발견하였다.
특히, 본 실시예에서 입증된 바와 같이, 상기 펩티드는 개선된 화학적-물리적 특성을 나타내며, 이는 특히 국소 및 안과용으로 유리하며, 서열식별번호: 1의 상응하는 펩티드와 비교해서 IL-17A에 대한 더 나은 투과성 및 증가된 친화성을 나타낸다. 또한, 본 발명자들은 펩티드 HAP가 IL-17A 시그널링에 대한 활성과는 독립적으로, 염증성 시토카인의 발현을 유도함으로써 각막 세포에 직접적인 독성 효과를 발휘한다는 것을 발견하였다. 놀랍게도, 서열식별번호: 2의 펩티드는 이러한 효과를 나타내지 않으므로, HAP와 비교해서 개선된 내약성을 특징으로 한다.
바람직하게는, 상기 식 (I)의 펩티드에서:
X1은 I, V 또는 L이고;
X2는 H, M, R, K 또는 E이고;
X3은 V, F 또는 I이고;
X4는 T, Q, S, Y 또는 N이고;
X5는 I, F 또는 V이고;
X6은 P이고;
X7은 A, Q, 또는 L이고;
X8은 D, E, 또는 Q이고;
X9는 L, W, F, V 또는 I이고;
X10은 W, Y 또는 F이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W 또는 F이고;
X13은 I, V, F 또는 L이고;
X14는 N, R, Q 또는 E이고;
X15는 K, R, H 또는 E이고;
단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1)이 아니거나;
또는
X1은 I 또는 V이고;
X2는 H, M 또는 R이고;
X3은 V 또는 F이고;
X4는 T 또는 Q이고;
X5는 I, F 또는 V이고;
X6은 P 또는 G이고;
X7은 A 또는 Q이고;
X8은 D 또는 E이고;
X9는 L이고;
X10은 W 또는 Y이고;
X11은 D 또는 E이고;
X12는 W이고;
X13은 I 또는 V이고;
X14는 N, R 또는 E이고;
X15는 K, R 또는 E이고;
단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1)이 아니거나;
또는
X1은 I 또는 V이고;
X2는 H 또는 M이고;
X3은 V이고;
X4는 T이고;
X5는 I이고;
X6은 P이고;
X7은 A이고;
X8은 D이고;
X9는 L, W, F, V 또는 I이고;
X10은 W 또는 Y이고;
X11은 D 또는 E이고;
X12는 W이고;
X13은 I 또는 V이고;
X14는 N, R 또는 E이고;
X15는 K, R 또는 E이고;
단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1)가 아니거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L 또는 P이고;
X2는 M, K, N, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
X11은 E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L 또는 P이고;
X2는 H, M, K, N, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
X11은 E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 V, A, G, L 또는 P이고;
X2는 M, K, N, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
X11은 E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 Y, F 또는 Q이고;
X11은 E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
X11은 E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 Y, F 또는 Q이고;
X11은 E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 R, E, Q 또는 D이고;
X15는 R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 R, E, Q 또는 D이고;
X15는 R, E, V, W, H 또는 D이거나;
또는
X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
X11은 D, E 또는 N이고;
X12는 W, F, H 또는 Y이고;
X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
X14는 R, E, Q 또는 D이고;
X15는 R, E, V, W, H 또는 D이다.
상기 기재된 것 중에서 식 (I)의 특히 바람직한 펩티드는 X1이 V인 것이다.
실험 섹션에서 입증되는 바와 같이, 식 (I)의 펩티드 내의 제1 아미노산이 발린인 경우, 상기 펩티드는 놀랍게도, 특히 국소 및 안과용으로 유리한 화학적-물리적 특성 및 IL-17A에 대한 개선된 친화성을 나타낸다.
바람직하게는, 상기 식 (I)의 펩티드에서 모든 아미노산 X1 내지 X15가 존재한다.
본 발명에 따른 식 (I)의 바람직한 개별 펩티드가 하기 표 1에 열거된다.
표 1
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
본 발명에 따른 IL-17A의 다른 펩티드 억제제는 표 1A의 것들이다.
표 1A:
Figure pct00008
추가 아미노산 서열이 본 발명의 제1 목적에 따른 펩티드의 N- 또는 C-말단에 부가될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 기재된 식 (I) 또는 (II)의 펩티드는, 그의 N- 및/또는 C-말단에서, 식 (III)의 아미노산 서열을 갖는 추가 아미노산 서열인 서열 A에 결합된다:
(III) Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-Y13-Y14-Y15-Y16
여기서:
Y1은 A, T, V, K, R, I, L, X 또는 G이고;
Y2는 R, W, P, E, Q 또는 A이고;
Y3은 K, W, G, T, I, R 또는 P이고;
Y4는 K, T, E, W, A, R, D, G, X 또는 F이고;
Y5는 A, E, T, G, W, I, R, P 또는 V이고;
Y6은 A, W, E, R, G, P이거나 또는 부재하고;
Y7은 K, S, W, T, F, R, V, G이거나 또는 부재하고;
Y8은 A, Q, W, R, G이거나 또는 부재하고;
Y9는 N, G이거나 또는 부재하고;
Y10은 R이거나 또는 부재하고;
Y11은 R이거나 또는 부재하고;
Y12는 M이거나 또는 부재하고;
Y13은 K이거나 또는 부재하고;
Y14는 W이거나 또는 부재하고;
Y15는 K이거나 또는 부재하고;
Y16은 K이거나 또는 부재한다.
바람직하게는, 식 (III)의 서열에서, 아미노산이 부재하는 경우, 상기 아미노산의 N 말단에서의 아미노산이 또한 부재한다. 예를 들어, 아미노산 Y6이 부재하는 경우, 아미노산 Y7 내지 Y16이 또한 부재한다.
본 발명에 따른 식 (III)의 바람직한 서열이 하기 표 2에 열거된다.
표 2
Figure pct00009
따라서, 본 발명의 제2 목적은 본 발명의 제1 목적에 따른 식 (I) 또는 (II)의 펩티드의 서열, 및 상기 서열의 C- 및/또는 N-말단에서의, 상기 기재된 바와 같은 서열 A를 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.
아미노산 서열인 서열 A는 식 (I) 또는 (II)의 펩티드의 N- 및 C-말단 둘 다에 결합될 수 있다. 그러한 경우, 상기 펩티드의 N- 및 C-말단에 결합된 2개의 아미노산 서열인 서열 A는 동일하거나 상이할 수 있다.
대안적으로, 아미노산 서열인 서열 A는 상기 펩티드의 N-말단 또는 C-말단 중 하나에 결합될 수 있다.
이러한 본 발명의 목적에 따른 바람직한 개별 펩티드가 하기 표 3에 열거된다.
표 3
Figure pct00010
상기에 대한 대안적인 실시양태에서, 본 발명의 제1 목적에 따른 상기 식 (I) 또는 (II)의 펩티드는 그들의 N- 및/또는 C-말단에서 아미노산 서열 (A)m에 결합될 수 있으며, 여기서 A는 R, K, G, E, Q 또는 A, 바람직하게는 R, K, G, E 또는 A로부터 선택된 아미노산이고, m은 1 내지 10의 정수이다.
아미노산 서열 (A)m은 식 (I) 또는 (II)의 펩티드의 N- 및 C-말단 둘 다에 결합될 수 있다. 그러한 경우, 상기 펩티드의 N- 및 C-말단에 부착된 2개의 아미노산 서열 (A)m은 동일하거나 상이할 수 있다.
대안적으로, 아미노산 서열 (A)m은 상기 펩티드의 N- 또는 C-말단 중 하나에 부착될 수 있다.
따라서, 본 발명의 제3 목적은 본 발명의 제1 목적에 따른 펩티드의 서열, 및 상기 서열의 C- 및/또는 N-말단에서의, 상기 정의된 바와 같은 서열 (A)m을 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.
이러한 본 발명의 실시양태에 따른 바람직한 개별 펩티드가 하기 표 4에 열거된다.
표 4
Figure pct00011
특별한 실시양태에서, 상기 식 (I) 또는 (II)의 펩티드는 서열 A의 서열과 서열 (A)m 둘 다에 결합된다. 이러한 경우, 상기 펩티드는 그의 N- 및/또는 C-말단에서 상기 정의된 바와 같은 아미노산 서열 (A)m에 결합되며, 이는 그의 N- 및/또는 C-말단에서 상기 기재된 바와 같은 아미노산 서열인 서열 A에 결합된다.
따라서, 본 발명의 제4 목적은 본 발명의 제1 목적에 따른 펩티드의 서열, 상기 서열의 C- 및/또는 N-말단에서의, 상기 기재된 바와 같은 서열 (A)m, 및 상기 서열 (A)m의 C- 및/또는 N-말단에서의, 상기 기재된 바와 같은 서열 A를 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩티드이다.
본 발명의 상기 목적 중 임의의 것에 따른 펩티드의 바람직한 실시양태에 따르면, 상기 펩티드는 C- 및/또는 N-말단에서, 분해를 방지할 수 있는 보호 캡 기에 결합된다.
관련 기술분야에서 통상적인 임의의 보호 캡 기가 사용될 수 있다.
바람직하게는, C-말단에 결합된 보호 캡 기는 아미드, 바람직하게는 N-알킬 아미드, 알데히드, 에스테르, 바람직하게는 메틸 및 에틸 에스테르, p-니트로아닐리드, 7-아미노-4-메틸쿠마린으로부터 선택된다.
바람직하게는, N-말단에 결합된 보호기 캡은 아세틸, 포르밀, 피로글루타밀, 지방산, 우레아, 카르바메이트 술폰아미드, 알킬아민으로부터 선택된다.
바람직하게는, 상기 펩티드는 N-말단에서만 보호 캡 기에 결합된다. 보다 바람직하게는 상기 펩티드는 N-말단에서만 보호 캡 기에 결합되고, 보호 캡 기는 아세틸이다.
결합 친화도 및 억제제 활성을 증가시키기 위해, 본 발명의 상이한 목적 중 임의의 것에 따른 상기 기재된 펩티드, 바람직하게는 본 발명의 제1 목적에 따른 식 (I) 또는 (II)의 펩티드의 이량체를 제조하는 것이 특히 유리하다.
상기에 따르면, 바람직하게는 상기 기재된 본 발명의 상이한 목적에 따른 펩티드, 바람직하게는 본 발명의 제1 목적에 따른 식 (I) 또는 (II)의 펩티드, 보다 바람직하게는 본 발명의 제1 목적에 따른 식 (I)의 펩티드는 이량체의 형태로 존재한다.
따라서, 본 발명의 제5 목적은 본 발명의 상기 목적 중 임의의 것에 따른 2개의 펩티드에 의해 형성된 이량체이다. 바람직하게는 상기 펩티드는 본 발명의 제1 목적에 따른 식 (I) 또는 (II)의 펩티드이고, 보다 바람직하게는 이들은 본 발명의 제1 목적에 따른 식 (I)의 펩티드이다.
바람직하게는, 상기 이량체는 동종이량체이고, 여기서 이량체를 형성하는 2개의 펩티드는 동일한 서열을 갖는다. 바람직하게는, 상기 이량체에서, 펩티드는 스페이서 분자, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 스페이서를 통해 연결된다.
바람직하게는, 이러한 실시양태에 따르면, 폴리에틸렌 글리콜은 본 발명에 따른 펩티드의 N-말단에 연결되거나 또는 식 (I)의 두 펩티드의 아미노산 X4, X7 또는 X14에 연결된다.
추가 실시양태에 따르면, 보호기 캡의 부재 하에, 본 발명의 상이한 목적에 따른 펩티드는 바람직하게는 그의 C- 및/또는 N-말단에서 생체분자에 결합되어 생체접합체를 형성한다. 바람직하게는, 상기 생체분자는 카프르산, 카프론산, 아스코르브산, NAG-NAM, NAG, NAM, 히알루론산, 알긴산, 키틴, (GalNAc)2, Gal-알파1,3-GalNAc 및 트리갈락투론산으로부터 선택된다.
생체분자는 펩티드에 특이적 기능을 부가하거나 또는 펩티드의 물리적 화학적 특성을 조정하기 위해 펩티드에 결합된다. 예를 들어, 아스코르브산은 펩티드에 항산화 활성을 제공하고, 카프론산은 펩티드가 세포막에 고정되는 것을 선호한다.
따라서, 본 발명의 제6 목적은 본 발명의 상이한 목적에 따른 펩티드, 바람직하게는 본 발명의 제1 목적에 따른 식 (I) 또는 (II)의 펩티드, 보다 바람직하게는 본 발명의 제1 목적에 따른 식 (I)의 펩티드, 및 상기 기재된 바와 같은 적어도 생체분자를 포함하는, 바람직하게는 이들로 이루어진 생체접합체이다.
바람직하게는, 상기 생체접합체에서, 상기 생체분자는 상기 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 결합된다.
이러한 실시양태에 따른 바람직한 생체접합체가 하기 표 5에 열거된다.
표 5
Figure pct00012
한 실시양태에 따르면, 상기 생체접합체에서 상기 생체분자 또는 보호 캡 기는 펩티드의 N 및/또는 C-말단과 직접적으로 결합된다.
한 실시양태에 따르면, 상기 생체분자는 펩티드의 N- 및 C-말단 둘 다에 결합된다. 그러한 경우, 상기 펩티드의 N 및 C 말단에 결합된 두 생체분자는 동일하거나 상이할 수 있다.
대안적인 실시양태에 따르면, 상기 생체분자는 펩티드의 N- 또는 C-말단에 결합된다.
대안적인 실시양태에 따르면, 상기 생체분자 또는 보호 캡 기는 링커를 통해 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 연결된다. 바람직하게는, 상기 링커는 4-아미노부티르산, 베타-알라닌, 2-아미노에톡시-아세트산, 5-아미노발레르산, 6-아미노카프로산, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, 12-아미노-4,7,10-트리옥사도데칸산, 15-아미노-4,7,10,13-테트라옥사펜타-데칸산 및 트리옥사트리데칸-숙시남산으로부터 선택된다. 바람직하게는, 링커가 하나의 아미노산 리신 상에 부착되는 경우, 상기 링커는 NHS-에스테르, 이소시아네이트, 벤조일 플루오라이드 또는 카르바메이트로부터 선택된다.
상기 기재된 상이한 실시양태에 따라, 본 발명은 상기 기재된 식 (I) 또는 (II)의 IL-17A 결합 펩티드를 포함하거나 또는 이로 이루어지고, 하기 화학식 (IV)을 갖는 화합물에 관한 것이다:
(IV) [생체분자 또는 캡]a - [링커]b - (서열 A)n-Am-[펩티드] - A'm'- (서열 A)n' -[링커]b' - [생체분자 또는 캡]a'
여기서, 서로 독립적으로:
a = 0 또는 1;
b = 0 또는 1;
a' = 0 또는 1;
b' = 0 또는 1;
m = 0 내지 10;
m' = 0 내지 10;
n= 0 또는 5;
n'= 0 또는 5;
펩티드는 식 (I) 또는 식 (II)에 따른 폴리펩티드이고;
A 또는 A'는 m회 또는 m'회 반복된 R, K, G, E 또는 A로부터 선택된 하나의 아미노산이고;
서열 A는 상기 기재된 식 (III)의 서열을 포함하고;
생체분자는, 서로 독립적으로, 카프론산, 아스코르브산, NAG-NAM, NAG, NAM, 히알루론산, 알긴산, 키틴, (GalNAc)2, Gal-알파1,3-GalNAc 또는 트리갈락투론산이고;
캡은 서로 독립적으로, 아미드, 알데히드, 에스테르, p-니트로아닐리드, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 아세틸, 포르밀, 피로글루타밀 또는 지방산이고;
링커는, 서로 독립적으로, 4-아미노부티르산, 베타-알라닌, 2-아미노에톡시-아세트산, 5-아미노발레르산, 6-아미노카프로산, 8-아미노-3,6-디옥사옥탄산, 12-아미노-4,7,10-트리옥사도데칸산, 15-아미노-4,7,10,13-테트라옥사펜타-데칸산 또는 트리옥사트리데칸-숙시남산이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 상기 서열 A는 식 (I) 또는 (II)의 펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 부착된다.
본 발명에 따른 가능한 화합물의 일부 예가 하기에 보고되지만, 화학식 (IV)에 포함된 다른 모든 가능한 조합이 존재할 수 있다:
- [생체분자 또는 캡] - [링커] - (서열 A) -A-[펩티드]-;
- [생체분자 또는 캡] - (서열 A) -A-[펩티드]-;
- [생체분자 또는 캡] - -A-[펩티드]-;
- [생체분자 또는 캡] -[펩티드]-;
- -[펩티드] - Am'- (서열 A)n'- [생체분자 또는 캡]a';
- -[펩티드] - Am'- [생체분자 또는 캡]a';
- -[펩티드]- [생체분자 또는 캡]a'.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 화학식 (IV) 내의 생체분자는 아스코르브산, 카프론산, NAG 또는 NAM으로부터 선택된다.
추가의 바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명에 따른 캡은 아미드, 바람직하게는 N-알킬 아미드, 알데히드, 에스테르, 바람직하게는 메틸 및 에틸 에스테르, p-니트로아닐리드, 7-아미노-4-메틸쿠마린으로부터 선택된 C-말단 변형이거나, 또는 아세틸, 포르밀, 피로글루타밀, 지방산, 바람직하게는 카프론산, 우레아, 카르바메이트, 술폰아미드 또는 알킬아민으로부터 선택된 N-말단 변형이고, 바람직하게는 상기 캡은 아미드, 카프론산으로서의 지방산 및 아세틸로부터 선택된다.
본 발명에 따르면, 화학식 (IV) 내의 상기 링커, 생체분자 또는 캡은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 화학식 (IV)의 링커는 4-아미노부티르산, 베타-알라닌, 2-아미노에톡시-아세트산, 5-아미노발레르산 또는 트리옥사트리데칸-숙시남산으로부터 선택된다.
바람직하게는, 링커가 하나의 아미노산 리신 상에 부착되는 경우, 상기 링커는 NHS-에스테르, 이소시아네이트, 벤조일 플루오라이드 또는 카르바메이트로부터 선택된다.
본 발명의 제7 목적은 상기 기재된 바와 같은 본 발명의 목적에 따른 상기 펩티드, 이량체 또는 생체접합체, 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물이다.
본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 안과 투여에 적합한 형태로 제형화될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 제약 조성물의 투여가 국소 경로에 의해 수행되는 경우, 제약 형태는 크림, 연고, 젤, 고약, 용액, 세척액, 현탁액, 비말, 완충액 (완충 용액), 현탁액, 점안제, 비말, 스프레이, 와이프 또는 분말로부터 선택되고, 바람직하게는 크림, 젤, 스프레이 또는 연고로부터 선택된다.
안과 투여 중, 제약 형태는 바람직하게는, 점안제, 안과용 젤, 연고, 세척액, 와이프, 스프레이 또는 크림으로부터 선택된다.
특별한 실시양태에 따르면, 본 발명의 펩티드 또는 생체접합체는 마이크로입자 또는 나노입자를 사용하여 국부적으로 투여된다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 제약 조성물은 성인 및 "소아과 집단"으로서 정의되는 인간 및 동물에게 투여될 수 있으며, 여기서 용어 "소아과 집단"은 출생부터 18세까지의 집단의 일부를 나타낸다.
본 발명의 제8 목적은 염증성 및 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한, 본 발명에 따른 상기 기재된 펩티드, 이량체 또는 생체접합체이다.
본 발명의 제9 목적은 염증성 및 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방을 필요로 하는 환자에게, 본 발명에 따른 상기 기재된 펩티드, 이량체 또는 생체접합체의 치료상 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 염증성 및 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방 방법이다.
바람직하게는, 상기 염증성 및 자가면역 질환은 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병, 전신 홍반성 루푸스, 천식, 베체트병, 고 IgE 증후군, 강직성 척추염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 건성 각막결막염, 춘계 각막결막염, 기질 포진성 각막염, 각막 동종이식편 거부, 각막 감염, 바람직하게는 헤르페스 바이러스 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 각막염, 및 안구 건조 질환으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 상기 질환은 자가면역성 안과 또는 피부과 질환, 보다 더 바람직하게는 안구 건조 질환 또는 건선이다.
상기 명시된 질환 및 의학적 병태 모두는 그 기원 및/또는 증상이 IL-17A 및/또는 Th-17과 관련이 있다는 공통점이 있다.
후자, 즉 광범위한 스펙트럼의 안구 표면 장애를 포함하는 매우 만연한 병태인 안구 건조 질환 (DED)에 대해 보다 구체적으로, 안구 점막 염증은 염증-유발 각막 궤양 및 흉터로 인해 비제어된다면 잠재적으로 시력 상실을 초래하는 독특한 특징이다. DED의 진행에서, 병원성 면역 세포, 주로 Th17 세포는 지속적으로 안구 점막 표면으로 이동하고 IL17을 포함한 염증유발성 매개인자를 분비하여 안구 표면 염증과 상피병증을 유발한다.
본 발명의 펩티드, 이량체 또는 생체접합체는 편리하고 바람직하게는, 점안제 또는 안과용 젤 및 연고로서 국소로 투여된다.
추가 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩티드, 이량체 또는 생체접합체는 유일한 활성 성분으로서 투여되거나, 또는 추가 활성 성분과 조합하여 및/또는 DED를 포함하나 이에 제한되지는 않는 안과 병태의 증상성 치료를 위한 의료 장치, 예를 들어 안구 윤활제 또는 "인공 눈물", 국소 재상피제, 치료용 콘택트 렌즈 및 누점 마개와 조합하여 투여된다.
바람직하게는, 상기 추가 활성 성분은 아주반트, 면역 억제제, 면역 조정제 또는 항염증제이다.
예를 들어, 본 발명의 IL-17A 결합 펩티드는 DMSO와 조합하여 사용될 수 있다.
바람직한 실시양태에 따르면, 본 발명의 IL-17A 결합 펩티드는 면역 억제성 모노클로날 항체, 예컨대 MHC, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40, CD45, CD58, CD80, CD86 또는 그의 리간드로부터 선택된 백혈구 수용체에 대한 친화성을 갖는 모노클로날 항체; 다른 면역 조정 화합물, 바람직하게는 CTLA4의 세포외 도메인의 적어도 일부분 또는 그의 돌연변이체, CTLA4의 적어도 세포외 일부분 또는 비 -CTLA4 단백질 서열에 연결된 그의 돌연변이체를 갖는 재조합 결합 분자, 예를 들어, ATCC 68629로 지명된 CTLA4lg 또는 그의 돌연변이체, 예를 들어, LEA29Y; 접착 분자 억제제, LFA-1 길항제, ICAM-1 또는 -3 길항제, VCAM-4 길항제 또는 VLA-4 길항제와 조합하여 사용될 수 있다.
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 IL-17A 결합 펩티드는 DMARD (질환 완화 항류마티스 약물), 바람직하게는 금염, 술파살라진, 항말라리아제, 메토트렉세이트, D-페니실라민, 아자티오프린, 미코페놀산, 시클로스포린 A, 타크롤리무스,시롤리무스, 미노사이클린, 레플루노미드, 글루코코르티코이드; 칼시뉴린 억제제, 바람직하게는 시클로스포린 A 또는 FK 506; 림프구 재순환 조정제, 바람직하게는 FTY720 및 FTY720 유사체; mTOR 억제제, 바람직하게는 라파마이신, 40-O-(2-히드록시에틸)-라파마이신, CCI779, ABT578, AP23573 또는 TAFA-93; 면역 억제 특성을 갖는 아스코마이신, 바람직하게는 ABT-281, ASM981; 코르티코스테로이드; 시클로포스파미드; 아자티오프렌; 메토트렉세이트; 레플루노미드; 미조리빈; 미코페놀산; 미코페놀레이트 모페틸; 15-데옥시스페르구알린 또는 그의 면역 억제 동족체, 유사체 또는 유도체; 또는 화학요법제, 바람직하게는 파클리탁셀, 젬시타빈, 시스플라티넘, 독소루비신 또는 5-플루오로우라실; 항-TNF 작용제, 바람직하게는 TNF에 대한 모노클로날 항체, 바람직하게는 인플릭시맙, 아달리무맙, CDP870, 또는 TNF-RI 또는 TNF-RII에 대한 수용체 구축물, 바람직하게는 에타네르셉트, PEG-TNF-RI; 염증유발성 시토카인의 차단제, IL-1 차단제, 바람직하게는 아나킨라(Anakinra) 또는 IL-1 트랩, AAL160, ACZ 885, IL-6 차단제; 프로테아제, 바람직하게는 메탈로프로테아제의 억제제 또는 활성화제, 항-IL-15 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-23 항체, 항-IL-22 항체, 항-IL-21 항체, 항-IL-12 항체, 항-IFN-감마 항체, 항-IFN-알파 항체, 항-CD20 항체, 항염증제, 바람직하게는 아스피린 또는 항감염성 인자와 조합하여 사용된다.
자연적으로, 이러한 공동 투여를 위한 작용제의 목록은 제한적이지 않거나 완전하지 않다.
본 발명의 추가 목적은 상기 기재된 염증성 및 자가면역 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 표 6에 열거된 펩티드 중 하나이다.
표 6.
Figure pct00013
Figure pct00014
본 발명에 따른 펩티드의 투여량 및 투여 방식은 본 발명의 특별한 펩티드 억제제, 개별 환자 군 또는 환자, 추가의 의학적 활성 화합물의 존재 및 치료되는 병태의 성질 및 중증도에 따라 달라질 것이다.
바람직한 실시양태에 따르면, 예방적 및/또는 치료적 사용 투여량은 약 5-50 μg/ml, 바람직하게는 약 10-25 μg/ml이다.
바람직하게는, 예방적 및/또는 치료적 사용을 위한 투여 빈도는 1일 약 1회 내지 2회, 바람직하게는 1회 적용 범위에 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 예시로써 추가로 설명되며, 이들 중 어느 것도 첨부된 청구 범위에 요약된 바와 같은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되서는 안된다.
실시예
실시예 1 펩티드 합성 & 정제:
본 발명자들은 이용 가능한 결정학적 데이터 (PDB 5h13, PDB 5vb9 및 PDB 4hsa)를 사용하여 IL-17A의 상동성 모델을 개발하였다 (Liu et al. Nat Commun 2013, 4, 1888, Liu et al. Sci Rep 2016, 6: 30859, Liu et al. Sci Rep 2016, 6, 26071, Ting, Tung et al. Plos One 2018, 13(1): e01908502018). 본 발명자들의 모델에서는 또한, 슈뢰딩거 마에스트로(Schrodinger Maestro) 매크로 모델 제품군에서 구현된 바와 같은, 데스몬드(Desmond) 소프트웨어로 수행된 분자 역학 시뮬레이션을 통해 최적화된 모델 및 결정에서 해결되지 않은 루프를 재현하였다. 모든 분자 시뮬레이션은 시스템 안정성을 보장하기 위해 1 마이크로초 동안 실행되었다.
IL-17A α-포켓의 구조 및 특성을 기반으로 하여, i) IL-17A를 최적화된 단백질 결합 부위 점유와 밀접한 관련을 맺게 하는 안정적인 2차 및 3차 입체 형태를 수득하고, ii) 안과 및 피부 병리학에서 국소 사용에 적합한 물리적-화학적 특성을 수득하도록 상이한 펩티드 서열이 설계되었다 (Liu et al. Nat Commun 2013, 4, 1888, Espada et al. J Med Chem 2016, 59(5), 2255-2260).
부가적으로, 본 발명자들은 수소 결합을 도입하고 소수성 상호작용을 최적화함으로써 리간드-IL-17A 상호작용을 최적화하였다.
a. Fmoc 기반 고체상 펩티드 합성
모든 화학물질을 구입하여 추가 정제없이 사용하였다.
표 1의 서열식별번호: 1 내지 43 및 111 내지 257의 펩티드는 하기 기재된 바와 같이 아세틸 기로 캡핑된 N-말단 아민을 사용하여, 고체 지지체로서 링크 아미드-MBHA 수지 상에서 수동 또는 자동 고체상 펩티드 합성에 의해 제조되었다.
Nα 보호에 사용된 Fmoc (9-플루오레닐메톡시카르보닐) 기는 디메틸포름아미드 (DMF) 중 20% 피페리딘으로 8분 처리한 후, 동일한 시약으로 10분 동안 추가 처리하여 절단하였다. Fmoc 절단 후, 펩티드-수지 복합체를 DMF로 세척하였다 (x 6). 이어서, 그 다음 잔류물을, 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄3-옥시드 헥사플루오로포스페이트 (HATU) / N,N-디이소프로필아민 (DIPEA) 커플링 프로토콜 [Fmoc-아미노산 (3 당량), HATU (3 당량) 및 DIPEA (6 당량)]의 사용을 통해 혼입시켰다. 부드럽게 교반하고 (1시간) DMF로 세척한 후 (x 6), 펩티드-수지의 일부를 카이저(Kaiser) 시험에 의해 분석하였다. 어셈블리가 완료되면, 펩티드-수지를 DMF (x 3), 디클로로메탄 (DCM) (x 4)으로 세척한 다음, 진공 하에 건조시켰다.
절단 및 탈보호
펩티드를 수지로부터 절단하고, 필요한 경우 68.5/10/10/5/3.5/1, v/v 비율의 트리플루오로아세트산/1,2-에탄디티올/티오아니솔/페놀/H2O/트리이소프로필실란의 혼합물을 절단 용액으로서 사용함으로써 탈보호시켰다. 수지 100 mg당 3 ml의 절단 용액을 사용하였다. 30℃에서 4시간 동안 교반하면서 완전한 탈보호가 달성되었다. 절단 반응 후, 상기 혼합물 중의 펩티드를 차가운 디에틸 에테르에 침전시키고 50℃에서 진공 하에 건조시켰다.
b. 펩티드 41에서의 디술피드 결합 형성
표 1의 서열식별번호: 41의 펩티드에서의 디술피드 결합 형성은 혼합물 DMSO/H2O (20/80, v/v)에서 펩티드를 인큐베이션함으로써 수득되었고, 이를 RP-HPLC, MS 및 유리 술프히드릴 검출 (DTNB 방법)에 의해 모니터링하였다.
c. 분취 RP-HPLC에 의한 정제 및 분석 HPLC에 의한 순도 평가
조질의 펩티드 샘플을, C18 칼럼 (10 μm, 100 Å, 50 x 250 mm)을 사용하여 분취 RP-HPLC [애질런트(Agilent)]에 의해 정제하였다. 용매 A (수 중 0.1% TFA, 2% CH3CN) 및 용매 B (90% CH3CN/H2O)로 이루어진 용매 시스템을 25 mL/min의 유속 하에 용출에 사용하였고, 흡광도를 220 nm에서 검출하였다. 동결 건조에 의해 용매를 제거하였다. MALDI-TOF-MS에 의해 최종 산물의 특징을 규명하였고, 물질의 순도를 분석 RP-HPLC (C18-250 mm x 4.6 mm I.D., 1 mL/min의 유속)에 의해 평가하였으며, 흡광도를 220 nm에서 검출하였다.
실시예 2: NAM 및/또는 NAG 생체 접합된 펩티드 BIO-1, BIO-2 및 BIO-3의 제조
생체 접합된 펩티드 BIO-1, BIO-2 및 BIO-3은 하기 절차에 따라 펩티드 42 또는 43의 접합 반응에 의해 제조되었다.
1. 공여자 및 수용자의 제조
모든 반응은 N2 대기 하에 수행되었다. NMR 스펙트럼은 브루커(Brucker) 400 MHz 기기에서 실행되었다. HPLC-UV 분석은 G1311B 애질런트 1260 4차 펌프, G1329B 애질런트 1260 자동 샘플 주입기, G1315C 애질런트 1260 다이오드 어레이 검출기 및 G1316A 애질런트 1260 칼럼 온도 조절기 모듈이 장착된 애질런트 1260 인피니티 시스템 상에서 수득되었다. 페노메넥스(Phenomenex) GEMINI C18 150 x 4.6 mm2 (5 μm) 칼럼이 사용되었다. 이동 상 A는 0.05% TFA를 포함하는 밀리큐(MilliQ) 수이고, B는 1.0 mL/min의 유속에서 0.05% TFA를 포함하는 HPLC 등급 아세토니트릴이었다. HPLC 시스템은 양이온 모드에서 작동하는 애질런트 4중극 6120 LC/MS 질량 분광계와 커플링되었다. 이온은 전기 분무 이온화 이온 소스를 사용하여 생성되었다. 획득 데이터는 애질런트 켐스테이션(Chemstation) 소프트웨어로 처리되었다.
a. 1-(2,2,2-트리클로로아세트이민)2-데옥시-3-O-아세틸-4,6-O벤질리덴-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (공여자)의 합성
트리클로로에톡시카르보닐 클로라이드 (2.1 mL, 15.3 mmol)를 수 (30 mL) 중 D-글루코사민 염산염 (3 g, 13.9 mmol) 및 NaHCO3, (3.5 g, 41.7 mmol)의 격렬하게 교반된 용액에 실온 하에 적가하였다. 이 혼합물을 2시간 동안 교반시킨 다음, 1 M HCl로 중화시키고, 농축시키고, 진공 하에 건조시켰다. 2-데옥시-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (중간체 A)를 수득하였다.
수득된 조질의 산물을 추가 정제없이 다음 반응 단계에 직접 사용하였다.
세부적으로, 염화 아연 (1.9 g, 13.9 mmol)을 벤즈알데히드 (24 ml) 중 중간체 A (4.9 g, 13.9 mmol)의 용액 및 분자 체 4 Å (4 Å MS, 600 mg)에 부가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 포화 수성 NaHCO3 (30 mL) 및 디에틸 에테르 (90 mL)를 부가하고 반응 혼합물을 15분 동안 교반하였다. 형성된 침전물을 여과하고, 물, 디에틸 에테르로 세척하고 건조시켰다. 잔류물을 0℃로 냉각시킨 피리딘 (13 mL)에 용해시키고, 아세트산 무수물 (6.4 mL, 68 mmol)로 처리하고, 밤새 실온에서 교반한 다음, 용액을 톨루엔으로 농축시키고, 0℃로 냉각시키고, DCM 및 포화 수성 NaHCO3으로 추출한 다음 (3x), 포화 NaCl 용액으로 세척하였다. 합한 유기 층을 건조시키고, 농축시키고, 조질의 물질을 이소렐라(Isolera) (EtPet/EtOAc)에 의해 정제하여 1,3-디-O-아세틸 2-데옥시-4,6-O-벤질리덴-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (중간체 B)를 백색 고체 (3.05 g, 41.7% 수율)로서 제공하였다.
이어서, 모르폴린 (1.2 mL, 13.9 mmol)을 건조 에틸 아세테이트 (EtOAc) (12.2 mL) 중 중간체 B (3.05 g, 5.8 mmol)의 용액에 부가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 3 N HCl 용액 (3.5 mL)으로 켄칭한 다음 20분 동안 교반 하였다. EtOAc로 추출하고 물, 포화 수성 NaHCO3 및 포화 NaCl 용액으로 세척하고 건조 및 농축시켰다. 조질의 물질을 이소렐라 (EtPet/EtOAc)에 의해 정제하여 2-데옥시-3-O-아세틸-4,6-O-벤질리덴-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (중간체 C)를 백색 고체 (2.2 g, 78.4%)로서 제공하였다. 건조 DCM (44 ml) 중 중간체 C (2.2 g, 4.54 mmol)의 용액에 Cs2CO3 (680 mg, 2.1 mmol) 및 CCl3CN (4.4 mL, 43.8 mmol)을 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 셀라이트 상에서 여과하고 농축시켜 1-(2,2,2-트리클로로아세트이민)2-데옥시-3-O-아세틸-4,6-O벤질리덴-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (공여자)를 연황색 고체 (2.2 g, 77%)로서 제공하였다.
b. 1,6-디-O-벤질 2-데옥시-3-O-((R)-10-에톡시카르보닐에틸)-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (수용자)의 합성
알릴 클로로포르메이트 (6.6 mL, 62.2 mmol)를 실온에서 수 (61 mL) 중 D-글루코사민 염산염 (12.2 g, 56.6 mmol) 및 NaHCO3 (14.3 g, 169.7 mmol)의 격렬하게 교반된 용액에 적가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, 1 M HCl로 중화하고 농축시키고, 진공 하에 건조시켰다. 조질의 2-데옥시-2-(알릴옥시카르보닐아미노) -a-D-글루코피라노시드 (중간체 D)를 수득하였다. 산물을 추가 정제없이 다음 반응 단계에 사용하였다. 중간체 D (14.9 g, 56.6 mmol)를 벤질 알콜 (89 mL)에 용해시키고 아세틸 클로라이드 (15.4 mL, 215.2 mmol)를 0℃에서 적가하였다. 80℃에서 3시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 차가운 포화 수성 NaHCO3 (20 ml)로 켄칭하고 30분 더 교반하였다. 냉수 및 디에틸 에테르를 부가하고 반응 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 두 상을 분리하고, 수성 상을 농축시키고, 진공 하에 건조시켰다. 침전물이 형성될 때까지 30 ml의 물 및 200 ml의 에틸 에테르를 부가하고, 이를 여과하고 차가운 디에틸 에테르로 수 회 세척하였다 (미량의 벤질 알콜이 검출되지 않을 때까지 함). 벤질 2-데옥시-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (중간체 E)를 백색 고체 (11 g, 55%)로서 수득하였고, 이를 추가 정제없이 다음 반응 단계에 직접 사용하였다. 염화 아연 (4.2 g, 31.1 mmol)을 벤즈알데히드 (55 mL) 중 중간체 E (11 g, 31.1 mmol)의 용액 및 4 Å MS (4.9 g)에 부가하였다. 2시간 후, 염화 아연 (4.2 g, 31.1 mmol)을 더 부가하였다. 실온에서 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO3 (70 mL), 페트로리움 에테르 (420 mL)로 처리하고 10분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, 페트로리움 에테르로 세척하고 DCM에 용해시켰다. 유기 용액을 포화 수성 NaHCO3, 물 및 포화 NaCl 용액으로 추출하고, 건조시키며 농축시켰다. 조질의 물질을 이소렐라 (DCM/EtOAc)에 의해 정제하여 벤질 2-데옥시-4,6-O-벤질리덴-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (중간체 F)를 백색 고체 (2.75 g, 20%)로서 제공하였다.
0℃로 냉각시킨, 건조 DCM (40.6 mL) 중 중간체 F (2.75 g, 6.2 mmol)의 용액에 수소화 나트륨 (NaH, 348.8 mg, 8.7 mmol, 60% 오일 분산액)을 부가하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 순수한 (-)-에틸 (S)-2-트리플루오로메탄술포닐 프로피오네이트로 적가 처리하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 얼음을 부가함으로써 반응 혼합물을 켄칭하고, DCM으로 추출하였다. 유기 용액을 포화 수성 NaHCO3, 포화 NaCl 용액으로 세척하고 건조 및 농축시켰다. 잔류물을 이소렐라 (DCM/EtOAc)에 의해 정제하여 벤질 2-데옥시-3-O-((R)-10-에톡시카르보닐에틸)-4,6-O벤질리덴-2-(알릴옥시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (중간체 G)를 백색 고체 (2.35 g, 69.7%)로서 제공하였다.
테트라키스(트리페닐포스핀) 팔라듐 (1.5 g, 1.3 mmol) 및 아세트산 (AcOH, 0.385 mL, 6.725 mmol)을 건조 DCM (42.7 mL) 중 중간체 G (2.35 g, 4.34 mmol)의 용액에 부가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 15분 동안 교반한 다음, 2,2,2-트리클로로에틸 클로로포르메이트 (TrocCl, 1.224 mL, 8.895 mmol)를 적가하고, 그 결과로 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NaHCO3로 켄칭하고, DCM으로 추출하고, H2O 및 포화 NaCl 용액으로 세척하였다. 진공 하에 농축시킨 후, 잔류물을 디에틸 에테르 (100 ml)에 용해시키고 불용성 물질을 여과하였다. 유기 상을 건조시키고, 농축시키고, 이소렐라 (시클로헥산/AcOEt)에 의해 정제하여 벤질 2-데옥시-3-O-((R)-10-에톡시카르보닐에틸)-4,6-O-벤질리덴-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (중간체 H)를 백색 고체 (2.3 g, 83.7%)로서 제공하였다.
0℃에서 건조 CH3CN (38 mL) 중 중간체 H (2.4 g, 3.8 mmol)의 용액에 CH3CN (2.2 mL) 중 Me3N-BH3 (332 mg, 4.55 mmol)의 용액을 부가한 다음, CH3CN (8 mL) 중 BF3-OEt2 (2.89 mL, 23.4 mmol)의 용액을 적가하였다. 0℃에서 3시간 동안 교반한 후, 혼합물을 차가운 포화 수성 NaHCO3 (30 mL)로 켄칭하고, EtOAc (350 ml)로 희석하고, 포화 수성 NaHCO3 (100 ml), 5% 시트르산 (4x50ml), 포화 수성 NaHCO3 (50 mL) 및 포화 NaCl 용액 (40 mL)로 세척하였다. 유기 층을 건조시키고, 농축시키고, 조질의 물질을 이소렐라 (시클로헥산/AcOEt)에 의해 정제하여 1,6-디-O-벤질 2-데옥시-3-O-((R)-10-에톡시카르보닐에틸)-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (수용자)를 무색 포말 (1.2 g, 49.8%)로서 제공하였다.
2. NAG-NAM 접합된 펩티드 BIO-3의 합성
4 Å 분자 체 (200 mg)와 함께 건조 DCM (55 mL)에 현탁된, 공여자 (1.6 g, 2.6 mmol) 및 수용자 (1.1 g, 1.73 mmol)를 -15℃에서 트리메틸실릴 트리플루오로메탄술포네이트 (TMSOTf, 188 μL, 1.04 mmol)로 처리하였다. 20분 동안 교반한 후, 0.75 당량의 공여자 및 0.3 당량의 TMSOTf를 더 부가하였다. 20분 동안 교반한 후, 0.75 당량의 공여자 및 0.3 당량의 TMSOTf를 더 부가하였다. 그 다음 혼합물을 NaHCO3 (15 mL)의 차가운 포화 수용액으로 켄칭하고 DCM (60 mL)으로 추출하였다. 유기 층을 포화 수성 NaHCO3 및 포화 NaCl 용액으로 세척하고, 건조 및 농축시켰다. 잔류물을 이소렐라 역상 (H2O/ACN 중성 상)에 의해 정제하여 벤질 6-O-벤질-4-O-[2-데옥시-3-O-아세틸-4,6-O벤질리덴-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-b-D글루코피라노실]-2-데옥시-3-O-[(R)-1'-에톡시카르보닐에틸]-2-(2,2,2-트리클로로에톡시카르보닐아미노)-a-D-글루코피라노시드 (중간체 L)를 백색 포말 (1.2 g, 62.9%)로서 제공하였다.
혼합물 AcOH/Ac2O/THF 1:1:1 (12 mL) 중 중간체 L (1.2 g, 1.09 mmol) 및 아연-구리 커플 (3.12 g, 24.2 mmol)의 용액을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트 상으로 여과하고, EtOAc로 세척하고 농축시켰다. 조질의 물질을 농축시키고, 칼럼 크로마토그래피 (시클로헥산/AcOEt)에 의해 정제하여 벤질 6-O-벤질-4-O-[2-데옥시-3-O-아세틸-4,6-O벤질리덴-2-아세틸아미노-b-D-글루코피라노실]-2-데옥시-3-O-[(R)-10-에톡시카르보닐에틸]-2-아세틸아미노-a-D-글루코피라노시드 (중간체 M)를 백색 고체 (560 mg, 0.67 mmol, 61.6%)로서 제공하였다. HPLC-MS (ESI+) m/z: C44H54N2O14+Na: 857.3472. 실측치: 857.6124.
THF/1,4-디옥산/H2O 4:2:1 (2.8 mL) 중 중간체 M (91 mg, 0.109 mmol)의 용액에 LiOH.H2O (56 mg, 1.34 mmol)를 부가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 도웩스(Dowex) H+ (1 N HCl로 신선하게 활성화됨) 상으로 여과하였다. 잔류물을 미리 물, MeOH 및 물로 세척한 다이아 이온 HP-20 칼럼 크로마토그래피 (2 x 7 cm)에 의해 정제하였다. 칼럼을 먼저 H2O (50 mL)로 용출시킨 다음, MeOH (30 mL)로 용출하였다. 알콜 분획을 농축시켜 벤질 6-O-벤질-4-O-[2-데옥시-4,6-O-벤질리덴-2-아세틸아미노-b-D-글루코피라노실]-2-데옥시-3-O-[(R)-10-에톡시카르보닐에틸]-2-아세틸아미노-a-D-글루코피라노시드 (중간체 N)를 약간 백색인 고체 (57.4 mg, 69%)로서 제공하였다. Mp 102-105℃, 1HNMR (600 MHz, CD3OD) δH 7.51-7.27 (m, 15H, ArH), 5.59 (s, 1H,CHPh), 5.36 (d, J 3.1 Hz, H-1), 4.85 (m) H2O, H-10, ½ CH2Ph), 4.66-4.57 (m, 3H, J 12.1 Hz, CHCH3, CH2-Ph), 4.46 (d, 1H, J 12.2 Hz, ½ CH2Ph), 4.29 (dd, 1H, J 10.3 Hz, J 5.0 Hz, H-60b), 4.07 (t, 1H, J 9.6 Hz, H-30), 3.95 (t, 1H, J 9.1 Hz,H-4), 3.82-3.77 (m, 2H, H-6b, H-3), 3.72-3.62 (m, 3H, H-60a, H-5,H-6a), 3.55-3.40 (m, 3H, H-20 , H-40,H-2), 3.30-3.27 (m, 1H, H-50),1.98 (s, 3H, COCH3), 1.96 (s, 3H, COCH3), 1.37 (d, J 6.9 Hz, 3H,CHCH3). HPLC-MS (ESI+) m/z: C40H48N2O13+Na: 787.3054 실측치: 787.7830.
아미노산 커플링에 사용된 조건에서 서열식별번호: 42의 펩티드를 화합물 N과 커플링하고, 그 결과로 생성된 생체접합체를 트리플루오로아세트산 (DCM 중 1% 용액)으로 처리하여 고체 지지체로부터 절단하였다. 그 결과로 생성된 생체접합체 (0.026 mmol)를 아세트산 (8 mL)에 용해시키고, Pd(OH)2/C (58 mg)를 부가하였다. 그 결과로 생성된 혼합물을 수소 대기 하에 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 상으로 여과시키고 농축시켜 생체접합체 BIO-3을 정량적 수율로 제공하였다.
생체접합체를 수지로부터 절단하고, 마지막 잔류물을 68.5/10/10/5/3.5/1, v/v 비율의 트리플루오로아세트산/1,2-에탄디티올/티오아니솔/페놀/H2O/트리이소프로필실란의 혼합물을 절단 용액으로서 사용하여 탈보호시켰다. 수지 100 mg당 3 ml의 절단 용액을 사용하였다. 30℃에서 4시간 후에 완전한 탈보호가 달성되었다. 절단 반응 후, 차가운 디에틸 에테르를 부가하여 조질의 펩티드를 침전시키고 50℃에서 진공 하에 건조시켰다.
조질의 생체접합체를, C18 칼럼 (10 μm, 100 Å, 50 x 250 mm)을 사용하여 분취 RP-HPLC (애질런트)에 의해 정제하였다. 25 mL/min의 유속 하에 용매 A (H2O 중 0.1% TFA, 2% CH3CN) 및 용매 B (90% CH3CN/H2O)로 이루어진 용해 혼합물을 용출에 사용하였고, 흡광도를 220 nm에서 검출하였다. 용매를 동결 건조에 의해 제거하고, MALDI-TOF-MS에 의해 최종 산물의 특징을 규명하였다. 정제된 물질의 순도를 분석 RP-HPLC (C18-250 mm x 4.6 mm I.D., 1 mL/min의 유속)에 의해 평가하였고, 흡광도를 220 nm에서 검출하였다.
3. NAG 및 NAM 생체접합체 BIO-1 및 BIO-2의 합성
NAM-펩티드 및 펩티드-NAG의 합성은 펩티드 고정 수지로부터 시작하여 수행되었으며 (실시예 1), 여기서 펩티드는 각각 서열식별번호: 42의 펩티드 (BIO-1의 경우) 또는 서열식별번호: 43의 펩티드 (BIO-2의 경우)였고, 공여자 및 수용자는 문헌 [Swaminathan et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2006, 17;103 (3):684-9]에 기재된 절차에 따라 상기 기재된 분자였다.
실시예 3: 카프르산 생체접합체 BIO-4의 합성
카프르산으로 캡핑된 펩티드는 카프르산으로 캡핑된 N-말단 아민을 사용하여 실시예 1에 기재된 절차에 따라 합성되었다.
실시예 4: 아스코르브산 생체접합체 BIO-5의 합성
5,6-O-이소프로필리덴-L-아스코르브산 (iASA)을 정(Jung)의 방법에 의해 합성하였다 (Jung, M. E.; Shaw, T. J. J. Am. Chem. Soc. 1980, 102, 6304). 활성화를 위해, CDI (10 당량)를 펩티드 고정 수지에 2시간 동안 부가하였다. 수지로부터 절단된 후, 펩티드의 N-말단 아민의 활성화는 하기 조건을 사용하여 RP-HPLC에 의해 확증되었다: A에서 B (A: H2O 중 0.1% TFA, B: CH3CN 중 0.1% TFA; 1.0 mL/min의 유속으로 30분에 걸쳐 0%에서 60% B); 검출, UV 230 nm. 그 다음, iASA를 상기 활성화된 펩티드 고정 수지 내로 도입하였다. 50% TFA/DCM (v/v)으로 1시간 동안 처리하여 산물을 수지로부터 분리하였다. 수지를 여과하고, 여액을 고 진공 하에 농축시키고, 차가운 디에틸 에테르로 침전시켰다. 그 결과로 생성된 생체접합체 BIO-5의 구조는 용리액으로서 0.1% 포름산/메탄올을 사용하여 30분에 걸쳐 250 μL/min의 유속으로 LC/MS에 의해 확증되었고, 230 nm에서 모니터링하였다.
실시예 5: IL-17A에 반응하는 IL-17RA/IL17RC 이량체화 검정
표 7의 펩티드는 IL-17A의 수용체에 대한 IL-17A의 결합 및 IL-17RA와 IL17RC의 후속 상호작용을 억제할 수 있는 능력에 관하여 시험되었다.
인터류킨 수용체 RA 및 RC 이량체화 검정 [디스커버X(DiscoverX)]을 사용하여 표 7의 펩티드의 부재 또는 존재하에 IL-17A에 의한 활성화 시 수용체 쇄 IL-17RA와 IL17RC의 상호작용을 측정하였다.
패스헌터(PathHunter)® 시토카인 수용체 검정에서, 하나의 시토카인 수용체 쇄는 작은 펩티드 에피토프 프로링크 (PK)로 태그부착시키고, 다른 쇄는 효소 수용자 (EA)로 태그부착시킨다. 리간드 결합은 두 수용체의 이량체화를 유도하여, PK 및 EA 단편의 보완을 촉진시킨다. 이러한 상호작용은 화학발광 기질을 사용하여 검출되는 b-갈락토시다제의 활성 단위를 생성한다. 패스헌터 세포주는 표준 절차에 따라 냉동고 스톡으로부터 확장되었다. 세포를 백색 벽이 있는 384-웰 마이크로플레이트 내로 20 μL의 총 용적으로 시딩하고, 시험 전에 적절한 시간 동안 인큐베이션하였다. 효능제 활성 억제를 위해, 세포를 샘플과 함께 인큐베이션하여 반응을 유도하였다. 샘플 스톡의 중간 희석을 수행하여 검정 완충액에서 5X 샘플을 생성하였다. 5 μL의 5X 샘플을 세포에 부가하고, 37℃ 또는 실온에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 비히클 농도는 1%였다. 검정 완충액 중의 5 μL의 6X EC80 효능제 (IL-17A)를 세포에 부가하고, 검정에 따라 37℃에서 6 내지 16시간 동안 인큐베이션하였다. 1. 효능제 (IL-17A) 및 (표 7의 펩티드) 검정을 위한 패스헌터 검출 시약 칵테일 12.5 또는 15 μL (50% v/v)을 각각 단일 부가한 다음, 실온에서 1시간 인큐베이션함으로써 검정 시그널을 생성하였다. 일부 검정의 경우, 검정 성능을 개선시키기 위해 고 감도 검출 시약 (패스헌터 플래시 키트)을 사용하여 활성을 검출하였다. 이들 검정에서, 동일한 용적의 검출 시약 (25 또는 30 uL)을 웰에 부가한 다음, 실온에서 1시간 인큐베이션하였다. 마이크로플레이트는 화학발광 시그널 검출을 위해 퍼킨엘머 엔비젼(PerkinElmer Envision)™ 기기로 시그널 생성 후 판독되었다. CBIS 데이터 분석 제품군 [켐이노베이션(ChemInnovation; 미국 캘리포니아주)]을 사용하여 화합물 활성을 분석하였다. % 억제 = 100% x (1 - (시험 샘플의 평균 RLU - 비히클 대조군의 평균 RLU) / (EC80 대조군의 평균 RLU - 비히클 대조군의 평균 RLU)).
하기 표 7에 보고된 바와 같이, 시험된 모든 분자는 IL-17RA/IL17RC 이량체화를 억제하므로 IL-17A 경로 활성화를 억제하는데 활성이 있는 것으로 밝혀졌으며, 중간 나노몰 범위의 IC50 값을 나타낸다.
표 7
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
도 1에서, 예시적인 펩티드에 대한 용량-반응 프로파일이 보고된다.
실시예 6: 인간 분화된 TH17 세포에서의 표현형 검정 및 생육성 검정
안과 또는 피부 병리학에서의 염증에 책임이 있는 표적 세포에 대한 본 발명의 펩티드의 효과를 평가하기 위해, 본 발명자들은 인간 Th17 세포에 의한 시험관내 염증유발성 시토카인 및 메탈로프로테이나제 분비를 억제할 수 있는 서열식별번호: 18의 펩티드의 능력을 시험하였다.
인간 1차 CD4 T-세포는 Th17 분화 배지에서 10일 동안 세포를 배양함으로써 시험관내에서 Th17 세포로 분화되었다. 세부적으로, 정제된 인간 말초 혈액 CD4 T-세포는 제조업체의 지침에 따라 Th-17 분화 배지 [셀엑스비보(CellXVivo) 인간 Th17; 토크리스(Tocris)]에서 배양되었다. 간단하게: 96-웰 조직 배양 플레이트를 항-CD3 및 CD28 효능작용 항체로 코팅하였다. 트리판 블루 배제를 통해 세포를 계수하고 Th-17 분화 배지에서 1E5개 세포/ml의 농도로 현탁시켰다. 0.2 mL의 상기 현탁액을 96-웰 플레이트의 개별 웰에 플레이팅하였다. 세포를 37℃에서 5% CO2와 함께 10일 동안 인큐베이션하고, 필요에 따라 배지를 교체하였다. 10일 세포 분화 후, 실시예 1에서 합성된 펩티드, 예컨대 서열식별번호: 18의 펩티드를 CGM [세포 성장 배지, XVivo-15, 론자(Lonza)]에서 적절한 농도로 희석하였다. 세포 플레이트를 300 xg에서 5분 동안 원심 분리하고, Th17 분화 배지를 제거하였다.
분화 후, 다양한 농도의 시험 물품의 존재하에 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 및 이오노마이신을 함유하는 활성화 칵테일 둘 다로 세포를 자극하였다.
자극 후 24시간에, 배양 상청액을 IL-17, IL-6, IL-23, MMP3의 발현에 관하여 분석하고 형광 생육성 염료인 알라마르 블루(Alamar blue)를 사용하여 생육성에 관하여 조사하였다. CD4 세포는 활성화 칵테일에 의한 자극에 반응하여 높은 수준의 IL-17A를 분비하며, 이는 Th17 세포로의 성공적인 분화를 나타낸다. 부가적으로, 자극된 세포는 IL-6, IL23 및 MMP3을 분비하였다.
상청액을 제거하고 적절한 군에서 200 μL의 희석된 펩티드 또는 비히클 (TI 농도와 같이 희석된 CGM + DMSO)로 교체하였다. 세포를 자극 전에 1시간 동안 펩티드 시험 항목과 함께 인큐베이션하였다. 하기 자극 용액이 생성되었다: 10x 세포 활성화 칵테일: CGM에서 500 x 내지 10 x 작업 용액으로 희석됨. 22 μL의 적절한 자극제를 TI 부가 후 1시간에 웰에 부가하였다. 마지막으로, 25 μL의 알라마르 블루 시약 (10x)을 자극 후 20시간 (24시간 혈청 수집 전 4시간)에 각각의 웰에 부가하여 세포 생육성을 결정하였다. 자극 후 24시간에, 제조업체의 지침에 따라 알라마르 블루 형광을 측정하였다. 나머지 상청액은 후속 다중 단백질 분석을 위해 수집되었다. MAGPIX 기기 상의 루미넥스(Luminex) 멀티플렉스 플랫폼을 사용하여 24시간 자극된 배양 상청액에서 IL-6, IL-17, 및 IL-23 뿐만 아니라 MMP3의 발현 수준을 평가하였다.
도 2 및 3은 서열식별번호: 18의 펩티드의 효과를 제시한다. 알 수 있는 바와 같이, 이러한 펩티드는 IL-17A, IL-6 및 IL-23의 분비 뿐만 아니라 MMP3의 분비를 현저하게 감소시킬 수 있다. 도 4에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 18의 펩티드로 11일 동안 세포를 처리해도 세포 생육성이 손상되지 않았기 때문에, 시토카인 및 메탈로프로테이나제 분비의 억제는 세포 생육성 문제로 인한 것이 아니다.
실시예 7: 펩티드의 물리적-화학적 분석
선행 기술의 펩티드 HAP 및 본 발명에 따른 일부 펩티드 (표 8 참조)의 물리적-화학적 특성은 하기 기재된 바와 같이 시험되었다.
i. 방법
a. 등전점 IP log D 및 logP
하기 표 8의 펩티드의 주요 물리 화학적 특성 (등전점 (IP), log D (7.4) 및 logP)은 Ag/AgCl 이중 연접 참조 pH 전극, 시리우스(Sirius) D-PAS 분광계 및 탁도 감지 장치가 장착된 시리우스T3 장치 [시리우스 어낼리티컬 인스트루먼츠 리미티드(Sirius Analytical Instruments Ltd.; 영국 이스트 서섹스)]를 사용하여 결정되었다. pH 전극은 pH 범위 1.8 내지 12.2에서 적정법으로 보정되었다. 오버 헤드 교반기를 사용하였고, 온도 프로브 [펠티에(Peltier) 제어기]는 적정 과정 동안 온도를 모니터링하였다. 적정 실험은 0.15 M KCl 이온 강도 조정된 용액 (ISA 수)에서 질소 대기 하에 25 ± 1℃의 온도 하에 시행되었다. 모든 시험은 표준화된 0.5 M KOH 및 0.5 M HCl을 적정 시약으로서 사용하여 수행되었으며, 분할 계수 시험을 위해 ISA 수 중 포화 옥탄올 (ISA 수 중 5%)을 분할 용매로서 사용하였다. pKa는 pH 측정 적정에 의한 전위차법에 의해 결정되었다. 분말 (약 0.5 mg)을 1.5 ml의 ISA 수에 용해시키고 적정을 pH 범위 2.0 내지 12.0에서 삼중으로 수행하였다. 각각의 Log P는 분말 (약 1 mg)을 1 ml의 ISA 수에 용해시킨 다음, 3가지 상이한 백분율의 옥탄올 (일반적으로 50%, 60%, 70%)에서 pH 측정 적정함으로써 삼중으로 수행되었다.
b. 수 용해도 및 안정성
원액의 제조를 위한 일반적 절차
각각의 동결 건조된 펩티드를 앰버 바이알에서 칭량하였다. 10 mM 원액을 직접 수득하기 위해, pH 7.8 하의 계산된 용적의 인산염 완충 용액을 부가하였다. 회수된 현탁액을 37℃에서 궤도 진탕기 인큐베이터로 30분 동안 교반하였다. 후속 희석을 수행하여 덜 용해성인 화합물에 대해 더 희석된 원액을 수득하였다.
안정성과 용해도를 평가하기 위해, 모든 원액을 25℃에서 저장하였다. 표제는 표준 용액과 비교하여 UHPLC-MS 분석에 의해 3가지 시점: T0, 3일, 1주에서 평가되었다.
크로마토그래피 프로파일은 정량적 검정을 위해 평가된 반면, MS 스펙트럼은 안정성 연구에서의 지원으로서 검출되었다.
표준 용액 제조를 위한 일반적 절차
각각의 펩티드를 칭량하고, pH 7.8 하의 인산염 완충액으로 100 μM에서 직접 희석하였다. 용액을 와동하여 5분 동안 교반하고 37℃에서 20분 동안 가열하였다. 수득된 표준 용액을 온도 제어 하의 암실에서 25℃ 하에 저장하였다.
샘플 제조를 위한 일반적 절차
원액의 일부분을 앰버 바이알에 수집하고 pH 7.8 하의 인산염 완충액에 의해 100 μM로 희석하였다 (희석 계수, 1:100).
기기 방법
루나 오메가 폴라(Luna Omega Polar) C18 칼럼 (기공 크기 1.6 μm, 2.1 x 100 mm)을 사용하여 0.3 ml/min의 유속으로 작동하는 역상 UHPLC를 수행하였다. 용매 A는 수 중 0.5% 포름산이고 용매 B는 아세토니트릴 중 0.5% 포름산이었다. 먼저, 샘플을 칼럼 상에 부하하고 10% B에서 3분 동안 등비적으로 세척하였다. 그런 다음, 10-95% B의 구배를 22분에 걸쳐 실행하고, 95%에서 2분 동안 유지한 다음, 1분에 걸쳐 10%로 감소시키고 압력 안정화를 위해 5분 동안 유지하였다. UV 흡수는 DAD (220 - 400 nm)에 의해 모니터링되었다. ESI-MS 이온 트랩이 TIC의 모니터링을 위해 사용되었다.
ii. 결과
시험된 모든 펩티드는 1주일까지 25℃에서 안정성을 나타냈는데, 이는 크로마토그래피 프로파일과 질량 스펙트럼에서 유의미한 변화가 발견되지 않았기 때문이다.
시험된 펩티드의 물리 화학적 특성이 하기 표 8에 표시된다.
표 8
Figure pct00023
Figure pct00024
상기로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따른 대부분의 펩티드는 최적의 물리 화학적 특성을 가지고 있으며, 이는 용해도와 친유성 간의 좋은 균형을 나타낸다. 펩티드의 LogD 평균은 -2.64 ± 2.06이었고, 대부분의 펩티드의 경우에 관찰된 수 중 용해도는 매우 우수하였다 (> 10 mM). 관찰된 특성은 안과 및 피부과 적용에 사용하기 특히 적합하도록 만드는데, 이는 피부 및 눈 표면에 소수성 성분과 친수성 성분 둘 다가 존재하기 때문이다. 이들은 또한 펩티드에 의해 관찰된 우수한 투과성을 설명한다 (실시예 8 참조).
실시예 8: 투과성 시험
시험된 펩티드는 서열식별번호: 1, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 115 및 서열식별번호: 121의 펩티드였다. 10 mM 원액을 갖기 위해, 이들을 세포 배양 등급 수 [커밍(Coming; 미국 버지니아주 매너서스)]에 용해시켰다.
i. 방법
시험관내 모델
불멸화된 인간 각막 상피 세포주인 I-HCEC는 일차 인간 각막 상피 세포로부터 유래되었다 (> 99% 순도). 이들 세포는 건강과 질환에 대한 인간 각막 연구에 적합하다. 상기 세포는 프로토콜에 따라 이노프로트 (Innoprot; 스페인 비즈카이아)에 의해 제안된 배지 (IM-각막 상피 세포 배지 ref. P60131)를 사용하여 배양하였다.
면역형광
약물 시험을 진행하기 전에 장벽 무결성을 먼저 확인하고 정량화하기 위한 정성적 및 정량적 기술이 개발되었다. 먼저, 본 발명자들은 밀착 연접 특유의 단백질 (Z0-1)에 대한 면역형광을 수행하였다 (Sugrue SP et al., (1997) Exp Eye Res. Jan;64 (1): 11-20). 세포를 콜라겐 I 50 μg/ml [깁코(Gibco; 미국 뉴욕주)로부터의 원액 3 mg/ml]로 코팅된 커버 슬립에 1 * 104개 세포/cm2의 밀도로 시딩하고 14 DIV 동안 배양하고 합류 후 배지를 매일 새롭게 하였다. 세포를 -20℃에서 10분 동안 메탄올에 고정시키고, 인산염 완충 용액 (PBS)으로 세정하고, 4% 소 혈청 알부민 [BSA; 시그마 알드리치(Sigma-Aldrich)]을 함유하는 PBS에서 실온 (RT) 하에 10분 동안 인큐베이션한 후, 연속적으로 실온 하에 각각 60분 동안 1차 및 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 1차 항체는 4℃에서 밤새 염소 항-인간 Z0-1 [1:100, 써모 피셔(Thermo Fisher)]에 이어 항-염소 알렉사플루오르(Alexafluor) 488 (1:10000)이었다. 세포를 최종적으로 DAPI (0.5 mg/ml) (시그마 알드리치)로 실온에서 5분 동안 대조 염색하고, 벡타쉴드(Vectashield) 봉입제 [벡터 래보러토리즈 인크(Vector Laboratories Inc; 미국 캘리포니아주 벌링게임)]를 슬라이드에 고정시키고, 공초점 레이저 스캐닝 현미경 [레이카(Leica) TCS SP5; 독일 베출라]으로 관찰하였다.
MTS 검정
세포 생육성은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸륨 (MTS)에 근거한 비색법인 셀 타이터 원 솔루션 셀 프로리퍼레이션 어세이(Cell Titer One Solution Cell Proliferation Assay) [프로메가 코포레이션(Promega Corporation; 미국 위스콘신주 매디슨)]을 사용하여 24시간에 결정되었다. 생육성의 함수로서 형성된 포르마잔의 수량은 ELISA 플레이트 판독기인 인피니트(Infinite) F200 [테칸(Tecan; 스위스 만도르프)]을 사용하여 492 nm에서 측정되었다. 본 검정은 50 및 100 μM에서 수행되었다 (N=9). 그 결과는 492 nm에서의 흡광도로서 표현되었다.
TEER 검정
각막 상피 배양물의 장벽 무결성은 TEER (경상피/경내피 전기 저항)의 측정 및 세포 주위 투과제 (예를 들어, 만니톨, 6-카르복시플루오레세인)의 투과성을 사용하여 검증되었다 (Ronkko S et al., (2016) Drug Deliv Transl Res 6: 660-675). TEER는 내피 및 상피 단층의 세포 배양 모델에서 밀착 연접 역학의 무결성을 측정하기 위해 널리 허용되는 정량적 기술이다. TEER 값은 약물 또는 화학물질의 수송에 대해 평가되기 전에 세포 장벽의 무결성을 나타내는 지표이다. TEER 측정은 세포 손상없이 실시간으로 수행될 수 있으며, 일반적으로 삼투 저항을 측정하거나 또는 광범위한 스펙트럼의 주파수 전체에 걸친 임피던스을 측정하는 것을 기반으로 한다 (Snirivasan et al., 2015 J Lab Autom. 20(2): 107-126). 이러한 검정을 수행하기 위해, 제조업체의 지침에 따라 EMD 밀리포어(Millipore) (미국 매사추세츠주 벌링턴)의 전기 저항 시스템인 밀리셀(Millicell) ERS-2를 사용하였다. 본 검정은 50 및 100 μM에서 수행되었다 (N=9). 그 결과는 저항 (Q/cm2)으로서 표현되었다.
투과성 시험
본 연구의 목적은 층화 인간 각막 상피 세포 전체에 걸친 펩티드의 겉보기 투과성 계수 (Papp) 값을 평가하는 것이었다. 모든 펩티드는 50 μM에서 이중으로 시험되었다.
특히, 인간 각막 상피 세포 (hCEPIC)는 트랜스웰(Transwell) 세포 배양 삽입물 (커밍; 미국 뉴욕주) 상에 층화되었다. 투과 실험은 5분, 30분, 60분 시점에서 수용자 챔버로부터 샘플을 채취하고 동일한 시점에서 공여자 챔버로부터 샘플을 채취하여 수행되었다. 수집된 각각의 분취액을, 40℃에서 자동 온도 조절되는 C18 버텍스(Vertex) 플러스 칼럼 [크나우어(Knauer)]이 장착된 HPLC 기기 (크나우어)에 의해 분석하였다. 연구 화합물의 비율 (겉보기 투과성 계수, Papp)을 계산하고, 이를 저 투과성 마커 및 고 투과성 마커인 6-카르복시플루오레세인 및 로다민 B 각각의 Papp 값과 비교하였다.
겉보기 투과성 계수 (Papp)는 하기 방정식에 따라 계산되었다:
Papp=(l/A *C0)(dM/dt)
여기서 dM/dt는 세포 층을 가로 지르는 플럭스 (초당 나노몰)이고;
A (평방 센티미터)는 삽입 막의 노출된 표면적이며;
C0는 t=0에서 공여자 구획 내의 초기 약물 농도 (마이크로몰)이다 (Xiang et al., Drug Metab Dispos. 2009 May;37(5):992-8).
통계
모든 군 (연구된 화합물 및 로다민)을 저 투과성 대조군과 비교하였다. 다른 모든 실험은 평균 ± S.E.로서 표현하였고, 유의성은 대조군 세포와 비교한 스튜던트 t 검정에 의해 계산되었다. 차이는 스튜던트 t 검정에 의해 결정된 바와 같이 통계적으로 유의미한 것으로 간주되었다 (p < 0.05).
ii. 결과
MTS 및 TEER 검정
본 발명자들의 실험 조건에서 고려된 펩티드는 50 μM 및 100 μM 시험 농도에서 세포 생육성 또는 TEER에 상당한 영향을 미치지 않았다.
투과성 시험
각각의 펩티드에 대해 수득된 결과가 하기 표 9에 제시되어 있다.
표 9
Figure pct00025
HCE 세포 배양물이 펩티드를 스크리닝하는데 유용하였다는 것을 검증하기 위해, 친유성 세포 횡단 마커 로다민 B의 투과성을 결정하였다. 예상대로, 로다민 B는 HCE 세포 배양물의 높은 투과성을 나타냈다 (51.26 ± 5.44 10-6 cm/sec). 그런 다음, 6-카르복시플루오레세인의 투과성을 검정하였고, 이는 문헌 내용과 일치하였다 (0.61±0.33 10-6 cm/sec). 이러한 마커는 친유성이 매우 낮으며 세포 간 공간을 통해서만 생물학적 막을 투과한다.
시험된 펩티드는 고 투과성 표준인 로다민 B와 비교하여 불멸화된 인간 각막 상피에 대해 매우 우수한 투과성을 나타냈다. 분명히, HCE 투과성 모델은 간질또는 내피를 포함하지 않지만, 이들 층은 각막 약물 흡수에 결정적인 장벽이 아니다. 본 발명자들은 우수한 투과성을 나타내는 펩티드 (서열식별번호: 2) 및 로다민 B와 비교해서 더 높은 투과성을 나타내는 펩티드 (서열식별번호: 115, 서열식별번호: 113 및 서열식별번호: 111)를 밝혀내었다.
실시예 9: 펩티드-IL-17A 친화성 시험
선행 기술 HAP (서열식별번호: 1)의 펩티드 및 서열식별번호: 2의 펩티드를 하기에 기재된 바와 같이 mIL-17A에 대한 친화성에 관하여 시험하였다.
a. mIL-17A의 고정화
마우스 IL-17A 단백질의 고정화를 위해, 아민 커플링 화학을 사용하였다. 센서 칩 표면에서 덱스트란 매트릭스를 먼저, 1-에틸-3-카르보디이미드 (EDC)와 N-히드록시숙신이미드 (NHS)의 혼합물로 활성화시켜 반응성 숙신이미도 에스테르를 수득하였다. 10 ug/ml의 IL17을 pH = 5.0에서 10 mM 아세테이트 완충액으로 희석한 다음, 리간드를 표면 위로 통과시켜 에스테르가 하전되지 않은 아미노 기와 자발적으로 반응할 수 있도록 하고, 이러한 방식으로 리간드는 덱스트란에 공유 결합된다. mIL17의 공유 고정화는 3000 RU의 리간드를 상기 표면에 안정적으로 부착시켜 준다.
b. 펩티드/IL17 상호작용의 특징규명
서열식별번호: 1 (HAP) 및 서열식별번호: 2의 펩티드를, 고정화된 mIL-17A에 결합할 수 있는 능력에 관하여 분석하였다. 분자를 HBS-EP 완충액에서 상이한 농도 (62.5 내지 1000 nM) 하에 희석하고, 센서 칩에 4분 동안 주입하고 5분 동안 해리되도록 두었다. 각각의 실행 후, 센서 칩은 2 M NaCl 주입으로 재생시켰다. 센서 그램 (도 1, 패널 A)에 기반하고 BIA이밸류에이션 소프트웨어를 사용하여, 평형 상태에서 RU 값에 대한 스캐차드(Scatchard) 분석을 통해, 용액 중 분석물 농도의 함수로서 친화성 상수를 결정할 수 있었다 (도 6, 패널 B). 수득된 결과가 하기 표 10에 제시되어 있다.
표 10
Figure pct00026
표 8에 제시된 바와 같이, 서열식별번호: 2의 펩티드는 130 nM의 친화도 값으로 IL-17A에 결합하는 반면, 서열식별번호: 1의 펩티드는 매우 낮은 친화도 값 (3700 nM)으로 IL-17A에 결합한다.
실시예 8 및 9에서 수득된 결과를 고려할 때, 선행 기술의 HAP 펩티드 내의 위치 1에서의 이소류신을 서열식별번호: 2의 펩티드에서와 같이 발린으로 변형시키면, 리간드에 대한 물리 화학적 특성인 투과성 및 친화성에 관하여 현저한 차이가 발생한다.
본 발명자들은 두 펩티드의 특성을 하기에 요약한다:
표 11
Figure pct00027
표 11은 서열식별번호: 1의 펩티드와 서열식별번호: 2의 펩티드 간의 비교 데이터를 제시한다.
본 발명자들은 logP 및 logD의 관점에서 큰 차이를 발견하였으며 (각각 6-log 및 3-log 차이): 이는 서열식별번호: 1과 비교해서 서열식별번호: 2의 경우에 관찰된 더 높은 투과성을 설명해주었다 (28.8 vs 19.3). 마우스 IL-17A 상에서 수행된 표면 플라스몬 공명 (SPR) 검정에서 측정된 Kd (nM)는 서열식별번호: 2가 서열식별번호: 1보다 28배 더 친화적이었다는 것을 보여주었다.
더욱이, 분자 역학 시뮬레이션 연구도 수행되었는데, 이는 이소류신 (HAP) 대신 발린 (서열식별번호: 2)이 폴딩된 구조를 크게 안정화시킨다는 것을 나타내며; 서열식별번호: 2는 80% 더 안정한 것으로 예측되었다.
실시예 10: 염증성 시토카인 발현의 시험관내 평가
펩티드 HAP (서열식별번호: 1) 및 서열식별번호: 2의 펩티드를, 각막에서 염증성 시토카인의 발현에 대한 직접적인 영향을 평가하기 위해 시험관내 시험하였다.
이러한 시험은 불멸화된 인간 각막 상피 세포주 (I-HCEC) (이노프로트; 스페인 비즈카이아; Ref. P10871) 상에서 시행되었다. 이것은 일차 인간 각막 상피 세포로부터 유래되고 (>99% 순도), 건강과 질환에 대한 인간 각막 연구에 적합하다. 상기 세포는 프로토콜에 따라 이노프로트에 의해 제안된 배지 (IM-각막 상피 세포 배지 ref. P60131)를 사용하여 배양하였다. 세포 배지는 5% 소 태아 혈청 (FBS)으로 보충되었다.
세포를 320000개 세포/웰 6 플레이트 및 15000개 세포/웰 96 플레이트에 시딩하였다. 세포가 80%의 밀집도에 도달하면 24시간 동안 용량 곡선 (0.01-500 μM)으로 서열식별번호: 1 및 서열식별번호: 2 화합물로 처리하였다.
제조업체의 지침에 따라 퀵-스타트(Quick-Start) RNeasy 미니 키트 [퀴아젠(Qiagen), cat. N° 74104]를 사용하여 6 웰 플레이트로부터 전체 RNA를 단리하였다. 슈퍼스크립트 빌로(SuperScript Vilo) [ref. 11755050, 라이프 테크놀로지스(Life technologies)]를 사용하여 역전사를 수행하였고, CFX96 실시간 시스템에 적합한 TaqMan 프로토콜 [ref. 4444557, 어플라이드 바이오시스템(Applied Biosystem)]을 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 상기 실험은 3회 수행되었으며, 매회 이중으로 수행되었다. 사용된 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터의 프로브는: 인간 CXCL8 (Hs00174103_m1), 인간 IL6 (Hs00174131_m1), 인간 TNFα (Hs99999043_m1)이다. 하우스키핑 유전자로서 GAPDH (프로브 Hs02758991_g1)를 사용하였다.
I-HCEC에서의 IL-8, IL-6 및 TNF-α 발현은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 2의 펩티드의 상이한 농도 (0.01, 0.1, 1, 10, 100, 500 μM)로 24시간 동안 처리한 후 평가되었다. 미처리된 I-HCEC가 음성 대조군 (비히클)으로서 사용되었다.
그 결과는 화합물 서열식별번호: 2가, 상기 측정된 염증성 시토카인 중 어떠한 것의 발현도 변화시키지 않는 반면 (도 8A, 9A 및 10A), 500 μM의 화합물 서열식별번호: 1로 처리하면, 두 염증성 시토카인 IL-6 및 TNFα의 발현이 상당히 유도된다는 것을 제시한다 (도 9B 및 10B).
수득된 데이터는 서열식별번호: 1의 펩티드가 직접적인 염증유발성 활성을 가지며, HCEC에 의한 IL-6 및 TNF-α 염증성 시토카인의 발현을 각각 10배 및 8배 증가시켜 상당히 유도시킨다는 것을 명확하게 보여준다. 그와는 반대로, 서열식별번호: 2의 펩티드는 시토카인의 발현에 대해 어떠한 영향도 나타내지 않는다.
상기의 관점에서, 서열식별번호: 2의 펩티드는 서열식별번호: 1의 펩티드 HAP와 비교하여 놀랍게도 훨씬 더 우수한 내약성과 독성 결여를 보인다는 결론을 내릴 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> DOMPE <120> IL-17 BINDING PROTEINPOLYPEOTIDES AND MEDICAL USES THEREOF <130> 19LG52E <140> PCT/EP2019/070265 <141> 2019-07-26 <150> EP18186029.7 <151> 2018-07-27 <160> 257 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Val His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ile Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Glu Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 7 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Val Asn Lys 1 5 10 15 <210> 9 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Lys 1 5 10 15 <210> 10 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Arg 1 5 10 15 <210> 11 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Glu Lys 1 5 10 15 <210> 12 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Glu 1 5 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Val Glu Glu 1 5 10 15 <210> 16 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Arg Arg 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu 1 5 10 15 <210> 19 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 20 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Arg 1 5 10 15 Arg Arg <210> 21 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Ala 1 5 10 15 Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala 20 <210> 22 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Gly 1 5 10 15 Gly Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln 20 25 <210> 23 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Thr 1 5 10 15 Trp Trp Glu Thr Trp Trp 20 <210> 24 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Val 1 5 10 15 Pro Gly Trp Gly 20 <210> 25 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Gly 1 5 10 15 Gly Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp 20 25 <210> 26 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Val 1 5 10 15 Pro Gly Lys Gly 20 <210> 27 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Val 1 5 10 15 Pro Gly Ala Gly 20 <210> 28 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Arg 1 5 10 15 Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 20 25 30 <210> 29 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp 1 5 10 15 Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu 20 <210> 30 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 20 <210> 31 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp 1 5 10 15 Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu 20 <210> 32 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gly Gly Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln Val Met Val Thr Ile Pro 1 5 10 15 Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu 20 25 <210> 33 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Gly Gly Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp Val Met Val Thr Ile Pro 1 5 10 15 Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu 20 25 <210> 34 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Val Pro Gly Trp Gly Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Trp Ile Glu Glu 20 <210> 35 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Val Pro Gly Ala Gly Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Trp Ile Glu Glu 20 <210> 36 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Val Pro Gly Lys Gly Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Trp Ile Glu Glu 20 <210> 37 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Val 1 5 10 15 Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly 20 25 <210> 38 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Val Pro Gly Ala Gly Val Pro Gly Ala Gly Val Met Val Thr Ile Pro 1 5 10 15 Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu 20 25 <210> 39 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Val Pro Gly Asp Gly Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu 1 5 10 15 Trp Ile Glu Glu 20 <210> 40 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Val Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Val 1 5 10 15 Pro Gly Asp Gly 20 <210> 41 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Asp Leu Ser Ala Val Cys Trp Ala Phe Pro Trp Asp Pro Glu Cys His 1 5 10 15 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ile Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu 1 5 10 15 <210> 43 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Ile Met Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Tyr Glu Trp Ile Glu Glu Gln 1 5 10 15 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ala Arg Lys Lys Ala Ala Lys Ala 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Thr Trp Trp Thr Glu Trp Ser Gln 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Thr Trp Trp Glu Thr Trp Trp 1 5 <210> 47 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Val Pro Gly Trp Gly 1 5 <210> 48 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Lys Glu Thr Trp Trp Glu Thr Trp 1 5 <210> 49 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Val Pro Gly Lys Gly 1 5 <210> 50 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Val Pro Gly Ala Gly 1 5 <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 52 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Val Pro Gly Asp Gly 1 5 <210> 54 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 54 Val Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 55 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ile Pro Gly Gly 1 <210> 56 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Ala Val Gly Val Pro 1 5 <210> 57 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic generated peptide <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 57 Ile Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 58 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Ile Pro Gly Val Gly 1 5 <210> 59 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> VARIANT <222> 4 <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 59 Leu Pro Gly Xaa Gly 1 5 <210> 60 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Leu Pro Gly Val Gly 1 5 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Val Ala Pro Gly Val Gly 1 5 <210> 62 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetically generated peptide <220> <221> VARIANT <222> 1 <223> Xaa = Any Amino Acid <400> 62 Xaa Pro Gly Val Gly 1 5 <210> 63 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Gly Val Gly Val Pro Gly Val Gly 1 5 <210> 64 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Val Pro Gly Phe Gly Val Gly Ala Gly 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Val Pro Gly Gly Val Pro Gly Gly 1 5 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Lys Ala 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Lys 1 5 10 15 <210> 69 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Ala Ala 1 5 10 15 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ala Arg Ala 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Ala Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Ala Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 73 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Ala Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 74 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 75 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Ile Val Val Thr Ala Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 76 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Ile Val Val Ala Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 77 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Ile Ala Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 78 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Ala Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 79 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ile His Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 80 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Ile Gln Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 81 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Ile Arg Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 82 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Ile Thr Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 83 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Ile Trp Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 84 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Ile Tyr Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 85 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Ile Val Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 86 Ile Val Val Thr Leu Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Ile Val Val Thr Val Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Met Ala 1 5 10 15 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Ala 1 5 10 15 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Ile Val Val Thr Met Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Gln Ala 1 5 10 15 <210> 91 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Ile Val Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 92 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Ile Val Val Thr Leu Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Arg Ala 1 5 10 15 <210> 93 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn 1 5 10 <210> 95 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile 1 5 10 <210> 96 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Asp Ser Ser Ala Val Cys Trp Ala Phe Pro His His Pro Leu Cys His 1 5 10 15 Met Lys Ala Thr 20 <210> 97 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Ala Asp Ala Asp Met Cys Trp Phe Phe Pro Thr Ser Pro Trp Cys His 1 5 10 15 <210> 98 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Asp Leu Ser Ala Val Cys Trp Ala Phe Pro Trp Asp Pro Glu Cys His 1 5 10 15 Met <210> 99 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Asp Ser Ser Ala Val Cys Trp Ala Phe Pro Tyr Leu Pro Glu Cys His 1 5 10 15 <210> 100 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sapiens <400> 201 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Ala Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 202 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 202 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Gly Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 203 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 203 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Pro Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 204 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 204 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Val Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 205 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 205 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Ile Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 206 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 206 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu His Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 207 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 207 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Phe Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 208 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 208 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asn Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 209 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 209 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp His Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 210 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 210 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Phe Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 211 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 211 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Tyr Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 212 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 212 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Glu Asn Lys 1 5 10 15 <210> 213 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 213 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Lys Asn Lys 1 5 10 15 <210> 214 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 214 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ala Asn Lys 1 5 10 15 <210> 215 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 215 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Gly Asn Lys 1 5 10 15 <210> 216 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 216 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Leu Asn Lys 1 5 10 15 <210> 217 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 217 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Pro Asn Lys 1 5 10 15 <210> 218 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 218 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Phe Asn Lys 1 5 10 15 <210> 219 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 219 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Tyr Asn Lys 1 5 10 15 <210> 220 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 220 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Gln Lys 1 5 10 15 <210> 221 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 221 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asp Lys 1 5 10 15 <210> 222 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 222 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn His 1 5 10 15 <210> 223 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 223 Ile His Val Thr Ile Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Asp 1 5 10 15 <210> 224 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 224 Val His Val Thr Val Pro Gln Glu Leu Trp Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 225 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 225 Val His Val Thr Val Pro Gln Glu Leu Phe Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 226 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 226 Val His Val Thr Val Pro Gln Glu Leu Tyr Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 227 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Val His Val Thr Val Pro Gln Glu Leu Trp Glu Trp Val Glu Glu 1 5 10 15 <210> 228 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 228 Val His Val Thr Val Pro Gln Glu Leu Phe Glu Trp Val Glu Glu 1 5 10 15 <210> 229 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 229 Val His Val Thr Val Pro Gln Glu Leu Tyr Glu Trp Val Glu Glu 1 5 10 15 <210> 230 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 230 Val His Val Ser Ile Pro Gln Glu Leu Trp Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 231 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 231 Val His Val Ser Val Pro Gln Glu Leu Trp Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 232 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 232 Val His Val Ser Val Pro Gln Glu Leu Tyr Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 233 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 233 Val Arg Val Thr Ile Pro Gln Glu Leu Trp Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 234 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 234 Val Arg Val Thr Val Pro Gln Glu Leu Tyr Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 235 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 235 Val Arg Val Thr Val Pro Gln Glu Leu Trp Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 236 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 236 Val His Val Thr Val Pro Gln Glu Ile Tyr Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 237 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 237 Val His Val Thr Ile Pro Gln Glu Ile Trp Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 238 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 238 Val His Phe Thr Val Pro Gln Glu Leu Tyr Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 239 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 239 Val Lys Ile Ser Val Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 240 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 240 Leu Arg Ile Ser Val Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 241 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 241 Leu Arg Ile Tyr Val Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 242 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 242 Val Arg Gly Tyr Val Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 243 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 243 Val Arg Ala Tyr Val Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 244 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 244 Val Arg Leu Tyr Val Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 245 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 245 Val Arg Ile Tyr Leu Pro Ala Asp Leu Trp Asp Trp Ile Asn Lys 1 5 10 15 <210> 246 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 246 Ile His Val Thr Ile Pro Leu Glu Ile Phe Glu Trp Leu Gln His 1 5 10 15 <210> 247 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 247 Ile His Val Thr Ile Pro Leu Glu Ile Phe Glu Trp Ala Gln His 1 5 10 15 <210> 248 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 248 Ile His Val Thr Ile Pro Leu Glu Ile Phe Glu Trp Leu Gln Arg 1 5 10 15 <210> 249 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 249 Ile His Val Thr Ile Pro Leu Glu Val Phe Glu Trp Leu Gln His 1 5 10 15 <210> 250 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 250 Ile His Val Thr Ile Pro Gly Glu Ile Phe Glu Trp Leu Gln His 1 5 10 15 <210> 251 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 251 Val Arg Phe Ser Val Pro Gln Glu Ile Tyr Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 252 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 252 Leu Arg Ile Ser Val Pro Leu Glu Ile Phe Glu Trp Leu Gln His 1 5 10 15 <210> 253 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Leu Arg Gly Ser Val Pro Leu Glu Ile Phe Glu Trp Leu Gln His 1 5 10 15 <210> 254 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254 Val Lys Ile Ser Val Pro Leu Glu Ile Phe Glu Trp Leu Gln His 1 5 10 15 <210> 255 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255 Val Glu Phe Asn Phe Pro Gln Gln Val Tyr Glu Trp Phe Asp Asp 1 5 10 15 <210> 256 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 256 Val Glu Phe Asn Phe Pro Gln Gln Val Tyr Glu Trp Val Arg Arg 1 5 10 15 <210> 257 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 257 Thr Trp Tyr Val Phe Asn Glu Gln His Gln Glu Tyr Val Arg Lys 1 5 10 15

Claims (17)

  1. ILRA에 대한 IL-17A 결합을 억제할 수 있으며, 하기 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩티드:
    식 (I):
    (I) X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15
    여기서, 서로 독립적으로:
    X1은 I, V, D, K, W, A, G, L 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, N, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, H, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이거나 또는 부재하고;
    X11은 D, E 또는 N이거나 또는 부재하고;
    X12는 W, F, V, H 또는 Y이거나 또는 부재하고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이거나 또는 부재하고;
    X14는 N, R, E, F, Q 또는 D이거나 또는 부재하고;
    X15는 K, R, E, F, V, W, H 또는 D이거나 또는 부재하고;
    단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1) 또는 IHVTIPADLWDWIN, IHVTIPADLWDWI 또는 IHVTIPADLWDW가 아님;
    또는 식 (II):
    (II) an-DLSAVCWAFPWDPECH-bn'
    여기서, 서로 독립적으로:
    a, b는 A, R, N, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y 또는 V로부터 선택되고;
    n = 0 내지 3의 정수이고;
    n' = 0 내지 3의 정수임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식 (I)에서:
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이거나 또는 부재하고;
    X11은 D, E 또는 N이거나 또는 부재하고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이거나 또는 부재하고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이거나 또는 부재하고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이거나 또는 부재하고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나 또는 부재하고;
    단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1), IHVTIPADLWDWIN, IHVTIPADLWDWI 또는 IHVTIPADLWDW가 아닌 것인
    펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 15개의 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식 (I)에서:
    X1은 I, V 또는 L이고;
    X2는 H, M, R, K 또는 E이고;
    X3은 V, F 또는 I이고;
    X4는 T, Q, S, Y 또는 N이고;
    X5는 I, F 또는 V이고;
    X6은 P이고;
    X7은 A, Q, 또는 L이고;
    X8은 D, E, 또는 Q이고;
    X9는 L, W, F, V 또는 I이고;
    X10은 W, Y 또는 F이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W 또는 F이고;
    X13은 I, V, F 또는 L이고;
    X14는 N, R, Q 또는 E이고;
    X15는 K, R, H 또는 E이고;
    단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1)이 아니거나;
    또는
    X1은 I 또는 V이고;
    X2는 H, M 또는 R이고;
    X3은 V 또는 F이고;
    X4는 T 또는 Q이고;
    X5는 I, F 또는 V이고;
    X6은 P 또는 G이고;
    X7은 A 또는 Q이고;
    X8은 D 또는 E이고;
    X9는 L이고;
    X10은 W 또는 Y이고;
    X11은 D 또는 E이고;
    X12는 W이고;
    X13은 I 또는 V이고;
    X14는 N, R 또는 E이고;
    X15는 K, R 또는 E이고;
    단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1)이 아니거나;
    또는
    X1은 I 또는 V이고;
    X2는 H 또는 M이고;
    X3은 V이고;
    X4는 T이고;
    X5는 I이고;
    X6은 P이고;
    X7은 A이고;
    X8은 D이고;
    X9는 L, W, F, V 또는 I이고;
    X10은 W 또는 Y이고;
    X11은 D 또는 E이고;
    X12는 W이고;
    X13은 I 또는 V이고;
    X14는 N, R 또는 E이고;
    X15는 K, R 또는 E이고;
    단, 상기 서열은 IHVTIPADLWDWINK (서열식별번호: 1)가 아니거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L 또는 P이고;
    X2는 M, K, N, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
    X11은 E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, N, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
    X11은 E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 V, A, G, L 또는 P이고;
    X2는 M, K, N, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
    X11은 E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 Y, F 또는 Q이고;
    X11은 E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
    X11은 E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 Y, F 또는 Q이고;
    X11은 E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 N, R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 K, R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 H, M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 R, E, V, W, H 또는 D이거나;
    또는
    X1은 I, V, A, G, L, 또는 P이고;
    X2는 M, K, R, E, Q, W 또는 Y이고;
    X3은 V, F, A, G, L, P, I, Y 또는 W이고;
    X4는 T, Q, S, N 또는 Y이고;
    X5는 I, F, A, G, L, P, V 또는 Y이고;
    X6은 P, G, A, L, V, I 또는 N이고;
    X7은 A, Q, G, L, P, V, I, N 또는 E이고;
    X8은 D, E, N, Q 또는 Y이고;
    X9는 L, V, F, W, A, G, P, I 또는 H이고;
    X10은 W, Y, F 또는 Q이고;
    X11은 D, E 또는 N이고;
    X12는 W, F, H 또는 Y이고;
    X13은 I, V, F, E, K, A, G, L, P 또는 Y이고;
    X14는 R, E, Q 또는 D이고;
    X15는 R, E, V, W, H 또는 D인
    펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 식 (I)에서 X1이 V인 펩티드.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 3, 서열식별번호: 4, 서열식별번호: 5, 서열식별번호: 6, 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 10, 서열식별번호: 11, 서열식별번호: 12, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 14, 서열식별번호: 15, 서열식별번호: 16, 서열식별번호: 17, 서열식별번호: 18, 서열식별번호: 42, 서열식별번호: 111, 서열식별번호: 112, 서열식별번호: 113, 서열식별번호: 114, 서열식별번호: 115, 서열식별번호: 116, 서열식별번호: 117, 서열식별번호: 118, 서열식별번호: 119, 서열식별번호: 120, 서열식별번호: 121, 서열식별번호: 122, 서열식별번호: 123, 서열식별번호: 124, 서열식별번호: 125, 서열식별번호: 126, 서열식별번호: 127, 서열식별번호: 128, 서열식별번호: 129, 서열식별번호: 130, 서열식별번호: 131, 서열식별번호: 132, 서열식별번호: 133, 서열식별번호: 134, 서열식별번호: 135, 서열식별번호: 136, 서열식별번호: 137, 서열식별번호: 138, 서열식별번호: 139, 서열식별번호: 140, 서열식별번호: 141, 서열식별번호: 142, 서열식별번호: 143, 서열식별번호: 144, 서열식별번호: 145, 서열식별번호: 146, 서열식별번호: 147, 서열식별번호: 148, 서열식별번호: 149, 서열식별번호: 150, 서열식별번호: 151, 서열식별번호: 152, 서열식별번호: 153, 서열식별번호: 154, 서열식별번호: 155, 서열식별번호: 158, 서열식별번호: 159, 서열식별번호: 160, 서열식별번호: 161, 서열식별번호: 162, 서열식별번호: 163, 서열식별번호: 164, 서열식별번호: 165, 서열식별번호: 166, 서열식별번호: 167, 서열식별번호: 168,, 서열식별번호: 169, 서열식별번호: 170, 서열식별번호: 171, 서열식별번호: 172, 서열식별번호: 173, 서열식별번호: 174, 서열식별번호: 175, 서열식별번호: 176, 서열식별번호: 177, 서열식별번호: 178, 서열식별번호: 179, 서열식별번호: 180, 서열식별번호: 181, 서열식별번호: 182, 서열식별번호: 183, 서열식별번호: 184, 서열식별번호: 185, 서열식별번호: 186, 서열식별번호: 187, 서열식별번호: 188, 서열식별번호: 189, 서열식별번호: 190, 서열식별번호: 191, 서열식별번호: 192, 서열식별번호: 193, 서열식별번호: 194, 서열식별번호: 195, 서열식별번호: 196, 서열식별번호: 197, 서열식별번호: 198, 서열식별번호: 200, 서열식별번호: 201, 서열식별번호: 202, 서열식별번호: 203, 서열식별번호: 204, 서열식별번호: 205, 서열식별번호: 206, 서열식별번호: 207, 서열식별번호: 208, 서열식별번호: 209, 서열식별번호: 210, 서열식별번호: 211, 서열식별번호: 212, 서열식별번호: 213, 서열식별번호: 214, 서열식별번호: 215, 서열식별번호: 216, 서열식별번호: 217, 서열식별번호: 218, 서열식별번호: 219, 서열식별번호: 220, 서열식별번호: 221, 서열식별번호: 222, 서열식별번호: 223, 서열식별번호: 224, 서열식별번호: 225, 서열식별번호: 226, 서열식별번호: 227, 서열식별번호: 228, 서열식별번호: 229, 서열식별번호: 230, 서열식별번호: 231, 서열식별번호: 232, 서열식별번호: 233, 서열식별번호: 234, 서열식별번호: 235, 서열식별번호: 236, 서열식별번호: 237, 서열식별번호: 238, 서열식별번호: 239, 서열식별번호: 240, 서열식별번호: 241, 서열식별번호: 242, 서열식별번호: 243, 서열식별번호: 244, 서열식별번호: 245, 서열식별번호: 246, 서열식별번호: 247, 서열식별번호: 248, 서열식별번호: 249, 서열식별번호: 250, 서열식별번호: 251, 서열식별번호: 252, 서열식별번호: 253, 서열식별번호: 254, 서열식별번호: 255, 서열식별번호: 256, 서열식별번호: 257로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 화학식 (I)의 펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 펩티드의 서열, 및 상기 서열의 C- 및/또는 N-말단에서의, 식 (III)의 아미노산 서열을 갖는 서열인 서열 A로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩티드:
    (III) Y1-Y2-Y3-Y4-Y5-Y6-Y7-Y8-Y9-Y10-Y11-Y12-Y13-Y14-Y15-Y16
    여기서:
    Y1은 A, T, V, K, R, I, L, X 또는 G이고;
    Y2는 R, W, P, E, Q 또는 A이고;
    Y3은 K, W, G, T, I, R 또는 P이고;
    Y4는 K, T, E, W, A, R, D, G, X 또는 F이고;
    Y5는 A, E, T, G, W, I, R, P 또는 V이고;
    Y6은 A, W, E, R, G, P이거나 또는 부재하고;
    Y7은 K, S, W, T, F, R, V, G이거나 또는 부재하고;
    Y8은 A, Q, W, R, G이거나 또는 부재하고;
    Y9는 N, G이거나 또는 부재하고;
    Y10은 R이거나 또는 부재하고;
    Y11은 R이거나 또는 부재하고;
    Y12는 M이거나 또는 부재하고;
    Y13은 K이거나 또는 부재하고;
    Y14는 W이거나 또는 부재하고;
    Y15는 K이거나 또는 부재하고;
    Y16은 K이거나 또는 부재함.
  8. 제7항에 있어서, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22, 서열식별번호: 23, 서열식별번호: 24, 서열식별번호: 25, 서열식별번호: 26, 서열식별번호: 27, 서열식별번호: 28, 서열식별번호: 31, 서열식별번호: 32, 서열식별번호: 33 서열식별번호: 34, 서열식별번호: 35, 서열식별번호: 36, 서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38, 서열식별번호: 39, 서열식별번호: 40의 서열을 갖는 펩티드.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 펩티드의 서열, 및 상기 서열의 C- 및/또는 N-말단에서의, 서열 (A)m으로 이루어진 아미노산 서열을 갖는 펩티드로서, 여기서 A는 R, K, G, E, Q 또는 A, 바람직하게는 R, K, G, E 또는 A로부터 선택된 아미노산이고, m은 1 내지 10의 정수인 펩티드.
  10. 제9항에 있어서, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 29, 서열식별번호: 30, 서열식별번호: 43의 서열을 갖는 펩티드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, C- 및/또는 N-말단에서 보호 캡 기에 결합되며, 바람직하게는 C-말단에 결합된 보호 캡 기가 아미드, 알데히드, 에스테르, p-니트로아닐리드, 7-아미노-4-메틸쿠마린으로부터 선택되고, N-말단에 결합된 보호 캡 기가 아세틸, 포르밀, 피로글루타밀, 지방산, 우레아, 카르바메이트 술폰아미드, 알킬아민으로부터 선택되는 것인 펩티드.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 2개의 펩티드에 의해 형성된 이량체.
  13. 제12항에 있어서, 상기 펩티드가 폴리에틸렌 스페이서에 의해 연결되는 것인 이량체.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 펩티드 및 생체분자를 포함하며, 바람직하게는 상기 분자가 상기 펩티드의 N- 및/또는 C-말단에 결합되는 것인 생체접합체.
  15. 제14항에 있어서, 상기 생체분자가 바람직하게는, 카프르산, 카프론산, 아스코르브산, NAG-NAM, NAG, NAM, 히알루론산, 알긴산, 키틴, (GalNAc)2, Gal-알파1,3-GalNAc 및 트리갈락투론산으로부터 선택되는 것인 생체접합체.
  16. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 청구된 바와 같은 펩티드, 제12항 또는 제13항에 청구된 바와 같은 이량체, 제14항 또는 제15항에 청구된 바와 같은 생체접합체 및 적어도 하나의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 류마티스 관절염, 다발성 경화증, 크론병, 전신 홍반성 루푸스, 천식, 베체트병, 고 IgE 증후군, 강직성 척추염, 건선, 건선성 관절염, 류마티스 관절염, 건성 각막결막염, 춘계 각막결막염, 기질 포진성 각막염, 각막 동종이식편 거부, 각막 감염, 헤르페스 바이러스 또는 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 각막염 및 안구 건조 질환으로부터 선택된 질환, 바람직하게는 건선 또는 안구 건조 질환의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 펩티드, 이량체 또는 생체접합체.
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