KR20210037058A - 주요 임상 아스페르길루스 종의 분자 진단을 위한 ｂｅｎＡ와 Ｃｙｐ５１Ａ 유전자 바이오마커 및 정성 정량 분석을 위한 대조군 유전자 합성물 - Google Patents

주요 임상 아스페르길루스 종의 분자 진단을 위한 ｂｅｎＡ와 Ｃｙｐ５１Ａ 유전자 바이오마커 및 정성 정량 분석을 위한 대조군 유전자 합성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 주요 임상 아스페르길루스 종의 분자 진단을 위한 benA와 cyp51A 유전자 바이오마커 및 정성 정량 분석을 위한 대조군 유전자 합성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 아스페르길루스 종의 분자 진단을 위한 benA와 cyp51A 유전자 바이오마커를 이용하여 아스페루길루증을 유발하는 아스페르길루스 균종을 분자적으로 신속히 진단함과 더불어 아졸 내성 아스페르길루스 균종을 판별하여 적절한 항진균제의 선택을 통해 효과적인 아스페루길루증의 치료를 가능케 한다.

Description

주요 임상 아스페르길루스 종의 분자 진단을 위한 ｂｅｎＡ와 Ｃｙｐ５１Ａ 유전자 바이오마커 및 정성 정량 분석을 위한 대조군 유전자 합성물{Biomarkers of benA and cyp51A gene for the molecular diagnosis of clinical Aspergillus and genetic synthetic control template for the qualitative and quantitative analysis}
본 발명은 주요 임상 아스페르길루스 종의 분자 진단을 위한 benA와 cyp51A 유전자 바이오마커 및 정성 정량분석을 위한 대조군 유전자 합성물에 관한 것이다.
침습성 아스페루길루증(Invasive aspergillosis, IA)은 면역저하 환자에서 발생하는 아스페르길루스(Aspegillus) 종에 의한 치명적인 감염증으로 알려져 있는데, 최근 면역환자가 증가하는 추세에 있고 IA의 질병률(morbidity)과 사망률(mortality) 또한 매우 높아 이에 따른 사회 경제적인 비용이 급증하고 있다. IA를 일으키는 대표적인 진균종은 아스페르길루스 푸미가투스(A. fumigatus), 아스페르길루스 플라버스(A. flavus), 아스페르길루스 테레우스(A. terreus), 아스페르길루스 나이거(A. niger) 등이 속한 Section(closely related species가 모여 있는 집단으로 기존 형태학적(morphology) 검사나 ITS 분자진단 검사법으로 구분하기 힘든 경우가 많음)인데, 최근 아졸(Azole) 내성 등 항진균제 내성 증가가 큰 문제가 되고 있다.
기존 IA의 진단은 배양을 통한 진균의 형태학적 진단(배양 후 현미경 검사 등)과 PCR-시퀀싱을 통한 분자학적 진단이 있다. 두 검사 모두 임상 검체에서 배양을 통해 분생포자(conidia) 생성하는 과정이 필요한데, 조건에 따라 분생포자 생성까지 소요되는 시간이 3~10일까지 걸리고(형태학적 검사), 이후 DNA를 추출하여 시퀀싱을 통한 분석결과(분자학적 진단)를 얻는 데까지는 2~3일 추가 소요되는 문제점이 있다. 또한, 항진균제 내성을 판단하기 위해서는 추가 2-3일 더 소요된다.
사망률이 높은 IA를 치료하기 위해서는 신속한 진단이 요구되고 있어 기존 진단법 개선이 매우 시급하다. 그래서 많은 연구자들이 주요종인 아스페르길루스 푸미가투스(A. fumigatus) 분자진단(ITS 바이오마커 활용)이나 아졸 내성의 분자진단법을 real-time PCR을 활용해 개발하고 있다.
Herbrecht R et al., Ann N Y Acad Sci 2012;1272:23-30 Meis JF et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2016;371(1709), pii: 20150460 Cho SY et al., Medicine (Baltimore) 2017;96:e8841
본 발명의 목적은 아스페루길루스증의 분자진단을 위한 benA 및 cyp51A 유전자 탐지용 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는 침습성 아스페루길루스증의 진단용 조성물 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 아스페루길루스증의 분자진단을 위한 benA 및 cyp51A 유전자 탐지용 프라이머 세트 및 프로브를 이용한 침습성 아스페루길루스증의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열; SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트; SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis) 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열; SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트; SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열을,
SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트; SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 반응시켜 표준 정량 곡선을 작성하는 단계; 및
상기 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 생물학적 샘플을 접촉시키고 표준 정량 곡선과 비교하여 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis) 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열을,
SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트; SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 반응시켜 표준 정량 곡선을 작성하는 단계; 및
상기 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 생물학적 샘플을 접촉시키고 표준 정량 곡선과 비교하여 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis)의 진단 방법을 제공한다.
상기 아스페루길루증 진단용 조성물, 키트 및 방법은 아졸(azole) 내성 판별을 위해 SEQ ID NO: 8 및 9의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 SEQ ID NO: 10 및 11의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및 SEQ ID NO: 12의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 Cyp51A 유전자 변이 탐지용 프로브를 더 포함할 수 있다.
본 발명은 아스페르길루스 종의 분자 진단을 위한 benA와 cyp51A 유전자 바이오마커를 이용하여 아스페루길루증을 유발하는 아스페르길루스 균종을 분자적으로 신속히 진단함과 더불어 아졸 내성 아스페르길루스 균종을 판별하여 적절한 항진균제의 선택을 통해 효과적인 아스페루길루증의 치료를 가능케 한다.
도 1은 본 발명의 바이오마커를 활용한 멀티플렉스 식별(multiplex identification)의 개요를 나타낸 것이다.
도 2는 benA 유전자 대조군 및 게놈 DNA의 민감도 측정 및 정량 곡선을 나타낸다.
도 3은 아졸 감수성 아스페르길루스 푸미가투스(A. fumigatus) 균주와 내성 균주의 분석 결과이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열; SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트; SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis) 진단용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열; SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트; SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis) 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 IA의 주요 임상 균종에 대해 benA 유전자 바이오마커(프라이머/프로브 세트)를 활용하여 멀티플렉스 식별 방법으로 동시에 신속동정하고 정성/정량 방법으로 분자적 진단에 활용하는 것을 특징으로 한다(표 1 참조). 다음으로, 아졸 내성에 관여된 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 Cyp51A 프로모터의 TR 변이와 아졸 내성균주가 빈번히 발생하는 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis)(section Nigri)에 대해 Cyp51A 유전자를 활용한 바이오마커(표 1)를 통해 신속 정량/정성 분석에 사용하는 것을 특징으로 한다. 아울러, benA 정량/정성에 활용할 수 있는 대조군 유전자 합성물(control DNA template: benA 유전자 각 5종 프로브 염기서열을 가지고 있음)를 설계하여 정량 분석에 사용할 표준물질(표 2 참조: SEQ ID NO: 13)을 개발하였다. 도 1은 상술한 바이오마커를 활용한 본 발명의 분자진단법의 개요를 도시한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "바이오마커"는 질환 상태를 나타낼 수 있는 물질을 의미한다. 아스페루길루증의 진단에 관한 본 발명의 문맥에서, "바이오마커"는 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 또는 Cyp51A 유전자의 특정 부위를 의미한다. "바이오마커"는 그 종류에 따라 아스페루길루증을 앓고 있거나 또는 정상의 건강한 상태에 비하여 아스페루길루증에 걸리기 쉬운 개체에서 나타날 수도 있고, 나타나지 않을 수도 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "진단"은 병리학적 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적과 관련하여, "진단"은 생물학적 시료의 생체외 분석에 기초하여 임상 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 존재 및 발병 위험도를 결정하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명은 침습성 아스페루길루증(Invasive aspergillosis, IA)을 진단할 수 있다.
상기 임상 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)은 아스페르길루스 푸미가투스(A. fumigatus), 아스페르길루스 나이거(A. niger), 아스페르길루스 플라버스(A. flavus) 및 아스페르길루스 테레우스(A. terreus)를 포함할 수 있다.
상기 benA 및 Cyp51A 유전자의 바이오마커는 real-time PCR에 사용하는 프라이머 세트 및 프로브로서,
아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트는 SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진다. 상기 프라이머 세트에 의해 증폭될 수 있는 유전자 대조군 합성물은 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함할 수 있다.
아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브는 SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어질 수 있다.
아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브는 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어질 수 있다.
또한, 상기 아스페루길루증 진단용 조성물, 키트 및 방법은 아졸(azole) 내성 판별을 위해 SEQ ID NO: 8 및 9의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 SEQ ID NO: 10 및 11의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및 SEQ ID NO: 12의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 Cyp51A 유전자 변이 탐지용 프로브를 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로브"는 특정 뉴클레오티드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 구체적으로는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이며, 보다 구체적으로는 디옥시리보뉴클레오티드이다. 본 발명에 이용되는 프로브로서, benA 또는 Cyp51A 유전자 핵산 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 따라서, 본 발명에서 이용되는 서열은, 생물학적으로 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기 용어, '실질적인 동일성'은 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 더욱 구체적으로 70%의 상동성, 더더욱 구체적으로 80%의 상동성, 가장 구체적으로 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.
본 발명의 조성물 또는 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약으로서 DNA 중합효소, dNTPs 및 버퍼를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 예컨대, DNA 중합효소, dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 반응 완충액, 증류수 등으로 구성된 증폭 반응 혼합물을 포함할 수 있으며, 증폭 산물의 검출 여부를 확인할 수 있는 아가로스 및 전기영동 완충액을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물 또는 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있으며, 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열을, SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트; SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 반응시켜 표준 정량 곡선을 작성하는 단계; 및 상기 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 생물학적 샘플을 접촉시키고 표준 정량 곡선과 비교하여 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis) 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열을, SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트; SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 반응시켜 표준 정량 곡선을 작성하는 단계; 및 상기 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 생물학적 샘플을 접촉시키고 표준 정량 곡선과 비교하여 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis)의 진단 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료는 개체에서 유래한 핵 및/또는 미토콘드리아를 포함하여 유전자 분석이 가능한 모든 생물-유래 시료로서, 세포, 조직, 기관, 체액, 혈액 등의 시료일 수 있다. 또한, 상기 생물학적 시료로부터 추출된 핵산은, 검출하고자 하는 감염균의 유전자 마커가 존재하는 표적 유전자의 전체 또는 일부를 포함하는 핵산으로서, DNA 또는 RNA 일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 프라이머 세트 및 프로브는 real-time PCR 용일 수 있다.
본 발명의 아스페루길루증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 진단 방법은 단계별로 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자의 대조군 핵산 서열을 대상으로, 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트, 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브 및 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브를 사용하여 real-time PCR을 통해 표준 정량 곡선을 작성하는 것이다.
상기 대조군 핵산 서열은 SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함할 수 있다.
제2단계는 생물학적 시료를 대상으로, 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브 및 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브를 사용하여 real-time PCR 반응을 수행하고, 상기에서 작성된 표준 정량 곡선과 비교하여 민감도 측정 및 정량 분석을 통해 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 존재를 판별하는 것이다.
본 발명의 아스페루길루증 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 진단 방법은, 아졸 내성 균주를 판별하는 제3단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 아졸 내성 균주의 판별은 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트, 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 Cyp51A 유전자 변이 탐지용 프로브를 생물학적 샘플과 반응시켜 아졸 내성 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 균주의 존재를 측정하는 것이다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 아졸 내성 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)를 분자진단하기 위해 melting curve analysis를 통해 감수성 균주와 내성 균주의 차이를 분석한 결과, melting peak의 온도는 각각 83℃과 85.6℃에서 확연한 차이를 볼 수 있었다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 아스페르길루스(Aspergillus) 분석
본 실시예에서, 총 임상 아스페르길루스(Aspergillus) 분리주 102주와 환경 분리주 129주, 그리고 78종의 비-아스페르길루스(non-Aspergillus) 아스코마이세테스(Ascomycetes)에서 특이도를 측정하였다.
수집된 아스페르길루스(Aspergillus) 분리주들은 분자지표를 활용하여 subgenus, section, species(cryptic species포함)으로 구분한 결과, 임상 및 환경 분리주에서 Fumigati와 Nigri에 속하는 균종이 높은 빈도로 검출되었으며, 임상에서는 Fumigati(특히 A. fumigatus), 환경에서는 Nigri section에 속하는 균종이 각각 높게 분리되었다.
이들 분리주에서 항진균제 감수성을 살펴본 결과, 아졸계 항진균제에서는 Nigri 균종들이 항진균제 감수성이 저하되고 있었으며 amphotericin B 항진균제에서는 Flavi, Terrei section에 속하는 진균 종들이 항진균제 감수성 저하가 관찰되었다. 아스페르길루스 푸미가투스(A. fumigatus) 임상 환경분리주의 Cyp51A 유전적 변이, 아졸 내성 및 임상데이터의 상관관계를 살펴보면, 아졸내성 균주의 유전적 지표로는 다른 유전적 변이보다는 프로모터의 TR34 삽입과 L98H 유전적 변이가 국내 분리주에서 밀접한 관계가 있었다.
따라서, benA 유전자를 통한 진균 종 바이오마커를 상동성이 높은 엑손 부분에서 비교적 낮은 인트론 부분으로 변경하였고 종보다는 Nigri, Fumigati, Flavi 등을 표적으로 하는 바이오마커를 설계하였다.
또한, 종 동정을 위해 Cyp51A 유전자를 활용하여 임상에서 중요하고 아졸-내성과 관련성이 높은 아스페르길루스 푸미가투스(A. fumigatus), 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis) 바이오마커를 설계하였다. Real-time PCR을 위한 각 프로브와 프라이머는 멀티플렉스(multiplex) 반응이 가능하도록 설계하였다.
대조군 유전자 합성물(control DNA template)은 benA 유전자 각 5종 프로브 염기서열을 가지도록 설계하여 정성분석의 대조군뿐만 아니라 정량분석에서 표준 곡선을 활용한 정량적 분석이 가능하도록 설계하였다. 본 실험은 LC-480(roche) real-time PCR 기계에서 시험분석하였다. 각 민감도는 10-1 genome copy였고 대조군과 연관분석할 수 있었고, 임상균주를 통해 LOD와 LOQ를 측정하였다(표 3).
도 2는 benA 유전자 대조군 및 게놈 DNA의 민감도 측정 및 정량 곡선을 나타낸다.
멀티플렉스 식별을 위해 설계된 바이오마커의 핵산 서열(프라이머 및/또는 프로브 세트)
PCR 표적 균종 명칭 서열번호 Sequence (5'　→　3') 표적 유전자 비고
프라이머 Aspergillus spp.
benA 		정방향 benA F3 1 TCGGTGTAGTGACCCTTGG benA 본 발명
역방향 benA R2 2 GCTGGAGCGYATGAACGTCT
A. tubingensis
cyp51A 		정방향 Tubcyp_
1F46		 8 CTCGTTGCGATAGTCTTKAATGT Cyp51A
역방향 Tubcyp_
1R308		 9 GCCCAAGTATACGGTKGTCTTTT
A. fumigatus 정방향 TR F1 10 TAATCGCAGCACCACTTCAG Ref**
역방향 TR R1 11 AGGGTGTATGGTATGCTGGAA 본 발명
가수분해 프로브 Section of Ascomycetes Asco_1F9 3 AVACGAAGTTGTCGGGRC benA 본 발명
Section of Fumigati Fumi_1R2 4 CGGCAACATCTCACGATCTGACTCGC
Section of Nigri Nig_1R26 5 ACTTCAGCAGGCTAGCGGTAACAAGT
Section of Flavi Flavi_1F18 6 CGGTCAGGAGTTGCAAAGCGTTTTCA
Section of Terrei Terrei_1R29 7 ACCATCCTGGGACAGATTCTYCACGC
A. tubingensis Tubcyp_201 12 GTCAGYC*ACTGTCC*ATATGC*GATTG Cyp51A 본 발명
* LNA로 프로브 합성한 부위
** Morio F et al. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 2012;67:1870-3.
benA 대조군 주형의 서열(대조군 유전자 합성물)
Oligo DNA 서열 (5'→3')(서열번호: 13)
아스페르길루스 종의 양성 대조군 (276bp) ATCGTAAGCTTTCGGTGTAGTGACCCTTGGCCCAGCCGAAGACGAAGTTGTCGGGACGGACGGTCAGGAGTTGCAAAGCGTTTTCAGCACGGACAACTCAGGGACGGTGTGATCTAACCTCATGGTACGCGTGGAGAATCTGTCCCAGGATGGTAGAACGGCACGAGGTAGCGAGTCAGATCGTGAGATGTTGCCGAAATAGTATAAATCAAGAGACTTGTTACCGCTAGCCTGCTGAAGTAAATAGACGTTCATGCGCTCCAGCGAGCTCATCGT
IA 주요 아스페르길루스 종의 각 benA 바이오마커의 LOD와 LOQ
프로브 명칭 LOD LOQ
Fumi_1R2 40 fg 400 fg
Nigri 1R26 40 fg 400 fg
Flavi 1F18 40 fg 400 fg
Terrei 1R29 40 fg 400 fg
LOD = limit of detection, LOQ = limit of quantification; R2 = correlation coefficient.
<실시예 2> 아졸 내성 아스페르길루스(Aspergillus) 균주 분석
아졸(Azole) 내성 아스페르길루스 푸미가투스(A. fumigatus)를 분자 진단하기 위한 melting curve analysis를 통해 감수성 균주와 내성 균주의 차이를 분석하였고 melting peak의 온도는 각각 83℃와 85.6℃여서 확연한 차이를 분석할 수 있었다(도 3).
<110> CATHOLIC UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Biomarkers of benA and cyp51A gene for the molecular diagnosis of clinical Aspergillus and genetic synthetic control template for the qualitative and quantitative analysis <130> P19U11C1088 <160> 13 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> benA F3 forward primer of Aspergillus spp. benA <400> 1 tcggtgtagt gacccttgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> benA R2 reverse primer of Aspergillus spp. benA <400> 2 gctggagcgy atgaacgtct 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asco_1F9 probe of Section of Ascomycetes benA <400> 3 avacgaagtt gtcgggrc 18 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fumi_1R2 probe of Section of Fumigati benA <400> 4 cggcaacatc tcacgatctg actcgc 26 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nig_1R26 probe of Section of Nigri benA <400> 5 acttcagcag gctagcggta acaagt 26 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flavi_1F18 probe of Section of Flavi benA <400> 6 cggtcaggag ttgcaaagcg ttttca 26 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Terrei_1R29 probe of Section of Terrei benA <400> 7 accatcctgg gacagattct ycacgc 26 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tubcyp_1F46 forward primer of A. tubingensis Cyp51A <400> 8 ctcgttgcga tagtcttkaa tgt 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tubcyp_1R308 reverse primer of A. tubingensis Cyp51A <400> 9 gcccaagtat acggtkgtct ttt 23 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TR F1 forward primer of A. fumigatus Cyp51A <400> 10 taatcgcagc accacttcag 20 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TR R1 reverse primer of A. fumigatus Cyp51A <400> 11 agggtgtatg gtatgctgga a 21 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Tubcyp_201 probe of A. tubingensis Cyp51A <400> 12 gtcagycact gtccatatgc gattg 25 <210> 13 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Aspergillus benA positive control <400> 13 atcgtaagct ttcggtgtag tgacccttgg cccagccgaa gacgaagttg tcgggacgga 60 cggtcaggag ttgcaaagcg ttttcagcac ggacaactca gggacggtgt gatctaacct 120 catggtacgc gtggagaatc tgtcccagga tggtagaacg gcacgaggta gcgagtcaga 180 tcgtgagatg ttgccgaaat agtataaatc aagagacttg ttaccgctag cctgctgaag 240 taaatagacg ttcatgcgct ccagcgagct catcgt 276

Claims (9)

  1. SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열;
    SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트;
    SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및
    SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis) 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)은 아스페르길루스 푸미가투스(A. fumigatus), 아스페르길루스 나이거(A. niger), 아스페르길루스 플라버스(A. flavus) 및 아스페르길루스 테레우스(A. terreus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 아스페루길루증 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 조성물은
    SEQ ID NO: 8 및 9의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 SEQ ID NO: 10 및 11의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및
    SEQ ID NO: 12의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 Cyp51A 유전자 변이 탐지용 프로브를 더 포함하는, 아스페루길루증 진단용 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    조성물은 아졸(azole) 내성 판별용인, 아스페루길루증 진단용 조성물.
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서,
    프라이머 및 프로브는 real-time PCR용인, 아스페루길루증 진단용 조성물.
  6. SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열;
    SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트;
    SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및
    SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis) 진단용 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    SEQ ID NO: 8 및 9의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 SEQ ID NO: 10 및 11의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및
    SEQ ID NO: 12의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 Cyp51A 유전자 변이 탐지용 프로브를 더 포함하는, 아스페루길루증(aspergillosis) 진단용 키트.
  8. SEQ ID NO: 13의 염기서열을 포함하는 benA 유전자의 핵산 서열을,
    SEQ ID NO: 1 및 2의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트; SEQ ID NO: 3의 염기서열로 이루어진 아스코마이세테스(Ascomycetes) benA 유전자 탐지용 대조군 프로브; 및 SEQ ID NOS: 4 내지 7로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 반응시켜 표준 정량 곡선을 작성하는 단계; 및
    상기 benA 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 benA 유전자 탐지용 프로브와 생물학적 샘플을 접촉시키고 표준 정량 곡선과 비교하여 아스페르길루스 균종(Aspergillus spp.)의 존재를 측정하는 단계를 포함하는 아스페루길루증(aspergillosis) 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    SEQ ID NO: 8 및 9의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트 및 SEQ ID NO: 10 및 11의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)의 Cyp51A 유전자 증폭용 프라이머 세트; 및 SEQ ID NO: 12의 염기서열로 이루어진 아스페르길루스 튜빙겐시스(Aspergillus tubingensis) 균주의 Cyp51A 유전자 변이 탐지용 프로브를,
    생물학적 샘플과 접촉시켜 아졸 내성 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus) 균주의 존재를 측정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010004879A (ja) * 2008-05-28 2010-01-14 Kao Corp ネオサルトリア属に属する菌類及びアスペルギルスフミガタスの検出方法
JP2019013206A (ja) * 2017-07-11 2019-01-31 国立大学法人帯広畜産大学 アゾール耐性アスペルギルス・フミガーツスの検出方法および検出キット

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cho SY et al., Medicine (Baltimore) 2017;96:e8841
GENBANK ACCESSION NO. JF450905 *
GENBANK ACCESSION NO. MF070884 *
GENBANK ACCESSION NO. MF189897 (2018.05.26.)* *
Herbrecht R et al., Ann N Y Acad Sci 2012;1272:23-30
Meis JF et al., Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 2016;371(1709), pii: 20150460
N. Louise Glass et al., Applied and Environmental Microbiology, 61(4), pp.1323-1330, 1995.* *

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