KR20210031689A - 전기화학적 활성화 염 용액 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS), 그것의 제조, 및 감염 처리를 위한 그것의 용도에 관한 것이다.

Description

전기화학적 활성화 염 용액
본 출원은 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS), 그것의 생산, 및 감염 치료를 위한 그것의 용도에 관한 것이다.
전기화학적 활성화 염 용액은 통상적으로 소듐 클로라이드 용액의 전기분해에 의해 얻어진다. 전기화학적 활성화 염 용액은, 예를 들어, 농업, 치과, 의약 및 식품 산업에서 세척 또는 소독제로 알려져 있다. 전기화학적 활성화 염 용액은, 작업 판, 테이블, 바닥, 등의 표면 소독과 같은 용도로, 농업의 저온 살균 절차를 위해, 미생물 유기체 제거를 위해, 세척 및 세탁 용도를 위해, 수영장에서 및 무좀 예방 조치로서 사용할 수 있다.
WO 2004/031077은 염 수용액을 전기분해 처리하여 살생물 용액을 제조하기 위한 장치를 개시하고 있다. WO 2005/065388은 산화 환원 전위 수용액(oxidative reduction potential water solution) 및 상처 치료의 소독제로서의 이것의 용도를 개시한다.
JP 1997/0040444는 안과용 제형으로 사용하기 위한 2.0 내지 6.0의 pH를 갖는 산성 ECAS를 개시한다.
US 2010/0330204는 백내장, 안구 각막염, 각막 혈관신생, 상피 결핍, 및 만성 혼탁 중에서 선택된 외안 질환의 치료를 위한 1.0 내지 4.0의 pH를 갖는 산성 ECAS를 개시한다.
WO 2009/013019는 활성 성분 및 의료용 ECAS를 포함하는 2-상 약제학적 제형(two-phase pharmaceutical preparations)를 개시한다. ECAS는 또한, 약제학적 제형의 제조를 위한 운반체로서 제안된다.
대부분 공격적인 치료가 즉시 시작되지 않으면, 안구 감염은 심각한 시력-위협을 초래하는 심각한 안구 문제를 일으킬 수 있다. 수년 동안, 세팔로스포린 및 아미노글리코사이드는 감염성 안질환에 대한 제1 선택 치료제로 사용되어 왔다. 그러나, 국소 항생제와 관련된 문제들 및 항생제-내성 유기체의 출현은 치료 대안을 찾기 위한 관심을 불러 일으켰다(Romanowski et al., 2005, Willcox, 2011).
또한, 최근에는 알레르기 반응으로 인해 안약에서 벤즈알코늄클로라이드(benzalkoniumchloride: BAK)와 같은 방부제 사용에 대한 논쟁이 있었다. 반면에, 방부제가 없는 의약품은 통상적으로 일회용 단위로만 제공된다. 또한, 방부제가 없는 제형은 통상적으로 5 미만의 산성 pH 값을 갖는 반면, 안과의 권장 pH 값은 눈의 자극을 방지하고 환자의 순응도를 높이기 위해 중성에서 약 알칼리성이다.
위의 사항을 고려할 때, 알려진 약물의 단점을 극복하는 안염(eye infections)의 치료를 위한 새로운 제형이 시급히 필요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 장기간에 걸쳐 안정적이고, 적용시 임의의 유해한 부작용을 최소화함으로써 환자의 순응도를 향상시키는 효과적인 약물을 제공하는 것이다.
제1 측면에 있어서, 본 발명은 다음을 포함하는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)에 관한 것이다:
a. 1 mg/l 내지 500 mg/l, 바람직하게는 100 mg/l 내지 450 mg/l의 총 염소 함량;
b. 2 g/l 내지 8 g/l, 바람직하게는 3 g/l 내지 7 g/l의 클로라이드 함량;
c. +150 mV 내지 +1,350 mV, 바람직하게는 +600 mV 내지 +1,100 mV, 더 바람직하게는 +700 mV 내지 +1,050 mV, 더욱더 바람직하게는 +700 mV 내지 +1,000 mV의 산화환원 전위;
d. 20 mOsm/kg 내지 800 mOsm/kg, 바람직하게는 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 더 바람직하게는 250 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg의 오스몰농도(osmolality); 및
e. 6.0 내지 7.8, 바람직하게는 6.2 내지 7.6, 더 바람직하게는 7.1 내지 7.4의 pH 값.
본 발명의 ECAS는 적어도 하나의 붕산(염) 및/또는 적어도 하나의 인산(염)을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 ECAS는 바람직하게는 적어도 하나의 붕산 염 및/또는 적어도 하나의 인산 염, 더욱 바람직하게는 적어도 하나의 인산 염을 더 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 ECAS는 적어도 하나의 붕산 염을 더 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 ECAS는 적어도 하나의 붕산 염 및 적어도 하나의 인산 염을 더 포함한다.
붕산 염은 통상적으로 보레이트(BO3 3-)이다. 인산의 염은 포스페이트(PO4 3-), 하이드로젠포스페이트(HPO4 2-) 및/또는 디하이드로젠 포스페이트(H2PO4 -)를 포함할 수 있다. 상기 염들의 적합한 상대이온은 소듐(Na+) 및 포타슘(K+), 암모늄(NH4 +), 또는 Ca2+와 같은 알칼리 이온이다. 바람직한 구현예들에 있어서 본 발명의 ECAS는 소듐 디하이드로젠포스페이트 및 디소듐 하이드로젠포스페이트를 더 포함한다.
인산(염)(존재하는 경우)은 바람직하게는 총 0.01 g/l 내지 1000 g/l, 더 바람직하게는 총 0.1 g/l 내지 100 g/l로 존재한다. 붕산(염)(존재하는 경우)은 바람직하게는 총 0.01 g/l 내지 1000 g/l, 더 바람직하게는 총 0.1 g/l 내지 500 g/l로 존재한다.
전기화학적 활성화 염 용액은 20 ℃에서 밀폐된 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 용기에 보관할 때, 바람직하게는 1년 동안, 더 바람직하게는 2년 동안 안정하다. 놀랍게도 적어도 하나의 붕산(염) 및/또는 적어도 하나의 인산(염)을 포함하는 ECAS는 적어도 하나의 붕산(염) 및/또는 적어도 하나의 인산(염)을 결핍한 본 발명의 ECAS에 비해 본 발명의 ECAS의 안정성을 한층 향상시킬 수 있다는 것이 발견되었다. 더욱이, 고밀도 폴리에틸렌 재료(HDPE)에 보관하면 저밀도 폴리에틸렌(LDPE) 또는 폴리프로필렌(PP)과 같은 다른 재료들에 비해 우수한 안정성을 제공하는 것으로 밝혀졌다.
일 구현예에서, 본 발명의 의미에서 "안정한" 또는 "안정성"은 본 발명의 ECAS의 산화환원 전위가 각각의 저장 조건하에서 6개월 저장 후 최대로, 20%, 바람직하게는 1% 내지 10% 만큼 감소됨을 의미한다. 대안적으로, 본 발명의 ECAS의 산화환원 전위는 각각의 저장 조건하에서 12개월 저장 후 최대로, 25%, 바람직하게는 1% 내지 10% 만큼 감소된다. 대안적으로, 본 발명의 ECAS의 산화환원 전위는 각각의 저장 조건하에서 24개월 저장 후 최대로, 30%, 바람직하게는 2% 내지 15% 만큼 감소된다.
산화환원 전위는 통상의 기술자에게 알려진 확립된 방법들을 통해 측정될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명에 따른 ECAS는 하이포클로라이트 이온 및/또는 하이포클로러스산(hypochlorous acid)을, 특히 1 mg/l 내지 10,000 mg/l의 총 농도, 더욱 바람직하게는 10 mg/l 내지 1000 mg/l의 총 농도로 함유할 수 있다.
클로라이트(chlorite) 및/또는 클로레이트(chlorate) 이온의 총 함량은 바람직하게는 독성 수준 미만, 예를 들어, 10 mg/l 미만, 더 바람직하게는 0.001 mg/l 내지 10 mg/l, 더욱더 바람직하게는 0.001 mg/l 내지 4 mg/l이다.
또한, 본 발명에 따른 ECAS 내의 중금속 및 중금속 이온의 총 함량은 바람직하게는 독성 수준 미만, 예를 들어, 10 ㎍/g 미만, 바람직하게는 6 ㎍/g 미만, 더 바람직하게는 0.001 내지 6 ㎍/g, 및 각각의 개별 중금속 및 중금속 이온의 함량은 바람직하게는 0.5 ㎍/g 미만이다. 중금속 및 중금속 이온은, 은, 비소, 금, 이리듐, 팔라듐, 백금, 로듐, 탈륨, 카드뮴, 코발트, 수은, 납, 루테늄, 크롬, 몰리브덴, 안티몬, 주석 구리, 니켈, 오스뮴, 또는 바나듐이거나 또는 이들로부터 유래될 수 있다. 중금속(이온)은 ISO 17025에 따른 ICP-MS 분석을 통해 검출될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명의 ECAS는 폴리머와 같은 적어도 하나의 점도 증가제를 함유할 수 있다. 모든 폴리머는 유기 또는 무기로 사용될 수 있다. 적합한 폴리머는 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 예를 들어, 카르복시 메틸 셀룰로오스(CMC), 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(HPMC), 다당류, 예를 들어, 글루코오스아미노글리칸, 예를 들어, 히알루론산(HA), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 실리카 젤, 마그네슘 메타실리케이트 및/또는 알루미늄-메타실리케이트일 수 있다.
본 발명의 ECAS는 바람직하게는 약물과 같은 추가적인 치료 활성 작용제(therapeutically active agent)를 함유하지 않는다. 즉, 부재한다. 놀랍게도 본 발명의 ECAS가 추가적인 치료 활성 작용제 없이도 안염의 치료에 효과적이라는 것이 밝혀졌다.
본 발명의 ECAS는 바람직하게는 BAK, 소듐 퍼보레이트, 옥시클로로 착물, 아연 보레이트 착물, 등과 같은 추가 방부제(preservative)를 함유하지 않는다. 놀랍게도 본 발명의 ECAS는 미생물 성장을 방지하기에 충분한 소독력을 본질적으로 가지고 있다는 것이 발견되었다.
추가 측면에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)을 제조하는 방법에 관한 것으로, 이 제조 방법은:
(i) 전기분해 반응기 내에서 클로라이드 수용액을 전기분해하는 단계;
(ii) 선택적으로(optionally) 적어도 하나의 붕산(염) 및/또는 적어도 하나의 인산(염)을 첨가하는 단계; 및
(iii) 선택적으로(optionally), 바람직하게는 주입수를 첨가하여 ECAS를 희석시키는 단계;를 포함한다.
전기분해 반응기는 바람직하게는 실린더형 캐소드를 포함하며, 실린더형 캐소드는 실린더형 애노드 내에 동축으로 장착된다. 캐소드 및 애노드는 미세 다공성 멤브레인에 의해 분리될 수 있으며, 여기서 전류가 전극에 인가된다. 전기분해는 10.0 A 내지 30.0 A의 전류, 바람직하게는 15.0 A 내지 20.0 A의 전류에서 수행된다. 전기분해 반응기는 바람직하게는 연속 전기분해를 위해 구성된다. 상기 반응기들 중 하나 이상은 병렬 또는 직렬로 결합될 수 있다.
단계 (i)에서 사용되는 클로라이드 수용액은 바람직하게는 주입수(멸균수) 중에 최대 10 g/l, 바람직하게는 2 g/l 내지 9 g/l의 농도를 갖는다.
단계 (i) 또는 (ii)에서 얻은 ECAS는 수성 매질, 바람직하게는 멸균수로 희석될 수 있다. 단계 (i) 또는 (ii)에서 얻은 ECAS는 예를 들어, 1:6 내지 6:1, 바람직하게는 1:0.5 내지 1:3의 ECAS:수성 매질의 비로 수성 매질을 사용하여 희석될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 본 발명의 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS) 및 선택적으로(optionally) 적어도 하나의 치료학적으로 유효한 작용제를 포함하는 제약 제형에 관한 것이다. 본 발명에 따른 약제학적 제형은 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 약제약학적으로 허용되는 부형제는 예를 들어, 완충제, 보조제(adjuvants), 보조 작용제(auxiliary agents), 충전제, 희석제, 등으로부터 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)은 예를 들어, 박테리아, 진균(fungi) 및/또는 바이러스와 같은 미생물에 의한, 감염(infections), 특히 안염(eye infections)을 치료하는 데 사용하기 위한 것이다. 박테리아 및/또는 진균 감염은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 스타필로코쿠스 에피데미디스(Staphylococcus epidermidis), 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes), 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼길루스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 아시네토박터 피티(Acinetobacter pitii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 종(species)에 의해 발생될 수 있다. 바이러스 감염은 아데노바이러스(예를 들어, 인간 아데노바이러스 B 및 인간 아데노바이러스 C), 엔테로바이러스(예를 들어, 엔테로바이러스 70 또는 콕사키 바이러스), 및 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus) 1 및 단순 헤르페스 바이러스 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이러스에 의해 발생될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명의 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)은 특히 안염을 치료하기 위해, 특히 결막염(conjunctivitis), 각막염(keratitis), 안검염(blepharitis), 안구내염(endophthalmitis), 더욱 바람직하게는 각막염(keratitis) 및/또는 결막염, 더욱더 바람직하게는 결막염을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명의 ECAS는 해로운 부작용을 일으키지 않으면서 시험관 내 및 생체 내 연구에 의해 세균성 결막염 및 세균성 각막염의 치료에서 최적의 효능을 나타냈다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 매우 바람직한 구현예에서, 본 발명의 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)은, 예를 들어, 미생물들, 예를 들어, 박테리아, 진균 또는 바이러스에 의해 발생된 결막염을 치료하기 위해, 더욱 바람직하게는 박테리아 결막염을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)은 각막염, 예를 들어, 박테리아 각막염을 치료하는데 사용될 수 있다.
안염을 치료하기 위해, 본 발명의 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)을 눈, 누낭 및/또는 눈꺼풀에 국소 투여할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 ECAS는 감염 직후에 눈에 투여될 수 있다.
도 1. HSV-1 균주 Kupka의 역가. 베로 세포들(Vero cells)을 시험 제품으로 (감염 24 시간 전 및 2 시간 전에, 감염 동안, 감염 2 시간 후 및 6 시간 후에) 처리하였고, 0.01의 감염 다중도(MOI)에서 HSV-1 균주 Kupka로 감염시켰다. 감염된 세포들은 감염 24 시간 후(24 hours post infection: 24 hpi)에 수집되었고, 바이러스 역가는 플라크 분석(plaque assay)에 의해 측정되었다. 위약군(MOCK) - 감염되었지만 처리되지 않은 세포들; 1:1 - 1:1로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; 1:2 - 1:2로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; ACV - 아시클로버(aciclovir) 100 μM로 처리된 감염된 세포들.
도 2. HSV-1 균주 ANGpath의 역가. 베로 세포들(Vero cells)을 시험 제품으로 (감염 24 시간 전 및 2 시간 전에, 감염 동안, 감염 2 시간 후 및 6 시간 후에) 처리하였고, 0.01의 감염 다중도(MOI)에서 HSV-1 균주 ANGpath로 감염시켰다. 감염된 세포들은 감염 후 24 시간(24 hours post infection: 24 hpi)에 수집되었고, 바이러스 역가는 플라크 분석(plaque assay)에 의해 측정되었다. 위약군 - 감염되었지만 처리되지 않은 세포들; 1:1 - 1:1로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; 1:2 - 1:2로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; ACV - 아시클로버(aciclovir) 100 μM로 처리된 감염된 세포들.
도 3. HSV-1 균주 Kupka의 역가. HSV-1 균주 Kupka(MOI 0.01)는 베로 세포(Vero cell)의 감염 2, 6, 8 또는 12 시간 전에, 시험 제품을 사용하여 배양되었다. 감염된 세포들는 24 hpi에서 수집되었고, 바이러스 역가는 플라크 분석에 의해 측정되었다. 위약군 - 처리되지 않은 바이러스에 감염된 세포들; 1:1 - 1:1로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; 1:2 - 1:2로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; ACV - 아시클로버 100 μM로 처리된 감염된 세포들.
도 4. HSV-1 균주 ANGpath의 역가. ANGpath(MOI 0.01)는 베로 세포(Vero cell)의 감염 2, 6, 8 또는 12 시간 전에, 시험 제품을 사용하여 배양되었다. 감염된 세포들는 24 hpi에서 수집되었고, 바이러스 역가는 플라크 분석에 의해 측정되었다. 위약군 - 처리되지 않은 바이러스에 감염된 세포들; 1:1 - 1:1로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; 1:2 - 1:2로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; ACV - 아시클로버 100 μM로 처리된 감염된 세포들.
도 5. 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 감염되었으며 ECAS2 및 Floxal®로 처리된 토끼 눈의 안과적 평가의 요약 점수. 토끼 눈은 6일 동안 처리되었다. 24, 48, 72, 96, 144 및 168 hpi에서, 안과적 평가를 수행하였다. 결막염의 주요 파라미터들은 각 사분면(quadrant)에 대해 1, 2, 3 또는 4의 등급이 매겨졌다. 관찰 결과는 그룹 당 요약되었다. 그룹 당 눈(eyes)의 개수 n은 8이었다.
도 6. 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 감염되었으며 ECAS2 및 Floxal®로 처리된 토끼 눈의 안과적 평가의 평균 점수. 토끼 눈은 6일 동안 처리되었다. 24, 48, 72, 96, 144 및 168 hpi에서, 안과적 평가를 수행하였다. 결막염의 주요 파라미터들은 각 사분면(quadrant)에 대해 1, 2, 3 또는 4의 등급이 매겨졌다. 관찰 결과는 그룹 당 평균 점수로서 표현되었다. 그룹 당 눈(eyes)의 개수 n은 8이었다.
도 7. 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 감염되었으며 ECAS2 및 Floxal®로 처리된 토끼 눈 결막에서 발견된 군체 형성 단위(CFU). 토끼 눈은 6일 동안 처리되었다. 24, 48, 72, 96, 및 144 hpi에서, 안과적 평가를 수행하였다. 관찰 결과는 그룹 당 요약되었다. 그룹 당 눈(eyes)의 개수 n은 8이었다.
도 8. 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 감염되었으며 ECAS2 및 Floxal®(0.3% Ofloxacin)로 처리된 토끼 눈. 토끼 눈은 감염 6 시간 후 내지 19 시간 후에 매시간 처리되었다. 토끼를 희생시킨 후, 각막 100 mg 당 생존 가능한 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 수를 정량화하였다. 그룹 당 눈(eyes)의 개수 n은 5였다.
본 발명은 더 상세히 설명될 것이며 하기 실시예들에 의해 이에 제한되지 않는다.
실시예 1: 전기화학적 활성화 염 용액의 제조 및 특성분석
ECAS의 제조를 위해 6 개의 결합된 전기분해 반응기(동축 전극)가 사용되었다. 탱크에 저장된 포화 소듐 클로라이드 용액은, 예를 들어, 2.83 l/분의 유량을 갖는 순수한 주입수의 흐름에 미리 결정된 비율로 밸브를 통해 적용된 다음 반응기들을 통해 펌핑되었다. 애노드 및 캐소드에 의해 생성된 두 개의 활성화된 용액을 수집하였고 미리 결정된 비율로 혼합하여 순수한 ECAS를 제공하였다.
선택적으로(optionally), 주입수로 희석하기 전에 보레이트 및/또는 포스페이트를 순수한 ECAS에 첨가하였다.
획득한 ECAS는 다음 표에 요약되어 있다.
표 1: ECAS의 구성
ECAS 0 ECAS 1
(붕산 포함)		 ECAS 2
(포스페이트 포함)
단계 (i)로부터 획득한 ECAS [wt.-%] 50 49.83 48.58
붕산(H3BO3) [wt.-%] 0.15
NaH2PO4 [wt.-%] 0.27
Na2HPO4 [wt.-%] 1.15
주입수 [wt.-%] 50 49.83 50.00
NaOH (1M) [wt.-%] 0.19
pH 7.5 7.3 7.4
산화환원 전위 (mV ) 907 871 856
총 염소 (ppm ) 313 290 302
오스몰농도 (mOsm/kg) 305 326 315
실시예 2: 전기화학적 활성화 염 용액의 안정성
전기화학적 활성화 염 용액의 안정성은 획득한 ECAS(표 1 참조)를 밀폐된 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 용기에 20 ℃에서 저장함으로써 평가하였다.
표 2: 6개월 및 12개월 동안 ECAS 0, ECAS 1 및 ECAS 2의 안정성
저장 ECAS 0 ECAS 1 ECAS 2
0 개월 pH 7.5 7.3 7.4
산화환원 전위 (mV) 907 871 856
총 염소 (ppm) 313 290 302
타임 킬 항균 시험 1 양성 양성 양성
6 개월 pH 5.5 7.3 7.40
산화환원 전위 (mV) 1010 886 841
총 염소 (ppm) 128 230 190
타임 킬 항균 시험 1 양성 양성 양성
12 개월 pH 5.7 7.2 7.4
산화환원 전위 (mV) 961 873 833
총 염소 (ppm) 94 160 142
타임 킬 항균 시험 1 감소됨 양성 양성
1타임 킬 항균 시험(Time Kill Antibacterial Test)은 박테리아 현탁액에 ECAS를 접종한 후 서로 다른 시간에 죽은 박테리아의 수를 측정하는 시험관 내 시험(in-vitro test)이다. 각기 다른 저장 시간에서 모든 ECAS 샘플에 대한 이 시험의 자세한 결과는 표 21, 22, 23에 보고된다.
표 21: 저장 0 시간 경과 후의 ECAS의 항균 활성(Time Kill Anti-bacterial test)
ECAS
샘플		 저장 시간 박테리아 농도
CFU/ml		 노출 시간 생존 박테리아
CFU/ml		 감소 백분율
ECAS 0 0 스타필로코쿠스
아우레우스
(Staphylococc.
aureus)
1.5 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
수도모나스
아에루기노사
(Pseudomonas aeruginosa)
1.6 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
6 개월 스타필로코쿠스
아우레우스

6.4 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
수도모나스
아에루기노사

4.9 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
12 개월 스타필로코쿠스
아우레우스

6.0 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 6.1 x 105
5.2 x 105
5.3 x 105
5.5 x 105
5.2 x105 		89.8300 %
91.3300 %
91.1700 %
90.8300 %
91.3300 %




수도모나스
아에루기노사

3.4 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 4.1 x105
4.2 x105
4.1 x105
3.2 x105
3.4 x105 		87.9400 %
87.6500 %
87.9400 %
90.5900 %
90.0000 %
표 22: 저장 1 시간 경과 후의 ECAS의 항균 활성(Time Kill Anti-bacterial test)
ECAS
샘플		 저장 시간 박테리아 농도
CFU/ml		 노출 시간 생존 박테리아
CFU/ml		 감소 백분율
ECAS 1 0 스타필로코쿠스
아우레우스

4.8 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
수도모나스
아에루기노사

4.7 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
6 개월 스타필로코쿠스
아우레우스

5.0 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
수도모나스
아에루기노사

2.8 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
12 개월 스타필로코쿠스
아우레우스

5.5 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10
 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %





수도모나스
아에루기노사

4.5 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10 		99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
표 23: 저장 2 시간 경과 후의 ECAS의 항균 활성(Time Kill Anti-bacterial test)
ECAS
샘플		 저장 시간 박테리아 농도
CFU/ml		 노출 시간 생존 박테리아
CFU/ml		 감소 백분율
ECAS 2 0 스타필로코쿠스
아우레우스
8.8 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
수도모나스
아에루기노사
4.7 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
6 개월 스타필로코쿠스
아우레우스
7.5 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
수도모나스
아에루기노사
3.8 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
12 개월 스타필로코쿠스
아우레우스
5.0 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10		 99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %





수도모나스
아에루기노사
4.9 x 106 		1 분
5 분
15 분
30 분
60 분		 < 10
< 10
< 10
< 10
< 10 		99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
99.9999 %
모든 ECAS는 우수한 항균 활성을 보여준다. 또한, 안정성 시험 결과는, 붕산 염 및 인산 염을 각각 포함하는 ECAS 1 및 ECAS 2가 물리화학적 파라미터(표 21)에 있어서 그리고 1년 이후에도 항균 활성 유지 측면들에 있어서 ECAS 0보다 안정함을 보여주며, 표 22 및 23에 자세히 표시된 바와 같다.
실시예 3: 전기화학적 활성화 염 용액의 시험관 내 항균 활성
박테리아, 효모, 및 포자에 대한 ECAS 2의 시험관 내 항균 활성을 시험하였다. 시험은 10개의 표준 균주 및 39개의 임상 단리 균주에 대해 음성 대조군(완충된 소듐 클로라이드-펩톤 용액), ECAS 2 및 참조 제품(Floxal®:, 점안액, 0.3% 오플록사신(ofloxacin), 벤잘코늄 클로라이드(benzalkoniumchloride), 주입수)의 각각에 대해 세 개씩(in triplicate) 수행되었다.
각각의 미생물 샘플은 적어도 105 CFU/ml 내지 106 CFU/ml의 시작 농도로 희석되었다. 그런 다음, 음성 대조군, ECAS 2 및 참조 제품에 각각 0.1ml를 접종하고, 각각의 샘플을 혼합하였다. 접종 후 0 분, 15 분 및 30 분의 시간 간격으로, 샘플을 채취하고 불활성화하여, 미생물 생존을 측정하였다.
초기 미생물 농도와 각각의 배양 간격에서의 농도(둘 다 CFU/mL 단위로)를 비교하여 미생물 개체수의 감소를 계산하였다. 결과는 표 3에 나타내었다.
표 3: 평균 억제율로 표시된, 참조 균주에 대해 참조 제품 Floxal®("참조"라고 함)과 비교한, ECAS 2의 항균 활성
미생물 번호 항목 #시험 (N) 시간(분)
0 15 30
스타필로코쿠스
아우레우스		 　CCM
4223		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 92.9 >99.4 >99.4
참조 3 12.0 >93.6 >93.6
스타필로코쿠스 에피데미디스
(Staphylococcus epidermidis)		 　　CCM
2124
 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 97.9 >99.8 >99.8
참조 3 95.6 >97.5 >97.5
대장균
(Escherichia coli)		 　CCM
4517		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 99.7 >99.9 >99.9
참조 3 >99.4 >99.4 >99.4
수도모나스 아에루기노사
(Pseudomonas aeruginosa)		 　CCM
1961		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 95.5 >99.1 >99.1
참조 3 >90.8 >90.8 >90.8
아시네토박터
칼코아세티쿠스
(Acinetobacter calcoaceticus)		 CCM　
4503		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 >99.8 >99.8 >99.8
참조 3 54.3 >98.4 >98.4
엔테로박터
아에로제네스
(Enterobacter aerogenes)		 　CCM
7797 		대조군 3 0 - -
ECAS2 3 86.7 >99.9 >99.9
참조 3 60.4 >98.7 >98.7
스트렙토코쿠스 안지노수스
(Streptococcus anginosus)		 　CCM
7437 		대조군 3 0 - -
ECAS2 3 20.6 >99.6 >99.6
참조 3 26.6 >96.4 >96.4
스트렙토코쿠스 파이오제네스
(Streptococcus pyogenes)		 　A1
96/50 		대조군 3 0 - -
ECAS2 3 97.5 >99.5 >99.5
참조 3 36.6 >94.9 >94.9
칸디다
알비칸스
(Candida albicans)		 　CCM
8215 		대조군 3 0 - -
ECAS2 3 98.2 >99.9 >99.9
참조 3 1.2 28.1 30.0
아스퍼길루스
브라실리엔시스
(Aspergillus brasiliensis)
 　CCM
8222
 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 66.5 >99.7 >99.7
참조 3 0 0 0
표 31: (계속됨) 평균 억제율로 표시된, 임상 단리 균주(clinical isolates)에 대해 참조 제품 Floxal®("참조"라고 함)과 비교한, ECAS 2의 항균 활성.
미생물 번호 항목 #시험 (N) 샘플링 시간(분)
0 15 30
스타필로코쿠스
아우레우스		 GAOC
955/1
 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 >98.1 >98.1 >98.1
참조 3 42.3 >80.8 >80.8
스타필로코쿠스
아우레우스		 GAOC
950/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 83.3 >99.7 >99.7
참조 3 37.7 >97.1 >97.1
스타필로코쿠스
아우레우스		 DOC
792/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 43.6 >99.6 >99.6
참조 3 4.0 >95.9 >95.9
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
838/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 37.2 >99.7 >99.7
참조 3 9.1 >96.6 >96.6
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
800/2		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 46.8 >99.6 >99.6
참조 3 20.7 >96.3 >96.3
스타필로코쿠스
아우레우스		 DOC
806/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 >99.7 >99.7 >99.7
참조 3 27.3 >96.7 >96.7
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
816/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 90.7 >99.8 >99.8
참조 3 70.4 >98.2 >98.2
스타필로코쿠스
아우레우스		 DOC
818/3		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 95.9 >99.8 >99.8
참조 3 32.2 >98.3 >98.3
스타필로코쿠스
아우레우스 		GAOC
997		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 99.2 >99.8 >99.8
참조 3 81.3 >98.4 >98.4
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
833/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 79.1 >99.7 >99.7
참조 3 58.9 >97.4 >97.4
스타필로코쿠스
아우레우스		 DOC
907		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 >99.5 >99.5 >99.5
참조 3 42.8 >94.9 >94.9
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
885		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 91.7 >99.8 >99.8
참조 3 44.5 >97.9 >97.9
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
890		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 81.8 >99.5 >99.5
참조 3 44.6 >94.6 >94.6
표 32: (계속됨) 평균 억제율로 표시된, 임상 단리 균주(clinical isolates)에 대해 참조 제품 Floxal®("참조"라고 함)과 비교한, ECAS 2의 항균 활성.
미생물 번호 항목 #시험
(N) 		샘플링 시간(분)
0 15 30
스타필로코쿠스
아우레우스 		GAOC
979		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 94.0 >99.9 >99.9
참조 3 41.9 >98.7 >98.7
스타필로코쿠스
아우레우스		 GAOC
983		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 81.2 >99.7 >99.7
참조 3 37.9 >96.7 >96.7
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
939/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 99.4 >99.8 >99.8
참조 3 87.0 >97.9 >97.9
스타필로코쿠스
아우레우스		 DOC
955/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 88.2 >99.5 >99.5
참조 3 55.3 >95.3 >95.3
스타필로코쿠스
아우레우스		 DOC
855/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 26.7 >99.7 >99.7
참조 3 24.2 83.2 >97.3
스타필로코쿠스
아우레우스		 DOC
862/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 52.8 >99.7 >99.7
참조 3 42.8 >96.5 >96.5
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
848/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 94.5 >99.9 >99.9
참조 3 72.2 >98.6 >98.6
스타필로코쿠스
아우레우스		 DOC
849/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 69.6 >99.9 >99.9
참조 3 23.0 >99.3 >99.3
스타필로코쿠스
아우레우스 		TOOC
227/3		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 59.2 >99.9 >99.9
참조 3 25.5 >99.2 >99.2
스타필로코쿠스
아우레우스 		TOOC
226/3		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 >99.8 >99.9 >99.9
참조 3 51.5 >97.6 >97.6
스타필로코쿠스
아우레우스 		LVOC
557/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 86.2 >99.8 >99.8
참조 3 52.1 >97.9 >97.9
스타필로코쿠스
아우레우스 		TOOC
224/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 73.8 >99.8 >99.8
참조 3 60.7 >97.9 >97.9
표 33: (계속됨) 평균 억제율로 표시된, 임상 단리 균주(clinical isolates)에 대해 참조 제품 Floxal®("참조"라고 함)과 비교한, ECAS 2의 항균 활성.
미생물 번호 항목 #시험
(N) 		샘플링 시간(분)
0 15 30
스타필로코쿠스
아우레우스 		TOOC
243/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 81.6 >99.8 >99.8
참조 3 26.4 >97.9 >97.9
스타필로코쿠스
아우레우스 		LVOC
550/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 92.5 >99.9 >99.9
참조 3 68.1 >98.5 >98.5
스타필로코쿠스
아우레우스		 KNOC
467/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 58.2 >99.5 >99.5
참조 3 34.5 >94.9 >94.9
스타필로코쿠스
아우레우스		 LVOC
559/2		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 >99.4 >99.4 >99.4
참조 3 68.2 >93.9 >93.9
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
854/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 77.8 >99.3 >99.3
참조 3 54.3 >92.8 >92.8
스타필로코쿠스
아우레우스 		TOOC
236/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 99.5 >99.9 >99.9
참조 3 93.9 >99.5 >99.5
스타필로코쿠스
아우레우스 		DOC
960/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 98.1 >99.6 >99.6
참조 3 86.9 >95.9 >95.9
스타필로코쿠스
아우레우스
MR		 DOC
873/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 88.4 >99.7 >99.7
참조 3 35.8 >97.1 >97.1
스타필로코쿠스
아우레우스
MR		 DOC
845/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 96.8 >99.6 >99.6
참조 3 14.9 >95.9 >95,9
대장균
(Escherichia coli)		 GAOC
961/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 93.3 >99.8 >99.8
참조 3 73.6 >97.6 >98.2
대장균
(Escherichia coli)		 DOC
958/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 99.5 >99.9 >99.9
참조 3 82.7 >98.8 >98.8
수도모나스
아에루기노사		 DOC
809/1		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 >99.9 >99.9 >99.9
참조 3 61.4 >98.7 >98.7
세라티아
마르세센스
(Serratia marcescens)		 DOC
920		 대조군 3 0 - -
ECAS2 3 82.5 >98.7 >98.7
참조 3 81.0 >87.3 >87.3
아시네토박터
피티
(Acinetobacter
pitii)		 DOC 대조군 3 0 - -
784/1 ECAS2 3 67.9 >99.6 >99.6
참조 3 63.4 >96.3 >96.3
참조 균주
참조 균주 스타필로코쿠스 아우레우스(S. aureus), 스타필로코쿠스 에피데미디스(S. epidermidis), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes), 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(E.coli), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 아스퍼길루스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis)는 ECAS 2에 취약하였다. ECAS 2는 10개중 9개의 미생물에 대해 시간 0에서 높은 활성(50% 초과의 억제)을 나타냈다. 7개의 미생물에 대해 90% 이상의 억제가 확인되었다.
15 분에서, ECAS 2는 시험된 모든 참조 균주에 대해 활성(99% 초과의 억제)을 나타냈다.
참조 균주 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피데미디스(S. epidermidis), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes), 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(E. coli) 및 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes)는 참조 제품 Floxal®에 의해 영향을 받았다. 참조 제품은 10개 중 5개의 미생물에 대해 0 분에서 높은 활성(50% 초과의 억제)을 나타냈다. 3 개의 미생물에 대해 90% 초과의 억제가 확인되었다.
15 분에서, 참조 제품은 10개 중 8개의 시험된 참조 균주에 대해 활성(90% 초과의 억제)을 나타냈다.
두 가지 미생물, 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 아스퍼길루스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis)는 최대 30 분의 배양 시간 동안 생존 가능한 상태를 유지했다(50% 미만의 억제).
임상 단리 균주(Clinical isolates)
연구에 포함된 39 개의 임상 단리 균주는 의료 미생물학 실험실에서 1개월 이내에 결막염에서 수집된 균주의 발생률을 기준으로 선택되었다. 그 중 대부분(34 개)은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)과 MRSA 였고, 나머지는 대장균(E.coli)(2 개), 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)(1 개), 아시네토박터 피티(Acinetobacter pitii)(1 개), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)(1 개)이었다.
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 MRSA
ECAS 2는 시험된 단리 균주의 34 개 중 30 개에 대해 0 분에서 높은 활성(50% 초과의 억제)을 나타냈다. 스타필로코쿠스 아우레우스/MRSA의 34 개 중 16 개의 단리 균주에 대해 90% 초과의 억제가 측정되었다.
15 분에서, ECAS 2는 34 개 중 34 개의 단리 균주에 대해 활성(99% 초과의 억제)을 나타냈다.
참조 제품은 34 개 중 14 개의 시험된 스타필로코쿠스 아우레우스/MRSA 단리 균주에 대해 0 분에서 높은 활성(50% 초과의 억제)을 나타냈다. 34 개 중 1 개의 단리 균주에 대해 90% 초과의 억제가 측정되었다.
15 분에서, 참조 제품은 34개 중 32 개의 시험된 단리 균주에 대해 활성(90% 초과의 억제)을 나타냈다.
대장균(E. coli)
ECAS 2는 시험된 대장균(E. coli) 단리 균주에 대해 0 분에서 높은 활성(50% 초과의 억제)을 나타냈다. 2 개 중 2 개의 단리 균주에 대해 90% 초과의 억제가 측정되었다.
ECAS 2는 15 분에서 2 개 중 2 개의 시험된 대장균(E. coli) 균주에 대해 활성(99% 초과의 억제)을 나타냈다.
참조 제품은 시험된 대장균(E. coli) 단리 균주의 2 개 중 2 개에 대해 0 분에서 높은 활성(50 % 초과의 억제)을 나타냈다. 2 개 중 0 개의 단리 균주에 대해 90 % 초과의 억제가 측정되었다.
참조 제품은 15 분에서 2 개 중 2 개의 시험된 대장균(E. coli) 단리 균주에 대해 활성(90 % 초과의 억제)을 나타냈다.
수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)
ECAS 2는 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 1 개 중 1 개의 단리 균주에 대해 0 분에서 90 % 초과의 높은 활성을 나타냈다.
15 분에서, ECAS 2는 1 개 중 1 개의 시험된 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 균주에 대해 활성(99 % 초과의 억제)을 나타냈다.
참조 제품은 1 개 중 1 개에 대해 높은 활성(50% 초과의 억제)을 보였고, 시간 0에서, 0 개의 수도모나스 아에루기노사 단리 균주에 대해, 90% 초과의 억제를 나타냈다.
참조 제품은 15 분에서 1 개 중 1 개의 수도모나스 아에루기노사의 시험된 단리 균주에 대해 활성(90% 초과의 억제)을 나타냈다.
그람 음성 박테리아(세라티아(Serratia), 아시네토박터 피티(Acinetobacter pitii))
ECAS 2는 나열된 그람 음성 박테리아의 단리 균주 2 개 중 2 개에 대해 0 분에서 높은 활성(50% 초과의 억제)을 나타냈다.
15 분에서, ECAS 2는 단리 균주 2 개 중 2 개에 대해 높은 활성(99% 초과의 억제)을 나타냈다.
참조 제품은 나열된 그람 음성 박테리아의 단리 균주 2 개 중 2 개에 대해 0 분에서 높은 활성(50% 초과의 억제)을 나타냈다.
15 분에서, 참조 제품은 2 개 중 1 개의 시험된 단리 균주에 대해 활성(90 % 초과의 억제)을 나타냈다.
논의
상기 결과는 ECAS 2가 강력한 항균 활성을 가지고 있음을 보여준다. 활성 범위는 그람 양성 및 그람 음성 박테리아, 효모 및 곰팡이(molds)를 포함한다. 억제 활성은, 시험 접종물(inoculum)(105-106)을 ECAS 2와 혼합한 직후, 모든 참조 균주들(10개의 균주들), 및 결막염으로부터의 모든 임상 분리주들(clinical isolates)(39개의 균주들)에 대해 검출되었다. 두 개의 경우들을 제외하고(스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) GAOC 955/1 및 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) DOC 920), 15 분 배양 후에, 모든 시험 균주들에 대해 99% 초과의 억제가 측정되었다.
ECAS 2와 비교된 참조 제품 Floxal®에 대한 항균 활성의 차이는 특히 시간 0에서 관찰되었다. 시간 0에서 ECAS 2에 대해 측정된 억제는, 참조 제품을 사용한 경우의 억제보다 더 효과적이었다. 또한, 아스퍼길루스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)는, 최대 30 분의 시간 간격에서, 참조 제품에 영향받지(susceptible) 않았다.
실시예 4: 전기화학적 활성화 염 용액의 시험관 내(in vitro) 항바이러스 활성
A. 베로 세포(Vero cell)들을 24-웰 플레이트에 접종하고, ECAS 2 Dil.1:1 및 Dil.1:2의 희석액으로, 다음 중 어느 하나의 시점에서, 처리하였다:
I. 감염 24 시간 전;
II. 감염 2 시간 전;
III. 감염 동안;
IV. 감염 2 시간 후; 또는
V. 감염 6 시간 후.
세포들은, 0.01의 감염 다중도(multiplicity of infection: MOI)에서, HSV-1 균주들 Kupka 및 ANGpath로 감염되었다. 감염 24 시간 후(24 hours post infection: 24 hpi), 세포들을 수집하였고, 플라크 분석(plaque assay)에 의해 바이러스 역가(virus titer)를 측정하였다. 간단히 말해서, 샘플들을 순차적으로 희석하였고, 24- 또는 6-웰 조직 플레이트들에서, 1일 베로 세포 단층들(one-day Vero cell-monolayers) 상에, 동일하게 플레이팅하였다. 그 후, 세포들을 정상 성장 배지 중의 1% 메틸셀룰로오스로 덮었다. 감염 5일 후, 세포들을 고정하였고, 20% 에탄올 중 2% 크리스탈 바이올렛으로 착색하였으며, 개별 플라크들(individual plaques)을 계수하여 각각의 샘플에서의 바이러스 역가를 측정하였다. 처리되지 않은 샘플들(위약군(mock), 음성 대조군) 및 ACV(Acyclovir, 100 μmol/l, 참조 대조군)로 처리된 샘플들을 동일한 방식으로 취급하였다. 시험은 두 개의 독립적인 실험들에서 수행되었으며, 샘플들 각각은 병렬 웰들(parallel wells)에서 시험되었다.
B. HSV-1 균주들 Kupka 및 ANGpath가, 0.01의 MOI에서, Dil.1:1 또는 Dil.1:2의 ECAS 2 희석액을 사용하여, 100 μl의 최종 부피로, 다음 중 하나의 시간 동안, 배양되었다:
I. 12 시간;
II. 8 시간;
III. 6 시간; 또는
IV. 2 시간.
그 다음, 감염 24 시간 전에 24-웰 플레이트에 접종된 세포들을, 앞에서 언급된 사전 배양된 바이러스들로 감염시켰다. 24 hpi에서, 세포들을 수집하였고, 앞에서 설명된 바와 같이, 플라크 분석에 의해 바이러스 역가를 측정하였다. 처리되지 않은 샘플들(위약군, 음성 대조군) 및 Acyclovir(참조 대조군으로서 100 μmol/l)로 처리된 샘플들을 동일한 방식으로 취급하였다. 시험은 두 개의 독립적인 실험들에서 수행되었으며, 샘플들 각각은 병렬 웰들에서 시험되었다.
결과
A. 모든 시점들에서, 1:1로 희석된 ECAS 2로 세포들을 처리했을 때, HSV-1 균주 Kupka의 역가의 현저한 감소가 검출되었다(도 1). 흥미롭게도, 감염 동안, 또는 2 및 6 hpi에서, ECAS 2(1:1)로 처리된 세포들에서의 바이러스 역가의 감소는, 동일한 시점들에서 ACV로 처리된 것에 비해, 훨씬 더 강하였다. 6.29 log10 PFU/ml(p ≤ 0.01) 만큼의, HSV-1 균주 Kupka의 역가의 최대 감소가, 감염 동안 1:1로 희석된 ECAS 2로 처리된 세포들에서 검출되었다(표 4).
1:2로 희석된 ECAS 2는, 1:1 희석에서 관찰되는 정도로는 바이러스 복제를 억제하지 못하였다. 그럼에도 불구하고, 감염 동안 세포들을 처리했을 때, 위약으로 처리된(mock-treated) 감염된 세포들에 비해, 3.26 log10 PFU/ml(p ≤ 0.01) 만큼의 역가 감소가 검출되었다.
세포들을 ACV로 처리했을 때, 4.52 log10 PFU/ml(p ≤ 0.01)만큼의, HSV-1 균주 Kupka의 역가의 최대 감소가, 2 hpi에서 처리된 세포들에서 검출되었다.
표 4: 시험 방법 A에 따른 HSV-1 균주 Kupka의 바이러스 역가의 감소. 위약군 - 감염되었으나 처리되지 않은 세포들; 1:1 - 1:1로 희석된 ECAS2 100μl로 처리된 감염된 세포들; 1:2 - 1:2로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; ACV - 아시클로버(aciclovir) 100 μM로 처리된 감염된 세포들;
희석 시험 제품으로
세포를 처리한 시점		 바이러스 역가의 감소
[log10]
1:1 감염 24 시간 전 1.42
감염 2 시간 전 1.74
감염 동안 6.29
2 hpi 4.76
6 hpi 5.67
1:2 감염 24 시간 전 1.18
감염 2 시간 전 0.40
감염 동안 3.26
2 hpi 0.97
6 hpi 1.55
ACV 감염 24 시간 전 1.96
감염 2 시간 전 1.96
감염 동안 3.69
2 hpi 4.52
6 hpi 3.43
HSV-1 균주 Kupka와 유사하게, 세포들이 모든 시점들에서 1:1로 희석된 ECAS 2로 처리되었을 때, HSV-1 ANGpath의 역가의 현저한 감소가 검출되었다(도 2). 흥미롭게도, 모든 처리 시점들에서, ECAS(1:1)로 처리된 세포들에서의 바이러스 역가의 감소는, ACV로 처리된 세포에 비해 훨씬 더 강하였다. 6.11 log10 PFU/ml(p ≤ 0.01) 만큼의, HSV-1 균주 ANGpath의 역가의 최대 감소가, 감염 동안 1:1로 희석된 ECAS 2로 처리된 세포들에서 검출되었다(표 5).
1:2로 희석된 ECAS 2는, 1:1의 희석에서 관찰되는 정도로는 바이러스 복제를 억제하지 못하였다. 그럼에도 불구하고, 6 hpi에서 세포들을 처리했을 때, 위약으로 처리된(mock-treated) 감염된 세포들에 비해, 2.24 log10 PFU/ml(p ≤ 0.01) 만큼의 역가 감소가 검출되었다.
세포들을 ACV로 처리했을 때, 2.45, 2.81 및 2.38 log10 PFU/ml(p ≤ 0.01)만큼의, HSV-1 균주 ANGpath의 역가의 최대 감소가, 각각, 감염 동안, 2 hpi에서 및 6 hpi에서 처리된 세포들에서 검출되었다.
표 5: 시험 방법 A에 따른 HSV-1 균주 ANGpath의 바이러스 역가의 감소. 위약군 - 감염되었지만 처리되지 않은 세포들; 1:1 - 1:1로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; 1:2 - 1:2로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; ACV - 아시클로버 100 μM로 처리된 감염된 세포들;
희석 시험 제품으로
세포를 처리한 시점		 바이러스 역가의 감소
[log10]
1:1 감염 24 시간 전 1.98
감염 2 시간 전 2.66
감염 동안 6.11
2 hpi 5.56
6 hpi 4.29
1:2 감염 24 시간 전 1.46
감염 2 시간 전 0.30
감염 동안 1.91
2 hpi 1.75
6 hpi 2.24
ACV 감염 24 시간 전 0.54
감염 2 시간 전 0.61
감염 동안 2.45
2 hpi 2.81
6 hpi 2.38
바이러스 역가가 대조군과 비교하여 적어도 1 log10 PFU/ml 만큼 감소된 경우, 제품은 바이러스에 대해 약한 활성(mildly active)인 것으로 간주된다. 바이러스 역가가 적어도 4 log10 PFU/ml 만큼 감소되면, 제품은 강한 항바이러스 효과를 갖는 것으로 간주된다.
우리의 결과들이 나타내는 바와 같이, 감염 동안 또는 감염 후 초기 시간에서, 1:1로 희석된 ECAS 2로 세포들을 처리하면, 바이러스 역가를 적어도 4 log10 PFU/ml 만큼 감소시킬 수 있었으며, ECAS의 이러한 능력은 HSV-1 균주에 의존하지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 ECAS 2는, 세포들이 감염 동안 또는 감염 후 초기 시간에서 처리될 때, 바이러스 역가를 감소시키는 능력을 갖는다.
B. HSV-1 균주 Kupka의 역가의 총 감소는, 모든 시점들에 대해, 1:1로 희석된 ECAS 2로 처리된 감염된 세포들에서 검출되었다. 흥미롭게도, 1:2로 희석된 ECAS 2로 처리된 감염된 세포들에서의 바이러스 역가의 감소는, ACV 처리에 비해, 훨씬 더 강했다(도 3). 모든 시점들에 대해 1:1로 희석된 ECAS 2로 처리된 감염된 세포들에서, 그리고 12 시간 동안 1:2로 희석된 ECAS 2로 처리된 세포들에서, 5.74 log10 PFU/ml(p ≤ 0.01) 만큼의, HSV-1 균주 Kupka의 역가의 최대 감소가 검출되었다(표 6).
표 6: 시험 방법 B에 따른 HSV-1 균주 Kupka의 바이러스 역가 감소. 위약군 - 처리되지 않은 바이러스로 감염된 세포들; 1:1 - 1:1로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; 1:2 - 1:2로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; ACV - 아시클로버 100 μM로 처리된 감염된 세포들;
희석 시험 제품으로 바이러스를
배양(incubation)한 시간		 바이러스 역가의 감소
[log10]
1:1 2 시간 5.74
6 시간 5.74
8 시간 5.74
12 시간 5.74
1:2 2 시간 5.24
6 시간 5.24
8 시간 5.24
12 시간 5.74
ACV 2 시간 4.62
6 시간 3.55
8 시간 5.17
12 시간 3.15
HSV-1 균주 ANGpath의 역가의 총 감소는, 2, 8 및 12 시간 동안, 1:1로 희석된 ECAS 2로 처리된 감염된 세포들에서 검출되었다. 흥미롭게도, 6 시간 내지 12 시간에서, 1:2로 희석된 ECAS 2로 처리된 감염된 세포들에서의 바이러스 역가의 감소는, ACV 처리에 비해, 훨씬 더 강했다(도 4). 7.50 log10 PFU/ml(p ≤ 0.01) 만큼의, HSV-1 균주 ANGpath의 역가의 최대 감소가, 2, 8 및 12 시간 동안, 1:1로 희석된 ECAS 2로 처리된 감염된 세포들에서 검출되었다(표 7). .
표 7: 시험 방법 B에 따른 HSV-1 균주 ANGpath의 바이러스 역가의 감소. 위약군 - 처리되지 않은 바이러스로 감염된 세포들; 1:1 - 1:1로 희석된 ECAS2 100 μl로 처리된 감염된 세포들; 1:2 - 1:2로 희석된 ECAS2 100μl로 처리된 감염된 세포들; ACV - 아시클로버 100 μM로 처리된 감염된 세포들;
희석 시험 제품으로 바이러스를
배양(incubation)한 시간		 바이러스 역가의 감소
[log10]
1:1 2 시간 7.50
6 시간 6.22
8 시간 7.50
12 시간 7.50
1:2 2 시간 2.38
6 시간 3.12
8 시간 3.72
12 시간 3.69
ACV 2 시간 2.85
6 시간 2.59
8 시간 2.97
12 시간 2.56
상기 결과들은, 2 시간 이상 동안, 1:1로 희석된 ECAS 2를 사용하여 바이러스를 사전 배양(pre-incubation)하면, HSV-1 균주 Kupka 및 ANGpath의 역가가 현저하게 감소한다는 것을 명백하게 실증한다. 종합하면, ECAS 2는, 바이러스가 감염 전 2 시간 이상 동안 시험 제품으로 사전 배양될 때, 바이러스에 직접 영향을 미치고 HSV-1 복제의 억제를 매개(mediate)할 능력을 갖는다.
ECAS 2는, 감염 동안에, 또는 감염 후 초기 시간에, 세포들이 ECAS 2로 처리될 때, 바이러스 역가를 감소시키는 능력을 갖는다. 더욱이, 바이러스가, 감염 전 2 시간 이상 동안, ECAS 2로 처리될 때, ECAS 2는 바이러스 역가를 감소시키는 능력을 갖는다.
여기에 제시된 상기 결과들은, ECAS 2가 기본적으로 ACV와 동일한 항바이러스 효과를 갖는다는 것을 명백히 실증하는데, 이는, ECAS 2가, 감염 동안 또는 HSV-1 감염 후 초기 시간에 ECAS 2로 세포들이 처리될 때, 바이러스 복제를 억제(바이러스 역가의 감소로서 표현됨)할 수 있고, 또한, HSV-1 감염 전 2 시간 이상 동안 ECAS 2로 바이러스가 처리될 때, 바이러스 복제를 억제(바이러스 역가의 감소로서 표현됨)할 수 있기 때문이다.
실시예 5: 전기화학적 활성화 염 용액의 생체 내(in vivo) 항균 활성
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 생체 내 활성
ECAS 2의 생체 내 항균 효과를, 어린 뉴질랜드 알비노 암컷 토끼의 안구에서 조사하였다. 이소플루란 마취 상태에서 토끼 오른쪽 눈의 결막을 손상시켰다. 접종을 위한 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) DOC 845/1을, 원심 분리, 식염수 세척 및 적절한 희석 후 밤새 현탁하여 106 CFU의 현탁액으로서 준비하였으며, 분지 손상(branch injury)을 흉내내기 위해 주입(instilled)(50 μl 부피로 주입(injection))하였다. 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)가 48 시간 동안 배양되도록 하였다.
48 시간 후, 감염된 토끼의 안구를 검사하였다. 모든 동물들(뉴질랜드 알비노 암컷 토끼 24 마리)은, 안과 의사가 확인한 결막염을 제외하고는, 드레이즈(Draize)의 눈 검사(각막 및 홍채 포함)에 따라 검사했을 때, 첫 번째 처리 전에는 어떠한 결과도 나타내지 않았다. 48 시간 후, 결막염의 등급(W. Behrens-Baumann 및 T. Begall, 1997)에 기초하여, 동물들을, 각 그룹에서 유사한 결막 염증 점수를 얻도록 하는 방식으로, 세 그룹(그룹 I, II 및 III)으로 분류하였다.
감염된 눈의 처리는 감염 48 시간 후에 시작되었다. 그룹 I의 동물들은 정상적인 멸균 생리 식염수로 처리되었다(음성 대조군/비처리 그룹); 그룹 II의 동물들은 ECAS 2로 처리되었다; 그룹 III의 동물들은 오플록사신을 함유하는 상업용 안약 Floxal®로 처리되었다(주입수 중 0.3 %(w/v), 방부제 없음, 양성 대조군). 세 그룹 모두 안구 당 30 μL 처리 용액을 각각 받았다. 이 용액을, 일정에 따라(6일 동안 3 시간마다), 마이크로피펫으로 오른쪽 결막 낭(conjunctival sac) 내로 멸균 주입하고, 안구 전체에 퍼지도록 하여, 몇 초 동안 유지하였다. 왼쪽 눈이 대조군의 역할을 하였다. 이러한 상이한 그룹들에 대한 처리를 표 8에 요약하였다.
표 8: 생체 내 실험 설계
그룹 명칭 농도/설명 투여량
(μl) 		동물들의 수
그룹 I(감염됨/처리받지 않음) 생리 식염수 0.9% 30 8
그룹 II(감염됨/처리받음 - ECAS 2) 전달받은 그대로
(as delivered) 		30 8
그룹 III(감염됨/처리받지 않음 - Floxal®) 오플록사신 0.3% 30 8
안과적 검사
안과적 검사는, 처리 4일째를 제외하고는, 매일 첫 번째 처리 직전에 수행되었다. 주요 파라미터인 결막 충혈증(conjunctival hyperaemia)이, 드레이즈(Draize) 눈 검사(표 9)(J. Draize et al., 1944)에 따라, 각 사분면에 대해 1, 2, 3 또는 4의 등급으로 매겨졌다. 채점은 두 사람에 의해 수행되었다. 왼쪽 눈이 대조군으로 사용되었다. 첫 번째 처리 전 안과 검사 및 최종 안과 검사에서는 각막 및 홍채도 포함되었다.
표 9: 결막 병변의 중증도에 대한 등급을 매기기 위한 가중된 점수 척도
장애(Lesion) 점수
A. 발적(Redness)(눈꺼풀결막(palpebral conjunctiva) 만을 참조함)
혈관이 정상치를 초과하여 명확하게 충혈되었음 1
더욱 확산되고, 더 진한 진홍색이며, 개별 혈관들이 쉽게 식별되지 않음 2
확산된 소고기같은 적색(Diffuse beefy red) 3
B. 결막수종(Chemosis)
정상을 초과하는 부종(swelling)(순막(nictitating membrane) 포함) 1
눈꺼풀의 부분적 외반(eversion)을 동반하는 명백한 부종 2
눈꺼풀이 반쯤 닫힌 상태를 동반하는 부종 3
눈꺼풀이 반쯤 닫힌 상태 내지 완전히 닫힌 상태가 되도록 하는 부종 4
C. 눈물분비(Discharge)
정상과 다른 임의의 양(정상 토끼의 안쪽 안각(canthus)에서 관찰되는 소량은 포함하지 않음)
눈꺼풀, 및 눈꺼풀 바로 옆에 있는 털을 적실 정도로 눈물이 분비됨 2
눈꺼풀, 및 눈 주위의 상당한 영역을 적실 정도로 눈물이 분비됨 3
미생물학적 평가
2일마다, 접종 48 시간 후, 감염된 눈으로부터 스와브(swabs)를 채취하였다. 스와브는 멸균 운반 배지(sterile transport media) 내로 운반(transport)된 후 희석되었고, 스프레드 플레이트 방법(spread plate method)을 사용하여 배양되었다. 회복 한천(recovery agar) 내에 잔류하는 항균제는, 생존 세포들의 회복(recovery)을 인위적으로 저하시킬 수 있다. 이러한 이유로, 잔류 항균 활성이, 아래에서 설명되는 바와 같이, 희석에 의해 불활성화되었다.
0.1 mL의 분취액들이 멸균 완충 식염수 중에 10 배로 순차적으로 희석되었다. Floxal®로 처리된 토끼들로부터의 샘플들이, 완충된 소듐 클로라이드 펩톤 용액(pH 7.0) + 5% Tween + 0.3% 레시틴 + 0.1% 히스티딘 중에서 불활성화되었다. 각 희석액으로부터의 샘플들은, Tryptone Soy 한천에 100 μL를 피펫팅하고 퍼지도록 함으로써, 세 개씩(in triplicate) 플레이팅되었고, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양되었다. CFU의 수가 계수되었다.
결과
동물 당 3개의 플레이트들/희석액의 각각에서 관찰된 군체 형성 단위들(colony-forming units)을 계수하였다. 얻어진 개별적인 CFU 값들은 통계적 평가 전에 로그값으로 변환되었다. 세 개의 처리 그룹들에서 관찰된 LogCFU를 비교하기 위해, 스튜던트의 t-검정(Student's t-test)이 적용되었다. P < 0.05의 유의 수준(significance level)이 채택되었다. 만 휘트니(Mann Whitney)(Wilcoxon's) 시험이 구성 그룹들의 결막에 대한 임상 점수를 비교하기 위해 채택되었다. 통계 분석은 StatgraphicsTM Centurion 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
안과적 평가
접종 24 시간 후 첫 번째 안과 검사를 수행하여, 감염 과정의 시작을 확인하였다. 그 결과를 표 10에 나타냈다.
처리(48 시간) 시작 직전 검사에서 모든 동물들의 결막염의 발생이 확인되었다. 또한, 연구에 동원된 동물들의 각막 및 홍채에서 병리학적 발견이 없음이 확인되었다(표 11).
감염된 눈들은 6번 검사되었다. 요약 점수로 표시된 안과 검사의 결과를 표 10에 나타내었다. 마지막 평가(144 시간) 후 사진 문서화(photographic documentation)가 완료되었다.
모든 시점들에 대한 요약 점수 및 평균 점수를 도 5 및 도 6에 나타내었다.
표 10: 안과적 평가 - 개별 점수
그룹 그룹 내
번호 		번호 24 시간 48 시간 72 시간 96 시간 144 시간 168 시간
대조군
(I)









1 1 1 16 8 6 5 2
2 2 1 9 12 14 6 2
3 3 14 12 6 4 0 0
4 4 8 6 2 8 0 0
5 5 6 5 2 10 3 0
6 6 8 16 14 12 6 1
7 7 4 8 14 11 2 0
8 8 1 8 4 8 1 0
평균 ±
표준편차		 5.38 ± 4.60 10.0 ± 4.24 7.75 ± 5.06 9.13 ± 3.27 2.88 ± 2.53 0.63 ± 0.92
요약 점수 43 80 62 73 23 5
ECAS 2
(II)









1 9 1 16 6 10 0 0
2 10 11 10 14 8 2 1
3 11 5 10 6 5 1 0
4 12 7 12 8 14 3 0
5 13 4 4 2 3 0 0
6 14 7 8 10 7 4 0
7 15 6 6 8 5 3 1
8 16 6 8 8 7 1 0
평균 ±
표준편차		 5.88 ± 2.85 9.25 ± 3.69 7.75 ± 3.45 7.38 ± 3.42 1.75 ± 1.49 0.25 ± 0.46
요약 점수 47 74 62 59 14 2
Floxal ®
(III)









1 17 13 16 11 12 1 0
2 18 6 11 11 9 1 0
3 19 2 10 14 10 2 0
4 20 8 7 7 5 1 0
5 21 11 8 7 6 0 0
6 22 5 10 8 6 2 1
7 23 3 6 5 3 0 0
8 24 1 6 3 5 0 0
평균 ±
표준편차		 6.13 ± 4.29 9.25 ± 3.33 8.25 ± 3.58 7.00 ± 3.02 0.88 ± 0.83 0.13 ± 0.35
요약 점수 49 74 66 56 7 1
표 11: 안과 의사의 검사(Ophthalmologists' control)
그룹 그룹 내
번호 		번호 48 시간 192 시간
결막 홍채 각막 결막 홍채 각막
대조군
(I)






1 1 +++ - - + - -
2 2 ++ - - - - -
3 3 +++ - - - - -
4 4 ++ - - - - -
5 5 ++ - - +* - -
6 6 +++(+) - - - - -
7 7 +++ - - - - -
8 8 +++ - - - - -
ECAS 2
(II)






1 9 ++ - - - - -
2 10 +++ - - - - -
3 11 +++ - - +* - -
4 12 +++ - - - - -
5 13 ++ - - - - -
6 14 ++- +++ - - - - -
7 15 ++-+++ - - - - -
8 16 ++ - - - - -
Floxal ®
(III)






1 17 ++-+++ - - - - -
2 18 +++ - - - - -
3 19 +++(+) - - - - -
4 20 +++ - - - - -
5 21 +++ - - - - -
6 22 +++ - - - - -
7 23 +++(+) - - - - -
8 24 + - - - - -
*: 이 토끼는 (168h)에 의해 평가되었을 때 이미 "0"의 점수를 받았다. 국소 발견에 대한 평가는 2명의 수의사 팀에 의해 독립적으로 수행되었고(24, 48, 72, 96, 144, 168 시간), 완전한 평가는 안과 의사에 의해 수행되었다(192 시간). 이러한 불일치는, 아마도, 이들 평가자들에 의해 설정된 기준의 차이로 인한 것이다.
ECAS 2 및 Floxal® 처리 둘 다, 96 시간 후 증상이 증가한 것으로 나타난 대조군에 비해, 감염 후 시간 동안 증상이 감소한 것으로 나타났다. 임상 점수 결과(표 10)에 기초할 때, 처리 첫날 이후(72 시간), 세 그룹 모두에서, 충혈, 결막수종 및 눈물분비의 증상이 약간 감소한 것으로 추정된다.
처리 2일 후에(96 시간), 대조군 그룹과는 대조적으로, ECAS 2(II) 및 Floxal®(III) 그룹들에서 결막수종의 진행이 관찰되지 않았다(표 12). 두 처리 그룹들(II 및 III) 둘 다에서 결막수종은 감소된 범위에 있었다.
처리 4일 후, ECAS 2 그룹은 4/8 동물들(8 마리 중 4 마리의 동물들)에서 효과적인 임상적 치료를 보인 반면(점수: 0 내지 1), Floxal® 처리 그룹은 6/8 동물들에서 효과적인 임상적 치료를 보여주었다.
감염 8일 후(6 투여일 후), 완전한 임상적 치료가 ECAS 2 그룹의 6/8 동물들에서 관찰된 반면, Floxal® 처리 그룹에서는, 결막염의 임상적 경미한 증상의 부재가 7/8 동물들에서 관찰되었다. 감염 근절 과정은 비교적 빨랐기 때문에, 더 많은 시점들에서 비교를 수행하는 것이 가능하지 않았다.
표 12: 감염의 근절 단계에서 충혈, 결막수종 및 눈물분비 점수에 대한 점수
그룹 72 시간 96 시간 144 시간
H CH D H CH D H CH D
대조군 39 23 0 35 38 0 16 5 2
ECAS 2 38 24 0 32 27 0 9 5 0
Floxal ® 37 29 0 30 26 0 7 0 0
H - 충혈(hyperaemia), CH - 결막수종(chemosis), D - 눈물분비(discharge)
미생물학적 검사
처리 2일 후(96 시간), ECAS 2를 사용한 처리는 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 수를, 처리 시작 시점에 비해 대략 1.2 log CFU 만큼 감소시켰다(도 7). 이러한 감소는, 주로 데이터의 높은 변동성으로 인해, P = 0.05(P = 0.2679)에서 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 통계적으로 유의하지 않았다. 스와브(swabs)는 2/8 토끼들에서 음성이었다(표 13).
처리 2일 후(96 시간), Floxal®은, 처리 시작시 측정된 계수(counts)에 비해, 대략 1.6 log CFU 만큼의 감소를 발생시켰다(도 7). 이러한 감소는, P = 0.05(P = 0.0768)에서, 처리되지 않은 대조군과 비교하여 통계적으로 유의하지 않았다. 이 경우에도, 결과 데이터의 변동성이 상당하였다. 스와브는 3/8 토끼들에서 음성이었다.
표 13: 안구 스와브(ocular swabs)의 미생물학적 검사
그룹 번호 48 시간 96 시간 144 시간
CFU log CFU CFU log CFU CFU log CFU
대조군
(I)
　
　
　
　
　
　
　 		1 8958 3.95 1517 3.18 585 2.77
2 19250 4.28 2440 3.38 1 0
3 10458 4.02 221 2.34 1 0
4 7271 3.86 244 2.38 1 0
5 9333 3.97 16667 4.22 1 0
6 515 2.71 1065 3.03 1 0
7 7650 3.88 9967 3.99 1 0
8 2850 3.45 1018 3.01 1 0
평균 ±
표준편차		 3.77 ± 0.48 3.20 ± 0.67 0.35 ± 0.98
ECAS 2
(II)
　
　
　
　
　
　
　 		9 44250 4.65 15333 4.18 1 0
10 5909 3.77 15983 4.20 1 0
11 3342 3.52 1 0 1 0
12 48167 4.68 55 1.74 1 0
13 658 2.82 6800 3.83 1 0
14 1428 3.15 5017 3.70 1 0
15 3925 3.59 42 1.62 1 0
16 676 2.83 1 0 1 0
평균 ±
표준편차		 3.62 ± 0.73 2.41 ± 2.72 0.0
Floxal ®
(III)
　
　
　
　
　
　
　		 17 15025 4.18 4750 3.67 1 0
18 5683 3.75 43 1.63 1 0
19 6517 3.81 1933 3.28 1 0
20 4217 3.63 750 2.87 1 0
21 5050 3.70 1 0 1 0
22 10433 4.02 9583 3.98 1 0
23 58 1.76 1 0 1 0
24 6608 3.82 1 0 1 0
평균 ±
표준편차		 3.58 ± 0.76 1.93 ± 1.74 0.0
결론
이 조사에서는, 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 의해 유도된 결막염을 갖는 토끼를 사용하여, Floxal®과 비교하여 ECAS 2의 활성을 분석하는 데 중점을 둔다. 효능 연구는, 임상적 단리물인 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus) DOC 845/1의 로그 단계 배양으로 감염된 어린 뉴질랜드 알비노 암컷 토끼들의 오른쪽 안구에서 수행되었다. 항결막염 효능은, 각 그룹의 증상 및 점수를 모니터링하여 평가되었다. 1일, 2일, 3일, 4일, 6일 및 7일에 안과적 평가를 수행하였고, 평균 세균 수에 대한 스와브 시험을 2일마다 수행하였다.
ECAS로 처리된 그룹에서는, 5일(96 시간) 이후부터 구별되는 상당한 처리 효과가 있었다. ECAS 2 및 Floxal® 처리 그룹들 둘 다에서, 대조군 그룹에 비해 결막 점수가 임상적으로 감소하였다.
7일(144 시간)에 등록된 임상 점수 결과는, 세균 제거를 달성하는 데 있어서, 처리된 그룹과 처리되지 않은 그룹 간에 명확한 차이를 나타냈다.
또한, ECAS 2 그룹에서 국소적 불내성(local intolerance)의 근거는 관찰되지 않았다.
수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)에 대한 생체 내 활성
수도모나스 아에루기노사는 콘택트 렌즈 관련 궤양성(ulcerative) 사례로부터 가장 통상적으로 단리되는 병원체들 중 하나이다. 수도모나스 아에루기노사에 감염된 환자는 중증 궤양을 나타내며, 다른 병원균에 의한 감염 환자보다 더 광범위한 처리가 필요한 경우가 많다. 수도모나스 아에루기노사 감염 동안의 각막 파괴는 빠르고, 천공 및/또는 시력 상실은 24 시간 이내에 가능하다.
세균의 간질내 주입(intrastromal injection)은, 접종 경로 측면들에 있어서, 인간 각막염의 가장 흔한 형태와 유사하지 않다. 각막 표면으로부터 조직으로의 박테리아에 의한 침입은, 감염을 개시하는 더욱 자연스러운 수단이다. 그러나, 국소 접종(topical inoculations)은 종종 감염을 일으키지 못하거나, 부정확한 방식으로 감염을 일으킨다(조직 내 박테리아 수의 큰 변동을 일으킴)(O'Callaghan et al., 1999).
토끼 각막은 수 많은 안구 연구에 대한 표준 모델이 되었기 때문에, 그 데이터는 인간 각막염 처리에 대해 확대적용될 수 있다(O'Brien et al., 2003). 실험적인 박테리아 각막염에 대한 연구는, 조직 손상이 박테리아 숙주 인자들의 조합에 의해 매개된다는 것을 실증하였다.
이 연구의 목적은 실험적인 각막염에서 ECAS의 효과를 평가하는 것이었다. 간질내(intrastromal) 수도모나스 아에루기노사를 토끼 15 마리의 오른쪽 눈에 투여하였다. 토끼들은 3개의 처리 그룹들(n = 5)로 동일하게 나뉘었다: 식염수(대조군 그룹 I), ECAS 2(시험 제품 그룹 II) 및 Floxal®(참조 그룹 III).
수도모나스(Pseudomonas)에 감염된 각막의 처리는, 임상 징후에 기초하여, 감염 6 시간 후 시작되었다. 처리 제품들은 60 분마다 투여되어, 총 19 회 투여되었다. ECAS 처리된 감염되지 않은 토끼의 평가를 위해, 그룹 IV에서 동일한 처리 일정이 적용되었다.
그룹 I(감염되었으나 처리되지 않았음 - I): 생리 식염수로 처리됨
그룹 II(감염되었고 처리됨 - II): 동물들이 ECAS 2로 처리되었다. 40 μl의 ECAS 2를 일정에 따라 마이크로피펫을 사용하여 오른쪽 결막 낭에 멸균 주입하였다. 눈꺼풀을 10 초 내지 15 초 동안 부드럽게 닫았다. 왼쪽 눈이 대조군의 역할을 하였다.
그룹 III(감염되었고 처리됨 - III): 동물들은 일정에 따라 마이크로피펫을 사용하여 오른쪽 결막 낭 내로 멸균 주입된 40 μl 부피의 Floxal®에 의한 처리되었다. 눈꺼풀을 10 초 내지 15 초 동안 부드럽게 닫았다. 왼쪽 눈이 대조군의 역할을 하였다.
그룹 IV(감염되지 않았으나 처리됨 - IV): 동물들은 일정에 따라 마이크로피펫을 사용하여 오른쪽 결막 낭 내로 멸균 주입된 40 μl의 ECAS 2로 처리되었다. 눈꺼풀을 10 초 내지 15 초 동안 부드럽게 닫았다. 왼쪽 눈이 대조군의 역할을 하였다.
첫 번째 처리 직전, 접종 후 6, 17 및 19 시간 후에, 감염 발달을 평가하기 위해 세극등(slit lamp)으로 눈을 검사하였다. 마지막 적용 1 시간 후, 토끼들을 티오펜탈 과다 투여로 희생시키고, 각막을 수집하여 박테리아 수를 측정하였다.
미생물학적 평가
각막을 무균상태로 제거하고, 해부하고, 튜브로 옮기고, 무게를 재고, 여러 조각으로 잘랐다. 조직들(tissues)은 0.5 mL의 멸균 포스페이트 완충 식염수에서 30 초 동안 20,000 rpm의 조직 균질화기에 의해 얼음 조에서 2회 균질화되었고, 분취액들은 멸균 완충 소듐 클로라이드 펩톤 용액에 10 배로 순차적으로 희석되었다. 참조 제품으로 처리된 동물들은, 잔류 참조 제품의 비활성화를 위해, 완충된 소듐 클로라이드 펩톤 용액 + 5% Tween + 0.3% 레시틴 + 0.1% 히스티딘 중에 순차적으로 희석되었다. 각 희석액으로부터의 샘플들을 Tryptone Soy 한천(TSA) 및 세트리미드(Cetrimid) 한천에 100 μL를 피펫팅하고 퍼지게 하여, 세 개씩(in triplicate) 플레이팅하였고, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 생존 가능한 CFU가 계수되었다. 생존 가능한 수도모나스 아에루기노사의 수는 각막 100 mg 당으로 표현되었다(표 14 및 도 8).
감염 과정이 눈 구조 내에만 위치되어 있는지를 확인하고, 2차 오염을 배제하기 위해, 모든 동물들로부터, 감염 10 시간 후에, 결막 낭으로부터 스와브를 수집하였다.
표 14: 마지막 처리 후 1 시간에서의 각막의 미생물학적 검사의 결과
플레이트 당 CFU 각막 당 CFU
번호 각막
(mg) 		TSA TSA 세트리미드 희석 CFU/1mL-각막 균질화물 CFU/100 mg-각막 균질화물 Log CFU/100 mg-각막 균질화물
1/1 0.0253 0 0 0 1 <10 <40 <1.6
1/2 0.025 77 112 85 102 91 x103 364 x103 5.56
1/3 0.0313 55 48 43 102 49 x103 157 x103 5.19
1/4 0.0358 23 16 10 104 16x105 45 x105 6.65
1/5 0.0282 58 48 39 104 48 x105 170 x105 7.23
2/1 0.0402 150 150 168 102 156 x103 388 x103 5.59
2/2 0.037 74 45 38 102 52 x103 141 x103 5.15
2/3 0.0477 24 15 13 102 17 x103 36 x103 4.56
2/4 0.0386 0 0 0 1 <10 <26 <1.41
2/5 0.0591 0 0 0 1 <10 <17 <1.23
3/1 0.0346 0 0 0 1 <10 <29 <1.46
3/2 0.0406 0 0 0 1 <10 <25 <1.39
3/3 0.0297 0 0 0 1 <10 <34 <1.53
3/4 0.0266 0 0 0 1 <10 <38 <1.58
3/5 0.037 0 0 0 1 <10 <27 <1.43
4/1 0.0515 0 0 0 1 <10 <19 <1.28
4/2 0.0338 0 0 0 1 <10 <30 <1.48
4/3 0.0356 0 0 0 1 <10 <28 <1.45
4/4 0.0331 0 0 0 1 <10 <30 <1.48
4/5 0.0387 0 0 0 1 <10 <26 <1.41
수도모나스 아에루기노사에 감염된 토끼 눈을, ECAS 2로, 감염 6 시간 후 내지 19 시간 후에 처리함으로써, 수도모나스 아에루기노사 유기체의 수가, 처리되지 않은 대조군과 비교하여 대략 1.6 log CFU/100 mg-각막 만큼 감소하였다(4.4 x 106 CFU/100 mg-각막으로부터 1.1 x 105 CFU/100 mg-각막으로 감소하였음)(도 8). ECAS2 처리 후 박테리아의 % 잔류 수는 대조군 그룹의 2.6%였다.
Floxal®은 박테리아 수를 4.4 x 106 CFU/100 mg-각막으로부터 30.6 CFU/100 mg-각막으로 감소시켰으며, 즉, 식염수 대조군에 비해 0.1% 미만에 해당하는 박테리아의 % 잔류 수로 감소시켰다. 비록 Floxal®에 의해 발생된 박테리아 % 감소율은 ECAS 2에 의한 것보다 약간 높았지만, Floxal® 처리 그룹과 ECAS 2 처리 그룹 간의 차이는, P = 0.05에서, 통계적으로 유의하지 않았다.
이 결과는, 박테리아 각막염 처리에서의 ECAS 2의 큰 처리 능력을 강하게 입증한다.
본 발명은 다음 항목들을 포함한다:
항목 1. 1 mg/l 내지 500 mg/l, 바람직하게는 100 mg/l 내지 450 mg/l의 총 염소 함량;
2 g/l 내지 8 g/l, 바람직하게는 3 g/l 내지 7 g/l의 클로라이드 함량;
+150 mV 내지 +1,350 mV, 바람직하게는 +600 mV 내지 +1,100 mV, 더 바람직하게는 +700 mV 내지 +1,050 mV, 더욱더 바람직하게는 +700 mV 내지 +1,000 mV의 산화환원 전위;
20 mOsm/kg 내지 800 mOsm/kg, 바람직하게는 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 더 바람직하게는 250 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg의 오스몰농도(osmolality);
6.0 내지 7.8, 바람직하게는 7.1 내지 7.4의 pH 값; 및
선택적으로(optionally) 적어도 하나의 붕산(염) 및/또는 적어도 하나의 인산(염);을 포함하는
전기화학적 활성화 염 용액(electrochemically activated salt solution: ECAS).
항목 2. 항목 1에 있어서, 상기 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)은, 20 ℃에서, 밀폐된 고밀도 폴리에틸렌(HDPE) 용기에 보관될 때, 1년에 걸쳐(over), 바람직하게는 2년에 걸쳐 안정한, 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 3. 항목 1 또는 2에 있어서, 적어도 하나의 인산(염)을, 바람직하게는 0.01 g/l 내지 1,000 g/l, 더 바람직하게는 0.1 g/l 내지 100 g/l의 양으로, 포함하는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 4. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 붕산(염)을, 바람직하게는 0.01 g/l 내지 1,000 g/l, 더욱 바람직하게는 0.1 g/l 내지 500 g/l의 양으로, 포함하는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 5. 항목 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 하이포클로라이트 이온 및/또는 하이포클로러스산을, 특히 1 mg/l 내지 10,000 mg/l의 총 농도, 더욱 바람직하게는 10 mg/l 내지 1,000 mg/l의 총 농도로, 함유하는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 6. 항목 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 클로라이트 이온 및 클로레이트 이온의 총 함량이 10 mg/l 미만인, 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 중금속 및 중금속 이온의 총 함량이 10 μg/g 미만, 바람직하게는 6 μg/g 미만이고, 바람직하게는 중금속 함량 및 중금속 이온 함량이 각각 개별적으로 바람직하게는 0.5 μg/g 미만인, 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 폴리머와 같은, 적어도 하나의 점도증가제를 더 포함하는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 9. 항목 8에 있어서, 상기 폴리머는, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 다당류(예를 들어, 글루코오스아미노글리칸), 폴리비닐 알코올, 폴리비닐 피롤리돈, 실리카 겔, 및 마그네슘 및/또는 알루미늄의 메타실리케이트로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS) .
항목 10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 약물과 같은, 추가적인 치료 활성 작용제(therapeutically active agent)를 함유하지 않는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 11. 항목 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 추가적인 방부제(preservative)를 함유하지 않는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 12. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)을 포함하는 약제학적 제형(pharmaceutical preparation).
항목 13. 항목 12에 있어서, 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하는 약제학적 제형.
항목 14. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 전기화학적 활성화 염 용액으로서, 예를 들어 박테리아, 진균(fungi) 및/또는 바이러스에 의한, 감염(infections)을 처리하는데 사용하기 위한 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 15. 항목 14에 있어서, 상기 박테리아 및/또는 진균은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 스타필로코쿠스 에피데미디스(Staphylococcus epidermidis), 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes), 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼길루스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 아시네토박터 피티(Acinetobacter pitii)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 16. 항목 14에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 엔테로바이러스 및 헤르페스바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus) 1 및 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 17. 항목 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 안염(eye infections) 처리에 사용하기 위한 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 18. 항목 14 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 결막염(conjunctivitis), 특히 세균성 결막염, 각막염(keratitis), 안검염(blepharitis), 및/또는 안구내염(endophthalmitis)을 처리하는데 사용하기 위한 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 19. 항목 14 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 결막염(conjunctivitis), 특히 세균성 결막염을 처리하는데 사용하기 위한 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 20. 항목 14 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 눈(eye), 누낭(lacrimal sac), 및/또는 눈꺼풀(lid)에 국소적으로(topically) 투여되는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 21. 항목 14 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 감염 직후에, 눈에 투여되는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
항목 22. 항목 1 내지 11 중 어느 하나에 따른 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)의 제조 방법으로서, 상기 제조 방법은:
(i) 전기분해 반응기 내에서 클로라이드 수용액을 전기분해하는 단계;
(ii) 선택적으로(optionally), 적어도 하나의 붕산(염) 및/또는 적어도 하나의 인산(염)을 첨가하는 단계; 및
(iii) 선택적으로(optionally), 주입수(water for injection)를 첨가하여 상기 ECAS를 희석시키는 단계;를 포함하는,
제조 방법.
항목 23. 항목 22에 있어서, 상기 전기분해 반응기는 실린더형 캐소드를 포함하고, 상기 실린더형 캐소드는 실린더형 애노드 내에 동축으로 장착되는, 제조 방법.
항목 24. 항목 22 또는 23에 있어서, 상기 클로라이드 용액은 최대 10 g/l의 농도를 갖는, 제조 방법.
항목 25. 항목 22 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 전기분해는, 10.0 A 내지 30.0 A의 전류에서, 바람직하게는 15.0 A 내지 20.0 A의 전류에서, 수행되는, 제조 방법.
항목 26. 항목 22 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 전기분해 반응기는 연속 전기분해를 위해 구성되는, 제조 방법.

Claims (15)

1 mg/l 내지 500 mg/l, 바람직하게는 100 mg/l 내지 450 mg/l의 총 염소 함량;
2 g/l 내지 8 g/l, 바람직하게는 3 g/l 내지 7 g/l의 클로라이드 함량;
+150 mV 내지 +1,350 mV, 바람직하게는 +600 mV 내지 +1,100 mV, 더 바람직하게는 +700 mV 내지 +1,050 mV, 더욱더 바람직하게는 +700 mV 내지 +1,000 mV의 산화환원 전위;
20 mOsm/kg 내지 800 mOsm/kg, 바람직하게는 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 더 바람직하게는 250 mOsm/kg 내지 350 mOsm/kg의 오스몰농도(osmolality);
6.0 내지 7.8, 바람직하게는 7.1 내지 7.4의 pH 값; 및
선택적으로(optionally) 적어도 하나의 붕산(염) 및/또는 적어도 하나의 인산(염);을 포함하는
전기화학적 활성화 염 용액(electrochemically activated salt solution: ECAS).
제 1 항에 있어서, 적어도 하나의 인산(염)을, 바람직하게는 0.01 g/l 내지 1,000 g/l, 더 바람직하게는 0.1 g/l 내지 100 g/l의 양으로, 포함하는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 적어도 하나의 붕산(염)을, 바람직하게는 0.01 g/l 내지 1,000 g/l, 더욱 바람직하게는 0.1 g/l 내지 500 g/l의 양으로, 포함하는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 하이포클로라이트 이온 및/또는 하이포클로러스산을, 특히 1 mg/l 내지 10,000 mg/l의 총 농도, 더욱 바람직하게는 10 mg/l 내지 1,000 mg/l의 총 농도로, 함유하는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 유기 또는 무기의, 폴리머와 같은, 적어도 하나의 점도증가제를 더 포함하는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 약물과 같은, 추가적인 치료 활성 작용제(therapeutically active agent)를 함유하지 않는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 방부제(preservative)를 함유하지 않는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)을 포함하고, 바람직하게는 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제를 더 포함하는, 약제학적 제형(pharmaceutical preparation).
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 전기화학적 활성화 염 용액으로서, 예를 들어 박테리아, 진균(fungi) 및/또는 바이러스에 의한, 감염(infections), 바람직하게는 안염(eye infections)을 처리하는데 사용하기 위한 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 9 항에 있어서, 상기 박테리아 및/또는 진균은 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 대장균(Escherichia coli), 스타필로코쿠스 에피데미디스(Staphylococcus epidermidis), 수도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus), 엔테로박터 아에로제네스(Enterobacter aerogenes), 스트렙토코쿠스 안지노수스(Streptococcus anginosus), 스트렙토코쿠스 파이오제네스(Streptococcus pyogenes), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 아스퍼길루스 브라실리엔시스(Aspergillus brasiliensis), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 및 아시네토박터 피티(Acinetobacter pitii)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 9 항에 있어서, 상기 바이러스는 아데노바이러스, 엔테로바이러스 및 헤르페스 바이러스(예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus) 1 및 2)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 결막염(conjunctivitis), 특히 세균성 결막염, 각막염(keratitis), 안검염(blepharitis), 및/또는 안구내염(endophthalmitis)을 처리하는데 사용하기 위한 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 9 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 감염 직후에, 눈에 투여되는 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS).
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 전기화학적 활성화 염 용액(ECAS)의 제조 방법으로서, 상기 제조 방법은:
(i) 전기분해 반응기 내에서 클로라이드 수용액을 전기분해하는 단계로서, 바람직하게는 상기 전기분해 반응기는 실린더형 캐소드를 포함하고, 상기 실린더형 캐소드는 실린더형 애노드 내에 동축으로 장착되는, 단계;
(ii) 선택적으로(optionally), 적어도 하나의 붕산(염) 및/또는 적어도 하나의 인산(염)을 첨가하는 단계; 및
(iii) 선택적으로(optionally), 주입수(water for injection)를 첨가하여 상기 ECAS를 희석시키는 단계;를 포함하는,
제조 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 전기분해는, 10.0 A 내지 30.0 A의 전류에서, 바람직하게는 15.0 A 내지 20.0 A의 전류에서, 수행되는, 제조 방법.
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