KR20110104367A

KR20110104367A - 무보존제 안과용 조성물

Info

Publication number: KR20110104367A
Application number: KR1020100023471A
Authority: KR
Inventors: 박상준; 이진성; 이우영; 임광진
Original assignee: 삼천당제약주식회사
Priority date: 2010-03-16
Filing date: 2010-03-16
Publication date: 2011-09-22

Abstract

본 발명은 벤잘코늄클로라이드 등의 보존제를 함유하지 않는 안과용 조성물에 관한 것이다. 특히 히알루론산, 올로파타딘, 펙소페나딘, 플루오로메톨론 및 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성성분 0.005% 내지 5.0%, 완충제 0.001% 내지 12%, 등장화제 0.01% 내지 10%, 안정화제 0.01% 내지 5%, pH 조절제 0.02% 이하, 및 잔량의 물을 포함하는 안과용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 안과용 조성물은 벤잘코늄클로라이드 등의 보존제를 함유하지 않으므로, 우수한 항균 성능으로 충분한 보존력을 유지하면서 점안 시 결막상피 세포의 손상 등의 문제를 예방하여 눈에 안전한 효과를 달성할 수 있다.

Description

무보존제 안과용 조성물 {OPHTHALMIC COMPOSITIONS WITHOUT PRESERVATIVES}

본 발명은 무보존제 안과용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 보존제를 함유한 점안제와 비교하여 동등 이상의 보존 효과와 눈 안전성이 확보된 안과용 조성물에 관한 것이다.

눈에 직접적으로 적용되는 인공눈물, 점안제 등의 안구용 조성물은 멸균을 위하여 다양한 보존제를 포함한다.

그러나, 보존제에 관한 많은 연구에 따르면, 벤잘코늄클로라이드 등의 보존제는 세포막 형질막에 세포융해 효과를 갖고 있으며, 결막 및 각막 미세융모 및 표면세포막에 손상을 줄 수 있다고 알려져 있다. 또한, 실험실 연구에서는 배양된 인체 결막 및 각막 세포에 벤잘코늄클로라이드의 농도에 비례해서 독성을 보였으며, 많은 인체 혹은 동물연구에서 벤잘코늄클로라이드를 함유한 녹내장약제의 만성사용이 결막의 염증성 변화와 관련됨이 밝혀졌다. 특히, 현재 대부분의 점안제는 보존제를 함유하고 있어 예민한 눈에 자극을 주기 쉬우며, 장기간 사용 시 결막 또는 각막 상피의 변화가 치유를 늦추거나 시력감소를 가져올 수 있다.

일반적인 안과용 조성물에 쓰이는 보존제로는 벤잘코늄클로라이드, 염화벤제토늄과 같은 4차 암모늄염; 메틸 파라옥시벤조에이트 및 에틸 파라옥시벤조에이트와 같은 알킬 파라옥시벤조에이트; 벤질 알코올, 페니틸 알코올, 소르브산 및 그의 염, 티메로살 및 클로로부탄올로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상이 선택되고 있다. 상기 보존제들은 전체 조성물에 대하여 0.002 내지 0.1%(w/v)의 함량으로, 더욱 바람직하게는 0.002 내지 0.05%(w/v)의 함량으로 포함할 수 있는데, 만일 보존제의 농도가 0.002%(w/v)미만이면 점안제의 살균작용이 약하고, 0.05%(w/v)를 초과하면 점안제의 사용 빈도가 많아져 각막상피 손상을 가져올 수 있다.

또한, 보존제를 함유한 점안액은 특히 눈의 건조증을 위해 자주 사용할 뿐 아니라 장시간 동안 사용해야 하기 때문에 예민한 눈에 자극을 주기 쉬우므로 이로 인해 각막의 손상을 유발할 수 있다. 특히, 일반 점안액에는 세균의 성장을 억제하기 위해 보존제를 첨가하는데, 벤잘코늄클로라이드가 가장 흔히 사용되고 있다. 벤잘코늄클로라이드는 세포막에서 친지질성 성분으로 존재하면서 전해질이 세포내로 들어갈 수 있도록 세포막의 성질을 바꾸어 세포내의 전해질 농도에 변화를 초래하여 세포의 손상을 초래하며, 세포막에 작용하여 이온이나 물질의 투과성을 변화시켜 결막이나 각막의 세포조직에 독성을 초래할 수 있다.

따라서, 우수한 항균 성능으로 충분한 보존력을 유지하면서 점안 시 결막상피 세포의 손상 및 변형을 초래하지 않으며 눈에 대한 충분한 안전성이 확보된 안구용 조성물 개발에 대한 연구가 필요하다.

본 발명은 안과용 조성물에 있어서, 벤잘코늄클로라이드 등의 보존제를 함유하지 않으면서도 우수한 항균 성능으로 충분한 보존 효과를 갖고, 결막상피 세포의 손상 및 변형을 초래하지 않으며 우수한 각막 상피 치유 등의 효과를 갖는 안과용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 히알루론산, 올로파타딘, 펙소페나딘, 플루오로메톨론 및 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성성분 0.005% 내지 5.0%, 완충제 0.001% 내지 12%, 등장화제 0.01% 내지 10%, 안정화제 0.01% 내지 5%, pH 조절제 0.2% 이하, 및 잔량의 물을 포함하는 안과용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 벤잘코늄클로라이드 등의 보존제를 함유하지 않는 무보존제 안과용 조성물에 있어서, 히알루론산 등의 주성분과 함께 여러 가지의 부형제에 대한 배합 가능성 및 개량 효과에 대하여 시험한 결과, 히알루론산, 올로파타딘, 펙소페나딘, 플루오로메톨론 또는 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염 등의 활성성분과 완충제, 등장화제, 안정화제, pH 조절제, 및 물을 특정 조성 범위로 포함함으로써 점안액의 보존 효과 및 결막이나 각막 상피 치유 등에 매우 우수한 효과를 얻을 수 있음에 기초하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 주성분으로 이온성 중합체인 히알루론산, 올로파타딘, 펙소페나딘, 플루오로메톨론 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염을 처방하고, 약제학적 허용 가능한 부형제를 특정량 배합 사용함으로써, 보존제를 첨가하지 않고 점안제 조성물의 개선에 의해 점안액의 보존효과, 보존제가 결막 및 각막 세포에 미치는 영향을 감소시켜 기존의 보존제를 함유한 제제에 비해 월등한 치료효과를 보이는 안과용 조성물에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 히알루론산, 올로파타딘, 펙소페나딘, 플루오로메톨론 및 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성성분 0.005% 내지 5.0%, 완충제 0.001% 내지 12%, 등장화제 0.01% 내지 10%, 안정화제 0.01% 내지 5%, pH 조절제 0.2% 이하, 및 잔량의 물을 포함하는 안과용 조성물에 관한 것으로, 벤잘코늄클로라이드 등의 보존제를 함유하지 않으면서도 기존의 보존제를 함유한 점안제와 비교하여 동등 이상의 보존 효과와 눈 안전성을 확보할 수 있는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 안과용 조성물에서 활성성분으로는 히알루론산, 올로파타딘, 펙소페나딘, 플루오로메톨론 및 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 이 때, 히알루론산 또는 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염은 쇼그렌 증후군, 스티븐슨-존슨증후군, 안구건조증후군 등의 내인성 질환과 수술 후 약제성, 외상, 하드콘택즈 렌즈 착용 등에 의한 외인성 질환에 의한 각결막 상피장해 치료보조제로서 사용될 수 있다. 또한, 올로파타딘 또는 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염은 넓은 농도 범위에서 화학전달물질 유리의 저해에 의한 결막염의 비만세포 안전화 작용과 기관 말단의 H1수용체 길항에 의한 항히스타민 작용의 이중 작용으로 알레르기성 결막염으로 인한 증상치료제로서 효과적으로 사용될 수 있다. 펙소페나딘 또는 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염은 심장 장애가 없는 제3 세대 항히스타민 제제로서 작용시간이 더 길며 항히스타민 작용뿐만 아니라 비만세포의 안정화를 통한 강력한 약효를 지니고 있어 알레르기성 질환 등의 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있다. 플루오로메톨론 또는 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염은 외안부 및 전안부의 염증성 질환, 예컨대, 안검염, 결막염, 각막염, 공막염, 상공막염, 홍채염, 홍채모양염, 포도막염, 수술 후 염증 등의 치료제로서 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 안과용 조성물에 있어서, 상기 활성성분은 전체 조성물에 대하여 0.005% 내지 5.0%(w/v), 바람직하게는 0.01% 내지 2.0%(w/v), 좀더 바람직하게는 0.01% 내지 1.0%(w/v)의 함량으로 사용할 수 있다.

또한, 전술한 바와 같이, 본 발명에서는 주성분으로 히알루론산 등을 사용하고 일체의 보존제를 함유하지 않으면서도, 우수한 보존 효과나 결막 및 각막 세포 등에 미치는 영향 등을 파악하여 무보존 점안액의 효과를 입증하였다. 즉, 주성분으로 히알루론산 또는 그 약제학적으로 허용 가능한 염, 예컨대 히알루론산 나트륨을 사용하고, 점안제에 사용 가능한 부형제를 최적의 중량비로 혼합 사용하여 점안액의 보존효과 및 상술한 히알루론산 나트륨 함유 점안제의 고유한 효과를 극대화시켰다.

본 발명의 조성물은 0.5 내지 10 cps, 바람직하게는 0.5 내지 5 cps, 가장 바람직하게는 1 내지 2 cps의 점도를 가질 수 있다. 상대적으로 낮은 점도는 편안한 사용감을 제공하며 시야 흐림을 유발하지 않고, 제조, 이동 및 적재 동작 도중 쉽게 가공되는 것을 보장할 수 있다. 특히, 점도가 낮게 되면 안구 주위에 머무름 시간이 짧아지게 되어 약효를 제대로 발휘하지 못하게 되어 상기 점도가 0.8 cps 이상인 것이 바람직하고, 점도가 높게 되면 일정량의 투여가 곤란하게 되고, 또한 눈 주위에 부착하여 불쾌한 끈적임이 발생하여 3 cps 이하인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 조성물의 pH는 4.5 내지 8.5가 될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 8, 좀더 바람직하게는 6 내지 7.5가 될 수 있다. 수성 안과용 점안제로서 이용하는 경우에는 pH가 4.5 이상이 바람직하고, pH가 4.5 미만인 경우에는 눈에 대한 자극이 너무 강하게 될 우려가 있다. 또한 pH 8.5를 초과하면 생리적 pH 범위를 벗어나 바람직하지 않다.

본 발명에 따른 조성물의 몰삼투압 농도(Osmolality)는 안구내의 유체와 동일한 몰삼투압 농노의 조성물이 바람직하다. 몰삼투압 농도는 약 150 mOsm/kg 내지 450 mOsm/kg, 더욱 바람직하게는 약 280 mOsm/kg 내지 약 380 mOsm/kg의 범위이다. 삼투압이 안과용 제제에 널리 사용되는 범위 내라면 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 안과용 조성물에서 상기 활성성분과 함께 소정의 범위로 사용될 수 있는 부형제로는 완충제, 등장화제, 안정화제, 및 pH 조절제 등을 들 수 있다.

상기 완충제는 점안제의 산도 또는 알칼리도를 조정하는데 필요한 것으로 약제 조성물이 자극을 일으키지 않고 눈에 의해 수용되기 위해서는 포유동물의 눈물과 같거나 비슷한 pH를 가진 등장액인 것이 중요하다. 본 발명의 안과용 수성 액제는 pH 를 소정의 범위로 유지하기 위해 완충제를 배합할 수 있다. 그 밖에, 본 발명의 목적에 반하지 않는 한, 안과용 조성물에 범용되는 성분을 배합해도 된다. 다만, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 측면에서 상기 완충제로는 아미노카프론산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨, 붕산, 붕사, 구연산 및 구연산나트륨 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 완충제는 전체 조성물에 대하여 0.001% 내지 12%(w/v), 바람직하게는 0.01% 내지 10%(w/v), 좀더 바람직하게는 0.1% 내지 1.0%(w/v)의 함량으로 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물에서 등장화제는 점안제의 생리적 전해질의 등장성을 조절하는 역할을 한다. 상기 등장화제로는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 및 글리세린 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 이 중에서 염화나트륨, 염화칼륨, 또는 그의 혼합물 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하다. 이렇게 염화나트륨과 염화칼륨의 혼합물을 등장화제로 사용할 경우에는, 상기 염화나트륨과 염화칼륨이 1:0.1 내지 1:1의 중량비, 바람직하게는 0.7:0.1 내지 0.4:0.1의 중량비로 혼합된 것을 사용할 수 있다.

또한, 상기 등장화제는 전체 조성물에 대하여 0.01% 내지 10%(w/v), 바람직하게는 0.01% 내지 5.0%(w/v), 좀더 바람직하게는 0.1% 내지 2.0%(w/v)의 함량으로 사용할 수 있다. 상기 등장화제는 전체 조성물이 안과학적으로 허용 가능한 정도로 150 내지 450 mOsm의 삼투압 농도, 바람직하게는 280 내지 380 mOsm의 삼투압 농도를 갖도록 하는 데 충분한 양으로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물에서 안정화제는 점안제의 안정화를 도모하는 역할을 한다. 상기 안정화제로는 에데트산나트륨 및 과붕산나트륨 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

상기 안정화제는 전체 조성물에 대하여 0.01% 내지 5.0%(w/v), 바람직하게는 0.01% 내지 2.0%(w/v), 좀더 바람직하게는 0.01% 내지 1.0%(w/v)의 함량으로 사용할 수 있다. 점안액의 안정성 확보 측면에서 상기 등장화제는 0.01%(w/v) 이상 포함되는 것이 바람직하고, 과량 사용하게 되면 오히려 점안액의 안정성을 저해할 우려가 있기 때문에 5.0%(w/v) 이하로 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 조성물에서 pH 조절제는 천연 눈물의 pH를 생리적 상태로 조절해 주는 역할을 하며, 첨가되는 pH 조절제의 양에는 특별한 제한이 없지만, 전체 조성물이 바람직한 pH 범위를 가질 수 있는 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 상기 pH 조절제로는 염산, 수산화나트륨, 초산, 및 인산 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에서 pH 조절제는 안과용 조성물의 pH가 4.5 내지 8.5 범위로 되게 조절하는 데 적량으로 사용될 수 있다. 상기 pH 조절제는 전체 조성물에 대하여 0.2%(w/v) 이하의 함량 즉, 0 내지 0.2%(w/v)의 함량으로 첨가할 수 있으며, 좀더 바람직하게는 0.01 내지 0.05%(w/v)의 함량으로 포함할 수 있다.

본 발명의 안과용 조성물은 액제 형태의 점안제가 형성될 수 있도록 용제, 즉, 물을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 용제로는 멸균 정제수 또는 주사용 증류수, 탈이온수 등이 바람직하며, 이의 함량은 제조하고자 하는 점안액의 총 용량에 필요한 양에 맞추어 사용량을 조절할 필요가 있다. 즉, 점안액의 경우에는 전체 점안액 중 상기 활성성분, 완충제, 등장화제, 안정화제, pH 조절제의 함량을 제외한 범위로 용제의 사용량을 조절한다.

또한, 본 발명의 안과용 조성물은 상기의 활성 성분 및 부형제 이외에 계면활성제, 가용화제, 연화제(emollients), 완화제(demulcents), 윤활제 및 이의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

상술한 바와 같이, 바람직한 구현 예에서, 본 발명은 벤잘코늄클로라이드 등의 보존제를 함유하지 않는 무보존 점안액으로 제형화가 가능하다. 특히, 본 발명의 안과용 조성물은 1 내지 30 mL 점안액 용기에 충전된 점안 제제로 제공될 수 있다. 일반적으로 기존의 무보존제로 출시되는 점안제는 1 mL 미만의 1회용 점안제 용기에 충전되어 사용하게 되어있다. 그러나, 이러한 경우 하루에 여러 번 점안해야 치료 효과를 볼 수 있는데, 한 번 사용하고 버리게 되는 한계점이 있어 사용하는 데 불편함이 초래된다. 따라서, 본 발명의 안과용 조성물은 통상의 1회용 점안제에 비해 환자의 순응도를 개선시켰다.

본 발명에 있어서 상기 기재된 내용 이외의 사항은 필요에 따라 가감이 가능한 것이므로, 본 발명에서는 특별히 한정하지 아니한다.

본 발명에 따른 안과용 조성물은 벤잘코늄클로라이드 등의 보존제를 함유하지 않으면서도, 우수한 항균 성능으로 충분한 보존력을 유지하면서 점안시 결막상피 세포의 손상 등의 문제를 예방하여 눈에 대한 우수한 안정성 효과를 확보할 수 있다.

도 1은 대조군(control), 실시예 6, 대조예 6, 및 대조예 8~10의 점안액에 대하여 결막세포에서의 MTT 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 대조군(control), 실시예 6, 대조예 6, 및 대조예 8~10의 점안액에 대하여 결막세포에서의 LDH 수치 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 실시예 6, 대조예 6, 및 대조예 8~10의 점안액에 노출시 결막세포의 미세구조를 나타낸 투과전자현미경 사진이다(A: 실시예 6, B: 대조예 6, C: 대조예 8, D: 대조예 9, E: 대조예 10).

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1~7

하기의 표 1에 나타낸 바와 같은 조성에 따라, 히알루론산나트륨을 함유하는 안과용 수성 액제를 제조하였다. 특히, 보존제로 널리 쓰이는 벤잘코늄 클로라이드를 함유하지 않는 무보존 제제로서, 염화나트륨, 염화칼슘, 붕산, 붕사를 일정 비율로 혼합한 액제를 제조하였다.

각 성분을 정확히 칭량 후, 멸균 조제실에서 조제탱크에 멸균 정제수를 넣고 용해시켰다. 이 용액에 pH 조절제를 넣어 pH를 7.0으로 조절하고, 이 액을 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 멸균, 여과 후 이를 10 mL 점안용기에 충전하고 박킹과 캡으로 밀봉하여 점안액을 제조하였다. 하기 표 1에서 각 성분에 대한 함량 단위는 w/v%이다.

성분	실시예 1	실시예 2	실시예 3	실시예 4	실시예 5	실시예 6	실시예 7
히알루론산나트륨	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
염화나트륨	1.0	0.7	0.6	0.5	0.4	0.3	0.1
염화칼륨	0.2	0.15	0.13	0.1	0.09	0.07	0.02
붕산	10	10	10	10	10	10	10
붕사	1	1	1	1	1	1	1
에데트산나트륨	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
정제수	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
pH조절제 (2M NaOH 또는 HCl)	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
pH	6.98	7.01	7.02	6.99	7.00	7.00	6.99
삼투압 (mosmol/Kg)	360	345	342	335	318	307	295

비교예 1~7

하기의 표 2에 나타낸 바와 같이 조성을 달리한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 안과용 수성 액제를 제조하였다. 하기 표 2에서 각 성분에 대한 함량 단위는 w/v%이다.

성분	비교예 1	비교예 2	비교예 3	비교예 4	비교예 5	비교예 6	비교예 7
히알루론산나트륨	0.01	10	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
염화나트륨	0.3	0.3	-	10	0.3	0.3	-
염화칼륨	0.07	0.07	-	0.1	0.07	0.07	-
붕산	10	10	10	10	-	10	-
붕사	1	1	1	1	-	1	-
에데트산나트륨	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	6	-
정제수	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
pH조절제 (2M NaOH 또는 HCl)	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
pH	7.00	6.97	6.98	6.92	7.03	7.05	6.99
삼투압 (mosmol/Kg)	360	390	43	420	318	372	35

대조예 1~7

하기의 표 3에 나타낸 바와 같은 조성에 따라, 보존제로서 벤잘코늄클로라이드 0.01%(w/v)를 추가로 함유하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1~7과 동일한 방법으로 안과용 수성 액제를 제조하였다. 하기 표 3에서 각 성분에 대한 함량 단위는 w/v%이다.

성분	대조예 1	대조예 2	대조예 3	대조예 4	대조예 5	대조예 6	대조예 7
히알루론산나트륨	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
염화나트륨	1.0	0.7	0.6	0.5	0.4	0.3	0.1
염화칼륨	0.2	0.15	0.13	0.1	0.09	0.07	0.02
붕산	10	10	10	10	10	10	10
붕사	1	1	1	1	1	1	1
에데트산나트륨	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
정제수	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
pH조절제 (2M NaOH)	적량	적량	적량	적량	적량	적량	적량
벤잘코늄클로라이드	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
pH	6.99	7.02	7.00	7.02	7.00	7.00	7.02
삼투압 (mosmol/Kg)	355	340	337	329	315	303	293

대조예 8~10

하기의 표 4에 나타낸 바와 같이, 보존제로서 벤잘코늄클로라이드 0.01%(w/v)를 함유하는 시판제품을 대조예 8~10의 안과용 수성 액제로 준비하였다.

구분	제품명	비고
대조예 8	A사의 0.1% 히알루론산나트륨 함유제제 (일본제품)	벤잘코늄클로라이드 0.01% 함유
대조예 9	B사의 0.1% 히알루론산나트륨 함유제제 (국내제품)	벤잘코늄클로라이드 0.01% 함유
대조예 10	C사의 0.1% 히알루론산나트륨 함유제제 (국내제품)	벤잘코늄클로라이드 0.01% 함유

실험예 1. 보존력시험

상기 실시예 1~7, 비교예 1~7, 및 대조예 1~7에 따른 안과용 수성 액제에 대하여 보존력 시험을 수행하였다.

보존력시험법은 분활반복 투여용기 중에 충전된 제제 자체 또는 제제에 첨가된 보존 효력을 미생물학적으로 평가하는 방법이다. 제제에 시험대상이 되는 균종을 강제적으로 접종, 혼합하고 경시적으로 시험균의 소멸과 생장을 추적하여 보존력을 평가할 수 있다.

먼저, 상기 표 1의 무보존 점안액(실시예 1~7), 표 2의 무보존 점안액(비교예 1~7), 및 표 3의 보존제 함유 점안액(대조예 1~7)에 대하여, 각각의 용기 5 개에 접종균액을 무균적으로 주입하고 균일하게 혼합하였다. 보통 제제 1 mL당 105 ~ 106 개의 생균수가 되도록 접종 혼합하였다. 이들 용기를 차광 하에서 20 ~ 25 ℃로 보존하고, 14 및 28일째에 피검 제제에서 1 mL를 취하여 보존력의 유무를 판단하였다.

보존력의 판정에 대한 평가기준은 하기의 표 5에 따른다. 표 5에 나타낸 바와 같은 시험 결과가 얻어진 경우 보존력이 있다고 판정하였다.

미생물	판정기준
미생물	14일 후	28일 후
세균	접종균수의 0.1%이하	14일후의 수준과 동등하거나 그 이하
진균	접종균수와 같은 수준 또는 그 이하	접종균수와 같은 수준 또는 그 이하

상기 보존력 시험 결과, 실시예 1~7에 따른 무보존 점안액의 세균과 진균 모두에서 보존 효과가 있음을 확인하였고, 보존제가 함유된 대조예 1~7의 점안액과 비교하였을 때 동등 이상의 보존력이 있음을 확인하였다. 그러나, 히알루론산 등의 주성분과 완충제, 등장화제, 안정화제 등의 부형제가 최적 범위로 포함되지 않는 비교예 1~7의 경우에는 세균 및 진균에 대한 보존력 시험 모두에서 접종 균수의 0.1%를 초과하여 보존 효과가 현저히 떨어졌으며, 상기 표 1의 조성물 범위를 벗어날 경우, pH 조절제가 실시예의 점안액보다 과량 들어갔으며, 삼투압이 불안정하였다. 이로써 본 발명에 따른 무보존 점안액의 보존 효과는 보존제를 함유한 점안액과 비교하여 동등 이상임을 입증하였다.

실험예 2. 안전성 시험(무균시험)

상기 실시예 6 및 대조예 6의 안과용 수성 액제와 대조예 8~10의 시판 안약 제품에 대하여 안전성 시험을 수행하였다.

일반적으로 소비자가 사용하는 것을 가정하여 각 점안액을 매일 2~3방울 떨어뜨리고 뚜껑을 닫았다. 시험에 사용되는 채취량에서 초기 검체는 전량 시험에 사용하고, 1주 검체부터는 각 용기에서 1 mL씩 취하여 시험에 사용하였다. 시험기간은 2개월 동안 매주 각 시험군을 검체 일시에 맞춰 10개씩 시험하였다. 외부요인에 인한 오염 우려로 인해서 미생물 한도 실험실에서 무균시험 직접법으로 시험하여 균의 발육 유무를 판단하였다.

이때, 상기 실시예 6 및 대조예 6의 안과용 수성 액제와 대조예 8~10의 시판 안약 제품에 대한 균의 발육 유무 평가 결과는 하기 표 6에 나타낸 바와 같다.

구분	무균시험결과
실시예 6	균의 발육이 인정되지 않음(미발육)
대조예 6	균의 발육이 인정되지 않음(미발육)
대조예 8	균의 발육이 인정되지 않음(미발육)
대조예 9	균의 발육이 인정되지 않음(미발육)
대조예 10	균의 발육이 인정되지 않음(미발육)

상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 상기 안전성 시험 결과, 본 발명의 실시예 6에 따른 무보존 점안액의 균에 대한 안전성은 기존의 판매되고 있는 보존제가 함유된 대조예 8~10의 점안액 및 대조예 6의 점안액과 비교하여 동등 이상임을 확인하였다.

실험예 3. MTT 분석법을 사용한 세포의 대사 활성도 측정

상기 실시예 6 및 대조예 6의 안과용 수성 액제와 대조예 8~10의 시판 안약 제품에 대하여 세포의 대사 활성도를 측정하였다.

특히, 세포의 대사능력을 측정하기 위해서, 색도분석법(calorimetric assay)를 이용하여 세포 내에 존재하는 포르마잔(formazan) 화합물의 흡광도를 측정하여 세포 증식억제력을 비교하였다. 세포의 대사능력을 측정하기 위해 MTT 용액(MTT solution: 3-〔4,5-Dimethylthiazol-2-yl〕-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma, St. Louis, USA)를 이용한 분석법을 사용하였는데, 노란색의 테트라졸륨 염(tetrazolium salt)이 세포 내 미토콘드리아 효소에 의해 청색의 포르마잔(formazan) 화합물로 바뀌는 원리를 이용한 것으로, 생존하고 있는 세포 즉 대사작용이 왕성한 세포를 흡광도를 이용해서 측정하는 방법이다.

서브컨플루언스(Subconfluence)에 도달한 세포(cell)를 D-PBS 완충액(D-PBS: Dulbecco's phosphate buffered saline, Giboco BRL, Rockville, NY, USA)으로 1회 세척한 후 대조군(Control)과 상기 실시예 6 및 대조예 6의 안과용 수성 액제와 대조예 8~10의 시판 안약 제품의 다섯 가지 점안액을 각각 4 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 동안 결막세포와 접촉시킨 후 다시 D-PBS로 1회 세척한 다음 배지를 넣어 주었다. 약물처리 후 24시간 정도 세포 배양기에 넣어 배양한 다음 MTT 평가(MTT assay)를 실시하였다. 약제의 효능을 비교하기 위한 상기 대조군(control)으로는 BSS 용액(Balanced salt solution)를 사용하였고, DMEM 배지(DMEM: Dulbecco's modified Eagles's medium, Giboco BRL, Rockville, NY, USA)를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 세포를 배양하여 세포대사능력을 측정하였다.

세포의 흡광도를 측정하기 위해 5 ㎎의 MTT 용액을 PBS 1 mL에 녹인 후 0.2 μL 실린지 필터(syringe filter)로 거른 다음, DMEM 배지로 10배 희석하여 사용하였다. 상층의 배양액을 140 μL 정도 제거한 후 MTT 용액을 100 μL 첨가하여 알루미늄 호일로 플레이트(plate)를 가린 후 37 ℃에서 4 시간 동안 반응시켰다. 다시 상층액을 110 μL 정도 제거한 후 DMSO (Dimethyl sulfoxide: Sigma, Cat. D-5869, St. Louis, USA)를 100 μL 정도 넣어 실온에서 20 분간 흔들어 혼합시키고 ELISA 판독기(ELISA reader: Moleculae Devices, USA)로 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

이러한 과정들을 3회 반복하여 각 농도와 노출 시간별로 측정된 흡광도의 평균을 구하여 하기 계산식 1에 나타낸 바와 같이 각 세포의 생존률을 구하였다.

[계산식 1]

세포의 생존율(%) = [각 칸의 흡광도 / 대조군칸의 흡광도] × 100

상기의 실험은 각 농도별로 3번씩 시도하여 각 군과의 통계학적 유의성을 비교하였다(Student’s t test, p<0.05). 그의 측정 결과를 하기의 표 7에 나타내고, 이러한 측정 결과에 대한 그래프를 도 1에 나타내었다.

구분	세포 대사 활성도(OD570nm)
시간	4 hr	6 hr	12 hr	24 hr
대조군(control)	100	100	100	100
실시예 6	79.93	89.95	80.31	62.77
대조예 6	12.59	18.87	17.67	16.69
대조예 8	71.55	70.97	48.61	20.31
대조예 9	12.01	19.34	17.12	16.83
대조예 10	92.99	54.88	43.06	60.83

상기 표 7 및 도 1에 나타낸 바와 같이, MTT 분석법을 통해 세포의 흡광도를 분석한 결과, 대조군(control), 대조예 6, 및 대조예 8~10의 점안액과 비교하였을 때, 실시예 6에 따른 무보존 점안액의 경우 세포 대사 활성도가 큰 감소를 보이지 않아 결막 세포에 미치는 영향이 적다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4. LDH 분석법을 이용한 약제의 독성 비교 분석

상기 대조군(control)과 실시예 6 및 대조예 6의 안과용 수성 액제와 대조예 8~10의 시판 안약 제품에 대하여 젖산탈수소효소 (lactate dehydrogenase, LDH) 분석법을 이용한 약제의 독성 비교 분석을 수행하였다.

먼저, 상기 대조군(control)과 실시예 6, 대조예 6, 및 대조예 8~10의 다섯 가지 점안액을 96 well 배지의 총량 200 μL 의 점안액을 배지액에 넣은 후 각각 4 시간, 12 시간, 24 시간, 48 시간 동안 접촉시켰다. 약물에 노출 된 후 세포질에서 유리된 LDH 양을 37 ℃ 온도의 암순응 상태에서 ELISA 판독기(ELISA reader: Moleculae Devices, USA)를 이용하여 측정하였고, 대조군으로는 BSS 용액(Balanced salt solution)을 처리하여 490 nm의 파장에서 각각의 파장을 측정하여 노출시간에 따른 농도의 차이를 비교하였다. 상기 대조군(Control)과 실시예 6, 대조예 6, 및 대조예 8~10의 점안액은 각각 10개의 배양된 결막세포를 대상으로 실험을 하였으며, 평균 LDH 역가를 산출하여 대조군(Control)과의 통계학적인 비교를 하였다(유의 수준은 95% 수준이었고, ANOVA 검사법을 사용하였다). 그의 측정 결과를 하기의 표 8에 나타내고, 상기 측정 결과에 대한 그래프를 도 2에 나타내었다.

구분	LDH 활성도(IU/L)
시간	4 hr	12 hr	24 hr	48 hr
대조군(control)	0.09	0.09	0.11	0.39
실시예 6	0.08	0.1	0.65	0.09
대조예 6	0.63	1.48	1.41	0.79
대조예 8	0.64	1.68	1.57	1.00
대조예 9	0.50	0.78	0.75	0.70
대조예 10	0.58	0.82	0.85	0.90

상기 표 8 및 도 2에 나타낸 바와 같이, LDH 역가 분석 결과에 따르면 LDH는 점안액 노출 후 12시간까지 점차 증가하다가 24시간에는 다시 감소하는 양상을 보였다. 특히, 본 발명에 따른 실시예 6의 무보존 점안액이 LDH 역가가 가장 낮았으며, 대조군(Control)과 비교하여 동등 이상의 효과를 보였다. 반면에, 보존제가 첨가된 대조예 6 및 대조예 8~10의 점안액의 경우, 결막세포의 세포질의 변성과 손상이 더 심하다는 것을 알 수 있다. 이는 점안액에 함유된 보존제의 세포독성에 의해 많은 결막세포들이 죽어 남아있는 일부의 결막세포들이 LDH 효소를 유리하는 것으로 해석될 수 있다.

실험예 5. 약제에 따른 세포의 형태학적 변화 관찰

상기 실시예 6, 대조예 6 및 대조예 8~10의 점안액에 노출시 점안액에 노출 시 세포의 형태학적인 변화를 관찰하기 위해서, 결막세포의 미세구조를 측정하였다.

먼저, 배양액에 결막세포를 각각 5 X 10³ cell/ml이 되도록 부유시킨 다음 6 well 플레이트(plate)에 500 μL씩 씨딩(seeding)한 후 37 ℃, 5% CO₂-95% 에어(air)의 배양기에서 4~5일 정도 배양하였다. 서브컨플루언스(Subconfluence)에 도달한 세포를 상기 실시예 6, 대조예 6 및 대조예 8~10의 점안액에 각각 접촉시키고, 24 시간 동안 배양시킨 후에 배양액을 제거하고 각 군의 결막실질세포들은 0.1 M 완충액(sodium cacodylate buffer)로 씻어내고, 약 2 시간 동안 고정액(Karnosky fixative: 2% paraformaldehyde, 2.5% glutaraldehyde, and 0.1M sodium cacodylate buffer)에 고정시킨 후에 0.1 M 완충액(sodium cacodylate buffer)으로 3 차례에 걸쳐 세척한 후에, 이 세포를 오스뮴 테트라옥사이드(osmium tetraoxide)로 고정시키고 계열에탄올(ethanol) 용액으로 탈수한 후 에폰(Epon) 으로 포맷하였다. 60~80 nm의 절편을 만들고 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)와 시트르산납(lead citrate)로 이중 염색시켜 투과전자현미경(JEOL, 1200 EX, Japan)으로 결막세포의 미세구조를 관찰하였다. 이렇게 측정한 결막세포의 미세구조에 대한 투과전자현미경 사진을 도 3에 나타내었다(A: 실시예 6, B: 대조예 6, C: 대조예 8, D: 대조예 9, E: 대조예 10).

도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 6의 무보존 점안액에 노출된 결막세포의 미세구조가 가장 온전한 형태를 유지함을 확인하였다. 반면에, 보존제가 첨가된 대조예 6 및 대조예 8~10의 점안액에 노출된 결막세포의 경우에, 그의 형태가 현저히 변형되고 손상이 심하다는 것을 알 수 있다.

Claims

히알루론산, 올로파타딘, 펙소페나딘, 플루오로메톨론 및 그의 약제학적으로 허용할 수 있는 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 활성성분 0.005% 내지 5.0%,
완충제 0.001% 내지 12%,
등장화제 0.01% 내지 10%,
안정화제 0.01% 내지 5%,
pH 조절제 0.2% 이하, 및
잔량의 물
을 포함하는 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 완충제는 아미노카프론산, 인산일수소나트륨, 인산이수소나트륨, 붕산, 붕사, 구연산 및 구연산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 등장화제는 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 및 글리세린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 등장화제는 염화나트륨과 염화칼륨이 1:0.1 내지 1:1의 중량비로 혼합된 것인 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안정화제는 에데트산나트륨 및 과붕산나트륨으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 pH 조절제는 염산, 수산화나트륨, 인산, 및 초산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물의 pH는 4.5 내지 8.5인 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물의 점도는 0.5 내지 10 cps인 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물의 몰삼투압 농도는 150 내지 450 mOsm/kg인 안과용 조성물.