KR20210026725A - 에피갈로카테킨갈레이트를 유효성분으로 포함하는 인지능력 개선용 조성물 - Google Patents

에피갈로카테킨갈레이트를 유효성분으로 포함하는 인지능력 개선용 조성물 Download PDF

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최정준
최혜진
신윤민
김연경
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대전대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 녹차에서 분리한 에피갈로카테킨갈레이트를 유효성분으로 포함하는 인지능력 개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 인지능력 개선용 조성물은 신경세포의 손상을 억제하고, 뇌신경의 인지 능력과 관련된 유전자 발현을 촉진하여 인지 능력 개선 효과를 나타내며, 단순 녹차추출물 또는 카테킨을 포함하는 녹차분획물에 비해 월등한 효과를 나타내어 이를 통해 인체에 대한 임상에서 또한 인지능력 개선에 우월한 효과가 있을 것으로 기대된다.

Description

에피갈로카테킨갈레이트를 유효성분으로 포함하는 인지능력 개선용 조성물{Composition for improving reduced cognitive function comprising epigallocatechingallate as active ingredient}
본 발명은 에피갈로카테킨갈레이트를 유효성분으로 포함하는 인지능력 개선용 조성물에 관한 것이다.
21세기에 들어, 의료 기술의 발전과 고도의 경제 성장으로 인해, 사회가 고령화되고 이에 따라 퇴행성 질병이 사회의 중요한 문제로 대두되고 있다.
인지능력의 장애는 기억력 또는 인지기능이 연령 등의 수준에 비해 낮아진 상태로써 일상생활에 영향을 미치는 정도의 장애를 말한다. 이는 치매와 경도인지장애로 구별할 수 있는데, 치매 대표적인 질병은 알츠하이머이다. 알츠하이머는 퇴행성 뇌질환으로 증상이 서서히 나타나다가 점진적으로 악화되는 특징을 가지며 비가역적인 증상의 악화를 나타낸다. 병의 진행에 따라 인지기능이 저하될 뿐 아니라 성격변화, 초조행동, 우울증, 망상, 환각, 공격성 등이 나타낸다. 반면 경도인지장애의 특징은 기억력이 낮아진 상태이나 일상적인 생활자체를 영유하는데 있어서 장애를 나타내지 않는 수준을 일컫는다.
사람은 연령이 증가함에 따라 일정한 수준을 넘어서면 노화가 진행되고 뇌의 기능도 떨어지게 된다. 저하되는 뇌의 기능으로 인해 기억력 감소가 대표적으로 나타나며 정보의 처리가 느려짐에 따라 외부 환경에서 나타나는 변화에 대한 대처가 느려지게 된다. 또한 새로운 정보가 제공되더라도 이를 정보화하여 내면화하는데 어려움을 겪기도 한다.
알츠하이머 질환과 같은 뇌의 퇴행은 인지 능력의 저하를 가져온다. 알츠하이머병은 아밀로이드베타의 축적에 의한 신경세포의 손상이 관찰되며 사후 검안에 의해 신경퇴행에 의한 측두엽 및 두정엽에서의 대사감소가 관찰된다. MRI 소견으로는 내측두엽의 위축이 나타나고 뇌척추액에서는 tau 단백질의 양이 증가되어 있는 것이 관찰된다. 내측두엽은 해마를 포함하여 변연계, 전두엽과 함께 집행신경네트워크 체계를 담당하고 있다. 치매가 발생할 경우 이 부위의 손상이 나타나고 이는 감각적 인식정보와 감정 기억의 연결에 문제를 일으켜 환자에게서 망상 또는 잘못된 사고를 유발한다. 낮아진 인지 능력은 지식과 정보를 효율적으로 조작하는 능력의 저하를 유발하고 이는 기억력, 공간지각력, 판단력, 집행기능, 언어능력 등 일상생활에 필요한 다양한 뇌의 기능들이 정상적으로 수행되지 못함을 의미한다. 이는 결과적으로 사회 생활에 큰 불편을 초래하는 문제로 대두되고 있다.
인지능력 장애는 퇴행성 질환으로 나이가 많은 수록 그 발병률이 증가하는 특징이 있다. 우리나라의 경우 급격한 노령화로 인해 2017년 65세 이상의 노령인구가 차지하는 비율이 14%를 넘어 고령사회에 속하게 되었다. 이마저도 곧 20%의 초고령사회 진입을 바로 앞두고 있는 상황으로 노인인구의 유입은 급격하게 증가하고 있다. 65세 이상의 노령인구는 치매 유병률이 약 9.2%로 알려져 있다. 따라서 이를 토대로 계산하면 2050년에는 약 270만명의 인지능력 장애 환자가 발생할 것으로 예상되고 있다. 인구 노령화는 비단 한국만의 문제는 아니어서 2017년 유엔 경제사회 사회국 (UN DESA)는 2050년에 전세계 인구에서 20억명이 60세 이상에 달할 것으로 예견하였다. 이에 따라 인구 고령화에 따른 치매환자의 수도 급격하게 늘 것으로 예상되고 있다.
따라서, 다양한 원인에 의해 발생되는 이러한 인지 능력의 저하의 원인을 해소하고, 고령화 시대에서 중요한 인지 기능 개선을 위한 물질의 발굴이 절실한 상황이다.
대한민국 공개특허공보 제2018-0001031호. 대한민국 공개특허공보 제2018-0009316호.
본 발명은 에피갈로카테킨갈레이트를 유효성분으로 포함하는 인지능력 개선용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 인지능력 개선용 조성물은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 에피갈로카테킨갈레이트(Epigallocatechingallate, EGCG)를 유효성분으로 포함한다.
Figure pat00001
[화학식 I]
본 발명의 일 예에 따른 인지 능력 개선용 조성물에 있어서, 상기 에피갈로카테킨갈레이트는 뇌신경의 BDNF 단백질 및 세로토닌 수용체 5-HT1a 발현을 증가시키는 작용을 할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 인지 능력 개선용 조성물에 있어서, 상기 에피갈로카테킨갈레이트는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의한 세포 손상을 감소시키는 작용을 할 수 있다.
본 발명의 의약품은 상기 인지능력 개선용 조성물을 함유한다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 인지능력 개선용 조성물을 함유한다.
본 발명의 화장품은 상기 인지능력 개선용 조성물을 함유한다.
본 발명에 따른 인지능력 개선용 조성물은 신경세포의 손상을 억제하고, 뇌신경의 인지 능력과 관련된 유전자 발현을 촉진하여 인지 능력 개선 효과를 나타내며, 이를 통해 인체에 대한 임상에서 또한 인지능력 개선에 효과가 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 고순도 EGCG의 SH-SY5Y 신경세포주에 대한 세포독성 평가에 관한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 고순도 EGCG의 신경세포 손상 보호 효과에 관한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 고순도 EGCG가 BDNF 단백질의 발현에 미치는 영향에 관한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 고순도 EGCG가 CREB의 인산화에 미치는 영향에 관한 결과이다.
도 5는 Y-미로 시험 (Y-maze test)에 관한 결과이다.
도 6은 수동회피시험 (Passive avoidance test)에 관한 결과이다.
도 7은 모리스 수중미로시험 (Morris water maze test)에서 마우스의 이동경로 추적에 관한 결과이다.
도 8은 모리스 수중미로시험 (Morris water maze test)에서 모리스 수중미로 사분면 잔여시간에 관한 결과이다.
도 9는 모리스 수중미로시험 (Morris water maze test)에서 플랫폼 위치 횡단횟수에 관한 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 고순도 EGCG가 BDNF와 5-HT1a의 발현에 미치는 영향에 관한 결과이다.
도 11은 녹차추출물의 에틸아세테이트(Ethyl acetate) 용매 분획을 통해 카테킨 함량을 높인 분획물의 신경세포주에 대한 세포독성 평가에 관한 결과이다.
도 12는 녹차추출물의 신경세포주에 대한 세포독성 평가에 관한 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 고순도 EGCG와 카테킨 함량을 높인 분획물, 녹차추출물이 신경세포에서 신경세포 손상 보호 효과를 비교한 결과이다.
도 14은 본 발명에 따른 고순도 EGCG와 카테킨 함량을 높인 분획물, 녹차추출물이 신경세포에서 BDNF 유전자의 발현에 미치는 영향을 비교한 결과이다.
도 15는 본 발명에 따른 고순도 EGCG와 카테킨 함량을 높인 분획물, 녹차추출물이 신경세포에서 5HT-1alpha 유전자의 발현에 미치는 영향을 비교한 결과이다.
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 에피갈로카테킨갈레이트를 유효성분으로 포함하는 인지능력 개선용 조성물에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
또한 본 발명의 명세서에서, "포함한다"는 표현은 "구비한다", "함유한다", "가진다" 또는 "특징으로 한다" 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 "실질적으로…로 구성된다"는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 "구성된다"는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "성분", "조성물", "화합물의 조성물", "화합물", "약물", "약학적 활성제", "활성제", "치유" "치료법" "치료" 또는 "약제"는 대상체(인간 또는 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물 또는 화합물(들) 또는 물질의 조성물을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어 "치료" 또는 "치료법"(뿐만 아니라 그의 상이한 형태)는 예방적 (예: 예방적 치료), 치유적 또는 경감성 치료를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "치료하는"은 상태, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 유해 또는 부정적 효과 또는 증상을 경감시키거나 감소시키는 것을 포함한다.
본 발명에 있어 "샘플" 또는 "시료"는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
이하 본 발명의 인지능력 개선용 조성물에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 인지능력 개선용 조성물은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 에피갈로카테킨갈레이트(Epigallocatechingallate, EGCG)를 유효성분으로 포함한다.
Figure pat00002
[화학식 I]
에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechingallate, EGCG)는 갈산염-3-에피갈로카테킨으로도 불리며, 녹차 잎의 추출물인 폴리페놀의 일종인 성분이다.
에피갈로카테킨갈레이트는 강한 항산화 작용을 가지고 있으며, 독감 바이러스 및 인플루엔자에 대한 항바이러스 능력을 지니고 있으며, 전립선암의 성장을 저해하고, 백혈병 치료 효과가 있음이 보고된 바 있다. 또한, 주요 성인 질환인 당뇨, 고지혈증, 동맥경화를 지연 또는 예방할 수 있는 효과가 있다는 보고가 이루어진 바 있다.
본 발명의 일 예에 따른 인지 능력 개선용 조성물에 있어서, 상기 에피갈로카테킨갈레이트는 뇌신경의 BDNF 단백질 및 세로토닌 수용체 5-HT1a 발현을 증가시키는 작용을 할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 인지 능력 개선용 조성물에 있어서, 상기 에피갈로카테킨갈레이트는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의한 세포 손상을 감소시키는 작용을 할 수 있다.
이하 본 발명의 인지능력 개선용 조성물을 이용한 의약품, 건강기능식품 및 화장품에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 의약품 또는 약학적 조성물은 상기 인지능력 개선용 조성물을 함유한다. 상기 약학적 조성물은 유효성분에 통상의 무독성 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제 등을 첨가하여 약제학적 분야에서 통상적인 제제, 예를 들면 정제, 환제, 경·연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭서제(elixirs) 등의 경구투여용 제제 또는 정맥내, 피하, 설하, 근육내 투약용 멸균성 수성 또는 오일상 용제의 비경구투여용 제제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용 가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및/또는 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 부형제로는 감미제, 결합제, 용해제, 용해보조제, 습윤제, 유화제, 등장화제, 흡착제, 붕해제, 산화방지제, 방부제, 활탁제, 충진제, 방향제 등이 있으며, 이러한 부형제의 비율 및 성질은 선택된 정제의 용해도 및 화학적 특성, 선택된 투여경로 및 표준 약제 실무에 의해 결정될 수 있다. 부형제의 예로는 락토스, 덱스트로스, 슈크로스, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스, 글라이신, 실리카, 탈크, 스테아린산, 스테린, 마그네슘 스테아린산염, 마그네슘 알루미늄 규산염, 녹말, 젤라틴, 트라가칸트 고무, 알지닌산, 소디움 알진산염, 메틸셀룰로오스, 소디움 카르복실메틸셀룰로오스, 아가, 물, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 염화나트륨, 염화칼슘, 오렌지 엣센스, 딸기 엣센스, 바닐라 향 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여 형태로 제형화될 수도 있는데, 이러한 경우 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 때, 상기 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 상기 약학적 조성물은 유효성분이 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합되어 용액 또는 현탁액으로 제조되고, 이러한 용액 또는 현탁액이 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 멸균되거나, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제를 더 포함할 수도 있고, 기타 치료적으로 유용한 물질을 더 포함할 수도 있으며, 혼합, 과립화 또는 코팅의 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물에서 유효성분의 사람을 포함하는 포유류에 대한 투여용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질병정도에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로 하루에 0.001 내지 500 ㎎/㎏(체중), 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎/㎏(체중)의 유효량으로 상기 약제학적 조성물에 포함될 수 있고, 이러한 약학적 조성물은 1 일 1 회 또는 2 회 이상 분할되어 경구 또는 비경구적 경로를 통해 투여될 수 있다. 그러나, 투여 경로, 질병의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 인지능력 개선용 조성물을 함유한다. 본 발명에서 '건강기능식품'이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다. 건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 건강기능식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 유효성분을 첨가할 수 있는 건강기능식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다. 추가로, 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 건강보조식품, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 음료(예, 과실,채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상술된 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 물, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분을 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이와 같이 본 발명의 건강기능식품은 상술된 바와 같이 다양한 제형을 갖을 수 있으며, 특히 분말, 과립, 정제, 캡슐 및 음료 등에서 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 화장품은 상기 인지능력 개선용 조성물을 함유한다. 본 발명에서 상기 화장품은 제한되지는 않으나 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.
상기 화장품은 유효성분 이외에 화장품에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
한편, 상기 화장품은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있다. 다만, 이에 반드시 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장품의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장품의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본,프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장품의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 화장품의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실험재료, 시약 및 장비]
- 에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechingallate, EGCG; 순도 97% 이상)는 ㈜ 알엔오식품(http://alnofood.com)에서 구입하여 사용하였다.
상기 순도 98% 이상의 에피갈로카테킨갈레이트 제조 방법에 대해서는 이하에 기술하였다.
- 인간 유래 SH-SY5Y 뉴로블라스토마(neuroblastoma) 세포는 한국세포주은행(Korea cell line Bank, 서울, 대한민국)에서 구매하여 사용하였다.
- DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) 배지는 Lonza(Walkersville, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
- 10% FBS(fetal bovine serum)은 Lonza(Basel, Switzerland)에서 구입하여 사용하였다.
- 1% P/S(penicillin 100 U/ml, streptomycin 100 ug/ml)은 Lonza에서 구입하여 사용하였다.
- Ez-Cytox 시약은 DoGen(대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- 흡광도는 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader; Molecular Device, Sunnyvale, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 프로테아제 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail) 및 포스파타제 저해제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail)은 Sigma(St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- RIPA(Radioimmunoprecipitation assay) 버퍼는 Biosesang(대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- BCA(bicinchoninic acid)는 Intron(대한민국)사에서 구입하여 사용하였다.
- PVDF(polyvinylidene difluoride) 멤브레인은 Merck Millipore(MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 5% 탈지유(skim milk)는 Becton, Dickinson and Company (NJ, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Phospho-CREB, BDNF(Brain-derived neurotrophic factor)는 Santa Cruz(Dallas, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- CREB 항체 및 2차 항체는 Cell Signaling Technology Inc.(Danvers, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Β-actin 항체는 Sigma(St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- TBST(Tris buffered saline with Tween-20; 100mM Tris.HCl, 1.5M NaCl, 0.5% Tween-20, pH 7.5) 버퍼는 Intron(대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- AmershamTM ECL SelectTM Western Blotting Detection Reagent는 GE Healthcare(Chicago, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- ChemiDocTM XRS+ System은 BioRad(Hercules, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 6주령 수컷 C57/BL6 마우스(19-22 g)은 대한바이오링크(의성, 대한민국)에서 분양받아 사용하였다.
- 스코폴라민(scopolamine)은 Sigma(St. Louis, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 말린 녹차(Camellia sinensis)의 잎은 보성(대한민국)에서 구입하여 사용하였다.
- 당귀추출물은 당귀를 옴니허브로부터 구매하여, 열수추출 후 동결건조하여 사용하였다.
[통계 처리]
실험 결과는 평균±표준편차(mean±SD)로 표기하였으며 동물실험 결과는 평균±평균의표준오차(mean±SEM)로 기록하였다.
통계처리는 IBM SPSS Statistics 23 프로그램을 이용하였고, Duncan test (<0.05) 또는 일원배치 분산분석(one way ANOVA) 시스템을 사용하여 Tukey's HSD test로 유의성을 검증하였다.
P값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.
[실시예 1] 고순도 에피갈로카테킨갈레이트(EGCG)의 제조
1 kg의 녹차 잎을 60℃에서 6 시간 동안 물로 추출하였다. 수득한 추출액을 감압 농축한 후, 뜨거운 물에 현탁시키고, Diaion HP-20 컬럼 크로마토그래피(미쯔비시, Tokyo, Japan)을 이용하여 0, 10, 20, 30, 및 100%의 에탄올로 순차적으로 희석한 후 투입하였다.
20% 및 30% 분획의 혼합물을 HP-20 컬럼 크로마토그래피로 추가 정제하여, 백색분말 형태의 고순도 52 g의 CGTE(catechin-rich grean tea extract)를 수득하였다.
개별적인 카테킨 성분의 함량은 Agilent 1220 Infinity LC System(Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 HPLC 분석으로 확인하였다. 전체 추출물 및 CGTE의 분석을 위한 조건은 하기 표 1에 도시하였다.
상기로부터 수득한 CGTE를 HPLC 분석한 결과, 에피갈로카테킨(epigallocatechin, EGC) 0.1%, 에피카테킨(epicatechin) 0.2%, 에피갈로카테킨갈레이트(epigallocatechingallate, EGCG) 97.2%, 에피카테킨갈레이트(epicatechingallate) 2.5%로 측정되었으며, 카페인 성분은 포함되지 않은 것을 확인하였다.
[표 1] HPLC 수행 조건
Figure pat00003
[시험예]
[세포배양]
인간 유래 SH-SY5Y 뉴로블라스토마 세포는 DMEM 배지에 10% FBS 및 1% P/S를 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다.
[세포독성 평가]
상기 EGCG가 인간 유래 SH-SY5Y 신경 세포주에 미치는 세포 독성을 평가하기 위해, 고순도 EGCG를 각각 0, 1.56, 3.13, 6.25, 12.5 및 25 μM로 처리하였다.
그 결과를 도 1에 도시하였다.
이로부터, 본 발명에 따른 고순도 EGCG 성분은 신경세포주에 대해 대부분의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
[세포생존율 측정] - 신경세포 손상에 대한 EGCG의 보호 효과 측정
상기 배양한 SH-SY5Y 세포주를 96웰 플레이트에 웰당 4x105 cells/mL로 100 μL씩 분주한 후, 세포가 부착될 수 있도록 1일간 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다.
이후, 1, 10 및 25 μM 농도의 EGCG를 1시간 전에 전처리하고, 이후 100 μM 과산화수소를 세포에 각각 처리하였다.
세포를 24시간 동안 상기 세포 배양기에서 배양한 후, EZ-Cytox 시약 10 μL씩 각 웰에 첨가하였다. 4 시간 경과 후, 마이크로플레이트 판독기를 이용하여, 450 nm에서 세포의 생존율을 측정하였다.
그 결과를 도 2에 도시하였다.
이로부터, 과산화수소만을 투여한 대조군에서는 세포 생존율이 크게 감소한 반면, 본 발명에 따른 고순도 EGCG 성분을 처리한 신경세포주에서는 투여 농도가 증가할수록 세포 생존율이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이를 통해, 본 발명에 따른 고순도 EGCG는 활성 산소종에 의한 신경세포의 손상을 방지하는 효과가 있음을 확인하였다.
[단백질 발현 측정(웨스턴 블롯)] - 세포 내 단백질 발현 변화 측정
상기 세포생존율 측정 시험에서 시약 처리된 SH-SY5Y와 동일한 방법으로 EGCG 또는 당귀추출물이 처리된 SH-SY5Y를 각각 차가운 PBS로 2회 세척하였다.
프로테아제 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail) 및 포스파타제 저해제 칵테일(phosphatase inhibitor cocktail)이 함유된 RIPA 버퍼 150 μL을 가하여 용해한 후, 얼음 속에 30분간 방치하였다. 이후, 4℃에서 13,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다.
상층액으로부터 얻은 단백질은 BCA 방법으로 정량하였다.
총 단백질의 양이 30 μg으로 동일하게 하여 10% SDS-PAGE로 전기영동하고, PDVF 멤브레인으로 이동시켰다.
이후, 5% 탈지유가 함유된 TBST로 1시간 동안 상온에서 블로킹(blocking)하고, 4℃에서 1일간 1:1,000으로 희석된 Phospho-CREB, CREB 및 BDNF, 1:10,000으로 희석된 β-actin의 1차 항체들과 반응시켰다.
TBST로 10분간 3회 세척한 후, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 1시간 동안 반응시켰다.
다시 TBST로 10분간 3회 세척한 후, AmershamTM ECL SelectTM Western Blotting Detection Reagent를 이용하여 발광시키고, ChemiDocTM XRS+ System으로 영상을 저장하였다.
그 결과를 도 3 및 도 4에 도시하였다.
이로부터, 본 발명에 따른 고순도 EGCG 성분을 처리한 결과, SH-SY5Y 신경세포주에서 BDNF의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명에 따른 고순도 EGCG 성분을 처리한 결과 CREB의 인산화 정도가 EGCG의 농도에 따라 증가하는 것을 확인하였다.
[실험대상 동물의 사육, 약물 투여 및 행동테스트]
6주령 수컷 C58/BL6 마우스는 실험 당일까지 고형 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하고, 23±1℃ 온도를 유지하였고, 주야 12 시간(light-dark 사이클) 환경에서 7일간 적응시킨 후, 실험에 사용하였다.
3개의 실험군의 마우스에 대해 고순도의 EGCG를 20, 40 및 60 mg/kg의 농도로 6주간 매일 1일 1회 경구투여하였다. EGCG는 PBS에 용해하여 사용하였으며, 경구 투여하는 시료의 부피는 200 μL의 일정량으로 조정하였다.
EGCG에 대한 양성대조실험군의 마우스에는 인지능력개선 능력이 있는 것으로 알려진 당귀 추출물을 150 mg/kg의 농도로 6주간 매일 1일 1회 경구투여하였다.
실험 마지막날에 스코폴라민(scopolamine) 1 mg/kg을 복강 투여하여 기억력 감소를 유도하였으며, 약물 투여 30분 후 하기 행동 테스트를 순차적으로 수행하였다.
행동테스트 완료 후, 각 실험군의 마우스를 마취시키고 뇌를 적출한 후 해마조직을 각각 분리하였다.
행동테스트: Y-미로 실험(Y-maze test)
폭×길이×벽이 10×40×15 cm인 통로 3개가 Y자 모양의 120˚ 각도를 이루도록 되어있는 미로에서 인지능력을 검증하였다.
각 통로를 A, B, C로 정하고 한쪽 통로에 실험군의 마우스를 놓고 자유롭게 움직이도록 하여 5분 동안 각 통로에 들어간 횟수와 순서를 기록하였다. 이때 각 통로에 들어간 횟수와 순서는 꼬리가 완전히 들어간 경우에 한정하였으며, 동일한 통로에 다시 들어간 경우도 반복 기록하여 총 출입횟수로 정하였다.
3개의 서로 다른 통로에 순차적으로 들어간 경우 즉 ABC, CAB, BCA 등의 순서로 들어간 경우를 실제변경횟수로 지정하고 1점씩을 부여하였으며, 변경행동력 (spontaneous alternation, %)은 다음의 식에 의해 계산하였다.
변경행동력(%) = 실제변경횟수/(총출입횟수-2)×100
그 결과를 도 5에 도시하였다.
이로부터, Y-미로의 각 통로를 번갈아가며 들어가는 변경행동력(spontaneous alternation)을 통해 인지능력을 평가한 결과, 스코폴라민을 투여한 대조군은 정상군에 비해 변경행동력이 크게 감소한 반면, 20, 40 mg/kg의 고순도 EGCG를 경구투여한 실험동물에서는 변경행동력이 개선되는 것을 확인하였다.
행동테스트: 수동회피 시험 (Passive avoidance test)
동일한 구조를 갖는 조명이 있는 방과 조명이 없는 방이 칸막이 문으로 연결되어 있는 장치에서 수동회피 시험을 수행하였다.
조명이 있는 방은 흰색으로 제작하여 밝은 환경을 제공할 수 있도록 하였으며, 조명이 없는 방은 검은 색으로 제작하여 어두운 환경을 제공할 수 있도록 하였다.
실험군의 마우스를 조명이 있는 방에 위치하고, 칸막이를 막은 채 10초간 탐색하도록 한 다음, 칸막이를 열어 조명이 없는 방으로 들어갈 수 있도록 하였다.
실험군의 마우스의 네 발과 꼬리까지 조명이 없는 방으로 완전히 들어가면 칸막이 문을 닫은 후, 바닥의 철망을 통해 5초 동안 0.2 mA의 전기 자극으로 통증을 주었다.
시험은 2일간 1일 1회 같은 시각에 실시하였다.
실험 마지막 날에는 칸막이를 제거한 채 실험동물을 조명이 있는 방에 놓아 주고 전기 자극을 받았던 어두운 방으로 들어가는데 걸리는 시간을 300초까지 측정하였다. 시간 안에 실험군의 마우스가 어두운 방에 들어가지 않으면 300초로 간주하였다.
그 결과를 도 6에 도시하였다.
이로부터, 인지장애를 유발한 실험군의 마우스는 암실로 들어갈 때까지의 시간 지연이 고순도 EGCG를 투여한 마우스에 비해 유의적으로 크게 감소하는 것을 확인하였다.
반면, 본 발명의 고순도 EGCG를 투여한 실험군의 마우스는 농도 의존적으로 암실에 이동하는 시간이 유의적으로 지연되어 인지능력이 개선된 것을 확인하였다.
행동테스트: 모리스 수중미로 시험 (Morris water maze test)
직경이 90 cm, 높이가 30 cm인 원형 통에 온도가 22ㅁ2℃되는 물을 채우고, 우유를 섞어 불투명하게 하여 속이 보이지 않는 수중 미로 형태의 수조를 제작하였다. 남쪽 벽면에 가로×세로가 각각 20 cm인 붉은 색 별 모양의 공간단서를 붙였다.
공간단서에서 10 cm 떨어진 수조 안쪽에는 직경이 10 cm, 높이가 20 cm인 원형 플랫폼(platform)을 설치하였다. 상기 플랫폼은 수면보다 1.5 cm 낮은 위치에 설치하여 육안으로 확인할 수 없도록 하였다.
행동테스트 수행 4일 전부터 실험군의 마우스에 대한 훈련을 1일 1회 실시하였다.
수조를 가상으로 사분면으로 나누고 플랫폼이 놓인 남쪽 사분면을 제외한 곳을 출발지로 정하고 실험군의 마우스가 수영을 시작하도록 하였다.
훈련 기간 동안에는 180초 동안 실험동물이 플랫폼을 찾을 수 있도록 자유수영을 하도록 하였으며 상기 시간 내에 플랫폼을 찾지 못하면, 플랫폼으로 가게끔 유인한 후 플랫폼 상에서 15초간 머무르게 하였다.
실험 마지막 날에는 플랫폼을 수조에서 제거하고, 수중미로의 사분면의 한가운데부터 수영을 하도록 하였으며 실험 동물의 행동은 비디오 카메라로 90초 동안 녹화하고 행동분석 프로그램(SMART 3.0, Panlab S.I., Barcelona, Spain)으로 분석하였다.
그 결과를 도 7~도9에 도시하였다.
이로부터, 본 발명의 고순도 EGCG를 투여한 실험군의 마우스는 수중 미로에서 플랫폼 근처로 이동하는 능력이 크게 개선되어, 플랫폼이 존재하고 있던 사분면의 위치에 머무르는 시간이 대조군 대비 유의적인 수준으로 현저히 증가하였을 뿐만 아니라, 플랫폼이 존재했던 위치를 찾아온 횟수가 대조군에 비해 유의적인 수준으로 증가하는 것을 확인하였다.
[실험대상 동물 뇌조직의 단백질 분석]
상기 행동테스트 후 분리한 해마 조직에 대하여, 프로테아제 저해제 칵테일이 포함된 RIPA 버퍼 150 μL을 각각 첨가한 후, 초음파 용해시켰다.
균질한 용액을 4℃에서 12,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다.
이후 상기 [단백질 발현 측정(웨스턴 블롯)]에서 수행한 것과 같은 방법으로 단백질 발현을 측정하였다.
그 결과를 도 10에 도시하였다.
이로부터, 본 발명에 따른 고순도 EGCG를 처리한 결과, BDNF 및 5-HT1a의 발현량이 대조군에 비해 증가하는 것을 확인하였다.
[기존 녹차추출물과 실시예1로 제조한 EGCG의 효능 비교] - 신경세포독성 평가
기존의 녹차추출물과 본 발병에 따른 고순도 EGCG의 세포독성의 정도를 비교하기 위해 상기의 [세포독성 평가]와 같은 방법으로 시험을 시행하였다.
녹차의 열수추출물인 TGE (total green tea extract)는 5%의 EGCG를 함유하는 추출물이다. Catechin이라 명한 추출물은 TGE를 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 용매분획하여 농축시켜 카테킨 함량이 상승된 분획물이다. 카테킨(Catechin)의 EGCG 함량은 34%였다.
그 결과를 도11~도12에 도시하였다.
이로부터, TGE는 12.50 μg/ml 농도까지 신경세포주에 대해 세포독성이 나타나지 않았으며 Catechin은 12.50 μg/ml에서 유의적인 독성이 나타났으나 90%이상의 생존율을 나타내었다. 따라서 신경세포주에 대해 대부분의 농도에서 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
[기존 녹차추출물과 실시예1로 제조한 EGCG의 효능 비교] - 신경세포손상 보호효능 평가
기존의 녹차추출물과 본 발병에 따른 고순도 EGCG가 H2O2로 손상을 유발한 신경세포에서 나타내는 보호효능의 정도를 비교하기 위해 상기의 [세포생존율 측정] - 신경세포 손상에 대한 EGCG의 보호 효과 측정과 같은 방법으로 시험을 시행하였다. 각 시료의 농도는 10 μg/ml로 처리하였다.
그 결과를 도13에 도시하였다.
이로부터, 본 발병에 따른 고순도 EGCG는 확연한 세포보호효능을 나타내어 H2O2의 손상으로부터 살아남은 세포의 수가 통계적으로 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 반면 카테킨과 TGE그룹은 약간의 신경세포 보호 효능을 나타내었으나 통계적 유의성이 나타나지 않았다. 따라서 본 발명에 따른 고순도 EGCG가 가장 현저한 신경세포 보호 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
[기존 녹차추출물과 실시예1로 제조한 EGCG의 효능 비교] - 뇌기능 조절 단백질 발현
기존의 녹차추출물과 본 발병에 따른 고순도 EGCG 신경세포에서 나타내는 뇌기능 조절 단백질의 발현에 나타내는 효능의 정도를 비교하였다.
SH-SY5Y 세포를 12 웰 플레이트(well plate)에 3×105 cells/ml 농도로 세포를 분주하고 24시간 동안 배양한 다음, 각 시료를 10 μg/ml의 농도로 6시간 동안 처리하였다.
이후, 세포에 Easy Blue(iNtRON, South Korea)를 가하고 용액을 수집한 뒤, 클로로포름을 넣고 잘 교반하여 13,000rpm, 4℃에 15분간 원심분리하였다. 상등액을 새로운 튜브로 옮겨준 다음 동량의 아이소프로판올을 가하여 10분간 실온에서 방치한 후, 13,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 펠렛을 분리한 뒤, 75% 에탄올을 가하여 남아있는 불순물을 제거하였다. 펠렛을 잘 말린 후, DEPC water(Invitrogen) 30 μl를 첨가하여 RNA를 용해시켰다.
얻어진 RNA를 NanoDrop 2000 (Thermo Fisher)을 이용하여 정량한 후, Easy cDNA Synthesis kit (NanoHelix, South Korea)으로 cDNA를 합성하였다. 과정은 RNA 주형 5 μl(1 μg), Oligo-d(T) 1 μl 그리고 DEPC water 9 μl를 넣고, 65℃에서 5분동안 반응시킨 후, 즉시 아이스에 방치한 다음, 각 튜브에 미리 만들어둔 두 번째 혼합물 (5X RT reaction mix 4 μl + RT Enzyme mix)을 5 μl씩 넣어, 50℃에서 40분, 70℃에서 10분 동안 반응하여 cDNA를 합성하였다.
유전자 발현 측정을 위해 Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Warrington, UK)을 이용한 실시간 정량 PCR (real time quantitative PCR)을 수행하였다. 이 때, 기기는 QuantStudioTM 3 Real Time PCR system (Thermo Fisher Scientific)을 사용하였다.
실시간 정량 PCR 반응은 총 20 ㎕ 내에 cDNA 1 ㎕와 10 ㎕의 2X SYBR mix, 프라이머는 각각 10 pmol/㎕의 농도로 1 ㎕씩 첨가하였고, 나머지는 증류수로 채워 주었다. 모든 유전자에 대하여 PCR 증폭 단계는 다음과 같고 증폭 cycle은 40 cycles을 실시하였다. Hot start를 위해 95℃에서 10분, 증폭 단계의 denaturation을 95℃에서 15초, annealing을 60℃에서 60초, extension을 72℃에서 30초간 반복하며, 각 사이클(cycle)의 extension 후에 형광 값을 기록하였다.
모든 사이클 수행이 완료된 후, 프라이머 특이성 확인을 위해 녹는점 곡선(melting curve) 분석을 Real-Time PCR Instrument software(Thermo Fisher Scientific )로 수행하였다.
그 결과, 측정한 유전자는 BDNF와 5HT1a이며 GAPDH는 내부대조군으로 사용하였다.
상기 분석에 사용된 유전자의 정방향 및 역방향 프라이머 염기서열은 표2와 같다.
표2. BDNF와 5HT1a 유전자 염기서열
Figure pat00004
상기 분석에 따른 결과를 도14~도15에 도시하였다.
이로부터, 본 발명에 따른 고순도 EGCG는 신경세포에서 BDNF 유전자 발현에 통계적으로 유의적인 증가 효과가 있는 것을 확인하였다. 특히, 양성대조군으로 사용한 당귀추출물보다도 발현량이 현저히 많은 새로운 결과를 확인하였다.
BDNF 발현에 있어서, 카테킨은 대조군 대비 통계적으로 유의적이지 않은 발현 증가 효과를 얻은 반면, TGE는 대조군 대비 통계적으로 다소 유의적인 발현 증가 효과를 나타냈다.
반면, 본 발명의 EGCG는 상기 대조군 대비 신경세포에서 BDNF의 발현을 통계적으로 현저히 유의적으로 증가시키는 효과가 있음을 확인하였으며, 이를 도 14에 도시하였다.
또한, 5HT-1a의 경우, 당귀추출물과 TGE는 통계적으로 다소 유의적인 유전자의 발현 증가 효과를 나타내었고, 카테킨은 5HT-1a 유전자의 발현에 통계적으로 유의적이지 않은 발현 증가를 나타내는 것을 확인하였다.
반면, 본 발명의 EGCG는 상기 대조군 대비 5HT-1a의 발현을 통계적으로 현저히 유의적으로 증가시키는 효과가 있음을 확인하였으며, 이를 도 15에 도시하였다.
상기 결과로부터, 본 발명에 따른 고순도 EGCG를 투여한 결과, 뇌신경에 대한 보호 효과를 나타낼 뿐만 아니라, BDNF 및 5-HT1a의 발현을 증가시킴으로, 기억 및 학습에 필수적인 세로토닌에 대한 감수성을 증가시키는 역할을 수행하며, 이를 통해 인지 능력을 개선할 수 있는 효과가 있음을 확인하였다. 더욱이 기존의 녹차추출물 또는 카테킨을 포함하는 녹차분획물에 비하여 EGCG의 순도가 높은 본 발명의 조성물의 경우, 신경세포의 보호 효과를 비롯하여 인지기능과 관련된 단백질의 발현을 크게 증가시켜 인지능력을 개선하는 효과를 나타내는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

Claims (6)

  1. 하기 화학식 I의 구조를 갖는 에피갈로카테킨갈레이트(Epigallocatechingallate, EGCG)을 유효성분으로 포함하는 인지능력 개선용 조성물.
    Figure pat00005

    [화학식 I]
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 에피갈로카테킨갈레이트는 뇌신경의 BDNF 단백질 및 세로토닌 수용체 5-HT1a 발현을 증가시키는 작용을 하는 것인 인지능력 개선용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 에피갈로카테킨갈레이트는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 의한 세포 손상을 감소시키는 작용을 하는 것인 인지능력 개선용 조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 인지능력 개선용 조성물을 함유하는 의약품.
  5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 인지능력 개선용 조성물을 함유하는 건강기능식품.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 인지능력 개선용 조성물을 함유하는 화장품.
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KR20180009316A (ko) 2016-07-18 2018-01-26 (주)아모레퍼시픽 3-O-갈로일-3,3',5,5',7-펜타하이드록시플라반(3-O-galloyl-3,3',5,5',7- pentahydroxyflavan)을 포함하는 인지 기능 개선용 조성물

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