KR20210021026A

KR20210021026A - 암에 걸린 동물을 지원하기 위한 조성물

Info

Publication number: KR20210021026A
Application number: KR1020217001030A
Authority: KR
Inventors: 줄리 벨; 델핀 모니오; 뱅상 뷰르지; 얀 퀴오; 제프리 다니엘
Original assignee: 마아즈, 인코오포레이티드
Priority date: 2018-06-14
Filing date: 2019-06-13
Publication date: 2021-02-24
Also published as: CA3099923A1; AU2019287545A1; JP2021526363A; WO2019241584A1; ZA202006988B; EP3806655A1; WO2019241584A8; US20220053796A1; CN112367848A; BR112020024464A2

Abstract

본원은 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 60 중량%의 단백질을 포함하는 개 사료 조성물에 관한 것이다.

Description

암에 걸린 동물을 지원하기 위한 조성물

관련 출원에 대한 상호참조

본원은 그 전문이 본원에 참고로 포함된 EP18177847.3(출원일: 2018년 6월 14일)을 우선권 주장한다.

기술분야

본원은 암에 걸린 개를 위한 사료 조성물의 분야에 관한 것이다.

동물 건강의 유지 및 개선은 당분야의 끊임없이 지속적인 목표이다. 인간과 마찬가지로, 선진국에 사는 애완동물은 기대 수명이 지속적으로 연장되었다. 따라서, 노화 및 개 개체수 증가로 인해 암에 대한 전세계적 부담이 크게 증가하고 있다. 예로서, 개 개체군의 암 발병률은 100,000마리의 개 당 282.2 내지 958마리인 것으로 추청된다. 개에서 가장 흔한 종양은 암컷의 유방 종양(모든 암의 70.5%), 비-호지킨 림프종(8.4%(암컷) 및 20.1%(수컷)) 및 피부 종양(4%(암컷) 및 19.9%(수컷))이다. 또한, 유럽 수의 종양학 협회에 따르면, 10살 이상의 개의 50%가 암 관련된 문제로 인해 사망한다.

화학 요법이 동물 종양학에서 점점 더 많이 사용되고 있다. 인간 암 치료에서의 의학 진보의 이점을 취하여, 반려동물을 치료하는 데 이용가능한 분자(예컨대 빈크리스틴(vincristine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 카보플라틴(carboplatin) 또는 시스플라틴(cisplatin))가 점점 더 많아지고 있다. 수의학 분야에서, 항암 약물은 특히 조혈 조직으로부터 유래된 종양(림프종, 백혈병)의 치료에 사용된다. 예를 들어, 사이클로포스파미드, 독소루비신(doxorubicin), 빈크리스틴 및 프레드니손(prednisone)을 조합한 CHOP-기반 프로토콜이 많은 림프종의 치료에 현재 사용되고 있다. 화학 치료제는 암에 걸린 동물의 수명을 몇 주 내지 몇 달 연장시키는 데 특히 효과적일 수 있다(CHOP 프로토콜에 의해 치료받은 개의 중간 생존 시간은 13개월이다).

실제로, 애완동물 주인, 특히 반려동물, 예컨대 개의 주인은 양호한 생활의 질(QOL)을 가능한 길게 연장시키기 위해 이의 애완동물을 화학 요법에 의해 치료하는 것을 갈수록 더 선택하고 있다. 개는 식욕 저하, 메스꺼움 또는 설사 형태의 위장 장애를 경험할 수 있고, 이는 이의 QOL을 감소시킬 수 있고, 치료 변경 또는 심지어 치료 중단을 초래할 수 있다.

암 환자 관리를 위한 통합적인 접근법은, 종양 발달을 지원하고 정상 조직 독성을 최소화하는 다수의 생화학적 및 생리학적 경로를 표적화해야 한다. 영양 조정은 요법에 대한 반응을 증진시키고 QOL을 개선하는 주요 요소이다. 또한, 특정 영양소는 항암 요법과 관련된 독성을 감소시키는 강력한 도구로서 사용될 수 있다.

암에 걸린 애완동물의 주인은 흔히 암 치료 동안 애완동물을 지원(supporting)하는 것을 보조하기 위해 어떠한 식단이 공급하기에 가장 적절한지를 묻고, 인터넷 및 기타 리소스는 암에 걸린 개에서 결과를 개선하고 치료의 부작용을 최소화하는 것으로 알려진 많은 "암 식단"(예를 들어 생식 식단, 고 또는 중간 단백질/저 탄수화물 식단, "케톤체 생성" 식단, 고 지방, 오메가-3 지방산 보충식)을 기재한다.

이러한 문제를 해결하기 위해 유일하게 존재하는 제품은 "Prescription Diet^TM n/d^TM Canine"으로 지칭되는 습식 제품으로 존재한다. 이는, 독소루비신 화학 요법과 함께 사용될 때, 임상 시험에서 림프종을 갖는 개의 선택된 군에서 일부 적당한 생존 이익과 관련되었다. 이러한 제품은 일반적으로 수의사에 의해 사용되거나 처방되지 않으며, 임상 실습에서 일반적으로 사용되지 않는다. 먼저, 이는 습식 제품이기 때문에, 건식 제품보다 사용에 더 많은 제약이 있다. 이는 일부 애완동물 주인에게는 불편하고 고비용일 수 있는 통조림 형태로만 이용가능하며, 이는 또한 위장 장애를 유발한다는 입증되지 않은 평판도 있다. 또한, 이 제품은, 통상적으로 일반 상식에 의해 인정되는 바와 같이, 적당한 양의 단백질 및 탄수화물을 포함하나, 고 용량의 어유로 보충된다. 일반적으로, 당업자는 이러한 종류의 사료에 고 수준의 지방이 필요하다고 생각하는데, 이는 지방이 종양이 쉽게 사용할 수 없는 애완동물에 필요한 에너지원을 나타내기 때문이다. 덜 효휼적인 경로이나, 암 세포가 글루코스 흡수를 증가시키고 이의 에너지 생산을 미토콘드리아 산화성 포스포릴화로부터 세포질 당분해로 이동시키도록 프로그램되어 있음이 밝혀졌다; 암 세포의 이러한 대사 특징을 "바르부르크(Warburg) 효과"라고 지칭한다. 암 세포의 성장 및 증식을 촉진하는 데 사용되는, 암 세포에 의한 글루코스 섭취 증가로 인해, 암 환자를 위한 식단이 종양 세포를 "불리한" 상황에 두기 위해 적당한 수준의 탄수화물을 가져야 하는 것이 가정되었다. 반대로, 많은 암 세포가 순환성 지질을 사용하는 대신 필요한 대부분의 지방산을 내생적으로 합성하기 때문에(데노보(de novo) 지질 생성), 암 환자의 고 지방 식단이 종양 세포보다 숙주 세포에 유익할 할 수 있음이 가정되었다.

암에 걸린 애완동물의 최적의 영양 상태 및 생활의 질을 지원하고 화학 요법의 위장 부작용을 줄이는 것을 보조하도록 특별히 제형화되고 임상적으로 검증된 상업적으로 이용가능한 식단은 현재 없다.

본원은 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 60 중량%의 단백질을 포함하는 애완동물 사료 조성물에 관한 것이다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

일부 실시양태에서, 본원의 애완동물 사료 조성물은 습식 애완동물 사료 조성물로 구성된다.

일부 다른 실시양태에서, 본원의 애완동물 사료 조성물은 반습식(semi-moist) 애완동물 사료 조성물로 구성된다.

일부 추가적 실시양태에서, 본원의 애완동물 사료 조성물은 건식 애완동물 사료 조성물로 구성된다.

일부 실시양태에서, 본원의 애완동물 사료 조성물은 습식 개 사료 조성물로 구성된다.

일부 다른 실시양태에서, 본원의 애완동물 사료 조성물은 반습식 개 사료 조성물로 구성된다.

일부 추가적 실시양태에서, 본원의 애완동물 사료 조성물은 건식 개 사료 조성물로 구성된다.

또한, 본원은 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 50 중량%의 단백질을 포함하는 개 사료 조성물에 관한 것이다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

일부 실시양태에서, 본원의 상기 애완동물 사료 조성물은 습식 개 사료 조성물로 구성된다.

일부 다른 실시양태에서, 본원의 상기 애완동물 사료 조성물은 반습식 개 사료 조성물로 구성된다.

일부 추가적 실시양태에서, 본원의 상기 애완동물 사료 조성물은 건식 개 사료 조성물로 구성된다.

일부 실시양태에서, 본원에 따른 상기 사료 조성물은 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 약 15 내지 약 40 중량% 범위의 양의 탄수화물을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 산화 방지제 공급원을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 산화 방지제 공급원은 비타민 C, 비타민 E 및 카로테노이드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 비타민을 포함한다.

가장 바람직한 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 건식 애완동물 사료 조성물로 구성되고, 산화 방지제 공급원은 비타민 C(비타민 C는 건물을 기준으로 약 220 내지 약 440 ppm 범위의 양으로 사료 조성물에 존재함) 및/또는 비타민 E(비타민 E는 건물을 기준으로 약 660 내지 약 1100 ppm 범위의 양으로 사료 조성물에 존재함) 및/또는 카로테노이드(카로테노이드는 건물을 기준으로 약 2 내지 약 12 ppm 범위의 양으로 사료 조성물에 존재함)를 포함한다.

다른 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 습식 애완동물 사료 조성물로 구성되고, 산화 방지제 공급원은 비타민 C(비타민 C는 건물을 기준으로 약 200 내지 약 600 ppm 범위의 양으로 사료 조성물에 존재함) 및/또는 비타민 E(비타민 E는 건물을 기준으로 약 600 내지 약 2000 ppm 범위의 양으로 사료 조성물에 존재함) 및/또는 카로테노이드(카로테노이드는 건물을 기준으로 약 30 내지 약 100 ppm 범위의 양으로 사료 조성물에 존재함)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 산화 방지제 공급원을 포함하는 건식 개 사료 조성물이고, 산화 방지제 공급원은 공급 상태로(as fed) 약 200 내지 약 400 ppm 범위의 양의 비타민 C 및/또는 공급 상태로 약 600 내지 약 1000 ppm 범위의 양의 비타민 E 및/또는 공급 상태로 약 2 내지 약 10 ppm 범위의 양의 카로테노이드를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 쿠쿠미노이드(curcuminoid) 공급원을 추가로 포함한다.

가장 바람직한 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 건물을 기준으로 약 250 내지 약 2000 ppm 범위의 양의 쿠쿠미노이드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 터메릭(turmeric) 추출물을, 예컨대 공급 상태로 약 300 내지 약 700 ppm 범위의 양으로 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 카노스산(carnosic acid)/카노솔(carnosol) 공급원을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 카노스산 및 카노솔 공급원으로서 로즈마리 추출물을 추가로 포함한다. 애완동물 사료 조성물의 기타 성분에 대해 말하자면, 애완동물 사료 조성물에 존재하는 로즈마리 추출물의 양은 카노스산 및 카노솔의 상기 추출물의 함량에 따라 변할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 사료는 로즈마리 추출물을 추가로 포함하고, 상기 로즈마리 추출물은 공급 상태로 약 50 내지 약 120 ppm 범위의 양으로 존재할 수 있다.

가장 바람직한 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 건물을 기준으로 약 20 내지 약 90 ppm 범위의 양의 카노스산 및 카노솔을 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 피페린(piperine) 공급원을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 건식 개 사료이고, 피페린 공급원을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 피페린 공급원은 페퍼 추출물로 구성될 수 있다.

본원에 따른 사료 조성물의 일부 실시양태에서, 피페린 공급원은 페퍼 추출물로 구성되고, 페퍼 추출물은 공급 상태로 약 15 내지 약 35 ppm 범위의 양으로 조성물에 존재한다.

가장 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 건물을 기준으로 14 내지 60 ppm 범위의 양의 피페린을 포함한다.

본원에 따른 사료 조성물의 일부 실시양태에서, 피페린 공급원은 페퍼 추출물로 구성된다.

피페린의 상기 페퍼 추출물의 함량에 따라, 페퍼 추출물은 가장 바람직하게는 사료 조성물에서 건물을 기준으로 14 내지 60 ppm 범위의 최종 함량을 달성하기에 적합한 양으로 조성물에 존재한다.

상기 애완동물 사료 조성물이 페퍼 추출물 형태의 피페린 공급원을 포함하는 건식 개 사료 조성물인 실시양태에서, 페퍼 추출물은 공급 상태로 15 내지 35 ppm 범위의 양으로 건식 개 사료 조성물에 존재한다.

일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 터메릭 추출물 및/또는 로즈마리 추출물 및/또는 페퍼 추출물 및/또는 녹차 추출물 및/또는 석류 추출물을 포함한다. 일부 이들 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 쿠쿠미노이드 공급원 및 로즈마리 추출물 공급원, 및 임의적으로 또한 피페린 공급원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 사료 조성물은 건식 개 사료 조성물이다.

또한, 본원은 암에 걸려 화학 요법 중인 개를 지원하는 데 사용하기 위한, 본원에 걸쳐 정의된 사료 조성물에 관한 것이다.

도 1은 중간 지방 영양 조성물을 공급받은 동물의 시간에 따른 배설물 점수를 도시한다.
세로 좌표: 주간 배설물 점수의 평균 값.
가로 좌표: (i) 좌측 패널: 동물의 시험군; (ii) 우측 패널: 동물의 대조군. 좌측 패널 및 우측 패널 각각에서, 각각의 패널 좌측에서 우측으로 하기와 같다: 동물에게 본 발명의 조성물(좌측 패널) 또는 통상적인 조성물(우측 패널)을 공급하기 시작한 후 시간: (i) 제1주, (ii) 제2주, (iii) 제3주, (iv) 제4주, (v) 제5주, (vi) 제6주, (vii) 제7주, (viii) 제8주.
도 2는 중간 지방 영양 조성물을 공급받은 동물의 시간에 따른 전반적인 QOL 점수 값을 나타낸다.
세로 좌표: 사례의 백분율.
가로 좌표: (1) 쌍을 이룬 막대의 각각의 군, 좌측에서 우측으로 하기와 같다: (i) 중간 지방 영양 조성물을 공급받은 동물, (ii) 통상적 영양 조성물을 공급받은 동물. (2) 쌍을 이룬 막대의 군, 좌측에서 우측으로 하기와 같다: (i) 기선, (ii) 제2주, (iii) 제4주, (iv) 제6주, (v) 제8주. 각각의 막대에서, 채색된 구획은 위에서 아래로 하기와 같다: (i) 불량함, (ii) 적정함, (iii) 양호함, (iv) 매우 양호함, (v) 훌륭함. 각각의 구획에서, 숫자는 동물의 수를 나타낸다.
도 3은 다양한 개 종양 세포주에 대한 식물 추출물의 항증식 효과를 나타낸다.
도 3a는 다양한 개 종양 세포주에 대한 석류 40% 엘라그산 추출물(POE40(등록상표))의 항증식 활성을 나타낸다. 도면의 상부에서 하부로 세포 좌표는 하기와 같다: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물의 최종 농도(μg/mL).
도 3b는 다양한 개 종양 세포주에 대한 녹차 추출물(나투렉스((Naturex))의 항증식 활성을 나타낸다. 도면의 상부에서 하부로, 세로 좌표는 하기와 같다: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물의 최종 농도(μg/mL).
도 3c는 다양한 개 종양 세포주에 대한 블랙 페퍼 추출물(VETPERINE(등록상표))의 항증식 활성을 나타낸다. 도면의 상부에서 하부로, 세로 좌표는 하기와 같다: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물의 최종 농도(μg/mL).
도 3d는 다양한 개 종양 세포주에 대한 로즈마리 추출물(INOLENS70(등록상표))의 항증식 활성을 나타낸다. 도면의 상부에서 하부로, 세로 좌표는 하기와 같다: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물의 최종 농도(μg/mL).
도 3e는 다양한 개 종양 세포주에 대한 터메릭 뿌리(나투렉스) 추출물의 항증식 활성을 나타낸다. 도면의 상부에서 하부로, 세로 좌표는 하기와 같다: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물의 최종 농도(μg/mL).
도 3f는 다양한 개 종양 세포주에 대한 석류 40% 푸니코시드(punicoside) 추출물(P40P(등록상표))의 항증식 활성을 나타낸다. 도면의 상부에서 하부로, 세로 좌표는 하기와 같다: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물의 최종 농도(μg/mL).
도 4는 다양한 개 종양 세포주에 대한 2개의 식물 추출물의 조합의 항증식 효과를 나타낸다.
도 4a는 C2 암 세포주의 증식에 대한 로즈마리 추출물 및 터메릭 추출물의 조합의 항증식 효과를 나타낸다. 곡선: (i) 파선: 터메릭 추출물, (ii) 점선: 로즈마리 추출물(70% w/w 카노스산); (iii) 실선: 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물(70% w/w 카노스산)의 조합. 세로 좌표: 이들 추출물의 부재 하에 대조군 배양물과 비교한 증식 세포의 백분율. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물 조합의 최종 농도(μg/mL).
도 4b는 CMT-12 암 세포주의 증식에 대한 로즈마리 추출물 및 터메릭 추출물의 조합의 항증식 효과를 나타낸다. 곡선: (i) 파선: 터메릭 추출물, (ii) 점선: 로즈마리 추출물(70% w/w 카노스산); (iii) 실선: 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물(70% w/w 카노스산)의 조합. 세로 좌표: 이들 추출물의 부재 하에 대조군 배양물과 비교한 증식 세포의 백분율. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물 조합의 최종 농도(μg/mL).
도 4c는 D17 암 세포주의 증식에 대한 로즈마리 추출물 및 터메릭 추출물의 조합의 항증식 효과를 나타낸다. 곡선: (i) 파선: 터메릭 추출물, (ii) 점선: 로즈마리 추출물(70% w/w 카노스산); (iii) 실선: 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물(70% w/w 카노스산)의 조합. 세로 좌표: 이들 추출물의 부재 하에 대조군 배양물과 비교한 증식 세포의 백분율. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물 조합의 최종 농도(μg/mL).
도 5는 다양한 개 종양 세포주에 대한 상이한 공급원으로부터의 별개의 식물 추출물의 항증식 활성을 나타낸다.
도 5a는 개 종양 세포주 C2에 대한 하기 추출물 조합의 항증식 활성을 나타낸다: (i) 터메릭 추출물(나투렉스) 및 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), (ii) 터메릭 추출물(나투렉스) 및 로즈마리 추출물 INOLENS50(등록상표), (iii) 터메릭 추출물 BCM-95(등록상표) 및 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), 및 (iv) 터메릭 추출물 BCM-95(등록상표) 및 로즈마리 추출물 INOLENS50(등록상표). 세로 좌표: 상기 식물 추출물의 부재 하에 수행된 대조군 배양물과 비교한 생존 세포의 백분율. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물 조합의 최종 농도(μg/mL).
도 5b는 개 종양 세포주 CMT-12에 대한 하기 추출물 조합의 항증식 활성을 나타낸다: (i) 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), (ii) 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물 INOLENS50(등록상표), (iii) 터메릭 추출물 BCM-95(등록상표) 및 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), 및 (iv) 터메릭 추출물 BCM-95(등록상표) 및 로즈마리 추출물 INOLENS50(등록상표). 세로 좌표: 상기 식물 추출물의 부재 하에 수행된 대조군 배양물과 비교한 생존 세포의 백분율. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물 조합의 최종 농도(μg/mL).
도 5c는 개 종양 세포주 D17에 대한 하기 추출물 조합의 항증식 활성을 나타낸다: (i) 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), (ii) 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물 INOLENS50(등록상표), (iii) 터메릭 추출물 BCM-95(등록상표) 및 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), 및 (iv) 터메릭 추출물 BCM-95(등록상표) 및 로즈마리 추출물 INOLENS50(등록상표). 세로 좌표: 상기 식물 추출물의 부재 하에 수행된 대조군 배양물과 비교한 생존 세포의 백분율. 가로 좌표: 세포 배양물에서 추출물 조합의 최종 농도(μg/mL).
도 6은 연한천 콜로니 형성 분석에서 천연 추출물의 항증식 활성을 나타낸다. 세로 좌표: 추출물의 부재 하에 수행된 대조군 배양물과 비교한 생존 세포의 백분율. 좌측에서 우측으로, 가로 좌표의 막대는 하기와 같다: (i) 대조군(DMSO), (ii) 0.4 μg/mL 쿠쿠민(curcumin) 추출물(나투렉스의 터메릭 추출물), (iii) 0.8 μg/mL 로즈마리 INOLENS70(등록상표), (iv) 6.25 μg/mL VETPERINE(등록상표), (v) 0.4 μg/mL 쿠쿠민 추출물(나투렉스) 및 0.8 μg/mL 로즈마리 INOLENS70(등록상표), 및 (vi) 0.4 μg/mL 쿠쿠민 추출물(나투렉스), 0.8 μg/mL 로즈마리 INOLENS70(등록상표) 및 6.25 μg/mL VETPERINE(등록상표).
도 7은 개 세포에 대한 다양한 식물 추출물의 세포독성 활성을 나타낸다. 세로 좌표: 상기 식물 추출물의 부재 하에 대조군 배양물과 비교한 생존 세포의 백분율. 가로 좌표: (1) 좌측에서 우측으로, 막대의 군은 하기 개 종양 세포주를 나타낸다: (i) CDF, (ii) C2, (iii) CMT-12, (iv) D17; (2) 각각의 군의 막대는, 좌측에서 우측으로 하기와 같다: (i) 대조군(DMSO), (ii) 6.3 μg/mL 터메릭 추출물(나투렉스), (iii) 6.3 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), (iv) 3.1 μg/mL 터메릭 추출물(나투렉스) 및 3.1 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표).
도 8은 식물 추출물의 항증식 활성 및 세포독성 효과의 메커니즘을 나타낸다.
도 8a 내지 8d는 유세포 분석의 결과로 구성되되, 여기서 각각의 사분면은 하기에 상응하는 이벤트의 수를 나타낸다: (i) 좌측 하부 사분면: 살아있는 것으로 평가된 세포, (ii) 우측 하부 사분면: 조기 세포사멸로 평가된 세포, (iii) 우측 상부 사분면: 후기 세포사멸/괴사로 평가된 세포. 세로 좌표: 7-AAD-발현 세포의 형광 신호(임의 단위). 가로 좌표: 아넥신(Annexin)-V-양성 세포의 형광 신호(임의 단위).
도 8e는 조기 사멸 세포(아넥신 V 양성 및 7-AAD 음성 세포의 우측 하부 사분면)의 백분율을 3회의 독립적인 반복 시험의 평균 ± 표준 편차로서 나타낸다. 각각의 세포주 내에서, 상이한 문자를 갖는 평균은 서로 유의미하게 상이하다(p<0.05). 세로 좌표: 사멸 세포 백분율. 가로 좌표: (1) 좌측에서 우측으로, 막대의 군은 하기 개 종양 세포주를 나타낸다: C2, CMT-12 및 D17. (2) 각각의 군의 막대는 좌측에서 우측으로 하기와 같다: (i) 대조군(DMSO), (ii) 6.3 μg/mL 터메릭 추출물(나투렉스), (iii) 6.3 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), (iv) 3.1 μg/mL 터메릭 추출물, 3.1 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표).
도 9는 식물 추출물의 세포사멸 활성을 나타낸다. 세로 좌표: 활성화된 카스파제 3/7의 변화 배수(fold change). 가로 좌표: (1) 막대의 군은 좌측에서 우측으로 하기 개 종양 세포주를 나타낸다: C2, CMT-12 및 D17. (2) 각각의 군의 막대는 좌측에서 우측으로 하기와 같다: (i) 대조군(DMSO), (ii) 6.3 μg/mL 터메릭 추출물(나투렉스), (iii) 6.3 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), (iv) 3.1 μg/mL 터메릭 추출물(나투렉스), 3.1 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표).
도 10은 식물 추출물의 산화 방지제 활성을 나타낸다. 세로 좌표: 반응성 산소 종(ROS) 생산의 변화 배수. 가로 좌표: (1) 막대의 군은 좌측에서 우측으로 하기 개 종양 세포주를 나타낸다: C2, CMT-12 및 D17. (2) 각각의 군의 막대는 좌측에서 우측으로 하기와 같다: (i) 대조군(DMSO), (ii) 6.3 μg/mL 터메릭 추출물(나투렉스), (iii) 6.3 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), (iv) 3.1 μg/mL 터메릭 추출물(나투렉스), 3.1 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표).
도 11은 식물 추출물에 의한 SAPK/JNK 경로 활성화를 나타낸다.
도 11a는 C2 세포주를 사용하여 수행한 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 실험의 결과를 나타낸다. 도 11b는 CMT-12 세포주를 사용하여 수행한 웨스턴 블롯팅 실험의 결과를 나타낸다.
도 11a 및 11b의 레인은 좌측에서 우측으로 하기와 같다: (i) 12시간 배양 후 대조군(DMSO), (ii) 24시간 배양 후 대조군(DMSO), (iii) 12시간 배양 후 터메릭 추출물(나투렉스)(6.3 μg/mL), (iv) 24시간 배양 후 터메릭 추출물(나투렉스)(6.3 μg/mL), (v) 12시간 배양 후 로즈마리 추출물(INOLENS70(등록상표))(6.3 μg/mL), (vi) 24시간 배양 후 로즈마리 추출물(INOLENS70(등록상표))(6.3 μg/mL), (vii) 12시간 배양 후 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물의 조합(3.1 μg/mL), (viii) 24시간 배양 후 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물의 조합(3.1 μg/mL).
도 12는 로즈마리 추출물로 처리된 세포에 의한 쿠쿠민의 축적을 나타낸다.
도 12a: C2 세포주에 대한 효과. 도 12b: CMT-12 세포주에 대한 효과. 도 12c: D17 세포주에 대한 효과.
도 12a, 12b 및 12c에서, 세로 좌표: 로즈마리 추출물이 부재하는 대조군 배양물과 비교한 쿠쿠민의 변화 배수. 가로 좌표는 좌측에서 우측으로 하기와 같다: (i) 대조군(DMSO), (ii) 3.1 μg/mL 터메릭 추출물(나투렉스), (iii) 3.1 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표), (iv) 3.1 μg/mL 터메릭 추출물(나투렉스) 및 3.1 μg/mL 로즈마리 추출물 INOLENS70(등록상표).

본원은 화학 요법 중이고/이거나 (ii) 화학 요법에 의한 치료 기간 후에(일일 소비), 암으로 진단받은 개를 위해 이용가능한 영양 제품을 제조하는 것을 목적으로 한다. 이러한 사료 조성물은 양호한 QOL을 유지하고 화학 요법의 부작용을 제한하고(예를 들어 "치료에 대한 지원"을 통해 암과 투병하는 개를 보조함) 양호한 영양 상태를 유지할 수 있어야 한다(체중 유지, 양호한 소화 건강(digestive health)).

이러한 목표는 많은 양의 단백질, 적당량의 탄수화물 및 적당량의 지방을 갖는 영양 조성물을 제공함으로써 달성되었다. 본원 실시예에 나타내는 바와 같이, 이러한 영양 조성물은, 암에 걸린 개, 특히 항암 화학 요법 치료 중인 개에게 제공될 때, 잘 관용되며, 병의 징후를 실질적으로 감소시키고, 개의 생활의 질을 유의미하게 개선한다. 또한, 본원에 개시된 고 단백질/중간 탄수화물 및 지방을 공급받은 암에 걸린 개의 생활의 질의 개선은 이러한 사료 식이 요법의 시작 후 짧은 시간 후에 용이하게 발생하고, 전형적으로 이러한 사료 식이 요법의 시작 후 단지 4주 후에 발생한다.

본원은 많은 양의 단백질 및 적당량의 탄수화물 및 지방을 갖는 사료 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 암에 걸린 동물, 보다 특히 치료, 예컨대 화학 요법이 진행 중인 암에 걸린 동물을 지원하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 사료 조성물은 치료, 예컨대 화학 요법 중인 암에 걸린 동물을 지원하는 방법에서 사용될 수 있다. 또한, 조성물은 암의 치료 방법에서 사용될 수 있다.

본원은 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 60 중량%의 단백질을 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

일부 실시양태에서, 본원의 사료 조성물은 습식 애완동물 사료 조성물, 예컨대 습식 개 사료 조성물로 구성된다.

일부 다른 실시양태에서, 본원의 사료 조성물은 반습식 애완동물 사료 조성물, 예컨대 반습식 개 사료 조성물로 구성된다.

일부 추가적 실시양태에서, 본원의 사료 조성물은 건식 애완동물 사료 조성물, 예컨대 건식 개 사료 조성물로 구성된다.

본원에 사용된 "약" 또는 "대략"은 당분야의 통상의 기술 중 하나에 의해 결정되는 특정 값의 허용되는 오차 범위 이내를 의미하며, 이는 값을 측정하거나 결정하는 방법, 즉 측정 시스템의 제한에 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당분야의 실행에 따라 3개 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 제시된 값의 20% 이하, 바람직하게는 10% 이하, 보다 바람직하게는 5% 이하, 보다 더 바람직하게는 1% 이하 범위를 의미할 수 있다. 또한, 특히 시스템 및 공정에 관하여, 상기 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배 이내, 보다 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "건식 애완동물 사료", "건식 사료", "습식 애완동물 사료", "습식 사료", "반습식 애완동물 사료" 및 "반습식 사료"는 애완동물이 이의 식단으로 소비하는 임의의 제품을 포함하는 영양상 완전한 애완동물 사료 조성물을 지칭한다. 애완동물 사료 조성물은 바람직하게는 조리된 제품이다. 이는 육류 또는 동물 유래된 물질(예컨대 소고기, 닭고기, 칠면조고기, 양고기, 생선, 혈장, 골수 등 또는 이들 중 하나 이상)을 포함할 수 있다. 애완동물 사료 조성물은 대안적으로 단백질 공급하기 위해 육류 미함유물(meat-free)일 수 있다(바람직하게는 육류 대용물, 예컨대 대두, 옥수수 글루텐 또는 대두 제품을 포함함).

본원에 사용된 "건식" 애완동물 사료 조성물은 15% 이하의 수분 함량, 예컨대 1 내지 15% 범위의 수분 함량을 갖는다.

본원에 사용된 "반습식" 애완동물 사료 조성물은 15 초과 내지 50% 범위의 수분 함량을 갖는다.

본원에 사용된 "습식" 애완동물 사료 조성물은 90% 이하의 수분 함량, 예컨대 50 초과 내지 90% 범위의 수분 함량을 갖는다.

일부 이들 양상에서, 본원은 암에 걸린 개에게 유용한, 지방, 섬유질 및 단백질을 포함하는 사료 조성물에 관한 것으로서, 이는 건물을 기준으로 약 10 내지 약 20% 범위의 양의 지방, 건물을 기준으로 약 5 내지 약 15% 범위의 양의 섬유질, 및 건물을 기준으로 약 30 내지 약 50% 범위의 양의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본원은 지방, 섬유질 및 단백질을 포함하는 사료 조성물에 관한 것으로서, 여기서 조성물의 총 건물 중량을 기준으로, 지방은 약 10 내지 약 20 중량% 범위의 양으로 포함되고, 섬유질은 약 5 내지 약 15 중량% 범위의 양으로 포함되고, 단백질은 약 30 내지 약 50 중량% 범위의 양으로 포함된다.

본원은 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 50 중량%의 단백질을 포함하는 사료 조성물에 관한 것이다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

용어 "건물(DM) 기준"은 건물 함량(수분이 제거된 후에 남아있는 농도)에 대한 농도를 표현함으로써 공급물의 영양소 또는 성분의 농도를 표현하는 방법으로서 해석되어야 한다. 반대로, 용어 "공급 상태로"는, 수분을 함유하는, 공급된 상태에서 이의 농도를 표현함으로써 공급물의 영양소 또는 성분의 농도를 표현하는 방법으로 해석되어야 한다.

전술된 바와 같이, 본원의 사료 조성물은 건식 애완동물 사료 조성물, 반습식 애완동물 사료 조성물 또는 습식 애완동물 사료 조성물로 구성될 수 있다.

본원에 기재된 애완동물 사료 조성물의 지방, 섬유질, 단백질 및 탄수화물의 각각의 양은 상기 조성물의 건물의 총 중량을 기준으로, 따라서 상기 애완동물 사료 조성물의 수분 함량과는 관계없이 표현된다.

본원에 기재된 사료 조성물에 포함될 수 있는 다른 성분은 "ppm" 단위("백만분율"로도 지칭됨)로 표현될 수 있고, 이는 애완동물 사료 조성물에 포함되는 경우를 포함하여 조성물에 포함된 물질의 양을 명시하는 또 다른 통상적인 방법이다.

본원에 걸쳐서, "ppm" 단위로 표현되는 제시된 물질의 양은 (i) "공급 상태로" 조성물에서의 양 또는 (ii) "건물 기준" ppm 양을 의미하며, 이는 명시될 것이다.

제시된 물질의 양을 본원에서 "공급 상태로" ppm으로 표현하는 경우, ppm 단위의 수량의 값은 애완동물 사료 조성물의 수분 함량에 따라 변할 수 있다. 예시적으로, 50%의 수분 함량을 갖고 "공급 상태로" 100 ppm의 제시된 물질의 양을 포함하는 애완동물 사료 조성물은, 30%의 수분 함량을 갖고 "공급 상태로" 140 ppm의 상기 제시된 물질을 포함하는 애완동물 사료 조성물과 비교하여, 건물 기준으로 표현되는 경우 동일한 양의 상기 제시된 물질을 갖고, 즉 둘 모두의 경우에 애완동물 사료 조성물은 건물을 기준으로 200 ppm의 상기 제시된 물질을 포함한다.

당분야에 통상적인 바와 같이, "공급 상태로 ppm"으로 표현되는 애완동물 사료 조성물에 포함되는 제시된 물질의 양은, 하기 수학식을 사용하여, 애완동물 사료 조성물의 총 건물을 기준으로 표현되는 상기 제시된 물질의 양으로 용이하게 전환된다.

Y mg/100 g DM = X ppm(공급 상태)*100/(%건물)

상기 식에서,

- Y는 애완동물 사료 조성물에 함유된, 100 g의 건물(DM) 당 상기 제시된 물질의 양(mg)이고,

- X는 애완동물 사료 조성물에서 상기 제시된 물질의 양(ppm)이고,

- %건물은 애완동물 사료 조성물에서 건물의 백분율이다.

또한, 하기 다른 수학식이 사용될 수 있다:

(% X(공급 상태))*100/(%건물) = Y g/100 g DM

상기 식에서,

- %X는 "레디 투 잇(ready to eat)" 애완동물 사료 조성물에서 상기 제시된 물질의 양(중량%)이고,

- %건물은 "레디 투 잇" 애완동물 사료 조성물에서 건물의 백분율이고,

- Y는 "레디 투 유즈(ready to use)" 애완동물 사료 조성물에 함유된, 100 g의 건물(DM) 당 상기 제시된 물질의 양(g)이다.

본원의 목적을 위해, 달리 지시되지 않는 한, 건식 개 사료 조성물에 포함된 물질의 백분율은 상기 조성물의 건물의 총 중량을 기준으로 한 중량%로 구성된다.

본원에 기재된 사료 조성물의 제1 양상은 내부에 포함된 중간 수준의 지방으로 구성된다. 전술된 바와 같이, 지방이 암 세포에 대해 쉽게 사용되지 않는 에너지원을 나타내기 때문에 고 수준의 지방이 암 치료 중인 동물을 위한 사료에 존재해야 함이 과학계에서 흔히 인정된다. 본원의 특정한 획기적인 양상은 이러한 편견과는 대조적으로 비교적 중간 수준의 지방을 포함하는 조성물을 처음으로 기재한다. 본 발명자들은, 암에 걸린 개, 특히 항암 치료, 예를 들어 화학 요법에 의한 암 치료 중인 암에 걸린 개에서 사용하기 위한 사료 조성물에 포함될 수 있는 최적의 지방 함량을 정의하였다. 본 발명자들은 지방의 함량이, 생성된 개 사료 조성물이 칼로리 함량의 적어도 최소 필요요건을 갖추기 위해, 너무 낮지 않을 것임을 본원에서 결정하였다. 그러나, 본 발명자들은 또한 지방 함량이, 생성된 개 사료 조성물을 암에 걸린 동물이 잘 관용하도록, 너무 높지 않을 것임을 본원에서 결정하였다. 병에 걸린 동물의 암 치료가 소화계의 기능에 있어서 변화를 초래하는 것이 주지되어 있다. 따라서, 본 발명자들은, 암에 걸린 개에 의해 잘 관용되는, 특히 암 치료 중인 암에 걸린 개에 의해 잘 관용되는 조성물을 설계함에 있어서 주의를 기울였다.

바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 건식 개 사료 조성물은 건물을 기준으로(즉 조성물의 총 건물 중량을 기준으로) 10 내지 20 중량% 범위의 양, 바람직하게는 12 내지 16 중량% 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 약 13 중량%의 양의 지방을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "지방" 또는 "지방 공급원"은, 실온에서의 농도와 관계없이, 즉 상기 "지방 공급원"이 본질적으로 액체 형태로 또는 본질적으로 고체 형태로 존재하는지에 관계없이, 사료로 허용되는 임의의 지방 및/또는 오일을 포함한다. 본원에 따른 조성물은 동물 및/또는 야채 기원의 지방을 포함할 수 있다. 지방은 당업자에게 공지된 임의의 다양한 공급원에 의해 공급될 수 있다. 식물 지방 공급원은 비제한적으로 밀, 해바라기, 잇꽃, 유채 씨, 올리브, 보리지, 아마 씨, 땅콩, 까막까치밥나무 씨, 목화 씨, 맥아, 옥수수 배아뿐만 아니라, 이들로부터 유래된 오일 및 기타 식물 지방 공급원을 포함한다. 동물 공급원은 예를 들어 비제한적으로 닭고기 지방, 칠면조고기 지방, 소고기 지방, 오리고기 지방, 돼지고기 지방, 양고기 지방 등, 어유 또는 임의의 육류, 육류 부산물, 해산물, 유제품, 달걀 등을 포함한다. 사료의 지방 함량은 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 결정될 수 있다.

본원에 기재된 사료 조성물의 제2의 특정한 양상은 내부에 포함된 섬유질의 수준으로 구성된다.

용어 "섬유질"은 "식이 섬유질"과 유사하며, 본원의 목적을 위해 전체 섬유질로서 가용성 섬유질 및 불용성 섬유질을 포함하는 것을 의미한다. 가용성 섬유질(발효성 섬유질로도 지칭됨)은 소장에서 소화 및 흡수에 대한 저항력이 있고 대장에서 완전 또는 부분적 발효를 겪는 것으로 정의된다. 가용성 섬유질의 비제한적인 예로서, 비트 펄프, 구아 검, 치커리 뿌리, 사일륨(psyllium), 펙틴, 블루베리, 크랜베리, 늙은 호박, 사과, 귀리, 빈, 시트러스, 보리 또는 완두콩을 언급할 수 있다. 바람직한 가용성 섬유질은 치커리 펄프이다. 가용성 섬유질은 결장 세포에 에너지원으로서 단쇄 지방산을 제공함으로써 프리바이오틱(prebiotic) 효과를 갖는 것으로 간주된다. 반대로, 불용성 섬유질(비-발효성 섬유질로도 지칭됨)은 소장에서 소화 및 흡수에 대한 저항력이 있고 대장에서 발효에 대한 저항력이 있는 비-전분 폴리사카라이드로서 정의될 수 있다. 불용성 섬유질의 비제한적인 예로서, 셀룰로스, 통밀 제품, 밀 귀리, 옥수수 겨, 아마 씨, 포도, 셀러리, 그린빈, 콜리플라워, 감자 껍질, 과일 껍질, 야채 껍질, 땅콩 깍지 및 대두 섬유질이 언급될 수 있다. 바람직한 불용성 섬유질은 셀룰로스이다. 불용성 섬유질은 통과(transit) 및 밸러스트(ballast) 효과를 위해 유용한 것으로 간주된다. 바람직한 실시양태에서, 본원의 조성물은 건물을 기준으로 5 내지 15%, 바람직하게는 7 내지 10%, 보다 더 바람직하게는 약 8.9%의 양의 섬유질을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 사료 조성물은 또한 소화 건강을 개선하기 위해 사일륨을 포함할 수 있는데, 이는 사일륨이 액체 배설물에 굳기를 제공하고 건조한 배설물을 연화시킬 수 있기 때문이다. 우선적으로, 본원에 개시된 건식 개 사료 조성물은 건물을 기준으로(즉 조성물의 총 건물 중량을 기준으로) 0.2 내지 1 중량% 범위의 양, 보다 우선적으로 약 0.5 중량%의 양의 사일륨을 포함한다.

본원에 개시된 사료 조성물의 제3의 특정한 양상은 내부에 포함된 단백질의 수준으로 구성된다. 단백질 수준은 제지방 체중의 유지를 보장하기 위해 높아야 한다. 본원에 따른 사료 조성물은 하나 이상의 별개의 단백질을 함유할 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 사료 조성물은 제조 공정에서 사용되는 단백질 공급원에 함유된 다수의 단백질을 포함한다. 일부 실시양태에서, 사료 조성물에 포함된 단백질은 천연 형태이다. 일부 다른 실시양태에서, 단백질은 적어도 부분적으로 가수분해된 형태로 존재할 수 있으며, 이는 거의 완전히 가수분해된 단백질을 포함한다. 본원에 따른 사료 조성물은 육류 또는 동물 유래된 물질(예컨대 소고기, 닭고기, 칠면조고기, 양고기, 생선, 혈장, 골수 등 또는 이들 중 하나 이상이 것)의 형태의 단백질을 포함할 수 있다. 일부 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 사료 조성물은 육류 미함유물일 수 있고, 바람직하게는 육류 대용물 단백질 공급원, 예컨대 대두, 옥수수 글루텐 또는 임의의 다른 단백질-함유 대두 제품을 단백질 공급원을 제공하기 위해 포함한다. 본원에 개시된 사료 조성물은 추가적 단백질 공급원, 예컨대 대두 단백질 농축물, 유단백질, 글루텐 등을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 사료 조성물은 건물을 기준으로(즉 조성물의 총 건물 중량을 기준으로) 약 15 내지 약 40 중량% 범위의 양의 탄수화물을 추가로 포함한다.

본원에 사용된 용어 "탄수화물"은 체내에서 가수분해될 때 에너지를 위해 대사되는 폴리사카라이드 및 당을 포함한다. 사료의 탄수화물 함량은 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 본원에서는, 반대가 분명히 명시되지 않는 한, 탄수화물 백분율은 무질소 추출물(NFE)로서 계산되며, 이는 하기와 같이 계산될 수 있다:

NFE = 100% - 수분% - 단백질% - 지방% - 재% - 미가공 섬유질%

탄수화물은, 귀리 섬유질, 셀룰로스, 땅콩 깍지, 비트 펄프, 파라보일드 라이스, 옥수수 전분, 옥수수 글루텐 밀 및 이들 공급원의 임의의 조합을 포함하는 당업자에게 공지된 임의의 다양한 탄수화물 공급원의 형태로 공급될 수 있다. 탄수화물을 공급하는 곡물은 비제한적으로 밀, 옥수수, 보리 및 쌀을 포함한다.

본원에 따른 사료의 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 건식 애완동물 사료 조성물의 수분 함량은 건물을 기준으로(즉 조성물의 총 건물 중량을 기준으로) 1 내지 15 중량%, 유리하게는 5 내지 12 중량%, 보다 우선적으로 8 내지 10 중량% 범위이다. 가장 바람직한 실시양태에서, 수분 함량은 건물을 기준으로(즉 조성물의 총 건물 중량을 기준으로) 약 9.5 중량%이다.

추가적 성분

일부 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 산화 방지제 공급원을 추가로 포함한다.

용어 "산화 방지제"는 자유 라디칼과 반응하여 이를 중화시킬 수 있는 물질 또는 성분을 의미한다. 이러한 물질의 예시적 예는 비제한적으로 카로테노이드(베타-카로틴, 리코펜 및 루테인을 포함함), 셀레늄, 코엔자임 Q10(유비퀴논), 토코트라이엔올, 대두 이소플라본, S-아데노실메티오닌, 글루타티온, 타우린, N-아세틸시스테인, 비타민 E, 비타민 C, 리포산 및 L-카르니틴을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 사료 조성물은 비타민 C를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 사료 조성물은 비타민 E를 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 사료 조성물은 카로테노이드를 포함한다. 바람직한 카로테노이드는 루테인 및 베타-카로틴이다.

바람직한 실시양태에서, 사료 조성물은 루테인을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 사료 조성물은 산화 방지제의 조합, 예컨대 비타민 C 및/또는 비타민 E 및/또는 카로테노이드 및/또는 타우린의 조합을 포함한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 사료 조성물은 비타민 C, 비타민 E 및 카로테노이드의 조합을 포함한다.

일부 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 비타민 C를 포함하는 산화 방지제 공급원을 추가로 포함한다.

가장 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 건물을 기준으로 200 내지 600 ppm 범위의 양의 비타민 C를 포함한다.

일부 가장 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 건식 애완동물 사료 조성물이고, 비타민 C를 포함하는 산화 방지제 공급원을 포함하되, 비타민 C는 건물을 기준으로 220 내지 440 ppm 범위의 양으로 존재한다.

일부 가장 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 습식 애완동물 사료 조성물이고, 비타민 C를 포함하는 산화 방지제 공급원을 추가로 포함하되, 비타민 C는 건물을 기준으로 200 내지 600 ppm 범위의 양으로 존재한다.

일부 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 건식 애완동물 사료 조성물이고, 비타민 E를 포함하는 산화 방지제 공급원을 추가로 포함하되, 사료 조성물에서 비타민 E의 최종량은 건물을 기준으로 660 내지 1100 ppm 범위의 양이다.

일부 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 습식 애완동물 사료 조성물이고, 비타민 E를 포함하는 산화 방지제 공급원을 추가로 포함하되, 사료 조성물에서 비타민 E의 최종량은 건물을 기준으로 600 내지 2000 ppm(800 내지 1300 ppm을 포함함) 범위의 양이다.

일부 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 건식 애완동물 사료 조성물이고, 카로테노이드를 포함하는 산화 방지제 공급원을 추가로 포함한다.

본원에 따른 건식 애완동물 사료의 가장 바람직한 실시양태에서, 카로테노이드는 건물을 기준으로 2 내지 12 ppm 범위의 양으로 사료 조성물에 존재한다.

일부 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 습식 애완동물 사료 조성물이고, 카로테노이드를 포함하는 산화 방지제 공급원을 추가로 포함한다.

일부 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 습식 애완동물 사료 조성물이고, 카로테노이드를 추가로 포함하되, 카로테노이드는 건물을 기준으로 2 내지 100 ppm(30 내지 100 ppm을 포함함) 범위의 양으로 상기 습식 애완동물 사료에 존재한다.

비제한적인 실시양태로서, 비타민 C(약 300 ppm), 비타민 E(약 800 ppm), 루테인(약 5pp), 타우린(약 0.625 g/MCal) + 비타민 D3(약 1000 IU/kg)을 포함하는, "CELT 칵테일(cocktail)"로서 지칭되는 산화 방지제의 조합이 사용될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 또한 단쇄 지방산으로서 프리바이오틱 효과 및 결장 세포에 대한 에너지원을 위해 나트륨 부티레이트를 포함할 수 있다. 우선적으로, 사료 조성물은 건물을 기준으로(즉 조성물의 총 건물 중량을 기준으로) 0.2 내지 1 중량%의 부티레이트 나트륨, 보다 우선적으로 약 0.5 중량%의 부티레이트 나트륨을 포함한다.

상기 부티레이트 나트륨과 같은 목표에 있어서, 본원에 따른 사료 조성물은 배설물 굳기를 개선하기 위해 제올라이트를 또한 포함할 수 있다. 우선적으로, 사료 조성물은 건물을 기준으로(즉 조성물의 총 건물 중량을 기준으로) 0.5 내지 1.5 중량%, 보다 우선적으로 약 1 중량%의 제올라이트를 포함한다.

일부 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 사료 조성물은 또한 특이 면역을 증진시키기 위한 보충제로서 아르기닌을 포함할 수 있다. 우선적으로, 사료 조성물은 건물을 기준으로(즉 조성물의 총 건물 중량을 기준으로) 1 내지 4 중량%, 보다 우선적으로 2 내지 3 중량%, 보다 더 우선적으로 약 2.7 중량%의 아르기닌을 포함한다.

또 다른 실시양태에서, 사료 조성물은 또한 대사 상태를 개선하고 항염증 효과를 생성하기 위해 EPA/DHA를 포함할 수 있다. 우선적으로, 사료 조성물은 건물을 기준으로(즉 조성물의 총 건물 중량을 기준으로) 0.4 내지 0.8 중량%, 보다 우선적으로 약 0.6 중량%의 EPA/DHA를 포함한다.

본원 실시예에 나타내는 바와 같이, 본원에 따른 사료 조성물이, 암 세포에 대한 항증식 및/또는 전세포사멸 효과를 갖는 물질을 포함하는, 암 세포에 대한 세포독성인 물질을 포함하는, 항암 활성을 갖는 하나 이상의 추출물을 추가로 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 본원 실시예에 나타내는 바와 같이, 본원에 따른 건식 개 사료 조성물이 항암 활성을 갖는 2개 이상의 물질의 조합, 특히 상승작용성 항암 활성이 결정된 항암 활성을 갖는 2개 이상의 물질의 조합을 추가로 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 항암 활성을 갖는 물질의 조합은 항암 활성을 갖는 2개의 물질의 조합 및 항암 활성을 갖는 3개의 물질의 조합, 특히 상승작용성 항암 활성을 갖는 것을 포함한다.

본원에 개시된 사료 조성물의 또 다른 특정한 바람직한 실시양태는 쿠쿠미노이드가 포함된 것이다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 사료 조성물은 쿠쿠미노이드 공급원을 추가로 포함한다.

쿠쿠미노이드는 쿠쿠민, 데메톡시쿠쿠민, 비스-메톡시쿠쿠민 및/또는 테트라하이드로쿠쿠민을 포함한다. 쿠쿠미노이드는 특히 인도 향신료 터메릭에 존재하는 천연 페놀이다. 터메릭은 식물 쿠쿠마 론자(Curcuma longa)의 뿌리로부터 유래된다. 또한, 쿠쿠미노이드는 쿠쿠마 속의 생강 과 식물의 다른 종의 뿌리에서도 발견되었다. 특히, 터메릭은 60 내지 80%의 쿠쿠민, 15 내지 30%의 데메톡시쿠쿠민 및 2 내지 6%의 비스-데메톡시쿠쿠민으로 구성된다. 본원의 조성물의 쿠쿠미노이드는 분말 또는 액체 추출물을 포함하는 임의의 형식의 것일 수 있다.

본원에 따른 사료 조성물의 가장 바람직한 실시양태에서, 쿠쿠미노이드는 건물을 기준으로 약 250 내지 약 2000 ppm 범위의 양으로 존재한다.

바람직한 실시양태에서, 쿠쿠미노이드 공급원은 터메릭 추출물(쿠쿠마 론자)로 구성된다. 비제한인 예로서, (i) 86% wt/wt 쿠쿠미노이드를 포함하는, 아르주나(Arjuna)에 의해 상업화된 터메릭 추출물 BCM-95(등록상표), (ii) 85% wt/wt 쿠쿠미노이드를 포함하는, 나투렉스에 의해 상업화된 터메릭 추출물, 및 (iii) 20% wt/wt 쿠쿠미노이드를 포함하는, 인데나/메리바(Indena/Meriva)에 의해 상업화된 터메릭 추출물을 언급할 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 임의의 기타 공급원이 사용될 수 있다. 이러한 바람직한 양상에 따라, 본원에 기재된 사료 조성물은 터메릭 추출물을 추가로 포함한다. 또한, 다른 이용가능한 쿠쿠미노이드 공급원은 리포좀성 쿠쿠민, 쿠쿠민 나노 입자, 쿠쿠민 인지질 복합물, 쿠쿠민의 구조적 유사체(예를 들어 EF-24), 데메톡시쿠쿠민, 비스데메톡시쿠쿠민, 테트라하이드로쿠쿠민 및 상업적/DM, 쿠쿠민 생체이용률을 증진시키도록 설계된 임의의 제형으로부터 선택될 수 있다.

숙련가가 용이하게 이해하는 바와 같이, 본원에 따른 애완동물 사료 조성물에 포함된 터메릭 추출물의 양은 농도에 좌우된다.

예시적으로, 약 1000 ppm의 쿠쿠미노이드를 포함하는 애완동물 사료 조성물은 (i) 86% wt/wt 쿠쿠미노이드를 갖는 약 1163 ppm의 터메릭 추출물을 포함하는 애완동물 사료 조성물, (ii) 85% wt/wt 쿠쿠미노이드를 갖는 약 1176 ppm의 터메릭 추출물을 포함하는 애완동물 사료 조성물, 또는 (iii) 20% wt/wt 쿠쿠미노이드를 갖는 약 5000 ppm의 터메릭 추출물을 포함하는 애완동물 사료 조성물로부터 선택될 수 있다.

사료 조성물이 건식 개 사료 조성물인 실시양태에서, 상기 터메릭 추출물은 공급 상태로 300 내지 700 ppm 범위의 양, 우선적으로 공급 상태로 400 내지 600 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 공급 상태로 500 ppm의 양으로 건식 사료 조성물에 존재할 수 있다.

상기 터메릭 추출물은 공급 상태로 300 내지 700 ppm 범위의 양, 우선적으로 공급 상태로 400 내지 700 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 공급 상태로 500 ppm의 양으로 건식 개 사료 조성물에 존재할 수 있다.

사료 조성물이 건식 개 사료 조성물인 또 다른 바람직한 실시양태에서, 애완동물 사료 조성물은 약 300 내지 약 700 ppm 범위의 양으로 존재하는 상기 터메릭 추출물을 포함할 수 있다.

일부 다른 실시양태에 따라, 본원에 기재된 사료 조성물은 카노스산/카노솔을 포함할 수 있다. 일부 바람직한 양상에서, 본원에 개시된 사료 조성물은 카노스산/카노솔 공급원을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 카노스산/카노솔 공급원은 로즈마리 추출물(로즈마리너스 오피시날리스(Rosmarinus officinalis))로 구성된다. 비제한적인 예로서, 비티바(Vitiva)의 로즈마리 추출물 INOLENS50(등록상표) 또는 INOLENS70(등록상표)이 언급될 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 임의의 다른 공급원이 사용될 수 있다. 이러한 바람직한 양상에 따라, 본원에 기재된 애완동물 사료 조성물은 로즈마리 추출물을 추가로 포함한다. 상기 로즈마리 추출물은 건물을 기준으로 공급 상태로 약 50 내지 약 120 ppm 범위의 양, 우선적으로 공급 상태로 약 70 내지 약 100 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 약 90 ppm의 양으로 상기 사료 조성물에 존재할 수 있다. 사료 조성물의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 로즈마리 추출물은 공급 상태로 약 50 내지 약 120 ppm 범위의 양으로 존재한다.

상기 로즈마리 추출물은 건물을 기준으로 55 내지 140 ppm 범위의 양, 우선적으로 건물을 기준으로 80 내지 120 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 건물을 기준으로 약 100 ppm의 양으로 약 10%의 수분 함량을 갖는 건식 애완동물 사료 조성물에 존재할 수 있다. 사료 조성물의 또 다른 바람직한 실시양태에서, 로즈마리 추출물은 건물을 기준으로 약 55 내지 약 140 ppm 범위의 양으로 존재한다. 또한, 카노스산/카노솔의 다른 이용가능한 공급원은 꿀풀 과의 커먼 세이지 추출물(샐비아 오피리날리즈(Salvia Officinalis)), 예컨대 타임, 오레가노, 새베로, 레몬밤 또는 히솝으로부터 선택될 수 있다.

본원에 따른 사료의 일부 실시양태에서, 상기 사료는 건물을 기준으로 약 20 내지 약 90 ppm 범위의 양의 카노스산 및 카노솔을 추가로 포함할 수 있다.

본원에 사용된 "카노스산 및 카노솔"의 양은 애완동물 사료 조성물의 (i) 카노스산의 양 및 (ii) 카노솔의 양의 합으로부터 야기된 총량을 의미한다.

본원의 또 다른 특정하고 바람직한 실시양태는 피페린을 포함하는 것이다. 바람직한 양상에서, 본원에 개시된 사료 조성물은 피페린 공급원을 추가로 포함한다.

본원에 따른 사료 조성물의 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 건물을 기준으로 14 내지 60 ppm 범위의 양의 피페린을 포함할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 피페린 공급원은 블랙 페퍼 추출물(피퍼 니그룸(Piper nigrum))로 구성된다. 비제한적인 예로서, 사빈사(Sabinsa)의 페퍼 추출물 Vetperine(등록상표)이 언급될 수 있다. 또한, 당업자에게 공지된 임의의 다른 공급원이 사용될 수 있다. 이러한 바람직한 양상에 따라, 본원에 기재된 건식 개 사료 조성물은 페퍼 추출물을 추가로 포함한다. 상기 페퍼 추출물은 공급 상태로 15 내지 35 ppm 범위의 양, 우선적으로 공급 상태로 20 내지 30 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 공급 상태로 약 27 ppm의 양으로 건식 개 사료 조성물에 존재할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 약 15 내지 약 35 ppm 범위의 양으로 페퍼 추출물을 포함할 수 있다. 또한, 다른 이용가능한 피페린 공급원은 그린 페퍼, 화이트 페퍼, 파이퍼(Piper) 속 또는 롱 페퍼(파이퍼 롱굼(Piper longum) 및 파이퍼 오피시나룸(Piper officinarum))으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은, 터메릭 추출물이 약 300 내지 약 700 ppm 범위의 양으로 상기 조성물에 존재하고/하거나 로즈마리 추출물이 약 50 내지 약 110 ppm 범위의 양으로 상기 조성물에 존재하고/하거나 페퍼 추출물이 약 15 내지 약 35 ppm 범위의 양으로 상기 조성물에 존재하는 것을 특징으로 한다.

터메릭 추출물(쿠쿠민이 풍부함) 및 로즈마리 추출물(카노스산이 풍부함)은 신생 세포 성장을 감소시키는 데 상승작용적으로 작용한다(하기 실시예에 나타냄). 이러한 추출물 조합은 카스파제 3/7 활성화를 통해 세포사멸을 초래한다. 둘 모두의 추출물은 반응성 산소 종(ROS)을 감소시키면서 산화 방지 효과를 갖는다. 또한, 터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물 노출은 활성화된 c-jun N-말단 키나제(JNK)를 증가시켰다. 추가 시험시, 로즈마리 처리가 쿠쿠민의 세포 축적의 유의미한 증가를 야기함이 밝혀졌다. 이러한 세포내 쿠쿠민 수준의 증가는 상승작용에서 역할을 할 수 있다. 또한, 피페린이 풍부한 페퍼 추출물은 다양한 종양 세포 증식을 감소시킬 수 있고(실시예에 입증됨), 또한 이는 쿠쿠민으로서 다양한 영양소의 흡수 및 이에 따른 생체이용률을 증가시킨다.

일부 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 또한 폴리페놀, 예컨대 카테킨 공급원을 포함할 수 있다. 카테킨(플라보노이드) 공급원은 우선적으로 녹차 추출물(카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis))로 구성될 수 있다. 비제한적인 예로서, 나투렉스의 추출물이 언급될 수 있다. 녹차 추출물은 녹찻잎으로부터의 허브 유도체를 지칭한다. 녹차 추출물은 소프트 우려냄, 소프트 추출, 건식 추출 및 부분적으로 정제된 추출 기술에 의해 생성될 수 있다. 녹차 추출물은 녹차 카테킨(GTC), 에피갈로카테킨(EGC), 에피카테킨 갈레이트(ECG), 에피갈로카테킨 갈레이트(EGCG) 및 플라보노이드, 예컨대 캠페롤(kaempferol), 케르세틴(quercetin) 및 마이리세틴(myricetin)을 포함할 수 있다. 다른 통상적인 폴리페놀 공급원은 비제한적으로 카카오, 센타우레아 마큘레이트(Centaurea maculate) 뿌리, 차 나무(화이트 티, 블랙 티 및 우롱티를 포함함) 및 포도주이다.

일부 다른 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 또한 엘라그산/푸니칼라진(punicalagin) 공급원을 포함할 수 있다. 엘라그산/푸니칼라진 공급원은 우선적으로 석류 추출물(푸니카 그라나툼(Punica granatum))로 구성될 수 있다. 비제한적인 예로서, 폴리냇(Polinat)의 추출물 POE40(등록상표) 또는 P40P(등록상표)가 언급될 수 있다. 다른 이용가능한 엘라그산/푸니칼라진 공급원은 크랜베리, 호두, 라즈베리, 테르미날리아 카타파(Terminalia catappa) 나무, 테르미날리아 마이리오카르파(Terminalia myriocarpa) 나무, 콤브레툼 몰(Combretum molle)(벨벳 부쉬윌로우 식물) 또는 마이르탈레즈(Myrtales) 속 식물로부터 선택될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 사료 조성물은 터메릭 추출물 및/또는 로즈마리 추출물 및/또는 페퍼 추출물 및/또는 녹차 추출물 및/또는 석류 추출물을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 사료 조성물은 쿠쿠미노이드 및 로즈마리 추출물 공급원의 조합을 포함한다. 일부 이들 실시양태에서, 상기 애완동물 사료 조성물은 피페린 공급원을 추가로 포함한다.

본원은 사료 조성물의 제조 방법을 포함한다. 본원에 기재된 사료 제조 방법은 당분야에 공지된 임의의 방법에 따라 수행될 수 있다.

건식 애완동물 사료 조성물

본원에 기재된 바와 같이, 본원에 따른 건식 애완동물 사료 조성물은 15% 미만의 수분 함량, 예컨대 1 내지 15% 범위의 수분 함량, 예컨대 약 10%의 수분 함량, 또는 약 12%의 수분 함량을 갖는다.

따라서, 본원은 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 60 중량%의 단백질을 포함하는 건식 애완동물 사료 조성물을 포함한다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

본원은 특히 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 50 중량%의 단백질을 포함하는 건식 개 사료 조성물에 관한 것이다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

일부 실시양태에서, 상기 건식 애완동물 사료 조성물은 비타민 C(여기서 비타민 C는 공급 상태로 약 200 내지 약 400 ppm 범위의 양으로 존재함) 및/또는 공급 상태로 약 600 내지 약 1000 ppm 범위의 양의 비타민 E 및/또는 공급 상태로 약 2 내지 약 10 ppm 범위의 양 카로테노이드를 포함하는 산화 방지제 공급원을 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 건식 애완동물 사료 조성물은 비타민 C(여기서 비타민 C는 건물을 기준으로 약 220 내지 약 440 ppm 범위의 양으로 존재함) 및/또는 비타민 E(여기서 비타민 E는 약 660 내지 약 1100 ppm 범위의 양으로 존재함) 및/또는 카로테노이드(여기서 카로테노이드는 약 2 내지 약 12 ppm 범위의 양으로 존재함)를 포함하는 산화 방지제 공급원을 포함한다(여기서, ppm 단위의 양은 건물을 기준으로 함).

일부 실시양태에서, 상기 건식 애완동물 사료 조성물은, 공급 상태로 300 내지 700 ppm 범위의 양, 우선적으로 공급 상태로 400 내지 600 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 공급 상태로 500 ppm의 양으로 건식 개 사료 조성물에 존재할 수 있는 터메릭 추출물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 건식 애완동물 사료 조성물은 건물을 기준으로 360 내지 780 ppm 범위의 양, 우선적으로 건물을 기준으로 440 내지 670 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 건물을 기준으로 550 ppm의 양으로 건식 개 사료 조성물에 존재할 수 있는 터메릭 추출물을 포함한다.

가장 바람직한 실시양태에서, 상기 건식 애완동물 사료 조성물은 건물을 기준으로 약 250 내지 약 2000 ppm 범위의 양으로 존재하는 쿠쿠미노이드를 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 건식 애완동물 사료 조성물은 카노스산/카노솔 공급원, 예컨대 로즈마리 추출물을 추가로 포함한다. 상기 로즈마리 추출물은 공급 상태로 50 내지 120 ppm 범위의 양, 우선적으로 공급 상태로 70 내지 100 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 공급 상태로 약 90 ppm의 양으로 상기 건식 개 사료 조성물에 존재할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 건식 애완동물 사료 조성물은 공급 상태로 약 50 내지 약 120 ppm 범위의 양으로 존재하는 로즈마리 추출물을 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 건식 애완동물 사료 조성물은 카노스산/카노솔 공급원, 예컨대 로즈마리 추출물을 추가로 포함한다. 상기 로즈마리 추출물은 건물을 기준으로 약 55 내지 약 130 ppm 범위의 양으로 상기 건식 개 사료 조성물에 존재할 수 있다.

건식 애완동물 사료 조성물의 가장 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 건물을 기준으로 20 내지 90 ppm 범위의 양으로 존재하는 카노스산 및 카노솔을 포함한다.

본원에 사용된 "카노스산 및 카노솔"의 양은 (i) 카노스산의 양 및 (ii) 카노솔의 양의 합으로부터 초래된 총량을 의미한다.

일부 실시양태에서, 상기 건식 애완동물 사료 조성물은 피페린 공급원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 피페린 공급원은 블랙 페퍼 추출물로 구성된다. 상기 페퍼 추출물은 공급 상태로 15 내지 35 ppm 범위의 양, 우선적으로 공급 상태로 20 내지 30 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 공급 상태로 약 27 ppm의 양으로 건식 개 사료 조성물에 존재할 수 있다.

건식 애완동물 사료 조성물의 실시양태에서, 상기 페퍼 추출물은 건물을 기준으로 15 내지 35 ppm 범위의 양, 우선적으로 건물을 기준으로 20 내지 30 ppm 범위의 양, 보다 더 바람직하게는 건물을 기준으로 약 30 ppm의 양으로 애완동물 사료 조성물에 존재할 수 있다.

본원에 따른 건식 애완동물 사료의 일부 실시양태에서, 피페린 공급원은 페퍼 추출물로 구성된다.

가장 바람직한 실시양태에서, 피페린은 건물을 기준으로 14 내지 60 ppm 범위의 양으로 건식 사료 조성물에 존재한다.

또 다른 바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 건식 애완동물 사료 조성물은 터메릭 추출물이 공급 상태로 약 300 내지 약 700 ppm 범위의 양으로 상기 조성물에 존재하고/하거나 로즈마리 추출물이 공급 상태로 약 50 내지 약 120 ppm 범위의 양으로 상기 조성물에 존재하고/하거나 페퍼 추출물이 공급 상태로 약 15 내지 약 35 ppm 범위의 양으로 상기 조성물에 존재하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 실시양태에서, 본원에 따른 건식 애완동물 사료 조성물은, 터메릭 추출물이 건물을 기준으로 약 360 내지 약 780 ppm 범위의 양으로 상기 조성물에 존재하고/하거나 로즈마리 추출물이 약 55 내지 약 130 ppm 범위의 양으로 상기 조성물에 존재하고/하거나 페퍼 추출물이 건물을 기준으로 약 15 내지 약 35 ppm 범위의 양으로 상기 조성물에 존재하는 것을 특징으로 한다.

사료 조성물은, 성분을 함께 혼합하고, 조리될 수 있는 일정한 도우를 제조하기 위해 반죽함으로써 제조된다. 건식 애완동물 사료의 제조 공정은 베이킹 및/또는 압출에 의해 수행된다. 도우는 전형적으로 익스팬더(expander) 및/또는 압출기로 지칭되는 기계 내로 공급되고, 이는 가압된 스팀 또는 온수를 사용하여 성분을 조리한다. 압출기 내에 있는 동안, 도우는 극압 및 고온 하에 놓인다. 이어서, 도우는 다이(die)(특정한 크기 및 모양의 구멍)를 통과한 후에, 나이프를 사용하여 절단된다. 뿜어져 나온 도우 조각을, 소비될 때까지 사료의 안정성을 보장하는 정의된 표적으로 수분을 감소시키기 위해 이를 건조기에 통과시킴으로써 이를 키블(kibble)로 제조한다. 이어서, 키블에 지방, 오일, 미네랄, 비타민, 천연 추출물 칵테일로 분무하고 임의적으로 패키지 내로 밀봉할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 건식 애완동물 사료는 키블 형태로 구성된다. 우선적으로 예를 들어 비제한적으로, 키블은 미립자; 펠릿; 애완동물 사료 피스, 말린 육류, 육류 유사물, 야채 및 이들의 조합; 및 애완동물 스낵, 예컨대 육류 또는 야채 절키(jerky), 로하이드(rawhide) 및 비스킷을 포함한다.

건식 애완동물 사료 조성물은 바람직하게는 패키징된다. 이러한 방식으로, 소비자는 패키징으로부터 사료 제품 내 성분을 확인할 수 있고 특정 해당 애완동물에 적합한지를 확인할 수 있다. 패키징은 금속, 플라스틱, 종이 또는 카드일 수 있다.

습식 애완동물 사료 조성물

바람직한 실시양태에서, 본원에 따른 영양상 완전한 습식 사료는 50% 초과의 수분 함량, 예컨대 50 초과 내지 90% 범위의 수분 함량을 갖는다.

따라서, 본원은 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 60 중량%의 단백질을 포함하는 습식 애완동물 사료 조성물을 포함한다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

본원은 특히 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 50 중량%의 단백질을 포함하는 습식 개 사료 조성물에 관한 것이다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

상기 습식 애완동물 사료에 포함될 수 있는 다른 성분 또는 물질, 뿐만 아니라 조성물에서 이들 각각의 양은 본원에 따른 애완동물 사료의 일반적 설명에 이미 전술되었다.

일부 실시양태에서, 상기 습식 애완동물 사료 조성물은 비타민 C(여기서 비타민 C는 건물을 기준으로 약 200 내지 약 600 ppm 범위의 양으로 존재함) 및/또는 비타민 E(여기서 비타민 E는 건물을 기준으로 약 600 내지 약 2000 ppm 범위의 양으로 존재함) 및/또는 카로테노이드(여기서 카로테노이드는 건물을 기준으로 약 30 내지 약 100 ppm 범위의 양으로 존재함)를 포함하는 산화 방지제 공급원을 포함한다.

일부 실시양태에서, 상기 습식 사료 조성물은 쿠쿠미노이드 공급원으로서 터메릭 추출물을 포함한다.

따라서, 일부 실시양태에서, 상기 습식 사료 조성물은 쿠쿠미노이드 공급원을 포함한다. 일부 이들 실시양태에서, 쿠쿠미노이드는 건물을 기준으로 약 250 내지 약 2000 ppm 범위의 양으로 존재한다.

일부 실시양태에서, 상기 습식 사료는 카노스산 및 카노솔 공급원을 추가로 포함할 수 있다. 일부 이들 실시양태에서, 카노스산 및 카노솔의 양은 건물을 기준으로 약 20 내지 약 90 ppm 범위이다.

일부 실시양태에서, 상기 습식 사료 조성물은 피페린 공급원을 포함한다. 일부 이들 실시양태에서, 피페린은 건물을 기준으로 약 14 내지 약 60 ppm 범위의 양으로 존재한다.

바람직한 실시양태에서, 습식 사료는 청크(chunk) 형태, 보다 특히 그레이비(gravy) 형태의 청크로 구성된다. 우선적으로, 습식 사료는 청크 및 그레이비, 젤리, 로프(loaf), 무스(mousse), 테린(terrine), 바이트(bite) 형태의 청크로 구성된다.

"청크 및 그레이비" 제품은, 미트 에멀젼(meat emulsion)을 제조하고 상기 미트 에멀젼을 압력 하에 머즐(muzzle)에 밀어 넣어 제조된 후에 조리되는 미리 형성된 미트 입자를 포함한다. 제품, 예컨대 조리된 미트를 청크로 깍뚝썰기하고, 이를 궁극적으로 그레이비 또는 소스와 혼합한다. 이어서, 2개의 성분을 용기, 통상적으로 캔 또는 파우치 내로 충전하고, 이를 봉합하거나 밀봉하고 멸균한다. 그라운드 로프(ground loaf)와는 반대로, 청크 및 그레이비 조성물은 제조된 바와 같은 물리적으로 분리된 별개의 청크(즉 그라운드 미트의 피스 및 그레인)를 갖는다. 이들 별개의 입자는 최종 용기에서 그레이비-유형 액체 내에 존재한다. 제공시, 청크 및 그레이비 제품은 캔으로부터 유출되고, 기타 건식 제품과 용이하게 혼합될 수 있다. 청크 및 그레이비 제품이 개별적 성분의 보다 나은 통합성을 가능하게 하나, 청크 및 그레이비 제품의 불균질 제형은 때때로 소비자가 싫어한다.

습식 사료 조성물은 일반적으로 캔 유사 용기에 패키징되고, 내부에 함유된 수분으로 인해 외관상 "습식"인 것으로 간주된다. 습식 조성물의 2가지 유형이 일반적으로 당분야야 공지되어 있다. 첫번째는 "그라운드 로프"로서 당분야에 공지되어 있다. 로프 제품은 전형적으로 성분의 혼합물을 가열 하에 접촉시켜 본질적으로 균일한 세포내 벌집형 덩어리 또는 "그라운드 로프"를 생산함으로써 제조된다. 이어서, 그라운드 로프 덩어리는 실린더형 용기, 예컨대 캔 내로 패키징된다. 패키징시, 그라운드 로프는 용기의 모양을 취하여 그라운드 로프는 반려동물에게 제공될 때 절단되어야 한다.

추가적 양상에서, 본원은 반고체 습식 동물 사료 조성물의 제조를 위한 공정 설명 예를 제공한다. 공정은 수성 성분의 존재 또는 부재 하에 조성물의 고체 성분을 절단하거나 썰거나 분쇄하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 고체 성분은 냉동육 블록일 수 있다. 성분은 보충 성분, 예컨대 영양 보충제와 추가로 혼합될 수 있다. 전형적으로 20℃ 내지 70℃의 온도로 가열된다. 한 배열에서, 혼합물은 약 45℃의 온도로 가열된다. 혼합 용기는 스팀 주입을 통한 가열, 또는 열 교환기 또는 사료 제조 분야에서 통상적인 임의의 장치에 적합할 수 있다.

또한, 본원에 따른 방법은 배취식 공정으로 준비될 수 있다.

공정의 말에, 조성물은 용기, 예컨대 캔을 충전하는 데 사용될 수 있다. 용기는 밀봉되고, 통상적인 기기가 내용물을 멸균하는 데 사용된다. 상업용 멸균은 일반적으로 사용된 온도 및 조성에 따라 적절한 시간 동안 118℃ 이상의 온도로 가열함으로써 달성된다. 건식의 영양상 완전한 사료 조성물은 바람직하게는 패키징된다. 이러한 방식으로, 소비자는 패키징으로부터 사료 제품 내 성분을 확인할 수 있고 특정 해당 애완동물에 적합한지를 확인할 수 있다. 패키징은 금속, 플라스틱, 종이 또는 카드일 수 있다.

반습식 애완동물 사료 조성물

본원에 사용된 "반습식" 애완동물 사료 조성물은 15% 초과 내지 50% 범위의 수분 함량을 갖는다.

따라서, 본원은 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 60 중량%의 단백질을 포함하는 반습식 애완동물 사료 조성물을 포함한다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

본원은 특히 약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 50 중량%의 단백질을 포함하는 반습식 개 사료 조성물에 관한 것이다(여기서, 중량%는 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 함).

통상적으로 허용되는 바와 같이, 반습식 애완동물 사료는, 건식 애완동물 사료와 습식 애완동물 사료 사이의 중간의 수분 함량 값을 수득하도록 허용된 공정의 최종 산물이다. 일부 실시양태에서, 상기 공정은 습윤제의 첨가 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 공정은 압출 단계 및 과열 스팀(SHS)에 의한 후속 처리 단계를 포함한다.

비제한적인 예로서, 반습식 사료는 과열 스팀(SHS) 공정, 예컨대 WO2009/018990, WO2009/018996, WO2010/112097, WO2014/122072, WO2016/071372 및/또는 WO2016/071367에 기재된 공정 또는 방법을 사용하여 수득될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 반습식 사료는 소프트 반습식 키블로 구성된다.

사료 조성물은 바람직하게는 패키징된다. 이러한 방식으로, 소비자는 패키징으로부터 사료 제품 내 성분을 확인할 수 있고 특정 해당 애완동물에 적합한지를 확인할 수 있다. 패키징은 금속, 플라스틱, 종이 또는 카드일 수 있다.

애완동물 사료 제품의 형태로서 조성물은 애완동물이 식단에서 소비하는 임의의 제품을 포함할 수 있다. 따라서, 본원은 표준 사료 제품 및 애완동물 사료 스낵(예를 들어 스낵 바, 비스킷 및 스위트 제품)을 포함한다. 사료 제품은 바람직하게는 조리된 제품이다. 이는 육류 또는 동물 유래된 물질(예컨대 소고기, 닭고기, 칠면조조기, 양고기, 생선, 혈장, 골수 등 또는 이들 중 하나 이상의 것)을 포함할 수 있다. 제품은 대안적으로 단백질 공급원을 제공하기 위해 육류 미함유물일 수 있다(바람직하게는 육류 대용물, 예컨대 대두, 옥수수 글루텐 또는 대두 제품을 포함함). 제품은 추가적 단백질 공급원, 예컨대 대두 단백질 농축물, 유단백질, 글루텐 등을 포함할 수 있다. 또한, 제품은 전분 공급원, 예컨대 하나 이상의 곡물(예를 들어 밀, 옥수수, 쌀, 귀리, 보리 등)을 함유할 수 있거나 전분 미함유물일 수 있다. 제품은 섬유질, 예컨대 치커리, 슈가 비트 펄프 등 및/또는 성분, 예컨대 이눌린, 프룩토올리고사카라이드, 프로바이오틱을 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는, 본원에 따른 애완동물 사료 제품의 합해진 성분은 예를 들어 문헌[National Research Council, 1985, Nutritional Requirements for dogs, National Academy Press, Washington DC or Association of America Feed Control Officials, Official Publication 1996]에 기재된 바와 같은 특정한 해당 동물에게 권고되는 비타민 및 미네랄 모두를 제공한다(완전식 및 균형식).

본원에 기재된 사료 조성물은 특히 암에 걸려 화학 요법 중인 개를 지원하는 데 사용하기 위한 것이다.

용어 "지원"은 치료-관련된 문제의 관리, 부작용 최소화, 양호한 영양 상태 유지, 암 투병 보조, 및 자율적 영양소 섭취의 적절성 보장을 의미하는 것으로 통상적으로 이해된다. 제지방 체중을 유지하고, 건강한 체중 및 최적 BCS를 유지하고, 영양 실조를 예방한다.

바람직한 실시양태에서, 상기 암은 림프종 또는 비만 세포 종양(MCT)으로 구성된다.

본원의 또 다른 특정 양상은, 암에 걸린 동물에게 본원에 따른 사료 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 개를 지원하는 방법으로 구성된다.

또한, 본원은, 암에 걸리고 화학 요법 치료를 제공받은 동물에게 본원에 따른 사료 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암에 걸린 개를 지원하는 방법에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본원은 화학 치료제 및 본원에 기재된 사료 조성물 둘 모두의 투여를 포함하는 병용되는 항암 치료에 관한 것이다.

보다 특히, 본원은 암에 걸린 개에게 치료 효과량의 화학 치료제 및 본원에 따른 애완동물 사료 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 애완동물 사료는 개 사료이다. 일부 실시양태에서, 개 사료는 건식 개 사료이다.

또한, 본원은, 동물에게 본원에 따른 애완동물 사료 조성물과 병용된 화학 치료제의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함하는, 개에서 암, 우선적으로 림프종 또는 비만 세포 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 애완동물 사료는 개 사료이다. 일부 실시양태에서, 개 사료는 건식 개 사료이다.

또한, 본원은 본원에 따른 애완동물 사료 조성물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 애완동물 사료는 개 사료이다. 일부 실시양태에서, 개 사료는 건식 개 사료이다.

본원에 따라, "화학 치료제"는, 작용의 메커니즘과 관계없이 암의 치료에 유용한 화학적 제제(예를 들어 화합물 또는 약물)이다. 화학 치료제는 표적화된 요법 및 통상적 화학 요법에 사용되는 화합물을 포함한다. 당업자에게 공지된 임의의 이러한 화합물 또는 약물은 본원에 따라 사용될 수 있다.

본원에 따라 적합한 바람직한 화학 치료제는 악티노마이신(Actinomycin), 블레오마이신(Bleomycin), 카보플라틴, 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 시토신 아라비노시드(Cytosine arabinoside), 독소루비신, L-아스파라기나제, 로무스틴(Lomustine), 멜팔렌(Melphalen), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미톡산트론(Mitoxantrone), 피록시캄(Piroxicam), 프레드니손, 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴이다.

용어 "치료 효과량"은 암의 중증도 및/또는 지속기간 및/또는 그와 관련된 증상을 감소시키고/시키거나 개선하는 데 충분한 화학 치료제의 양으로 이해되어야 한다.

용어 "병용 요법" 또는 "병용으로"는, 본원에 기재된 치료의 질환 또는 장애를 치료하기 위한 치료제 및 건식 사료 조성물의 투여를 의미한다. 이러한 투여는 실질적으로 동시적 방식 또는 순차적 방식의 이들 성분의 공동-투여를 포함한다.

본원은, 어떤 식으로든 제한되지 않고, 하기 실시예에 의해 추가로 예시된다.

실시예

실시예 1: 화학 요법을 제공받은 개에서 생활의 질에 대한 새로운 식단의 영향

목적

암은 개 사망의 가장 흔한 원인 중 하나이고, 애완동물 주인은 양호한 생활의 질(QOL)을 가능한 길게 연장시키기 위해 이의 애완동물을 화학 요법에 의해 치료하는 것을 갈수록 더 선택하고 있다. 이중맹검 멀티센터 무작위화된 이러한 임상 시험의 목적은, 8-주의 공급 기간 이내에 비만 세포 종양(MCT) 및 다중심 림프종(LSA)의 치료를 위해 화학 요법 중인 개에서 생활의 질(QOL) 및 위장 건강에 대한, 증가된 섬유질 함량을 갖고 오메가-3 지방산 농출물로 보충된 새로운 고 단백질, 저 탄수화물, 중간 지방(전형적인 건식 사료와 비교시) 식단의 효과를 조사하는 것이다.

A. 재료 및 방법

다중심 LSA 또는 고등급의 전이성이거나 절제 불가능한 MCT를 새로이 진단받은 45마리의 화학 요법-무경험의 고객 소유의 개를 무작위화하여, 종양 유형에 따른 표준 화학 요법 프로토콜(LSA의 경우 CHOP 프로토콜; MCT의 경우 빈크리스틴 및/또는 티로신 키나제 억제제 또는 CCNU) 외에, 대조군 식단 또는 시험군 식단을 8주 동안 제공하였다. 대조군 식단은 25% 단백질, 13% 지방, 8.5%, 수분, 1.5% 조 섬유질을 함유하였다. 시험군 식단은 37% 단백질, 13% 지방, 8.5% 수분, 3.5% 조 섬유질, 0.6% EPA-DHA, 산화 방지제 보충물 및 대조군 식단과 상이한 섬유질 블렌드를 함유하였다; 둘 모두의 식단은 개 성체 유지를 위한 AAFCO 영양소 프로필을 만족시키도록 제형화되었고 동일한 에너지 함량을 가졌다.

[표 1]

[표 2]

성분

브루어스 라이스(brewers rice), 닭고기 부산물 밀(meal), 귀리 그로트(oat groat), 닭고기 지방, 천연 조미료, 치커리, 밀 글루텐, 완두콩 섬유질, 칼슘 카보네이트, 칼륨 클로라이드, 염, 콜린 클로라이드, 비타민[DL-알파 토코페롤 아세테이트(비타민 E 공급원), 비오틴, D-칼슘 판토테네이트, 비타민 A 아세테이트, 니아신 보충물, 피리독신 하이드로클로라이드(비타민 B6), 티아민 모노니트레이트(비타민 B1), 비타민 B12 보충물, 리보플라빈 보충물, 폴산, 비타민 D3 보충물], 미량 미네랄[아연 단백질 화합물, 아연 옥사이드, 제일철 설페이트, 망간 단백질 화합물, 제일망간 옥사이드, 구리 설페이트, 칼슘 요오데이트, 나트륨 셀레나이트, 구리 단백질 화합물], 로즈마리 추출물, 혼합된 토코페롤 및 시트르산과 함께 보존됨.

[표 3]

성분

닭고기 부산물 밀, 귀리 그로트, 브루어스 라이스, 밀 글루텐, 천연 조미료, 완두콩 섬유질, 어유, 닭고기 지방, 치커리, L-아르기닌, 칼슘 카보네이트, 칼륨 클로라이드, 나트륨 실리코 알루미네이트, 사일륨 씨 껍질, 프룩토올리고사카라이드, 염, 가수분해된 효모, 타우린, N-부티르산, L-카르니틴, 콜린 클로라이드, 비타민[DL-알파 토코페롤 아세테이트(비타민 E 공급원), L-아스코르빌-2-폴리포스페이트(비타민 C 공급원), 비오틴, D-칼슘 판토테네이트, 비타민 A 아세테이트, 니아신 보충물, 피리독신 하이드로클로라이드(비타민 B6), 티아민 모노니트레이트(비타민 B1), 비타민 B12 보충물, 리보플라빈 보충물, 폴산, 비타민 D3 보충물], 미량 미네랄[아연 단백질 화합물, 아연 옥사이드, 제일철 설페이트, 망간 단백질 화합물, 제일망간 옥사이드, 구리 설페이트, 칼슘 요오데이트, 나트륨 셀레나이트, 구리 단백질 화합물], 매리골드 추출물(Tagetes erecta L.), 로즈마리 추출물, 혼합된 토코페롤 및 시트르산과 함께 보존됨.

개 주인은 생활의 질(QOL)(각각의 문항 당 5-레벨을 갖는 12개의 문항을 포함함)을 암에 걸린 개에 대해 설계된 사전에 공개된 설문지를 사용하여 기선에서 평가한 후에 2주마다 8주까지 평가하고(문헌[Iliopoulou MA,　Kitchell BE,　Yuzbasiyan-Gurkan V. Development of a survey instrument to assess health-related quality of life in small animal cancer patients treated with chemotherapy. J Am Vet Med Assoc.　2013 Jun 15;242(12):1679-87]), 평균 배설물 점수를 9-점의 도시된 배설물 점수 차트(1(매우 액상인 대변)에서 5(매우 단단한 대변)까지 0.5점씩, 최적의 점수: 4)를 사용하여 매주 8주까지 평가하였다.

체중, BCS(신체 상태 점수, 2-점 간격의 1에서 9까지 5-점 규모, 최적 점수: 5) 및 MCS(근육 상태 점수: 정상 근육량, 경도, 중등도 또는 고도 근육 손실)를 수의학 조사관에 의해 기선에서 평가한 후에 2주마다 8주까지 평가하고, CBC(전체 혈구 계산) 및 표준 생화학을 동일한 일정에 수행하였다.

B. 결과

임상 시험의 결과가 하기 표 4에 제공된다.

[표 4]

보전군/대조군의 14마리의 개(10마리 LSA, 4마리 MCT) 및 시험군의 22마리의 개(16마리 LSA, 6마리 MCT)가 8-주 연구를 완료하였다(p = 0.061).

B.1. 식단 수용은 양호하였다: 45마리의 개 중, 4마리(대조군: 3/21, 시험군: 1/24, p = 0.325)만이 식단을 먹지 않아 연구로부터 제외되었다.

각각의 군에서 중퇴한 개의 수(대조군: 7/21(33%); 시험군: 2/24(8%))는 상이하였으나(p = 0.061), 시험군과 비교하여 대조군에서 연구를 중퇴한 개의 수가 더 많은 경향이 있었다.

개는 안정한 CBC 및 생화학 값을 연구 기간 동안 가졌다.

결과를 하기 표 5에 나타냈다.

[표 5]

B.2. 체중 및 신체 상태 점수는 연구에 걸쳐 두 군 모두에서 안정하였으며 건강한 기준 범위에 들었다.

결과를 하기 표 6 및 7에 나타냈다.

[표 6]

[표 7]

B.3. 배설물 점수

도 1에 나타낸 바와 같이, 연구에 걸쳐 둘 모두의 군에서 배설물 점수는 안정하였으며 건강간 기준 범위에 들었다.

B.4. 생활의 질(QOL) 파라미터

기선에서 8주까지, 10/12 QOL 파라미터가 시험군 식단의 개에서 유의미하게 개선된 반면에, 단지 1/12가 대조군 식단을 섭취한 개에서 개선되었다.

시험군에서 유의미한 개선을 나타낸 QOL 파라미터, 및 p-값:

○ 개가 얼마나 많이 암으로 인해 괴로워했는가(p = 0.003),

○ 개가 얼마나 빈번히 좋아하는 활동을 즐겼는가(p = 0.021),

○ 개의 수면 패턴 변화(p = 0.009),

○ 개의 장난기(p = 0.030),

○ 개가 얼마나 빈번히 병의 징후를 나타냈는가(p = 0.003),

○ 개가 얼마나 많이 상호작용을 즐겼는가(p = 0.035),

○ 개가 얼마나 빈번히 행복해 보였는가(p = 0.026),

○ 개가 얼마나 빈번히 불안 또는 공포를 경험하였는가(p = 0.018),

○ 개가 얼마나 빈번히 이동성 문제를 경험하였는가(p = 0.011),

○ 개의 전체 QOL(p = 0.010).

또한, 시험군 식단의 개는 대조군 식단의 개와 비교하여 병의 징후의 유의미한 개선을 나타냈다(p < 0.009).

암 진단시, 및 화학 요법 제2주, 제4주, 제6주 및 제8주에서 각각의 식단 군의 전체 QOL 점수는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 치료받은 개의 생활의 질의 점수를 개시한다.

전반적으로, 실시예 1의 결과는, 시험군 식단이 잘 관용되며, 시험군 식단의 개가 화학 요법 및 식단 소비 8주 후에 개선된 생활의 질을 나타냈음을 보여준다.

실시예 2: 다수의 식물 추출물의 항증식 활성

A. 재료 및 방법

A.1. 천연 추출물을 공급사로부터 직접 제공받고, 공급사 순도 분석을 기반으로 각각의 해당 화합물의 함량을 이차 실험에 의해 확인하였다. 추출물을 매 실험 전에 100% DMSO에 20 mg/mL로 용해시켜 스톡 용액을 수득하였다.

[표 8]

A.2. 사용된 화학 치료제는 토세라닙 포스페이트(toceranib phosphate)(팔라디아(Palladia, 상표), 조에티스 애니멀 헬쓰(Zoetis Animal Health)) 및 독소루비신 하이드로클로라이드(시그마 알드리치(Sigma Aldrich))였다. 독소루비신(양성 기준)을 200 mM로 제조하였다(증식 분석을 위한 스톡 용액).

A.3. 다양한 종양 유형을 나타내는 다양한 개 신생 일차 세포주를 사용하였다. 세포주를, 10% 열 불활성화된 소 태아 혈청 및 1% 항생제-항진균제를 함유하는 적절한 배지를 갖는 조직 배양물-처리된 플레이트 상에서 성장시켰다. 이를 모든 실험 및 세포 계대를 위해 37℃ 및 5% CO₂에서 성장시켰다.

[표 9]

또한, 개 일차 진피 섬유아세포(CDF)를 사용하여 정상 세포에 대한 효과를 조사하였고, 10 HI-FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 Prigrow II 배지에서 증식시키고 유지하였다.

A.4. 세포 증식을 분석하는 다양한 시험관내 분석

A.4.1. ATPlite(상표) 증식 분석

다양한 암 세포주를 웰 당 최적의 개수의 세포로 90 μL의 적절한 배지/웰에 평저 미세 적정 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 약물 미함유 배양 배지로 처리하기 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 제1 희석 공정 후에, 10 μL의 시험 물질(단일)을 플레이팅 24시간 후에 세포를 함유하는 플레이트 상에 첨가하였다. 종양 세포주를 1:2 희석 단계의 9개의 농도의 각각의 천연 추출물과 함께 72시간 동안 37℃에서 5% CO₂ 하에 배양하였다. 최고 투여량은 식물 추출물의 경우 100 μg/mL였고 독소루비신의 경우 1 μM이었다. 각각의 농도를 삼중 반복 시험으로 시험하였다. 각각의 시험 물질의 희석 및 세포를 함유하는 플레이트로의 분배를 수동으로 수행하였다. 적어도 2개의 독립적 실험을 각각의 식물 추출물에 대해 수행하였다. 대조군 세포를 비히클 단독으로 처리하였다.

5개의 식물 추출물(녹찻잎, 석류 POE40, 로즈마리 잎 INOLENS70, 터메릭 뿌리 및 vetperine)을 DMSO에 적절한 농도로 가용화시켰다. 2개의 선택된 암 세포주(HMPOS 및 C2)를 웰 당 최적의 개수의 세포로 80 μL의 적절한 배지/웰에서 평저 미세 적정 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 약물 미함유 배양 배지로 처리하기 전에 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 제1 희석 공정 후에, 10 μL의 각각의 시험 물질을 세포를 함유하는 플레이트 상에 첨가하였다. 종양 세포주를 5개의 농도의 각각의 시험 물질 단독 또는 조합물과 함께 72시간 동안 37℃에서 5% CO₂ 하에 배양하였다. 각각의 조건을 사중 반복 실험으로 수행하였다. 각각의 시험 물질의 희석 및 세포를 함유하는 플레이트로의 분배를 수동으로 수행하였다. 2개의 독립적 실험을 수행하였다. 대조군 세포를 비히클 단독으로 처리하였다(1% DMSO).

처리의 종결시, 시험된 물질의 세포독성 활성을 ATP-Lite 분석에 의해 평가하였다(Ref. 6016949, 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 배취 69-12172). 본 분석은 대사 활성의 마커인 ATP의 세포내 수준을 측정한다. 이러한 ATP 수준은 ATP-의존적 반응을 통해 반딧불이 루시페라제에 의해 방출된 발광에 의해 정량화된다. 세포 처리의 종결시, 50 μL의 포유동물 세포 용해 용액을 웰 당 100 μL의 세포 현탁액에 첨가하였다. 플레이트를 700 rpm에서 오비탈 진탕기에서 5분 동안 진탕하였다. 이러한 용액은 세포를 용해시키고 ATP를 안정화시킨다. 이어서, 50 μL의 기질 용액을 웰에 첨가하고, 플레이트를 700 rpm에서 오비탈 진탕기에서 5분 동안 진탕하였다. 이후, 플레이트를 10분 동안 어둠에서 방치하고, 발광을 LV(발광 값)로 측정하였다.

Chou-Tallalay CI는 적절한 알고리즘을 사용하여 계산한 조합 지수에 해당한다. 6개의 상이한 투여량의 각각의 추출물(1.6, 3.1, 6.3, 12.5 및 25 μg/mL 로즈마리, 0.8, 1.6, 3.1, 6.2 또는 12.5 μg/mL 페퍼, 또는 터메릭 추출물)의 조합. 0.9 이하의 CI 값은 상승작용을 나타내고, 0.9 초과 내지 1.1 미만의 CI 값은 부가효과를 나타내고, 1.1 이상의 CI 값은 길항작용을 나타낸다.

A.4.2. MTT 증식 분석

세포를 96-웰 조직 배양물-처리된 평저 플레이트 상에 4 x 10³ 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고 밤새 완전 배지에서 배양하였다. 세포를 다음날 DMSO 대조군, 또는 2배 연속 희석을 사용한 0.4 내지 100 μg/mL 범위의 8개의 최종 농도의 추출물로 48시간 동안 처리하여 모든 추출물을 세포 증식 감소에 대한 잠재적 유효성에 대해 평가하였다. 세포 증식을 정량화하기 위해, MTT 염료 분석을, 30 μL의 MTT 염료(포스페이트 완충된 염수 용액에서 5 mg/mL)를 각각에 웰에 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 배양함으로써 수행하였다. 이어서, 배지를 흡입해내고, 세포를 200 μL의 이소프로판올에 가용화시켰다. 각각의 웰의 광학 밀도를 분광 광도 플레이트 리더(에포크(Epoch); 바이오테크(Biotek, 미국 버몬트주 위누스키 소재)) 상에서 570 nm의 파장에서 분석하였다.

추출물 사이의 상승작용을 6개의 농도의 2개의 추출물의 조합을 사용하여 시험하였다: 0.8, 1.7, 3.1, 6.3, 12.5 또는 25 μg/mL. 각각의 처리에 대한 대조군의 증식성 세포의 백분율을 모든 실험으로부터 모으고, 평균 ± 평균의 표준 오차로 기록하였다.

증식 분석의 미처리 데이터(각각의 웰의 광학 밀도)를, 100% 증식성 세포(단일 또는 조합된 처리)를 나타내는 것으로 간주되는 개별적 분석에 대한 비히클 단독 처리에 대해 정규화하였다. 이어서, % 증식성 세포를 각각의 반복 실험에 걸쳐 평균을 냈다. 이어서, 각각의 추출물의 IC50를 프로빗(Probit) 분석에 의해 실험에 걸쳐 계산하였다. 화합물 상호작용을 CalcuSyn 소프트웨어(v.2.11; 바이오소프트(Biosoft, 영국 캠브릿지 소재))를 사용하여 다수의 약물 효과 분석에 의해 계산하였다.

A.4.3. 세포 생존능의 트립판 블루 배제 분석

본 분석을, 생산적인 MTT 분석을 불가능하게 하는, 정상 개 세포의 저속의 증식 및 저 대사 활성으로 인해 CDF에 대해 수행하였다. 추출물 처리의 효과를 C2, CMT-12 및 D17 세포주에 대해 수득한 결과와 비교하였다. 모든 세포주의 경우, 세포를 5 x 10³ 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고 60% 컨플루언시까지 배양한 후에, DMSO 비히클 대조군, 6.3 μg/mL TE, 6.3 μg/mL RE, 또는 각각 3.1 μg/mL의 TE 및 RE의 조합으로 처리하였다. 48시간의 처리 후에, 세포를 수집하고 원심분리하였다. C2 세포주를 제외하고, 세포를 0.05% 트립신/EDTA에 의해 탈착시켰다. 세포 펠릿을 PBS 용액 중의 0.1% 트립판 블루 및 1% FBS에 재현탁시키고 혈구 계산기 상에 적재하고 도립 현미경 상에서 시각화하였다. 블루로 염색시킨 세포는 비-생존으로 간주되었다. 모든 값을 100% 생존 세포를 나타내는 것으로 간주되는 비히클 대조군 처리에 대해 표준화하였다.

A.5. 콜로니 형성에 대한 연한천 성장 분석

본 분석은, 세포의 악성 변형을 검출하기 위해 가장 정밀하고 엄밀한 시험관내 분석으로 간주되는 세포 변형의 홀마크 중 하나이다. 본 클론원성 분석은 콜로니의 수동 계산에 의해 약 3주 후에 반고체 배양 배지에서 증식을 측정한다. D17 세포를 100 mm 세포 배양 접시에서 성장시켰다. 6 웰 배양 접시를, 멸균 포스페이트 완충된 염수에 3%로 초기에 가용화되고 완전 RPMI 배지에 0.6%로 재구성된 0.6% 한천 유형 VII을 함유하도록 준비하였다. 0.5 mL의 연한천을 6 웰 접시에 베이스 층으로서 놓은 후에, 각각의 세포주를 38℉에서 완전 RPMI에서 0.6% 연한천에 10,000 세포/웰로 현탁하고, 처리를 6 웰 접시에 플레이팅하기 직전에 해당하는 현탁액에 적용하였다. 추출물 투여를 이전 실험에서 사용된 MTT 분석 투여량을 기반으로 선택하였다. 전형적으로, 연한천의 세포는 MTT 분석에서 전형적으로 나타내는 바보다 적은 투여량에 대해 반응하였다. 따라서, MTT의 하한의 투여량이 선택되었다(0.4 내지 0.8 μg/mL).

0.5 mL의 세포 및 처리물을 동일한 날에 삼중 반복 실험으로 플레이팅하고 실온에서 세포 배양 후드에서 30 내지 60분 동안 고화시키고 37℉ 배양기에 두었다. 세포를 완전 RPMI 및 0.6%에서 적절한 처리물로 3일마다 보충하였다. 콜로니 수를 블라인딩된 관찰자에 의해 성장 제16일에 현미경 하에 계산하였다. 모든 데이터를 DMSO 대조군(100%)을 기준으로 한 콜로니의 백분율 수로 나타냈다.

A.6. 세포사멸 연관된 카스파제 3/7 활성화 분석

세포를 4 x 10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 조직 배양물-처리된 플레이트 상에 플레이팅하고 밤새 완전 배지에서 배양하였다. 세포를 다음날 DMSO 비히클 대조군, 6.3 μg/mL 추출물 단독, 또는 각각 3.1 μg/mL의 추출물의 조합으로 36시간 동안 처리하였다. 50% 억제 농도(IC50)의 화학 요법 약물을 양성 대조군으로서 사용하였다; 12.5 nM 토세라닙 포스페이트(팔라디아(상표))를 C2 세포주에 대해 사용하고, 0.3 또는 0.5 μM 독소루비신 하이드로클로라이드를 각각 CMT-12 및 D17 세포주에 대해 사용하였다. 백그라운드 형광 및 발광을, 세포는 미함유하나 처리물을 함유하는 웰에서 측정하였다. 카스파제 3/7 활성화를 Apolive-Glo(상표) 멀티플렉스 분석(프로메가(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재))을 공급사의 지시서에 따라 사용하여 정량화하였다. 간략히, 36시간의 처리 후에, 생존능 시약을 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 배양하고, 형광을 400Ex/505Em에서 측정하였다. 이어서, 카스파제-Glo 3/7 시약을 모든 웰에 첨가하고 30분 동안 실온에서 배양하고, 발광을 측정하였다. 형광 및 발광을 SpectraMax M3 마이크로플레이트 리더를 사용하여 측정하였다.

A.7. 유세포 분석

세포를 60 mm 조직 배양물-처리된 플레이트(LPS) 상에 플레이팅하고 완전 배지에서 60% 컨플루언시까지 배양하였다. 이어서, 세포를 배지, DMSO 비히클 대조군, 추출물 단독 또는 추출물 조합으로 처리하였다. 세포를 12시간(ROS 생성), 24시간(쿠쿠민 축적) 또는 48시간(세포사멸/괴사) 동안 처리하였다. 모든 유세포 분석을 BD FACSCalibur 상에서 수행하였다. 모든 유세포 분석 실험에서, 10,000개의 사례를 샘플마다 수집한 후에, 전방 산란/측면 산란 플롯을 기반으로 게이팅하였다. 각각의 처리의 기하 평균 형광(GMF)을 DMSO 처리된 샘플과 비교하고 GMF를 사용하여 모든 실험에 대한 세포주에 걸친 형광 강도의 차이로 인한 변화 배수로서 나타냈다.

A.8. 세포사멸 및 괴사 분석

세포사멸 및 괴사를 아넥신-V 및 7-AAD 염색을 사용하여 48시간의 처리 후에 측정하였다. 간략히, 세포를 Accumax 해리 용액(이노베이티브 셀 테크놀로지스(Innovative Cell Technologies))을 사용하여 탈착시키고 수집하고 10분 동안 500 rcf에서 4℃에서 원심분리하였다. 세포 펠릿을 1회 PBS로 세척한 후에, 아넥신 결합 완충제(ABB; 10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂, pH 7.4)에 1 x 10⁶ 세포/mL의 밀도로 재현탁하였다. 아넥신-V 488 접합체 및 7-아미노악티노마이신 D(7-AAD)를 세포 현탁액에 첨가하고 15분 동안 실온에서 배양하였다. 이어서, ABB를 세포 현탁액에 첨가하고, 형광 분석할 때까지 얼음 상에서 보관하였다. 아넥신-V 양성으로만 표지된 사례는 사멸 세포를 나타내는 것으로 간주되었고; 아넥신-V 양성 및 7-AAD 양성으로 표지된 사례는 괴사 세포를 나타내는 것으로 간주되었다.

A.9. 세포내 반응성 산소 종(ROS) 분석

터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물의 주성분(각각 쿠쿠민 및 카노스산)이 산화 방지제로서 관련되기 때문에, 다이하이드로호다민(Dihydrorhodamine)123(DHR123; 인비트로젠(Invitrogen)) 분석을 사용하여 각각의 추출물에 의한 12시간의 처리 후에 존재하는 ROS의 양을 결정하였다. 간략히, 세포를 Accumax 해리 용액을 사용하여 탈착시키고 수집하고 10분 동안 500 rcf에서 4℃에서 원심분리하였다. 펠릿을 1회 PBS로 세척한 후에, 1 mL의 착색제(DMEM 중의 30 μM DHR123)에 재현탁하였다. 이어서, 세포 현탁액을 37℃에서 30분 동안 배양하고 펠릿화시키고 1 mL DMEM에 재현탁하고 여과한 후에, 세포의 형광 분석을 수행하였다.

A.10. 쿠쿠민의 세포 축적

쿠쿠민의 세포 축적을 본 화합물의 자가-형광 특성을 사용하여 측정하였다. 24시간의 처리 후에, 세포를 Accumax 해리 용액에 의해 탈착시키고 수집하고 10분 동안 500 rcf에서 4℃에서 원심분리하였다. 세포 펠릿을 1회 PBS로 세척한 후에, DMEM에 재현탁하고 여과한 후에, 488 nm의 파장에서 여기시 형광 분석을 수행하고, 이어서 530/30 필터를 사용하여 방출을 측정하였다.

A.11. 웨스턴 블롯팅(신호전달 경로)

세포를 100 mm 조직 배양물-처리된 플레이트(LPS) 상에 플레이팅하고 60% 컨플루언시에 도달할 때까지 밤새 완전 배지에서 배양하였다. 세포를 다음날 DMSO 비히클 대조군, 6.3 μg/mL 추출물 단독, 또는 각각 3.1 μg/mL의 추출물의 조합으로 처리하였다. 세포를 채취하고 포유동물 용해 완충제(MLB; 25 mM Tris, 100 mM NaCL, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 0.004% NaF, 1 mM NaVO₄, 25 mM -글리세로인산, 100 μg/mL 페닐메탄설폰일 플루오라이드, 및 각각 1 μg/mL의 아프로티닌 및 류펩틴, pH 7.4)를 사용한 처리 및 초음파 처리 후 12시간 및 24시간에 용해하고, 5분 동안 14,000 rcf에서 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 단백질 농도를 Bradford 분석(쿠마시-염료)을 사용하여 결정하였다. 샘플을 MLB 및 5x 램라이(laemmli) 로딩 완충제에서 통상 부피(μg/μ)로 평형시켰다. 각각의 해당 단백질의 경우, 30 μg의 전체 단백질을 SDS-PAGE를 수행시켰다. 이어서, 단백질을 1시간 동안 333 mA에서 0.45 μm 공극 크기의 폴리비닐리덴 플루오라이드 막에 옮긴 후에, TBST 용액 중의 5% 밀크(milk)에서 차단하였다. 막을 TBST에 1:1000 희석된 일차 항체 용액에서 밤새 록킹 플랫폼 상에서 4℃에서 배양하였다. 일차 항체는 토끼 스트레스-활성화된 단백질 키나제/jun-아미노-말단 키나제(SAPK/JNK), 및 Thr183/Tyr185 포스포릴화된-SAPK/JNK(셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology))를 포함하였다. 막을 3회 TBST로 세척하고 실온에서 1시간 동안 1:2000 희석된 항-토끼 IgG 홀스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 항체(셀 시그널링 테크놀로지)에서 배양하였다. 막을 3회 TBST로 세척하고 화학-발광 시약(바이오-라드(Bio-Rad))에 의해 시각화하였다. 디지털 이미지를 이미징 시스템(바이오스펙트럼(Biospectrum) 410)을 사용하여 포착하였다. 이미지를 수집한 후에, 막을 3회 TBST에서 세척하고 하우스-키핑(house-keeping) 항체 β-액틴(시그마-알드리치)의 1:10,000 희석물과 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 막을 세척하고 1:2000 희석된 마우스 이차 항체와 함께 배양하였다.

B. 결과

B.1. 개 암 세포주에 대한 단일 추출물 처리의 항증식 활성

ATPlite(상표) 분석에 의해 결정된 항증식 활성: IC50 값

다양한 식물 추출물의 항증식 활성의 결과를 석류 40%(도 3a), 녹차(도 3b), vetperine(도 3c), 로즈마리 잎(도 3d), 터메릭 뿌리(도 3e) 및 석류 40% 푸니코시드(도 3f)의 추출물에 대해 도 1a 내지 1f에 도시하였다

독소루비신(양성 기준): 모든 세포주는 11 nM(HMPOS의 경우) 내지 375±361 nM(CF41.Mg 세포주의 경우) 범위의 IC50 값을 갖는 독소루비신에 민감하였다. 참고로 CLBL-1 및 BACA 세포주는 배양시키기에 매우 어려운 세포주였고, 상이한 식물 추출물의 이들 세포주에 관해 수득된 결과는 신중하게 고려되어야 한다.

또한, 항증식 활성을 MTT 분석에 따라 분석하였다. 결과가 하기 표 10에 제시된다.

[표 10]

B.2. 개 암 세포주에 대한 이중 추출물 조합 처리의 항증식 활성

ATPlite(상표) 분석에 의해 결정된 2개의 유형의 암 세포주(C2 및 HMPOS)로부터의 상승작용 결과

최적의 지시된 농도 범위에서 하기 화합물을 사용하여 최상의 상승작용성 조합이 관찰되었다:

- 로즈마리(0.8 내지 6.3 μg/mL) + 석류(1.2 내지 33 μg/mL).

- 로즈마리(0.8 내지 3.1 μg/mL) + 터메릭 뿌리(0.8 내지 3.1 μg/mL).

- 석류(3.7 내지 11 μg/mL) + 터메릭 뿌리(1.6 내지 6.2 μg/mL).

각각의 조합 분석에서, 화합물의 상승작용 효과를, 농도 혼합물의 입증된 조건의 수와 비교한 상승작용 조합 지수의 수(CI<0.9)로서 평가하였다. 농도 혼합물의 조건은 이의 합한 Fa가 0.05 및 0.95 범위 내에 속할 때 Chou-Tallalay 계산식으로 입증되었다. 2개의 추출물의 조합은 농도 혼합물의 입증된 조건의 50% 이상이 CI<0.9를 나타낼 때 상승작용성인 것으로 간주되었다. 2개의 세포주 모두에서, 부가적 모델 방법을 사용하여 계산된 상승작용 효과의 70%가 Chou-Tallalay 모델을 사용하여 계산된 것에 일치된다. 이러한 결과의 유사성은 대부분의 상승작용성 조합이 2개의 독립적 게산법에 의해 입증됨을 나타낸다.

결과가 하기 표 11에 제시된다.

B.3. MTT 분석에 의해 결정된 3개의 유형의 암 세포주(C2, CMT-12 및 D17)로부터의 상승작용 결과

터메릭 추출물 및 로즈마리 추출물의 조합은 3개의 세포주 모두에서 IC50에 도달하는 데 필요한 각각의 추출물의 농도의 가장 유의미한 감소를 야기하였고, 이는 상승작용성 조합을 시사한다. 결과는 하기 표 12, 13 및 14에 제시된다.

[표 12]

또한, C2 암 세포주에 대한 항증식 활성은 도 4a에 도시되어 있다.

[표 13]

또한, CMT-12 암 세포주에 대한 항증식 활성은 도 4b에 도시되어 있다.

[표 14]

또한, D17암 세포주에 대한 항증식 활성은 도 4c에 도시되어 있다.

로즈마리 INOLENS70 추출물 및 터메릭 뿌리 추출물을 0.8 내지 25 μg/mL 범위의 투여량의 조합으로 사용한 경우 (a) C2, (b) CMT-12 및 (c) D17 세포주에 대한 CI 값을 MTT 분석에 의해 결정하였다. 0.8 미만의 값은 상승작용을 나타내고, 0.8 내지 1.2는 부가효과를 나타내고, 1.2 초과는 길항작용을 나타낸다. NP = 계산을 수행할 수 없음.

DMSO 대조군과 비교하여 증식율(%)의 유의미한(p<0.05) 감소를 유도한 최저 투여량을 하기 기호를 사용하여 표시하였다: +(TE 단독), # (RE 단독), ^(이중 추출물 조합).

B.4. 상이한 추출물 공급원으로부터의 항증식 활성

또한, 2개의 상이한 공급원의 터메릭 추출물(나투렉스 또는 아르주나) 또는 로즈마리 추출물(Inolens70(등록상표), Inolens50(등록상표))을 사용한 유사한 추출물의 유사한 항증식 활성을 수득하였다. 단일 처리 또는 이중 조합을 3개의 종양 세포주(C2, D17 및 CMT12)에 대해 시험하였고, 세포독성(IC50)을 MTT 분석에 의해 결정하였다. 결과가 하기 표 15, 및 도 5a, 5b 및 5c에 제시된다.

[표 15]

B.5. 연한천 콜로니 형성 분석에 의해 시험한 터메릭 추출물의 항증식 활성

터메릭 추출물(쿠쿠미노이드)은 대조군의 27%의 소수의 콜로니 형성을 나타내어 연한천에 대한 최대 효과를 가졌다. 로즈마리 및 페퍼 추출물은 각각 단지 75% 및 65% 콜로니 형성의 경미한 효과를 나타냈다. 이중 쿠쿠민 및 로즈마리 처리는 0.4 μg/mL의 쿠쿠민 및 0.8 μg/mL의 로즈마리에서 단지 21%의 형성을 나타냈다. 6.25 μg/mL의 페퍼 추출물의 첨가는 칵테일 혼합물에서 12%로의 별로 크지 않은 감소를 나타냈다.

결과는 도 6에 도시되어 있다.

삼중 반복 실험의 평균을 수득하기 위해, 세포를 3일마다 16일 동안 처리한 후에 계수하였다. DMSO 비히클 대조군에 따른 평균 콜로니 형성(%)을 기록하였다. DMSO 대조군과 비교시, *는 p<0.05를 나타내고, **는 p<0.01을 나타낸다.

B.6. 암 세포주의 성장 억제에 대한 천연 추출물과 화학 요법의 상호작용

추출물과 통상적으로 사용되는 화학 요법(비만 세포 질병(C2 세포주)의 경우 팔라디아/토세라닙(티로신 키나제 억제제) 및 유방 암종 및 골육종의 경우 독소루비신(안트라사이클린 항생제)을 포함함)의 상호작용을 시험하는 것을 목적으로 한다.

터메릭 및 로즈마리 추출물(0.8 내지 1.7 μg/mL) 둘 모두는 경미한 길항작용 내지 부가효과를 유도한 반면에, 3.1 μg/mL의 둘 모두의 추출물에서 토세라닙 포스페이트의 존재 하에 거의 완벽한 부가효과가 존재하였다. 둘 중 하나의 추출물이 6.3 μg/mL로 첨가될 때, 거의 완벽한 상승작용성 효과가 존재하였다(비만 세포종 세포주).

결과가 하기 표 16 내지 24에 제시된다.

[표 16]

[표 17]

[표 18]

[표 19]

[표 20]

[표 21]

[표 22]

[표 23]

[표 24]

B.7. 정상 세포에 영향을 미치지 않는 암 세포주에 대한 추출물의 세포독성 활성

6.3 μg/mL의 개별적 추출물, 또는 3.1 μg/mL의 TE 및 3.1 μg/mL의 RE의 조합은 대조군 일차 세포에서 세포 생존능의 유의미한 감소를 유도하지 않았다.

결과는 도 7에 제시된다.

트립판 블루 배제 분석에 의해 결정된 생존 세포(%)를 DMSO 비히클 처리군과 비교하여 평균 ± SEM으로서 나타냈다. 각각의 세포주 내에서, 동일한 문자를 공유하지 않는 평균은 유의미하게 상이하다(p<0.05). NS = 유의미하지 않음.

B.8. 개별적으로 또는 병용으로 TE 및 RE가 항증식 및 세포독성 효과를 행사하는 메커니즘

세포성 세포사멸은 터메릭 및 로즈마리 추출물 처리에 의해 유도된다.

TE+RE 병용 처리는 모든 세포주에서 TE 단독의 효과를 뛰어넘는 카스파제 3/7 활성화 및 세포사멸을 야기하였다.

결과는 도 8a 내지 8e에 도시된다.

도 8은 (도 8a) DMSO, (도 8b) 6.3 μg/mL TE, (도 8c) 6.3 μg/mL RE, 또는 (도 8d) 3.1 μg/mL TE + 3.1 μg/mL RE로 처리된 CMT-12 세포주로 처리된 CMT-12 세포주의 대표적인 사분면 플롯을 개시한다. 각각의 사분면은 생존(좌측 하부), 초기 세포사멸(우측 하부) 또는 후기 세포사멸/괴사(우측 상부)로 간주되는 사례의 수를 나타낸다. (도 8e) 초기 사멸 세포의 백분율(아넥신 V 양성 및 7-AAD 음성 세포의 우측 하부 사분면)은 평균 ± 표준 편차(3회의 독립적인 반복 시험)로 표현된다. 각각의 세포주 내에서, 상이한 문자로 표시된 평균은 서로 유의미하게 상이하다(p< 0.05).

또한, 세포사멸 효과를, 생존 세포 당 카스파제 3/7의 수준의 변화를 정량화함으로써 평가하였다.

결과는 도 9에 도시된다.

도 9에서, 생존 세포 당 활성화된 카스파제 3/7을 DMSO 대조군 값으로부터의 평균 변화 배수 ± 3회의 독립적인 반복 시험으로부터의 표준 편차로서 표현하였다. 각각의 세포주 내에서, 상이한 문자로 표시된 값은 서로 유의미하게 상이하다(C2 p < 0.001; CMT-12 p < 0.005; D17 p < 0.05).

B.9. 암 세포주에서 TE 및 RE의 산화 방지제 활성

둘 모두의 추출물은 산화 방지제 효과를 가졌고, RE는 반응성 산소 종(ROS)을 40 내지 50%만큼 감소시키고, TE는 ROS를 80 내지 90%만큼 감소시켰다.

결과는 도 10에 도시된다.

도 10에서, 값을 4회의 독립적인 반복 시험의 평균 ± 표준 편차로서 표현하였다. 기록된 값을 DMSO 비히클 대조군과 비교한 변화 배수로서 나타냈다. 각각의 세포주 내에서, 상이한 문자로 표시된 평균은 서로 유의미하게 상이하다(C2 p < 0.05; CMT-12; D17 p < 0.0001).

B.10. TE 및 RE는 SAPK/JNK 세포 경로 활성화를 촉진한다

RE 처리는 C2 세포주에서 c-jun N-말단 키나제(JNK) 활성을 증진시켰고, TE+RE 노출은 CMT-12 세포주에서 4 내지 5배만큼 활성화된 JNK를 증가시켰다.

결과는 도 11a(C2 세포주) 및 11b(CMT-12 세포주)에 제시된다.

도 11a 및 11b에서, 각각의 블롯은 3회의 독립적 실험의 대표이다. 밀도 측정 값은 전체 단백질에 대한 포스포릴화된 단백질의 비를 나타내고 동일한 시점의 DMSO 비히클 대조군에 대해 정규화된다(3회의 별개의 실험의 평균). DMSO 대조군과 비교한 밀도 측정의 차이를(유의도: p < 0.05) *로 나타냈다. β-액틴은 샘플의 고른 적재를 보장하기 위해 모든 블롯에서 적재 대조군으로서 사용하였다.

B.10. RE 처리에 의해 유도된 쿠쿠민의 증가된 세포 축적

TE는, RE 처리가 C2 및 D17 세포주에서 약 30%만큼 및 CMT-12 세포주에서 4.8-배만큼의 쿠쿠민의 세포 축적에 있어서 유의미한 증가를 초래하였음을 나타냈다. 이러한 증가된 쿠쿠민의 세포내 수준은, TE 및 RE를 병용으로 사용시 나타난 상승작용에 있어서 역할을 할 수 있다.

결과는 도 12a, 12b 및 12c에 도시된다.

C2(도 12a), CMT-12(도 12b) 및 D17(도 12c) 세포주를 지시된 농도의 추출물로 24시간 동안 처리한 후에, 쿠쿠민의 세포 축적을 유세포 분석에 의해 정량화하였다. Y-축 값은 DMSO 대조군과 비교한 모든 세포의 기하 평균 형광(GMF)의 변화 배수를 나타낸다. 보고된 데이터를 4회의 독립적인 반복 시험의 평균 ± 표준 편차로서 표현하였다. 각각의 세포주 내에서, 상이한 문자로 표시된 평균은 서로 유의미하게 상이하다(p< 0.0001).

실시예 3: 최종 조성물을 사용한 생체내 실시예

예기되는 다중심 임상 시험의 목적은, 특정하게 제형화된 시험용 식단이 화학 요법 효능을 이의 부작용을 감소시키면서 개선할 수 있고 화학 요법 프로토콜을 수행 중인 개의 생활의 질(QoL)을 유지할 수 있는지를 결정하는 것이다. 이러한 새로운 식단의 임상 효능을 암 진단 후 1년 동안 평가하였다. 주요 목표는 양호한 영양 상태를 유지하는 "치료 지원"을 통해 암과 투병 중인 개를 보조하는 것이다. 연구는 이중 맹검 무작위화된 플라세보-제어된 시험으로서 설계되었다. 일차 결과는 전반적인 건강 상태/QoL점수, GI 부작용 및 체중 유지이다. 이차 효능 파라미터는 다른 QoL 점수(기능 및 증상 규모), 배설물 점수(GI-AE와 관련된 파라미터), 중앙 생존 시간, 1-년 생존비, 처리 반응 속도, 혈액학적 부작용(H-AE), 주인에 의한 식단 평가일 것이다.

연구 설계

● 비교: 화학 요법 프로토콜 중이거나 화학 요법 프로토콜 후의, 암에 걸린 개를 위한 2개의 맞춤-제형화된 영양상 완전하고 균형 있는 건식 식단을 비교할 것이다.

● 무작위화: 대조군 또는 시험군으로 무작위로 배정하기 전에 동물을 연구 사이트별로 층화할 것이다(미리 결정된 무작위화 계획을 사용함).

○ (처리 동안 및 처리 후) 암 진단 후 1년 동안 공급받은 (고객 소유의) 개의 2개의 군:

■ 군 A (n=30) = 시험군 식단.

성분: 건조한 가금류 고기 단백질, 탈곡한 귀리, 쌀, 밀 글루텐, 야채 섬유질, 가수분해된 가금류 고기 단백질, 가금류 고기 지방, 어유, 치커리 펄프, 지방산 염, 사일륨 겉껍질 및 씨, 매리골드 추출물, 천연 추출물의 배타적 칵테일, 미네랄, 비타민, 산화 방지제 및 보존제. 보증 분석: 수분(최대) 9.5%; 단백질(최소) 36.5%; 조 지방(최소) 13%; 조 섬유질(최대) 4.8%; 재(평균) 7.2%.

■ 군 B(n=30) = 대조군 식단.

성분: 탈곡한 귀리, 쌀, 건조한 가금류 고기 단백질, 가금류 고기 지방, 밀 글루텐, 야채 섬유질, 가수분해된 가금류 고기 단백질, 비트 펄프 미네랄, 비타민, 산화 방지제 및 보존제. 보증 분석: 수분(최대) 9.5%; 단백질(최소) 25%; 조 지방(최소) 13%; 조 섬유질(최대) 4.8%; 재 (평균) 6.8%.

연구 집단

포함 기준

■ 나이: ≥ 1살; 체중 ≥ 3 kg.

■ 스테이지 III, IV 또는 V(골수 또는 말초혈 관여에 제한되는 경우)의 결절성 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL, 중심아세포 또는 면역아세포)을 새로이 진단받은 개.

■ 모든 동물은 현재 암에 대한 치료에 대해 무경험이어야 하나, 일년 이상 이전에 다른 암에 대해 치료받은 적 있을 수 있다.

■ 25주 동안 표준 다중 약물 화학 요법(사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론(prednisolone)을 포함하는 CHOP 프로토콜)에 의해 치료할 의지가 있는 주인.

처리 일정은 하기 표 25에 개시된다.

■ 모든 허브 및 비타민 보충물을 중단할 의지가 있는 애완동물 주인. 개가 임의의 식이 보충물을 제공받는 경우, 이는 등록시 중단할 수 있어야 하고 계속 연구에 적합해야 한다.

■ 미리 정해진 식단을 공급하고, 간식을 칼로리의 5%로 제한하고(특정한 간식 권고사항 제공), 월간 QOL을 유지하고 배설물 점수 및 상세한 식단 일기(주간 식단 섭취량)를 기록할 의지가 있는 애완동물 주인.

배제 기준

■ 인클루전 방문시 림프종에 의해 유도된 신경학적 문제를 갖는 개.

■ 골수, 혈액 침윤 이외에 림프종(폐, SNC 등)을 갖는 개.

■ 잠재적으로 QoL에 부정적인 영향을 미치거나, 생존 시간을 변경하거나(예상 < 3개월), 특정 치료식이 필요한 것으로 예상되는, 현재 진단된 동반이환(예를 들어 내분비 질병, ISACHC 스테이지 2 내지 3의 심장병, IRIS 2 내지 4 만성 신장병 등).

■ 연구 등록 1주일 이내에 항생제의 통용. 동물은, 인클루전이 수행되기 전에 1주일의 약효 세척(wash-out)이 수행되는 경우 포함될 수 있다.

■ 위장 징후(만성 구토 또는 설사)의 이력(암 이전에)(6개 초과의 에피소드/년 1개월의 임상적 징후), 및 (암과 관련되지 않은) 제어를 위한 특별식을 필요로 하는 동물.

■ 연구 등록 1주일 이내에 제토제 및 지사제의 예방적 통용.

■ 연구 등록 1개월 이내에 오메가-3 지방산 보충물(예를 들어 어유, 크릴 오일, 아마, 보리지, 달맞이꽃)의 사용.

■ 최종 월에 1주일 초과 동안 암에 대한 코르티코스테로이드(구강 경로) 또는 최종 월에 장기-작용성 코르티코스테로이드의 투여(주입의 수와 관계 없음).

참가자의 철수/중단 기준

하기 기준 중 하나를 만족하는 경우 동물을 연구로부터 제외시킬 것이다:

■ 화학 요법 프로토콜의 변형을 필요로 하는 치료 반응 평가 후에(프로토콜의 제6주에서) 부분적 반응(PR), 안정적 질환(SD) 또는 진행성 질병(PD)의 동물.

■ 제6주의(유도 단계) 세포학적 시험(LN FNA)에 의해 확인한 재발.

■ 연구 식단 과민증 - 의약 없이 5일 이내에 해결되지 않는, 실험 식단 도입의 처음 2주 이내에 식단과 관련된 GI 징후.

■ 하기와 같은 불량한 식단 준수: 실험 식단이 (질병, 고객 완전 소모, 튜브 공급 등으로 인해) 공급되지 않은 경우의 5일 초과의 간격. 간식의 과도한 사용.

■ 추가적 식이 보충물의 사용 (기본 글루코사민/콘드로이틴 보충물 제외).

연구 타임라인

- V1 = 기선/인클루전, 화학 요법 및 식단의 개시 전에 진단을 수행하였다.

- V2 = 약 1개월의 식단 후(= 유도 단계의 종결, 제6주, 마지막 독소루비신 주입 2주 후면서 빈크리스틴 주입 전).

- V3 = 약 3개월의 식단 후(= 유지 단계 중간 지점, 빈크리스틴 주입 전 제15주).

- V4 = 6개월의 식단 후(= 화학 요법 프로토콜 완료 후에, 마지막 주입으로부터 2주 이내에, 제26주 또는 제27주).

- V5 = 9개월의 식단 후(제39주 내지 제41주).

- V6 = 1년의 식단 후(제51주 내지 제53주).

처리 일정은 하기 표 26에 추가로 기재된다.

파라미터

■ 진단 및 임상 단계(V1):

- 신체 검사 완료.

- 혈액 도말 표본을 사용한 CBC + 혈청 생화학적 프로파일(BUN-CREA-ALT-ALKP-TP-ALB- Ca) + 소변 검사(당일 사내 실행).

- 1 개 또는 2 개의 영향을 받은 림프절의 미세 바늘 흡인물(FNA)에 대한 유세포 분석에 의한 (또는 생검시 면역 조직화학에 의한; 조사자의 재량에 따름) 세포학적 시험 및 면역 표현법.

- 흉부 방사선 사진(2개의 사진: 오른쪽 측면 및 등-배)(또는 조사자의 재량에 따른 스캐너).

- 복부 초음파 검사 및 필수적 비장/간 FNA 및 세포학적 시험.

- 골수 천자 및 세포학.

■ 체중; 신체 상태 점수(BCS 9 pt 규모); 근육 상태 점수(MCS WSAVA).

■ 의약 문서화: 화학 요법 프로토콜(AE로 인한 적응 규칙과 관련된 사소한 변형) 및 다른 약물.

■ "위장" 카테고리 및 "혈액/골수" 카테고리에 대해서만 화학 요법 후 부작용 문서화(VCOG-CTCAE 스케일 V1.1에 따라, 1 내지 5로 등급 매김 및 사건 날짜).

■ 유도 단계 동안 치료 반응 평가(V2):

○ 문헌[VCOG consensus: Response evaluation criteria for peripheral nodal lymphoma in dogs v1.0]에 따라 수행된 완전 반응(CR), 부분적 반응(PR), 안정적 질환(SD) 및 진행성 질병(PD).

○ (동물이 CR인 경우에만) 진단 방문시 비정상인 파라미터에 대해서만 수행.

■ 표준화된 생활의 질 설문 조사.

■ 배설물 점수 매김(5 pt 규모).

■ 특정한 혈액 바이오마커.

■ 식단 평가 설문지.

■ 문서화.

○ LN 세포학적 시험(FNA)에 의해 확인한 (초기 진단 후) 최대 12개월의 재발 상태 모니터링. 수의사는 조사자의 재량에 따라 화학 요법 프로토콜 완료 후에 (1개월에 1회 이상 또는 명백한 진행성 질병인 경우) 동물을 확인해야 한다(무진행 간격 계산을 가능하게 함).

○ 사망(자연사 또는 안락사; 암에 기인할 가능성이 있음; 원인 불명)으로 중간 생존 시간 계산이 가능하다.

○ 입원, 수술, 부상 등과 같은 기타 주요 사건.

처리 프로토콜은 하기 표 27에 기재되어 있다.

[표 11]

[표 25]

[표 26]

[표 27]

Claims

약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 60 중량%의 단백질을 포함하는 개 사료 조성물로서, 중량%가 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 하는, 사료 조성물.
제1항에 있어서,
약 10 내지 약 20 중량%의 지방, 약 5 내지 약 15 중량%의 섬유질 및 약 30 내지 약 50 중량%의 단백질을 포함하는 사료 조성물로서, 중량%가 조성물의 총 건물 중량을 기준으로 하는, 사료 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
조성물의 총 건물 중량을 기준으로 약 15 내지 약 40 중량% 범위의 양의 탄수화물을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
건식 애완동물 사료, 반습식 애완동물 사료 및 습식 애완동물 사료로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사료 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
산화 방지제 공급원을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 사료 조성물이 건식 애완동물 사료 조성물이고, 산화 방지제 공급원이 비타민 C 및/또는 비타민 E 및/또는 카로테노이드를 포함하되, 비타민 C가 건물을 기준으로 약 220 내지 약 440 ppm 범위의 양으로 존재하고, 비타민 E가 건물을 기준으로 약 660 내지 약 1100 ppm 범위의 양으로 존재하고, 카로테노이드가 건물을 기준으로 약 2 내지 약 12 ppm 범위의 양으로 존재하거나;
b) 사료 조성물이 습식 애완동물 사료 조성물이고, 산화 방지제 공급원이 비타민 C 및/또는 비타민 E 및/또는 카로테노이드를 포함하되, 비타민 C가 건물을 기준으로 약 200 내지 약 600 ppm 범위의 양으로 존재하고, 비타민 E가 건물을 기준으로 약 600 내지 약 2000 ppm 범위의 양으로 존재하고, 카로테노이드가 건물을 기준으로 약 30 내지 약 100 ppm 범위의 양으로 존재하는, 사료 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
쿠쿠미노이드 공급원을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
쿠쿠미노이드 공급원으로서 터메릭 추출물을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
건식 애완동물 사료인 사료 조성물.
제9항에 있어서,
건물을 기준으로 360 내지 780 ppm 범위의 양의 터메릭 추출물을 포함하는, 사료 조성물.
제9항에 있어서,
건물을 기준으로 약 250 내지 약 2000 ppm 범위의 양의 쿠쿠미노이드를 포함하는, 사료 조성물.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
카노스산/카노솔 공급원을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
로즈마리 추출물을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제13항에 있어서,
로즈마리 추출물이 건물을 기준으로 약 55 내지 약 130 ppm 범위의 양으로 존재하는, 사료 조성물.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
건물을 기준으로 약 20 내지 약 90 ppm 범위의 양의 카노스산 및 카노솔을 포함하는, 사료 조성물.
제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
피페린 공급원을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제16항에 있어서,
피페린이 건물을 기준으로 14 내지 60 ppm 범위의 양으로 애완동물 사료 조성물에 존재하는, 사료 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
습식 사료 조성물인 사료 조성물.
제18항에 있어서,
터메릭 추출물을 포함하는, 사료 조성물.
제18항에 있어서,
쿠쿠미노이드 공급원을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제20항에 있어서,
쿠쿠미노이드가 건물을 기준으로 약 250 내지 약 2000 ppm 범위의 양으로 존재하는, 사료 조성물.
제20항 또는 제21항에 있어서,
카노스산 및 카노솔 공급원을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제22항에 있어서,
카노스산 및 카노솔의 양이 건물을 기준으로 약 20 내지 약 90 ppm 범위인, 사료 조성물.
제20항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
피페린 공급원을 추가로 포함하는, 사료 조성물.
제24항에 있어서,
피페린이 건물을 기준으로 14 내지 60 ppm 범위의 양으로 애완동물 사료 조성물에 존재하는, 사료 조성물.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
암에 걸려 화학 요법 중인 개를 지원하는 데 사용하기 위한 사료 조성물.