BR112020024464A2 - composição de suporte para animal com câncer - Google Patents

Abstract

COMPOSIÇÃO DE SUPORTE PARA ANIMAL COM CÂNCER. A presente divulgação relaciona-se a uma composição de ração para cães compreendendo e cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 60% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição.

Description

COMPOSIÇÃO DE SUPORTE PARA ANIMAL COM CÂNCER REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido de Patente Europeia nº EP18177847.3 depositado em 14 de junho de 2018, que é 5 incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

CAMPO DA DIVULGAÇÃO

[002] A presente divulgação diz respeito ao campo de composições alimentares para cães afetados por câncer.

FUNDAMENTOS DA DIVULGAÇÃO 10 [003] A manutenção e melhoria da saúde animal é um objetivo constante na técnica. Como suas contrapartes humanas, observa-se que animais de estimação que vivem em países desenvolvidos tiveram sua expectativa de vida prolongada de modo consistente. Portanto, a pressão global de cânceres continua a aumentar muito devido ao envelhecimento e crescimento da população de 15 cães. Como um exemplo, a taxa de incidência de cânceres na população de cães é estimada como sendo de 282,2 a 958 a cada 100.000 cães. Os tipos de tumores mais frequentes em cães são os tumores mamários nas fêmeas (70,5% de todos os cânceres), linfomas não Hodgkin (8,4% em fêmeas e 20,1% em machos) e tumores da pele (4% em fêmeas e 19,9% nos machos). Além disso, de acordo com 20 a Sociedade Europeia de Oncologia Veterinária, 50% dos cães acima de dez anos de idade morrerão devido a um problema relacionado ao câncer.

[004] A quimioterapia é cada vez mais usada na oncologia animal. Tirando vantagem dos avanços medicinais na terapia de câncer humano, existem cada vez mais moléculas disponíveis com vincristina, ciclofosfamida, carboplatina e 25 cisplatina para tratar animais de companhia. No campo veterinário, drogas contra o câncer são usadas particularmente no tratamento de tumores derivados do tecido hematopoiético (linfomas, leucemia). Por exemplo, o protocolo baseado em CHOP combinado com ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisona é usado atualmente no tratamento de vários linfomas. Agentes quimioterapêuticos podem 30 ser particularmente eficientes no prolongamento do ciclo de vida de um animal canceroso de algumas semanas até vários meses (o tempo médio de sobrevida dos cães tratados com o protocolo CHOP é de 13 meses).

[005] Realmente, os proprietários de animais de estimação, especialmente os proprietários de animais de companhia como os cães, estão optando cada vez 5 mais por tratar seus animais com quimioterapia para prolongar o máximo possível uma boa QOL (Qualidade de Vida). Os cães podem sofrer de distúrbios gastrointestinais na forma de apetite reduzido, náuseas ou diarreia que podem reduzir suas QOL e podem resultar em modificações no tratamento ou até mesmo a descontinuação do tratamento.

10 [006] Uma abordagem integrativa para administrar um paciente com câncer deve objetivar as múltiplas vias bioquímicas e fisiológicas que suportam o desenvolvimento do tumor e minimizam a toxicidade do tecido normal. A intervenção nutricional é um componente chave para aumentar a resposta à terapia e para melhorar a QOL. Além disso, nutrientes específicos podem ser usados como 15 ferramentas poderosas para reduzir a toxicidade associada com a terapia anticâncer.

[007] Proprietários de animais de estimação com câncer geralmente indagam sobre quais dietas seriam as mais adequadas na alimentação para auxiliar o animal durante o tratamento do câncer, e a internet e outros recursos descrevem 20 inúmeras “dietas para câncer” (por exemplo, dietas com alimentos crus, dietas com alto ou moderado teor de proteínas/baixo teor de carboidratos, dietas “citogênicas”, alto teor de gorduras, suplementação com ômega-3 e ácidos graxos) que alegadamente melhoram os resultados em cães com câncer ou minimizam os efeitos colaterais da terapia.

25 [008] O único produto existente que tem por objetivo solucionar este problema consiste em um produto úmido denominado “Prescription DietTM n/dTM Canine”. Foi associado com alguns benefícios de sobrevida modestos em um grupo selecionado de cães com linfoma em um ensaio clínico quando usados em conjunto com quimioterapia de doxorrubicina. Este produto não é normalmente 30 usado ou prescrito pelos veterinários e não é comumente usado na prática clínica.

Em primeiro lugar, visto que é um produto novo, apresenta mais restrições no seu uso da mesma forma como produtos secos. Está disponível apenas na forma enlatada que pode ser inconveniente e proibitiva em termos de custo para alguns proprietários de animais de estimação e possui também uma reputação casual de 5 causar distúrbios gastrointestinais. Além disso, como é comumente admitido pelo conhecimento geral, este produto compreende quantidade moderada de proteína e carboidratos, mas é suplementado com altas doses de óleo de peixe. Geralmente, considera-se pelo versado na técnica que um nível elevado de gordura é necessário para este tipo de alimento, pois isto representa uma fonte necessária de energia 10 para o animal de estimação que o tumor não consegue facilmente utilizar. Foi descoberto que células cancerígenas são programadas para aumentar a absorção de glicose e deslocar a sua produção de energia da fosforilação oxidativa mitocondrial para a glicólise citosólica, embora esta seja uma via pouco eficiente.

Este marco de tradição metabólico das células cancerígenas é chamado de “efeito 15 Warburg”. Devido a esta maior absorção de glicose pelas células cancerígenas que é usada para alimentar seu crescimento e proliferação, presume-se que uma dieta para pacientes cancerosos deveria possuir um nível moderado de carboidratos, a fim de colocar as células do tumor em uma situação “desfavorável”. Por outro lado, visto que muitas células cancerosas sintetizam a maioria dos ácidos graxos que 20 elas precisam endogenamente (lipogênese de novo) ao invés de usar os lipídios circulantes, presume-se que uma dieta com alto teor de gorduras no paciente com câncer seria benéfica para as células hospedeiras, exceto para as células do tumor”.

[009] Atualmente, não existem dietas comercialmente disponíveis 25 especificamente formuladas e clinicamente validadas para suportar o estado nutricional ideal e qualidade de vida de animais de estimação com câncer e para auxiliar a reduzir os efeitos colaterais gastrointestinais da quimioterapia.

SUMÁRIO

[0010] A presente divulgação relaciona-se a uma composição de ração de 30 animais de estimação compreendendo e cerca de 10% em peso a cerca de 20%

em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 60% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição.

[0011] Em algumas modalidades, a composição de ração de animais de 5 estimação da presente divulgação consiste em uma composição de ração de animais de estimação úmida.

[0012] Em algumas outras modalidades, a composição de ração de animais de estimação da presente divulgação consiste em uma composição de ração de animais de estimação semiúmida.

10 [0013] Em algumas modalidades adicionais, a composição de ração de animais de estimação da presente divulgação consiste em uma composição de ração de animais de estimação seca.

[0014] Em algumas modalidades, a composição de ração de animais de estimação da presente divulgação consiste em uma composição de ração úmida 15 para cães.

[0015] Em algumas outras modalidades, a composição de ração de animais de estimação da presente divulgação consiste em uma composição de ração semiúmida para cães.

[0016] Em algumas modalidades adicionais, a composição de ração de 20 animais de estimação da presente divulgação consiste em uma composição de ração seca para cães.

[0017] A presente divulgação também relaciona-se a uma composição de ração para cães compreendendo e cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca 25 de 30% em peso a cerca de 50% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição.

[0018] Em algumas modalidades, a composição de ração de animais de estimação acima da presente divulgação consiste em uma composição de ração úmida para cães.

30 [0019] Em algumas outras modalidades, a composição de ração de animais de estimação acima da presente divulgação consiste em uma composição de ração semiúmida para cães.

[0020] Em algumas modalidades adicionais, a composição de ração de animais de estimação acima da presente divulgação consiste em uma composição 5 de ração seca para cães.

[0021] Em algumas modalidades, a referida composição de ração de acordo com a presente divulgação compreende adicionalmente carboidratos em uma quantidade que varia de cerca de 15% em peso a cerca de 40% em peso, com base no peso total de matéria seca da composição.

10 [0022] Em algumas modalidades, a referida composição de ração compreende adicionalmente uma fonte de antioxidantes.

[0023] Em algumas modalidades, a fonte de antioxidantes compreende uma ou mais vitaminas selecionadas no grupo que consiste em Vitamina C, Vitamina E e carotenoide. 15 [0024] Na maioria das modalidades preferenciais, a referida composição de ração consiste em uma composição de ração de animais de estimação seca e a fonte de antioxidantes compreende Vitamina C em que a Vitamina C está presente na composição de ração em uma quantidade que varia de cerca de 220 ppm a cerca de 440 ppm em uma base de matéria seca, e/ou Vitamina E em que a 20 Vitamina E está presente na composição de ração em uma quantidade que varia de cerca de 660 ppm a cerca de 1100 ppm em uma base de matéria seca e/ou carotenoide, em que o carotenoide está presente na composição de ração em uma quantidade que varia de cerca de 2 ppm a cerca de 12 ppm em uma base de matéria seca.

25 [0025] Na maioria das outras modalidades preferenciais, a referida composição de ração consiste em uma composição de ração de animais de estimação úmida e a fonte de antioxidantes compreende Vitamina C em que a Vitamina C está presente na composição de ração em uma quantidade que varia de cerca de 200 a cerca de 600 ppm em uma base de matéria seca, e/ou Vitamina 30 E em que a Vitamina E está presente na composição de ração em uma quantidade que varia de cerca de 600 ppm a cerca de 2000 ppm em uma base de matéria seca e/ou carotenoide, em que o carotenoide está presente na composição de ração em uma quantidade que varia de cerca de 30 ppm a cerca de 100 ppm em uma base de matéria seca.

5 [0026] Em algumas modalidades, a referida composição de ração é uma composição de ração seca para cães compreendendo uma fonte de antioxidantes e em que a fonte de antioxidantes pode compreender Vitamina C em uma quantidade que varia de cerca de 200 ppm a cerca de 400 ppm como alimentação, e/ou Vitamina E em uma quantidade que varia de cerca de 600 ppm a cerca de 10 1000 ppm como alimentação e/ou carotenoide em uma quantidade que varia de cerca de 2 ppm a cerca de 10 ppm como alimentação.

[0027] Em algumas modalidades, a referida composição de ração compreende adicionalmente uma fonte de curcuminoides.

[0028] Na maioria das modalidades preferenciais, a referida composição de 15 ração compreende uma quantidade de curcuminoides que varia de cerca de 250 ppm a cerca de 2000 ppm em uma base de matéria seca.

[0029] Em algumas modalidades, a referida composição de ração compreende adicionalmente um extrato de cúrcuma, tal como em uma quantidade que varia de cerca de 300ppm a cerca de 700ppm como alimentação. 20 [0030] Em algumas modalidades, a referida composição de ração compreende adicionalmente uma fonte de ácido carnósico/carnasol.

[0031] Em algumas modalidades, a referida composição de ração compreende adicionalmente um extrato de alecrim como uma fonte de ácido carnósico e carnasol. Quanto aos outros ingredientes da composição de ração de 25 animal de estimação, a quantidade de extrato de alecrim que está presente na composição de ração de animal de estimação pode variar dependendo do conteúdo do dito extrato no ácido carnósico e carnasol.

[0032] Em algumas modalidades, a referida ração compreende um extrato de alecrim, cujo extrato de alecrim pode estar presente em uma quantidade que 30 varia de cerca de 50 ppm a cerca de 120 ppm como alimentação.

[0033] Na maioria das modalidades preferenciais, a referida composição de ração compreende uma quantidade de ácido carnósico e carnasol em uma quantidade que varia de cerca de 20 ppm a cerca de 90 ppm em uma base de matéria seca.

5 [0034] Em algumas modalidades, a referida composição de ração compreende adicionalmente uma fonte de piperina.

[0035] Em algumas modalidades, a referida composição de ração é uma ração seca para cães e compreende adicionalmente uma fonte de piperina.

[0036] Em algumas modalidades, a fonte de piperina pode consistir em um 10 extrato de pimenta.

[0037] Em algumas modalidades da composição de ração de acordo com a presente divulgação, a fonte de piperina consiste em um extrato de pimenta e o extrato de pimenta está presente na composição em uma quantidade que varia de carca de 15 ppm a cerca de 35 ppm como alimentação. 15 [0038] Na maioria das modalidades preferenciais, a composição de ração de acordo com a presente divulgação compreende uma quantidade de piperina que varia de 14 ppm a 60 ppm em uma base de matéria seca.

[0039] Em algumas modalidades, na composição de ração de acordo com a presente divulgação, a fonte de piperidina consiste em um extrato de pimenta. 20 [0040] O extrato de pimenta, dependendo do teor do dito extrato de pimenta na piperina, está mais preferencialmente presente na composição em uma quantidade adequada para obter um teor final na composição de ração que varia de 14 ppm a 60 ppm em uma base de matéria seca.

[0041] Nas modalidades em que a referida composição de ração para 25 animais de estimação é uma composição de ração seca para cães que compreende uma fonte de piperina sob a forma de um extrato de pimenta, o extrato de pimenta está presente na composição de ração seca para cães em uma quantidade que varia de 15 a 35 ppm como alimentação.

[0042] Em algumas modalidades, a referida composição de ração 30 compreende um extrato de cúrcuma e/ou um extrato de alecrim e/ou um extrato de pimenta e/ou um extrato de chá verde e/ou um extrato de romã. Em algumas dessas modalidades, a referida composição de ração compreende uma fonte de curcuminoides e de extrato de alecrim e, opcionalmente, também uma fonte de piperina. Em algumas modalidades, a referida composição de ração é uma 5 composição de ração seca para cães.

[0043] A presente divulgação também diz respeito a uma composição de ração definida pelo presente relatório descritivo para uso no suporte a cães afetados por câncer ou que se submetem a quimioterapia.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS 10 [0044] A Figura 1 ilustras os escores fecal com tempo de animais alimentados com composição nutricional moderada de gorduras.

[0045] Ordenada: valor médio do escore fecal semanal.

[0046] Abscissa: (i) painel esquerdo: grupo de animais de teste; (ii) painel direito: grupo de animais de controle. Em cada um dentre o painel esquerdo e painel 15 direito, e da esquerda para direita de cada painel: período de tempo após o início da alimentação dos animais com a composição (painel esquerdo) ou com a composição de convenção (painel direito): (i) semana 1, (ii) semana 2, (iii) semana 3, (iv) semana 4, (v) semana 5, (vi) semana 6, (vii) semana 7, (viii) semana 8.

[0047] A Figura 2 ilustras os valores de escore de QOL global com tempo de 20 animais alimentados com composição nutricional moderada de gorduras.

[0048] Ordenada: percentual do caso

[0049] Abscissa: (1) cada grupo de barras pareadas, da esquerda para direita: (i) animais alimentados com composição nutricional moderada de gorduras, (ii) animais alimentados com composição nutricional convencional. (2) grupos de 25 barras pareadas, da esquerda para direita: (i) referencial, (ii) semana 2, (iii) semana 4, (iv) semana 6, (v) semana 8. Em cada barra, seções coloridas, do topo para o fundo: (i) Ruim, (ii) Aceitável, (iii) Bom, (iv) Muito bom, (v) Excelente. Em cada seção, o número representa o número dos animais.

[0050] Figura 3: Efeitos antiploriferativos dos extratos de planta em várias 30 linhas de células tumorais de cães.

[0051] A Figura 3A ilustra a atividade antiploriferativa de um extrato de 40% de ácido elágico de romã (POE40®) em várias linhas de células tumorais de cães.

Ordenada, da parte superior para a parte inferior da figura: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9, Abscissa: concentração final de 5 extrato na cultura de células, conforme expresso em µg/ml.

[0052] A Figura 3B ilustra a atividade antiproliferativa de um extrato de chá verde (Naturex) em várias linhas celulares de tumor de cães. Ordenada, da parte superior para a parte inferior da figura: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL- 1, D17, HMPOS, K9,. Abscissa: concentração final de extrato na cultura de células, 10 conforme expresso em µg/ml.

[0053] A Figura 3C ilustra a atividade antiproliferativa de um extrato de pimenta do reino (VETPERINE®) em várias linhas de células tumorais de cães.

Ordenada, da parte superior para a parte inferior da figura: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9, Abscissa: concentração final de 15 extrato na cultura de células, conforme expresso em µg/ml.

[0054] A Figura 3D ilustra a atividade antiproliferativa de um extrato de alecrim (INOLENS70®) em várias linhas de células tumorais de cães. Ordenada, da parte superior para a parte inferior da figura: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9, Abscissa: concentração final de extrato na cultura de 20 células, conforme expresso em µg/ml.

[0055] A Figura 3E ilustra a atividade antiproliferativa de um extrato de raízes de cúrcuma (Naturex) em várias linhas de células tumorais de cães. Ordenada, da parte superior para a parte inferior da figura: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9,. Abscissa: concentração final de extrato na cultura de 25 células, conforme expresso em µg/ml.

[0056] A Figura 3F ilustra a atividade antiproliferativa de um extrato de 40% de punicosídeos de romã (P40P®) em várias linhas de células tumorais de cães.

Ordenada, da parte superior para a parte inferior da figura: BACA, BR, C2, CF33.MT, CF41.Mg, CLBL-1, D17, HMPOS, K9. Abscissa: concentração final de 30 extrato na cultura de células, conforme expresso em µg/ml.

[0057] A Figura 4 ilustra os efeitos antiproliferativos das combinações de dois extratos de plantas em várias linhas de células tumorais de cães.

[0058] A Figura 4A ilustra o efeito antiproliferativo da combinação de um extrato de alecrim e de um extrato de cúrcuma na proliferação da linha celular 5 cancerosa C2. Curvas: (i) linha tracejada: extrato de cúrcuma, (ii) linha pontilhada: extrato de alecrim a 70% p/p de ácido carnósico; (iii) linha contínua: combinação de extrato de cúrcuma e extrato de alecrim a 70% p/p de ácido carnósico. Ordenada: Percentual de células proliferativas em comparação com a cultura de controle na ausência desses extratos. Abscissa: concentração final da combinação de extratos 10 na cultura de células, conforme expresso em µg/ml.

[0059] A Figura 4B ilustra o efeito antiproliferativo da combinação de um extrato de alecrim e de um extrato de cúrcuma na proliferação da linha celular cancerosa CMT-12. Curvas: (i) linha tracejada: extrato de cúrcuma, (ii) linha pontilhada: extrato de alecrim a 70% p/p de ácido carnósico; (iii) linha contínua: 15 combinação de extrato de cúrcuma e extrato de alecrim a 70% p/p de ácido carnósico. Ordenada: Percentual de células proliferativas em comparação com a cultura de controle na ausência desses extratos. Abscissa: concentração final da combinação de extratos na cultura de células, conforme expresso em µg/ml.

[0060] A Figura 4C ilustra o efeito antiproliferativo da combinação de um 20 extrato de alecrim e de um extrato de cúrcuma na proliferação da linha celular cancerosa D17. Curvas: (i) linha tracejada: extrato de cúrcuma, (ii) linha pontilhada: extrato de alecrim a 70% p/p de ácido carnósico; (iii) linha contínua: combinação de extrato de cúrcuma e extrato de alecrim a 70% p/p de ácido carnósico. Ordenada: Percentual de células proliferativas em comparação com a cultura de controle na 25 ausência desses extratos. Abscissa: concentração final da combinação de extratos na cultura de células, conforme expresso em µg/ml.

[0061] A Figura 5 ilustra a atividade antiproliferativa de distintos extratos de plantas de diferentes origens em várias linhas de células tumorais de cães.

[0062] A Figura 5A ilustra a atividade antiproliferativa da seguinte 30 combinação de extratos: (i) extrato de cúrcuma (Naturex) e extrato de alecrim

INOLENS70, (ii) extrato de cúrcuma (Naturex) e extrato de alecrim INOLENS50, (iii) extrato de cúrcuma BCM-95 e extrato de alecrim INOLENS70 e (iv) extrato de cúrcuma BCM-95 e extrato de alecrim INOLENS50, na linha e células tumorais de cães C2. Ordenada: percentual de células viáveis em comparação com 5 a cultura de controle realizada na ausência das referidas combinações e extratos de plantas. Abscissa: concentração final da combinação de extratos na cultura de células, conforme expresso em µg/ml.

[0063] A Figura 5B ilustra a atividade antiproliferativa da seguinte combinação de extratos: (i) extrato de cúrcuma e extrato de alecrim INOLENS70, 10 (ii) extrato de cúrcuma e extrato de alecrim INOLENS50, (iii) extrato de cúrcuma BCM-95 e extrato de alecrim INOLENS70 e (iv) extrato de cúrcuma BCM-95 e extrato de alecrim INOLENS50, na linha e células tumorais de cães CMT-12.

Ordenada: percentual de células viáveis em comparação com a cultura de controle realizada na ausência das referidas combinações e extratos de plantas. Abscissa: 15 concentração final da combinação de extratos na cultura de células, conforme expresso em µg/ml.

[0064] A Figura 5C ilustra a atividade antiproliferativa da seguinte combinação de extratos: (i) extrato de cúrcuma e extrato de alecrim INOLENS70, (ii) extrato de cúrcuma e extrato de alecrim INOLENS50, (iii) extrato de cúrcuma 20 BCM-95 e extrato de alecrim INOLENS70 e (iv) extrato de cúrcuma BCM-95 e extrato de alecrim INOLENS50, na linha e células tumorais de cães D17.

Ordenada: percentual de células viáveis em comparação com a cultura de controle realizada na ausência das referidas combinações e extratos de plantas. Abscissa: concentração final da combinação de extratos na cultura de células, conforme 25 expresso em µg/ml.

[0065] A Figura 6 ilustra a atividade antiproliferativa dos extratos naturais em um ensaio de formação de colônias em ágar mole. Ordenada: percentual de células viáveis em comparação com a cultura de controle realizada na ausência de extratos. Barras na abscissa, da esquerda para a direita: (i) Controle (DMSO), (ii) 30 0,4 µg/ml extrato de curcumina (extrato de cúrcuma de Naturex), (iii) 0,8 µg/ml de alecrim INOLENS70, (iv) 6,25 µg/ml de VETPERINE, (v) 0,4 µg/ml de extrato de curcumina (Naturex) e 0,8 µg/ml de alecrim INOLENS70, e (vi) 0,4 µg/ml de extrato de curcumina (Naturex), 0,8 µg/ml de alecrim INOLENS70 e 6,25 µg/ml de VETPERINE.

5 [0066] A Figura 7 ilustra a atividade citotóxica de vários extratos de planta nas células caninas. Ordenada: percentual de células viáveis em comparação com a cultura de controle sem o referido extrato de planta. Abscissa: (1) grupo de barras, da esquerda para direita, com as seguintes linhas de células tumorais de cães: (i) CDF, (ii) C2, (iii) CMT-12, (iv) D17; (2) Em cada grupo de barras, da esquerda para 10 direita: (i) Controle (DMSO), (ii) 6,3 µg/ml de extrato de cúrcuma (Naturex), (iii) 6,3 µg/ml de extrato de alecrim INOLENS70, (iv) 3,1 µg/ml de extrato de cúrcuma (Naturex), 3,1 µg/ml extrato de alecrim INOLENS70

[0067] A Figura 8 ilustra mecanismos da atividade antiproliferativa e efeito citotóxico dos extratos de planta. 15 [0068] As Figuras 8A a 8D consistem em resultados dos ensaios de citometria de fluxo em que cada quadrante representa o número de eventos correspondentes a (i) quadrante esquerdo inferior: células avaliadas com estando vivas, (ii) células do quadrante direito inferior avaliadas como sendo apoptóticas iniciais, (iii) quadrante direito superior: células avaliadas como sendo 20 apoptóticas/necróticas tardias. Ordenada: sinal fluorescente de células que expressam 7-AAD, como expressas em Unidades Arbitrárias. Abscissa: sinal fluorescente de células positivas com Anexina V, conforme expressas em Unidades Arbitrárias.

[0069] A Figura 8E ilustra o percentual de células apoptóticas iniciais 25 (quadrante direito inferior de Anexina V positiva e células negativas 7-AAD) são representadas como 3 replicatas independentes com média ± desvio padrão.

Dentro de cada linha celular, médias com letras diferentes são significativamente diferentes umas das outras (p< 0,05). Ordenada: percentual de células apoptóticas.

Abscissa: (1) grupo de barras, da esquerda para direita, com as seguintes linhas 30 de células tumorais de cães: C2, CMT-12 e D17. (2) para cada grupo de barras, da esquerda para direita: (i) Controle (DMSO), (ii) 6,3 µg/ml de extrato de cúrcuma (Naturex), (iii) 6,3 µg/ml de extrato de alecrim INOLENS70, (iv) 3,1 µg/ml de extrato de cúrcuma, 3,1 µg/ml extrato de alecrim INOLENS70.

[0070] A Figura 9 ilustra a atividade apoptótica de extratos de planta.

5 Ordenada: alteração de dobra de caspase 3/7 ativada. Abscissa: (1) grupo de barras, da esquerda para direita, com as seguintes linhas de células tumorais de cães: C2, CMT-12 e D17. (2) para cada grupo de barras, da esquerda para direita: (i) Controle (DMSO), (ii) 6,3 µg/ml de extrato de cúrcuma (Naturex), (iii) 6,3 µg/ml de extrato de alecrim INOLENS70, (iv) 3,1 µg/ml de extrato de cúrcuma (Naturex), 10 3,1 µg/ml extrato de alecrim INOLENS70.

[0071] A Figura 10 ilustra a atividade antioxidante de extratos de planta.

Ordenada: alteração de dobra na reprodução de Espécies Reativas de Oxigênio (ERO). Abscissa: (1) grupo de barras, da esquerda para direita, com as seguintes linhas de células tumorais de cães: C2, CMT-12 e D17. (2) para cada grupo de 15 barras, da esquerda para direita: (i) Controle (DMSO), (ii) 6,3 µg/ml de extrato de cúrcuma (Naturex), (iii) 6,3 µg/ml de extrato de alecrim INOLENS70, (iv) 3,1 µg/ml de extrato de cúrcuma (Naturex), 3,1 µg/ml extrato de alecrim INOLENS70.

[0072] A Figura 11 ilustra a via de adição de SAPK/JNK por extratos de planta. 20 [0073] A Figura 11A representa os resultados de um experimento de Western blotting realizado com linhas de células C2. A Figura 11B representa os resultados de um experimento de Western blotting realizado com linha de células CMT-12.

[0074] As Figuras 11A e 11B, faixas da esquerda à direita: (i) Controle (DMSO) após 12h de incubação, (ii) Controle (DMSO) após 24h de incubação, (iii) 25 extrato de cúrcuma (Naturex) a 6,3 µg/ml após 12 h de incubação, (iv) extrato de cúrcuma (Naturex) a 6,3 µg/ml após 24 h de incubação, (v) extrato de alecrim (INOLENS70®) a 6,3 µg/ml após 12 h de incubação, (vi) extrato de alecrim (INOLENS70®) a 6,3 µg/ml após 24 h de incubação, (vii) 3,1 µg/ml de uma combinação de extrato de cúrcuma com extrato de alecrim após 12 h de incubação, 30 (viii) 3,1 µg/ml de uma combinação de extrato de cúrcuma com extrato de alecrim após 24h de incubação.

[0075] A Figura 12 ilustra a acumulação de curcumina por células tratadas por extrato de alecrim.

[0076] Figura 12A: efeito na linha de células C2. Figura 12B: efeito na linha 5 de células CMT-12. Figura 12C: efeito na linha de células D17.

[0077] Nas figuras 12A, 12B e 12C. Ordenada: alteração de dobra em curcumina, em comparação com a cultura de controle sem extrato de alecrim.

Abscissa, barras da esquerda para a direita: (i) Controle (DMSO), (ii) 3,1 µg/ml de extrato de cúrcuma (Naturex), (iii) 3,1 µg/ml de extrato de alecrim INOLENS70, (iv).

10 3,1 µg/ml de extrato de cúrcuma (Naturex) e 3,1 µg/ml de extrato de alecrim INOLENS70

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0078] A presente divulgação tem por objetivo disponibilizar um produto nutricional para cães diagnosticados com câncer (i) submetidos à quimioterapia 15 e/ou (ii) após um período de tratamento por quimioterapia (consumo diário). A presente composição de ração deve ser capaz de manter uma boa QOL, limitando os efeitos colaterais da quimioterapia (por exemplo, auxiliando os cães a lutar contra o câncer por meio do “suporte ao tratamento”) e mantendo um bom estado nutricional (manutenção do peso corporal, boa saúde digestiva). 20 [0079] Este objetivo tem sido alcançado pela provisão de uma composição nutricional com uma alta quantidade de proteína e uma quantidade moderada de carboidratos e uma quantidade moderada de gorduras. Como é conhecido nos exemplos deste documento, a referida composição nutricional, quando fornecida à cães afetados com câncer, especialmente a cães submetidos a um tratamento de 25 quimioterapia anticâncer, é bem tolerado e reduz significativamente os sinais de doença e melhora significativamente sua qualidade de vida. Além disso, a melhoria da qualidade de via de cães cancerosos alimentados com alto teor de proteínas / teor moderado de carboidratos e gorduras divulgados neste documento ocorre prontamente após um curto período de tempo após o início deste regime alimentar, 30 ocorre tipicamente apenas quatro semanas após o início deste regime alimentar.

[0080] A presente divulgação diz respeito a uma composição de ração com um alto teor de proteínas e teor moderado de carboidratos e gorduras. A referida composição pode ser usada para suportar um animal com câncer e, mais particularmente, um animal com câncer submetido à tratamento tal como 5 quimioterapia. A composição de ração também pode ser usada em um método para suportar um animal com um câncer submetido à terapia, tal como quimioterapia. A composição também pode ser usada em um método para o tratamento de câncer.

[0081] A presente divulgação relaciona-se a uma composição de ração compreendendo e cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de 10 cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 60% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição.

[0082] Em algumas modalidades, a composição de ração da presente divulgação consiste em uma composição de ração úmida para animais de 15 estimação, tal como composição de ração úmida para cães.

[0083] Em algumas outras modalidades, a composição de ração da presente divulgação consiste em uma composição de ração semiúmida para animais de estimação, tal como uma composição de ração semiúmida para animais de estimação. 20 [0084] Em algumas modalidades adicionais, a composição de ração da pressente divulgação consiste em uma composição de ração seca para animais de estimação, tal como uma composição de ração seca para cães.

[0085] Como usado neste documento, o termo “cerca de” ou “aproximadamente” significa dentro de um intervalo de erro aceitável para o valor 25 particular determinado por um versado na técnica, o que dependerá em parte da forma como o valor é medido ou determinado, ou seja, as limitações do sistema de medição. Por exemplo, “cerca” pode significar dentro de três ou mais de três desvios padrão, de acordo com a prática na técnica. Alternativamente, "cerca de" pode significar um intervalo de até 20%, de preferência até 10%, mais 30 preferencialmente até 5% e mais preferencialmente ainda até 1% de um determinado valor. Igualmente, em particular no que diz respeito a sistemas ou processos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude, preferencialmente dentro de 5 vezes, e mais preferencialmente dentro de 2 vezes, de um valor.

5 [0086] Como usado neste documento, os termos “ração seca para animais de estimação”, “ração seca”, “ração úmida para animais de estimação”, “ração úmida”, “ração semiúmida para animais de estimação” e “ração semiúmida” designa uma composição de ração nutricionalmente completa para animais de estimação abrangendo qualquer produto que um animal de estimação consume em sua dieta.

10 A composição de ração para animais de estimação preferencialmente um produto cozido. Pode-se incorporar material derivado de carne ou animal (tal como carne bovina, galinha, peru, cordeiro, peixe, plasma sanguíneo, medula óssea, etc., ou um ou mais destes). A composição de ração para animais de estimação pode ser alternativamente ausente de carne (preferencialmente, incluindo um substituto de 15 carne, tal como soja, glúten de milho ou um produto de soja) a fim de fornecer uma fonte de proteínas.

[0087] Como usado neste documento, uma composição de ração “seca” para animais de estimação possui um teor de umidade de 15% ou menos, tal como um teor de umidade que varia de 1% a 15%. 20 [0088] Como usado neste documento, uma composição de ração “semiúmida” para animais de estimação possui um teor de umidade que varia de mais de 15% a 50%.

[0089] Como usado neste documento, uma composição de ração “úmida” para animais de estimação possui um teor de umidade de 90% ou menos, tal como 25 um teor de umidade que varia de mais de 50% a 90%.

[0090] Em alguns dos seus aspectos, a presente divulgação diz respeito a uma composição de ração útil para cães com câncer, compreendendo gordura, fibras e proteínas, caracterizada pelo fato de que compreende gordura em uma quantidade que varia de cerca de 10% a cerca de 20% em uma base de matéria 30 seca, fibras em uma quantidade que varia de cerca de 5% a cerca de 15% em uma base de matéria seca e proteínas em uma quantidade que varia de cerca de 30% a cerca de 50% em uma base de matéria seca.

[0091] A presente divulgação diz respeito a uma composição de ração compreendendo gordura, fibras e proteínas, e em que a gordura é compreendida 5 em uma quantidade que varia de cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso, fibras são compreendidas em uma quantidade que varia de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso e proteínas são compreendidas em uma quantidade que varia de cerca de 30% em peso a cerca de 50% em peso, com base no peso total de matéria seca da composição.

10 [0092] A presente divulgação relaciona-se a uma composição de ração compreendendo e cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 50% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição. 15 [0093] As expressões “base de matéria seca (DM)” deve ser interpretada como um método para expressar a concentração de um nutriente ou um componente em uma alimentação ao expressar sua concentração relativa ao seu teor de matéria seca (a concentração permanecendo uma vez que a umidade foi removida). Por outro lado, a expressão “conforme alimentado” deve ser interpretada 20 como um método de expressar a concentração de um nutriente ou um componente em uma alimentação ao expressar sua concentração no estado que é alimentada, que inclui umidade.

[0094] Como mencionado anteriormente, a composição de ração da presente divulgação pode consistir em uma composição de ração seca para 25 animais de estimação ou em uma composição de ração semiúmida para animais de estimação, ou uma composição de ração úmida para animais de estimação.

[0095] As quantidades respectivas de gordura, fibras, proteínas e carboidratos em uma composição de ração para animais de estimação descrita neste documento são expressas em referência do peso total de matéria seca da 30 referida composição, assim, independente do teor de umidade da referida composição de ração para animais de estimação.

[0096] Outros ingredientes que podem ser compreendidos na composição de ração descrita ao longo do presente relatório descritivo podem ser expressos em unidades de “ppm” (também denominadas de “partes por milhão”), que é outra 5 forma convencional de especificar uma quantidade de uma substância compreendida em uma composição, incluindo quando compreendida em uma composição de ração para animais de estimação.

[0097] Ao longo do presente relatório descritivo, uma quantidade de uma dada substância que é expressa em unidades de “ppm”, significa (i) uma 10 quantidade na composição “como alimentado” ou (ii) uma quantidade em ppm em “uma base de matéria seca”, como será especificado.

[0098] Quando uma quantidade de uma dada substância é expressa neste documento em ppm “como alimentada”, o valor da quantidade em ppm pode alterar de acordo com o teor de umidade da composição de ração de animal de estimação. 15 Ilustrativamente, uma composição de ração de animal de estimação tendo 50% de teor de umidade e compreendo uma quantidade de 100 ppm “como alimentado” de uma dada substância possui o mesmo teor da dada substância, se expresso em uma base de matéria seca, do que uma composição de ração de animais de estimação tendo 30% de teor de umidade e compreendendo 140 ppm “como 20 alimentada” da dada substância, ou seja, em ambos os casos uma composição de ração de animais de estimação compreendendo 200 ppm da referida dada substância em uma base de matéria seca.

[0099] Como é comum na técnica, uma quantidade de uma dada substância compreendida em uma composição de ração de animais de estimação expressa 25 em “ppm como alimentado” é facilmente convertida na quantidade da dada substância como expressa em referência à matéria seca total da composição de ração de animais de estimação usando a fórmula abaixo: Y mg/100g DM = X ppm “como alimentado”)*100/(% de matéria seca), em que 30 - Y é a quantidade em mg da dada substância por 100 g de matéria seca

(“DM”) contida na composição de ração para animal de estimação.

- X é a quantidade em ppm da dada substância na composição de ração de animais de estimação, - % de matéria seca é o percentual de matéria seca na composição de ração 5 de animais de estimação,

[00100] Pode ser utilizado também a outra fórmula abaixo: (% X “como alimentada”)*100 / (% de matéria seca) = Y g / 100 g DM , em que - %X é a quantidade em percentual de peso da dada substância na 10 composição de ração de animais de estimação “pronta para comer”, - % de matéria seca é o percentual de matéria seca na composição de ração de animais de estimação “pronta para comer”, - Y é a quantidade em g da dada substância por 100 g de matéria seca (“DM”) contida na composição de ração de animais de estimação “pronta para usar”.

15 [00101] Para o objetivo da presente divulgação, exceto se indicado de outra forma, o percentual de uma substância compreendida na composição de ração seca de animais de estimação consiste em um percentual em peso com base no peso total da matéria seca da referida composição.

[00102] Um primeiro aspecto de uma composição de ração descrita 20 neste documento consiste em um nível moderada de gordura compreendida desta forma. Como mencionado, é comumente admitido pela comunidade científica que um nível alto de gordura deveria deve apresentar um interesse real em ração para animais submetidos a tratamento de câncer, pois representa uma fonte de energia que não é fácil de usar para células cancerosas. Um aspecto inovador específico 25 da presente divulgação é que, contrário a este prejuízo, é descrito pela primeira vez uma composição compreendendo um nível relativamente moderado de gordura. Os inventores definiram um teor de gordura ideal que deve ser compreendido em uma composição de ração para uso em cães afetados com câncer e, especificamente, para cães cancerosos submetidos a um tratamento anticâncer, por exemplo, um 30 tratamento de câncer por quimioterapia. Os inventores determinaram neste documento que o teor de gordura não deve ser baixo de modo que a composição de ração para cães resultante possui pelo menos requisitos mínimos no teor de calorias. Contudo, os inventores também determinaram neste documento que o teor de gordura não deve ser tão elevado de modo que a composição de ração para 5 cães resultante seja bem tolerada por animais adoentados pelo câncer. É bem conhecido que tratamentos contra câncer de animais doentes causam alterações no funcionamento do sistema digestório. Portanto, os inventores tomaram o cuidado de projetar uma composição que seja bem tolerada por cães cancerosos, especialmente que seja bem tolerada por cães cancerosos submetidos a um 10 tratamento de câncer.

[00103] Em uma modalidade preferencial, uma composição de ração seca para cães como descrita neste documento compreende gordura em uma quantidade que varia de 10 % a 20% em peso, de preferência que varia de 12 % a 16% em peso e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 13% 15 em peso, em uma base de matéria seca, ou seja, com base no peso total de matéria seca da composição.

[00104] As expressões “gordura” ou “fonte de gordura” como usadas no presente relatório descritivo compreende qualquer gordura(s) e/ou óleo(s) aceitáveis para ração, independentemente de sua consistência a temperatura 20 ambiente, ou seja, independente se a referida “fonte de gordura” estiver presente na forma essencialmente fluida ou na forma essencialmente sólida. A composição de acordo com a presente divulgação pode compreende gordura de origem animal e/ou vegetal. A gordura pode ser fornecida por qualquer de uma variedade de fontes conhecidas pelos versados na técnica. Fontes de gordura vegetal incluem, 25 sem limitação, trigo, girassol, cártamo, colza, azeitona, borragem, linhaça, amendoim, semente de groselha preta, semente de algodão, trigo, gérmen, germe de milho, bem como óleos derivados destas e de outras fontes de gordura vegetal.

As fontes animais incluem, por exemplo e sem limitação, gordura de franco, gordura de peru, gordura de boi, gordura de pato, gordura de porco, gordura de cordeiro, 30 etc., óleo de peixe ou qualquer carne, subprodutos de carne, frutos do mar,

laticínios, ovos, etc. O teor de gordura dos alimentos pode ser determinado por qualquer número de métodos conhecidos pelos versados na técnica.

[00105] Um segundo aspecto de uma composição de ração descrita neste documento consiste no nível de fibras compreendida desta forma.

5 [00106] A expressão “fibras” é semelhante à “fibras dietéticas” e deve ser interpretada para o objetivo da presente divulgação como Fibras Totais, significando que inclui fibras solúveis e fibras insolúveis. Fibra solúvel (também mencionada como fibras fermentáveis) pode ser definida como sendo resistente à digestão e absorção no intestino delgado e submetida a fermentação completa ou 10 parcial no intestino grosso. Como exemplo não limitativo de fibras solúveis, pode- se mencionar polpa de beterraba, goma guar, raiz de chicória, psyllium, pectina, mirtilo, oxicoco, abóbora, maçã, aveia, feijão, cítrico, cevada ou ervilha. Uma fibra solúvel preferencial é polpa de chicória. Fibras solúveis são consideradas como tendo um efeito probiótico ao prover ácidos graxos de cadeia curta como uma fonte 15 de energia para os colonócitos. Por oposição, fibra insolúvel (também mencionada como fibras não fermentáveis) podem ser definidas como polissacarídeos não amiláceo que são resistente à digestão e absorção no intestino delgado e resistentes à fermentação no intestino grosso. Como exemplo não limitativo de fibras insolúveis, pode-se citar celulose, produtos de trigo integral, aveia de trigo, 20 farelo de milho, semente de linho, uva, aipo, feijão verde, couve-flor, cascas de batata, cascas de frutas, cascas de vegetais, cascas de amendoim e fibra de soja.

Uma fibra insolúvel preferencial é celulose. Fibras insolúveis são consideradas úteis para efeito de trânsito e lastro. Em uma modalidade preferencial, a composição da presente divulgação compreende fibras em uma quantidade de 5 a 15%, de 25 preferência de 7 a 10% e ainda mais preferencialmente em cerca de 8,9%, em uma base de matéria seca.

[00107] Em outra modalidade, uma composição de ração descrita neste documento também compreende Psyllium para melhorar a saúde digestiva, pois o Psyllium fornecerá consistência às fezes líquidas e suavizar as fezes secas.

30 Preferencialmente, uma composição de ração seca para cães divulgada neste documento compreende uma quantidade de Psyllium que varia de 0,2 % em peso a 1% em peso, mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 0,5% em peso, em uma base de matéria seca, ou seja, com base no peso total de matéria seca da composição.

5 [00108] Um terceiro aspecto particular de uma composição de ração divulgada neste documento consiste no nível de proteínas compreendida desta forma. O nível de proteína deve ser elevado de modo a garantir a manutenção da massa corporal magra. Uma composição de ração de acordo com a presente divulgação pode conter uma ou mais proteínas distintas. Geralmente, uma 10 composição de ração descrita neste documento compreende uma pluralidade de proteínas que estão contidas em uma fonte de proteínas que é usada no processo de fabricação. Em algumas modalidades, uma proteína compreendida em uma composição alimentar está em uma forma nativa. Em algumas outras modalidades, uma proteína pode estar presente pelo menos parcialmente na forma hidrolisada 15 que abrange uma proteína que é quase que completamente hidrolisada. Uma composição de ração de acordo com a presente divulgação pode incorporar proteínas sob a forma de carne ou material derivado de animal (tal como carne bovina, galinha, peru, cordeiro, peixe, plasma sanguíneo, medula óssea, etc., ou um ou mais destes). Em algumas outras modalidades, uma composição de ração 20 descrita neste documento pode ser isenta de carne e, de preferência, compreende uma fonte de proteína substituta de carne como soja, glúten de milho ou qualquer outro produto de soja contendo proteína, a fim de fornecer uma fonte de proteína.

Uma composição de ração conforme divulgada neste documento pode compreender fontes de proteínas adicionais tais como concentrado proteico de 25 soja, proteínas de leite, glúten, etc.

[00109] Em algumas modalidades, a composição de ração conforme descrita neste documento compreende adicionalmente carboidratos em uma quantidade que varia de cerca de 15% em peso a cerca de 40% em peso em uma base de matéria seca, ou seja, com base no peso total de matéria seca da 30 composição.

[00110] A expressão “carboidrato” como usada neste documento abrange polissacarídeos e açúcares que são metabolizados para energia quando hidrolisados no corpo. O teor de carboidratos das rações pode ser determinado por qualquer outro número de métodos conhecidos pelos versados na técnica.

5 Contudo, no presente relatório descritivo, e exceto se for claramente especificado ao contrário, o percentual de carboidratos é calculado como extrato isento de nitrogênio (“NFE”) que pode ser calculado a seguir:

[00111] NFE=100%−mistura %−proteína %−gordura %−cinzas %−fibra bruta %.

10 [00112] O carboidrato pode ser provido sob a forma de qualquer uma de uma variedade de fontes de carboidratos conhecida pelos versados na técnica, incluindo fibra de aveia, celulose, casca de amendoim, polpa de beterraba, arroz parboilizado, amido de milho, farinha de glúten e qualquer combinação daquelas fontes. Grãos que fornecem carboidratos incluem, mas não estão limitados a, trigo, 15 milho, cevada e arroz.

[00113] Nas modalidades preferenciais de uma ração de acordo com a presente divulgação, o teor de umidade de uma composição de ração seca de animais de estimação de acordo com a presente divulgação varia de 1 % em peso a 15% em peso, vantajosamente varia de 5 % em peso a 12% em peso, e mais 20 preferencialmente varia de 8 % em peso a 10% em peso em uma base de matéria seca, ou seja, com base no peso total de matéria seca da composição. Em uma modalidade mais preferencial, o teor de umidade é em torno de 9,5% em peso, em uma base de matéria seca, ou seja, com base no peso total de matéria seca da composição.

25 Ingrediente adicionais

[00114] Em algumas modalidades, a composição de ração de acordo com a presente divulgação compreende adicionalmente uma fonte de antioxidantes.

[00115] A expressão “antioxidante” significa uma substância ou um 30 componente que é capaz de reagir com radicais livres e neutralizá-los. Exemplos ilustrativos de tais substâncias incluem, sem limitação, carotenoides, incluindo betacaroteno, licopeno e luteína, selênio, coenzima Q10 (ubiquinona), tocotrienols, isoflavonas de soja, S-adenosilmetionina, glutationa, taurina, N-acetilcisteína, vitamina E, vitamina C, ácido lipoico e L-carnitina.

5 [00116] Em uma modalidade preferencial, a composição de ração compreende Vitamina C.

[00117] Em uma modalidade preferencial, a composição de ração compreende Vitamina E.

[00118] Em uma modalidade preferencial, a composição de ração 10 compreende Carotenoides. Carotenoides preferenciais são luteína e betacaroteno.

[00119] Em uma modalidade preferencial, a composição de ração compreende adicionalmente luteína.

[00120] Em algumas modalidades, a composição de ração compreende uma combinação de tais antioxidantes, tal como uma combinação de Vitamina C 15 e/ou Vitamina E e/ou Carotenoides e/ou taurina. Em algumas modalidades preferenciais, uma composição de ração compreende uma combinação de Vitamina C e Vitamina E e Carotenoides.

[00121] Em algumas modalidades preferenciais, a composição de ração de acordo com a presente divulgação compreende adicionalmente uma fonte 20 de antioxidantes compreendendo Vitamina C.

[00122] Na maioria das modalidades preferenciais, a composição de ração de acordo com a presente divulgação compreende Vitamina C em uma quantidade que varia de 200 ppm a 600 ppm em uma base de matéria seca.

[00123] Em algumas modalidades preferenciais, uma 25 composição de ração de acordo com a presente divulgação é uma composição de ração seca de animais de estimação e compreende uma fonte de antioxidantes compreendendo vitamina C, e em que a Vitamina C está presente em uma quantidade que varia de 220 ppm a 440 ppm em uma base de matéria seca.

[00124] Em algumas modalidades preferenciais, uma composição de 30 ração de acordo com a presente divulgação é uma composição de ração úmida de animais de estimação e compreende adicionalmente uma fonte de antioxidantes compreendendo vitamina C, e em que a Vitamina C está presente em uma quantidade que varia de 200 ppm a 600 ppm em uma base de matéria seca.

[00125] Em algumas modalidades preferenciais, uma composição de 5 ração de acordo com a presente divulgação é uma composição de ração seca de animais de estimação e compreende adicionalmente uma fonte de antioxidantes compreendendo vitamina C, e em que a quantidade final de Vitamina C na composição de ração está presente em uma quantidade que varia de 660 ppm a 1100 ppm em uma base de matéria seca.

10 [00126] Em algumas modalidades preferenciais, uma composição de ração de acordo com a presente divulgação é uma composição de ração úmida de animais de estimação e compreende adicionalmente uma fonte de antioxidantes compreendendo Vitamina E, e em que a quantidade final de Vitamina E na composição de ração está presente em uma quantidade que varia de 600 ppm a 15 2000 ppm, que abrange de 800 ppm a 1300 ppm em uma base de matéria seca.

[00127] Em algumas modalidades preferenciais, uma composição de ração de acordo com a presente divulgação é uma composição de ração seca de animais de estimação e compreende adicionalmente uma fonte de antioxidantes compreendendo carotenoides. 20 [00128] Nas modalidades mais preferenciais de uma ração seca de animais de estimação de acordo com a presente divulgação, carotenoides estão presentes na composição de ração em uma quantidade que varia de 2 ppm a 12 ppm em uma base de matéria seca.

[00129] Em algumas outras modalidades preferenciais, uma 25 composição de ração de acordo com a presente divulgação é uma composição de ração úmida de animais de estimação e compreende adicionalmente uma fonte de antioxidantes compreendendo carotenoides.

[00130] Em algumas outras modalidades preferenciais, uma composição de ração de acordo com a presente divulgação é uma composição de 30 ração úmida de animais de estimação e compreende adicionalmente carotenoides e em que os carotenoides estão presentes na referida ração úmida de animais de estimação em uma quantidade que varia de 2 ppm a 100 ppm, que abrange de 30 ppm a 100 ppm em uma base de matéria seca.

[00131] Como uma modalidade não limitativa, pode-se utilizar uma 5 combinação de antioxidantes chamado de “coquetel CELT” que compreende Vitamina C (cerca 300ppm), Vitamina E (cerca de 800ppm), Luteína (cerca de 5pp), Taurina (cerca de 0,625 g/MCal) + Vitamina D3 (cerca de 1000 IU/kg).

[00132] Em outra modalidade, a composição de ração de acordo com a presente divulgação pode compreender também Butirato de sódio para efeito 10 probiótico como um ácido graxo de cadeia curta e fonte de energia para colonócitos.

Preferencialmente, a composição de ração compreende de 0,2 % em peso a 1% em peso de butirato de sódio, mais preferencialmente de cerca de 0,5% em peso de butirato de sódio em uma base de matéria seca, ou seja, com base no peso total de matéria seca da composição. 15 [00133] No mesmo alvo do butirato de sódio acima, a composição de ração de acordo com a presente divulgação pode compreender também zeólito para melhor a consistência fecal. Preferencialmente, a composição de ração compreende de 0,5% em peso a 1,5% em peso de zeólito, mais preferencialmente de cerca de 1% em peso em uma base de matéria seca, ou seja, com base no peso 20 total de matéria seca da composição.

[00134] Em algumas modalidades preferenciais, a composição de ração descrita no presente documento pode compreender também arginina como um suplemento para aumentar a imunidade específica. Preferencialmente, a composição de ração compreende de 1 % em peso a 4% em peso de arginina, mais 25 preferencialmente de cerca de 2% em peso a 3% em peso e ainda mais preferencialmente cerca de 2,7% em peso em uma base de matéria seca, ou seja, com base no peso total de matéria seca da composição.

[00135] Em outra modalidade, a composição de ração pode compreender também EPA/DHA para melhorar o estado metabólico e gerar um 30 efeito anti-inflamatório. Preferencialmente, a composição de ração compreende de

0,4% em peso a 0,8% em peso de EPA/DHA, mais preferencialmente de cerca de 0,6% em peso em uma base de matéria seca, ou seja, com base no peso total de matéria seca da composição.

[00136] Como mostrado nos exemplos neste documento, pode ser 5 desejável que a composição de ração de acordo com a presente divulgação compreenda adicionalmente um ou mais extratos dotados de atividade anticâncer, que abrangem substâncias que são citotóxicas contra células cancerosas, incluindo substâncias tendo um efeito antiproliferativo e/ou próapoptótico contra células cancerosas, como é mostrado também nos exemplos deste documento, pode ser 10 desejável que uma composição de ração seca para cães de acordo com a presente divulgação compreenda adicionalmente uma combinação de duas ou mais substâncias dotadas de atividade anticâncer, e especialmente uma combinação de duas ou mais substâncias dotadas de atividade anticâncer, para as quais uma atividade anticâncer sinérgica foi determinada. Combinações de substâncias 15 dotadas de atividade anticâncer abrangem combinações de duas substâncias dotadas de atividade anticâncer, bem como combinações de três substâncias dotadas de atividade anticâncer, especialmente aquelas tendo uma atividade anticâncer sinérgica.

[00137] Outra modalidade particular e preferencial de uma composição 20 de ração divulgada neste documento é a inclusão de curcuminoides.

[00138] Assim, em algumas modalidades, uma composição de ração descrita neste documento compreende adicionalmente uma fonte de curcuminoides.

[00139] Curcuminoides incluem curcumina, demetóxicurcumina, bis- 25 metóxicurcumina e/ou tetrahidrocurcumina. Curcuminoides são fenois naturais que estão presentes, em particular, no açafrão-da-índia. A cúrcuma é derivada das raízes da planta Curcuma longa. Curcuminoides foram encontrados também nas raízes de outras espécies na família de plantas Zingiberaceae do gênero Curcuma.

Em particular, a cúrcuma contém de 60-80% de curcumina, 15-30% de 30 demetóxicurcumina e 2-6% de bis-demetóxicurcumina. O curcuminoides na composição da presente divulgação pode estar em qualquer formato, incluindo um pó ou extrato de lipídios.

[00140] Nas modalidades mais preferenciais, uma composição de ração de acordo com a presente divulgação, curcuminoides estão presentes em 5 uma quantidade variando de cerca de 250 ppm a 2000 ppm em uma base de matéria seca.

[00141] Em uma modalidade preferencial, a fonte de curcuminoides consiste em um extrato de cúrcuma (Curcuma Longa). Como exemplos não limitativos, pode-se mencionar que (i) o extrato de cúrcuma BCM-95® 10 comercializado pela Arjuna compreende 86% p/p de curcuminoides, (ii) o extrato de cúrcuma comercializado pela Naturex compreendendo 85% p/p de curcuminoides e (iii) o extrato de cúrcuma comercializado pela Indena/Meriva compreendendo 20% p/p de curcuminoides. Pode-se utilizar qualquer outra fonte conhecida pelo versado na técnica. De acordo com o referido aspecto preferencial, 15 uma composição de ração descrita neste documento compreende adicionalmente um extrato de cúrcuma. Outras fontes disponíveis para curcuminoides também pode ser selecionada a partir de curcumina lipossomal, nanopartículas de curcumina, complexo fosfolipídico de curcumina, análogos estruturais de curcumina (por exemplo, EF-24) detemetóxicurcumina, bisdemetóxicurcumina, 20 tetrahidrocurcumina e qualquer formulação comercial/DM criada para aumentar a biodisponibilidade de curcumina.

[00142] Como é prontamente entendido pelo versado na técnica, a quantidade de extrato de cúrcuma que é compreendida em uma composição de ração de acordo com a presente divulgação dependendo da concentração.

25 [00143] Ilustrativamente, uma composição de ração compreendendo cerca de 1000 ppm de curcuminoides pode ser selecionada dentre (i) uma composição de ração de animais de estimação compreendendo cerca de 1163 ppm de um extrato de cúrcuma tendo 86% p/p de curcuminoides, (ii) uma composição de ração de animais de estimação compreendendo cerca de 1176 ppm de um 30 extrato de cúrcuma tendo 85% p/p de curcuminoides ou (iii) uma composição de ração de animais de estimação compreendendo cerca de 5000 ppm de um extrato de cúrcuma tendo 20% p/p de curcuminoides.

[00144] Nas modalidades em que a composição de ração é uma composição de ração seca para cães, o referido extrato de cúrcuma pode estar 5 presente na composição de ração seca em uma quantidade que varia de 300ppm a 700ppm como alimentado, preferencialmente de 400ppm a 600ppm como alimentado, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de 500ppm como alimentado.

[00145] O referido extrato de cúrcuma pode estar presente em uma 10 composição de ração seca para cães em uma quantidade variando de 300 ppm a 700 ppm como alimentado, preferencialmente de 400 ppm a 700 ppm como alimentado, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de 500 ppm como alimentado,

[00146] Em ainda outra modalidade preferencial, em que a composição 15 de ração é uma composição de ração seca para cães, a composição de ração pode compreender o referido extrato de cúrcuma presente em uma quantidade variando de cerca de 300ppm a cerca de 700ppm.

[00147] Nas modalidades mais preferenciais, uma composição de ração de acordo com a presente divulgação, curcuminoides estão presentes em 20 uma quantidade variando de cerca de 250 ppm a 2000 ppm em uma base de matéria seca.

[00148] De acordo com algumas outras modalidades, a composição de ração conforme descrita neste documento pode compreende ácido carnósico /carnosol. Em alguns aspectos preferenciais, uma composição de ração como 25 divulgada neste documento compreende adicionalmente uma fonte de ácido carnósico/carnosol.

[00149] Em uma modalidade preferencial, a fonte de ácido carnósico/carnosol consiste em um extrato de alecrim (Rosmarinus officinalis).

Como exemplo não limitativo, pode-se mencionar o extrato de alecrim 30 INOLENS50 ou INOLENS70 da Vitiva. Pode-se utilizar qualquer outra fonte conhecida pelo versado na técnica. De acordo com o referido aspecto preferencial, uma composição de ração de animais de estimação descrita neste documento compreende adicionalmente um extrato de alecrim. O referido extrato de alecrim pode estar presente na referida composição de ração em uma quantidade variando 5 de cerca de 50 ppm a cerca de 120 ppm como alimentado, preferencialmente de cerca de 70 ppm a cerca de 100 ppm como alimentado, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 90 ppm em uma base de matéria seca. Em ainda outra modalidade preferencial, o extrato de alecrim está presente na composição de ração em uma quantidade variando de cerca de 50 10 ppm a cerca de 120 ppm como alimentado.

[00150] O referido extrato de alecrim pode estar presente em uma composição de ração seca de animais de estimação tendo cerca de 10% de teor de umidade em uma quantidade variando de 55 ppm a 140 ppm em uma base de matéria seca, preferencialmente de 80 ppm a 120 ppm em uma base de matéria 15 seca, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 100 ppm em uma base de matéria seca. Em ainda outra modalidade preferencial, o extrato de alecrim está presente na composição de ração em uma quantidade variando de cerca de 55 ppm a cerca de 140 ppm em uma base de matéria seca. Outras fontes disponíveis para ácido carnósico/carnosol também podem ser selecionadas a partir 20 de extrato de sálvia comum (Salvia Officinalis), a partir da família de plantas Lamiaceae como tomilho, orégano, savero, erva-cidreira ou hissopo.

[00151] Em algumas modalidades da ração de acordo com a presente divulgação, a referida ração pode compreender adicionalmente uma quantidade de ácido carnósico e carnasol variando de cerca de 20 a cerca de 90 ppm em uma 25 base de matéria seca.

[00152] Como usado neste documento, uma quantidade de “ácido carnósico e carnosol” significa a quantidade total resultante da soma da (i) quantidade de ácido carnósico e da (ii) quantidade de carnosol na composição de ração de animais de estimação.

30 [00153] Outra modalidade particular e preferencial da presente divulgação é a inclusão de piperina. Em um aspecto preferencial, uma composição de ração como divulgada no presente documento compreende uma fonte de piperina.

[00154] Na maioria das modalidades preferenciais de uma composição 5 de ração de acordo com a presente divulgação, a referida composição pode compreender piperina em uma quantidade variando de cerca de 14 a 60 ppm em uma base de matéria seca.

[00155] Em uma modalidade preferencial, a fonte de piperina consiste em um extrato de pimenta-do-reino (Piper nigrum). Como exemplo não limitativo, 10 pode-se mencionar o extrato de pimenta Vetperine da Sabinsa. Pode-se utilizar qualquer outra fonte conhecida pelo versado na técnica. De acordo com o referido aspecto preferencial, uma composição de ração seca para cães descrita neste documento compreende adicionalmente um extrato de pimenta. O referido extrato de pimenta pode estar presente em uma composição de ração seca para cães em 15 uma quantidade variando de 15 ppm a 35 ppm como alimentado, preferencialmente de 20 ppm a 30 ppm como alimentado, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 27 ppm como alimentado.

[00156] Em ainda outra modalidade preferencial, uma composição de ração de acordo com a presente divulgação pode compreender um extrato de 20 pimenta em uma quantidade variando de cerca de 15ppm a cerca de 35ppm. Outras fontes disponíveis para piperina também podem ser selecionadas a partir de pimenta verde e branca, , gênero Piper ou pimenta longa (Piper longum e Piper officinarum). Em ainda outra modalidade preferencial, a composição de ração de acordo com a presente divulgação é caracterizada pelo fato de que o extrato de 25 cúrcuma está presente na referida composição em uma quantidade variando de cerca de 300ppm a cerca de 700ppm e/ou o extrato de alecrim está presente na referida composição em uma quantidade variando de cerca de 50ppm a cerca de 110ppm e/ou o extrato de pimenta está presente na referida composição em uma quantidade variando de cerca de 15ppm a cerca de 35ppm.

30 [00157] O extrato de cúrcuma (rico em curcumina) e o extrato de alecrim (rico em ácido carnósico) trabalham em sinergia para reduzir o crescimento de células neoplásicas (como mostrado a seguir nos exemplos). Esta combinação de extratos resulta em apoptose das células através da ativação da Caspase 3/7.

Ambos extratos possuem efeitos antioxidantes com espécies reativas de oxigênio 5 (ERO) redutoras. Além disso, a exposição ao extrato de cúrcuma e extrato de alecrim aumentou a quinase N-terminal de c-jun ativada. Após exame adicional, descobriu-se que um tratamento de alecrim cause um aumento significativo na acumulação celular de curcumina. Esse aumento nos níveis de curcumina intracelular pode exercer um papel na sinergia. O extrato de pimenta rico em 10 piperina também é capaz de diminuir a proliferação de várias células cancerosas (como demonstrado nos exemplos) e, além disso, aumenta a absorção e também a biodisponibilidade de uma variedade de nutrientes, como a curcumina.

[00158] Em algumas modalidades, a composição de ração de acordo com a presente divulgação pode compreender também uma fonte de polifenois, tal 15 como catequinas. A fonte de catequinas (flavonoides) pode consistir preferencialmente de um extrato de chá verde (Camellia sinensis). Como exemplo não limitativo, pode-se mencionar o extrato da Naturex. O extrato de chá verde refere-se a um derivativo herbal das folhas de chá verde. Os extratos de chá verde podem ser criado por infusões moles, extratos moles, extratos secos e técnicas de 20 extratos parcialmente purificados. O extrato de chá verde compreende catequinas de chá verde (GTC), epigalocatequina (EGC), epicatequina galato (ECG), epigalocatequina galato (EGCG) e flavonoides como kaempferol, quercetina e miricetina. Outras fontes comuns de polifenois são, mas não limitadas a, cacau, raízes maculadas de Centaurea, plantas de chá incluindo chá branco, chá preto e 25 chá Oolonga e vinho de uva.

[00159] Em algumas outras modalidades, a composição de ração de acordo com a presente divulgação pode compreender também uma fonte de ácido elágico/punicalagina. A fonte de ácido elágico/punicalagina pode consistir preferencialmente em um extrato de romã (Punica granatum). Como exemplo não 30 limitativo, pode-se mencionar os extratos de Polinat POE40 ou P40P. Outra fonte disponível para ácido elágico/punicalagina pode ser selecionada de cranberries, nozes, framboesas, árvore Terminalia catappa, árvore Terminalia myriocarpa, Combretum molle (planta veludo bushwillow) ou planta do gênero Myrtales 5 [00160] Em uma modalidade preferencial, a composição de ração de acordo com a presente divulgação compreende adicionalmente extrato de cúrcuma e/ou extrato de alecrim e/ou extrato de pimenta e/ou extrato de chá verde e/ou extrato de romã.

[00161] Em algumas modalidades, uma composição de ração como 10 divulgada no presente documento compreende uma combinação de uma fonte de curcuminoides e de um extrato de alecrim. Em algumas destas modalidades, a referida composição de ração de animais de estimação compreende adicionalmente uma fonte de piperina.

[00162] A presente divulgação inclui um método para preparar a 15 composição de ração. O processo para fabricação de produtos alimentares como descrito pode ser feito de acordo com qualquer método conhecido na técnica.

Composição de ração seca para animais de estimação

[00163] Conforme descrito ao longo de toda a presente divulgação, uma composição de ração seca para animais de estimação de acordo com a 20 presente divulgação possui um teor de umidade de menos de 15% tal como um teor de umidade variando de 1% a 15%, tal como um teor de umidade de cerca de 10%, ou como tal, um teor de umidade de cerca de 12%.

[00164] Assim, a presente divulgação abrange uma composição de ração seca de animais de estimação compreendendo de cerca de 10% em peso a 25 cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 60% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição.

[00165] A presente divulgação relaciona-se notavelmente a uma 30 composição de ração seca para cães compreendendo e cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 50% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição.

5 [00166] Em algumas modalidades, a referida composição de ração seca para animais de estimação compreende uma fonte de antioxidantes compreendendo Vitamina C e em que a Vitamina C está presente em uma quantidade que varia de cerca de 200 ppm a cerca de 400 ppm como alimentado, e/ou Vitamina E em uma quantidade que varia de cerca de 600 ppm a cerca de 10 1000 ppm como alimentado e/ou carotenoide em uma quantidade que varia de cerca de 2 ppm a cerca de 10 ppm como alimentado.

[00167] Em algumas modalidades, a referida composição de ração seca de animais de estimação compreende uma fonte de antioxidantes compreendendo Vitamina C, em que a Vitamina C está presente em uma 15 quantidade que varia de cerca de 220 ppm a cerca de 440 ppm em uma base de matéria seca, e/ou Vitamina E em que a Vitamina E está presente em uma quantidade variando de cerca de 660 ppm a cerca de 1100 ppm e/ou carotenoide, em que carotenoide está presente em uma quantidade variando de cerca de 2 ppm a cerca de 12 ppm, as quantidades em ppm sendo expressas em uma base de 20 matéria seca.

[00168] Em algumas modalidades, a referida composição de ração seca para animais de estimação compreende um extrato de cúrcuma que pode estar presente na composição de ração seca para cães em uma quantidade que varia de 300ppm a 700ppm como alimentado, preferencialmente de 400ppm a 25 600ppm como alimentado, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de 500ppm como alimentado.

[00169] Em algumas modalidades, a referida composição de ração seca para animais de estimação compreende um extrato de cúrcuma que pode estar presente na composição de ração seca para animais de estimação em uma 30 quantidade variando de 360 ppm a 780 ppm em uma base de matéria seca,

preferencialmente de 440 ppm a 670 ppm em uma base de matéria seca, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de 550 ppm em uma base de matéria seca.

[00170] Na maioria das modalidades preferenciais, a referida 5 composição de ração seca para animais de estimação compreende curcuminoides que estão presentes em uma quantidade variando de cerca de 250 ppm a cerca de 2000 ppm em uma base de matéria seca.

[00171] Em algumas modalidades, a referida composição de ração seca para animais de estimação compreende adicionalmente uma fonte de ácido 10 carnósico/carnasol, tal como extrato de alecrim. O referido extrato de alecrim pode estar presente na referida composição de ração seca para cães em uma quantidade variando de 50 ppm a 120 ppm como alimentado, preferencialmente de 70 ppm a 100 ppm como alimentado, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 90 ppm como alimentado. Em ainda outra modalidade preferencial, o 15 extrato de alecrim está presente na composição de ração seca para animais de estimação em uma quantidade variando de cerca de 50 ppm a cerca de 120 ppm como alimentado.

[00172] Em algumas modalidades, a referida composição de ração seca para animais de estimação compreende adicionalmente uma fonte de ácido 20 carnósico/carnasol, tal como extrato de alecrim. O referido extrato de alecrim pode estar presente na referida composição de ração seca para cães em uma quantidade variando de cerca de 55 a cerca de 130 ppm em uma base de matéria seca.

[00173] Na maioria das modalidades preferenciais da composição de ração seca para animais de estimação, a referida composição compreende ácido 25 carnósico e carnosol que estão presentes em uma quantidade variando de 20 ppm a 90 ppm em uma base de matéria seca.

[00174] Como usado neste documento, uma quantidade de “ácido carnósico e carnosol” significa a quantidade total resultante da soma da (i) quantidade de ácido carnósico e da (ii) quantidade de carnosol.

30 [00175] Em algumas modalidades, a referida composição de ração seca para animais de estimação compreende uma fonte de piperina. Em algumas modalidades, a fonte de piperina consiste em um extrato de pimenta-do-reino. O referido extrato de pimenta pode estar presente em uma composição de ração seca para cães em uma quantidade variando de 15 ppm a 35 ppm como alimentado, 5 preferencialmente de 20 ppm a 30 ppm como alimentado, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 27 ppm como alimentado.

[00176] Em algumas modalidades da composição de ração seca para animais de estimação, o referido extrato de pimenta pode estar presente na composição de ração para animais de estimação em uma quantidade variando de 10 15 ppm a 35 ppm em uma base de matéria seca, preferencialmente de 20 ppm a 30 ppm em uma base de matéria seca, e ainda mais preferencialmente em uma quantidade de cerca de 30 ppm em uma base de matéria seca.

[00177] Em algumas modalidades de uma ração seca para animais de estimação de acordo com a presente divulgação, a fonte de piperina consiste em 15 um extrato de pimenta.

[00178] Na maioria das modalidades preferenciais, a piperina está presente na composição de ração seca em uma quantidade variando de 14 ppm a 60 ppm em uma base de matéria seca.

[00179] Em ainda outra modalidade preferencial, a composição de 20 ração seca para animais de estimação de acordo com a presente divulgação é caracterizada pelo fato de que o extrato de cúrcuma está presente na referida composição em uma quantidade variando de cerca de 300ppm a cerca de 700ppm como alimentado e/ou o extrato de alecrim está presente na referida composição em uma quantidade variando de cerca de 50ppm a cerca de 120ppm como 25 alimentado e/ou o extrato de pimenta está presente na referida composição em uma quantidade variando de cerca de 15ppm a cerca de 35ppm como alimentado.

[00180] Em ainda outras modalidades, a composição de ração seca para animais de estimação de acordo com a presente divulgação é caracterizada pelo fato de que o extrato de cúrcuma está presente na referida composição em 30 uma quantidade variando de cerca de 360 ppm a cerca de 780 ppm em uma base de matéria seca e/ou o extrato de alecrim está presente na referida composição em uma quantidade variando de cerca de 55 ppm a cerca de 130 ppm e/ou o extrato de pimenta está presente na referida composição em uma quantidade variando de cerca de 15 ppm a cerca de 35 ppm em uma base de matéria seca.

5 [00181] A composição de ração pode ser fabricada misturando ingredientes e amassando a fim de fazer uma massa consistente que possa ser cozinhada. O processo de criar uma ração seca para animais de estimação é usualmente feita por cozimento e/ou extrusão. A massa é normalmente alimentada em uma máquina chamada de expansora e/ou extrusora que usa vapor 10 pressurizado ou água quente para cozinhar os ingredientes. Quanto dentro da extrusora, a massa está sob extrema pressão e altas temperaturas. A massa é empurrada através de um molde (furo de tamanho e formato específico) e em seguida cortada com uma faca. Os pedaços de massa estufada são transformados em ração passando-os por um secador de modo que a umidade é derramada em 15 um alvo definido, garantindo a estabilidade do alimento até o consumo. Em seguida, a ração pode ser pulverizada com gorduras, óleos, minerais, vitaminas, o coquetel de extratos naturais e opcionalmente vedada em pacotes.

[00182] Em uma modalidade preferencial, a ração seca para animais de estimação consiste em uma forma de ração. Preferencialmente, por exemplo e 20 sem limitação, rações incluem particulados; peletes; pedaços de ração para animal de estimação, carne desidratada, análogo de carne, vegetais e combinações destes; e petiscos para animais de estimação, tal como carne ou carne seca de vegetais, couro cru e biscoitos.

[00183] A composição de ração seca para animais de estimação é 25 preferencialmente embalada. Desta forma, o consumidor é capaz de identificar, a partir do empacotamento, os ingredientes no produto de ração e confirma que é adequado para o animal de estimação particular em questão. O empacotamento pode ser de metal, plástico, papel ou papelão.

Composição de ração úmida para animais de estimação 30 [00184] Nas modalidades preferenciais, a ração úmida nutricionalmente completa de acordo com a presente divulgação possui um teor de umidade de mais de 50% tal como um teor de umidade variando de mais do que 50% a 90%.

[00185] Assim, a presente divulgação abrange uma composição de 5 ração úmida de animais de estimação compreendendo de cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 60% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição.

10 [00186] A presente divulgação relaciona-se notavelmente a uma composição de ração úmida para cães compreendendo e cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 50% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da 15 composição.

[00187] Os outros ingredientes ou substâncias que podem estar compreendidos na referida ração úmida para animais de estimação, bem como as respectivas quantidades destes na composição já estão descritos previamente na descrição geral de uma ração para animais de estimação de acordo com a presente 20 divulgação.

[00188] Em algumas modalidades, a referida composição de ração úmida de animais de estimação compreende uma fonte de antioxidantes compreendendo Vitamina C, e em que a Vitamina C está presente em uma quantidade que varia de cerca de 200 ppm a cerca de 600 ppm em uma base de 25 matéria seca, e/ou Vitamina E em que a Vitamina E está presente em uma quantidade variando de cerca de 600 ppm a cerca de 2000 ppm em uma base de matéria seca e/ou carotenoide, em que carotenoide está presente em uma quantidade variando de cerca de 30 ppm a cerca de 100 ppm em uma base de matéria seca.

30 [00189] Em algumas modalidades, a referida composição de ração úmida compreende um extrato de cúrcuma, como uma fonte de curcuminoides.

[00190] Assim, em algumas modalidades, a referida composição de ração úmida compreende uma fonte de curcuminoides. Em algumas destas modalidades, curcuminoides estão presentes em uma quantidade variando de 5 cerca de 250 ppm a cerca de 2000 ppm em uma base de matéria seca.

[00191] Em algumas modalidades, a referida ração úmida pode compreender adicionalmente uma fonte de ácido carnósico e carnasol. Em algumas destas modalidades, a quantidade de ácido carnósico e carnosol está variando de cerca de 20 ppm a cerca de 90 ppm em uma base de matéria seca.

10 [00192] Em algumas modalidades, a referida composição de ração úmida compreende uma fonte de piperina. Em algumas destas modalidades, piperina está presente em uma quantidade variando de cerca de 14 ppm a cerca de 60 ppm em uma base de matéria seca.

[00193] Em uma modalidade preferencial, a ração úmida consiste em 15 uma forma de pedaços, mais particularmente de pedaços na forma de molho. Preferencialmente, a ração úmida consiste de pedaços e molho, pedaços em geleia, pão, mousse, terrina, forma de mordidas.

[00194] Produtos de “pedaço e molho” compreendem uma partícula de carne pré-formada preparada fazendo uma emulsão de carne e colocando esta 20 emulsão de carne através de um focinho sob pressão e então cozida. Um produto, tal como uma carne cozida, é cortada em pedaços que são eventualmente misturados com um molho. Dois componentes são enchidos em um recipiente, geralmente uma lata ou bolsa que é costurada ou vedada e esterilizada. Ao contrário do pão moído, as composições de pedaço e molho têm pedaços discretos 25 fisicamente separados (ou seja, pedaços de carne moída e grãos) conforme preparadas. Estas partículas discretas estão presentes no líquido tipo molho no recipiente final. Quando servidos, os produtos de pedaço e molho fluem para fora da lata e podem ser facilmente misturados com outros produtos secos. Embora os produtos de pedaço e molho permitam uma melhor integridade dos ingredientes 30 individuais, a formulação heterogênea dos produtos de pedaço e molho às vezes é desfavorecida pelos consumidores.

[00195] As composições de ração úmida são geralmente empacotadas em recipientes semelhantes a latas e são consideradas “úmidas” na aparência devido à umidade contida neles. Dois tipos de composições úmidas são geralmente 5 conhecidas na técnica. A primeira é conhecida na técnica como “rolo de carne moída”. Os produtos de rolo de carne são tipicamente preparados pelo contato de uma mistura de componentes sob calor para produzir uma massa tipo favo de mel intracelular homogênea ou “rolo de carne moída”. O rolo de carne moída é então empacotado em um recipiente cilíndrico, como uma lata. Após o empacotamento, 10 o rolo de carne moída assume a forma do recipiente, de modo que o rolo de carne moída deve ser cortado ao servir um animal de companhia.

[00196] Em um aspecto adicional, a presente divulgação fornece um exemplo de descrição de processo para a preparação de uma composição de ração animal úmida semissólida. O processo pode compreender cortar, picar ou moer 15 componentes sólidos da composição com ou sem a presença de componentes aquosos. Tais componentes sólidos podem ser blocos de carne congelada. Os componentes pode adicionalmente ser misturados com componentes suplementares tais como suplementos nutricionais. Tipicamente, a mistura é aquecida a uma temperatura de 20 a 70°C. Em um arranjo, a mistura é aquecida a 20 uma temperatura em torno de 45°C. O recipiente de mistura pode ser adequado para aquecer através de injeção a vapor ou trocador de calor ou qualquer aparelho que seja convencional na técnica de preparação de ração.

[00197] O processo de acordo com a presente divulgação pode também ser preparado em um processo em lotes.

25 [00198] No final do processo, a composição pode ser usada para preencher recipientes, tais como latas. Os recipientes são vedados e equipamentos convencionais são usados para esterilizar os conteúdos. A esterilização comercial é geralmente realizada pelo aquecimento em temperaturas de pelo menos 118°C para um tempo adequado dependendo da temperatura usada e da composição. A 30 composição de ração nutricionalmente completa é preferencialmente empacotada.

Desta forma, o consumidor é capaz de identificar, a partir do empacotamento, os ingredientes no produto de ração e confirma que é adequado para o animal de estimação particular em questão. O empacotamento pode ser de metal, plástico, papel ou papelão.

5 Composição de ração semiúmida para animais de estimação

[00199] Como usado neste documento, uma composição de ração “semiúmida” para animais de estimação possui um teor de umidade que varia de mais de 15% a 50%.

[00200] Assim, a presente divulgação abrange uma composição de 10 ração semiúmida de animais de estimação compreendendo de cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 60% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição. 15 [00201] A presente divulgação relaciona-se notavelmente a uma composição de ração semiúmida para cães compreendendo e cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 50% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca 20 da composição.

[00202] Os outros ingredientes ou substâncias que podem estar compreendidos na referida ração úmida para animais de estimação, bem como as respectivas quantidades destes na composição já estão descritos previamente na descrição geral de uma ração para animais de estimação de acordo com a presente 25 divulgação.

[00203] Como convencionalmente admitido, uma ração semiúmida de animais de estimação é o produto final de um processo que permite obter um valor de teor de mistura que é intermediário entre uma ração seca de animais de estimação e uma ração úmida de animais de estimação. Em algumas modalidades, 30 o referido processo pode compreender uma etapa de adicionar um agente umectante. Em algumas modalidades, o referido processo compreende uma etapa de extrusão e uma etapa de tratamento subsequente com Vapor Superaquecido (SHS).

[00204] Como exemplo não limitativo, a ração semiúmida pode ser 5 obtida usando processo e Vapor Superaquecido (SHS) tal como os processos ou métodos descritos nos pedidos de patentes publicados WO2009/018990, WO2009/018996, WO2010/112097, WO2014/122072, WO2016/071372 e/ou WO2016/071367.

[00205] Em uma modalidade preferencial, a ração semiúmida consiste 10 em rações semiúmidas moles.

[00206] A composição de ração é preferencialmente embalada. Desta forma, o consumidor é capaz de identificar, a partir do empacotamento, os ingredientes no produto de ração e confirma que é adequado para o animal de estimação particular em questão. O empacotamento pode ser de metal, plástico, 15 papel ou papelão.

[00207] A composição como na forma de um produto de ração de animais de estimação pode abranger qualquer produto que um animal de estimação consume em sua dieta. Assim, a presente divulgação abrange produtos de ração padronizados bem como petiscos de ração de animal de estimação (por exemplo, 20 barras de petisco, biscoitos e produtos adocicados). O produto de ração é preferencialmente um produto cozido. Pode-se incorporar material derivado de carne ou animal (tal como carne bovina, galinha, peru, cordeiro, peixe, plasma sanguíneo, medula óssea, etc., ou um ou mais destes). O produto pode ser alternativamente isento de carne (preferencialmente, incluindo um substituto de 25 carne, tal como soja, glúten de milho ou um produto de soja) a fim de fornecer uma fonte de proteínas. O produto pode conter fontes de proteínas adicionais tais como concentrado proteico de soja, proteínas do leite, glúten, etc. O produto pode conter também uma fonte de amido tal como um ou mais grãos (por exemplo, trigo, milho, arroz, aveia, cevada, etc.) ou pode ser isento de amido. O produto pode incluir fibra 30 tal como chicória, polpa de beterraba sacarina, etc., e/ou componentes tais como inulina, fruto-oligossacarídeos, probióticos, mais preferencialmente, os ingredientes combinados do produto de ração de animal de estimação de acordo com a presente divulgação fornecem todas as vitaminas e minerais recomendados para o animal particular em questão (uma ração completa e balanceada), por exemplo, como 5 descrita no National Research Council, 1985, Nutritional Requirements for dogs, National Academy Press, Washington DC ou Association of America Feed Control Officials, Publicação Oficial de 1996.

[00208] A composição de ração descrita ao longo da presente divulgação serve particularmente para uso no suporte aos cães afetados por câncer 10 e submetidos à quimioterapia.

[00209] Pela expressão “suportar”, é comumente entendida a administração de questões relacionadas ao tratamento, minimizar efeitos colaterais, manter um bom estado nutricional e ajudar na luta contra o câncer, garantir a adequação do consumo voluntário de nutrientes. Manter a massa 15 corporal magra, manter o peso corporal saudável, BCS ideal e evitar a má nutrição.

[00210] Em uma modalidade preferencial, o referido câncer consiste em linfoma ou tumores de mastócitos (MCT).

[00211] Outro aspecto particular da presente divulgação consiste em um método para suportar um cão afetado com um câncer compreendendo a etapa 20 de administrar ao animal que possui um câncer a composição de ração de acordo com a presente divulgação.

[00212] A presente divulgação também diz respeito a um método para suportar um cão afetado com um câncer compreendendo a etapa de administrar ao animal que possui um câncer e que recebeu um tratamento quimioterápico a 25 composição de ração de acordo com a presente divulgação.

[00213] Em algumas modalidades, a presente divulgação diz respeito a tratamentos anticâncer combinados compreendendo a administração tanto de um agente quimioterápico como uma composição de ração como descrita neste documento.

30 [00214] Mais particularmente, a presente divulgação diz respeito a um método para o tratamento de um câncer compreendendo a etapa de administrar a um cão que possui um câncer uma quantidade terapêutica eficaz de um agente quimioterápico e da composição de ração de animais de estimação de acordo com a presente divulgação. Em algumas modalidades, a ração de animais de estimação 5 é uma ração para cães. Em algumas modalidades, a ração para cães é uma ração seca para cães.

[00215] A presente divulgação pertence adicionalmente a um método para tratamento de um câncer em um cão, preferencialmente linfoma ou tumor de mastócitos, compreendendo a etapa de administrar ao animal uma quantidade 10 terapêutica eficaz de um agente quimioterápico em combinação com a composição de ração de animais de estimação de acordo com a presente divulgação. Em algumas modalidades, a ração de animais de estimação é uma ração para cães.

Em algumas modalidades, a ração para cães é uma ração seca para cães.

[00216] A presente divulgação também diz respeito a uma composição 15 farmacêutica compreendendo um agente quimioterápico e uma composição de ração de animais de estimação de acordo com a presente divulgação. Em algumas modalidades, a ração de animais de estimação é uma ração para cães. Em algumas modalidades, a ração para cães é uma ração seca para cães.

[00217] De acordo com a presente divulgação, um “agente 20 quimioterápico” é um agente químico (por exemplo, composto ou fármaco) útil no tratamento de câncer, independentemente do mecanismo de ação. Os agentes quimioterápicos incluem compostos usados na terapia desejada e quimioterapia convencional. Quaisquer desses componentes ou drogas conhecidas pelo versado na técnica podem ser usados de acordo com a presente divulgação.

25 [00218] Agentes quimioterápicos preferenciais adequados de acordo com a presente divulgação são Actinomicina, Bleomicina, Carboplatina, Clorambucil, Cisplatina, Ciclofosfamida, Citosina arabinosídeo, Doxorubicina, L- Asparaginase, Lomustina, Melfaleno, Metotrexato, Mitoxantrona, Piroxicam, Prednisona, Vinblastina, Vincristina.

30 [00219] Pela expressão “quantidade terapeuticamente eficaz”, deve-se entender uma quantidade de um agente quimioterápico que é suficiente para reduzir e/ou melhorar a severidade e/ou duração de um câncer e/ou um sintoma relacionado a ele.

[00220] O termo “terapia de combinação” ou “em combinação” significa 5 a administração de um agente terapêutico e a composição de ração seca para tratar a condição terapêutica ou distúrbio descrito na presente divulgação. Essa administração abrange a coadministração destes componentes de uma maneira significativamente simultânea ou de maneira sequencial.

[00221] A presente divulgação é ilustrada adicionalmente, sem estar 10 limitada de nenhuma maneira, pelos exemplos abaixo.

EXEMPLOS Exemplo 1: Impacto de uma Dieta Nova na Qualidade de Vida em Cães que Recebem Quimioterapia Objetivo: 15 [00222] O câncer é uma das causas mais comuns de morte em cães e os proprietários de animais de estimação estão cada vez mais optando por tratar seus animais com quimioterapia para prolongar o máximo possível uma boa QOL (Qualidade de Vida). O objetivo deste ensaio clínico multicêntrico duplo cego randomizado foi investigar o efeito de uma dieta nova com moderado teor de 20 gorduras, baixo teor de carboidratos e alto teor de proteínas contendo maior teor de fibras e suplementada em concentrações de ácidos graxos ômega-3 na QOL (Qualidade de Vida) e saúde gastrointestinal em cães submetidos à quimioterapia para tratamento de tumores de mastócitos (MCT) e linfoma multicêntrico (LSA) dentro do período de alimentação de 8 semanas.

25 A. Materiais e Métodos

[00223] Foram randomizados 45 cães de clientes naïve submetidos a quimioterapia recentemente diagnosticados com LSA multicêntrico ou MCT de alto grau, metastático ou não ressecável para receber uma dieta de controle ou uma dieta de teste durante 8 semanas, no topo de um protocolo de quimioterapia 30 padronizada dependendo do tipo de tumor (protocolo CHOP para LSA; vincristina e/ou inibidor de tirosina quinase ou CCNU para MCT). A dieta de controle continha 25% de proteínas, 13% de gorduras, 8,5% de umidade, 1,5% de fibra bruta. A dieta de teste continha 37% de proteínas, 13% de gorduras, 8,5% de umidade, 3,5% de fibra bruta, 0,6% de EPA-DHA, suplementação com antioxidante e uma mistura de 5 fibras diferentes que a dieta de controle; ambas as dietas foram formuladas para atender os perfis de nutrientes da AAFCO para a manutenção de caninos adultos e tinham o mesmo conteúdo energético.

Tabela 1: Perfis nutricionais de dietas de controle e de teste

DIETA DE DIETA DE

TESTE CONTROLE Nutriente % g/Mcal % g/Mcal Umidade 8,5 23,01 8,5 22,34 Proteínas 37 100,16 25 65,72 Gorduras 13 35,19 13 34,17 Fibra Bruta 3,5 9,47 1,5 3,94 Total de fibras dietéticas 10 27,07 6,5 17,09 NFE 31,3 84,73 45,5 119,61 Ômega-6 2,23 6,04 2,74 7,20 Ômega-3 1 2,71 0,13 0,34 Razão Ômega 6:3 2,23 2,23 21,08 21,08 EPA + DHA 0,6 1,62 0 0,00 L-carnitina (ppm) 810 0,22 0 0,00 Luteína (ppm) 5 0,00 0 0,00 Vitamina D (IU/kg) 1000 270,71 800 210,30 Vitamina E (ppm) 800 0,22 100 0,03 Vitamina C (ppm) 300 0,08 0,00 Taurina 0,2 0,54 0,06 0,16 Arginina 2,75 7,44 1,48 3,89 Energia kcal/kg 3694 3804

Tabela 2: Análise garantida para dieta de controle UMIDADE (máx.) 10% PROTEÍNAS (min) 23%

GORDURA BRUTA 10% (min)

FIBRA BRUTA 3,5% (máx.) % DE CINZAS 6,5% (média) % DE NFE (média) 45,5% Ingredientes arroz de cervejaria, farinha de subproduto de frango, sêmola de aveia, gordura de 5 frango, aromatizantes naturais, chicória, glúten de trigo, fibra de ervilha, carbonato de cálcio, cloreto de potássio, sal, cloreto de colina, vitaminas [acetato de DL-alfa tocoferol (fonte de vitamina E), biotina, pantotenato de D-cálcio, acetato de vitamina A, suplemento de niacina, cloridrato de piridoxina (vitamina B6), mononitrato de tiamina (vitamina B1), suplemento de vitamina B12, suplemento de riboflavina, 10 ácido fólico, suplemento de vitamina D3], oligoelementos [proteinato de zinco, óxido de zinco, sulfato ferroso, proteinato de manganês, óxido manganoso, sulfato de cobre, iodato de cálcio, selenito de sódio, proteinato de cobre], extrato de alecrim, conservado com tocoferóis mistos e ácido cítrico.

Tabela 3 : Análise garantida para dieta de teste UMIDADE (máx.) 10% PROTEÍNAS (min) 35%

GORDURA BRUTA 11% (min)

FIBRA BRUTA 5,3% (máx.)

% DE ASH (média) 6,8% % DE NFE (média) 31,4% Ingredientes 5 farinha de subproduto de frango, sêmola de aveia, arroz de cervejaria, glúten de trigo, aromatizantes naturais, fibra de ervilha, óleo de peixe, gordura de frango, chicória, L-arginina, carbonato de cálcio, cloreto de potássio, sílica aluminato de sódio, casca de semente de psyllium, fruto-oligossacarídeos, sal, levedura hidrolisada, taurina, ácido N-butírico, L-carnitina, cloreto de colina, vitaminas 10 [acetato de DL-alfa tocoferol (fonte de vitamina E), L-ascorbil-2-polifosfato (fonte de vitamina C), biotina, D-pantotenato de cálcio, acetato de vitamina A, suplemento de niacina, cloridrato de piridoxina (vitamina B6), mononitrato de tiamina (vitamina B1), suplemento de vitamina B12, suplemento de riboflavina, ácido fólico, suplemento de vitamina D3], oligoelementos [proteinato de zinco, óxido de zinco, sulfato ferroso 15 , proteinato de manganês, óxido de manganês, sulfato de cobre, iodato de cálcio, selenito de sódio, proteinato de cobre], extrato de calêndula (Tagetes erecta L.), extrato de alecrim, conservado com tocoferois mistos e ácido cítrico.

[00224] Os proprietários dos cães avaliaram a Qualidade de Vida (QOL), incluindo 12 questões com 5 níveis de resposta cada uma, no referencial a 20 cada 2 semanas até 8 semanas usando um questionário previamente publicado projetado para cães com câncer (Iliopoulou MA, Kitchell BE, Yuzbasiyan-Gurkan V.

Development of a survey instrument to assess health-related quality of life in small animal cancer patients treated with chemotherapy. J Am Vet Med Assoc. 2013 Jun 15;242(12):1679-87), bem como um escore fecal médio a cada semana até 8 25 semanas usando um gráfico de escore fecal ilustrado de 9 pontos (meio ponto de 1: fezes muito líquidas a 5: fezes muito duras, 4 sendo o escore ideal).

[00225] Peso corporal, BCS (Escore de Condição Corporal na escala de 5 pontos de 1 a 9 com intervalos de 2 pontos, escore 5 sendo o ideal) e MCS (Escore de Condição Muscular: massa muscular normal, perda muscular leve, 30 moderada ou grave) foram avaliados por investigadores veterinários no referencial a cada 2 semanas até 8 semanas, CBC (Hemograma Total) e bioquímica padrão foram realizados no mesmo cronograma.

B. Resultados

[00226] Os resultados dos ensaios clínicos são apresentados na 5 Tabela 4 abaixo.

Tabela 4 : Dados demográficos na inclusão (referencial) Grupo de Grupo de controle teste Tipo de câncer n (%) n (%) Linfoma 16 (76,19) 17 (70,83) MCT 5 (23,81) 7 (29,17) Sexo do paciente macho intacto 1 (4,76) 0 (0,00) macho castrado 12 (57,14) 18 (75,00) fêmea intacta 0 (0,00) 0 (0,00) fêmea esterilizada 8 (38,10) 6 (25,00) Média (SD) Média (SD) n=24 n=21 Idade 8,33 (2,904) 7,54 (2,502) Peso corporal 21,02 (11,334) 28,53 (11,267) BCS 5,29 (1,347) 5,13 (0,612) Abaixo do peso 1 0 Peso ideal 14 20 Excesso de peso 6 4 MCS n n Músculo normal 20 23 Atrofia leve 0 1

Grupo de Grupo de controle teste Atrofia moderada 0 0 Atrofia severa 1 0 Linfoma n (%) n (%) Estágio 1 1 (6,25) 0 (0,00) Estágio 3 7 (43,75) 11 (64,71) Estágio 4 4 (25,00) 3 (17,65) Estágio 5 4 (25,00) 3 (17,65) Subestágio de n (%) n (%) linfoma A 13 (81,25) 15 (88,24) B 3 (18,75) 2 (11,76) MCT n (%) n (%) Grau 2 2 (40,00) 4 (57,14) Grau 3 2 (40,00) 1 (14,29) Outro 1 (20,00) 2 (28,57)

[00227] 14 cães no grupo de manutenção/ controle (10 LSA, 4 MCT) e 22 cães no grupo de teste (16 LSA, 6 MCT) concluídos no estudo de 8 semanas (p = 0. 061).

5 B.1. Aceitação de dieta foi boa: dos 45 cães, apenas 4 (3/21 para controle, 1/24 para teste, p = 0,325) foram removidos do estudo pois eles não comeriam a dieta.

[00228] Embora o número de cães declinou em cada grupo (7/21 - 33% no controle e 2/24 - 8% no teste) não foi diferente (p = 0,061), houve uma tendência para um número maior de cães deixando o estudo no grupo de controle em 10 comparação com o grupo de teste.

[00229] Os cães tinham valores de CBC e bioquímica sobre o estudo.

[00230] Os resultados são mostrados na Tabela 19 a seguir.

Tabela 5: resultados do ensaio clínico Dieta de Intervalo de teste Referência Média (SD) % de Hematócrito Referencial 42 (11,58) * 4 semanas 36,15 (8,45) 8 semanas 38,3 (4,9) Contagem de leucócitos K/uL Referencial 11,65 (6,09) * 4 semanas 9,49 (8,32) 8 semanas 8,1 (4,9) Linfócitos K/uL Referencial 4,77 (7,26) 4 semanas 1,96 (1,99) 8 semanas 2,84 (3,6) Albumina g/dL 2,7-4,4 g/dL Referencial 3,14 (0,41) 4 semanas 3,66 (0,39) 8 semanas 3,4 (0,40) Aspartato 15-66 U/L aminotransferase (AST) Referencial 40,96 (30,49) 4 semanas 29,29 (35,93) 8 semanas 28,45 (28,04) Nitrogênio ureico no 6-31 mg/dL

Dieta de Intervalo de teste Referência sangue (BUN) Referencial 14,75(4,27) 4 semanas 23 (7,53) 8 semanas 20,64 (6,23) Cálcio mg/dL 8,9-11,4 mg/dL Referencial 9,91 (1,15) 4 semanas 10,12 (0,63) 8 semanas 9,92 (0,05) Lactato mmol/L** * Referencial 1,60 (0,65) 4 semanas 2,41 (1,26) 8 semanas 1,67 (0,88) Gravidade 1,015 – 1,050 específica da urina Referencial 1,036 (0,015) 4 semanas 1,031 (0,011) 8 semanas 1,038 (0,017)

[00231] *Os intervalos de referência para essas variáveis diferiram de alguma forma entre os locais de estudo, pois estas variáveis foram medidas internamente. Veja o apêndice para os intervalos individuais para cada laboratório para estas variáveis.

5 [00232] **Todos os valores são agrupados aqui, independente da metodologia de medição B.2. Escore de condição corporal e peso corporal foram estáveis e no intervalo de referência saudável em ambos os grupos ao longo do estudo.

[00233] Os resultados são mostrados nas Tabelas 6 e 7 abaixo. 10 Tabela 6: Peso corporal médio para ambos grupos de dieta em cada ponto do tempo (cães com ambos os tipos de câncer)

Ponto do Controle Teste tempo Média (SD) N Média (SD) N Referencial 21,02 (11,33) 21 28,53 (11,27) 24 2 semanas 19,87 (11,30) 20 26,81 (10,46) 24 4 semanas 20,66 (11,25) 19 26,68 (10,18) 24 6 semanas 19,54 (11,44) 16 27,52 (10,84) 22 8 semanas 21,44 (11,27) 14 27,58 (10,62) 22 Tabela 7: Média de BCS e alteração não ajustada para ambos os grupos de dieta Ponto do Controle Teste tempo Média (SD) N Média (SD) N Referencial 5,29 (1,3) 21 5,13 (0,6) 24 2 semanas 5,3 (0,86) 20 4,88 (0,54) 24 4 semanas 5,32 (1) 19 5,17 (0,64) 24 6 semanas 5,44 (1,09) 16 5 (0,44) 22 8 semanas 5,21 (1,12) 14 5 (0,8) 22 B.3. Escores fecais

[00234] Os escores fecais foram estável no intervalo de referência 5 saudável para ambos os grupos ao longo do estudo, como é mostrado na Figura 1.

B.4. Parâmetros de Qualidade de Vida (QOL)

[00235] Do referencial a 8 semanas, os parâmetros de QOL 10/12 melhoraram significativamente para os cães na dieta de teste enquanto que apenas 1/12 melhorou para cães que se alimentaram da dieta de controle.

10 [00236] Os parâmetros de QOL que exibiram uma melhoria significativa no grupo de teste e valores p.

o quanto o cão foi incomodado pelo câncer (p = 0,003), o frequência que o cão apreciou suas atividades favoritas (p = 0,021), o alterações nos padrões de sono do cão (p = 0,009),

o as brincadeiras do cão (p =0,030), o frequência que o cão tinha sinais de doença (p =0,003) o quanto o cão apreciou a interação com humanos (p = 0,035) o frequência que o cão pareceu feliz ( p= 0,026) 5 o frequência que o cão sentiu ansiedade ou medo (p =0,018) o frequência que o cão passou por problemas de mobilidade (p = 0,011) o QOL geral para cães (p =0,010)

[00237] Cães na dieta de teste também tiveram melhoria significativa nos sinais de doença em comparação com cães na dieta de controle (p < 0. 009).

10 [00238] Escore geral de QOL em cada grupo de dieta no diagnóstico de câncer, semana 2, 4, 6 e 8 de quimioterapia, como mostrado na Figura 2, que divulga uma escala de escore da qualidade de vida dos cães tratados.

[00239] Ao todo, os resultados do Exemplo 1 mostram que a dieta de teste foi bem tolerada e cães na dieta de teste exibiram uma qualidade de vida 15 melhorada após 8 semanas de quimioterapia e consumo da dieta. Exemplo 2: Atividades antiproliferativas de uma pluralidade de extratos vegetais A. Materiais e Métodos A.1. Extratos naturais foram recebidos diretamente do fabricante e o teor de 20 cada composto de interesse com base na análise de pureza dos fabricantes foi verificada por um laboratório secundário. Os extratos foram dissolvidos em 20 mg/mL em 100 % de DMSO para obter soluções de estoque antes de cada experimento.

Tabela 8: Características de extratos naturais Nome Nome Composto Purez Fabrican Nome do Número comum latino de aa te produto do interesse Produto Pimenta-do- Piper Piperina 95,02 Sabinsa VetPerine FP- reino nigrum %  0215–06 Alecrim Rosmarinu Ácido 66,90 Vitiva INOLENS 302036 s officinalis carnósico % 70 Alecrim Rosmarinu Ácido Min Vitiva INOLENS 301999 s officinalis carnósico 40% 50 Cúrcuma Curcuma Curcuminoi 87,59 Naturex Extrato DA25147 longa des % de 1 cúrcuma Cúrcuma Curcuma Curcuminoi 89,41 Arjuna BCM- BCM-05- longa des % 95/ Bio- CG- Curcumin 1501-S- a 48 Romã Punica Ácido 43,6% Polinat POE40 POE401 granatum elágico 1-1711 Romã Punica Punicalagin 35,6% Polinat P40P P40P13- granatum as A/B 2102 Chá verde Camellia EGCG 45,76 Naturex Extrato EA14036 sinensis Catequinas % de chá 2 83,76 verde %

[00240] Valor de aPureza representa o percentual do composto de interesse principal em cada extrato como determinado pelo fabricante (para um lote específico).

A.2. Agentes quimioterápicos usados foram fosfato de toceranibe (PalladiaTM, 5 Zoetis Animal Health) e cloridrato de doxorrubicina (Sigma Aldrich). Doxorrubicina (referência positiva) foi preparada em 200 Μm (solução de estoque para ensaio proliferativo) A.3. Várias linhas celulares primárias neoplásicas caninas foram usadas representando os diferentes tipos de tumores. As linhas celulares foram cultivadas 10 nas placas tratadas por cultura de tecido com meio adequado contendo 10% de soro bovino fetal inativado por calor e 1% de antibiótico-antimicótico. Elas foram cultivadas a 37 °C e 5 % de CO2 para todos os experimentos e passagem de células.

Tabela 9: linhas de células cancerosas caninas Nome da Linha Celular Tipo de Célula Origem BR Mastocitoma University of California, SF, USA, Warren Gold C2 Mastocitoma University of California, SF, USA, Warren Gold Tumor da glândula CF33.MT mamária ATCC (#CRL-6227) Tumor da glândula CF41.Mg mamária ATCC (#CRL-6232) University of Veterinary Medicine Vienna, Áustria, CLBL-1 Linfoma de células B Barbara Rütgen Carcinoma da CMT-12 glândula mamária Auburn University, Alabama, USA, R. Curtis Bird D17 Osteosarcoma ATCC (#CRL-183) HMPOS Osteosarcoma Hokkaido University, Sapporo, Japan Fibrosarcoma K9 primário Cornell University, Ithaca, USA, Joseph Wakshlag

[00241] Todas as linhagens celulares caninas foram usadas na triagem inicial pelo Ensaio ATP-Lite (exceto CMT-12). Apenas células C2, CMT-12 e D17 5 foram usadas para estudos MTT

[00242] Além disso, fibroblastos dérmicos primários caninos (CDF) foram usados para investigar efeitos nas células normais e foram propagados e mantidos no meio com Prigrow II contendo 10 HI-FBS e 1 % de penicilina /estreptomicina.

10 A.4. Vários ensaios in vitro para analisar a proliferação celular A.4.1. Ensaio de proliferação ATPliteTM

[00243] As diferentes linhas de células cancerosas foram colocadas em placas no número de células ideal por poço em 90μL de meio/poço adequado em placas de 96 poços de microtitulação de fundo chato. As placas foram incubadas em 37°C durante 24 horas antes do tratamento em meio de cultura isento de drogas. Após um primeiro processo de diluição, 10μl das substâncias de teste 5 (única) foram adicionadas na placa contendo células 24h após o plaqueamento. As linhas de células tumorais foram incubadas durante 37°C sob 5% de CO2 com 9 concentrações de cada extrato natural nas etapas de diluição a 1:2. A dose superior foi de 100μg/ml para cada extrato de planta e 1 μM para doxorrubicina. Cada concentração foi testada em triplicatas. As diluições de cada substância de teste 10 bem como a distribuição em placas contendo células foram realizadas manualmente. Pelo menos 2 experimentos independentes foram realizados para cada extrato de planta. As células de controle foram tratadas apenas com veículos.

[00244] Os 5 extratos de planta (folhas de chá verde, romã POE40, folhas de alecrim INOLENS70, raiz de cúrcuma e vetperine) foram solubilizadas em 15 DMSO em concentrações adequadas. As 2 linhas de células cancerosas selecionadas (HMPOS) foram plaqueadas no número de células ideal por poço em 80μL de meio/poço adequado em placas de 96 poços de microtitulação de fundo chato. As placas foram incubadas em 37°C durante 24 horas antes do tratamento em meio de cultura isento de drogas. Após um primeiro processo de diluição, 10 μl 20 de cada substância de teste foi adicionada na placa contendo células. As linhas de células tumorais foram incubadas durante 72h a 37°C sob 5% de CO2 com 5 concentrações de cada substância de teste sozinha ou em combinação. Cada condição foi realizada em quadruplicata. As diluições de cada substância de teste bem como a distribuição em placas contendo células foram realizadas 25 manualmente. Foram realizados dois experimentos independentes. As células de controle foram tratadas apenas com veículos (1% de DMSO).

[00245] No final dos tratamentos, a atividade citotóxica das substâncias testadas foi avaliada por ensaio ATP-Lite (Ref. 6016949, Perkin-Elmer e Lote 69- 12172). Este ensaio mediu o nível intracelular de ATP, marcador de atividade 30 metabólica. Este nível de ATP é quantificado pela luminescência emitida pela luciferase de vagalume, através de uma reação dependente da ATP. No final do tratamento das células, 50μl da solução de lise de célula mamífera foi adicionado em 100 μl da suspensão celular por poço. A placa foi agitada durante cinco minutos em um agitador orbital em 700 rpm. Esta solução lisa as células e estabiliza a ATP.

5 Então, 50μl de solução de substrato foi adicionada às células e a placa foi agitada durante cinco minutos em um agitador orbital em 700 rpm. Posteriormente, a placa foi deixada durante dez minutos no escuro e luminescência foi medida como LV (Valor de Luminescência).

[00246] Chou-Tallalay CI corresponde aos índices de combinação 10 calculados usando os algoritmos adequados. Combinação de 6 doses diferentes de cada extrato (1,6, 3,1, 6,3, 12,5 e 25 µg/ml de alecrim, 0,8, 1,6, 3,1, 6,2 ou 12,5 µg/ml de pimenta ou extrato de cúrcuma). Valores de CI ≤0,9 indicam sinergismo, um valor de CI >0,9 e <1,1 indica um efeito aditivo e valores de CI ≥1,1 indicam antagonismo. 15 A.4.2. Ensaio de proliferação MTT

[00247] As células foram plaqueadas em uma densidade de 4 x 103 células por poço em placas de fundo chato tratadas com cultura de tecidos a 96 poços e incubadas durante à noite em meio completo. As células foram tratadas no dia seguinte com controle de DMSO ou extrato usando uma diluição serial de duas 20 dobras para 8 concentrações finais variando de 0,4 a 100 µg mL-1 durante 48 h para avaliar todos os extratos para eficácia potencial na redução da proliferação celular. Para quantificar a proliferação celular, foram realizados ensaios de molde MTT adicionando 30 µL de molde MTT (5 mg mL-1 solução salina tamponada com fosfato) em cada poço e incubando a 37°C durante 1 h. Os meios foram aspirados 25 e as células foram solubilizadas em 200µL de isopropanol. A densidade ótica de cada poço foi analisada em um leitor de placa espectrofotométrico (Epoch; Biotek, Winooski, VT, USA) em um comprimento de onda de 570 nm.

[00248] A sinergia entre os extratos foi examinada usando combinações de dois extratos em seis concentrações: 0,8, 1,7, 3,1, 6,3, 12,5 ou 25 30 µg mL-1. O percentual de células de controle proliferativas para cada tratamento foi agrupado de todos os experimentos e é relatado como média ± erro padrão da média.

[00249] Os dados brutos dos ensaios de proliferação (densidade óptica de cada poço) foram normalizados para o tratamento de veículo sozinho para 5 ensaios individuais, considerado por representar 100% das células proliferativas (tratamento único ou combinado). O percentual de células proliferativas foi avaliado ao longo de cada replicata. O IC50 para cada extrato foi calculado ao longo dos experimentos por análise de Probit. As interações dos compostos foram calculadas pela análise de efeito de drogas múltiplas usando o software CalcuSyn (v.2.11; 10 Biosoft, Cambridge, GB, Reino Unido).

A.4.3. Ensaio de exclusão de azul de tripan de viabilidade celular

[00250] O ensaio foi realizado em CDF devido à taxa de proliferação lenta e baixa atividade metabólica destas células caninas normais, impedindo ensaios MTT produtivos. Os efeitos dos tratamentos de extrato foram comparados 15 aos resultados obtidos nas linhas celulares C2, CMT-12 e D17. Para todas as linhas celulares, as células foram plaqueadas em uma densidade de 5 x 103 células por poço e incubadas até 60% de confluente antes do tratamento com controle de veículo de DMSO, 6,3 µg mL-1 TE, 6,3 µg mL-1 RE ou uma combinação de 3,1 µg mL-1 cada um TE e RE. Após 48h de tratamento, as células foram coletadas e 20 centrifugadas. Com exceção da linha celular C2, as células foram destacadas com 0,05% de Tripsina/EDTA. O pelete de células foi ressuspenso em 0,1% de azul de tripano em solução de PBS e 1% de FBS, carregado em hemocitômetro e visualizado em um microscópio invertido. As células que foram coradas em azul foram consideradas não viáveis. Todos os valores foram padronizados para o 25 tratamento de controle de veículo que foi considerado para representar 100% das células viáveis.

A.5. Ensaio de crescimento em ágar mole para formação de colônia

[00251] Este ensaio é um dos marcos da transformação celular que é considerado o ensaio in vitro mais preciso e restritivo para detectar a transformação 30 maligna das células. Este ensaio clonogênico mede a proliferação em um meio de cultura semissólido após cerca de 3 semanas por meio de contagem manual das colônias. As células D17 foram cultivadas em placas de cultura de célula de 100 mm. Foram preparadas placas de cultura de 6 poços contendo 0.6% de ágar tipo VII solubilizado inicialmente em 3% em solução salina tamponada com fosfato 5 estéril e reconstituído para 0.6% em meio RPMI completo. Após 0,5 ml de ágar mole ser colocado como uma camada de base nas placas de 6 poços, cada uma das linhas de células são então suspensas a 10.000 células por ml em ágar mole a 0,6% em RPMI completo a 38°F e os tratamentos são aplicados a as suspensões correspondentes imediatamente antes do plaqueamento nas placas de 6 poços. A 10 dosagem dos extratos foi escolhida com base nas doses de ensaio MTT que foram usadas nos experimentos anteriores. Tipicamente, as células no ágar mole respondem a doses baixas em relação ao que é tipicamente observado nos ensaios MTT. Portanto, foram escolhidas doses na extremidade inferior do MTT (0,4-0,8 ug/ml). 15 [00252] Foram semeados 0,5 ml de células e tratamentos na triplicata no mesmo dia e deixadas solidificar a temperatura ambiental na capa de cultura de células durante 30-60 minutos e colocadas na incubadora a 37°F. As células foram reabastecidas com os tratamentos adequados em RPMI completo e 0,6% a cada 3 dias. O número de colônias foi contado em 16 dias de crescimento sob microscópio 20 por um observador cego. Todos os dados são representados em um número percentual de colônias com base no controle de DMSO a 100%.

A.6. Ensaio de ativação de caspase 3/7 associada a apoptose

[00253] As células foram semeadas em uma densidade de 4 x 103 células por poço em placas tratadas com cultura de tecidos a 96 poços e incubadas 25 durante à noite em meio completo. As células foram tratadas no dia seguinte com controle de veículo DMSO, 6,3 µg/mL de extrato isolado ou 3,1 µg/mL de cada extrato em combinação durante 36h. Drogas quimioterápicas a uma concentração inibidora de 50% (IC50) foram usadas como um controle positivo; 12,5 nM de fosfato de toceranibe (PalladiaTM) foi usado para a linha de células C2 e 0,3 ou 0,5 30 µM de cloridrato de doxorrubicina foi usado para as linhas de células CMT-12 e

D17, respectivamente. A fluorescência e luminescência de fundo foi medida nos poços contendo tratamentos, mas sem células. A ativação da Caspase 3/7 foi quantificada usando o Ensaio Multiplex ApoLive-Glo™ (Promega, Madison, WI, USA) seguindo as instruções do fabricante. Brevemente, após 36h de tratamento, 5 o reagente de viabilidade foi adicionado às células e incubado a 37°C durante 30 min e a fluorescência foi medida a 400Ex/505Em. Em seguida, o Reagente Caspase-Glo 3/7 foi adicionado em todos os poços, incubado durante 30 min a temperatura ambiente e a luminescência foi medida. A fluorescência e a luminescência foram medidas usando o Leitor de Microplacas SpectraMax M3.

10 A.7. Citometria de fluxo

[00254] As células foram cultivadas em placas tratadas com cultura de tecidos de 60 mm (LPS) e incubadas em meio completo até 60% de confluente. As células foram em seguida tratadas com meio, controle de veículo DMSO, extrato isolado ou estrados em combinação. As células foram tratadas durante 12h 15 (geração de ROS), 24h (acumulação de curcumina) ou 48h (Apoptose/Necrose). Todas as análises citométricas de fluxo foram realizadas em BD FACSCalibur. Para todos os experimentos de citometria de fluxo, 10.000 eventos foram coletados por amostra e controlados com base em um gráfico de dispersão direta/dispersão lateral. A fluorescência média geométrica (GMF) de cada tratamento foi comparada 20 às amostras tratadas com DMSO e representada como alteração em todos os experimentos usando GMF devido às diferenças na intensidade de fluorescência entre as linhas de células.

A.8. Ensaio de apoptose e necrose

[00255] A apoptose e necrose foi medida após 48h de tratamento 25 usando coloração com Anexina-V e 7-AAD. Resumidamente, as células foram separadas com soluções de dissociação Accumax (Innovative Cell Technologies), coletadas e centrifugadas durante 10min a 500 rcf a 4°C. O sedimento celular foi lavado uma vez com PBS antes da ressuspensão em Tampão de Ligação de Anexina (ABB; 10mM HEPES, 140 mM de NaCl, 2,5 mM de CaCl2, pH 7,4) em uma 30 densidade de 1 x 106 células por mL-1. O conjugado de Anexina-V 488 e 7-

Aminoactinomicina D (7-AAD) foi adicionado às suspensões celulares e incubado durante 15 minutos a temperatura ambiente. ABB foi adicionado em seguido à suspensão de células e mantido no gelo até a análise de fluorescência. Os eventos identificados apenas como positivos para Anexina-V foram considerados para 5 representar as células apoptóticas; eventos identificados como positivos para Anexina-V e positivos para 7-AAD foram considerados para representar as células necróticas.

A.9. Análise de espécies reativas de oxigênio (ROS) intracelulares

[00256] Visto que os principais constituintes de extrato de cúrcuma e 10 extrato de alecrim (ácido de curcumina e ácido carnósivo, respectivamente) foram implicados como antioxidantes, foi utilizado ensaio de Dihidrorhodamina123 (DHR123; Invitrogen) para determinar a quantidade de ROS presente após 12h de tratamento com cada extrato. Brevemente, as células foram separadas usando solução de dissociação Accumax, coletadas e centrifugadas durante 10 minutos a 15 500 rcf a 4°C. O sedimento foi lavado uma vez com PBS antes da ressuspensão em 1 mL de coloração (30 µM DHR123 em DMEM). A suspensão de células foi incubada a 37°C durante 30 m, sedimentado e ressuspensas em 1 mL DMEM e filtradas antes da análise de fluorescência de células.

A.10. Acumulação celular de curcumina 20 [00257] A acumulação celular de curcumina foi medida por explotação das propriedades autofluorescentes deste composto. Após tratamento de 24h, as células foram separadas com solução de dissociação Accumax, coletadas e centrifugadas durante 10min a 500 rcf a 4°C. O sedimento celular foi lavado uma vez com PBS antes da ressuspensão em DMEM e filtrado antes da análise de 25 fluorescência quando excitado a um comprimento de onda de 488 nm e medida a emissão usando um filtro de 530/30.

A.11. Western blotting (vias de sinalização)

[00258] As células foram cultivadas em placas tratadas com cultura de tecidos de 100 mm (LPS) e incubadas durante à noite em meio completo até atingir 30 60% de confluência. As células foram tratadas no dia seguinte com controle de veículo DMSO, 6,3 µg/mL de extrato isolado ou 3,1 µg/mL de cada extrato em combinação. As células foram colhidas e lisadas a 12h e 24h após o tratamento usando Tampão de Lise de Mamífero (MLB; Tris 25 mM, NaCL a 100 mM, EDTA a 1 mM, Triton X-100 a 1%, NaF a 0,004%, NaVO4 a 1 mM, ácido glicerofosfórico a 5 25 mM, 100 leupeptina, pH a 7,4) e sonicação, e então centrifugado durante 5 min a 14.000 rcf a 4°C. O sobrenadante foi coletado e a concentração de proteína foi determinada usando o ensaio de Bradford (Coomassie-dye). As amostras foram equilibradas em um volume comum (µg/µ) em MLB e tampão de carregamento laemmili 5x. Para 10 cada proteína de interesse, 30 µg de proteínas totais foram submetidas a SDS- PAGE. As proteínas foram em seguida transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno com tamanho de poro de 0.45 µm durante 1h a 333 mA e então bloqueada em leite a 5% na solução TBST. As membranas foram incubadas durante à noite em soluções de anticorpo primário em uma diluição de 1:1000 em 15 TBST em uma plataforma oscilante a 4°C. Os anticorpos primários incluíram proteína quinase ativada por estresse de coelho/quinase jun-amino-terminal (SAPK/JNK) e Thr183/Tyr185 fosforilado-SAPK/JNK (Cell Signaling Technology).

As membranas foram lavadas três vezes com TBST e incubadas a temperatura ambiente durante 1h no anticorpo IgG anti-coelho conjugado com peroxidase de 20 rábano a uma diluição de 1:2000 (Cell Signaling Technology). As membranas foram lavadas três vezes com TBST e visualizadas com um reagente quimioluminescente (Bio-Rad). As imagens digitais foram capturadas usando um sistema de geração de imagens (Biospectrum 410). Depois que as imagens foram recolhidas, as membranas foram lavadas três vezes em TBST e incubadas com uma diluição de 25 1:10.000 em TBST do anticorpo doméstico β-Actina (Sigma-Aldrich) durante 1h a temperatura ambiente. As membranas foram lavadas, incubadas com anticorpo secundário de camundongo a uma diluição de 1:2000.

[00259] B. Resultados B.1. Atividade antiproliferativa de tratamento de extrato único nas linhas de células cancerosas caninas Atividade antiproliferativa determinada por Ensaio ATPliteTM: Valores de IC50 5 [00260] Os resultados da atividade antiproliferativa de vários extratos de planta são representados nas figuras 1A a 1F para o extrato de romã a 40% (fig 3A), chá verde (fig 3B), vetperine (fig 3C), folhas de alecrim (fig 3D), raízes de cúrcuma (fig 3E), punicosídeos de romã a 40% (fig 3F).

[00261] Doxorrubicina (referência positiva): Todas as linhas celulares 10 foram sensíveis à Doxorrubicina com valores de IC50 variando de 11nM para HMPOS a 375±361 nM para a linha de células CF41.Mg. É notável que as linhas de células CLBL-1 e BACA foram linhas de células muito difíceis de cultivar, os resultados com respeito a estas linhas de células obtidos de diferentes extratos de plantas devem ser considerados com cuidado. 15 [00262] As atividades antiproliferativas também foram ensaiadas de acordo com o ensaio MTT. Os resultados são apresentados na Tabela 10 abaixo.

Tabela 10: IC50 médio dos extratos com atividade antiproliferativa significativa determinada por ensaio MTT Extrato de alecrim Extrato de cúrcuma Extrato de Quimioterapiaa [70% de Ácido IC50 pimenta-do-reino Carnósico] IC50 (μg/mL) IC50 (μg/mL) IC50 IC50 (μg/mL) C2 11,9 4,8 21,8 12,5 Nm (6,2 ng mL-1) CMT-12 13,0 9,1 34,5 0,3 μM (6,2 ng mL-1) D17 13,6 12,3 36,5 0,5 μM (6,2 ng mL-1) 20

[00263] Os valores foram determinados pela média dos poços em duplicata em 4 experimentos independentes e usando análise Probit. C2 tratado com fosfato de toceranibe, CMT12 e D17 tratados com cloridrato de doxorrubicina.

25 B.2. Atividade antiproliferativa de tratamento de combinação de extrato duplo nas linhas de células cancerosas caninas

Resultados de sinergia de dois tipos de linhas de células cancerosas (C2 e HMPOS) determinados por ensaio ATPliteTM

[00264] As melhores combinações sinérgicas foram observadas com os seguintes compostos nos intervalos de concentração ideais indicados: 5- Alecrim (de 0,8 a 6,3 μg/ml) + Romã (de 1,2 a 33 μg/ml) - Alecrim (de 0,8 a 3,1 μg/ml) + Raiz de cúrcuma (de 0,8 a 3,1 μg/ml) - Romã (de 3,7 a 11 μg/ml) + Raiz de romã (de 1,6 a 6,2 μg/ml)

[00265] Para cada ensaio de combinação, o efeito sinérgico dos compostos foi avaliado como o número de Índice de Combinação sinérgico (CI<0.9) 10 sobre o número de condições validadas de misturas de concentração. Uma condição de misturas de concentração foi validada no cálculo de Chou-Tallalay quando seu Fa combinado estada dentro do intervalo de 0,05 e 0.95. Uma combinação de 2 extratos foi considerada sinérgica quando pelo menos 50% das condições validadas das misturas de concentração exibem um CI<0,9. Para todas 15 as duas linhas de células, 70% dos efeitos sinérgicos calculados com o método de modelo aditivo são comuns aos calculados com o modelo de Chou-Tallalay. As similaridade dos resultados indica que a maioria das combinações sinérgicas são validadas por dois métodos de cálculo independentes.

[00266] Os resultados são apresentados na Tabela 11 abaixo. 20 B.3. Resultados de sinérgica de três tipos de linhas de células de câncer (C2, CMT-12 e D17) determinados por ensaio MTT

[00267] A combinação de extrato de cúrcuma e extrato de alecrim resultou em uma diminuição mais significativa nas concentrações de cada extrato necessário para atingir um IC50 em todas as 3 linhas de células sugerindo uma 25 combinação sinérgica. Os resultados são apresentados nas tabelas 12, 13 e 14 abaixo.+ Tabela 12: Atividade antiproliferativa da combinação de um extrato de alecrim e de um extrato de cúrcuma na proliferação da linha celular cancerosa C2.

A Dose de extrato de cúrcuma (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 12,5 25,0 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) [70% de Ácido 0,8 2,551 1,786 1,307 0,362 0,128 0,216 Carnósico] 1,7 2,168 0,959 0,573 0,197 0,105 0,225 3,1 1,339 0,678 0,373 0,152 0,118 0,208 6,3 0,775 0,53 0,226 0,182 0,147 0,174 12,5 0,175 0,174 0,164 0,142 0,204 0,221 25,0 0,213 0,306 0,473 0,328 0,423 0,316

[00268] A atividade antiproliferativa da linha de células cancerosas C2 também é representada na Figura 4A.

Tabela 13: Atividade antiproliferativa da combinação de um extrato de alecrim e de 5 um extrato de cúrcuma na proliferação da linha celular cancerosa CMT-12. B Dose de extrato de cúrcuma (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 12,5 25,0 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) [70% de Ácido 0,8 NP 1,182 0,738 1,005 0,471 0,742 Carnósico] 1,7 0,611 0,682 0,655 0,793 0,355 0,703 3,1 0,877 0,771 0,766 0,655 0,406 0,671 6,3 0,971 0,859 0,789 0,647 0,524 0,775 12,5 0,629 0,603 0,523 0,528 0,687 1,048 25,0 0,853 0,944 0,871 0,869 0,882 1,601

[00269] A atividade antiproliferativa da linha de células cancerosas C2 também é representada na Figura 4B.

Tabela 14: Atividade antiproliferativa da combinação de um extrato de alecrim e de 10 um extrato de cúrcuma na proliferação da linha celular cancerosa D17. C Dose de extrato de cúrcuma (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 12,5 25,0 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) [70% de Ácido 0,8 NP NP NP 0,866 0,617 0,531 Carnósico] 1,7 NP NP NP 0,909 0,59 0,527 3,1 NP NP 0,69 0,665 0,644 0,573 6,3 0,619 0,584 0,547 0,522 0,434 0,561 12,5 0,746 0,655 0,597 0,505 0,583 0,664 25,0 0,491 0,526 0,558 0,666 0,61 0,79

[00270] A atividade antiproliferativa da linha de células cancerosas D17 também é representada na Figura 4C.

[00271] Valores de CI determinados por ensaio MTT para as linhas de 15 células (A) C2, (B) CMT-12 e (C) D17 quando o extrato de alecrim INOLENS70 e extrato de raiz de cúrcuma foram usados na combinação em doses que variam de

0,8 - 25 µg/mL. Os valores abaixo 0,8 indicam sinergia, 0,8-1,2 indicam efeito aditivo e maior do que 1,2 indicam antagonismo. NP= Não foi possível realizar o cálculo.

[00272] Menor dose que induziu uma diminuição significativa (p‹0,05) no percentual de proliferação em comparação com o controle de DMSO indicado 5 por + (TE isolado), # (RE isolado) e ^ (combinação de extrato duplo).

B.4. Atividade antiproliferativa de diferentes fontes de extratos

[00273] Também obtivemos atividade antiproliferativa semelhante de extratos semelhantes usando 2 fontes diferentes de extrato de cúrcuma (Naturex ou Arjuna) ou extrato de Alecrim (Inolesn70, Inolens50). O tratamento único ou 10 combinação dupla foram testados em três linhas de células tumorais (C2, D17, CMT12) e a citoxicidade (IC50) foi determinada por ensaios MTT. Os resultados são apresentados na Tabela 15 abaixo, bem como nas figuras 5A, 5B e 5C.

Tabela 15 : Atividade antiploriferativo dos extratos de planta distintos em várias linhas de células tumorais IC50 Extrato de Cúrcuma Arjuna Extrato de Extrato de Linhas cúrcuma BCM-95 (BCM- alecrim Vitiva alecrim Vitiva de Naturex 05-CG-1501-S- Inolens70 Inolens50 células (DA251471) 48) C2 4,81 µg/mL 4,04 µg/mL 11,94 µg/mL 7,17 µg/mL CMT-12 9,09 µg/mL 9,30 µg/mL 13,02 µg/mL 12,59 µg/mL D17 12,27 µg/mL 7,48 µg/mL 13,55 µg/mL 15,69 µg/mL 15 B.5. Atividade antiproliferativa de um extrato de cúrcuma testado pelo ensaio de formação de colônia de ágar mole

[00274] O extrato de cúrcuma (curcuminoides) tendo o maior dos efeitos no ágar mole com poucas colônias formando em 27% de controle. Os extratos de alecrim e pimenta exibiram efeitos moderados com apenas 75% e 65% 20 de formação de colônia, respectivamente. O tratamento de curcumina e alecrim duplo exibiu apenas 21% de formação em 0,4 μg/ml de curcumina e 0,8 μg/ml de alecrim. A adição de 6,25 μg/ml de extrato de pimenta exibiu uma diminuição modesta em 12% na mistura do coquetel.

[00275] Os resultados são representados na Figura 6.

[00276] Média de triplicata, células foram tratada a cada 3 dias durante 16 dias antes da contagem. Percentual médio de formação de colônia conforme controle de veículo DMSO é relatado. * indica p<0,05, ** indica p<0,01 em 5 comparação com o controle de DMSO.

B.6. Extratos naturais e interação da quimioterapia na inibição de crescimento de linhas de células cancerosas

[00277] Visamos examinar a interação entre os extratos e quimioterapias comumente usadas incluindo palladia/ toceranibe (inibidor de 10 tirosina quinase) para doença de mastócito (linhas de células C2) e doxorrubicina (antibiótico antraciclina) para carcinoma mamário e osteosarcoma.

[00278] Ambos os extratos de cúrcuma e alecrim (de 0,8 a 1,7 µg/ml) induziram o efeito antagonista a aditivo médio, enquanto que em 3,1µg/ml de ambos os extratos houve um efeito aditivo definitivo na presença de fosfato de 15 toceranibe (linha de células de mastocitoma). Quando os extratos foram adicionados em 6,3 µg/ml houve um efeito sinérgico definitivo.

[00279] Os resultados são apresentados nas Tabelas 16 e 14 abaixo.

Tabela 16 Extrato de cúrcuma

A Dose (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) 0,8 1,239 1,409 1,186 0,753 1,7 1,418 1,478 1,049 0,766 3,1 1,378 1,252 0,941 0,775 6,3 0,946 0,842 0,736 0,707 20 Tabela 17 Extrato de cúrcuma

B Dose (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) 0,8 1,1 1,158 0,886 0,669 1,7 1,424 1,444 1,044 0,855 3,1 1,527 1,223 1,051 0,887 6,3 1,018 0,887 0,808 0,729

Tabela 18 Extrato de cúrcuma

C Dose (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) 0,8 1,104 1,182 1,11 1,016 1,7 1,062 1,044 0,922 1,005 3,1 1,585 1,357 1,278 1,346 6,3 1,038 1,049 0,91 0,899 Tabela 19 Extrato de cúrcuma

D Dose (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) 0,8 1,625 1,307 1,445 1,088 1,7 1,622 1,272 1,002 0,895 3,1 1,46 0,89 0,836 0,809 6,3 1,259 0,846 0,748 0,717 5 Tabela 20 Extrato de cúrcuma

E Dose (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) 0,8 2,093 1,493 1,793 1,187 1,7 1,654 1,241 1,256 0,928 3,1 1,632 1,127 1,017 0,791 6,3 1,462 0,918 0,894 0,718

Tabela 21 Extrato de cúrcuma

F Dose (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) 0,8 2,111 1,764 1,38 1,048 1,7 1,594 1,586 1,234 0,87 3,1 1,456 1,262 0,91 0,767 6,3 1,339 1,333 0,866 0,913 Tabela 22 Extrato de cúrcuma

G Dose (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) 0,8 0,629 0,629 0,829 0,993 1,7 0,685 0,743 0,84 0,923 3,1 1,032 1,035 1,028 1,053 6,3 1,073 1,034 1,003 0,853 Tabela 23 Extrato de cúrcuma

H Dose (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) 0,8 1,154 1,134 1,31 1,158 1,7 1,132 1,189 1,451 0,992 3,1 1,224 1,136 1,377 0,899 6,3 1,083 1,081 1,17 0,69 5 Tabela 24 Extrato de cúrcuma

I Dose (μg mL-1) 0,8 1,7 3,1 6,3 Extrato de alecrim Dose (μ g mL-1) 0,8 0,361 0,399 0,421 0,554 1,7 0,589 0,63 0,591 0,588 3,1 0,599 0,639 0,603 0,647 6,3 0,792 0,775 0,842 0,772 B.7. Atividade citotóxica dos extratos contra as linhas de células cancerosas sem afetar as células normais

[00280] Extratos individuais em 6,3 µg mL-1 ou uma combinação de 3,1 µg mL-1 TE e 3,1 µg mL-1 RE não induziram uma diminuição significativa na viabilidade celular nas células primárias de controle

[00281] Os resultados são apresentados na Figura 7.

5 [00282] Percentual de células viáveis determinado por ensaio de exclusão com azul de tripano é representado como média+/- SEM na comparação com tratamento de veículo DMSO. Dentro de cada linha de célula as médias não compartilhando a mesma letra são significativamente diferentes (p‹0,05). NS= Não significativo.

10 B.8. Mecanismos pelos quais TE e RE exercem efeitos antiproliferativos e citotóxicos individualmente e em combinação Apoptose celular é induzida por tratamentos de extrato de cúrcuma e alecrim

[00283] O tratamento de combinação TE+RE resultou na ativação de Caspase 3/7 e apoptose em todas as linhas de células, além dos efeitos de TE 15 sozinho.

[00284] Os resultados são representados na Figura 8A a 8E.

[00285] A Figura 6 divulga gráficos de quadrante representativo da linha de células CMT-12 tratada com (Fig 8A) DMSO, (Fig 8B) 6,3 μg mL−1 TE, (Fig 8C) 6,3 μg mL−1 RE ou (Fig 8D) 3,1 μg mL−1 TE + 3,1 μg mL−1 RE são mostrados. 20 Cada quadrante representa o número de eventos considerados vivos (esquerda inferior), apoptótico tardio (direito inferior) ou apoptótico/necrótico tardio (direito superior). (Fig 6E) Percentual de células apoptóticas iniciais (quadrante direito inferior de Anexina V positiva e células negativas 7-AAD) são representadas como 3 replicatas independentes com média ± desvio padrão. Dentro de cada linha 25 celular, médias com letras diferentes são significativamente diferentes umas das outras (p< 0,05).

[00286] O efeito de apoptose também foi avaliado pela quantificação da alteração no nível de caspase 3/7 por célula viável.

[00287] Os resultados são representados na Figura 9.

30 [00288] Na Figura 7, caspase 3/7 ativada por células viáveis foi expressa como alteração média de valores de controle DMSO ± desvio padrão de 3 replicatas independentes. Dentro de cada linha de células, os valores com diferentes letras são significativamente diferentes um dos outros (C2 p < 0,001; CMT-12 p < 0,005; D17 p < 0,05) 5 B.9. Atividade antioxidantes de TE e RE nas linhas de células cancerosas

[00289] Ambos extratos tinham efeitos antioxidantes com RE reduzindo as espécies reativas de oxigênio (ROS) em 40-50% e TE reduzindo o ROS em 80- 90%.

[00290] Os resultados são representados na Figura 10.

10 [00291] Na figura 8, os valores são expressos como média ± desvio padrão de quadro replicatas independentes. Os valores relatados são representados como alteração em comparação ao controle do veículo DMSO.

Dentro de cada linha de células, as médias com diferentes letras são significativamente diferentes um dos outros (C2 p < 0,05; 15 CMT-12 e D17 p < 0,0001) B.10. TE e RE promove a Ativação da Via Celular SAPK/JNK

[00292] Tratamento RE melhorou a atividade da quinase N-terminal c- jun (JNK) na linha de células C2 e a exposição TE+RE aumentou a JNK ativada em 4-5 vezes na linha de células CMT-12. 20 [00293] Os resultados são apresentados nas Figuras 11A (linha de células C2) e 11B (linha de células CMT-12).

[00294] Nas figuras 11A e 11B, cada gráfico é um representativo de três experimentos independentes. Os valores de densitometria representam uma razão de proteína fosforilada para proteína total e normalizada para o controle de 25 veículo DMSO do mesmo ponto de tempo (média de 3 experimentos separados).

Alterações na densitometria em comparação com controle de DMSO com significância de p < 0,05 representado por *. β-Actina foi usado como um controle de carga para cada gráfico para garantir o carregamento uniforme das amostras.

B.10. Acumulação celular aumentada de curcumina induzida pelo tratamento 30 RE

[00295] TE mostrou que o tratamento RE provocou um aumento significativo na acumulação celular de curcumina em aproximadamente 30% nas linhas de células C2 e D17 e em 4,8-vezes na linha de células CMT-12. Este nível intracelular aumentado de curcumina pode exercer um papel na sinergia exibida ao 5 usar TE e RE em combinação.

[00296] Os resultados são representados na Figura 12A, 12B e 12C.

[00297] As linhas de células C2 (fig 12A), CMT-12 (fig 12B) e D17 (fig 12C) foram tratadas com a concentração indicada de extratos durante 24 h e, em seguida, a acumulação celular de curcumina foi quantificada por citometria de fluxo.

10 Os valores do eixo Y representam a alteração de vezes na fluorescência média geométrica (GMF) de todas as células em comparação com o controle DMSO. Os dados relatados são expressos como média ± desvio padrão de quadro replicatas independentes. Dentro de cada linha celular, médias com letras diferentes são significativamente diferentes umas das outras (p< 0,0001). 15 Exemplo 3: Exemplo in vivo com a composição final

[00298] O objetivo deste ensaio clínico multicêntrico prospectivo é determinar se a dieta experimental especialmente formulada pode melhorar a eficácia da quimioterapia reduzindo seus efeitos colaterais e mantendo a qualidade de vida (QoL0 de cães submetidos a protocolo de quimioterapia. A eficácia clínica 20 desta nova dieta será avaliada durante um período de 1 ano após o diagnóstico do câncer. O objetivo primário é ajudar os cães a lutar contra o câncer, através do “suporte ao tratamento” mantendo um bom estado nutricional. O estudo é projetado como ensaio controlado por placebo randomizado duplo cego. Os resultados primários são o estado de saúde global/QoLscore, eventos adversos GI e a 25 manutenção do peso corporal. Os parâmetros de eficácia secundários serão os outros escores de QoL (escalas funcional e de sintomas), o escore fecal (parâmetro ligado aos GI-AEs), sobrevida média, taxa de sobrevida em 1 ano, taxas de resposta ao tratamento, eventos adversos hematológicos (H-AEs), avaliação da dieta pelo proprietário.

30 Projeto do estudo:

• Comparativo: Duas dietas secas nutricionalmente completas e balanceadas formuladas para cães com câncer durante e após o protocolo de quimioterapia serão comparadas.

• Randomizado: Os animais serão estratificados pelo local de estudo 5 antes de ser randomicamente atribuído ao grupo de controle ou teste (utilizando um plano de randomização predeterminado).

o 2 Grupos de cães (de proprietários) alimentados durante um período de um ano após o diagnóstico de câncer (durante e após o tratamento):  Grupo A (n=30) = Dieta de teste 10 Ingredientes: Proteína desidratada de aves, aveia descascada, arroz, glúten de trigo, fibras vegetais, proteínas hidrolisadas de aves, gorduras de aves, óleo de peixe, polpa de chicória, sal de ácido graxo, cascas e sementes de psyllium, extrato de calêndula, coquetel exclusivo de extratos naturais, minerais, vitaminas, antioxidantes e conservantes. Análise de garantia: Mistura (max) 9,5%; proteína 15 (min) 36.5%, gordura bruta (min): 13%; fibra bruta (max) 4,8%, cinzas (média) 7,2%.  Grupo B (n=30) = Dieta de controle Ingredientes: Aveia descascada, arroz, proteína desidratada de aves, gorduras de aves, glúten de trigo, fibras vegetais, proteínas hidrolisadas de aves, minerais da polpa de beterraba, vitaminas, antioxidantes e conservantes. Análise 20 de garantia: Mistura (max) 9,5%; proteína (min) 25%, gordura bruta (min): 13%; fibra bruta (max) 4,8%, cinzas (média) 6,8%.

População do estudo Critérios de inclusão  ≥1 ano de idade ; Peso corporal ≥ 3kg 25  Cães diagnosticados recentemente com linfoma de células B grandes difusas nodais (DLBCL, centroblástico ou imunoblástico) nos estágios III, IV ou V (se limitado a medula óssea ou envolvimento do sangue periférico)  Todos os animais devem ser naïve ao tratamento para o câncer atual, mas podem ter sido tratados para outros cânceres no passado, se maior do que 1 30 ano prévio.

 O proprietário que desejar tratar com quimioterapia multidrogas padrão: Protocolo CHOP incluindo ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina e prednisolona durante 25 semanas

[00299] O cronograma de tratamento é divulgado na Tabela 25 abaixo.

5  O proprietário do animal de estimação que deseja descontinuar todos os suplementos herbais e vitaminas. Se o cão estiver recebendo quaisquer suplementos dietéticos, eles devem ser interrompidos no momento do registro e até estarem elegíveis para o estudo.

 O proprietário do animal de estimação que deseja usar a dieta 10 prescrita, limita os petisco em 5% de calorias (recomendações específicas de petiscos a serem fornecidas) e mantém o QOL mensal e registra os escores fecais, diário alimentar detalhado (quantidade semanal de dieta ingerida).

Critérios de exclusão  Cães com problemas neurológicos induzidos por linfoma na visita de 15 inclusão  Cães com linfoma com outros diferentes de infiltração da medula óssea, sanguínea (como pulmão, SNC...)  Comorbidades recentemente diagnosticadas previstas em afetar potencialmente e adversamente a QoL, alterar o tempo de sobrevida (estimativa de 20 <3 meses) ou exigindo dieta terapêutica específica, por exemplo, doenças endócrinas, doença do coração com ISACHC estágio 2-3, doença renal crônica IRIS 2-4…  Antibiótico atual usado dentro de 1 semana de registro do estudo. O animal pode ser incluído se for realizada a lavagem de 1 semana antes da inclusão.

25  Histórico de sinais gastrointestinais (antes do câncer)- vômito ou diarreia crônicos (mais de 6 episódios/ano ou um mês de sinais clínicos) e animal que requer dieta especial para controle (não relacionada ao câncer).

 Uso profilático atual de antiemétricos e antidiarreicos dentro de 1 semana de registro do estudo 30  Uso de suplementos de ácido graxo ômega-3 (por exemplo, óleo de peixe, óleo de krill, linho, borragem, prímula) dentro de 1 mês de registro de estudo.

 Administração de corticosteroides para câncer para mais de 1 semana dentro do último mês (via oral) ou de corticosteroides de ação longa dentro do último mês (qualquer que seja o número de injeções).

5 Critérios para remoção/descontinuação de participantes

[00300] O animal será removido do estudo se um dos seguintes critérios forem atendidos:  Animal em Resposta Parcial (PR), Doença Estável (SD) ou Doença Progressiva (PD) após avaliação de resposta do 10 tratamento (na semana 6 do protocolo) que requer a modificação do protocolo de quimioterapia.

 Recidiva confirmada com exame citológico (LN FNA) da semana 6 (fase de indução).

 Tolerância da dieta de estudo - sinais de GI 15 relacionados à dieta dentro das primeiras 2 semanas de introdução da dieta experimental que não soluciona dentro de 5 dias sem medicação.

 Fraca conformidade com a dieta, tal como: Intervalo de mais de 5 dias onde a dieta experimental não é fornecida (devido à doença, esgotamento do cliente, alimentação por sonda, etc.). Uso de petiscos 20 em excesso.

 Uso de suplementos dietéticos adicionais (exceto suplementos de glucosamina/condroitina básicos).

Linha do tempo do estudo -V1= referencial/inclusão, diagnóstico foi feito antes do início da 25 quimioterapia e dieta -V2= após cerca de 1 mês de dieta (=fim da fase de indução, na semana 6, assim, 2 semanas após a última injeção de doxorrubicina, mas antes da injeção de vincristina) -V3= após cerca de 3 semanas de dieta (= fase de manutenção de ponto 30 do meio, na semana 15 antes da injeção de vincristina)

-V4 = após 6 meses de dieta (=após conclusão do protocolo de quimioterapia, dentro de 2 semanas da última injeção, na semana 26 ou 27) -V5= após 9 meses de dieta (entre a semana 39 e 41) -V6= após 1 ano de dieta (entre a semana 51 e 53) 5 [00301] O cronograma de tratamento é descrito adicionalmente na Tabela 26 abaixo.

Parâmetros  Diagnóstico e fases Clínicas (V1): - Exame físico completo 10 - CBC com esfregaço sanguíneo + perfil bioquímico sérico (BUN- CREA-ALT-ALKP-TP-ALB- Ca) + urinálise (realizado internamente no mesmo dia) - Exame citológico e imunofenotipagem por citometria de fluxo em aspirados com agulha fina (FNA) de um ou dois linfonodos afetados (ou por imunohistoquímica na biópsia; a critério do investigador) 15 - Radiografias torácicas (2 visualizações: lateral direita e Dorsoventral) (ou varredura a critério do investigador) - Exame de ultrassom abdominal com FNA esplênico/hepático e exame citológico - Aspiração da medula óssea e citologia 20  Peso corporal; Escore de Condição Corporal (BCS escala de 9 pt); Escore de Condição Muscular (MCS WSAVA)  Registro da Medição: protocolo de quimioterapia (alterações menores ligadas às regras de adaptações devido às AEs) e outras drogas  Registro de eventos adversos após quimioterapia (graduação de 1 a 25 5 e data do evento de acordo com a escala V1.1 de VCOG-CTCAE) apenas em: na categoria “gastrointestinal” e na categoria “Sangue/Medula Óssea”  Avaliação da resposta ao tratamento durante a fase de indução (V2): o Resposta completa (CR), Resposta Parcial (PR), Doença Estável (SD) e Doença Progressiva (PD) realizada de acordo com o consenso VCOG: 30 Critérios de avaliação de resposta para linfoma nodal periférico em cães v1.0.

o Realiza apenas parâmetros que foram anormais na visita diagnósticas (apenas se o animal estiver em CR)  Questionário de Qualidade de Vida padronizado  Escore feral (escala de 5 pt) 5  Biomarcadores sanguíneos específicos:  Questionário de avaliação da dieta  Registro o O monitoramento do estado de recorrência até 12 meses (após o início do diagnóstico) confirmado com exame citológico LN (FNA). O veterinário 10 deve verificar o animal após a conclusão do protocolo de quimioterapia (pelo menos um mês ou se a doença mostrar progresso evidente); à critério do investigador (permite calcular o intervalo livre de Progressão) o Morte (natural ou eutanásia; provavelmente atribuível ao câncer ou não; origem desconhecida) permite calcular o Tempo Médio de Sobrevida. 15 o Outros eventos maiores como internação; cirurgia; injúrias...

[00302] O protocolo de tratamento é descrito na Tabela 27 abaixo.

Tabela 11: Atividade antiproliferativa de várias combinações de dois extratos de plantas Chá verde Alecrim Chá verde Romã Alecrim Romã Chá verde Raiz de cúrcuma Alecrim Raiz de cúrcuma C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 Nb CI<0,9/ Nb de fa validado 1/12 9/18 10/22 4/20 9/18 15/21 11/19 2/16 5/16 7/17 C2 Média de Fa validado 1,34 0,78 0,97 1,43 0,84 0,53 0,84 1,87 1,00 1,14 Nb CI<0,9/ Nb de fa validado 0/4 4/11 0/4 1/10 3/6 0/9 0/8 3/16 4/6 8/12

HMPOS Média de Fa validado 5,11 0,97 1,37 1,53 0,88 1,38 5,34 1,07 0,86 0,71 Raiz de Chá verde Vetperina Alecrim Vetperina Vetperina Raiz de cúrcuma Romã Vetperina Romã cúrcuma C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 C1 C2 Nb CI<0,9/ Nb de fa validado 7/25 2/20 5/18 14/25 6/19 0/20 13/18 5/18 15/25 7/25 C2 Média de Fa validado 1,20 1,26 1,88 0,85 1,06 1,53 0,66 1,25 0,68 1,01 Nb CI<0,9/ Nb de fa validado 0/9 1/19 1/12 0/20 12/22 8/20 8/11 6/16 6/15 1/15

HMPOS Média de Fa validado 2,12 1,25 1,14 1,53 0,83 1,07 0,85 0,97 0,95 1,27 5 Casos cinza claro e cinza escuro correspondem às combinações mostrando valores sinérgicos em mais da metade dos Fa validados.

Casos em laranja correspondem às combinações sinérgicas observadas com ambos os modelos de cálculo.

Tabela 25: cronograma de tratamento Número da semana Droga Dose Frequência Via 1 2 3 4 5 6 7 S 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Vincristina 0,7 mg/m2 ou uma vez por

IV X X X X X X X X (oncovina) 0,025 mg/kg semana 2 mg/kg ou 30

PO X mg/m2 1,5 mg/kg ou 20

PO X mg/m2 Prednisolona uma vez ao dia 1 mg/kg ou 10

PO X mg/m2 0,5 mg/kg ou 5

PO X mg/m2 250 mg/m2 ou uma vez por Ciclofosfamida PO X X X X 10 mg/kg semana 30 mg/m2 ou 1 uma vez por Doxorrubicina IV X X X X mg/kg semana

Tabela 26: Cronograma de tratamento

Consumo diário da dieta (Teste ou Controle) Diagnóstico Quimioterapia Meses

De 2 a Visitas ao vet 7 dias

Proprietário

Tabela 27: protocolo de tratamento Número da visita V1 V2 V3 V4* V5* V6* Triagem & ~1 – mês de ~3 – meses de ~6 – meses de ~9 – meses de ~12 – meses de PARÂMETROS/ Consumo da dieta Referencial dieta dieta dieta dieta dieta 26 Fim do 1 ano após o 6 Fase de 15 Manutenção Semana do protocolo de quimioterapia - protocolo de - diagnóstico indução do meio quimio inicial Visita ao vet X X X X X X Critérios de inclusão/exclusão X Formulário de consentimento informado X Informações do paciente; diagnóstico e informações das fases X Randomização X Informações do protocolo, fornece dieta e instruções X X X X X X Escore fecal; questionário de QOL; avaliação da dieta Visita V1: analisar os documentos com os proprietário sem responder as perguntas; outras visitas: coletar documentos do X X X X X X proprietário apenas se a coleta de dados não for possível usando a internet e enviar para o CRO Questionário de histórico da dieta X Informações do medicamento (quimioterapia e outros) X X X X X X Peso corporal X X X X X X

BCS X X X X X X

MCS X X X X X X CBC (incluindo esfregaço sanguíneo) ** X Painel de bioquímica sérica ** X X X Análise de urina X Biomarcadores séricos circulantes ** (CRP, TK1, HPT, LDH) X X X Análise de isótopo de cobre sanguíneo ** X X X X X X Avaliação da resposta ao tratamento (se a palpação dos linfonodos estiver anormal, todos os parâmetros anormais são X realizados) Monitoramento de recorrência X X X X Eventos adversos da quimioterapia (VCOG-CTCAE) X X X * Estas visitas serão agendadas +/- 1 semana (tentar colocar simultaneamente com a visita de acompanhamento)

* * Amostras sanguíneas obtidas como parte da avaliação rotineira (antes da injeção da droga)

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição de ração caracterizada pelo fato de que compreende de cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 60% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição.

2. Composição de ração, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende de cerca de 10% em peso a cerca de 20% em peso de gordura, de cerca de 5% em peso a cerca de 15% em peso de fibras e de cerca de 30% em peso a cerca de 50% em peso de proteínas, os percentuais de peso sendo baseados no peso total da matéria seca da composição.

3. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente carboidratos em uma quantidade que varia de cerca de 15% em peso a cerca de 40% em peso, com base no peso total de matéria seca da composição.

4. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que é selecionada no grupo que consiste em uma ração seca de animais de estimação, uma ração semiúmida de animais de estimação e uma ração úmida de animais de estimação.

5. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte de antioxidantes.

6. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a) a referida composição de ração é uma composição de ração seca de animais de estimação e a fonte de antioxidantes compreende Vitamina C, e em que a Vitamina C está presente em uma quantidade que varia de cerca de 220 ppm a cerca de 440 ppm em uma base de matéria seca, e/ou Vitamina E em que a Vitamina E está presente em uma quantidade variando de cerca de 660 ppm a cerca de 1100 ppm em uma base de matéria seca e/ou carotenoide, onde o carotenoide está presente em uma quantidade variando de cerca de 2 ppm a cerca de 12 ppm em uma base de matéria seca, ou b) a referida composição de ração é uma composição de ração úmida de animais de estimação e a fonte de antioxidantes compreende Vitamina C, em que a Vitamina C está presente em uma quantidade que varia de cerca de 200 a cerca de 600 ppm em uma base de matéria seca, e/ou Vitamina E em que a Vitamina E está presente em uma quantidade variando de cerca de 600 ppm a cerca de 2000 ppm em uma base de matéria seca e/ou carotenoide, em que carotenoide está presente em uma quantidade variando de cerca de 30 ppm a cerca de 100 ppm em uma base de matéria seca.

7. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte de curcuminoides.

8. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um extrato de cúrcuma como uma fonte de curcuminoides.

9. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é uma ração seca de animais de estimação.

10. Composição de ração, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende um extrato de cúrcuma em uma quantidade que varia de 360 ppm a 780 ppm em uma base de matéria seca.

11. Composição de ração, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que compreende curcuminoides em uma quantidade que varia de cerca de 250 a cerca de 2000 ppm em uma base de matéria seca.

12. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte ácido carnósico/carnosol.

13. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um extrato de alecrim.

14. Composição de ração, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o extrato de alecrim está presente em uma quantidade que varia de cerca de 55 ppm a cerca de 130 ppm em uma base de matéria seca.

15. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 14, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade em ácido carnósico e carnosol de cerca de 20 a cerca de 90 ppm em uma base de matéria seca.

16. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 15, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte de piperina.

17. Composição de ração, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que está presente na composição de ração de animais de estimação em uma quantidade que varia de 14 a 60 ppm em uma base de matéria seca.

18. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que é uma composição de ração úmida.

19. Ração, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende um extrato de cúrcuma.

20. Composição de ração, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte de curcuminoides.

21. Composição de ração, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que os curcuminoides estão presentes em uma quantidade que varia de cerca de 250 a cerca de 2000 ppm em uma base de matéria seca.

22. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 21, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte ácido carnósico e carnosol.

23. Composição de ração, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de que a quantidade de ácido carnósico e carnosol varia de cerca de 20 ppm a cerca de 90 ppm em uma base de matéria seca.

24. Composição de ração, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 23, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente uma fonte de piperina.

25. Composição de ração, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que está presente na composição de ração de animais de estimação em uma quantidade que varia de 14 a 60 ppm em uma base de matéria seca.

26. Composição de ração, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada pelo fato de que é aplicada no uso em suporte a um cão afetado por câncer e submetido a quimioterapia.