KR20210014289A - 라사길린을 함유하는 서방출성 미립구의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라사길린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 서방출성 미립구의 제조방법에 관한 것으로, 고유점도가 상이한 2종의 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자를 이용하여 여러 가지 유용한 특성을 나타내는 미립구를 제조하는 것을 특징으로 한다. 특히, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 미립구는 라사길린이 28일 이상 지속적으로 방출될 수 있다.

Description

라사길린을 함유하는 서방출성 미립구의 제조방법{Manufacturing method of sustained release rasagiline microsphere}

본 발명은 라사길린(rasagiline)을 오랜 시간 동안 일정한 속도로 방출하는 서방형 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

파킨슨병은 뇌의 특정영역 신경세포가 점진적으로 손실됨에 따라 나타나는 질환으로 떨림, 움직임의 속도 저하, 근육 경직과 같은 운동 조절 문제와 우울증, 치매, 통증, 수면 장애 및 자율신경계 기능 장애 등의 비운동성 증상을 포함하는 퇴행성 만성 질환이다.

한편, 라사길린은 모노아민 옥시다제의 B형(MAO-B) 효소를 선택적으로 억제하는 파킨슨병 치료제로, 신경세포에서 도파민이 MAO-B 효소에 의해 대사되는 것을 선택적으로 억제하여 도파민 효력 증강 효과를 일으키고 이를 통해 특발성 파킨슨병을 치료하게 된다. 라사길린은 경구용 치료제인 아질렉트 (AZILECT^® 또는 AGILECT^®, Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Petach Tikvah, 이스라엘)라는 상품명으로 유럽, 이스라엘 및 미국에서 피킨슨병 치료제로 승인을 받았다(US2012/0301542 A1).

이러한 경구제는 매일 1회 복용해야 하는 불편함이 있으며, 이를 극복하기 위하여 격일 혹은 주 1회 투여 가능한 패치 제형이 연구되고 있다. 예를 들어, 라사길린 염을 함유하는 경피패치 제형과 표준 핫-멜트 기술에 따라 제조된 패치 제형이 소개되고 있다(WO2007/101400 A1). 미국의 Teikoku Pharma사는 7일간 유지되는 라사길린 패치(TPU-002)에 대한 임상 1상을 진행하였으며, 환자의 편의성을 위한 장기 지속형 제형에 대한 연구를 지속하고 있다.

그러나 파킨슨병의 특성상 더 오랫동안 지속 가능한 라사길린 제제가 지속적으로 요구되어 오고 있으며, 예를 들어, 체내에서 수주 내지 수개월 동안 약물을 지속적으로 방출할 수 있는 장기 지속형 라사길린 제제가 요구된다.

중국 특허 CN 107049985 A는 0.5~5um와 20~150um의 두 개의 상이한 평균입자 크기를 갖는 미립구를 매칭하여 혈장내 라사길린 농도의 변동이 현저히 감소하고 지연방출이 없는 장기 지속형 라사길린 제제를 개시하고 있다. 미립구의 직경이 다른 두 가지를 조합함으로써 초기방출과 지연방출을 효과적으로 조정한 것으로 혼합비에 따라 방출 패턴을 조절할 수 있다는 장점을 갖고 있다. 하지만, 0.5~5.0um의 미립구는 대식세포에 의한 식균작용이 일어날 수 있는 입자 크기로, in vivo에서는 약물의 효능이 떨어질 수 있다. 일반적으로 고분자 미립구를 이용한 약물 전달 시스템의 경우, 식균 작용을 피할 수 있는 적절한 크기의 미립구를 이용하여 약물을 전달하는 시스템으로 디자인된다. 많은 연구진에 의해서 고분자 미립구의 크기에 따른 식균작용에 대한 연구가 수행되었다. Tabata와 Ikada는 폴리스티렌미립구와 폴리아크롤린 페닐염 미립구 (0.5 ~ 4.6um)를 이용하여 식균작용을 연구하였으며, 중간 입자 크기인 1.7um 에서 최대 식균 작용이 관찰되었다고 보고하였다. 유사한 결론으로, Rudt 그룹에서는 85nm ~ 3.2um 입자의 인간 혈액 과립 세포에 의한 식균 작용을 간접적으로 측정하였으며, Simon은 폴리스티렌미립구(0.5 ~ 8um)의 인간 혈액 호중구와 백혈구에 의한 식균 작용에 대해 연구를 통해, 입자의 크기가 증가할수록 식균 작용이 감소한다고 보고하였다.

CN 107049985 A에 개시된 기술은 평균 입자 크기가 다른 두 개의 미립구를 각각 제조하여 혼합해야 하는 불편함이 있으며, 작은 미립구 제조를 위해 초음파 균질화 과정 혹은 1000~1500 bar의 고압조건에서의 주입이 필요하고, in vivo내에서 식균작용에 대한 우려가 존재 한다.

이에 따라 제조공정이 단순하면서 장기간 안정한 약물의 서방출성을 갖고 혈중 유효농도를 지속적으로 유지할 수 있는 라사길린 미립구의 개발이 요구되고 있다.

미국 특허출원공개공보 US 2012/0301542 국제특허출원 공개공보 WO2007/101400 중국 특허공개공보 CN 107049985

Tabata, Y., & Ikada, Y. (1988). Effect of the size and surface charge of polymer microspheres on their phagocytosis by macrophage. Biomaterials, 9(4), 356-362.

Rudt, S., & Mller, R. H. (1993). In vitro phagocytosis assay of nano- and microparticles by chemiluminescence. II. Effect of surface modification by coating of particles with poloxamer on the phagocytic uptake. Journal of Controlled Release, 25(1-2), 51~59.

Simon, S. I., & Schmid-Schnbein, G. W. (1988). Biophysical aspects of microsphere engulfment by human neutrophils. Biophysical Journal, 53(2), 163-173.

따라서 본 발명은 단 1회의 제조공정만으로 일반적인 크기 분포를 갖는 각기 다른 2종의 미립구를 제조하여, Zero-order에 근접한 방출 패턴을 갖고, 28일 이상 라사길린을 방출하는 서방출성 미립구를 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 라사길린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 서방출성 미립구의 제조방법에 관한 것으로,

(a) 라사길린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자를 비극성 유기용매에 용해시켜 분산상을 준비하는 단계로,

고유점도 범위가 0.30 ~ 0.70dL/g인 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자를 유기용제에 용해시킨 제 1 분산상을 준비하는 단계와

고유점도 범위가 0.10 ~ 0.29dL/g인 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자를 유기용제에 용해시킨 제 2 분산상을 준비하는 단계;

(b) 계면활성제가 포함된 연속상인 수상을 준비하는 단계;

(c) 상기 (a)의 제 1 분산상과 제 2 분산상을 상기 (b)에서 기술한 연속상인 수상으로 혼합하여 교반하는 단계로

상기 (a)단계의 총 분산상과 상기 (b)단계의 연속상의 부피비가 1:10 내지 1:300 (총 분산상 : 연속상)인, 단계;

(d) 생성된 액적을 이용하여 미립구를 제조하는 단계; 및

(e) 제조된 미립구를 여과하고 건조하는 단계를 포함하는,

라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 제조방법에 있어, 상기 제 1 분산상과 제 2 분산상은 순서에 상관없이 혼합될 수 있으며, 더 나아가, 제 1 분산상과 제 2 분산상이 동시에 투입되어 교반 혼합될 수 있다. 후술하는 바와 같이, 동시 주입의 경우라도 고유점도가 다른 고분자를 각각 따로 주입하는 경우와 마찬가지로 두 가지 유형의 고유점도를 갖는 고분자 미립구가 각각 따로 형성된다.

본 발명에 따른 제조방법에서는, 고유점도가 다른 두 고분자를 미리 혼합하여 고유점도 분포가 넓은 균일한 단일분산상을 이용해 미립구를 제조하는 대신에 특정 범위의 고유점도를 갖는 두 종류의 생분해성 고분자를 고분자별로 분산상을 따로 제조하고 주입하여 고형화시킴으로써 고분자별로 각각의 독립된 미립구를 생성하게 되며, 이러한 방법으로 형성된 미립구의 균일성, 미립구의 분해속도, 약물방출 속도 및 패턴 등 여러 장점을 가진 미립구들을 한번에 간편하게 편차 없이 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법으로, 장기간 일정한 용출률을 가진 서방출성 미립구를 제조할 수 있으며, 얻어지는 미립구들의 용출률 편차를 줄일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 서방출성 미립구들은 상대적으로 일정한 크기를 가질 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어, 상기 단계 (a)는 생체적합성 고분자를 유기용매에 용해시켜 생체적합성 고분자 용액을 제조한 후, 상기 생체적합성 고분자 용액에 라사길린을 용해 또는 분산시켜 라사길린 함유 생체적합성 고분자 용액을 형성하는 방법, 라사길린과 생체적합성 고분자를 용매에 각각 용해시킨 후 혼합하여 라사길린 함유 생체적합성 고분자 용액을 형성하는 방법, 또는 라사길린 및 생체적합성 고분자를 동시에 용매에 용해시켜 라사길린 함유 생체적합성 고분자 용액을 형성하는 방법으로 수행할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어, 상기 단계 (a)에서 사용되는 라사길린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은, 미립구 제조 후에 미립구 총 중량 대비 라사길린이 1 내지 30 중량% 포함되도록 이용된다.

본 발명에 있어, 라사길린의 약학적으로 허용 가능한 염으로는 메실산염, 말레인산염, 푸마르산염, 타르타르산염, 염산염, 브롬화수소산염, 에탄설폰산염(ethanesulfonic acid, 에실레이트), p-톨루엔설폰산염(p-툴루엔설포네이트), 벤조산염, 아세트산염, 인산염, 황산염 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어, 상기 단계 (a)의 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자로는 폴리카프로락톤, 락트산-카프로락톤 공중합체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 락트산-글리콜산 공중합체, 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 특히 방출기간, 라사길린과의 적합성 등을 고려할 때 폴리락트산이 바람직하다.

상기 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자의 함량은, 제조 후 얻어지는 상기 미립구의 총 중량 대비 70 내지 99 중량%일 수 있고, 라사길린의 방출성, 미립구의 제조용이성 등을 고려 시 바람직하게는 80 내지 99 중량%, 더욱 바람직하게는 90 내지 99 중량%이다.

상기 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자의 중량평균 분자량은 특별히 제한되지 않지만, 그 하한이 5,000 이상, 바람직하게는 10,000 이상, 더욱 바람직하게는 15,000 이상일 수 있으며, 그 상한은 500,000 이하, 바람직하게는 300,000 이하, 더욱 바람직하게는 90,000 이하일 수 있다.

본 발명에 따른 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자로는, 예를 들어, 시판 중인 Evonik사의 Resomer PLA202H, Resomer PLA203H 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어, 상기 단계 (a)에서 사용되는 비극성 유기용매로는 할로겐화 알칸, 지방산 에스테르, 에테르, 방향족 탄화수소, 알코올 또는 이들의 혼합용매가 사용될 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 할로겐화 알칸 용매로는 예를 들어, 염화 알칸이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 생성되는 미립구의 방출 특성상 상기 비극성 유기용매로는 디클로로메탄이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어, 상기 지방산 에스테르로는 예를 들어, 메틸 리놀레이트, 메틸 올레이트, 메틸 팔미테이트, 메틸 스테아레이트, 에틸 리놀레이트, 에틸 올레이트, 에틸 팔미테이트, 에틸 스테아레이트 또는 이들의 혼합물이 사용 될 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 에테르로는 예를 들어, 디메틸에테르, 디에틸에테르, 메틸에틸에테르, 이소프로필에테르, 디부틸에테르, 테트라하이드로퓨란(THF) 또는 이들의 혼합물이 사용 될 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 방향족 탄화수소로는 예를 들어, 벤젠, 톨루엔, 자일렌, 나프탈렌, 안트라센, 벤조피렌, 에틸벤젠 또는 이들의 혼합물이 사용 될 수 있다.

본 발명에 있어, 상기 알코올로는 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 벤질알코올, 에틸렌글리콜 또는 이들의 혼합물이 사용 될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어, 상기 단계 (b)의 계면활성제로는 약물 함유 생분해성 고분자 용액이 연속상 내에서 안정한 액적의 분산상을 형성하여 O/W (Oil in Water) 에멀젼 형성을 도와줄 수 있는 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다. 상기 계면활성제는 바람직하게는, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스, 레시틴, 젤라틴, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체 등과 같은 비이온성 계면활성제; 라우릴 황산 나트륨 및 스테아르산 나트륨 등과 같은 음이온성 계면활성제; 이미다졸, 에스테르 아민, 리니어 디아민 및 패티 아민 등과 같은 양이온성 계면활성제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 가장 바람직하게는 폴리비닐알코올을 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어, 상기 단계 (b)의 연속상으로 폴리비닐알코올 수용액이 특히 바람직하다. 연속상에서 물을 사용할 경우, 후술하는 단계 (c)에서 연속상 내로 분산상이 혼용화되는 정도와, 다음 단계 (d)에서 미립구를 형성한 후, 후술하는 단계 (e)를 수행하기 전에, 여과 및 세척을 통해 미립구 표면에 잔류하는 유기용매 및 폴리비닐알코올과 같은 수용성 계면활성제를 보다 쉽게 제거할 수 있다.

본 발명의 제조방법은, 상기 단계 (c)에서, 상기 분산상과 연속상의 부피비는 1 : 10 내지 1 : 300 (총 분산상 : 연속상)이며, 바람직하게는 1 : 150 내지 1 : 220일 수 있다. 상기 단계 (c)에서, 분산상과 연속상의 부피비 조절을 통해서 분산상의 용매가 연속상으로 확산되어 혼용화되는 정도를 조절할 수 있다.

상기 단계 (c)에서 분산상과 연속상을 혼합하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 고속 교반기를 이용하여 수행할 수 있다.

상기 단계 (c)와 같이, 상기 분산상과 상기 연속상을 포함하는 에멀젼을 형성하는 경우, 라사길린 함유 생체적합성 고분자 용액이 계면활성제를 함유한 연속상 내에서 균질하게 분산되어, 액적 형태의 분산상 또는 불연속상을 형성하게 된다.

본 발명의 제조방법에 있어, 상기 (c) 단계에서 이용되는 제 1 분산상과 제 2 분산상은 0.1 : 10 내지 10 : 0.1의 고분자 원료중량비를 갖는 것이 본 발명의 목적상 바람직하다.

본 발명의 제조방법 중 상기 단계 (d)에서, 미립구를 1시간 내지 6시간 동안 고형화하는 것이 라사길린의 방출성, 라사길린의 봉입 효율 등 여러 측면에서 바람직하다. 이러한 미립구의 고형화 시간을 조절해서 미립구 내의 잔류 용매량과 표면형태 또한 조절할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어, 상기 (e) 단계의 여과는 습식여과가 바람직하며, 건조는 진공 건조가 바람직하다.

상기 단계 (e)의 건조 공정을 수행하기 전에, 상기 분산상과 연속상의 혼합물을 여과 및 세척하여 고형화된 미립구를 수득할 수 있으며, 상기 여과 및 세척 단계는 수회에 걸쳐 반복할 수 있다.

상기 단계 (e)에서 진공 건조 공정은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 진공 동결 건조를 통해 수행될 수 있다. 여과 및 세척을 통해 수득된 미립구에 대해 진공 동결 건조를 수행할 경우, 미립구 내에 존재하는 수분이 증발 또는 승화를 통해 제거될 수 있다. 상기 진공 동결 건조는 바람직하게는 상온 이상의 온도에서 수행될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 라사길린 함유 서방출성 미립구는, 바람직하게는, 10um 내지 200um의 평균 직경을 갖는다. 본 명세서에 있어 입도측정은 HELOS/KFS(제조원: SYMPATEC) 장비를 이용하였으며, SUCELL disperser와 R5 렌즈를 사용하여 습식법(Opt. concentration(%): 5±3)으로 측정하였다.

보다 바람직하게, 본 발명은 라사길린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 서방출성 미립구의 제조방법에 관한 것으로,

(a) 라사길린 유리염기와 PLA를 비극성 유기용매(바람직하게는 디클로로메탄)에 용해시켜 분산상을 준비하는 단계로,

고유점도 범위가 0.30 ~ 0.40dL/g인 PLA를 유기용제에 용해시킨, PLA 농도가 30-40 중량%인 제 1 분산상을 준비하는 단계와

고유점도 범위가 0.20 ~ 0.26dL/g인 PLA를 유기용제에 용해시킨, PLA 농도가 35-45 중량%이되 제 1 분산상의 고분자 농도보다는 높은 제 2 분산상을 준비하는 단계;

(b) 폴리비닐알코올이 0.2-4 w/v% 포함된, 연속상인 수상을 준비하는 단계;

(c) 상기 (a)의 제 1 분산상과 제 2 분산상을 상기 (b)에서 기술한 연속상인 수상으로 혼합하여 교반하는 단계로, 상기 수상은 5-15 ℃로 유지되며, 상기 (a)단계의 총 분산상과 상기 (b)단계의 연속상의 부피비가 1 : 150-220 (총 분산상 : 연속상)이고, 제 1 분산상과 제 2 분산상의 고분자 원료중량비가 1-2 : 1 (제 1 분산상 : 제 2 분산상)(바람직하게는, 1.3-1.8 : 1)인, 단계;

(d) 생성된 액적을 이용하여 미립구를 제조하는 단계이며, 미립구를 포함하는 연속상을 35-45℃에서 1-6시간 동안 교반하는 단계; 및

(e) 제조된 미립구를 습식여과하여 폴리비닐알코올을 제거하고, 진공 건조하여 수분 및 (d) 단계에서 제거되지 않은 잔류 유기용매를 추가로 제거하는 단계를 포함하는,

라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 따라 제조된 라사길린 함유 서방출성 미립구는, 바람직하게는, 약 28일 이상 지속적으로 라사길린을 방출할 수 있다.

본 발명은 단 1회의 제조공정만으로 일반적인, 유사한 크기 분포를 갖는 각기 다른 2종의 미립구의 제조방법을 제공함으로써, 제조 공정을 단순화하고 Zero-order에 근접한 방출 패턴을 가질 뿐만 아니라 28일 이상 라사길린을 방출하는 서방출성 미립구가 제공될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 미립구의 주사전자현미경 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 미립구의 입도 분포를 관찰한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예 및 비교예에 따라 제조된 미립구의 용출시험 결과이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 미립구를 수컷 랫트에 단회투여한 후 시간에 따른 혈중 라사길린의 농도를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 미립구를 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)에 의해 파킨슨병을 유도한 수컷 C57 마우스에 단회투여한 후 시간에 따른 행동능력(Rotarod test)을 평가한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 본 발명이 속한 분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

본 발명에 있어, 고분자의 고유점도는 0.1 % w/v, 용매 CHCl₃, 25 ℃의 측정 조건에서 평가하였으며, 측정 기기로는 Ubbelhode size 0c glass capillary viscometer를 사용하였다.

비교예 1

제 1 분산상 : 제 2 분산상 = 0:10인 라사길린 함유 미립구 제조

고유점도가 0.23 dL/g인 PLA(Poly lactic acid) 3.68g과 라사길린 0.32g을 디클로로메탄 (비등점: 39.6 ℃) 5.520g 용해시켜 제 2분산상(Polymer conc.:40%)을 제조하였다. 또한 계면활성제로서 폴리비닐알코올을 사용하여 연속상인 폴리비닐알코올 수용액 (농도: 1.0 w/v%) 800ml를 제조하였다. 이어서, 상기 제조된 제 2분산상을 10℃로 유지된 상기 폴리비닐알코올 수용액에 순차적으로 혼합한 후 고속 교반하여 액적을 형성하였다. 그 후, 미립구를 포함하는 연속상을 40℃에서 약 4시간 교반하여 상기 미립구로부터 디클로로메탄을 증발시킨 후, 증류수로 3회 세척하여 폴리비닐알코올을 제거하고 습식여과 하였다. 이어서, 상기 여과된 미립구를 상온 조건에서 진공 건조시켜 미립구 내에 잔존하는 수분 및 디클로로메탄을 증발시킴으로써, 라사길린 함유 미립구를 수득하였다.

실시예 1

제 1 분산상 : 제 2 분산상 = 5:5인 라사길린 함유 미립구 제조

고유점도가 0.32 dL/g인 PLA(Poly lactic acid) 1.84g과 라사길린 0.16g을 디클로로메탄 (비등점: 39.6℃) 3.417g 용매에 용해시켜 제 1분산상(Polymer conc.:35%)을 제조했고, 고유점도가 0.23 dL/g인 PLA(Poly lactic acid) 1.84g과 라사길린 0.16g을 디클로로메탄 (비등점: 39.6℃) 2.760g 용매에 용해시켜 제 2분산상(Polymer conc.:40%)을 제조하였다. 또한 계면활성제로서 폴리비닐알코올을 사용하여 연속상인 폴리비닐알코올 수용액 (농도: 1.0 w/v%) 800ml를 제조하였다. 이어서, 상기 제조된 제 1분상상과 제 2분산상을 10℃로 유지된 상기 폴리비닐알코올 수용액에 순차적으로 혼합한 후 고속 교반하여 액적을 형성하였다. 그 후, 미립구를 포함하는 연속상을 40℃에서 약 4시간 동안 교반하여 상기 미립구로부터 디클로로메탄을 증발시킨 후, 증류수로 3회 세척하여 폴리비닐알코올을 제거하고 습식여과 하였다. 이어서, 상기 여과된 미립구를 상온 조건에서 진공 건조시켜 미립구 내에 잔존하는 수분 및 디클로로메탄을 증발시킴으로써, 라사길린 함유 미립구를 수득하였다.

실시예 2

제 1 분산상 : 제 2 분산상 = 6:4인 라사길린 함유 미립구 제조

고유점도가 0.32dL/g인 PLA(Poly lactic acid) 2.208g과 라사길린 0.192g을 디클로로메탄 (비등점: 39.6℃) 4.100g 용매에 용해시켜 제 1분산상(Polymer conc.: 35%)을 제조했고, 고유점도가 0.23dL/g인 PLA(Poly lactic acid) 1.472g과 라사길린 0.128g을 디클로로메탄 (비등점: 39.6℃) 2.208g 용매에 용해시켜 제 2분산상(Polymer conc.: 40%)을 제조하였다. 또한 계면활성제로서 폴리비닐알코올을 사용하여 연속상인 폴리비닐알코올 수용액 (농도: 1.0 w/v%) 800ml를 제조하였다. 이어서, 상기 제조된 제 1분상상과 제 2분산상을 10℃로 유지된 상기 폴리비닐알코올 수용액에 순차적으로 혼합한 후 고속 교반하여 액적을 형성하였다. 그 후, 미립구를 포함하는 연속상을 40℃에서 약 4시간 동안 교반하여 상기 미립구로부터 디클로로메탄을 증발시킨 후, 증류수로 3회 세척하여 폴리비닐알코올을 제거하고 습식여과 하였다. 이어서, 상기 여과된 미립구를 상온 조건에서 진공 건조시켜 미립구 내에 잔존하는 수분 및 디클로로메탄을 증발시킴으로써, 라사길린 함유 미립구를 수득하였다.

비교예 2

제 1 분산상 : 제 2 분산상 = 10:0인 라사길린 함유 미립구 제조

고유점도가 0.32dL/g인 PLA(Poly lactic acid) 3.68g과 라사길린 0.32g을 디클로로메탄 (비등점: 39.6℃) 6.834g 용해시켜 제 1분산상(Polymer conc.:35%)을 제조하였다. 또한 계면활성제로서 폴리비닐알코올을 사용하여 연속상인 폴리비닐알코올 수용액 (농도: 1.0 w/v%) 800ml를 제조하였다. 이어서, 상기 제조된 제 2분산상을 10℃로 유지된 상기 폴리비닐알코올 수용액에 순차적으로 혼합한 후 고속 교반하여 액적을 형성하였다. 그 후, 미립구를 포함하는 연속상을 40℃에서 약 4시간 동안 교반하여 상기 미립구로부터 디클로로메탄을 증발시킨 후, 증류수로 3회 세척하여 폴리비닐알코올을 제거하고 습식여과 하였다. 이어서, 상기 여과된 미립구를 상온 조건에서 진공 건조시켜 미립구 내에 잔존하는 수분 및 디클로로메탄을 증발시킴으로써, 라사길린 함유 미립구를 수득하였다.

실험예 1: 미립구내 라사길린 약물 함량 측정

미립구 약 30 ㎎을 20 mL 용량의 플라스크에 넣고 5ml 아세토니트릴(Acetonitrile)로 표선을 맞춘 후 10분간 초음파처리하여 완전히 용해시켰다. 실온에서 식힌 후 희석액을 넣어 표선으로 맞추고, 0.45 ㎛ 실린지 필터로 여과하여 검액으로 사용하였다. HPLC를 이용하여 미립구 내에 봉입되어 있는 라사길린의 함량을 측정하였다. 함량 계산은 다음과 같이 하였으며, 그 측정 결과를 표 1에 나타내었다.

A_T : 검액 면적

A_S : 표준액 면적

C_S : 표준액 농도 (mg/mL)

C_T : 검액 농도 (mg/mL)

P(%) : 표준품 순도

	제 1분산상: 제 2분산상	함량 (%)
비교예 1	0:10	5.0
실시예 1	5:5 (1:1)	4.5
실시예 2	6:4 (1.5:1)	4.9
비교예 2	10:0	3.5

상기 표 1에서와 같이, 제 1분산상과 제 2분산상의 비율에 따른 약물 함량을 확인한 결과 3.5~5 % 사이의 함량을 가지는 것을 확인할 수 있었다. 제 2 분산상으로 단독 제조한 비교예 1의 경우 5.0%로 가장 높은 함량을 가지는 것으로 확인됐는데, 이는 제 2 분산상의 높은 고분자 농도(40%)에서 비롯된 것으로 보인다. 일반적으로 고분자 농도가 높을수록 분산상의 점도가 높아지게 되는데, 고점도의 분산상은 미립구 형성시 약물이 연속상으로 빠져나가는 것을 막아 높은 함량을 갖는 미립구를 형성 하기 때문인 것으로 추측된다. 동일한 이유로 제 1분산상으로 단독 제조한 비교예 2의 경우 낮은 고분자 농도(35%)로 인해 3.5%의 가장 낮은 함량을 나타내었다. 실시예 1, 2의 함량은 4.5%, 4.9%로 확인되었는데, 이는 단독 제조한 비교예 1,2의 함량 5.0%와 3.5%의 사이 값으로 해석 할 수 있다. 실시예 중에서 제 1 분산상 : 제 2 분산상 비율이 6:4인 실시예 2가 가장 높은 함량을 가지는 것으로 확인되었다. 다만, 본 발명은 이러한 이론적 추측에 한정되는 것은 아니다.

실험예 2: 미립구 형태 측정

미립구 약 10 ㎎을 알루미늄 스터브에 고정시키고 진공 조건 및 고전압(5 kV) 하에서 SEM(장비명: TM3000) 분체에 장착하고, 이미지 분석프로그램(TM3000 Tabletop Microscope ver.02-02)을 사용하여 X100 배율로 미립구의 표면을 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

미립구 표면 관찰 결과, 비교예와 실시예 모두에서 수축(Shrinking)이 없는 구형 미립구가 형성되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 미립구 입도 분포 측정

미립구의 입도 분포를 관찰하기 위하여 HELOS/KFS(제조원: SYMPATEC) 장비를 이용하여 습식법으로 입도를 관찰하였다. 0.1 % Trion X-100 용액에 검체를 넣어 덩어리가 없이 분산시킨 후 분석기에 넣고 다음과 같은 분석 조건에서 적절한 결과(optical concentration 1.5~9.0%)가 나올 때까지 검액을 가한 후 분석 한 결과를 표 2와 도 2에 나타내었다.

분석조건

- 펌프속도 : 100 %

- 분석시간 : 10초

- 실시횟수 : 3회

- Opical model : R5 0.5/4.5...875um

- Trigger condition : Wet standard

- Disperser : SUCELL

	Optical concentration (%)	Size (D10/D50/D90)
비교예 1	8.47	42/60/82
실시예 1	5.83	46/66/90
실시예 2	1.68	42/58/76
비교예 2	4.20	45/61/81

미립구 입도 분포 측정 결과, 모든 비교예 및 실시예에서 60um 전후의 D50을 중심으로 일반적인 정규분포곡선을 따르는 입도 분포를 나타냈다. 1개의 분산상을 갖는 비교예 1,2와 2개의 분산상을 갖는 실시예 1,2 모두 유사한 입도 분포 곡선과 입자 사이즈를 가지는 것으로 보아 분산상 개수의 차이가 입도에 영향을 미치지 않는 다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 4: 인비트로(In vitro) 용출 시험

약 25mg의 제형화된 미립구를 차광된 유리병에 넣고 실온의 용출시험액 100mL에 넣어 잘 섞어준 후, 37±0.5℃ 수욕조에 담그어 방치하였다. 용출 개시 1일, 3일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일, 24일, 및 28일 째에 검체를 채취하였다. 각 샘플 채취 전 (15분 이상 차이 나지 않도록) 세워두었던 병을 잘 흔들어 섞은 후 약 10분 정도 방치한 다음 샘플 5.0mL를 취하고 용출시험액 5.0mL를 채워 넣고 마개를 다시 채워 다음 검체 채취시간까지 수욕조에 담가 두었다. 채취한 샘플은 여과(0.45㎛)하여 검액으로 하여 검액 및 표준액 30 μL씩을 가지고 아래 조건에서 약전 일반 시험법 중 액체크로마토그래프법에 따라 HPLC로 시험하였다.

<HPLC 조작 조건>

- 칼럼 : Lichrospher 60 RP select B (4mm X 125mm, 4μm)

- 이동상 : pH 2.5 완충액 : 아세토니트릴 (80 : 20)

- 유속 : 1.0 mL/min

- 주입량 : 30 μL

- 분석시간 : 15분

- 검출기 : 자외부 흡광 광도계 (측정파장 : 210 nm)

- 칼럼 온도 : 30℃

Cs : 표준액 농도(mg/mL)

Ct : 검액 농도(mg/mL)

Cto : 이전시점 검액 농도(mg/mL)

At : 검액의 면적

As : 표준액의 면적

P : 표준품 함량(%)

Vt : 검액의 희석부피(mL)

Wt : 검체 무게(mg)

누적용출율 = %rel+∑%rel

%rel : 현 시점의 용출율

∑%rel : 앞선 시점에서의 용출율의 합

용출 평가 결과를 하기 표 3 및 도 3에 나타내었다.

시간 (Day)	누적 용출률(%)
	비교예 1	실시예 1	실시예 2	비교예 2
1 Day	9.1	5.8	6.9	4.5
3 Day	20.2	12.2	16.8	8.5
10 Day	73.0	48.5	38.1	32.4
14 Day	82.5	60.4	55.8	35.2
17 Day	84.7	69.9	68.4	39.4
21 Day	85.7	79.7	89.1	58.4
24 Day	86.5	82.4	97.3	70.6
28 Day	86.9	84.6	100.7	80.8

인비트로 용출 시험 결과, 고유점도가 낮은 고분자를 단독 사용한 비교예 1의 경우 미립구의 빠른 붕괴로 인해 73.0%의 약물이 초기 10일까지 방출 되는 것으로 나타났다. 반면 고유점도가 높은 고분자를 단독 사용한 비교예 2의 경우 미립구의 붕괴 속도 지연으로 70.6%의 약물이 방출되기까지 24일이 소요되는 것으로 확인되었다. 두 고분자를 모두 이용한 실시예 1, 2의 경우 비교예 1, 2와 비교하여 28일 동안 일정한 방출을 나타내는 것으로 확인되었으며, 특히 실시예 2의 경우 28일 동안 약물이 100% 방출되며 장기기속형 주사제에 가장 이상적인 제로 오더(Zero-order)와 유사한 방출 패턴을 보이는 것으로 확인되었다.

실험예 5: 인비보(In vivo) 혈중 농도 측정 시험

실시예 2의 제제를 분산매를 이용하여 현탁 후, 5.6mg/kg을 2mL/kg의 부피비로 수컷 랫트(n=10)의 대퇴부에 근육 주사하였다. 랫트의 혈액샘플은 투약 전과 투약 후 30분부터 랫트의 좌 또는 우측 경정맥에서 약 1mL을 채혈하였으며, 채혈 포인트는 0.5, 1, 3, 6시간 그리고 1, 2, 4, 7, 10, 12, 14, 21, 28, 35일이다. 혈액 샘플은 모든 시간 냉장 조건에서 보관되었으며, 혈액내 혈장 분리를 위하여 원심분리를 진행한 후, HPLC-MS/MS((Agilent 1260, AB SCIEX 4000)를 이용하여 혈중 라사길린의 농도를 분석하였다.

<<HPLC-MS/MS 조건>

- 컬럼 : Waters Xbridge C18 3.5um (2.1X50 mm)

- 이동상 : Methanol : 0.1% formic acid = 50 : 50 (v/v)

- 유속 : 0.25 mL/min

- 주입량 : 5 uL

평가 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 실시예 2를 이용해 랫트 인비보 혈중 농도 측정 시험 결과, 초기 1시간차에 최고 혈중농도(Cmax) 7.46ng/mL을 나타냈고, 이후 1일부터 21일 동안 1~3ng/mL 사이의 일정한 혈중농도를 나타냈다. 또한 주입 후부터 28일차까지 혈중에서 라사길린이 지속적으로 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 본 제형은 초기 낮은 혈중농도를 가지면서도 28일 이상 지속적으로 라사길린 혈중농도를 유지하는 장기지속형 주사제임을 확인할 수 있었다.

실험예 6: 파킨슨질환유발 동물 모델 행동능력 평가

실시예 2의 제제를 분산매를 이용하여 현탁 후, 5.6mg/kg을 2mL/kg의 부피비로 수컷 C57 마우스(n=10)의 대퇴부에 근육 주사하였다. 이때, MPTP를 30mg/kg의 농도로 마우스의 복강에 하루 1번 총 5일 동안 투여하여 파킨슨 질환을 유도하였다. 마우스의 행동능력 평가는 로타로드 장치(Harvard Apparatus LE8205, Panlab, USA)를 이용하여 0일, 3일, 7일, 10일, 14일, 21일, 24일, 28일에 측정하였으며, MPTP 투여 이전 5일동안 40 rpm으로 회전하는 원통 위에서 강제로 걷게 하여 training을 시킨 후, 40rpm으로 회전하는 원통 위에서 걷게 하여 보행을 멈추고 떨어지는 시간을 측정하였다. 개체당 3회씩 측정하였으며 400초동안 실험하였다. 그 결과는 도 5에 도시하였다.

도 5에서 알 수 있듯이, MPTP만을 투여한 대조군에서는 균형감각과 운동협응력이 감소하여 원통 위에서 걷는 시간이 유의적으로 감소한 것을 확인 할 수 있었다. 반면 MPTP 투여 후 실시예 2를 투약한 실험군에서는 라사길린의 지속적인 방출로 인해 투약 이후 28일 동안 대조군과 비교해서 균형감각과 운동협응력을 유지하는 결과를 보였다.

Claims (10)

1. 라사길린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 서방출성 미립구의 제조방법에 관한 것으로,
   (a) 라사길린 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자를 비극성 유기용매에 용해시켜 분산상을 준비하는 단계로,
   고유점도 범위가 0.30 ~ 0.70dL/g인 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자를 유기용제에 용해시킨 제 1 분산상을 준비하는 단계와
   고유점도 범위가 0.10 ~ 0.29dL/g인 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자를 유기용제에 용해시킨 제 2 분산상을 준비하는 단계;
   (b) 계면활성제가 포함된 연속상인 수상을 준비하는 단계;
   (c) 상기 (a)의 제 1 분산상과 제 2 분산상이 상기 (b)에서 기술한 연속상인 수상으로 혼합하여 교반하는 단계로
   상기 (a)단계의 총 분산상과 상기 (b)단계의 연속상의 부피비가 1:10 내지 1:300 (총 분산상 : 연속상)인, 단계;
   (d) 생성된 액적을 이용하여 미립구를 제조하는 단계; 및
   (e) 제조된 미립구를 여과하고 건조하는 단계를 포함하는,
   라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법.
2. 제1항에 있어서, (c) 단계에서 이용되는 제 1 분산상과 제 2 분산상은 0.1 : 10 내지 10 : 0.1의 고분자 원료중량비를 갖는, 라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 사용되는 비극성 유기용매는 할로겐화 알칸, 지방산 에스테르, 에테르, 방향족 탄화수소, 알코올 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 할로겐화 알칸 용매는 디클로로메탄, 클로로포름, 클로로에탄, 디클로로에탄, 트리클로로에탄 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법
5. 제1항에 있어서, 상기 계면활성제는 메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시메틸셀룰로오스, 레시틴, 젤라틴, 폴리비닐알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 피마자유 유도체를 포함하는 비이온성 계면활성제; 라우릴황산나트륨 및 스테아르산나트륨을 포함하는 음이온성 계면활성제; 이미다졸, 에스테르 아민, 리니어 디아민 및 패티아민을 포함하는 양이온성 계면활성제 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자는 폴리카프로락톤, 락트산-카프로락톤 공중합체, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 락트산-글리콜산 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자는 생성된 미립구의 총 중량 대비 70 내지 99 중량% 포함되도록 사용되는, 라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 제조된 미립구의 평균 크기가 10um 내지 200um의 평균 직경을 갖는, 라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 생분해성 지방족 폴리에스테르 고분자의 중량평균 분자량은 5,000 ~ 90,000 달톤인, 라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법.
10. 제1항에 있어서, 상기 미립구는 라사길린이 28일 이상 지속적으로 방출되는 것을 특징으로 하는, 라사길린 함유 서방출성 미립구의 제조 방법.

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